KR101348295B1 - Ｂｍｐ２ 발현 세포를 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 BMP2를 발현하는 세포를 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 BMP2를 발현하는 세포들 중에서 세포 생존율과 BMP2의 생산성이 가장 우수한 하나의 세포를 선택하기 위하여 무혈청 배지에서 상기 세포를 단일클론으로 배양 및 대량 증식시키는 방법에 관한 것이다.

Description

ＢＭＰ２ 발현 세포를 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법{METHOD FOR CULTURING CELL EXPRESSING BMP2 AS SINGLE CLONE IN SERUM FREE MEDIUM}
본 발명은 BMP2를 발현하는 세포를 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 BMP2를 발현하는 세포들 중에서 세포 생존율과 BMP2의 생산성이 가장 우수한 하나의 세포를 선택하여 무혈청 배지에서 단일클론으로 배양하고, 이러한 단일클론 세포를 대량 증식시키는 방법에 관한 것이다.
세포주를 개발하는 과정에는 형질도입 또는 MTX 유전자 증폭과 같은 다양한 기법들이 사용되며, 이에 따라 특성이 다양한 세포들이 생성되거나 증식된다. 이 때, 여러가지 특성을 갖는 다양한 세포들이 혼재되어 있기 때문에, 상기 세포들 중에서 원하는 단백질을 발현하는 능력이 가장 높거나 세포 생존율, 세포수 등의 특성이 우수한 하나의 특정 세포를 선별하여 이를 대량 증식시키는 것이 요구된다. 이와 같이 하나의 단일 세포를 분리하여 단일클론으로 배양 및 증식할 수 있는 방법은 세포의 생존율과 발현되는 단백질의 특성 등을 정확하게 확인하기 위하여 선행적으로 반드시 필요하다. 따라서, 원하는 세포를 단일클론으로 선별할 수 있는 방법을 개발하는 것은 중요한 기술적 과제이다.
통상적으로, 동물세포를 배양하기 위해 사용되는 배지에는 동물세포 성장인자가 포함되며, 상기 동물세포 성장인자로서 소태아혈청과 같은 혈청 성분이 종종 사용된다. 그러나, 혈청을 포함하는 배양배지의 배양상청액으로부터 유래된 생성물을 정제하는 데에는 추가적인 시간과 노력이 소요되며, 원하는 정도로 정제가 되지 않을 수 있다. 또한, 소태아혈청과 같은 성분은 고가이기 때문에 세포를 단일클론으로서 선별하는 과정의 비용을 전체적으로 증가시키는 요인이 된다. 뿐만 아니라, 동물로부터 유래된 혈청은 크로이펠츠 야곱병 또는 스크래피와 같이 광우병 관련 프리온 등의 바이러스에 감염될 가능성이 있기 때문에, 혈청 함유 배지에서 배양되는 세포는 안전성이 충분하게 보장되지 못한다는 단점이 있다. 또한, 혈청 함유 배지가 생물학적 실험에 사용되는 경우에는 혈청 내에 포함되어 있는 다양한 단백질 등 때문에 세포배양 후 수득된 생성물의 분리정제 공정이 매우 복잡해지고, 이에 따라 전체적인 실험 시스템이 복잡해지게 된다. 더욱이, 혈청에는 미확인된 다양한 성분들이 포함되어 있기 때문에, 원인과 효과 사이의 정확한 관계가 도출되지 않을 수 있다.
특히, 세포를 단일클론으로 선별하고 배양하는 과정에서 혈청의 사용이 바람직하지 않은 이유는, 배치(batch)마다 혈청의 조성이 달라지기 때문에 실험의 재현성을 얻기가 어렵다는 점이다. 즉, 동일한 세포를 같은 성분의 배지에서 배양한다고 하더라도, 그 배양의 결과는 일반적으로 다르게 나타난다.
이러한 이유들 때문에 세포를 단일클론으로 선별하고 배양하는 과정에서 무혈청 배지를 사용할 필요가 있다.
CloneMedia-CHO는 clone fix 기기와 함께 사용되는 젤 유형의 배지로서, 6-웰 플레이트에 적정수의 세포를 넣어 배양한 후, 항체반응을 통해 발현되는 형광의 강도로 기계가 picking하는 용도로 사용되던 배지이다. 그러나, 상기 배지와 함께 사용되는 clone fix와 같은 기기는 매우 고가(6억 이상)이며, 여기에 적용할 수 있는 다양한 항체, 예컨대 BMP2에 대한 항체가 없다는 단점이 있다. 또한, 6-웰 플레이트에서 배양을 할 경우 육안에 의해 각 클론들의 식별은 가능하였지만, 기계를 사용하지 않고 단일클론으로 분리하는 것은 거의 불가능하였다. 이에, 본 발명자들은 96-웰 플레이트에 세포를 하나씩 넣어 배양시켰으나, 세포들이 성장하지 않았을 뿐만 아니라, 배지가 매우 끈적하여 취급하기도 어렵고 버블이 많이 생겨 관찰이 어렵다는 문제점이 발생하였다.
EX-CELL ACF CHO 배지는 SIGMA사에서 제품명 C5467로서 시판되며, CHO PF-AF 배지로도 불리워진다. 이 배지에는 무기염, HEPES, 중탄산나트륨, 인간 인슐린 및 Pluronic® F-68 등의 구성성분이 함유되어 있는 반면, L-글루타민, 히포크산틴, 티미딘은 함유되어 있지 않다. EX-CELL ACF CHO 배지는 CHO 세포의 배양 및 성장을 위해 사용되는 무혈청 배지이지만, 실제로는 혈청을 사용하지 않으면 하나의 단일 세포가 배양되지 않는다는 문제점이 있다. 본 발명자들이 실험해본 결과에 따르면, 동물 유래 성분인 혈청을 함유하지 않는 배지에서 96-웰 플레이트에 약 50 내지 100개의 세포를 넣어야만 군집이 형성되었다는 점이 입증되었다. 그러나, 50 내지 100개의 세포로부터 형성된 군집은 본 발명에서 목적하는 단일클론으로 볼 수 없다.
종래에는, 단일클론의 세포를 배양증식하기 위한 방법으로서, (i) 혈청 함유 배지에 한계희석법에 의해 웰 당 하나의 단일클론을 넣어 부착 배양하는 방법, 및 (ii) 혈청과 같은 동물유래 성분을 첨가하지 않은 배지에 50 내지 100개의 세포를 넣어 집단선별(group selection, 즉 클러스터의 형성 유도)하는 방법이 존재하였다.
상기 첫번째 방법은 동물에서 유래된 성분(예컨대, 혈청)이 인체에 유해할 수 있다는 점, 부착 배양 후 대량 생산을 위해 필요한 부유 배양에 세포를 다시 적응시켜야 하기 때문에 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 세포가 부유 배양에 적응하는데 실패하는 경우가 발생할 수 있다는 단점이 있다.
상기 두번째 방법은 동물에서 유래된 성분 없이 배양할 수는 있지만, 세포를 집단으로 선택하는 방법이기 때문에 하나의 단일클론 세포만을 선별한다는 목적에 부합하지 않는다.
본 발명자들은 전술한 종래의 기술적 문제점을 해결하기 위하여 무혈청 배지에서 BMP2 발현 세포들을 단일클론으로 배양시킬 수 있는 방법을 제공한다. 상기 본 발명의 방법에 따라 배양된 단일클론 세포들 중에서 BMP2의 생산성이 가장 높고 생존율이 가장 우수한 하나의 특정 세포를 선택할 수 있게 되며, 이러한 특정 세포를 대량으로 증식할 수 있게 된다.
본 발명에서 BMP2 발현 세포를 단일클론으로 배양하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) L-글루타민을 포함하는 EX-CELL ACF CHO 배지에 반고형 배지를 첨가하는 단계, 및 (b) 상기 a) 단계에서 제조된 배지에서 BMP2 발현 세포를 배양하여, 단일클론의 세포를 수득하는 단계.
바람직하게는, 상기 a) 단계에서 제조된 배지에 혈청이 포함되지 않는다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 반고형 배지는 EX-CELL ACF CHO 배지와 1:3 내지 3:1의 부피비, 특히 바람직하게는 1:1의 부피비로 첨가된다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 L-글루타민의 농도는 1 내지 20 mM, 바람직하게는 8 mM이다. 또한, EX-CELL ACF CHO 배지는 F68을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 최종농도가 0.18%인 F68을 포함한다.
본 발명의 또다른 일구현예에 따르면, 상기 a) 단계 이전에, BMP2 발현 벡터의 세포내 형질도입 또는 MTX를 이용한 BMP2 유전자의 증폭에 의해 BMP2 발현 세포를 생성하는 단계가 추가적으로 수행된다.
본 발명의 또다른 일구현예에 따르면, PACEsol 유전자의 세포내 형질도입을 통해 정확한 크기의 성숙(mature) BMP2 단백질의 발현을 유도하는 단계가 포함되며, 적합한 배지를 선별하기 위한 배지 적응 단계가 추가적으로 수행된다.
본 발명의 또다른 일구현예에 따르면, 상기 b) 단계 이후에, 수득된 단일클론의 세포를 부유 배양하여 증식시키는 단계가 추가적으로 수행된다.
본 발명의 또다른 일구현예에 따르면, 상기 b) 단계 이후에, 복수개의 단일클론의 세포들 중에서 BMP2의 생산성 또는 세포 생존율이 가장 우수한 하나의 세포를 선별하는 단계가 추가적으로 수행된다.
본 발명은 하기의 실시예와 도면에 의해 더욱 상세하게 설명될 것이다. 다만, 본 발명의 권리범위는 하기의 실시예에 의해 제한되지 않으며, 당업자라면 본 발명의 의미 내에서 다양한 변형들을 수행할 수 있을 것이다.
종래에 혈청을 배지에 첨가하여 사용한 경우에는 인체에 대한 안전성이 보장되지 못하였다. 또한, 혈청 함유 배지에서 세포주를 개발하는 데에는 약 2년 이상의 기간이 소요되었으며, 부착 배양된 세포들을 대량으로 생산하기 위해 부유 배양을 적용할 경우 세포들은 부유 배양 배지에 대한 적응 기간이 필요하게 되며, 이 때 세포들이 부유 배양 배지에 적응하지 못할 경우에는 또다시 세포주 개발을 수행하여야 한다. 또한, 배지에 포함되어 있는 혈청은 배양된 세포에 대해 영향을 미칠 수 있기 때문에, 추후 생체 내에서의 사용에 필요한 승인을 받기 위해서는 혈청의 영향을 확인하는 비용과 시간이 추가적으로 발생하게 된다.
반면, 본 발명에 따른 방법에서는 배지에 혈청이 첨가되지 않으므로 인체에 대한 안전성이 보장될 수 있다. 뿐만 아니라, 배지에 혈청이 포함되어 있지 않기 때문에 부착 배양과 대량 생산을 위한 부유 배양 사이에서 세포가 별도로 적응할 기간이 필요하지 않으므로 세포주를 개발하는데 평균적으로 약 6개월 이상의 기간을 단축시킬 수 있으며, 이에 따라 종래의 혈청 함유 배지에 필요한 비용도 전체적으로 감축될 수 있게 된다. 또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 무혈청 배지에서 배양된 세포들은 부유 배양 배지에 적응할 필요가 없을 뿐만 아니라, 혈청이 사용됨으로써 배양된 세포 및 생산된 단백질에 대해 미치는 영향을 입증할 필요가 없게 된다. 더욱이, 세포들이 군집의 형태로 일정 기간 동안 유지될 경우에는 군집 내 일부 세포들의 성질이 변질됨에 따라 세포에서 생산되는 단백질의 질과 양에도 영향을 미치는 것이 일반적이지만, 본 발명의 방법에 따라 세포를 단일클론으로 배양할 경우에는 생산성이 우수한 세포를 선택할 수 있을 뿐만 아니라 선택 이후에는 성질이 균질한 세포들을 대량으로 배양할 수 있기 때문에 성질의 변화 없이 우수한 세포를 계속 유지할 수 있다는 장점을 얻을 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 방법에 의해, 세포주 개발 과정에서 필수적이었으나 혈청 없이는 불가능했던 단일클론 생성이 무혈청배지에서도 가능하게 되었다. 특히, 단백질 발현 및 세포 생존율과 같은 특성이 다양한 세포들 중에서 우수한 세포를 선택하기 위하여 세포들을 단일클론으로서 배양하여 대량 증식할 수 있으므로, 본 발명에 따른 배양방법은 형질도입, MTX 유전자 증폭과 같이 종래에 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 다수의 기법들과 함께 조합하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 첨부된 도면에 도시되어 있는 사진은 라이카(LEICA) 형광 현미경으로 관찰한 이미지에 해당한다.
도 1a 내지 도 1d는 무혈청 EX-CELL ACF CHO 배지와 반고형 배지를 50:50의 부피비로 조합한 배지에서 웰 당 1 개의 단일클론 세포를 부착 배양한 결과를 나타낸다. 각 도면은 다른 종류의 단일클론 세포를 이용하였을 때의 결과이며, 각 도면의 아래에는 배양으로부터 경과한 시간을 나타낸다. 단일클론 세포별로 세포주의 성장 속도에 차이가 있지만 비슷한 형태로 자라는 것을 상이한 클론들에서 확인하였다.
도 2a는 단일클론으로 배양된 세포들 각각에 대해 세포생존율과 이에 따른 세포주 성장율을 나타낸 것이며, 도 2b는 세포의 BMP2 생산성을 나타낸 것이다. 여기서, 도 2a 및 2b의 X축에 기재되어 있는 번호는 단일클론 세포들에 대해 본 발명자가 각각 부여한 번호들이다.
도 3a는 단일클론으로 배양된 세포들 중에서 Clone #33, 34, 49를 선별하여 Fed-batch test를 수행한 후에 측정한 세포생존율과 세포성장율을 나타내며, 도 3b는 세포의 BMP2 생산성을 나타낸다. 여기서, 도 3a 및 3b의 X축은 배양일수를 나타낸다.
도 4는 Clone #34의 웨스턴 블롯을 통해 BMP2 단백질이 정확하게 발현되는지를 보여준다. 상단의 이미지와 하단의 이미지는 서로 다른 항체를 이용하여 각각 BMP2 단백질의 발현 결과를 확인한 결과이며, 서로 다른 항체를 이용한 경우에도 동일한 크기의 단백질이 발현된다는 점을 확인할 수 있었다.
도 5는 본 실시예에 따라 Clone #34를 단일클론으로 배양하는 전체 과정에 있어서 세포성장율과 BMP2 생산성의 변화를 나타낸다.
1. BMP2 발현 벡터의 준비
pINCY 벡터를 미국의 Thermo사에서 구입하여 PCR 방법에 의해 BMP2 유전자를 증폭시켰다. 이어서, Qiagen gel extraction 키트를 이용하여 분리한 BMP2 유전자를 pOptiVECTM-TOPO 벡터에 라이게이션한 후 클로닝하였다. 이와 같이 제조된 벡터를 E.coli DH5α 세포에 형질도입한 후, 이 세포를 배양하여 다량의 벡터들을 준비하였다.
2. BMP2 벡터의 동물세포 형질도입을 통한 BMP2 단백질의 발현
상기 BMP2 벡터의 DNA가 형질도입에 의해 세포의 DNA에 잘 들어갈 수 있도록 하기 위하여, 상기 벡터를 PVU I 효소에 의해 절단하여 선형화시켰다. 그 후, DNA cleanup 키트(QIAGEN사)를 사용하여 순수 분리하였다.
숙주세포인 CHO DG44 세포(INVITROGEN사)를 형질전환하기 48시간 전에 3x105 세포수/ml의 농도로 CD DG44 배지(GIBCO사)에서 37℃ 및 5% CO2의 조건하에서 세포를 배양하였다. 이어서, 형질전환하기 24시간 전에 상기 배양한 CHO DG44 세포를 3x105 세포수/ml의 농도로 CD DG44 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건하에서 배양하였다. 배양 결과 CHO DG44 세포의 생존율이 95% 이상으로 나타났을 때, 상기에서 제조된 BMP2 벡터를 이용하여 형질도입을 수행하였다.
보다 구체적으로는, 선형화시켜 순수 분리한 37.5μg의 BMP2 벡터 DNA와 37.5μl의 FreeStyle 시약(INVITROGEN사)을 OptiPRO SFM(GIBCO사) 내에서 혼합액을 만들어 RT에서 인큐베이션한 후, 상기 준비된 30ml의 CHO DG44 세포가 배양되고 있는 125ml 플라스크에 천천히 넣었다. 그 후, 이를 37℃ 및 5% CO2의 조건하에서 배양하였다.
형질도입으로부터 48시간이 경과한 후, 세포 배양배지를 HT(hypoxanthine and thymidine) 영양성분이 결핍되고 8mM의 L-글루타민 및 0.18%의 F68을 함유하는 CHO C8862 배지(SIGMA사)로 교환하여 5x105 세포수/ml의 농도로 세포를 배양하였다. 생존율이 90% 이상이 될 때까지 약 2주 동안 배양을 진행하였으며, BMP2의 생산성을 측정하기 위하여 BMP2-특이적 ELISA(R&D사)를 사용하였다. 상기 F68은 SIGMA사에서 제품명 Pluronic®로 시판되는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체(평균 분자량 8350)이며, 하기 식을 갖는 것이다:
Figure 112013002784953-pat00001
이와 같이 형질도입에 의해 생성된 세포들은 BMP2의 생산성이 각각 상이하였다. 따라서, 이러한 다양한 세포들 중에서 BMP2의 생산성이 가장 우수한 하나의 세포를 효과적으로 선택할 수 있는 것이 필요하다.
3. MTX 를 이용한 BMP2 유전자의 증폭
상기 CHO C8862 배지에서 MTX의 농도를 순차적으로 높여 첨가하면서 배양을 진행하였으며, 생존율이 90% 이상일 경우 더 높은 수준의 다음 농도로 처리하였다(50nM → 100nM → 250nM → 500nM → 750nM → 1000nM → 2000nM). 2000nM의 MTX로 처리하여 유전자 증폭을 하였을 때 세포의 BMP2 생산성이 가장 증가하였다.
여기에서, MTX를 이용하여 유전자 증폭된 세포들은 폴리클로날 군(polyclonal population)이기 때문에, 이에 대해 단일 클론 선별(single clone selection) 과정이 반드시 필요하다.
4. 배지 스크리닝
BMP2 생산성 및 세포 생존율이 가장 우수한 세포를 배양할 수 있는 배지를 선택하기 위하여 배지 스크리닝을 실시하였다.
본 발명자들은 SIGMA사의 C8862, SIGMA사의 C5467 배지(즉, EX-CELL ACF CHO 배지), HYCLONE사의 CDM4 CHO(SH30558) 배지, GIBCO사의 CD OptiCHO(12681) 배지, 및 LONZA사의 PowerCHO2 배지를 사용하였다. 상기 배지에 8mM(최종농도)의 L-글루타민과 10% F68 18ml/L(최종 농도는 0.18%임)를 첨가하였으며, BMP2 세포주가 이미 적응되어 있는 C8862 배지를 제외한 나머지 배지들에 대해서는 그 비율을 25%, 50%, 75%, 100%로 순차적으로 높이면서 적응시켰다.
세포 생존율과 BMP2의 생산성에 근거하여 BMP2 발현 세포에 대해 가장 최적인 배지는 BMP2의 생산성과 세포성장이 안정적으로 나타나는 EX-CELL ACF CHO 배지였다.
5. BMP2 의 생산성 증대 및 정확한 크기의 성숙(mature) BMP2 단백질의 발현을 위해 PACE ( Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme ) 단백질의 추가적 형질도입
BMP2 발현 세포에서 생산되는 단백질에는 프로 도메인이 절단된 이량체 형태의 활성형 BMP2 외에도, 프로 도메인이 절단되지 않은 형태의 비활성형 BMP2 및 정확하지 않은 크기에서 프로 도메인이 절단되었기 때문에 정상적인 활성을 나타내지 못하는 BMP2가 함께 포함되어 검출되는 것이 일반적이다. 이러한 비활성형 BMP2는 PACE 단백질에 의해 활성형 BMP2로 효과적으로 전환될 수 있으며, 또한 PACE 단백질에 의해 정확하지 않은 크기의 활성형 BMP2의 양도 역시 감소될 수 있다. 따라서, BMP2 단백질에 추가적으로 PACEsol 유전자를 형질전환시켜 정확한 크기의 성숙(mature) BMP2 단백질의 발현을 유도하고 BMP2 단백질 생산성의 안정화를 유도하였다. 본 실험에서는 SIGMA사의 EX-CELL ACF CHO, CD OptiCHO(12681), 및 LONZA사의 PowerCHO2에 적응되어 있는 세포주 모두에 대해 PACE 형질도입을 수행하였으며, 본 명세서에는 EX-CELL ACF CHO에 적응된 세포주에 관한 결과만 나열하였다. PACEsol을 세포내에 형질도입하는 방식은 DNA 2.5μg의 HuPACEsol 벡터 DNA와 7.5μl 리포펙타민 LTX(INVITROGEN사)를 이용하여 IMEM(GIBCO사) 내에서 혼합액을 만들고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 형질도입을 수행하였다.
6. 한계희석법에 의한 단일클론의 선별
BMP2 발현 세포들로 구성된 집단에서 BMP2의 생산성이 가장 높고 생존율이 가장 우수한 하나의 단일 세포를 선택하기 위하여, 먼저 단일클론의 선별 과정을 수행하였다.
기본배지의 조성은 EX-CELL ACF CHO 배지에 8mM(최종농도)의 L-글루타민과 10% F68 18ml/L를 첨가한 것이다.
대조군으로서, (i) 동물유래 혈청(JRH Bioscience사)을 10 부피%로 첨가한 배지에서 단일 클론 및 집단 클론을 부착 배양한 군, 및 (ii) 동물유래 혈청을 첨가하지 않은 상기 기본배지에서 단일 클론 및 집단 클론을 정치배양한 군을 사용하였다.
실험군으로서, 동물유래 혈청을 첨가하지 않은 상기 기본배지에 대해 각각 반고형 배지를 100:0, 50:50, 0:100의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 여기에서 단일클론의 세포를 정치배양하였다. 상기 반고형(semi solid) 배지는 CHO 세포의 성장을 위해 GENETIX사에서 배치(batch) 번호 CMC0211A로 시판되는 것으로서, 메틸셀룰로오스 및 글루타민(16mM) 등의 구성성분이 함유되어 있지만 혈청과 같이 동물에서 기원한 물질들은 함유되어 있지 않은 배지이다.
한계희석법으로서, 배양 중인 세포들 중 90% 이상의 생존율을 나타내는 세포에 대해 100μl 당 세포수가 1개가 될 때까지 1/10로 희석하였다. 이와 같이 희석된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 100μl씩 분주한 후, 1주일 동안 어둡고 습도가 충분히 유지되는 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
결과
(1) 혈청 함유 배지에서 단일클론을 부착 배양한 경우(대조군)
혈청 함유 배지에서 웰 당 1개의 단일클론 세포를 배양한 경우에는 세포의 성장 및 증식이 관찰되지 않았다.
혈청 함유 배지에서 웰 당 여러 개(예를 들어, 5개, 10개 또는 20개)의 단일클론 세포들을 부착 배양한 경우에는 세포들이 옆으로 퍼지는 동시에 탑처럼 쌓이는 형태로 증식되었다. 일반적으로 혈청 함유 배지에서 배양된 세포들은 단일클론을 형성하고 웰의 바닥에 나뭇가지 모양의 형태로 부착되는 모습을 나타내는 것과는 달리, 본 실시예에서 BMP2 발현 세포에 대해 현미경으로 관찰한 결과에 따르면 단일클론이 형성되지 않았으나 완충액으로 세척했을 때 웰에서 쉽게 떨어지지 않을 정도의 강도로 부착된 모습을 나타내었다.
(2) 무혈청 배지에서 집단클론을 정치배양한 경우(대조군)
혈청을 첨가하지 않은 EX-CELL ACF CHO 배지에서 웰 당 5개 및 10개의 단일클론 세포를 각각 배양한 경우, 세포를 분주한 1일째에만 세포를 관찰할 수 있었으며, 그 이후에는 세포가 증식되지 않고 사멸하였다.
반면, 웰 당 50개 및 100개의 단일 클론 세포를 각각 배양한 경우에는 세포들이 집단으로 성장하여 옆으로 퍼져나가는 형태로 증식된 결과, 단일 클러스터를 형성하였다. 그러나, 이는 단일 클론이 아니라 집단 클론에 해당하는 것이다.
EX-CELL ACF CHO 배지에서 관찰된 상기 현상은 다른 배지들, 예를 들어 C8862 배지, CDM4 CHO(SH30558) 배지, CD OptiCHO(12681) 배지 및 PowerCHO2 배지에서 동일하게 나타났다. 다만, 후술하는 바와 같이 EX-CELL ACF CHO 배지는 반고형 배지와의 배합 비율에 따라 단일 클론의 증식이 관찰된 반면, C8862 배지, CDM4 CHO(SH30558) 배지, CD OptiCHO(12681) 배지 및 PowerCHO2 배지는 반고형 배지의 배합비율과 무관하게 단일 클론의 증식이 여전히 관찰되지 않았다.
(3) 무혈청 배지에서 단일클론을 부착 배양한 경우(실험군)
혈청을 첨가하지 않은 EX-CELL ACF CHO 배지에서 웰 당 1개의 단일클론 세포를 배양한 경우에는 세포들의 증식 현상을 관찰할 수 없었다.
반고형 배지가 100%로 구성된 배지에서도 세포들이 증식되지 않았으며, 이 경우에는 버블이 많이 형성되었기 때문에 증식 여부를 관찰하는 것조차 어려웠다.
혈청을 첨가하지 않은 EX-CELL ACF CHO 배지와 반고형 배지를 50:50으로 배합한 배지에서는 하나의 클론을 중심으로 옆으로 퍼지는 형태로 증식되었으며, 클론마다 성장 속도와 형태가 다양하게 나타났다(도 1a 내지 도 1d 참조). 이에 따라, 혈청을 첨가하지 않은 EX-CELL ACF CHO 배지와 반고형 배지를 50:50으로 배합한 경우에는 단일클론 배양에 성공하였다. 도 1의 현미경 사진에서 볼 수 있듯이 다른 배지를 사용한 종래 방법에 비해 단일클론의 형성 여부가 육안에 의해서도 정확하게 식별이 가능하였으며, 세포들의 성장 및 증식이 매우 잘 이루어졌다.
EX-CELL ACF CHO 배지와 반고형 배지의 1:1 배합비에서 단일클론의 세포 성장도 원활하게 이루어지며, 전체 세포주 개발에 소요되는 시간도 매우 단축되었으며, 세포 유지시에도 끈적임이 적어 가장 효율적인 방법으로 입증되었다.
7. 단일클론으로 배양된 세포의 증식 및 우수한 세포의 선별
L-글루타민 및 F68을 함유하는 EX-CELL ACF CHO 배지와 반고형 배지를 1:1로 배합한 배지에서 성장한 단일클론 세포들을 2주 동안 배양시킨 후, 8mM L-글루타민 및 F68이 함유된 EX-CELL ACF CHO 배지를 추가적으로 첨가하여 2주 동안 더 배양하였다. 세포의 성장 정도에 따라 48-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 6-웰 플레이트로 순차적으로 옮기면서 세포수를 증가시켜나갔다. 최종적으로 6-웰 플레이트를 가득 채울 때까지 평균적으로 약 8주가 소요되었으며, 그 후 125ml 플라스크로 옮겨 부유 배양하였다.
단일클론으로 배양된 상기 세포들 각각에 대해 세포수를 측정하여 생존율을 결정하였으며, BMP2-특이적 ELISA에 의해 BMP2 생산성을 결정하였다. 이러한 결과가 도시되어 있는 도 2a 및 도 2b에서 볼 수 있듯이, 단일클론으로 배양된 세포들은 세포생존율과 BMP2 생산성 모두가 서로 다르다는 점을 확인할 수 있다. 따라서, 본 실시예에서는 가장 우수한 특징을 갖는 세포로서 #33, 34, 49번 단일클론 세포를 선택하였다.
1차로 선별된 #33, 34, 49번 단일클론 세포주를 8일 동안 Fed-batch 배양한 후, 세포 생존율과 생산성 측면에서 가장 우수한 #34 단일클론을 선택하였으며(도 3a 및 도 3b 참조), #34 단일 클론은 2개의 다른 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅 수행에 의해 정확한 크기의 성숙한 BMP2가 발현되었음이 확인되었다(도 4 참조). DTT를 첨가한 조건(reduced)에서도 16kDa의 단량체 BMP2의 정확한 크기를 확인할 수 있었다.
이와 같이 선택된 #34번 단일클론 세포는 부유 배양을 통해 대량 증식될 수 있으며, 이러한 세포들은 생존율이 뛰어날 뿐만 아니라 다른 세포들에 비해 BMP2 생산성도 우수하므로(도 5 참조), 다양한 적용 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 하기 단계를 포함하는, BMP2(Bone Morphogenetic Protein 2: 골형성단백질 2) 발현 CHO 세포를 단일클론으로 배양하는 방법:
    a) L-글루타민을 포함하는 EX-CELL ACF CHO 배지에 반고형 배지를 첨가하는 단계, 및
    b) 상기 a) 단계에서 제조된 배지에서 BMP2 발현 CHO 세포를 배양하여, 단일클론의 세포를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계에서 제조된 배지에 혈청이 포함되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 반고형 배지는 EX-CELL ACF CHO 배지와 1:1의 부피비로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 L-글루타민의 농도는 1 내지 20 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계 이전에, BMP2 발현 벡터의 세포내 형질도입 또는 MTX를 이용한 BMP2 유전자의 증폭에 의해 BMP2 발현 CHO 세포를 생산하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계 이전에, PACE(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme) 유전자를 BMP2 발현 CHO 세포에 형질도입하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계 이후에, 복수개의 단일클론의 세포들 중에서 BMP2의 생산성 또는 세포 생존율이 가장 우수한 한 개의 세포를 선별하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계 이후에, 수득된 단일클론의 세포를 부유 배양하여 증식시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell. 1977 . vol. 10, issue 2, pp. 305-312. *
Nature Biotechnology. 2004, vol. 22, pp. 1393-1398. *
전복환. 1999, 무단백질배지에 재조합 차이니즈 햄스터 난소 세포배양에 의한 B-도메인 결핍 혈액 응고 제8인자 생산. 학위논문(박사). *

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