CN110691579A - 用于治疗的肉毒杆菌神经毒素 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于治疗操作的组合物和方法。“速效”肉毒杆菌毒素用于美容治疗和/或预防或减少瘢痕的用途。“速效”是指与由例如A型肉毒杆菌神经毒素产生的效果相比，在患者中更快地产生效果的肉毒杆菌毒素。“速效”肉毒杆菌毒素，例如E型。

Description

用于治疗的肉毒杆菌神经毒素

技术领域

本申请涉及神经毒素在治疗中的用途。

背景技术

美容或整形外科手术包括外科手术操作和非外科手术操作，它们可以增强和重塑身体结构，从而改善外貌和提高自信心。这些操作变得日益流行。

发明内容

本文公开了用于美容治疗的组合物和方法。例如，所公开的实施方案包括“速效(fast-acting)”肉毒杆菌毒素用于治疗，例如眉间纹(glabellar lines)的用途。

本文公开了用于使瘢痕最小化的组合物和方法。例如，所公开的实施方案包括使用“速效”肉毒杆菌毒素以减小伤口附近的肌肉张力，从而预防或减小瘢痕。

在实施方案中，减少了皮肤切口或撕裂处附近的肌肉活动，从而减小或预防疤痕的形成。

在实施方案中，所公开的方法包括其他美容操作方法。例如，所公开的实施方案包括将施用速效肉毒杆菌神经毒素与例如皮肤填充剂注射、眼部上提术(eye lift)、鼻整形术等相组合。

在实施方案中，肉毒杆菌毒素是“快速恢复”毒素。

在实施方案中，“速效”肉毒杆菌毒素也是“快速恢复”毒素。

在实施方案中，美容治疗可包括在初次施用之后进行肉毒杆菌补充施用。

在实施方案中，所公开的方法包括将速效肉毒杆菌神经毒素与例如较慢起效的神经毒素组合施用。

在实施方案中，所公开的方法包括将快速恢复的肉毒杆菌神经毒素与例如较慢恢复的神经毒素组合施用。

在实施方案中，神经毒素剂量以蛋白质的量表示。

附图说明

图1示出用于美容外科手术操作中的注射部位。

图2示出眉间纹治疗研究的主要功效。

图3示出眉间纹治疗研究的次要功效。

图4示出在术后疼痛的大鼠模型中，所公开的E型肉毒杆菌组合物的单次局部施用的疗效。

具体实施方式

本文公开的实施方案可以减少局部肌肉活动，从而减少美容缺陷的外貌或美容不规则物(cosmetic irregularities)，例如颜面纹。在实施方案中，美容不规则物可以包括眉间纹、前额纹、“兔子”纹、微笑不规则、下巴不规则、颈阔肌带(platysmal bands)、“木偶”纹、嘴唇纹、鱼尾纹、眉毛不规则、它们的组合等。

实施方案包括包含皮肤外科手术操作(例如治疗光化性角化病、脂溢性角化病、基底细胞癌、鳞状细胞癌和其他病变或皮下囊肿)的方法。

对于进行所公开的实施方案，有用的施用部位可以包括眉间复合体(glabellarcomplex)，包括皱眉肌(corrugator supercilli)和降眉间肌；眼轮匝肌(obicularisoculi)；眼轮匝肌的上外侧纤维；额部；鼻部；上唇方肌(1evator labii superiorisaleque nasi)；口轮匝肌(obicularis oris)；咬肌；降口角肌；和颈阅肌。在眉间纹治疗中有用的示例性注射部位如图1所示。

实施方案包括治疗严重的皱纹。

公开的实施方案可以包括治疗例如皮肤疾病，如痤疮等。公开的实施方案可以包括治疗炎性皮肤疾病。例如，公开的实施方案可以包括治疗银屑病、湿疹等。

本文公开的实施方案可减少局部肌肉活动，从而减少疤痕的形成，例如外科手术产生的疤痕。在实施方案中，外科手术可以包括整容手术，例如鼻整形术、眼部上提术、“肚子”除皱术等。在实施方案中，外科手术可以包括其他类型的医学操作，例如阑尾切除、器官移植等。在实施方案中，方法包括在伤口附近施用所公开的组合物。

本文公开的实施方案可以减少局部肌肉活动，从而减少疤痕的形成，例如由创伤产生的疤痕。例如，在创伤性损伤之后，公开的实施方案可包括在创伤(例如撕裂伤或截肢)附近施用公开的组合物。

对于进行所公开的实施方案，有用的施用部位可包括待减少肌肉活动的任何区域。例如，当与面部整容手术操作组合使用时，公开的实施方案可包括对下述部位施用：眉间复合体，包括皱眉肌和降眉间肌；眼轮匝肌；眼轮匝肌的上外侧纤维；额部；鼻部；上唇方肌；口轮匝肌；咬肌；降口角肌；和颈阔肌。

当与其他外科手术操作组合使用时，公开的实施方案可包括对例如手臂、腿、躯干等的肌肉进行施用。

公开的实施方案可以包括在操作之前准备外科手术部位的方法，以便减小切口附近的肌肉张力。

公开的实施方案可以促进例如弹性蛋白、胶原蛋白等的产生。公开的实施方案可以包括增加皮肤弹性的方法。

在实施方案中，本文公开的组合物可包含速效肉毒杆菌毒素，例如E型。

在实施方案中，本文公开的组合物可包含快速恢复肉毒杆菌毒素，例如E型。

在实施方案中，本文公开的组合物可包含速效的、快速恢复的肉毒杆菌毒素，例如E型。

定义：

“施用(administration)”或“施用(to administer)”是指向受试者给予(即施用)药物组合物或活性成分的步骤。本文公开的药物组合物可以通过许多合适的途径施用，但是如公开的方法中所述，所述组合物通过例如肌内施用途径(如通过注射或使用植入物)进行局部施用。

“肉毒杆菌毒素”或“肉毒杆菌神经毒素”是指由肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)衍生的野生型神经毒素，以及修饰、重组、杂合和嵌合的肉毒杆菌毒素。重组肉毒杆菌毒素可以具有由非-梭菌(Clostridial)属种重组制备的其轻链和/或重链。本文所用的“肉毒杆菌毒素”包括肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F、G和H。本文所用的“肉毒杆菌毒素”还包括肉毒杆菌毒素复合体(即300、600和900kDa的复合体)以及纯的肉毒杆菌毒素(即约150kDa的神经毒性分子)，所有这些都可用于实施本发明。“纯化的肉毒杆菌毒素”是指与其他蛋白质和杂质分离或基本分离的纯的肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌毒素复合体，所述蛋白质和杂质可伴有从培养或发酵方法中获得的肉毒杆菌毒素。因此，纯化的肉毒杆菌毒素可具有至少95％、更优选至少99％的非-肉毒杆菌毒素蛋白质和杂质被移除。

“生物相容性”是指在植入物的植入部位没有明显的炎症应答。

“梭菌神经毒素”是指由梭菌细菌例如肉毒梭菌、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)或贝氏梭菌(Clostridium beratti)制备或天然来源的神经毒素，以及由非梭菌属种重组产生的梭菌神经毒素。

“完全不含”(术语“由……组成”)是指在所用仪器或方法的检测范围内，无法检测到物质或无法确认其存在。

“基本上不含”是指在所用的仪器或方法的检测范围内，只能检测到痕量的物质。

如本文所用，“速效”是指与由例如A型肉毒杆菌神经毒素产生的效果相比，肉毒杆菌毒素在患者中更快地产生效果。例如，速效肉毒杆菌毒素的效果在36小时内可见。

如本文所用，“快速恢复”是指与由例如A型肉毒杆菌神经毒素产生的效果减小相比，肉毒杆菌毒素在患者中的效果减小更快速。例如，快速恢复的肉毒杆菌毒素的效果可以在以下时段内减小，例如120小时、150小时、300小时、350小时、400小时、500小时、600小时、700小时、800小时等。已知A型肉毒杆菌毒素的功效可最长达12个月。然而，肌内注射A型肉毒杆菌神经毒素的通常持续时间常常为约3至4个月。

如本文所用，“中效”是指肉毒杆菌毒素产生的效果比速效毒素产生的更慢。

“神经毒素”是指对神经元细胞表面受体具有特定亲和力的生物活性分子。神经毒素包括梭菌毒素，所述梭菌毒素为纯毒素以及与一种或多种非毒素、毒素相关蛋白复合的毒素。

“患者”是指接受医学护理或兽医护理的人类或非人类受试者。

“药物组合物”是指其中活性成分可以是肉毒杆菌毒素的制剂。术语“制剂”是指在药物组合物中，除了肉毒杆菌神经毒素活性成分以外，还存在至少一种其他成分(例如但不限于白蛋白[例如人血清白蛋白或重组人白蛋白]和/或氯化钠)。因此，药物组合物是适合于对受试者例如人类患者进行诊断、治疗或美容施用的制剂。所述药物组合物可以是：在冻干或真空干燥条件下，例如，将冻干或真空干燥的药物组合物用盐水或水复溶后形成的溶液，或；为不需要复溶的溶液。如上所述，药物组合物可以是液体或固体。药物组合物可以不含动物蛋白。

“基本上不含”是指以培养基、发酵培养基、药物组合物或评估其中物质重量百分比的其他材料的重量计，存在的量小于百分之一。

如本文所用，“补充施用”是指在最初施用神经毒素之后进行的肉毒杆菌施用。

“治疗制剂”是指可用于治疗并由此减轻其病症或疾病和/或与之相关的症状——例如特征在于外周肌肉活动性的病症或疾病——的制剂。

“治疗有效量”是指在不引起明显的消极副作用或不利副作用的情况下，治疗疾病、病症或病状所需的试剂(例如肉毒杆菌毒素或包含肉毒杆菌毒素的药物组合物)的水平、量或浓度。

“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指疾病、病症或病状的减轻或减少(其包括一定程度的减少、大幅度减少、近乎完全减少，和完全减少)、消除或预防(暂时或永久)，从而获得所期望的治疗或美容结果，例如通过使受伤或受损的组织愈合，或通过使现有或被感知的疾病、病症或病状得以改变、变化、增强、改善、改进和/或美化。

“单位”或“U”是指标准化为具有与市售A型肉毒杆菌神经毒素的单位等效的神经肌肉阻滞作用的活性BoNT的量。

神经毒素组合物

本文公开的实施方案包括神经毒素组合物，例如速效神经毒素组合物，如E型肉毒杆菌组合物。这样的神经毒素可以任何药学上可接受的形式配制成任何药学上可接受的制剂。神经毒素也可以任何制造商提供的任何药学上可接受的形式使用。

本文公开的实施方案包括神经毒素组合物，例如快速恢复的神经毒素组合物。这样的神经毒素可以任何药学上可接受的形式配制成任何药学上可接受的制剂。神经毒素也可以任何制造商提供的任何药学上可接受的形式使用。

本文公开的实施方案可包含多种神经毒素，例如，在实施方案中，所公开的组合物可包括两种类型的神经毒素，例如两种类型的肉毒杆菌神经毒素，例如速效和较慢起效的神经毒素，例如E型和A型。在实施方案中，所公开的组合物可包含肉毒杆菌神经毒素的片段，例如50kDa轻链(LC)。

神经毒素可以由梭菌细菌(例如肉毒梭菌、丁酸梭菌或贝氏梭菌细菌)制成。另外，神经毒素可以是修饰的神经毒素；即与天然或野生型神经毒素相比，其中至少一个氨基酸被去除、修饰或替换的神经毒素。此外，神经毒素可以是重组产生的神经毒素或其衍生物或片段。

在实施方案中，公开的E型组合物与A型相比具有40％的氨基酸同源性，并且它们共有相同的由2条链构成的基本结构域结构，所述2条链为通过二硫键连接的100kDa的重链(HC)和50kDa的轻链(LC)(Whelan 1992)。HC含有受体结合结构域和易位结构域，而LC含有突触体相关蛋白(SNAP)酶活性。域结构是所有肉毒杆菌神经毒素血清型共有的相同结构。

在公开的实施方案中，神经毒素被配制成单位剂型；例如，它可以在小瓶中的无菌溶液的形式提供，或以含有用于复溶合适媒介物(例如注射用盐水)的冻干粉的小瓶或囊剂形式提供。

在实施方案中，将肉毒杆菌毒素配制成含有盐水和巴氏灭菌的人血清白蛋白的溶液，其使毒素稳定并且通过非特异性吸附使损失最小化。可以将溶液无菌过滤(0.2μ过滤器)，装入单个小瓶中，然后真空干燥，得到无菌冻干粉末。在使用中，可以通过添加无菌的无防腐剂的生理盐水(注射用0.9％氯化钠)来复溶粉末。

在一个实施方案中，E型肉毒杆菌以5mL小瓶装注射用无菌溶液提供，其在pH 6.0下，标称浓度(nominal concentration)为20ng/mL于0.03M磷酸钠、0.12M氯化钠和1mg/mL人血清白蛋白(HSA)中。

在一个实施方案中，E型肉毒杆菌以5mL小瓶装注射用无菌溶液提供，其在pH 6.0下，标称浓度为10ng/mL于0.03M磷酸钠、0.12M氯化钠和1mg /mL HSA中。

在一个实施方案中，E型肉毒杆菌以5mL小瓶装注射用无菌溶液提供，其在pH 6.0下，标称浓度为5ng/mL于0.03M磷酸钠、0.12M氯化钠和1mg/mL HSA中。

在一个实施方案中，E型肉毒杆菌以5mL小瓶装注射用无菌溶液提供，其在pH 6.0下，标称浓度为1ng/mL于0.03M磷酸钠、0.12M氯化钠和1mg/mL HSA中。

尽管所述组合物可以仅包含单一类型的神经毒素，例如E型肉毒杆菌，但所公开的组合物可包含两种或更多种类型的神经毒素，其可以提供对病症的增强的治疗效果。例如，向患者施用的组合物可以包括A型和E型肉毒杆菌。施用包含两种不同神经毒素的单一组合物可以使每种神经毒素的有效浓度低于向患者施用单一神经毒素的同时仍然实现所需治疗效果的有效浓度。向患者施用的组合物也可包含与一种神经毒素或多种神经毒素组合的其他药学活性成分，例如蛋白受体或离子通道调节剂。这些调节剂可能有助于减少多种神经元之间的神经传递。例如，组合物可以包含增强由GABA_A受体介导的抑制作用的γ氨基丁酸(GABA)A型受体调节剂。GABA_A受体通过有效地分流细胞膜上的电流来抑制神经活动。GABA_A受体调节剂可增强GABA_A受体的抑制作用并且减少神经元的电信号传递或化学信号传递。GABA_A受体调节剂的实例包括苯二氮卓类(benzodiazepines)，例如地西泮(diazepam)、奥沙西泮(oxaxepam)、劳拉西泮(lorazepam)、普拉西泮(prazepam)、阿普唑仑(alprazolam)、哈拉西泮(halazeapam)、氯氮平(chordiazepoxide)和二甲氯氮卓(chlorazepate)。组合物还可以包含减少由谷氨酸受体介导的兴奋作用的谷氨酸受体调节剂。谷氨酸受体调节剂的实例包括抑制穿过AMPA、NMDA和/或红藻氨酸盐类型的谷氨酸受体的电流的试剂。所述组合物还可包含调节多巴胺受体的试剂(例如抗精神病药)、调节去甲肾上腺素受体的试剂和/或调节5-羟色胺受体的试剂。所述组合物还可包含影响通过电压门控的钙通道、钾通道和/或钠通道的离子通量的试剂。因此，在公开的实施方案中使用的组合物，除了包含可以减少神经传递的离子通道受体调节剂之外，还可以包含一种或多种神经毒素，例如肉毒杆菌毒素。

使用方法

本文公开的方法可以包括向患者施用速效神经毒素。在一个优选的实施方案中，神经毒素是E型肉毒杆菌。

本文公开的方法可以包括向患者施用快速恢复的神经毒素。在一个优选的实施方案中，神经毒素是E型肉毒杆菌。

在施用本文公开的组合物之前，仔细考虑治疗部位的解剖结构。例如，在实施方案中，治疗目标是注射神经肌肉接头浓度最高的区域(如果已知的话)。例如，在肌内施用的情况下，在注射肌肉之前，可以通过使肌肉在其运动范围内通过并且观察针头的由此产生的运动来确认针在肌肉中的位置。根据患者的年龄、待注射部位的数量以及患者的具体需要，使用全身麻醉、局部麻醉和镇静。为了达到期望的结果，可能需要超过一次的注射和/或注射部位。另外，根据待注射的肌肉，某些注射可能需要使用由肌电图引导的细的空心

涂层针。

所公开的组合物的施用可以包括，例如注射至以下一个或多个骨骼肌或其附近，例如枕额肌(occipitofrontalis)、鼻肌(nasalis)、口轮匝肌(orbicularis oris)、降口角肌(depressor anguli oris)、颈阔肌(platysma)、胸骨舌骨肌(sternohyoid)、前锯肌(serratus anterior)、腹直肌(rectus abdominis)、腹外斜肌(external oblique)、阔筋膜张肌(tensor fasciae latae)、肱桡肌(brachioradialis)、髂肌(lliacus)、腰大肌(psoas major)、耻骨肌(pectineus)、长收肌(adductor longus)、缝匠肌(sartorius)、股薄肌(gracillis)、股外侧肌(vastus lateralis)、股直肌(rectus femoris)、股内侧肌(vastus medialis)、股四头肌的腱(tendon of quadriceps femoris)、髌骨(patella)、腓肠肌(gastroctnemius)、比目鱼肌(soleus)、胫骨(tibia)、腓骨长肌(fibularis longus)、胫骨前肌(tibialis anterior)、髌韧带(patellar ligament)、髂胫束(iliotibialtract)、小鱼际肌(hypothenar muscles)、鱼际肌(thenar muscles)、尺侧腕屈肌(flexorcarpi ulnaris)、指浅屈肌(flexor digitorum superficialis)、掌长肌(palmarislongus)、桡腕屈肌(flexor carpi radials)、肱桡肌(brachioradialis)、旋前圆肌(pronator teres)、肱肌(brachialis)、肱二头肌(biceps brachii)、肱三头肌(tricepsbrachii)、胸大肌(pectoralis major)、三角肌(deltoid)、斜方肌(trapezius)、胸锁乳突肌(sternocleidomastoid)、咬肌(masseter)、眼轮匝肌(orbicularis oculi)、颞肌(temporalis)、颅顶腱膜(epicranial aponeurosis)、大圆肌(teres major)、指伸肌(extensor digitorum)、尺侧腕伸肌(extensor carpi ulnaris)、肘肌(anconeus)、外展拇指长肌(abductor policis longus)、跖肌(plantaris)、跟腱(calcanel tendon)、比目鱼肌(soleus)、大收肌(adductor magnus)、股大肌(gluteus maximas)、臀中肌(gluteusmedius)、背阅肌(latissimus dorsi)、棘下肌(intraspinatus)以及它们的组合等。

所公开的组合物的施用可以包括，例如注射至以下一种或多种神经或其附近，例如腋神经(axillary nerve)、膈神经(phrenic nerve)、脊神经节(spinal ganglion)、脊髓(spinal cord)、交感神经节链(sypathetic ganglia chain)、阴部神经(pudendalnerve)、指掌侧总神经(common palmar digital nerve)、尺神经(ulnar nerve)、尺神经的深支(deep branch of the ulnar nerve)、坐骨神经(sciatic nerve)、腓神经(peronealnerve)、胫神经(tibial nerve)、隐神经(saphenous nerve)、骨间神经(interosseousnerve)、腓浅神经(superficial peroneal nerve)、中间背皮神经(intermediate dorsalcutaneous nerve)、足底内侧神经(medial plantar nerve)、背内侧皮神经(medialdorsal cutaneous nerve)、腓深神经(deep peroneal nerve)、胫神经的肌支(muscularbranchesof tibial nerve)、隐神经的髌内支(intrapatellar branch of saphenousnerve)、腓总神经(common peroneal nerve)、股神经的肌支(muscular branch offemoral nerve)、股神经的前皮支(anterior cutaneous branches of femoral nerve)、坐骨神经的肌支(muscular branches of sciatic nerve)、股神经(femoral nerve)、iliolinguinal、终丝(filum terminate)、髂下腹(iliohypogastric)、闭孔神经(obturator)、尺骨(ulnar)、桡骨(radial)、闭孔神经(obturator)、桡骨(radial)、肋骨下(subcostal)、肋间(intercostal)、肋间的背侧支(dorsal branches of theintercostal)、肋间的内侧皮支(medial cutaneous branches of the intercostal)、黏膜与皮肤的(musculaneous)、三角肌(deltoid)、迷走神经(vagus)、臂丛(brachialplexus)、锁骨上(supraclavicular)、面部(facial)、耳颞(auriculotemporal)以及它们的组合等。

适合于施用所公开的组合物的平滑肌可以包括以下的任一种：血管壁、胃壁、输尿管、肠、主动脉(血管中膜层)、眼虹膜、前列腺、胃肠道、呼吸道、小动脉(small arteries)、微动脉(arterioles)、生殖道(两性)、静脉、肾脏的肾小球(称为肾小球系膜细胞)、膀胱、子宫、皮肤的毛肌、睫状肌、括约肌、气管、胆管等。

在所公开的方法下的注射频率和注射量可以基于所治疗的具体区域的性质和位置来确定。但是，在某些情况下，可能需要重复注射或补充注射以获得最佳结果。在每种具体情况下的注射频率和注射量可以由本领域普通技术人员确定。

在实施方案中，速效神经毒素的施用在外科手术操作之前进行。在实施方案中，施用在以下时间进行，例如手术前36小时内、手术前24小时内、手术前22小时内、手术前20小时内、手术前18小时内、手术前16小时内、手术前14小时内、手术前12小时内、手术前11小时内、手术前10小时内、手术前9小时内、手术前8小时内、手术前7小时内、手术前6小时内、手术前5小时内、手术前4小时内、手术前3小时内、手术前2小时内、手术前60分钟内、手术前50分钟内、手术前40分钟内、手术前30分钟内、手术前20分钟内、手术前10分钟内、手术前5分钟内、手术前2分钟内等。

在实施方案中，速效神经毒素的施用在外科手术操作之前进行。在实施方案中，施用在以下时间进行，例如在手术前至少36小时、手术前至少24小时、手术前至少22小时、手术前至少20小时、手术前至少18小时、手术前至少16小时、手术前至少14小时、手术前至少12小时、手术前至少11小时、手术前至少10小时、手术前至少9小时、手术前至少8小时、手术前至少7小时、手术前至少6小时、手术前至少5小时、手术前至少4小时、手术前至少3小时、手术前至少2小时、手术前至少60分钟、手术前至少50分钟、手术前至少40分钟、手术前至少30分钟、手术前至少20分钟、手术前至少10分钟、手术前至少5分钟、手术前至少2分钟等。

在实施方案中，速效神经毒素的施用与外科手术操作同时进行。

在实施方案中，速效神经毒素的施用在外科手术操作之后进行。例如，施用可以在以下时间进行：手术后1分钟内、手术后2分钟内、手术后3分钟内、手术后4分钟内、手术后5分钟内、手术后6分钟内、手术后7分钟内、手术后8分钟内、手术后9分钟内、手术后10分钟内、手术后20分钟内、手术后30分钟内、手术后40分钟内、手术后50分钟、手术后60分钟内、手术后90分钟内、手术后2小时内、手术后3小时内、手术后4小时内、手术后5小时内、手术后6小时内、手术后7小时内、手术后8小时内、手术后9小时内、手术后10小时内、手术后11小时内、手术后12小时内等。

本文公开的方法可以包括，在初次施用后，向患者补充施用速效神经毒素。包括补充施用的实施方案可以进一步包括，医生或患者对于先前的神经毒素施用的结果的评估。这样的评估可以包括使用例如照片、扫描等。

在实施方案中，神经毒素的初次施用的结果的评估可以在以下时间进行：例如，初次施用的6小时内、初次施用的8小时内、初次施用的10小时内、初次施用的12小时内、初次施用的14小时内、初次施用的16小时内、初次施用的18小时内、初次施用的24小时内、初次施用的30小时内、初次施用的36小时内、初次施用的42小时内、初次施用的48小时内、初次施用的54小时内、初次施用的60小时内、初次施用的66小时内、初次施用的72小时内、初次施用的78小时内、初次施用的84小时内、初次施用的90小时内、初次施用的96小时内、初次施用的102小时内、初次施用的108小时内、初次施用的114小时内、初次施用的120小时内、初次施用的1周内、初次施用的2周内、初次施用的3周内、初次施用的4周内、初次施用的5周内、初次施用的6周内、初次施用的7周内、初次施用的8周内、初次施用的9周内、初次施用的10周内、初次施用的11周内、初次施用的12周内等。

在包括补充施用的实施方案中，补充剂量的施用可以在以下时间进行：例如，评估的6小时内、评估的8小时内、评估的10小时内、评估的12小时内、评估的14小时内、评估的16小时内、评估的18小时内、评估的24小时内、评估的30小时内、评估的36小时内、评估的42小时内、评估的48小时内、评估的54小时内、评估的60小时内、评估的66小时内、评估的72小时内、评估的78小时内、评估的84小时内、评估的90小时内、评估的96小时内、评估的102小时内、评估的108小时内、评估的114小时内、评估的120小时内、评估的1周内、评估的2周内、评估的3周内、评估的4周内、评估的5周内、评估的6周内、评估的7周内、评估的8周内、评估的9周内、评估的10周内、评估的11周内、评估12周内等。

在实施方案中，补充施用可以例如在以下时间进行：例如，初次施用的6小时内、初次施用的8小时内、初次施用的10小时内、初次施用的12小时内、初次施用的14小时内、初次施用的16小时内、初次施用的18小时内、初次施用的24小时内、初次施用的30小时内、初次施用的36小时内、初次施用的42小时内、初次施用的48小时内、初次施用的54小时内、初次施用的60小时内、初次施用的66小时内、初次施用的72小时内、初次施用的78小时内、初次施用的84小时内、初次施用的90小时内、初次施用的96小时内、初次施用的102小时内、初次施用的108小时内、初始施用的114小时内、初次施用的120小时内、初次施用的1周内、初次施用的2周内、初次施用的3周内、初次施用的4周内、初次施用的5周内、初次施用的6周内、初次施用的7周内、初次施用的8周内、初次施用的9周内、初次施用的10周内、初次施用的11周内、初次施用的12周内等。

本文公开的方法可以提供快速起效的效果(例如，使用速效神经毒素)。例如，所公开的实施方案可以在以下时段内提供可见的美容效果：例如，施用后30分钟内、施用后45分钟内、施用后60分钟内、施用后75分钟内、施用后90分钟内、施用后2小时内、施用后3小时内、施用后4小时内、施用后5小时内、施用后6小时内、施用后7小时内、施用后8小时内、施用后9小时内、施用后10小时内、施用后11小时内、施用后12小时内、施用后13小时内、施用后14小时内、施用后15小时内、施用后16小时内、施用后17小时内、施用后18小时内、施用后19小时内、施用后20小时内、施用后21小时内、施用后22小时内、施用后23小时内、施用后24小时内、施用后30小时内、施用后36小时内、施用后42小时内、施用后48小时内、施用后3天内、施用后4天内、施用后5天内、施用后6天内、施用后7天内、施用后8天内、施用后9天内、施用后10天内、施用后11天内、施用后12天内等。

本文公开的方法可以提供较短范围的效果(例如，使用快速恢复的神经毒素)。例如，所本公开的实施方案可以提供在以下时间内减退的可见的美容效果：例如，施用后3天内、施用后4天内、施用后5天内、施用后6天内、施用后7天内、施用后8天内、施用后9天内、施用后10天内、施用后11天内、施用后12天内、施用后13天内、施用后14天内、施用后15天内、施用后16天内、施用后17天内、施用后18天内、施用后19天内、施用后20天内、施用后21天内、施用后22天内、施用后23天内、施用后24天内、施用后25天内、施用后26天内、施用后27天内、施用后28天内、施用后29天内、施用后30天内、施用后45天内、施用后60天内、施用后75天内、施用后90天内、施用后105天内等。

副作用可能与肉毒杆菌注射有关。与常规神经毒素治疗相比，所公开的实施方案可以提供产生更少的副作用或副作用持续时间更短的神经毒素治疗。

例如，所公开的实施方案可以导致以下情况更少发生(或持续时间更短)：复视或视力模糊、眼睑麻痹(受试者不能完全睁开眼睑)、面部肌肉运动丧失、声音嘶哑、失去膀胱控制力、呼吸急促、吞咽困难、说话困难、死亡等。

本发明的方法特别适合于治疗美容不规则物，其通常是老化、环境暴露、体重减轻、生育、受伤、手术或其组合的结果。老化和环境暴露通常会在皮肤的不同部位产生皱纹。另一方面，体重减轻和生育通常会在皮肤的多个位置产生妊娠纹，尤其是在胃部、下半身区域和腿部。受伤和外科手术通常会在受伤和手术区域产生疤痕。适用于通过所公开的方法进行治疗的具体的外形缺陷包括但不限于皱眉纹、忧虑纹、皱纹、鱼尾纹、木偶纹、妊娠纹、伤口、意外伤害、叮咬、外科手术等。特别适合于本发明治疗的是例如眼睛、脸颊、鼻子、嘴唇、前额和颈部的区域的外形缺陷。

此外，所公开的实施方案可以为患者提供更确定的持续时间的美容结果。例如，使用更长效的神经毒素，在效果的持续时间中的20％差异可导致有效持续时间相差一个月。使用所公开的快速恢复的神经毒素，这种20％的差异在有效持续时间上产生的差异并不明显。

速效神经毒素的补充施用可以有效地改进或增强先前的美容神经毒素施用。例如，本文公开的方法可以包括补充施用，与使用非速效的神经毒素所实现的结果相比，该补充施用矫正先前施用的不平坦的美容结果，或增加先前施用的美容效果，或加速结果的起效。

所公开的速效神经毒素组合物可以使用针或无针装置来施用。在某些实施方案中，该方法包括将组合物皮下注射到个体中。例如，施用可包括通过不大于约30号规格的针注射组合物。在某些实施方案中，该方法包括施用包含E型肉毒杆菌毒素的组合物。

组合物的注射可以通过注射器、导管、针和其他注射手段进行。注射可以在需要治疗的哺乳动物身体的任何区域上进行，包括但不限于面部、颈部、躯干、手臂、手、腿和足。注射可以在特定区域的任何位置，例如表皮、真皮、脂肪、肌肉或皮下层。

在所公开的方法下的注射频率和注射量可以基于所治疗的具体的美容不规则物的性质和位置来确定。但是，在某些情况下，可能需要重复注射以获得最佳结果。每种具体情况下的注射频率和注射量可以由本领域普通技术人员确定。

尽管提供了施用途径和剂量的实例，但是合适的施用途径和剂量通常由主治医生根据具体情况确定。对于本领域普通技术人员而言，这种确定是常规的。例如，本发明公开的梭菌神经毒素的施用途径和剂量可以基于标准(例如所选择的神经毒素的溶解度特性以及所治疗的美容状况的强度和范围)来进行选择。

速效神经毒素的施用量可以为约10^-3U/kg体重至约35U/kg体重。在一个实施方案中，神经毒素的施用量为约10^-2U/kg至约25U/kg。在另一个实施方案中，神经毒素的施用量为约10^-1U/kg至约15U/kg。在另一个实施方案中，神经毒素的施用量为约1U/kg至约10U/kg。在许多情况下，施用约1单位至约500单位的神经毒素，例如E型肉毒杆菌，提供有效的治疗性缓解。在一个实施方案中，可以使用约5单位至约200单位的神经毒素，例如E型肉毒杆菌；在另一个实施方案中，可以将约10单位至约100单位的神经毒素，例如E型肉毒杆菌，局部施用到靶组织例如肌肉中。

在实施方案中，施用可包含以下剂量的神经毒素：约4单位的神经毒素，或约5单位的神经毒素，或约6单位的神经毒素，或约7单位的神经毒素，或约8单位的神经毒素，或约10单位神经毒素，或约15单位神经毒素，或约20单位神经毒素，或约30单位神经毒素，或约40单位神经毒素，或约50单位神经毒素，或约60单位神经毒素，或约70单位神经毒素，或约80单位神经毒素，或约90单位神经毒素，或约100单位神经毒素，或约110单位神经毒素，或约120单位神经毒素，或约130单位神经毒素，或约140单位神经毒素，或约150单位神经毒素，或约160单位神经毒素，或约170单位神经毒素，或约180单位神经毒素，或约190单位神经毒素，或约200单位神经毒素，或约210单位神经毒素，或约220单位神经毒素，或约230单位神经毒素，或约240单位神经毒素，或约250单位神经毒素，或约260单位神经毒素，或约270单位神经毒素，或约280单位神经毒素，或约290单位神经毒素，或约290单位神经毒素，或约300单位神经毒素，或约310单位神经毒素，或约320单位神经毒素，或约330单位神经毒素，或约340单位神经毒素，或约350单位神经毒素，或约360单位神经毒素，或约370单位神经毒素，或约380单位神经毒素，或约390单位神经毒素，或约400单位神经毒素，或约410单位神经毒素，或约420单位神经毒素，或约430单位神经毒素，或约440单位神经毒素，或约450单位神经毒素，或约460单位神经毒素，或约470单位神经毒素，或约480单位神经毒素，或约490单位神经毒素，或约500单位神经毒素等。

在实施方案中，施用可包含以下剂量的E型肉毒杆菌神经毒素：约4单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约5单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约6单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约7单位肉毒杆菌E型剂量，或约8单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约10单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约15单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约20单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约30单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约40单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约50单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约60单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约70单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约80单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约90单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约100单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约110单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约120单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约130单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约140单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约150单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约160单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约170单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约180单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约190单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约200单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约210单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约220单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约230单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约240单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约250单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约260单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约270单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约280单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约290单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约290单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约300单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约310单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约320单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约330单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约340单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约350单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约360单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约370单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约380单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约390单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约400单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约410单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约420单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约430单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约440单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约450单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约460单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约470单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约480单位E型肉毒杆菌神经毒素，或约490单位E型肉毒杆菌毒素，或约500单位E型肉毒杆菌神经毒素等。

本文公开了表达神经毒素剂量和传递神经毒素剂量的方法。在实施方案中，剂量以蛋白质的量表示，例如纳克(ng)。在实施方案中，神经毒素可包含肉毒杆菌毒素。

本文公开的方法可包括向患者施用神经毒素，例如速效神经毒素，其中神经毒素的剂量以蛋白质的量表示，例如每次施用的蛋白质的量。在一个实施方案中，速效神经毒素是肉毒杆菌毒素，例如E型肉毒杆菌。

在实施方案中，神经毒素的剂量以蛋白质的量或浓度表示。例如，在实施方案中，神经毒素的施用量可以是约.2ng至20ng。在一个实施方案中，将神经毒素以下述量施用至目标组织，例如肌肉：约.3ng至19ng、约.4ng至18ng、约.5ng至17ng、约.6ng至16ng、约.7ng至约15ng、约.8ng至14ng、约.9ng至13ng、约1.0ng至12ng、约1.5ng至11ng、约2ng至10ng、约5ng至7ng等。

在实施方案中，施用可包含的总剂量为5至7ng、7至9ng、9至11ng、11至13ng、13至15ng、15至17ng、17至19ng等。

在实施方案中，施用可包含的总剂量为至多5ng、至多6ng、至多7ng、至多8ng、至多9ng、至多10ng、至多11ng、至多12ng、至多13ng、至多14ng、至多15ng、至多16ng、至多17ng、至多18ng、至多19ng、至多20ng等。

在实施方案中，施用可包含的总剂量为至少5ng、至少6ng、至少7ng、至少8ng、至少9ng、至少10ng、至少11ng、至少12ng、至少13ng、至少14ng、不少于15ng、至少16ng、至少17ng、至少18ng、至少19ng、至少20ng等。

在实施方案中，施用可包含的神经毒素的总剂量为如下：0.1ng神经毒素、0.2ng神经毒素、0.3ng神经毒素、0.4ng神经毒素、0.5ng神经毒素、0.6ng神经毒素、0.7ng神经毒素、0.8ng神经毒素、0.9ng神经毒素、1.0ng神经毒素、1.1ng神经毒素、1.2ng神经毒素、1.3ng神经毒素、1.4ng神经毒素、1.5ng神经毒素、1.6ng神经毒素、1.7ng神经毒素、1.8ng神经毒素、1.9ng神经毒素、2.0ng神经毒素、2.1ng神经毒素、2.2ng神经毒素、2.3ng神经毒素、2.4ng神经毒素、2.5ng神经毒素、2.6ng神经毒素、2.7ng神经毒素、2.8ng神经毒素、2.9ng神经毒素、3.0ng神经毒素、3.1ng神经毒素、3.2ng神经毒素、3.3ng神经毒素、3.4ng神经毒素、3.5ng神经毒素、3.6ng神经毒素、3.7ng神经毒素、3.8ng神经毒素、3.9ng神经毒素、4.0ng神经毒素、4.1ng神经毒素、4.2ng神经毒素、4.3ng神经毒素、4.4ng神经毒素、4.5ng神经毒素、5ng神经毒素、6ng神经毒素、7ng神经毒素、8ng神经毒素、9ng神经毒素、10ng神经毒素、11ng神经毒素、12ng神经毒素、13ng神经毒素、14ng神经毒素、15ng神经毒素、16ng神经毒素、17ng神经毒素、18ng神经毒素、19ng神经毒素、20ng神经毒素等。

在实施方案中，施用可包括每次注射的剂量如下：例如，约0.1ng E型肉毒杆菌神经毒素、0.2ng E型肉毒杆菌神经毒素、0.3ng E型肉毒杆菌神经毒素、0.4ng E型肉毒杆菌神经毒素、0.5ng E型肉毒杆菌神经毒素、0.6ng E型肉毒杆菌神经毒素、0.7ng E型肉毒杆菌神经毒素、0.8ng E型肉毒杆菌神经毒素、0.9ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.0ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.1ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.2ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.3ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.4ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.5ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.6ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.7ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.8ng E型肉毒杆菌神经毒素、1.9ng E型肉毒杆菌神经毒素、2.0ng E型肉毒杆菌神经毒素、2.1ng E型肉毒杆菌神经毒素、2.2ngE型肉毒杆菌神经毒素、2.3ng E型肉毒杆菌神经毒素、2.4ng神经毒素、2.5ng神经毒素、2.6ng E型肉毒杆菌神经毒素、2.7ng E型肉毒杆菌神经毒素、2.8ng E型肉毒杆菌神经毒素、2.9ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.0ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.1ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.2ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.3ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.4ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.5ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.6ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.7ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.8ng E型肉毒杆菌神经毒素、3.9ng E型肉毒杆菌神经毒素、4.0ng E型肉毒杆菌神经毒素、4.1ng E型肉毒杆菌神经毒素、4.2ng E型肉毒杆菌神经毒素、4.3ng E型肉毒杆菌神经毒素、4.4ng E型肉毒杆菌神经毒素、4.5ng E型肉毒杆菌神经毒素、5ng E型肉毒杆菌神经毒素、6ng E型肉毒杆菌神经毒素、7ng E型肉毒杆菌神经毒素、8ng E型肉毒杆菌神经毒素、9ng E型肉毒杆菌神经毒素、10ng E型肉毒杆菌神经毒素，等。

然而，最终，毒素的施用量及其施用频率将由负责治疗的医师酌情决定，并且根据安全性和毒素产生的效果而定。可以在本文所述的实施方案中使用控释系统，以在特定时间段内以预定速率在体内递送神经毒素。通常，释放速率由系统的设计确定，并且可在很大程度上与环境条件(例如pH)无关。可以在几年内递送药物的控释系统是已知的。相反地，持续性释放系统通常在24小时或更短的时间内递送药物，并且环境因素可影响释放速率。因此，神经毒素从植入的控释系统(“植入物”)中的释放速率随载体植入物材料和药物本身的物理化学性质而变化。通常，植入物由惰性材料制成，该惰性材料很少或根本不会引起宿主反应。

控释系统可以包括掺入载体中的神经毒素。载体可以是聚合物或生物-陶瓷材料。可以将控释系统注射、插入或植入患者身体的选定位置，并且在其中停留较长的时间，在此期间，神经毒素被植入物以提供所需治疗功效的方式和浓度释放。

聚合材料可由于扩散、化学反应或溶剂活化以及受到磁、超声或温度变化因素的影响而释放神经毒素。扩散可以来自容器或基质。化学控制可以归因于聚合物降解或药物从聚合物中的裂解。溶剂活化可包括聚合物溶胀或渗透作用。

植入物可以通过将所需量的稳定化的神经毒素混入溶于二氯甲烷中的合适的聚合物的溶液中来制备。该溶液可以在室温下制备。然后可以将溶液转移到陪替培养皿中，并在真空干燥器中蒸发二氯甲烷。根据所需的植入物尺寸以及因此掺入的神经毒素的量，将合适量的经干燥的掺有神经毒素的植入物在模具中在约8000p.s.i下压缩5秒钟或在3000p.s.i.下压缩17秒钟，以形成包封神经毒素的植入盘。

优选地，所使用的植入物材料是基本上无毒的、非致癌的且非免疫原性的。合适的植入物材料包括聚合物，例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(p-HEMA)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(p-NVP)+、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PM)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、乙烯-乙酸乙烯酯(EVAc)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮/丙烯酸甲酯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚酐、聚(原酸酯)、胶原蛋白和纤维素衍生物以及生物陶瓷、例如羟基磷灰石(HPA)、磷酸三钙(TCP)和磷酸铝钙(ALCAP)。乳酸、乙醇酸和胶原蛋白可用于制造可生物降解的植入物。

植入物材料可以是可生物降解的或可生物蚀解的。可生物蚀解的植入物的优点是不需要将其从患者中移除。可生物蚀解的植入物可以基于生物活性物质的膜或基质释放。已知由PLA-PGA制备的可生物降解的微球用于皮下或肌内施用。

本公开内容还包括用于实施所公开的实施方案的试剂盒。该试剂盒可以包括30号规格或更小的针和相应的注射器。该试剂盒还包括梭菌神经毒素组合物，例如E型肉毒杆菌毒素组合物。可以在注射器中提供神经毒素组合物。该组合物可通过针注射。根据注射器和针的大小以及其中含有的可注射组合物的体积，将试剂盒设计成各种形式，这又基于设计试剂盒以用于治疗的具体的美容缺陷。

实施例

提供以下非限制性实施例仅出于说明性目的，以便于更完整地理解代表性实施方案。该实施例不应被解释为限制本说明书中描述的任何实施方案。

实施例1

E型肉毒杆菌毒素治疗眉间纹(GL)的用途

这项首次在人类中进行的随机、双盲、安慰剂对照、递增剂量的队列研究招募了42名受试者，使这些受试者接受EB-001(本文公开的E型肉毒杆菌组合物)(N＝35)或安慰剂(N＝7)。功效的主要结果是在最大皱眉时，GL严重程度得到研究者评定的2级(IR-2)改善的受试者的比例。安全性评估包括不良事件(AE)、实验室测试和身体检查。从第三组队列(EB-001)开始观察到IR-2应答，并且在较高剂量下观察到应答率增加。在最高剂量下，临床效果在24小时内起效，持续14到30天。AE发生率低，最常见的是轻度至中度头痛。没有严重的AE或上睑下垂，在其他安全性评估中也没有临床上的重大改变。

在这项GL的临床研究中，EB-001显示出良好的安全性和耐受性，以及在最高剂量下应答率为80％的剂量依赖性功效。EB-001最大临床效果在24小时内可见，并持续14至30天。这种可区分的EB-001特性(profile)支持其开发用于美容和治疗应用，在这些应用中快速起效且效果持续时间短是合乎需要的。

肉毒杆菌神经毒素，其抑制乙酰胆碱的突触前释放，是自然界中最具潜力的分子之一。在将肉毒杆菌神经毒素注射到肌肉中时，它会抑制神经肌肉传递并产生剂量依赖性局部肌肉松弛。纯化的肉毒杆菌神经毒素(包括血清型A和B)已经被开发为可注射药物，并且广泛地用于治疗多种神经肌肉疾病。肉毒杆菌神经毒素血清型E是迄今为止尚未被开发用于临床使用的新的血清型。E型肉毒杆菌毒素在所有肉毒杆菌神经毒素中是起效最快且作用持续时间最短的。E型具有与A型相似的结构域结构，由2条蛋白链(通过二硫键相连的100kDa重链和50kDa轻链)组成。E型通过裂解与A型相同的突触前囊泡蛋白(突触体相关蛋白25)而抑制神经肌肉传递，但在不同的裂解位点。运动轴突上的两个结合位点介导肉毒杆菌神经毒素对神经细胞的高亲和力识别。结合首先由细胞表面神经节苷脂介导，然后由特定的蛋白质受体介导。这些受体存在于神经肌肉接头处运动轴突末端上。已表明，A型和E型肉毒杆菌毒素都结合特异性受体突触囊泡蛋白2，并且仅这两种血清型共用该受体。这是评估递增剂量的E型肉毒杆菌毒素在GL受试者中的安全性和功效的首次临床研究。

这项研究是对EB-001的安全性和功效进行的首次人类内评估，致力于中度至重度GL的治疗。EB-001是E型肉毒杆菌毒素的专有纯化形式，被配制为注射液(Bonti，Inc.，Newport Beach，California，USA)。这是在2个专家临床中心(Steve Yoelin，MD MedicalAssociates，Newport Beach，California，USA；Center for Dermatology ClinicalResearch，Fremont，California，USA)进行的随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增的队列研究。这项研究已获得机构审查委员会(Institutional Review Board)(AspireInstitutional Review Board，Santee，California，USA)批准，并根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)确定的指导方针进行。在所有受试者参与之前均已收到他们的书面知情同意书。

这项研究共招募42名健康的无毒素(toxin-

)男性和女性受试者，年龄为18至60岁。每名受试者的参与持续约6周。纳入的主要标准是：在最大皱眉时出现中度至重度的双侧对称GL；在不使用眼镜(可以使用隐形眼镜)的情况下具有足够的视力清晰度以准确评估其面部皱纹；以及符合研究要求的能力。排除的主要标准是：任何不受控制的全身性疾病或其他医学状况，任何可能使受试者暴露于肉毒杆菌神经毒素时处于风险增加的医学状况(包括确诊的重症肌无力、Eaton-Lambert综合征、肌萎缩侧索硬化或任何干扰神经肌肉功能的其他状况)，当前的或先前的肉毒杆菌神经毒素治疗，已知的对于肉毒杆菌神经毒素的免疫或超敏反应，在研究的3至12个月内的预先指定的皮肤病学操作(非烧蚀性表面重修、面部美容操作、局部/口服类维生素A疗法等)，以及先前的眶周手术或治疗。女性如果已怀孕、正在哺乳或计划怀孕，则不会招募。对于具有生育能力的女性伴侣的男性，只有他们同意在服药后三个月内使用双重避孕方法，才会被招募。

在筛查时，记录受试者的人口统计资料、病史以及先前和伴随的药物，并进行酒精/药物筛查。在治疗前的基线和贯穿至研究结束的每次随访中，均进行标准化的面部摄影，但是并未将这些照片用于功效评估。

招募了七组队列(每组队列有6个受试者)并使其以5∶1的比例接受递增剂量的EB-001或安慰剂。在这项首次人类内研究中推荐的最大起始剂量(具有10倍安全系数)是基于来自临床前安全性和毒性研究(未发表的数据)中的未观察到不良反应的水平而制定的。据此，计算出基础剂量(队列1)并将其确定为亚有效的，队列2至7分别接受基础剂量的3倍、9倍、12倍、16倍、21倍和28倍。这代表EB-001的亚有效剂量至最大有效剂量。全部的剂量以标准方式在5个注射位点等体积(以每个位点0.1mL注射到降眉间肌、左内侧皱眉肌、右内侧皱眉肌、左外侧皱眉肌、右外侧皱眉肌)递送(见图1)。注射到外侧皱眉肌的间距在眉弓上方约1cm处。EB-001是以在5mL小瓶中的无菌注射溶液的形式提供的。安慰剂以在相同的小瓶中，但不含EB-001的形式提供。

每个受试者在筛选(第-30天至第-1天)时，基线/注射(第0天)时，第1、2、7、14和30天(研究结束)时和第42天(最终安全随访)时完成访视。

通过不良事件(AE)、实验室测试、心电图(ECG)、身体检查、生命体征(脉搏率、呼吸频率和血压)、尿液妊娠试验(针对有生育能力的妇女)和集中的神经系统检查进行安全性评估，以评价肉毒杆菌神经毒素的潜在蔓延性。将治疗后出现的不良事件(TEAE)定义为在暴露于研究治疗之后，严重程度开始或恶化的任何不良事件。使用《监管活动医学词典》(Medical Dictionary for Regulatory Activities)(MedDRA，版本19.0)按照系统器官类别和首选术语汇总AE和TEAE。还评估了严重的AE(SAE或满足医学严重性监管标准的AE)以及由于AE而导致的停药。AE的严重性记录为轻度、中度、重度或威胁生命。在每个剂量队列加入之前，安全数据审查委员会开会分析了先前队列的所有安全数据。

在筛选、基线以及第1、2、7、14和30天时，使用面部皱纹量表(FWS)评估受试者在最大皱眉和休息时的GL。由研究者和受试者完成评估。FWS是一种被广泛认可的用于评估颜面线严重性的量度。在本研究中，表明GL严重性的4分制如下：0＝无，1＝轻度，2＝中度，3＝重度。如果受试者根据研究者的FWS评估至少获得了2级改进(降低)(IR-2)，则被视为治疗应答者。主要的功效变量是在基线访视后至第30天的任何时间，在最大皱眉时的IR-2应答者的比例。另一个感兴趣的功效终点是在第1、2、7、14或30天时达到研究者评估的FWS等级为零或轻度的应答者比例(通过访问分析的)。

预先指定了两个分析人群，即安全性人群和功效人群。合并接受安慰剂的受试者进行所有分析。安全性人群包括接受研究治疗并在其后至少进行了一次安全性评估的所有受试者。按照治疗组汇总所有的TEAE和SAE。研究人员审查所有安全性参数，包括实验室测试、ECG、身体检查、生命体征、尿液妊娠测试和集中的神经系统检查，并就其临床意义进行了评估。功效人群是改进的意向性治疗(mITT)人群，被定义为接受至少1剂量的研究治疗药物并且进行至少1次基线后功效评估的所有随机受试者。对mITT人群进行人口统计学和基线特征分析。病史是基于安全性人群，使用MedDRA进行编码，并按照系统器官类别和首选术语进行汇总。先前和同时使用的药物均以安全性人群为基础，使用世界卫生组织解剖学治疗化学(World Health Organization Anatomical Therapeutic Chemical)分类索引进行编码，并按照药物类别和治疗组进行汇总。使用mITT人群进行功效分析。通过治疗和研究日，使用频率计数和应答率(％)总结FWS等级。使用具有0.05的显著性水平的费舍尔精确检验，对于每组EB-001队列与安慰剂(合并)中的IR-2应答者的比例比较进行分析。

在为研究而筛选出的59名受试者中，将43名登记进入了7组队列中的1组。一名受试者不接受治疗，随后42名受试者被纳入mITT和安全性人群中(35名接受EB-001治疗，7名接受安慰剂治疗)。41名受试者完成了研究，其中1名受试者失访。表1示出mITT人群的人口统计学和基线特征。EB-001(合并)组与安慰剂(合并)组的受试者的平均年龄(年龄范围)分别为47.9岁(22至60岁)和50.4岁(32至57岁)。大多数受试者为女性(EB-001＝91.4％；安慰剂＝85.7％)和白人(两组均为71.4％)。研究人员评估的在最大皱眉时的GL基线平均值(标准差[SD])，对于EB-001组和安慰剂组分别为2.6(0.50)和2.9(0.38)。EB-001组和安慰剂组平衡良好，组间无明显差异。

在图2中，通过剂量队列代表在基线访视后至第30天的任何时间，mITT人群中实现对在最大皱眉时GL严重性的IR-2应答的受试者比例。在队列3中，40％的受试者为IR-2应答者。在所有较高剂量的队列中，该应答率相同或更高，队列6和7的IR-2应答率为80％。队列6和7表明IR-2应答者的百分比明显高于安慰剂(P＝0.046)。图3汇总了在基线访视后至第30天的任何时间，研究者评估的在最大皱眉时FWS等级为无或轻度的GL的受试者在每组队列中的比例。与安慰剂组相比，队列2至7(包含)的应答者的百分比更高，队列3及更高剂量的队列达到60％至100％的比率。在队列3至7中，在第1、2和/或7天，观察到大多数为无应答或轻度应答。在队列3、5、6和7中，在第14天观察到一名应答者(20％)；以及在队列3和5中，在第30天观察到一名应答者(20％)。安全性结果支持在该人群中所有以IM注射施用的EB-001的评估剂量的安全性。在任何受试者的神经系统检查、ECG、身体检查或实验室测试中均未观察到与基线相比的临床显著性变化。

用EB-001治疗的5名受试者报告了TEAE，而安慰剂组中没有受试者报告TEAE。没有报告SAE，也没有TEAE导致研究中断。所有TEAE的严重性均为轻度或中度。喉咙痛和流感样症状的事件被认为与治疗无关。3名受试者报告了为头痛的TEAE；其中1名被认为与治疗有关。没有剂量相关的头痛发生率的增加。没有可能与毒素蔓延有关的上睑下垂或其他TEAE事件。

就我们所知，这是将E型肉毒杆菌毒素产品用于任何美学或治疗用途的首次对照临床试验。这项首次在人类中进行的EB-001——一种新的纯化形式的E型肉毒杆菌毒素以IM施用——研究实现了评估EB-001的安全性、耐受性和有效剂量范围的目标。观察到剂量应答，在较高剂量的EB-001队列中的治疗应答者的比例更高。从队列3开始观察到IR-2应答，并且在更高剂量的队列中有所增加，这表明EB-001的有效剂量范围可能是在队列4至7中使用的剂量。队列6和7具有80％的IR-2应答者，其应答率与获批的A型肉毒杆菌毒素产品相似。从队列2开始，观察到FWS等级为零或轻度的受试者。就起效而言，最早在施用后24小时就观察到治疗应答，这支持了先前的报道——表明E型肉毒杆菌毒素比A型起效更快。

关于被定义为无或轻度等级的应答者比例的效果持续时间，在5组较高剂量的队列的大多数中，观察到1名受试者在14天中均具有该效果，在5组较高剂量的队列的2组中，观察到1名受试者在30天中具有该效果。所有剂量的EB-001均显示出良好的耐受性，没有局部注射部位反应。没有SAE或严重TEAE的报告，也没有因为TEAE而停药的。最常见的TEAE头痛的严重性是轻度或中度的，并且没有其他与治疗相关的AE。在任何剂量水平都没有上睑下垂的事件，也没有可能与毒素蔓延有关的事件。因此，该研究的临床安全性和耐受性特征似乎是有利的。EB-001的功效和安全性是有前景的，并支持EB-001有望成为在治疗GL和其他面部美容用途中的一种独特的治疗选择。快速起效可以满足那些在不可预料的社交或专业事件之前寻求快速治疗面部皱纹的人的尚未满足的需求。效果的有限持续时间对于可能正在考虑首次使用肉毒杆菌神经毒素治疗并且不愿长期如此的个体可能是有益的。与A型肉毒杆菌毒素产品的12周的效果持续时间相比，EB-001治疗会使他们在较短的效果持续时间内评估美容效果。在这项针对GL受试者的首次临床研究中，EB-001在所有的队列中均显示出良好的安全性和耐受性。与安慰剂相比，这7组队列中的5组显示出更高数值的应答率，从而支持EB-001在降低GL严重性方面的功效。与获批的A型肉毒杆菌毒素产品相似，这2种最高剂量提供了80％的应答率。与已知的A型产品的时间进程相比，EB-001的临床效果在24小时内可见(起效)，并持续14-30天(持续时间)。这种可区分的临床特性支持EB-001在面部美容和关键治疗用途方面的未来发展，这些方面需要快速起效且短的持续时间。

表S-1：剂量递增方案

实施例2

E型肉毒杆菌毒素治疗鱼尾纹的用途

一位57岁的老人因多年日晒而产生鱼尾纹，他寻求医师的治疗。医师推荐本文所公开的组合物，将其皮下注射在患者眼睛的任一侧。各注射位点接受约3单位的E型肉毒杆菌毒素，并在眼睛的任一侧进行数次注射。鱼尾纹在治疗后约2天内消失，并且鱼尾纹减少保持两个月。

实施例3

E型肉毒杆菌毒素用于眉毛上提术的用途

一名60岁的妇女的眉毛延伸到她的眉骨下方。医师推荐如本文所公开的组合物，将其皮下注射在每只眼睛的上方。各注射位点接受约10单位的E型肉毒杆菌毒素，并在眼睛的任一侧进行数次注射。眉毛的下垂在约2天内减少，并在施用后3个月内基本缓解。

实施例4

E型肉毒杆菌毒素用于隆胸的用途

一名30岁的妇女选择进行隆胸手术。手术前4小时，在将要进行手术切口的附近施用E型肉毒杆菌毒素。施用减少了切口区域的肌肉张力，从而使疤痕最小。手术后两周，施用补充剂量。

实施例5

E型肉毒杆菌毒素用于乳房再造的用途

一名30岁的妇女选择进行乳房再造手术。手术前14小时，在将要进行手术切口的附近施用E型肉毒杆菌毒素。施用减少了切口区域的肌肉张力，从而使疤痕最小。手术后两周，施用补充剂量。

实施例6

E型肉毒杆菌毒素治疗会阴切开术的用途

一名44岁的女性接受会阴切开术。手术后立即向手术区域周围的组织施用4ng E型肉毒杆菌毒素。在20小时内，伤口周围的肌肉和神经活动大大减少。

实施例7

E型肉毒杆菌毒素治疗运动型疝气的用途

一名28岁的男子患有运动型疝气。他的医生向两个疝气周围的组织施用4ng E型肉毒杆菌毒素。在10小时内，损伤周围的肌肉和神经活动大大减少。

实施例8

E型肉毒杆菌毒素用于治疗肩部分离的用途

一名48岁的男人患有肩部分离。他的医生向两个疝气周围的组织施用4ng E型肉毒杆菌毒素。在16小时内，损伤周围的肌肉和神经活动大大减少。

实施例9

E型肉毒杆菌毒素治疗撕裂的ACL的用途

一名23岁妇女患有撕裂的ACL。受伤后6小时，她的医生对撕裂的韧带周围的肌肉施用7ng的E型肉毒杆菌毒素。在30小时内，伤口周围的肌肉和神经活动大大减少。

最后，应当理解，尽管本说明书的各方面是通过参照特定实施方案来强调的，但是本领域技术人员将容易领会，这些公开的实施方案仅是对本文公开主题的组成部分的说明。因此，应当理解，所公开的主题绝不限于本文所述的具体方法、方案和/或试剂等。同样地，在不脱离本说明书的主旨的前提下，可以根据本文的教导对于所公开的主题进行各种修改或改变或替代的组合。最后，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且无意于限制本公开内容的范围，本公开内容的范围仅由权利要求书限定。因此，本公开内容的实施方案并不限于那些精确地示出和记载的实施方案。

本文所记载的某些实施方案，包括发明人已知的用于进行本文所述的方法和设备的最佳模式。当然，在阅读了上述说明之后，这些所记载的实施方案的变型对于本领域普通技术人员将是显而易见的。因此，本公开内容包括如适用法律所允许的，在所附的权利要求书中所述的主题的全部修改方案和等同方案。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在其所有可能的变型中，上述实施方案的任何组合由本公开内容所包括。

本公开内容的替代实施方案、要素或步骤的分组不应被解释成限定性的。各组成员可以单独地或与本文中公开的其他组成员任何组合而被提及且被要求保护。出于便利和/或可专利性，一组中的一个或多个成员可以被包括在一组中或从该组删除。当任何的这类包含或删除发生时，说明书被认为包含经修改的组，因而满足对附加的权利要求书中所用的全部马库什组的书面描述。

除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示特征、项目、数量、参数、特性、术语等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。本文使用的术语“约”是指特征、项目、数量、参数、特性或术语涵盖了所述的特征、项目、数量、参数或术语的值的以上和以下的正负百分之十的范围。因此，除非有相反的说明，否则说明书和所附权利要求书中提出的数字参数是可以变化的近似值。至少，不要试图应用等同原则来限制权利要求的范围，所示的每个数字至少应当解释为根据所报告的有效数字并且通过应用普通的舍入技术得到。尽管阐述本公开内容的宽泛范围的数字范围和数值是近似值，但是在具体实施例中阐述的数字范围和数值是尽可能精确报告的。然而，任何数字范围或数值都固有地包含某些误差，这些误差必定是由它们各自的测试测量中发现的标准偏差引起的。本文中数值的数字范围的叙述仅是意欲于用作独立地提及落入该范围内的每个单独数值的速记方法(shorthand method)。除非本文另外指出，否则数值范围的每个单独的数值都被纳入本说明书中，如同其被单独地引用在本文中一样。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中使用的术语“一”、“所述”和类似指代(特别是在以下权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本公开内容，并不对原本要求保护的范围构成限制。本说明书中的任何语言均不应被解释为表示，本文所公开的实施方案的实践所必需的任何不要求保护的要素。

本文公开的特定实施方案可在使用语言“由……组成”或“基本上由……组成”的权利要求中被进一步限制。在权利要求中使用时，无论是被提交的或是通过修改而添加的，过渡术语“由……组成”将权利要求中未指出的任何要素、步骤或成分排除在外。过渡术语“基本由……组成”将权利要求的范围限制为指出的材料或步骤和不实质性影响基本特征和新颖特征的材料或步骤。藉此要求保护的本发明的实施方案在本文中固有地或清楚地描述并且能够实施。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种进行美容治疗的方法，其包括向患者的所需治疗的区域施用治疗有效量的速效神经毒素，所述治疗有效量包括约4至40皮克/kg。

2.权利要求1的方法，其中所述速效神经毒素包含肉毒杆菌神经毒素血清型E。

3.权利要求2的方法，其中所述治疗有效量包括约0.1至2.8纳克(ng)的量。

4.权利要求2的方法，其中所述治疗有效量包括约0.1至10ng的量。

5.权利要求2的方法，其中所述施用包括注射。

6.权利要求2的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

7.权利要求2的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

8.一种用于修饰先前的美容治疗的方法，其包括向患者的先前进行美容治疗的区域附近施用治疗有效量的速效神经毒素，所述治疗有效量包括约4至40皮克/kg。

9.权利要求8的方法，其中所述速效神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型E。

10.权利要求1的方法，其中所述治疗有效量包括约8至20皮克/kg的量。

11.权利要求9的方法，其中所述施用包括注射。

12.权利要求9的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

13.权利要求9的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

14.一种向患者施用治疗有效量的神经毒素的方法，其中所述神经毒素的剂量以纳克(ng)表示。

15.权利要求14的方法，其中所述神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型E。

16.权利要求15的方法，其中所述治疗有效量包括约2至20ng的量。

17.权利要求16的方法，其中所述治疗有效量包括约8至20ng的量。

18.权利要求15的方法，其中所述施用包括注射。

19.权利要求15的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

20.权利要求15的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

21.一种用于修饰先前的神经毒素治疗的方法，其包括向患者的先前进行神经毒素治疗的区域附近施用至多10ng的速效神经毒素。

22.权利要求21的方法，其中所述速效神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型E。

23.权利要求22的方法，其中所述治疗有效量包括约2至20ng的量。

24.权利要求23的方法，其中所述治疗有效量包括约8至20ng的量。

25.权利要求22的方法，其中所述施用包括注射。

26.权利要求22的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

27.权利要求22的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

28.一种使瘢痕最小化的方法，其包括向患者的伤口附近施用治疗有效量的短效神经毒素，所述治疗有效量包括约4至40皮克/kg。

29.权利要求28的方法，其中所述短效神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型E。

30.权利要求29的方法，其中所述治疗有效量包括约10^-3U/kg至约35U/kg的量。

31.权利要求30的方法，其中所述治疗有效量包括约1U/kg至约25U/kg的量。

32.权利要求31的方法，其中所述治疗有效量包括约5U/kg至约15U/kg的量。

33.权利要求29的方法，其中所述治疗有效量包括约0.2纳克至约2纳克的量。

34.权利要求33的方法，其中所述治疗有效量包括约0.5纳克至约1纳克的量。

35.权利要求29的方法，其中所述施用包括注射。

36.权利要求29的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

37.权利要求29的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

38.权利要求29的方法，其中所述伤口包括外科手术切口。

39.权利要求38的方法，其中所述外科手术切口是美容外科手术的结果。

Claims (40)

1.一种进行美容治疗的方法，其包括向患者的所需治疗的区域施用治疗有效量的速效神经毒素。

2.权利要求1的方法，其中所述速效神经毒素包含肉毒杆菌神经毒素血清型E。

3.权利要求2的方法，其中所述治疗有效量包括约0.1至2.8纳克(ng)的量。

4.权利要求2的方法，其中所述治疗有效量包括约0.1至10ng的量。

5.权利要求2的方法，其中所述施用包括注射。

6.权利要求2的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

7.权利要求2的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

8.一种用于修饰先前的美容治疗的方法，其包括向患者的先前进行美容治疗的区域附近施用治疗有效量的速效神经毒素。

9.权利要求8的方法，其中所述速效神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型E。

10.权利要求9的方法，其中所述治疗有效量包括约4至40皮克/kg的量。

11.权利要求10的方法，其中所述治疗有效量包括约8至20皮克/kg的量。

12.权利要求9的方法，其中所述施用包括注射。

13.权利要求9的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

14.权利要求9的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

15.一种向患者施用治疗有效量的神经毒素的方法，其中所述神经毒素的剂量以纳克(ng)表示。

16.权利要求15的方法，其中所述神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型E。

17.权利要求16的方法，其中所述治疗有效量包括约2至20ng的量。

18.权利要求17的方法，其中所述治疗有效量包括约8至20ng的量。

19.权利要求16的方法，其中所述施用包括注射。

20.权利要求16的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

21.权利要求16的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

22.一种用于修饰先前的神经毒素治疗的方法，其包括向患者的先前进行神经毒素治疗的区域附近施用至多10ng的速效神经毒素。

23.权利要求22的方法，其中所述速效神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型E。

24.权利要求23的方法，其中所述治疗有效量包括约2至20ng的量。

25.权利要求24的方法，其中所述治疗有效量包括约8至20ng的量。

26.权利要求23的方法，其中所述施用包括注射。

27.权利要求23的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

28.权利要求23的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

29.一种使瘢痕最小化的方法，其包括向患者的伤口附近施用治疗有效量的短效神经毒素。

30.权利要求29的方法，其中所述短效神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型E。

31.权利要求30的方法，其中所述治疗有效量包括约10^-3U/kg至约35U/kg的量。

32.权利要求31的方法，其中所述治疗有效量包括约1U/kg至约25U/kg的量。

33.权利要求32的方法，其中所述治疗有效量包括约5U/kg至约15U/kg的量。

34.权利要求30的方法，其中所述治疗有效量包括约0.2纳克至约2纳克的量。

35.权利要求34的方法，其中所述治疗有效量包括约0.5纳克至约1纳克的量。

36.权利要求30的方法，其中所述施用包括注射。

37.权利要求30的方法，其中所述方法还包括向患者施用中效神经毒素。

38.权利要求30的方法，其中所述方法还包括向患者施用长效神经毒素。

39.权利要求30的方法，其中所述伤口包括外科手术切口。

40.权利要求39的方法，其中所述外科手术切口是美容外科手术的结果。

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