CN103173403B - 一种分程胚胎培养液及其配制方法 - Google Patents
一种分程胚胎培养液及其配制方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103173403B CN103173403B CN201310041700.0A CN201310041700A CN103173403B CN 103173403 B CN103173403 B CN 103173403B CN 201310041700 A CN201310041700 A CN 201310041700A CN 103173403 B CN103173403 B CN 103173403B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sodium
- chlor
- culture solution
- milliliter
- embryo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 80
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 68
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 39
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 39
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 19
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 18
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 7
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- NGSFWBMYFKHRBD-UHFFFAOYSA-N sodium;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound [Na+].CC(O)C(O)=O NGSFWBMYFKHRBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 5
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 230000012447 hatching Effects 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 abstract description 21
- 230000000327 embryotrophic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 9
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 7
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 3
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 229960004279 formaldehyde Drugs 0.000 description 3
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 2
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010004460 Gastric Inhibitory Polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 102100039994 Gastric inhibitory polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 229940087875 leukine Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108010038379 sargramostim Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种分程胚胎培养液及其配制方法属于细胞学、生物技术领域.采用添加三种胚胎营养因子的分程培养液，包括卵裂液和囊胚液两种，在体外受精卵和在8-细胞期前后分别使用。本发明的胚胎培养液加入的胚胎营养因子具有协同增效作用，避免了分程培养液丢失胚胎自身分泌的胚胎营养因子的缺陷，受精卵在本发明的培养液中生长具有更高的胚胎干细胞多能性，其发育情况与体内胚胎生长相当，提高了受精卵体外生长发育，改善了胚胎的质量。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体地说涉及一种提高体外受精卵生长发育效果的分程胚胎培养液及其配制方法。
背景技术
自从世界上第一个“试管”婴孩于1978年7月25日在英国出生后，到2012年7月1日已有500万个“试管”婴孩诞生。IVF（体外受精）为全球超过占5000万不孕症夫妇带来了福音。然而，三十多年的临床实践并没有显著提高IVF的成功率。2011年，美国妊娠协会统计35岁病人IVF成功率（受孕率）在25-30%左右，而1997年也在30%左右。而婴儿出生率更低。其中一个重要的原因是IVF胚胎培养液的质量。这是IVF胚胎质量最重要的决定性因素之一。
IVF培养通常分为两种流程即两种培养液系列：全程（单培养液系列）和分程（双培养液系列）。利用双培养液系列流程对胚胎早期和后期阶段提供不同的培养液成份，但也丢失了由胚胎分泌入培养液中的重要的有效成份，如胚胎营养因子。全程培养液系列流程保留了这些重要的有效成份，但也保留了培养液中有害的分解产物。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供加入多种胚胎营养因子的分程胚胎培养液，本发明的另一个目的是提供上述分程胚胎培养液的配制方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明的一种分程胚胎培养液，包括基本培养液和胚胎营养因子，其中，所述基本培养液包括无机盐缓冲液、氨基酸、丙酮酸钠、乳酸钠、葡萄糖和血清白蛋白；
所述胚胎营养因子包括PAF、IGF-1和GM-CSF的任意一种或多种。
对于本发明涉及的胚胎营养因子，PAF（Platelet-Activating Factor）是植入前期胚胎分泌的磷脂质，在应用中，主要作用在2-细胞期胚胎。PAF可诱导2-细胞胚胎中转录CREB（cAMP-Response element binding protein，cAMP反应元件结合蛋白）的磷酸化，并进一步诱导2-细胞胚胎表达有利于胚胎细胞生存的转录因子和CREB-靶向的转录因子。另一方面，PAF激活MDM2，促使其与细胞核的P53结合成复合物，在细胞浆内将P53降价，从而抑制胚胎细胞的凋零。
IGF-1是IGF（Insulin-like Growth Factors）胰岛素样生长因子中的一种，又被称作“促生长因子”，是一种植入前期胚胎分泌的活性蛋白多肽物质。GM-CSF（Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子），可由卵巢，输卵管，子宫内膜的上皮细胞产生，人类卵子和植入前期胚胎存在GM-CSF受体。起到抑制胚胎细胞凋零，提高胚胎发育的作用。
以上胚胎营养因子在培养液中，可促使受精卵生长发育，生成的囊胚期胚胎具有更高的胚胎干细胞多能性，胚胎干细胞生物学指标UTF1和NANOG的表达量比在无胚胎营养因子的胚胎培养液所生成的囊胚期胚胎明显增高。
本发明采用的是分程培养液，即双程培养液，包括卵裂液培养液和囊胚液培养液。所述卵裂液和囊胚液的无机盐缓冲液都包括如下组分：氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠和EDTA二钠。
具体地说，无机盐缓冲液中所述氯化钾与氯化钠的摩尔比为1.8~2.2:100；所述磷酸二氢钾与氯化钠的摩尔比为0.3~0.4:100；所述氯化钙与氯化钠的摩尔比为1.6~1.8:100；所述硫酸镁与氯化钠的摩尔比为0.18~0.22:100；所述碳酸氢钠与氯化钠的摩尔比为20~30:100；所述EDTA二钠与氯化钠的摩尔比为0.01:100。
作为本发明的最优方案，无机盐缓冲液中氯化钾与氯化钠摩尔比为2:100；磷酸二氢钾与氯化钠摩尔比为0.35:100，氯化钙与氯化钠摩尔比1.71:100，硫酸镁与氯化钠摩尔比为0.2:100，碳酸氢钠与氯化钠摩尔比为25:100，EDTA二钠与氯化钠摩尔比为0.01:100。从而使缓冲液维持在pH7.3~7.5之间，有利于体外胚胎的生长发育。
其中，对于卵裂液培养液，所述胚胎营养因子由PAF、IGF-1和GM-CSF组成，用于配制受精卵体外生长至8-细胞期的卵裂液培养液。
进一步的，对于卵裂液培养液，所述PAF浓度为20ng/毫升，所述IGF-1浓度为2ng/毫升；所述GM-CSF浓度为2ng/毫升。所述乳酸钠和氯化钠的摩尔比为10.5:100；所述丙酮酸钠和氯化钠的摩尔比为0.32:100；所述葡萄糖和氯化钠的摩尔比为0.5:100。每毫升基本培养液含有3mg血清白蛋白。
对于囊胚液培养液，所述胚胎营养因子由IGF-1和GM-CSF组成，用于配制体外受精卵从8-细胞期至植入前的囊胚液培养液。
具体地说，所述IGF-1浓度为5ng/毫升；所述GM-CSF浓度为4ng/毫升。进一步的，所述乳酸钠和氯化钠的摩尔比为5.87:100；所述丙酮酸钠和氯化钠的摩尔比为0.1:100；所述葡萄糖和氯化钠的摩尔比为3.15:100。每毫升基本培养液含有4mg血清白蛋白。
对于本发明分程胚胎培养液的配制方法，先配制基本培养液，将PAF预先存放在有机溶剂中，配制时吸取PAF于清洁的硅化玻璃管中，注入氮气将有机溶剂挥发，加入含有血清白蛋白的基本培养液，涡旋混合，避免气泡产生，于25℃水箱水浴孵化1小时使PAF与血清蛋白充分结合，再加入含有血清白蛋白的基本培养液配制到浓度为20ng/毫升；将高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超纯水中，再加入含有血清白蛋白的基本培养液分别稀释至终浓度2ng/毫升和2ng/毫升。获得卵裂液培养液。
配制基本培养液，将高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF完全溶于超纯水中，再加入含有血清白蛋白的基本培养液分别稀释至终浓度5ng/毫升和4ng/毫升。获得囊胚液培养液。
本发明中所述氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸，对于用于人类体外受精的合子而言，所述氨基酸包括所有胚胎所需的必需氨基酸和非必需氨基酸。
有益效果：本发明的一种胚胎培养液及其配制方法通过加入多种胚胎营养因子避免了分程培养液流程丢失胚胎自身分泌的胚胎营养因子的缺点，同时，三种胚胎营养因子具有协同增效效果。受精卵在含胚胎营养因子的培养液中所生成的囊胚胚胎具有更高的胚胎干细胞多能性，表现为其中更多的细胞表达胚胎干细胞生物学指标UTF1和NANOG；并且与体内发育成的囊胚期胚胎无统计学上的差别。本发明的胚胎培养液可显著提高受精卵体外生长发育，改善胚胎的质量，为提高助孕技术的成功率提供了重要的手段。
附图说明
图1表示受精卵在三种体外培养液下84小时后囊胚期胚胎的百分率及每个胚胎的细胞数；
图2为受精卵培养后每24小时胚胎与体内同期胚胎所含的细胞总数的比较图；
图3表示为本发明的免疫荧光技术分析加入胚胎营养因子的培养液所生长成的囊胚期胚胎含有与体内生长成的囊胚期胚胎相当数量的总细胞数和表达胚胎干细胞生物标记（UTF1）的细胞数；
图4所示为本发明的Western blot和免疫荧光技术分析加入胚胎营养因子的培养液所生长成的囊胚期胚胎含有更多数量的总细胞数和表达胚胎干细胞生物标记（NANOG）的细胞数。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1
一种分程胚胎培养液，由卵裂液和囊胚液组成，卵裂液用于受精卵生长至8-细胞期的时期内，囊胚液用于受精卵从8-细胞期生长至受精卵植入前时期内。卵裂液和囊胚液都由基本培养液和胚胎营养因子组成，且基本培养液中的无机盐缓冲液组分相同。
无机盐缓冲液的配方如表1所示，其pH在7.3~7.5之间：
表1卵裂液和囊胚液的配方
其中，氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸，包括所有胚胎所需的必需氨基酸和非必需氨基酸，其含量与胚胎需求相对应。氨基酸购于Life Technologies公司。
以上分程胚胎培养液的配制方法是，准备PAF，PAF购于Sigma-Aldrich.Co.LLC公司，将PAF C18(β-Acetyl-γ-O-octadecyl-L-α-phosphatidylcholine)和PAF C16（β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-phosphatidylcholine），按相同浓度混合，储于有机溶剂氯仿中（10毫克/毫升）。配制时吸取2微升PAF于清洁的硅化玻璃管中，注入高压氮气气流将氯仿挥发，加入1毫升含有3毫克血清白蛋白/毫升的基本培养液，涡旋混合，避免气泡产生，于25℃水箱水浴孵化1小时使PAF与血清蛋白充分结合，涡旋混合，再加入含有3毫克白蛋白/毫升的基本培养液配制到浓度为20ng/毫升。用MilliQ水（超纯水）配制高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF，完全溶解后再加入含有白蛋白的基本培养液稀释至终浓度，IGF-1和GM-CSF用于配制卵裂液的终浓度分别为2ng/毫升和2ng/毫升。以上获得用于受精卵体外生长至8-细胞期的卵裂液。
对于囊胚液的配制，用MilliQ水配制高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF，完全溶解后再加入含有白蛋白的基本培养液稀释至终浓度即可，用于配制囊胚液的终浓度分别为5ng/毫升和4ng/毫升。囊胚液用于8-细胞期生长至植入前。
其中，IGF-1购于Life Technologies公司的重组IGF-1产品，GM-CSF购于Sigma-Aldrich.Co.LLC.公司的重组GM-CSF产品。
本事实例中的胚胎营养因子在培养液中，可促使受精卵生成的囊胚期胚胎具有更高的胚胎干细胞多能性，胚胎干细胞生物学指标UTF1和NANOG的表达量比在无胚胎营养素的胚胎营养液所生成的囊胚期胚胎明显增高。请参考下文的试验例部分。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，其区别在于基本培养液的配方如表2所示：
表2实施例2基本培养液的配方
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，其区别在于胚胎培养液的配方如表3所示：
表3实施例3基本培养液的配方
试验例1囊胚期胚胎生成率和每个胚胎总细胞数的统计比较
取小鼠卵子并进行体外受精，胚胎培养条件如下：
1）以10微升培养液微滴，上面覆盖大约2毫米厚的矿物油；
2）37℃恒温、保湿，通入5%O2+5%CO2+90%N2的混合气体；
3）台式孵化器（COOK公司），气体流量为每分钟15毫升；
4）加入胚胎前，培养液必须在孵化箱内平衡至少2小时，pH值至7.4；
5）将10个受精卵加入到10μL实施例1获得的卵裂液培养液中；
6）受精卵在卵裂液中培养48小时后换成囊胚液培养液。
本试验将实施例1的双程胚胎培养液作为实验组，实施例1不加胚胎营养因子作为对照，同时采用COOK公司生产的产品sIVF双程胚胎培养液进行对比，在相同条件下体外培养受精卵。通过胚胎的形态学特点记录并计算出84小时受精卵培养后囊胚期胚胎的生成率，然后利用2%的福莫尔林固定胚胎30分钟，用每毫升10微克Hoechst33342染色，制片，荧光显微镜下检测每个胚胎的总细胞数。对比结果如图1所示。
从图1中可以看出，加入胚胎营养因子囊胚期胚胎生成率都高于不加胚胎营养因子的组，而囊胚期细胞数在加入胚胎营养因子后，具有显著增效作用。另外，本发明双程培养液中三种胚胎营养因子的组合其实验结果显著高于其他两组，显著地提高了受精卵体外生长发育。
试验例2与体内同期胚胎的总细胞数比较
本试验例将小鼠体内收集的受精卵分为两组，分别在实施例1的胚胎培养液中培养、以及在如实施例1中的胚胎培养液中生长但该培养液中不含有胚胎营养因子。另一组为体内同期胚胎。三组均以注射hCG后的相同时间假定为同期胚胎。通过采用2%的福莫尔林固定胚胎30分钟，用每毫升10微克Hoechst33342染色，制片，荧光显微镜下每12小时检测每个胚胎的总细胞数，将培养液中胚胎总细胞数与体内同期胚胎所含的总细胞数进行比较。
结果如图2所示，可以看出，加入胚胎营养因子的培养液产生的细胞数与体内同期胚胎相当，而不加胚胎营养因子的胚胎所含的细胞数明显降低（p<0.001）。
试验例3免疫荧光技术分析
UTF1（Unidifferentiated Embryonic Cell Transcription Factor1）是人类及动物胚胎干细胞的生物学指标之一，本试验通过统计囊胚期胚胎表达UTF1的细胞数，将实施例1的胚胎培养所产生的囊胚期胚胎和体内囊胚期胚胎进行比较。
利用2%福莫尔林室温下固定胚胎30分钟；室温下置于含0.3%Tween-20的PBS中30分钟使细胞膜通透化；室温下置于30%的与二抗相同源的动物血清中1小时以阻断非特异性的结合位点；在4℃环境下与一抗结合12小时；室温下与二抗结合1小时；每毫升10微克Hoechst33342染色DNA以确定细胞核的位置。试验结果如图3所示。
从图3可以看出，利用本发明实施例1的胚胎培养液，囊胚期胚胎含有与体内生长成的囊胚期胚胎相当数量的总细胞数（P>0.05）；并且表达胚胎干细胞生物标记（UTF1）的细胞数也无显著性差异（P>0.05）。
试验例4Western Blot检测目标蛋白质
NANOG是重要的人类及动物胚胎干细胞的生物学指标，是维持胚胎干细胞多能性的关键因子。本试验将体外受精卵在实施例1所述胚胎培养液的生长情况与体内同期受精卵的生长情况进行对比。
1）配制蛋白质抽取液：
溶剂：聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），
24mM脱氧胆酸，
0.2%十二烷基硫酸钠(SDS)，
20mM氟化钠，
20mM Na4P2O7，
2mM苯甲基磺酰氟（PMSF,Phenylmethanesulphony Fluoride），
3.08mM抑肽酶，
42mM亮抑蛋白酶肽（Leupeptin），
2.91mM抑胃肽（Pepstatin A）。
2）将50个小鼠胚胎置于1.5微升蛋白质抽取液。液氮处理收集蛋白质，稀释于Laemmli加载缓冲液。
3）使用PhastSystem装置系统（由Amersham Pharmacia Biotech公司制造）作蛋白质电泳和转膜。转膜缓冲液含12mM Tris,96mM甘氨酸和20%甲醇。以含5克%脱脂牛奶粉的阻断液阻断非特异性的结合位点。在4℃环境下与初级抗体结合12小时，于HRP（Horse Radish Peroxidase）共轭的二级抗体中室温下孵化1小时。
4）利用免疫荧光分析技术检测目标蛋白质，结果如图4所示。
如图4所示，本试验Western Blot分析胚胎营养因子增加了胚胎干细胞生物标记（NANOG）的表达，ACTIN是HOUSEKEEPER基因，作为蛋白质总量的常用参照；MBL5是常用的胚胎干细胞用于阳性对照。免疫荧光技术分析加入胚胎营养因子的培养液所生长成的囊胚期胚胎含有更多数量的总细胞数(P<0.01)；并且表达NANOG的细胞数也显著性增高(P<0.001)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种分程胚胎培养液，包括基本培养液和胚胎营养因子，其特征在于：
所述基本培养液包括无机盐缓冲液、氨基酸、丙酮酸钠、乳酸钠、葡萄糖和血清白蛋白；
所述胚胎营养因子由20ng/毫升PAF、2ng/毫升IGF-1和2ng/毫升GM-CSF组成，用于配制受精卵体外生长至8-细胞期的卵裂液培养液；以及
所述胚胎营养因子由5ng/毫升IGF-1和4ng/毫升GM-CSF组成，用于配制体外受精卵从8-细胞期至植入前的囊胚液培养液；
所述无机盐缓冲液包括氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠和EDTA二钠；
当配制受精卵体外生长至8-细胞期的卵裂液培养液时，
所述乳酸钠和氯化钠的摩尔比为10.5:100；
所述丙酮酸钠和氯化钠的摩尔比为0.32:100；
所述葡萄糖和氯化钠的摩尔比为0.5:100；
每毫升基本培养液含有3mg血清白蛋白；
当配制体外受精卵从8-细胞期至植入前的囊胚液培养液时，
所述乳酸钠和氯化钠的摩尔比为5.87:100；
所述丙酮酸钠和氯化钠的摩尔比为0.1:100；
所述葡萄糖和氯化钠的摩尔比为3.15:100；
每毫升基本培养液含有4mg血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种分程胚胎培养液，其特征在于：
所述氯化钾与氯化钠的摩尔比为1.8~2.2:100；
所述磷酸二氢钾与氯化钠的摩尔比为0.3~0.4:100；
所述氯化钙与氯化钠的摩尔比为1.6~1.8:100；
所述硫酸镁与氯化钠的摩尔比为0.18~0.22:100；
所述碳酸氢钠与氯化钠的摩尔比为20~30:100；
所述EDTA二钠与氯化钠的摩尔比为0.01:100。
3.如权利要求1所述的分程胚胎培养液的配制方法，其特征在于：用于配制受精卵体外生长至8-细胞期的卵裂液培养液时，先配制基本培养液，将PAF预先存放在有机溶剂中，配制时吸取PAF于清洁的硅化玻璃管中，注入氮气将有机溶剂挥发，加入含有血清白蛋白的基本培养液，涡旋混合，避免气泡产生，于25℃水箱水浴孵化1小时使PAF与血清蛋白充分结合，再加入含有血清白蛋白的基本培养液配制到浓度为20ng/毫升；将高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF 完全溶于超纯水中，再加入含有血清白蛋白的基本培养液分别稀释至终浓度2ng/毫升和2ng/毫升；
用于配制体外受精卵从8-细胞期至植入前的囊胚液培养液时配制基本培养液时，将高于终浓度200倍的IGF-1和GM-CSF 完全溶于超纯水中，再加入含有血清白蛋白的基本培养液分别稀释至终浓度5ng/毫升和4ng/毫升。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310041700.0A CN103173403B (zh) | 2013-02-01 | 2013-02-01 | 一种分程胚胎培养液及其配制方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310041700.0A CN103173403B (zh) | 2013-02-01 | 2013-02-01 | 一种分程胚胎培养液及其配制方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103173403A CN103173403A (zh) | 2013-06-26 |
| CN103173403B true CN103173403B (zh) | 2015-02-04 |
Family
ID=48633595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310041700.0A Active CN103173403B (zh) | 2013-02-01 | 2013-02-01 | 一种分程胚胎培养液及其配制方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103173403B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018102881A1 (en) * | 2016-12-09 | 2018-06-14 | The University Of Adelaide | Compositions and methods for maturation of oocytes in vitro |
| CN107118261B (zh) * | 2017-05-12 | 2018-02-13 | 南京市妇幼保健院 | 一种胚胎分泌型内源性多肽pdbcm及其应用 |
| CN108251353B (zh) * | 2018-01-22 | 2020-12-08 | 深圳韦拓生物科技有限公司 | 一种人胚胎体外培养液及培养系统 |
| CN108251355B (zh) * | 2018-01-31 | 2021-04-06 | 成都艾伟孚生物科技有限公司 | 一步式胚胎培养液 |
| CN108251354B (zh) * | 2018-01-31 | 2021-04-06 | 成都艾伟孚生物科技有限公司 | 一步式胚胎培养液及其制备方法 |
| CN108048392B (zh) * | 2018-01-31 | 2021-04-06 | 成都艾伟孚生物科技有限公司 | 一种一步式胚胎培养液及其制备方法 |
| CN109679895B (zh) * | 2018-12-18 | 2021-03-12 | 西安交通大学 | 含输卵管源外泌体的胚胎培养液及胚胎培养方法 |
| CN110669725A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-10 | 广州达瑞生殖技术有限公司 | 一种卵裂胚培养液及其制备方法 |
| CN112229993B (zh) * | 2020-09-24 | 2022-12-02 | 深圳中山泌尿外科医院 | Gm-csf因子作为生物标志物在筛选辅助生殖移植胚胎中的应用及方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7695426B2 (en) * | 2003-08-20 | 2010-04-13 | Biological Resources Pty Ltd | Methods for enhancing viability |
-
2013
- 2013-02-01 CN CN201310041700.0A patent/CN103173403B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103173403A (zh) | 2013-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103173403B (zh) | 一种分程胚胎培养液及其配制方法 | |
| RU2426784C2 (ru) | Способ селекции кардиомиоцитов (варианты) | |
| Lee et al. | Increased production of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) by the addition of stabilizing polymer in plant suspension cultures | |
| CN102899286B (zh) | C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用 | |
| AU2013221839B2 (en) | Feeder-free method for culture of bovine and porcine spermatogonial stem cells | |
| CN107636149A (zh) | 上皮细胞的离体增殖 | |
| WO2016206086A1 (zh) | 一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法 | |
| CN107475181A (zh) | 未成熟卵母细胞的体外成熟培养液及其应用 | |
| CN103429732B (zh) | iPS细胞及其制造方法 | |
| ES2377194T3 (es) | Suplemento de medios de cultivo de gametos y de embriones de mamÃferos y procedimiento de utilización del mismo | |
| CN104531763A (zh) | 利用过表达hoxa10基因制备转基因猪的方法 | |
| CN105039402A (zh) | 一种改良猪肌肉品质的方法 | |
| Wolf et al. | Cultivation of adult teleost tissues in vitro. | |
| CN101272804A (zh) | 调节颗粒细胞的凋亡 | |
| CN104694475A (zh) | 一种新型神经干细胞培养添加剂及筛选方法、应用及利用该添加剂的培养基 | |
| KR100715188B1 (ko) | 소 수정란의 체외배양용 배지조성물 및 이를 이용한체외배양 방법 | |
| CN106047799B (zh) | 辛酰化Ghrelin在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用 | |
| KR20080077738A (ko) | 돼지 미성숙란의 체외배양 방법 | |
| KR20120111790A (ko) | 지방유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법 | |
| Opiela et al. | Varied approach of using MSCs for bovine embryo in vitro culture | |
| Hosoi et al. | Production of mouse fibroblast growth factor 4 in E. coli and its application for isolation and maintenance of mouse trophoblast stem cells in vitro | |
| CN113249304B (zh) | 萝卜硫素在制备牛卵母细胞体外成熟液中的应用 | |
| CN101353640A (zh) | 小鼠间充质干细胞的分离培养方法 | |
| KR100883581B1 (ko) | 안면피하 지방조직 또는 탯줄조직 유래 성체 줄기세포를이용한 간세포 분화방법 및 그에 사용되는 간세포분화배양액 | |
| Hristova et al. | Immunohistochemical study of Hsp27 in human embryos |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200401 Address after: 211800 floor 2, building C, Zhongdan Ecological Life Science Industrial Park, No. 3-1, xinjinhu Road, Jiangbei new district, Nanjing City, Jiangsu Province Patentee after: NANJING YOUER BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd. Address before: Jiangning District of Nanjing City, Jiangsu Province, 211100 Tong Road No. 101 Patentee before: Jin Xingliang |
|
| TR01 | Transfer of patent right |