JP4527531B2 - 改良された増殖の特徴を伴う高められた抗体産生細胞株の生成方法 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子的に変えられた抗体産生細胞宿主をin vitroおよびin vivoで生成してそれにより該細胞が所定の抗体分子、免疫グロブリン(Ig)鎖若しくはIgドメイン(1種若しくは複数)に相同な領域を含有するポリペプチドの高められた産生、プロセシングおよび/若しくは細胞外分泌を表す方法を提供する。本発明はまた、高められた免疫グロブリンの発現、安定性、プロセシングおよび/若しくは分泌の調節に関与する遺伝子を同定するための遺伝子発見のためのこうした高力価抗体産生体細胞の使用方法も提供する。増大された抗体産生を伴う細胞の一同定方法は、抗体、Ig Lおよび/若しくはH鎖またはIgドメインを含むポリペプチドを産生するミスマッチ修復(MMR)欠陥細胞のスクリーニングによる。
[発明の詳細な記述]
本明細書に引用されるGenBankデータベース配列への受託番号を包含する参照研究、特許、特許出願および学術論文は当業者の知識を確立し、かつ、これにより、それぞれが引用することにより組込まれることをとりわけかつ個別に示された場合と同一の程度までそっくりそのまま引用することにより組み込まれる。本明細書に引用されるいかなる参考文献と本明細の特定の教示との間のいかなる衝突も後者に有利に解決されるべきである。同様に、語若しくは句の技術で理解された定義と、本明細でとりわけ教示されるところの語若しくは句の定義との間のいかなる衝突も後者に有利に解決されるべきである。
高められた抗体/免疫グロブリン産生体株を生成するためのミスマッチ修復欠陥細胞の生成。
[実施例2]
遺伝子発見のための増大された免疫グロブリン産生を伴うハイブリドーマクローンのスクリーニング。
[実施例3]
抗体若しくは分泌型タンパク質産生を高めることに関与する遺伝子を同定するための高力価抗体/免疫グロブリン産生体細胞の使用。
プライマー マウスAATおよびEMAP発現分析
配列番号3 AATセンス 5’−ttgaagaagccattcgatcc−3’
配列番号4 AATアンチセンス 5’−tgaaaaggaaagggtggtcg−3’
配列番号5 EMAPIセンス 5’−atgcctacagagactgagag−3’
配列番号6 EMAPIアンチセンス 5’−gattcgcttctgggaagtttgg−3’
PCR反応を95℃30秒間、58℃1分間、72℃1分間で18ないし33サイクル実施して直線範囲で発現を測定した。図2は、H6親およびH34過剰産生体株におけるAATおよびEMAPI遺伝子の定常状態発現の代表的プロファイルを示す。示されるとおり、AATおよびEMAPI双方について親対照に比較して発現の有意の喪失がH34過剰産生体株で観察された。DHFR発現レベルは双方のサンプルについて同様であり、双方のサンプルについての無傷のRNAおよび等しい負荷を示す。これらのデータは、哺乳動物細胞における抗体産生の調節におけるAATおよびEMAPIの役割を示唆する。
抗体産生を調節するためのα−1−アンチトリプシン経路に対し標的を定めた小分子の使用。
高められた若しくは抑制された免疫グロブリン産生についての細胞クローンのスクリーニングのためのα−1−アンチトリプシンおよび/若しくは内皮単球活性化ポリペプチドIに対する抗体の使用。
Claims (15)
- 抗体産生に関与する遺伝子の発現を抑制する工程を含んでなる、高力価抗体産生細胞のインビトロ製造方法であって、前記遺伝子がα−1−アンチトリプシンをコードする、方法。
- 前記遺伝子の発現を抑制する工程が、
a)前記α−1−アンチトリプシン遺伝子に対し向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入すること;
b)前記α−1−アンチトリプシン遺伝子に対し向けられたアンチセンス転写物を含む発現ベクターを導入すること;
c)前記α−1−アンチトリプシン遺伝子の内因性の機能を破壊するためのノックアウトターゲッティングベクターを導入すること、又は
d)前記α−1−アンチトリプシン遺伝子に対し向けられたリボザイムを含むポリヌクレオチドを導入すること
のいずれかを含んでなる、請求項1に記載の方法。 - 抑制が、前記α−1−アンチトリプシン遺伝子の産物に対する細胞内阻害抗体を導入することによって、又は増殖培地中の前記遺伝子の産物に対し向けられた中和抗体とともに細胞をインキュベートすることによって達成される、請求項1に記載の方法。
- 内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子の発現を抑制する工程をさらに含んでなる、請求項1〜3いずれかに記載の方法。
- 前記内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子の発現を抑制する工程が、
a)前記内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子に対し向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入すること;
b)前記内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子に対し向けられたアンチセンス転写物を含む発現ベクターを導入すること;
c)前記内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子の内因性の機能を破壊するためのノックアウトターゲッティングベクターを導入すること、又は
d)前記内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子に対し向けられたリボザイムを含むポリヌクレオチドを導入すること
のいずれかを含む、請求項4に記載の方法。 - 前記内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子の抑制が、前記内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子の産物に対する細胞内阻害抗体を導入することによって、又は増殖培地中の前記遺伝子の産物に対し向けられた中和抗体とともに細胞をインキュベートすることによって達成される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が、ハイブリドーマ、上皮細胞、卵巣細胞、腎細胞、骨髄性細胞、又はリンパ系細胞である、請求項1〜6いずれかに記載の方法。
- α−1−アンチトリプシンの発現が阻害されるようなα−1−アンチトリプシン遺伝子中の欠陥を含んでなる、抗体分子又はそれらのフラグメントを産生する宿主細胞。
- 前記欠陥がα−1−アンチトリプシン遺伝子の欠失を含んでなるか、又は前記欠陥がα−1−アンチトリプシン遺伝子中のフレームシフト突然変異である、請求項8に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、
a)α−1−アンチトリプシン遺伝子のアンチセンス転写物を含んでなる発現ベクター、ここで、前記アンチセンス転写物の発現がα−1−アンチトリプシン遺伝子の発現を抑制する;
b)α−1−アンチトリプシン遺伝子の発現を破壊するリボザイム;又は
c)α−1−アンチトリプシンタンパク質に対する細胞内中和抗体、ここで、前記抗体がα−1−アンチトリプシンの活性を抑制する、
を含んでなる、請求項8に記載の宿主細胞。 - 抗体分子の少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターをさらに含んでなる、請求項10に記載の宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも免疫グロブリン軽鎖若しくはそのフラグメント又は免疫グロブリン重鎖若しくはそのフラグメントをコードする、請求項11に記載の宿主細胞。
- 内皮単球活性化ポリペプチドIの発現が阻害されるような内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子中の欠陥をさらに含んでなる、請求項8〜12いずれかに記載の宿主細胞。
- 前記欠陥が内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子の欠失を含んでなるか、又は前記欠陥が内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子中のフレームシフト突然変異である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、
a)内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子のアンチセンス転写物を含んでなる発現ベクター、ここで、前記アンチセンス転写物の発現が内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子の発現を抑制する;
b)内皮単球活性化ポリペプチドI遺伝子の発現を破壊するリボザイム;又は
c)内皮単球活性化ポリペプチドIタンパク質に対する細胞内中和抗体、ここで、前記抗体が内皮単球活性化ポリペプチドIの活性を抑制する、
を含んでなる、請求項13に記載の宿主細胞。
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