CN111712253A - 用于使瘢痕最小化的神经毒素 - Google Patents

Abstract

记载了在伤口愈合过程中使瘢痕最小化的方法。还记载了改善在伤口上形成的瘢痕的外观的方法。所述方法包括在伤口附近施用治疗有效量的E亚型肉毒杆菌毒素(BoNT/E)。

Description

用于使瘢痕最小化的神经毒素

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2017年12月18日提交的美国临时专利申请第62/599,972号的优先权，其全部内容在此以引证的方式纳入本说明书。

技术领域

本公开内容涉及神经毒素用于使瘢痕最小化的用途。

背景技术

外科手术操作和其他侵入性操作或伤害可能会导致瘢痕。虽然机械地固定组织或关节可以有效地使瘢痕最小化，但是仍然需要这样的方法，其改善与伤口相关的瘢痕形成有关的临床结果。

发明内容

本文公开了用于使瘢痕最小化的组合物和方法。例如，所公开的实施方案包括使用“速效(fast-acting)”肉毒杆菌毒素来减少伤口附近的肌肉张力，从而防止或减少瘢痕。

一方面，提供一种用于使瘢痕最小化的方法。所述方法包括将治疗有效量的速效神经毒素施用至患者的伤口附近。

另一方面，提供一种在经历外科手术操作的患者中用于预防瘢痕形成的方法。所述方法包括将治疗有效量的速效神经毒素施用至患者在外科手术操作中产生的伤口附近。

另一方面，提供了一种用于快速减小伤口周围的动态张力的方法。所述方法包括将治疗有效量的速效和/或持续时间短的神经毒素施用至患者的伤口附近。

另一方面，提供了一种在近期经历过外科手术操作并且在伤口的瘢痕可见之前的患者中用于预防瘢痕形成的方法。所述方法包括将治疗有效量的速效神经毒素施用至患者在外科手术操作中产生的伤口附近。

另一方面，提供一种用于在已经具有瘢痕的患者中治疗瘢痕的方法。所述方法包括将治疗有效量的速效和/或持续时间短的神经毒素施用至患者的伤口附近。

在一个实施方案中，所述速效神经毒素包括E血清型肉毒神经毒素。

在一个实施方案中，所述治疗有效量包括约10^-3U/kg至约35U/kg的量。在另一实施方案中，所述治疗有效量包括约1U/kg至约25U/kg的量。在再一实施方案中，所述治疗有效量包括约5U/kg至约15U/kg的量。

在又一实施方案中，所述治疗有效量包括约0.2纳克至约2纳克的量。

在另一实施方案中，减少皮肤切口或皮肤撕裂附近的肌肉活动，从而减少或防止瘢痕形成。

在另一实施方案中，所述肉毒杆菌毒素为快速恢复的毒素。

在又一实施方案中，所述“速效”肉毒杆菌毒素也为快速恢复的毒素。

在再一实施方案中，所述方法还包括速效肉毒神经毒素与例如较慢起效神经毒素相结合施用。在一个实施方案中，所述较慢起效神经毒素为A亚型肉毒杆菌毒素(BoNT/A)。

在其他实施方案中，所述方法还包括将快速恢复的肉毒神经毒素与例如较慢恢复的神经毒素相结合施用。

在另一实施方案中，所述方法包括另外的外科手术操作。例如，所公开的实施方案包括将速效肉毒神经毒素与例如皮肤填充剂注射、眼部上提术(eye lift)、鼻整形术、隆乳术、开放性骨折、撕裂治疗等相结合施用。

BoNT/E的肌肉松弛作用迅速起效，可改善伤口愈合，并减少例如经历面部撕裂修复的受试者的瘢痕形成。与BoNT/A产品的3-4个月相比，BoNT/E提供的较短的肌肉松弛持续时间(2-4周)也是可取的。

另一方面，提供一种减少瘢痕组织形成以改善瘢痕外观的方法。所述方法包括在伤口附近以减少伤口上的动态张力和/或使伤口附近的肌肉麻痹的有效量施用包含E型肉毒杆菌毒素的制剂。在一个实施方案中，相对于未经治疗或经A型肉毒杆菌毒素(BoNT/A)治疗的类似伤口，施用BoNT/E减少了伤口的瘢痕组织形成。

在一个实施方案中，伤口由除去受试者的基底细胞癌或鳞状细胞癌产生。在另一实施方案中，伤口在Mohs外科手术过程中产生。

在又一实施方案中，伤口在脸上。在其他实施方案中，伤口在眼睛周围、在额头上、在鼻子上、在头皮上或在耳朵周围。

在再一实施方案中，伤口是额头上的单一伤口。

在其他实施方案中，肌内施用包含BoNT/E的制剂或组合物。

在一个实施方案中，将制剂在Mohs外科手术之后施用。在另一实施方案中，将制剂在Mohs外科手术之前施用。

在另一实施方案中，将制剂在Mohs外科手术后的约10分钟至约1小时内施用。

在其他实施方案中，瘢痕外观由临床医生使用VAS(直观模拟量表)评估。在另一实施方案中，瘢痕外观由受试者使用瘢痕美容评估与评级(SCARS)评估。在再一实施方案中，瘢痕外观由受试者使用患者与观察者瘢痕评估量表(Patient and Observer ScarAssessment Scale)评估。

另一方面，提供一种改善瘢痕外观的方法。所述方法包括在伤口的附近以减少瘢痕的发红、硬度和/或变色的有效量施用包含E型肉毒杆菌毒素的制剂，其中在伤口愈合的前48小时、72小时、1周或1个月内观察到发红、硬度和/或变色的减少。在一个实施方案中，减少量由患者和/或观察员(例如临床医生)评估，并且是相对于未经治疗或经A型肉毒杆菌毒素(BoNT/A)治疗的类似伤口。

另一方面，提供一种减少伤口上瘢痕组织形成的方法。所述方法包括在伤口附近皮下施用包含E型肉毒杆菌毒素的制剂，相对于未经治疗或用A型肉毒杆菌毒素治疗的类似伤口，通过所述施用减少了伤口的瘢痕组织形成。

在一个实施方案中，伤口垂直于皮肤张力松弛线。

在一个实施方案中，以减少伤口动态张力的有效量施用E型肉毒杆菌毒素。在另一实施方案中，伤口为外科手术切口。

再一方面，提供了一种用于改善在伤口上形成的瘢痕的外观的方法。所述方法包括在伤口附近施用治疗有效量的E亚型肉毒杆菌毒素(BoNT/E)。

在一个实施方案中，伤口为外科手术伤口。在另一实施方案中，在外科手术操作之前施用BoNT/E。在又一实施方案中，在外科手术操作之后施用BoNT/E。

在一个实施方案中，外科手术伤口与受试者已有的瘢痕重叠。

在一个实施方案中，所述治疗有效量包括减少瘢痕发红的量，相对于未经BoNT/E治疗的患者中类似伤口上形成的瘢痕。

在再一实施方案中，所述治疗有效量包括减少瘢痕硬度的量，相对于未经BoNT/E治疗的患者中类似伤口上形成的瘢痕。

在又一实施方案中，在伤口产生之前、过程中或之后在伤口附近还施用一定量的A亚型肉毒杆菌毒素。

附图说明

图1示出了肉毒神经毒素(BoNT)的主要结构的图示。

图2A-2D为BoNT/E(图2A、2C)和BoNT/B(图2B、2D)的示意图和带状模型表示。催化结构域、易位结构域和结合结构域分别标记为CD、TD和BD。

图3A-3B为显示肌肉的人体的前视图(图3A)和后视图(图3B)的说明。

图4为显示神经的人体的说明。

图5显示了实施例1中描述的用于研究的前额注射部位。

图6显示了实施例4中描述的用于研究的前额注射部位。

图7A是条形图，其显示了在Mohs外科手术期间使用在额肌中肌内注射的BoNT/E治疗的人类患者(虚线填充条)以及作为Mohs外科手术一部分的未经肉毒杆菌毒素治疗的人类患者(安慰剂，空心条)中，研究者评定的直观模拟量表(VAS)在第2-8天、第2-30天和第2-90天的平均变化。

图7B为条形图，其显示了在Mohs外科手术期间使用在额肌中肌内注射的BoNT/E治疗的人类患者(虚线填充条)以及作为Mohs外科手术一部分的未经肉毒杆菌毒素治疗的人类患者(安慰剂，空心条)中，使用患者与观察者瘢痕评估量表(POSAS)由患者报告的瘢痕评价的颜色成分在第2-8天、第2-30天和第2-90天的平均变化。

图7C为条形图，其显示了在Mohs外科手术期间使用在额肌中肌内注射的BoNT/E治疗的人类患者(虚线填充条)以及作为Mohs外科手术一部分的未经肉毒杆菌毒素治疗的人类患者(安慰剂，空心条)中，使用患者与观察者瘢痕评估量表(POSAS)由患者报告的瘢痕评价的硬度成分在第2-8天、第2-30天和第2-90天的平均变化。

具体实施方式

本文所公开的实施方案可减少局部肌肉活动，由此减少瘢痕(如外科手术引起的瘢痕)的发展。在一些实施方案中，外科手术可包括整容手术，例如鼻整形术、眼部上提术、整腹术(“tummy”tuck)等。在其他实施方案中，外科手术可包括其他类型的医疗手段，例如阑尾切除、器官移植、剖宫产等。在一些实施方案中，所述方法包括将所公开的组合物施用至伤口附近。

伤口修复的美容效果取决于许多因素，包括闭合质量、感染和缝合质量。一个关键因素是伤口边缘的张力，其往往会加剧炎症，导致纤维化和红斑。张力由静态张力(由伤口位置、大小、闭合技术等引起)和动态张力构成。这种动态张力是由伤口下面的肌肉的活动引起的。具体而言，平行于皮肤张力松弛线(RSTL)修复的伤口具有较小的动态张力，并且以较好的美容效果愈合。垂直于这些RSTL的瘢痕具有增加的张力，从而导致炎症增加、胶原蛋白和葡糖胺聚糖的沉积增加、成纤维细胞的响应增加、较差的伤口愈合和瘢痕增加。通过用肉毒杆菌毒素使深层肌肉切除神经来降低动态张力，这提供了一种潜在地减少疤痕的吸引人的方法。

在一些实施方案中，外科手术可包括用于治疗癌症(例如皮肤癌)的外科手术，例如Mohs外科手术。Mohs显微外科手术被认为是治疗许多基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)(包括眼睛、鼻子、嘴唇、耳朵、头皮、手指、脚趾或生殖器周围的在美容和功能上重要区域中的那些)的最有效技术。

BCC是皮肤基底细胞中出现的不受控制的异常生长或损伤，所述皮肤基底细胞排列于表皮(皮肤的最外层)的最深层。BCC通常看起来像是疮口、红色斑块、粉红色的生长物、发亮的鼓包或瘢痕，通常是由累积的和强烈的、偶尔的日晒的结合所造成的。每年在美国诊断出超过400万例基底细胞癌病例。实际上，BCC是所有癌症中最常见的形式。每三个新的癌症中就有超过一个是皮肤癌，且绝大多数是BCC。

SCC是皮肤癌的常见形式，皮肤癌在构成皮肤中层和外层的鳞状细胞中发展。尽管它们在某些情况下可能具有攻击性，但它们通常不会威胁生命。未经治疗的皮肤鳞状细胞癌可长大或扩散到身体的其他部位，引起严重的并发症。大多数SCC是由于长时间暴露于来自于日光或来自于日光浴床或照明灯的紫外线(UV)辐射所导致的。避免紫外光有助于减少患皮肤鳞状细胞癌和其他形式皮肤癌的风险。在人体的许多地方都发现了鳞状细胞，在任何发现鳞状细胞的地方都可能发生鳞状细胞癌。皮肤鳞状细胞癌是指在皮肤的鳞状细胞中形成的癌症。

还建议将Mohs用于大的、攻击性的或生长迅速的具有模糊边缘的或在先前治疗后复发的BCC或SCC。一些外科医生还成功地在某些黑素瘤病例中使用了Mohs外科手术。在患者等待期间，该操作分阶段(包括实验室工作)完成。这样可以在确保健康组织的同时，以最高的治愈率去除所有癌细胞。该操作对之前未治疗的皮肤癌的治愈率最高达99％，对于先前治疗后复发的皮肤癌的治愈率最高达94％。

该操作已在除去原位黑色素瘤(治愈率为77％至98％，取决于外科医生)以及某些类型的黑色素瘤(治愈率为52％)中使用。原位黑色素瘤另一项研究显示，冷冻切片Mohs的Mohs治愈率为95％，固定组织Mohs方法的Mohs治愈率为98％至99％。

Mohs操作是一种病理切片方法，可对外科手术切缘进行完整检查。它不同于标准的“面包块(bread loafing)”切片技术，其中检查外科手术切缘的随机样本。Mohs外科手术分四个步骤进行：

a.手术切除组织(肿瘤外科)

b.绘制组织切片，使用低温恒温器冷冻和切割5至10微米的组织，并用苏木精和曙红(H&E)或其他染色剂(包括甲苯胺蓝)染色

c.显微镜载玻片解读(病理学)

d.可能的手术缺损重建(重建手术)

Mohs操作通常在医师办公室中在局部麻醉下进行。用小的手术刀围绕可见的肿瘤切割。采用非常小的手术切缘，通常具有1至1.5mm的“独立缘”或未累及皮肤。去除的独立缘的量远远少于标准的皮肤癌切除术通常需要的4至6毫米。在每次手术移出组织后，将标本进行处理，在低温恒温器上切割，然后放在载玻片上，用H&E染色，然后由检查癌细胞切片的Mohs外科医生/病理学家读取。如果发现癌症，则将其位置标记在图(组织图)上，然后外科医生从患者中移除所示的癌组织。重复该操作，直到没有发现进一步的癌症为止。然后，绝大多数病例由Mohs外科医生重建。

本文公开的实施方案可以减少局部肌肉活动，从而减少瘢痕(例如由创伤产生的瘢痕)的形成。例如，在创伤性损伤之后，公开的实施方案可包括在创伤(例如撕裂伤或截肢)附近施用公开的组合物。

在一些实施方案中，所述外科手术可包括整容手术，例如鼻整形术、眼部上提术、整腹术等。在其他实施方案中，所述外科手术可包括其他类型的医学操作，例如阑尾切除、器官移植、剖腹产等。在一些实施方案中，方法包括在伤口附近施用所公开的组合物。

对于进行所公开的实施方案，有用的施用部位可包括待减少肌肉活动的任何区域。例如，当与面部整容手术操作组合使用时，所公开的实施方案可包括对下述部位进行施用：眉间复合体，包括皱眉肌和降眉间肌；眼轮匝肌；眼轮匝肌的上外侧纤维；额肌；鼻肌；提上唇鼻翼肌；口轮匝肌；咬肌；降口角肌；和颈阔肌。

当与其他外科手术操作组合使用时，所公开的实施方案可包括对例如手臂、腿、躯干等的肌肉进行施用。

所公开的实施方案可以包括在操作之前准备外科手术部位的方法，以便减小切口附近的肌肉张力。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物可包括速效肉毒杆菌毒素，例如E型肉毒杆菌。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物可包括快速恢复的肉毒杆菌毒素，例如E型肉毒杆菌。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物可包括快速恢复的速效肉毒杆菌毒素，例如E型肉毒杆菌。

定义

“施用(administration，to administer)”是指向受试者给予(即施用)药物组合物或活性成分的步骤。本文公开的药物组合物可以通过许多合适的途径施用。例如，肌肉内、皮内、皮下施用、鞘内施用、腹膜内施用、局部(透皮)、滴注和植入(例如聚合物植入物或微渗透泵的缓释装置)都是合适的施用途径。

“缓解”是指减轻疼痛、头痛或者病状或病症的任何症状或原因的发生。因此，缓解包括一定程度的减轻、显著减轻、几乎完全减轻和完全减轻。

术语“氨基酸”是指天然存在的或合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸具有相似功能的氨基酸类似物、立体异构体和氨基酸模拟物。该定义包括天然氨基酸，例如：(1)组氨酸(His；H)(2)异亮氨酸(Ile；I)(3)亮氨酸(Leu；L)(4)赖氨酸(Lys；K)(5)蛋氨酸(Met；M)(6)苯丙氨酸(Phe；F)(7)苏氨酸(Thr；T)(8)色氨酸(Trp；W)(9)缬氨酸(Val；V)(10)精氨酸(Arg；R)(11)半胱氨酸(Cys；C)(12)谷氨酰胺(Gln；Q)(13)甘氨酸(Gly；G)(14)脯氨酸(Pro；P)(15)丝氨酸(Ser；S)(16)酪氨酸(Tyr；Y)(17)丙氨酸(Ala；A)(18)天冬酰胺(Asn；N)(19)天冬氨酸(Asp；D)(20)谷氨酸(Glu；E)(21)硒代半胱氨酸(Sec；U)；包括非天然氨基酸：(a)瓜氨酸(Cit)；(b)胱氨酸；(c)γ-氨基丁酸(GABA)；(d)鸟氨酸(Orn)；(f)茶氨酸；(g)同型半胱氨酸(Hey)；(h)甲状腺素(Thx)；和氨基酸衍生物，如甜菜碱；肉碱；肌肽；肌酸；羟色氨酸；羟脯氨酸(Hyp)；N-乙酰半胱氨酸；S-腺苷甲硫氨酸(SAM-e)；牛磺酸；酪胺。

“不含动物蛋白”是指不存在血液来源、血池(blood pooled)和其他动物来源的产物或化合物。“动物”是指哺乳动物(例如人类)、鸟类、爬行动物、鱼类、昆虫、蜘蛛或其他动物物种。“动物”不包括微生物，例如细菌。因此，不含动物蛋白的药物组合物可包含肉毒神经毒素。例如，“不含动物蛋白”的药物组合物是指大体上不含或基本上不含或完全不含血清来源的白蛋白、明胶和其他动物来源的蛋白质(例如免疫球蛋白)的药物组合物。不含动物蛋白的药物组合物的实例为这样的药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素(作为活性成分)和作为稳定剂或赋形剂的合适多糖或由肉毒杆菌毒素(作为活性成分)和作为稳定剂或赋形剂的合适多糖组成。

“肉毒杆菌毒素”或“肉毒神经毒素”是指由肉毒梭状芽胞杆菌产生的神经毒素，以及由非梭菌类菌种重组产生的肉毒杆菌毒素(或其轻链或重链)。本文所用的短语“肉毒杆菌毒素”涵盖肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F、G、H和X，以及其亚型，花叶毒素(mosaictoxin)，例如BoNT/DC和BoNT/CD，及其任何其他类型的亚型，或上述任何一种在不同情况下的任何重组蛋白质、类似物、衍生物、同源物、部分、子部分、变体或版本。如本文所用，“肉毒杆菌毒素”还涵盖“修饰的肉毒杆菌毒素”。进一步地，如本文所用，“肉毒杆菌毒素”还涵盖肉毒杆菌毒素复合体(例如300、600和900kDa复合体)，以及与复合体蛋白无缔合的肉毒杆菌毒素(150kDa)的神经毒性成分。“纯化的肉毒杆菌毒素”是指与其他蛋白质和杂质分离或大体上分离的纯的肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌毒素复合体，所述蛋白质和杂质可伴有从培养或发酵方法中获得的肉毒杆菌毒素。因此，纯化的肉毒杆菌毒素可具有至少95％、更优选至少99％的非-肉毒杆菌毒素蛋白质和杂质被移除。

“梭菌属神经毒素”是指由梭菌毒素菌株产生的任何毒素，所述梭菌毒素菌株可以执行整个细胞机制，从而梭菌毒素会毒化细胞，并且涵盖梭菌毒素与低或高亲和力梭菌毒素受体的结合、毒素/受体复合体的内化、梭菌毒素轻链易位到细胞质中以及梭菌毒素底物的酶改性。梭菌毒素的非限制性实例包括肉毒杆菌毒素，例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C₁、BoNT/D、BoNT/CD、BoNT/DC、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H(也称为FA或HA型)、BoNT/X、破伤风毒素(TeNT)、巴拉提尼(Baratii)毒素(BaNT)和丁酸梭菌毒素(BuNT)。BoNT/C₂细胞毒素和BoNT/C₃细胞毒素(不是神经毒素)被排除在术语“梭菌毒素”之外。术语梭菌毒素还包括单独的约150-kDa的梭菌毒素(即，没有NAP)。梭菌毒素包括天然存在的梭菌毒素变体，例如梭菌毒素同种型和梭菌毒素亚型；非天然存在的梭菌毒素变体，例如保守梭菌毒素变体、非保守梭菌毒素变体、梭菌毒素嵌合变体和其活性梭菌毒素片段，或其任意结合物。梭菌毒素还包括梭菌毒素复合体，其是指包含梭菌毒素和非毒素相关蛋白(NAP)的复合体，如肉毒杆菌毒素复合体、破伤风毒素复合体、巴拉提尼毒素复合体以及丁酸梭菌复合体。梭菌毒素复合体的非限制性实例包括由肉毒梭状芽胞杆菌产生的那些，例如900-kDa BoNT/A复合体、500-kDa BoNT/A复合体、300-kDa BoNT/A复合体、500-kDa BoNT/B复合体、500-kDaBoNT/C₁复合体、500-kDa BoNT/D复合体、300-kDa BoNT/D复合体、300-kDa BoNT/E复合体和300-kDa BoNT/F复合体。

生物活性成分施用的“有效量”是指通常足以在受试者中产生所期望变化的成分量。例如，在期望的效果是减少瘢痕形成的情况下，该成分的有效量是这样的量：其产生至少显著减少的瘢痕形成并且不导致明显毒性。在该实施方案的其他方面，梭菌毒素活性成分的治疗有效浓度将与所治疗的饮食有关的症状降低例如至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、最多50％、最多60％、最多70％、最多80％、最多90％或最多100％。

如本文所用，“速效”是指与由例如A型肉毒杆菌神经毒素(如onabotulinumtoxinA)产生的效果相比，肉毒杆菌毒素在患者中更快地产生效果。例如，速效肉毒杆菌毒素的效果在12小时、24小时或36小时内可见。因此，相对于如E型的速效毒素，A型肉毒杆菌毒素可归类为“较慢起效”的肉毒杆菌毒素。在某些情况下，较慢起效的肉毒杆菌毒素是指“中等起效”毒素。在一些实施方案中，速效肉毒杆菌毒素在施用后6小时、12小时、24小时或36小时内产生可测量的治疗效果，和/或观察到的效果比由onabotulinum毒素A产生的治疗效果快至少约50％。

如本文所用，“快速恢复”是指与由例如A型肉毒杆菌神经毒素(如onabotulinumtoxinA)产生的效果减小相比，肉毒杆菌毒素在患者中的效果减小更快速。在一些实施方案中，快速恢复的肉毒杆菌毒素的治疗效果在其施用后的约3个月、2个月或6周内减小，且其效果减小比onabotulinumtoxinA产生的效果快约50％。例如，快速恢复的肉毒杆菌毒素的效果可以在例如120小时、150小时、300小时、350小时、400小时、500小时、600小时、700小时、800小时等内减小。已知A型肉毒杆菌毒素可具有最高达12个月的功效(European J.Neurology 6(Supp4):S111-S1150:1999)，且在一些情况下长达27个月，当用于治疗腺体时，例如在治疗多汗症时。参见例如Bushara K.,《肉毒杆菌毒素和鼻液溢》(Botulinum toxin and rhinorrhea),Otolaryngol Head Neck Surg 1996；114(3):507，以及Laryngoscope 109:1344-1346:1999。然而，肌内注射A型肉毒杆菌神经毒素的通常持续时间常常为约3至4个月。因此，相对于快速恢复的毒素如E型，A型肉毒杆菌毒素(如onabotulinumtoxinA)可被归类为“较慢恢复”或“长期起效”的肉毒杆菌毒素。

如本文所用，“中等起效”是指比速效毒素更慢产生作用的肉毒杆菌毒素。

“局部施用”是指在动物体上或动物体内的部位处或其附近直接施用药物，在该部位需要药物的生物学作用，例如通过肌肉内或皮内或皮下施用注射或局部施用。局部施用不包括全身施用途径，例如静脉内或口服施用。局部施用是将药剂施用于患者的局部的施用类型。

“神经毒素”是指对神经元细胞表面受体具有特定亲和力的生物活性分子。神经毒素包括梭菌毒素，所述梭菌毒素为纯毒素以及与一种或多种非毒素、毒素相关蛋白复合的毒素。

“患者”是指接受医学护理或兽医护理的人类或非人类受试者。

“药物组合物”是指包含活性药物成分和至少一种其他成分的组合物，所述活性药物为例如梭菌毒素活性成分，如肉毒杆菌毒素，所述其他成分为例如稳定剂或赋形剂等。因此，药物组合物是适合于对受试者例如人类患者进行诊断、治疗施用的制剂。所述药物组合物可以是：在冻干或真空干燥条件下，例如，将冻干或真空干燥的药物组合物复溶后形成的溶液，或者为不需要复溶的溶液或固体。如上所述，药物组合物可以是液体或固体。药物组合物可以不含动物蛋白。

“准备”手术部位是指施用本文公开的组合物以减少切口区域中的肌肉张力。

如本文所用，“补充施用”是指在最初施用神经毒素之后进行的肉毒杆菌施用。

“治疗制剂”是指可用于治疗并由此减轻其病症或疾病和/或与之相关的症状——例如特征在于外周肌肉活动性的病症或疾病——的制剂。

“治疗有效浓度”、“治疗有效量”、“有效量”、“有效剂量”和“治疗有效剂量”是指实现所期望的治疗效果所需的试剂(例如，肉毒杆菌毒素或包含肉毒杆菌毒素的药物组合物)的最小剂量且包括足以减少与治疗疾病、病症或病状有关的症状而不引起明显的消极副作用或不利副作用的剂量。

“治疗(treat，treating，treatment)”是指疾病、病症或病状的减轻或减少(其包括一定程度的减少、大幅度减少、近乎完全减少，和完全减少)、消除或预防(暂时或永久)，从而获得所期望的治疗或美容结果，例如通过使受伤或受损的组织愈合，或通过使现有或被感知的疾病、病症或病状得以改变、变化、增强、改善、改进和/或美化。

“单位”或“U”是指标准化为具有与市售A型肉毒杆菌神经毒素的单位等效的神经肌肉阻滞作用的活性肉毒神经毒素的量。

如本文所用，“伤口”是指例如由于伤害或故意造成的皮肤破坏。

本公开内容的替代实施方案、要素或步骤的分组不应被解释成限定性的。各组成员可以单独地或与本文中公开的其他组成员任何组合而被提及且被要求保护。出于便利和/或可专利性，一组中的一个或多个成员可以被包括在一组中或从该组删除。当任何的这类包含或删除发生时，说明书被认为包含经修改的组，因而满足对附加的权利要求书中所用的全部马库什组的书面描述。

除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示特征、项目、数量、参数、特性、术语等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。本文使用的术语“约”是指特征、项目、数量、参数、特性或术语涵盖了所述的特征、项目、数量、参数、特性或术语的值的以上和以下的正负百分之十的范围。因此，除非有相反的说明，否则说明书和所附权利要求书中提出的数字参数是可以变化的近似值。至少，不要试图应用等同原则来限制权利要求的范围，所示的每个数字至少应当解释为根据所报告的有效数字并且通过应用普通的舍入技术得到。尽管阐述本公开内容的宽泛范围的数字范围和数值是近似值，但是在具体实施例中阐述的数字范围和数值是尽可能精确报告的。然而，任何数字范围或数值都固有地包含某些误差，这些误差必定是由它们各自的测试测量中发现的标准偏差引起的。本文中数值的数字范围的叙述仅是意欲于用作独立地提及落入该范围内的每个单独数值的速记方法(shorthand method)。除非本文另外指出，否则数值范围的每个单独的数值都被纳入本说明书中，如同其被单独地引用在本文中一样。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中使用的术语“一”、“一个”、“所述”和类似指代(特别是在以下权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本公开内容，并不对原本要求保护的范围构成限制。本说明书中的任何语言均不应被解释为表示，本文所公开的实施方案的实践所必需的任何不要求保护的要素。

神经毒素组合物

本文所公开的实施方案包括神经毒素组合物，例如快速恢复的神经毒素。这种神经毒素可以任何药学上可接受的形式配制成任何药学上可接受的制剂。所述神经毒素也可以由任何生产商提供的任何药学上可接受的形式使用。

神经毒素可以由梭菌属细菌产生，例如由肉毒梭状芽胞杆菌、丁酸梭菌或贝氏梭菌(Clostridium beratti)细菌产生。另外，神经毒素可以是修饰的神经毒素；与天然或野生型神经毒素相比，它是这样的一种神经毒素，其至少一个氨基酸被删除、修饰或替换。此外，神经毒素可以是重组产生的神经毒素或其衍生物或片段。

图1描述了肉毒神经毒素(BoNT)的主要结构。图2A-2D为BoNT/E(图2A、2C)和BoNT/B(图2B、2D)的示意图和带状模型表示。催化结构域、易位结构域和结合结构域分别标记为CD、TD和BD。

在一些实施方案中，与A型相比，所公开的E型肉毒神经毒素(BoNT/E)组合物具有40％的氨基酸同源性且它们具有相同的基本结构域结构，该结构由2条通过二硫键相连的链(一条100kDa的重链(HC)和一条50kDa的轻链(LC))组成，参见，例如Whelan等人,Thecomplete amino acid sequence of the Clostridium botulinum type-E neurotoxin,derived by nucleotide-sequence analysis of the encoding gene,Eur.J.Biochem.204(2):657-667(1992)。HC含有受体结合结构域和易位结构域，而LC含有突触体相关蛋白(SNAP)酶活性。域结构是所有肉毒杆菌神经毒素血清型共有的相同结构。

在公开的实施方案中，神经毒素被配制成单位剂型；例如，它可以在小瓶中以无菌溶液的形式提供，或以含有用于复溶合适媒介物(例如注射用盐水)的冻干粉的小瓶或袋形式提供。

在一些实施方案中，将肉毒杆菌毒素配制成含有盐水和巴氏灭菌的人血清白蛋白的溶液，其使毒素稳定并且通过非特异性吸附使损失最小化。可以将溶液无菌过滤(0.2μm过滤器)，装入单个小瓶中，然后真空干燥，得到无菌冻干粉末。在使用中，可以通过添加无菌的无防腐剂的生理盐水(注射用0.9％氯化钠)来复溶粉末。

在一个实施方案中，E型肉毒杆菌以5mL小瓶装注射用无菌溶液提供，其在pH 6.0下，标称浓度(nominal concentration)为20ng/mL于0.03M磷酸钠、0.12M氯化钠和1mg/mL人血清白蛋白(HSA)中。在另一实施方案中，以液体制剂的形式提供E型肉毒杆菌，所述液体制剂包括磷酸钠、氯化钠和HAS。在又一实施方案中，E型肉毒杆菌以包含表面活性剂和二糖的冻干或液体制剂形式提供。

尽管所述组合物可以仅包含单一类型的神经毒素，例如E型肉毒杆菌，但所公开的组合物可包含两种或更多种类型的神经毒素，其可以提供对病症的增强的治疗效果。例如，向患者施用的组合物可以包括A型和E型肉毒杆菌。施用包含两种不同神经毒素的单一组合物可以使每种神经毒素的有效浓度低于向患者施用单一神经毒素的同时仍然实现所需治疗效果的有效浓度。向患者施用的组合物也可包含与一种神经毒素或多种神经毒素组合的其他药学活性成分，例如蛋白受体或离子通道调节剂。这些调节剂可能有助于减少多种神经元之间的神经传递。例如，组合物可以包含增强由GABA_A受体介导的抑制作用的γ氨基丁酸(GABA)A型受体调节剂。GABA_A受体通过有效地分流细胞膜上的电流来抑制神经活动。GABA_A受体调节剂可增强GABA_A受体的抑制作用并且减少神经元的电信号传递或化学信号传递。GABA_A受体调节剂的实例包括苯二氮卓类(benzodiazepines)，例如地西泮(diazepam)、奥沙西泮(oxaxepam)、劳拉西泮(lorazepam)、普拉西泮(prazepam)、阿普唑仑(alprazolam)、哈拉西泮(halazeapam)、氯氮平(chordiazepoxide)和二钾氯氮卓(chlorazepate)。组合物还可以包含减少由谷氨酸受体介导的兴奋作用的谷氨酸受体调节剂。谷氨酸受体调节剂的实例包括抑制穿过AMPA、NMDA和/或红藻氨酸盐类型的谷氨酸受体的电流的试剂。

治疗方法

本文公开的方法可以包括向患者施用速效神经毒素。在一个优选的实施方案中，神经毒素是E型肉毒杆菌。

本文公开的方法可包括向患者补充施用速效神经毒素。包含补充施用的实施方案可以进一步包括医生或患者对先前神经毒素施用结果的评估。

在一些实施方案中，在外科手术操作前施用速效神经毒素。在一些实施方案中，施用在例如以下时间进行：在操作前6小时内、操作前5小时内、操作前4小时内、操作前3小时内、操作前2小时内、操作前60分钟进行内、操作前50分钟内、操作前40分钟内、操作前30分钟内、操作前20分钟内、操作前10分钟内、操作前5分钟内、操作前2分钟内等。

在替代实施方案中，速效神经毒素的施用与外科手术操作同时进行。

在其他实施方案中，在外科手术操作后进行速效神经毒素的施用。例如，可以在以下时间施用：操作后1分钟内、操作后2分钟内、操作后3分钟内、操作后4分钟内、操作后5分钟内、操作后6分钟内进行给药、操作后7分钟内、操作后8分钟内、操作后9分钟内、操作后10分钟内、操作后20分钟内、操作后30分钟内、操作后40分钟内、操作后50分钟、操作后60分钟内、操作后90分钟内、操作后120分钟内、操作后180分钟内、操作后240分钟内、操作后300分钟内等。在一些其他实施方案中，可以在操作后的1-3天内进行施用。在其他实施方案中，可以在操作后3个月内进行施用。

在包括补充施用的实施方案中，神经毒素的初次施用的结果的评估可以在例如以下时间进行：初次施用的6小时内、初次施用的8小时内、初次施用的10小时内、初次施用的12小时内、初次施用的14小时内、初次施用的16小时内、初次施用的18小时内、初次施用的24小时内、初次施用的30小时内、初次施用的36小时内、初次施用的42小时内、初次施用的48小时内、初次施用的54小时内、初次施用的60小时内、初次施用的66小时内、初次施用的72小时内、初次施用的78小时内、初次施用的84小时内、初次施用的90小时内、初次施用的96小时内、初次施用的102小时内、初次施用的108小时内、初次施用的114小时内、初次施用的120小时内、初次施用的1周内、初次施用的2周内、初次施用的3周内、初次施用的4周内、初次施用的5周内、初次施用的6周内、初次施用的7周内、初次施用的8周内、初次施用的9周内、初次施用的10周内、初次施用的11周内、初次施用的12周内等。

在包括补充施用的实施方案中，补充剂量的施用可以在以下时间进行：例如，评估的6小时内、评估的8小时内、评估的10小时内、评估的12小时内、评估的14小时内、评估的16小时内、评估的18小时内、评估的24小时内、评估的30小时内、评估的36小时内、评估的42小时内、评估的48小时内、评估的54小时内、评估的60小时内、评估的66小时内、评估的72小时内、评估的78小时内、评估的84小时内、评估的90小时内、评估的96小时内、评估的102小时内、评估的108小时内、评估的114小时内、评估的120小时内、评估的1周内、评估的2周内、评估的3周内、评估的4周内、评估的5周内、评估的6周内、评估的7周内、评估的8周内、评估的9周内、评估的10周内、评估的11周内、评估12周内等。

在一些实施方案中，补充施用本身可在例如以下时间进行：初次施用速效神经毒素的例如6小时内、初次施用的8小时内、初次施用的10小时内、初次施用的12小时内、初次施用的14小时内、初次施用的16小时内、初次施用的18小时内、初次施用的24小时内、初次施用的30小时内、初次施用的36小时内、初次施用的42小时内、初次施用的48小时内、初次施用的54小时内、初次施用的60小时内、初次施用的66小时内、初次施用的72小时内、初次施用的78小时内、初次施用的84小时内、初次施用的90小时内、初次施用的96小时内、初次施用的102小时内、初次施用的108小时内、初始施用的114小时内、初次施用的120小时内、初次施用的1周内、初次施用的2周内、初次施用的3周内、初次施用的4周内、初次施用的5周内、初次施用的6周内、初次施用的7周内、初次施用的8周内、初次施用的9周内、初次施用的10周内、初次施用的11周内、初次施用的12周内等。在一些实施方案中，补充施用可例如在初次施用的例如3至6个月内进行。在一些实施方案中，补充施用可与初次施用同时进行。

本文公开的方法可以提供快速起效的效果(例如，使用速效神经毒素)。例如，所公开的实施方案可以在例如以下时段内降低手术切口附近的肌肉活动：施用后30分钟内、施用后45分钟内、施用后60分钟内、施用后75分钟内、施用后90分钟内、施用后2小时内、施用后3小时内、施用后4小时内、施用后5小时内、施用后6小时内、施用后7小时内、施用后8小时内、施用后9小时内、施用后10小时内、施用后11小时内、施用后12小时内、施用后13小时内、施用后14小时内、施用后15小时内、施用后16小时内、施用后17小时内、施用后18小时内、施用后19小时内、施用后20小时内、施用后21小时内、施用后22小时内、施用后23小时内、施用后24小时内、施用后30小时内、施用后36小时内、施用后42小时内、施用后48小时内、施用后3天内、施用后4天内、施用后5天内、施用后6天内、施用后7天内等。

本文公开的方法可在较短的持续时间内减少肌肉活动(例如，使用快速恢复的神经毒素)。例如，所公开的实施方案可以提供在例如以下时间内降低肌肉活动：施用后3天内、施用后4天内、施用后5天内、施用后6天内、施用后7天内、施用后8天内、施用后9天内、施用后10天内、施用后11天内、施用后12天内、施用后13天内、施用后14天内、施用后15天内、施用后16天内、施用后17天内、施用后18天内、施用后19天内、施用后20天内、施用后21天内、施用后22天内、施用后23天内、施用后24天内、施用后25天内、施用后26天内、施用后27天内、施用后28天内、施用后29天内、施用后30天内、施用后45天内、施用后60天内、施用后75天内、施用后90天内、施用后105天内等。

副作用可能与肉毒杆菌注射有关。所公开的实施方案可以提供比常规神经毒素治疗产生更少的副作用或缩短持续时间的副作用的神经毒素治疗，例如使用更长效的神经毒素如A型的治疗。

例如，所公开的实施方案可以导致以下情况更少发生(或持续时间更短)：复视或视力模糊、眼睑麻痹(受试者不能完全睁开眼睑)、面部肌肉运动丧失、声音嘶哑、失去膀胱控制力、呼吸急促、吞咽困难、说话困难、死亡等。

所公开的方法包括向易于形成瘢痕的区域的施用，所述区域为例如外科手术切口附近的区域，或对皮肤的任何伤害(例如创伤性伤害)附近的区域。所公开的实施方案包括对接近易于形成瘢痕的区域的肌肉例如骨骼肌组织或平滑肌组织的施用。

此外，所公开的实施方案可提供更确定持续时间的减少的肌肉活动。例如，使用更长效的神经毒素，在效果的持续时间中的20％差异可导致有效持续时间相差一个月。使用所公开的快速恢复的神经毒素，这种20％的差异在有效持续时间上产生的差异并不明显。

所公开的速效神经毒素组合物可以使用针或无针装置来注射到个体。在某些实施方案中，该方法包括将组合物皮下注射到个体中。例如，施用可包括通过不大于约30号规格的针注射组合物。在某些实施方案中，该方法包括施用包含E型肉毒杆菌毒素的组合物。

组合物的注射可以通过注射器、导管、针和其他注射手段进行。注射可以在需要治疗的哺乳动物身体的任何区域上进行，包括但不限于面部、颈部、躯干、手臂、手、腿和足。注射可以在特定区域的任何位置，例如表皮、真皮、脂肪、肌肉或皮下层。

例如，适合于施用所公开的组合物的骨骼肌可包括图3A-3B中所示的任何肌肉或肌肉组合。

施用可以包括注射到图4的示意图中所示的一条或多条神经中或其附近。

适合于施用所公开的组合物的平滑肌可以包括以下的任一种：血管壁、胃壁、输尿管、肠、主动脉(血管中膜层)、眼虹膜、前列腺、胃肠道、呼吸道、小动脉(small arteries)、微动脉(arterioles)、生殖道(两性)、静脉、肾脏的肾小球(称为肾小球系膜细胞)、膀胱、子宫、皮肤的毛肌、睫状肌、括约肌、气管、胆管等。

在所公开的方法下的注射频率和注射量可以基于所治疗的具体区域的性质和位置来确定。但是，在某些情况下，可能需要重复注射以获得最佳结果。在每种具体情况下的注射频率和注射量可以由本领域普通技术人员确定。

尽管提供了施用途径和剂量的实例，但是合适的施用途径和剂量通常由主治医生根据具体情况确定。对于本领域普通技术人员而言，这种确定是常规的(参见，例如Harrison's Principles of Internal Medicine(1998),由Anthony Fauci等人编纂,第14版,由McGraw Hill出版)。例如，本发明公开的梭菌神经毒素的施用途径和剂量可以基于标准(例如所选择的神经毒素的溶解度特性以及所治疗的状况的强度和范围)来进行选择。

速效神经毒素的施用量可以为约10^-3U/kg至约35U/kg。在一个实施方案中，神经毒素的施用量为约10^-2U/kg至约25U/kg。在另一个实施方案中，神经毒素的施用量为约10^-1U/kg至约15U/kg。在另一个实施方案中，神经毒素的施用量为约1U/kg至约10U/kg。在许多情况下，施用约1单位至约500单位的神经毒素，例如E型肉毒杆菌，提供有效的治疗性缓解。在一个实施方案中，可以使用约5单位至约200单位的神经毒素，例如E型肉毒杆菌；在另一个实施方案中，可以将约10单位至约100单位的神经毒素，例如E型肉毒杆菌，局部施用到靶组织例如肌肉中。

在一些实施方案中，施用可包含以下剂量的神经毒素：约10单位神经毒素，或约20单位神经毒素，或约30单位神经毒素，或约40单位神经毒素，或约50单位神经毒素，或约60单位神经毒素，或约70单位神经毒素，或约80单位神经毒素，或约90单位神经毒素，或约100单位神经毒素，或约110单位神经毒素，或约120单位神经毒素，或约130单位神经毒素，或约140单位神经毒素，或约150单位神经毒素，或约160单位神经毒素，或约170单位神经毒素，或约180单位神经毒素，或约190单位神经毒素，或约200单位神经毒素，或约210单位神经毒素，或约220单位神经毒素，或约230单位神经毒素，或约240单位神经毒素，或约250单位神经毒素，或约260单位神经毒素，或约270单位神经毒素，或约280单位神经毒素，或约290单位神经毒素，或约290单位神经毒素，或约300单位神经毒素，或约310单位神经毒素，或约320单位神经毒素，或约330单位神经毒素，或约340单位神经毒素，或约350单位神经毒素，或约360单位神经毒素，或约370单位神经毒素，或约380单位神经毒素，或约390单位神经毒素，或约400单位神经毒素，或约410单位神经毒素，或约420单位神经毒素，或约430单位神经毒素，或约440单位神经毒素，或约450单位神经毒素，或约460单位神经毒素，或约470单位神经毒素，或约480单位神经毒素，或约490单位神经毒素，或约500单位神经毒素等。

在一些实施方案中，施用可包含以下剂量的神经毒素：约0.1纳克(ng)的神经毒素、0.2ng的神经毒素、0.3ng的神经毒素、0.4ng的神经毒素、0.5ng的神经毒素、0.6ng的神经毒素、0.7ng的神经毒素、0.8ng的神经毒素、0.9ng的神经毒素、1.0ng的神经毒素、1.1ng的神经毒素、1.2ng的神经毒素、1.3ng的神经毒素、1.4ng的神经毒素、1.5ng的神经毒素、1.6ng的神经毒素、1.7ng的神经毒素、1.8ng的神经毒素、1.9ng的神经毒素、2.0ng的神经毒素、2.1ng的神经毒素、2.2ng的神经毒素、2.3ng的神经毒素、2.4ng的神经毒素、2.5ng的神经毒素、2.6ng的神经毒素、2.7ng的神经毒素、2.8ng的神经毒素、2.9ng的神经毒素、3.0ng的神经毒素、3.1ng的神经毒素、3.2ng的神经毒素、3.3n的神经毒素、3.4ng的神经毒素、3.5ng的神经毒素、3.6ng的神经毒素、3.7ng的神经毒素、3.8ng的神经毒素、3.9ng的神经毒素、4.0ng的神经毒素、4.1ng的神经毒素、4.2ng的神经毒素、4.3ng的神经毒素、4.4ng的神经毒素、4.5ng的神经毒素、5ng的神经毒素、6ng的神经毒素、7ng的神经毒素、8ng的神经毒素、9ng的神经毒素、10ng的神经毒素等。

在一些实施方案中，施用可包含以下剂量的神经毒素：约0.1纳克(ng)的神经毒素至20ng的神经毒素、约1ng的神经毒素至19ng的神经毒素、约2ng的神经毒素至18ng的神经毒素、约3ng的神经毒素至17ng的神经毒素、约4ng的神经毒素至16ng的神经毒素、约5ng的神经毒素至15ng的神经毒素、约6ng的神经毒素至14ng的神经毒素、约7ng的神经毒素至13ng的神经毒素、约8ng的神经毒素至12ng的神经毒素、约9ng的神经毒素至11ng的神经毒素等。在实施方案中，施用可包含一次或多次注射以下剂量的神经毒素：约0.1纳克(ng)的神经毒素、0.2ng的神经毒素、0.3ng的神经毒素、0.4ng的神经毒素、0.5ng的神经毒素、0.6ng的神经毒素、0.7ng的神经毒素、0.8ng的神经毒素、0.9ng的神经毒素、1.0ng的神经毒素、1.1ng的神经毒素、1.2ng的神经毒素、1.3ng的神经毒素、1.4ng的神经毒素、1.5ng的神经毒素、1.6ng的神经毒素、1.7ng的神经毒素、1.8ng的神经毒素、1.9ng的神经毒素、2.0ng的神经毒素、2.1ng的神经毒素、2.2ng的神经毒素、2.3ng的神经毒素、2.4ng的神经毒素、2.5ng的神经毒素、2.6ng的神经毒素、2.7ng的神经毒素、2.8ng的神经毒素、2.9ng的神经毒素、3.0ng的神经毒素、3.1ng的神经毒素、3.2ng的神经毒素、3.3ng的神经毒素、3.4ng的神经毒素、3.5ng的神经毒素、3.6ng的神经毒素、3.7ng的神经毒素、3.8ng的神经毒素、3.9ng的神经毒素、4.0ng的神经毒素、4.1ng的神经毒素、4.2ng的神经毒素、4.3ng的神经毒素、4.4ng的神经毒素、4.5ng的神经毒素、5ng的神经毒素、6ng的神经毒素、7ng的神经毒素、8ng的神经毒素、9ng的神经毒素、10ng的神经毒素等。

在一些实施方案中，施用可包含一次或多次注射以下剂量的神经毒素：约0.1纳克(ng)的神经毒素至20ng的神经毒素、约1ng的神经毒素至19ng的神经毒素、约2ng的神经毒素至18ng的神经毒素、约3ng的神经毒素至17ng的神经毒素、约4ng的神经毒素至16ng的神经毒素、约5ng的神经毒素至15ng的神经毒素、约6ng的神经毒素至14ng的神经毒素、约7ng的神经毒素至13ng的神经毒素、约8ng的神经毒素至12ng的神经毒素、约9ng的神经毒素至11ng的神经毒素等。

然而，最终毒素的施用量及其施用频率将由负责治疗的医师酌情决定，并且根据安全性和毒素产生的效果而定。

在一些实施方案中，施用可以包括一次或多次注射，例如大体上沿着切口部位或一条或多条切口线注射。在一些实施方案中，施用可以包括以特定图案进行注射，例如W形和X形、Z形、星形、圆形、半圆形、正方形、矩形、新月形或其组合。

进行这样的研究，其中将BoNT/E施用给正在接受眉间线治疗的人类患者，以评估BoNT/E在人类中的起效、安全性和耐受性。在实施例1中描述了该研究。如图5所示，在五个注射点将BoNT/E施用于降眉间肌。BoNT/E改善了眉间线的严重性，同时具有起效快、安全性好和耐受性好的特点。

进行了另一项研究，其中将BoNT/E施用给正在接受基础细胞癌手术治疗的人类患者。如实施例5中所述，将计划进行Mohs外科手术以去除额头上基底细胞癌的单发病灶的十二名人类受试者随机分为治疗组(n＝8)和安慰剂组(n＝4)。两组受试者均在手术部位附近的额肌中接受一次肌内注射，治疗组接受一定剂量的BoNT/E，安慰剂组接受生理盐水。从研究的第2天开始(术后24小时)，使用VAS、SCAR和POSAS量表评估每个受试者(参见实施例4)。在研究的第8、30和90天，使用各种量表再次评估受试者。结果示于图7A-7C，其中在用第x-y天表示的各条形图中的沿x轴的时间点作为在第y天-第x天的评估评分的变化来计算。

图7A为显示了研究者评定的直观模拟量表(VAS)在第2-8天、第2-30天和第2-90天的平均变化的条形图。VAS为0到10的数字等级，其中0是最严重可能的瘢痕，而10是最佳可能的瘢痕。在该图中，带有虚线的条形对应于在Mohs外科手术期间额肌中肌内注射BoNT/E进行治疗的患者，空心的条形(无填充)对应于用生理盐水治疗的安慰剂组的患者。与未使用BoNT/E治疗的受试者相比，BoNT/E治疗的受试者在手术伤口愈合期间的急性瘢痕形成阶段的第2天和第30天进行评估时，VAS评分的平均变化较大。

使用患者与观察者瘢痕评估量表(POSAS)，在第2、8、30和90天评估了患者瘢痕的颜色。颜色成分为1到10的等级，其中评分1分对应于受试者的正常皮肤颜色，而评分10分对应于瘢痕相对于受试者正常皮肤的“非常不同”的颜色。图7B中的条形图显示了在Mohs外科手术期间在额肌中肌内施用BoNT/E改善了在外科手术之后的前30天内患者观察到的变色。

该研究中的患者还使用POSAS来评估伤口部位的组织的硬度。使用1到10的等级，其中评分1对应于受试者正常皮肤的硬度，而评分10对应于相对于受试者正常皮肤的“非常不同”的硬度，患者在第2、8、30和90天进行了评估。图7C是柱状图，其显示了使用患者与观察者瘢痕评估量表(POSAS)在第2-8天、第2-30天和第2-90天患者报告的瘢痕评估的硬度成分的平均变化。与作为Mohs外科手术一部分的未使用肉毒杆菌毒素治疗的患者(安慰剂组，空心条)相比，在Mohs外科手术期间在额肌中进行肌内注射BoNT/E治疗的患者报告了瘢痕的物理特性得到改善(虚线填充条)。

对实施例5的研究中的受试者询问与瘢痕有关的痒和疼痛。在第2、8、30和90天询问受试者：“您在过去24小时内是否受到任何瘢痕引起的痒感困扰？”。在第2、8、30和90天，还询问了受试者“您在过去24小时内是否受到任何瘢痕引起的疼痛的困扰？”。下表中总结了对问题做出了肯定答复的受试者。

对瘙痒问题回答“是”的受试者的数量和百分比

对痛苦问题回答“是”的受试者的数量和百分比

组	第2天	第8天	第30天	第90天
					安慰剂(n＝4)	4(100％)	2(50％)	0	0
BoNT/E(n＝8)	6(75％)	2(25％)	0	0

用BoNT/E治疗的受试者报告，在伤口产生后到伤口开始愈合约21天、25天或30天期间，在急性瘢痕形成阶段，与瘢痕有关的瘙痒减少，疼痛减轻。因此，在一个实施方案中，一种使瘢痕形成最小化并改善与伤口愈合相关的瘢痕外观的方法通过一种减少与瘢痕有关的瘙痒和/或疼痛的方法而实现。即，用BoNT/E治疗伤口或伤口下方的肌肉可改善瘢痕外观并减少与瘢痕形成(或伤口愈合)相关的瘙痒或疼痛。在一个实施方案中，在75％或更多的接受BoNT/E治疗的患者中，施用BoNT/E可以在24-48小时内减少与瘢痕有关的痒感。在另一实施方案中，在至少约25％或50％的接受BoNT/E治疗的患者中，施用BoNT/E可以在伤口产生后和伤口愈合期间减轻疼痛2-8天或1周。

在研究的第1天和第2天(外科手术后24小时)以及第30天和第90天，在外科手术之前拍摄了手术伤口的照片。这些照片(本文未显示)显示，接受BoNT/E治疗的受试者相对于未使用BoNT/E治疗的受试者，在第30天和第90天时瘢痕的发红降低。

因此，一方面，通过在伤口附近施用E型肉毒神经毒素提供了一种使伤口瘢痕最小化的方法。如实施例5的数据所证明的，相对于安慰剂，向伤口或伤口附近的肌肉施用BoNT/E改善了瘢痕外观的结果，并且具有减少瘙痒和减轻疼痛的额外益处，特别是在伤口产生后的第一周或十天内的疤痕形成的急性期期间。

另一方面，提供一种使伤口的瘢痕最小化的方法或一种改善伤口的外观的方法。所述方法包含将BoNT/E在伤口产生之前、期间或之后施用至伤口或其附近。BoNT/E的施用改善了瘢痕的外观和/或使瘢痕形成最小化，且还改善了BoNT/E施用后2-8天内的瘢痕的变色。在一个实施方案中，在BoNT/E治疗后30天、60天或90天，该治疗方法减少了瘢痕发红。在另一实施方案中，相对于未用BoNT/E治疗的受试者，治疗方法在治疗后的前30天内降低了瘢痕的硬度。

实施例5中的研究表明，速效BoNT/E在伤口愈合过程中具有益处，因为其作用比较慢起效的毒素具有更即时的效果。在伤口形成之后的数小时和数天中，当开始形成瘢痕的生物学功能时，在伤口部位存在的速效毒素有助于改善瘢痕的整体外观、减少其发红和硬度，并减轻疼痛和瘙痒。BoNT/E提供了快速起效的作用，使得在伤口产生后的几分钟和几小时内，甚至(如果在伤口产生前施用BoNT/E的话)在伤口产生之前，仍会或基本上使伤口附近的肌肉麻痹。BoNT/E的短持续时间是有利的，因为伤口愈合过程大约数周至一个月，这与BoNT/E的作用持续时间有关。

在一个实施方案中，考虑到使瘢痕最小化或改善在已有瘢痕上形成的伤口上形成的瘢痕外观。例如，在与先前的外科手术操作相同或相似的位置处具有第二次外科手术操作的受试者将具有在与先前外科手术产生的已有瘢痕重叠的位置处产生的外科伤口。与在皮肤上形成的瘢痕相比，在已有瘢痕上形成的瘢痕可能表现出更严重的变色和/或发红。本发明的治疗方法被考虑用于伤口位置局部或基本上完全与已有瘢痕重叠的患者。

可以在本文所述的实施方案中使用控释系统，以在特定时间段内以预定速率在体内递送神经毒素。通常，释放速率由系统的设计确定，并且可在很大程度上与环境条件(例如pH)无关。可以在几年内递送药物的控释系统是已知的。相反地，缓释系统通常在24小时或更短的时间内递送药物，并且环境因素可影响释放速率。因此，神经毒素从植入的控释系统(“植入物”)中的释放速率随载体植入物材料和药物本身的物理化学性质而变化。通常，植入物由惰性材料制成，该惰性材料很少或根本不会引起宿主反应。

控释系统可以包括掺入载体中的神经毒素。载体可以是聚合物或生物-陶瓷材料。可以将控释系统注射、插入或植入患者身体的选定位置，并且在其中停留较长的时间，在此期间，神经毒素被植入物以提供所需治疗功效的方式和浓度释放。

聚合材料可由于扩散、化学反应或溶剂活化以及受到磁、超声或温度变化因素的影响而释放神经毒素。扩散可以来自容器或基质。化学控制可以归因于聚合物降解或药物从聚合物中的裂解。溶剂活化可包括聚合物溶胀或渗透作用。

植入物可以通过将所需量的稳定化的神经毒素混入溶于二氯甲烷中的合适的聚合物的溶液中来制备。该溶液可以在室温下制备。然后可以将溶液转移到培养皿中，并在真空干燥器中蒸发二氯甲烷。根据所需的植入物尺寸以及因此掺入的神经毒素的量，将合适量的经干燥的掺有神经毒素的植入物在模具中在约8000p.s.i下压缩5秒钟或在3000p.s.i.下压缩17秒钟，以形成包封神经毒素的植入盘。

优选地，所使用的植入物材料是基本上无毒的、非致癌的且非免疫原性的。合适的植入物材料包括聚合物，例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(p-HEMA)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(p-NVP)+、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PM)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、乙烯-乙酸乙烯酯(EVAc)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮/丙烯酸甲酯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚酐、聚(原酸酯)、胶原蛋白和纤维素衍生物以及生物陶瓷、例如羟基磷灰石(HPA)、磷酸三钙(TCP)和磷酸铝钙(ALCAP)。乳酸、乙醇酸和胶原蛋白可用于制造可生物降解的植入物。

植入物材料可以是可生物降解的或可生物蚀解的。可生物蚀解的植入物的优点是不需要将其从患者中移除。可生物蚀解的植入物可以基于生物活性物质的膜或基质释放。已知由PLA-PGA制备的可生物降解的微球用于皮下或肌内施用。

本公开内容还包括用于实施所公开的实施方案的试剂盒。该试剂盒可以包括30号规格或更小的针和相应的注射器。该试剂盒还包括梭菌神经毒素组合物，例如E型肉毒杆菌毒素组合物。可以在注射器中提供神经毒素组合物。该组合物可通过针注射。根据注射器和针的大小以及其中含有的可注射组合物的体积，将试剂盒设计成各种形式，这又基于设计试剂盒以用于治疗的具体缺陷。

实施例

提供以下非限制性实施例仅出于说明性目的，以便于更完整地理解代表性实施方案。该实施例不应被解释为限制本说明书中描述的任何实施方案。

实施例1

E型肉毒杆菌毒素治疗眉间纹的用途

在人类中进行了一项随机、双盲、安慰剂对照、递增剂量的队列的2a期研究，以评估所公开的速效E型组合物在患有眉间纹的受试者中单次治疗周期的安全性和有效性。这项研究是按照本方案以及所有适用的联邦和州法规进行的。组合物由E型肉毒神经毒素(BoNT/E，“EB-001”)构成。

总剂量分为5次注射；如图5所示，在中线向降眉间肌内注射1次，在内侧和外侧皱眉肌的两侧各注射一次。总剂量如下：

每个受试者接受5次注射，每个部位注射的体积为0.1mL。注入外侧皱眉肌的间隔在眉弓上方或大约1厘米处，已知这可以使潜在的上睑下垂最小化。

实施例2

E型肉毒杆菌毒素用于眉毛上提术的用途

一名60岁的妇女的眉毛延伸到她的眉骨下方。医师推荐如本文所公开的组合物，将其皮下注射在每只眼睛的上方。各注射位点接受约10单位的E型肉毒杆菌毒素，并在眼睛的任一侧进行数次注射。眉毛的下垂在约2天内减少，并在施用后3个月内基本缓解。

实施例3

E型肉毒杆菌毒素用于隆胸的用途

一名30岁的妇女选择进行隆胸手术。手术前4小时，在将要产生手术切口的附近施用E型肉毒杆菌毒素。施用减少了切口区域的肌肉张力，从而使瘢痕最小。手术后两周，施用补充剂量。

实施例4

E型肉毒杆菌毒素用于减少Mohs外科手术后瘢痕的用途

一名44岁的女性被诊断出患有皮肤癌，特别是额头区域的基底细胞癌(BCC)。除BCC外，该患者身体健康，未怀孕、打算怀孕或正在哺乳。该患者也没有肌肉神经接点的既往疾病(重症肌无力、伊顿-兰伯特综合症或肌萎缩性脊髓侧索硬化症)。在Mohs手术之前的30天内，患者未在前额区域进行任何美容手术、激光换肤治疗或类维生素A疗法。患者在基线没有眉毛或眼睑下垂，也没有任何增生性瘢痕或瘢痕疙瘩形成的病史，也没有医生评估的其他伤口异常情况。

该患者从未而且一直未使用过烟草且重140磅。

患者选择接受Mohs外科手术。Mohs外科手术的目标是消除尽可能多的皮肤癌，同时对周围健康组织的损害最小。Mohs外科手术通常在门诊使用局部麻醉剂进行。

皮肤癌的根源可能会超出肿瘤的可见部分。如果不清除这些根源，则癌症会复发。Mohs手术首先要由美国Mohs外科手术学院(ACMS)的专家检查可见的病变并计划要切除哪些组织。然后，患者接受局部麻醉，手术开始。

该过程分阶段(全部在一次就诊中)进行，而患者在每个阶段之间等待。去除一层组织后，外科医生在现场实验室的显微镜下对其进行检查。然后在技术人员的帮助下，外科医生用染料对每个切片进行颜色编码，并在皮肤上做参考标记以显示切片部分。然后绘制手术部位图，以精确追踪组织的每一小部分的来源。如果残留有任何癌细胞，则外科医生会从该精确位置去除另一层组织，同时尽可能多地保留健康组织。在实验室中，外科医生使用显微镜检查组织各切片的下表面和边缘，以寻找残留癌症的证据。如果外科医生在显微镜下找到癌细胞，则他或她会在“地图”上标记出它们的位置，然后返回患者以去除另一层更深的皮肤层——但仅从癌细胞来源的准确位置。这种方法可确保Mohs外科手术所产生的瘢痕最小。

医生重复此过程，直到没有癌细胞残留。

在外科手术后，用E型肉毒杆菌毒素治疗患者额头上的单个2cm瘢痕，该E型肉毒杆菌毒素以5mL小瓶装注射用无菌溶液提供，其在pH 6.0下，标称浓度为19.1ng/mL BoNT/E于0.03M磷酸钠、0.12M氯化钠和1mg/mL人血清白蛋白(HSA)中。BoNT/E的总剂量为2.8ng，在两排中划分为5个注射部位(倒W型；见图6)注射到额肌。注射进入额肌的注射深度应达到皮下水平，以影响浅表额肌组织，同时最大程度地减少出现伤痕的可能性。针头在注射过程中朝外上方，针尖倾斜成30度角。

计划在第2、8、30和90天进行随访。在进行外科手术前(给药前)的第1天、在进行外科手术后的第1天，以及在第2、8、30天(ET)和90(EOS)期间，将按照研究手册中的说明拍摄标准的面部照片。

随访包括：

a.使用直观模拟量表(VAS)进行瘢痕评估

b.瘢痕美容评估与评级(SCARS)

c.患者与观察者瘢痕评估量表(POSAS)

d.研究人员使用面部皱纹量表(FWS-IA)在最高隆起和其余部分处评估前额线

VAS使用固定长度(10厘米)的水平直线评估从最坏到最佳的瘢痕外观。末端定义为从左(最坏)向右(最佳)的瘢痕外观的极限。评分者会在线上标记，以表明瘢痕的外观。

SCARS衡量了术后瘢痕美容，其中全部患者和观察者评分为0(最佳可能的瘢痕)到15(最严重可能的瘢痕)(Kantor,Reliability and Photographic Equivalency of theScar Cosmesis Assessment and Rating(SCAR)Scale,an Outcome Measure forPostoperative Scars,JAMA Dermatol.153(1):55-60,2017)。SCAR量表的评分基于6个观察者评分的项目和2个患者评分的项目。

POSAS包括疼痛和瘙痒的主观症状，并详述了温哥华瘢痕评价量表(VSS)收集的客观数据。它由2个数字数值量表组成：“患者瘢痕评估量表”和“观察者瘢痕评估量表”。它评估了血管分布、色素沉着、厚度、缓解、柔软度和表面积，并结合了患者对疼痛、瘙痒、颜色、硬度、厚度和缓解的评估(Draaijers等人，The patient and observer scar assessmentscale:a reliable and feasible tool for scar evaluation,PlastReconstr.Surg.113(7):1960-1965,2004)。POSAS是唯一考虑到疼痛和瘙痒的主观症状的量表，但是像其他量表一样，它也缺乏关于疼痛或瘙痒是否会影响生活质量的功能测试。线性回归分析表明，观察者的评价受血管分布、厚度、色素沉着和缓解的影响，而患者的评价主要受瘙痒和瘢痕厚度的影响。POSAS已应用于术后瘢痕，并用于评估乳腺癌外科手术后的线性瘢痕，与VSS相比，这证明了内部一致性和观察者间信度，并具有获得患者评级的额外好处。

FWS-IA是一个四点量表，它表示抬头纹的严重性，如下所示：0＝无，1＝轻度，2＝中度或3＝严重。根据调查员的评估，将在最高隆起和其余部分处评估FWS-IA。

随访时未观察到毒素扩散(SOT)效应。

实施例5

E型肉毒杆菌毒素用于使瘢痕最小化和改善瘢痕外观的用途

十二名年龄在58-75岁之间并计划进行Mohs外科手术以去除额头上单个基底细胞癌病变的受试者被随机分为治疗组(n＝8)和安慰剂组(n＝4)。两组受试者均在手术部位附近的额肌中进行了一次肌内注射，治疗组接受一定剂量的BoNT/E，安慰剂组接受生理盐水。受试者和研究人员均设盲；主办者不设盲。下表总结了受试者的人口统计资料。

*由于高张力闭合导致伤口裂开，受试者从分析中排除。

在研究的第1天，让受试者接受外科手术操作，并通过肌内注射给予安慰剂或BoNT/E。进行外科手术以切除癌，并使伤口(长约2厘米)闭合。在研究的第2天(外科手术后24小时)，使用VAS、SCAR和POSAS量表对每个受试者进行评估(参见实施例4)。在第8天，再次使用各种量表对受试者进行评估，并移除外缝合线。在第30天和第90天，再次使用各种量表对受试者进行评估，研究在第90天正式结束。图7A-7C示出了结果。

最后，应当理解，尽管本说明书的各方面是通过参照特定实施方案来强调的，但是本领域技术人员将容易领会，这些公开的实施方案仅是对本文公开主题的组成部分的说明。因此，应当理解，所公开的主题绝不限于本文所述的具体方法、方案和/或试剂等。同样地，在不脱离本说明书的主旨的前提下，可以根据本文的教导对于所公开的主题进行各种修改或改变或替代的组合。最后，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且无意于限制本公开内容的范围，本公开内容的范围仅由权利要求书限定。因此，本公开内容的实施方案并不限于那些精确地示出和记载的实施方案。

本文所记载的某些实施方案，包括发明人已知的用于进行本文所述的方法和设备的最佳模式。当然，在阅读了上述说明之后，这些所记载的实施方案的变型对于本领域普通技术人员将是容易得知的。因此，本公开内容包括如适用法律所允许的，在所附的权利要求书中所述的主题的全部修改方案和等同方案。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在其所有可能的变型中，上述实施方案的任何组合由本公开内容所涵盖。本文公开的特定实施方案可在使用语言“由……组成”或“基本上由……组成”的权利要求中被进一步限制。在权利要求中使用时，无论是被提交的或是通过修改而添加的，过渡术语“由……组成”将权利要求中未指出的任何要素、步骤或成分排除在外。过渡术语“基本由……组成”将权利要求的范围限制为指出的材料或步骤和不实质性影响基本特征和新颖特征的材料或步骤。藉此要求保护的本发明的实施方案在本文中固有地或清楚地描述并且能够实施。

Claims (20)

1.一种使瘢痕最小化的方法，包括：

向患者的伤口附近施用治疗有效量的速效神经毒素。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述速效神经毒素包含E血清型肉毒神经毒素。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述治疗有效量包括约10^-3U/kg至35U/kg的量。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述治疗有效量包括约0.2纳克至约2纳克的量。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用包括注射施用。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述注射施用为肌内注射。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向患者施用A亚型肉毒杆菌毒素。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向患者施用较慢起效的神经毒素。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向患者施用较慢恢复的神经毒素。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述伤口包括外科手术切口。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述外科手术切口是美容外科手术操作的结果。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述外科手术切口是Mohs操作的结果。

13.一种改善伤口上形成的瘢痕的外观的方法，包括：在伤口附近施用治疗有效量的E亚型肉毒杆菌毒素(BoNT/E)。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述伤口为外科手术伤口。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述施用在外科手术操作前进行。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述施用在外科手术操作后进行。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述外科手术伤口与受试者已有的瘢痕重叠。

18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包括减少瘢痕发红的量，相对于未经BoNT/E治疗的患者中类似伤口上形成的瘢痕。

19.根据权利要求13-18中任一项所述的方法，所述治疗有效量包括减少瘢痕硬度的量，相对于未经BoNT/E治疗的患者中类似伤口上形成的瘢痕。

20.根据权利要求13-19中任一项所述的方法，还包括在伤口附近施用A亚型肉毒杆菌毒素。

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