CN105838736B - 一种gs表达系统细胞株的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种GS表达系统细胞株的高通量筛选方法。在氨基亚砜蛋氨酸加压后，选择细胞活力在25％～35％的细胞池进行单克隆化筛选，将细胞池加入到含有10％条件培养基的半固体培养基上形成单克隆(细胞终浓度为150cells/mL)，再利用高通量细胞筛选系统筛选并扩大培养获得高表达的细胞株，最后对筛选的高表达细胞株进行稳定性评估。通过本发明方法，更容易获得90％稳定率以上的细胞株。

Description

一种GS表达系统细胞株的筛选方法
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，具体来说，涉及一种GS表达系统细胞株的高通量筛选方法。
技术背景
Lonza公司的谷氨酸合成酶(glutamine sythetase，GS)表达系统于1992年问世并一直被改善，该系统是将外源基因插入到含有GS基因表达载体的下游，宿主细胞可以选择内源性不表达GS基因的重组鼠骨髓瘤细胞NS0和GS基因敲除型的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1SV GS-KO，在细胞培养时添加GS的抑制剂氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulfoximine，MSX)，使GS基因及与之相连的目的基因一起扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。至今，Lonza公司的GS表达系统在生物制药行业已被广泛应用，包括已经上市的(Roche)和(Medimmune)。
细胞株筛选的目的在于获得稳定高产的细胞株，其衡量标准包括抗体表达量、产品质量、代谢稳定性、细胞基质稳定性等。常规的筛选方法是：表达构建体的构建→转染至宿主细胞→加压筛选获得细胞池→细胞池(cell pool)的单克隆化→高表达细胞株扩大培养及筛选→细胞株的稳定性评估。
细胞池常规获得的方法是：当表达构建体被转染到宿主细胞内，直接用25～100μM的MSX加压，待细胞活力>95％后即为细胞池，或者是用前面提到的细胞池做流式细胞分选表达量TOP2～5％的细胞，待细胞活力再次>95％后即为细胞池。一般来说，在同样的培养环境下，低表达细胞株将营养成分更多用在细胞生长上，故生长较快，而高表达细胞株生长较慢，因此，以上提到的两种活力>95％的细胞池在细胞活力逐渐恢复的过程中，大多数高表达细胞株越长越慢，以至于丧失；而低表达细胞株越长越快；最终导致细胞池的高表达细胞株含量低，低表达的细胞株含量高。同时，在细胞活力恢复的过程中，增加细胞传代次数，据实验经验，每经历一次细胞活力恢复，细胞增加15～20Generations(Generation，世代，细胞每倍增一次，称为1Generation)，影响细胞株的稳定性。
单克隆化筛选最常规的方法是有限稀释(limiting dilution cloning，LDC)，低成本且易于操作，即将细胞密度按照<1cell/孔铺至96孔板中，培养基为液体培养基，大多时候会按照需求添加一定比例的条件培养基(含有细胞生长因子)，对细胞生长状态要求极高，活力<90％的细胞池几乎很难存活，克隆效率极低，即使单克隆化活力>95％的细胞池，克隆效率最高也仅有7％左右，平均水平在3％～4％，且操作繁琐，工作量大，实验周期长，实验效率低，无法实现高通量筛选。
用半固体培养基法进行单克隆化筛选，它是将细胞池按照一定的密度铺于半固体培养基上形成单克隆，继而挑选出来逐步扩大培养及筛选高表达细胞株。目前逐渐使用ClonePix2这类高通量筛选仪器在各种半固定培养基上进行高通量筛选，然而参照现有文献，如何提高克隆形成率及更快更易筛选出稳定高表达细胞株一直是本领域的技术难点。
发明内容
本发明目的在于提供一种克隆形成率高且易于获得稳定高表达细胞株的高通量筛选方法，该方法通过单克隆化低活力细胞池和在半固体培养基中加入条件培养基，从而容易获得稳定高表达的细胞株。
具体的，该方法是一种GS表达系统细胞株的高通量筛选方法，包含以下步骤：
(1)在氨基亚砜蛋氨酸MSX加压后，选择细胞活力在25％～35％的细胞池进行单克隆化筛选；
(2)将步骤(1)所述的细胞池加入到含有10％(体积比)条件培养基和甲基纤维素(0.9～1.5g/mL)的半固体培养基上形成单克隆，细胞终浓度为150cells/mL；
(3)利用高通量细胞筛选系统筛选细胞株；
(4)对步骤(3)中筛选出来的细胞株进行稳定性评估；
其中，步骤(2)所述条件培养基的制备方法为：取含GS空载体稳转的GS稳定细胞株进行批培养，细胞培养至密度在0.9×107～1.1×107cells/mL之间且细胞活力>95％时，经过离心分离上清和细胞，取上清用膜过滤处理后待用。
在一些实施方案中，所述GS表达系统为携带GS基因的并且GS基因下游插入了外源基因的表达载体转染至NS0细胞或者敲除了GS基因的CHO细胞(CHOK1SV GS-KO)。
在一些实施方案中，高通量细胞筛选系统为Molecular Devices的ClonePix2。
术语解释
谷氨酰胺合成酶(GS)是指在ATP供能的情况下，催化谷氨酸和氨离子(NH4 +)合成谷氨酰胺。
氨基亚砜蛋氨酸(MSX)加压是用于GS表达系统扩增GS基因下游的目的基因，从而实现外源基因的高表达，本发明一般使用25～100μM。
本发明使用的半固体培养基为含有甲基纤维素的半固体培养基。甲基纤维素的添加既能使同一单克隆在分裂时成一细胞团，又能使细胞分泌的抗体聚集在细胞团周围与荧光抗体(CloneDetect-anti-humanIgG(H+L)detection(Molecular Devices，K8200))结合达到定量检测的目的。目前除了可以使用商品化的CloneMatrix(Molecular Devices，K8510)外，还能使用甲基纤维素粉末(CAS#：9004-67-5)自行配制甲基纤维素溶液。铺板时将甲基纤维素溶液与基础培养基按照一定的比例混和即为用于该发明的半固体培养基，最终在半固体培养基中，甲基纤维素的质量分数为0.9～1.5g/mL，基础培养基为1倍的正常使用浓度。
高通量细胞筛选系统本发明所用为ClonePix2，筛选的流程是ClonePix2对细胞进行成像→ClonePix2计算克隆荧光强度→ClonePix2挑取荧光强度高的单克隆→96孔板继续培养。
细胞株的稳定性评估是将筛选得到的高表达细胞株继续传代至60世代，取各细胞株20世代、40世代和60世代的细胞，做500mL批培养评估。比较细胞株在不同代次的表达量水平，细胞株表达量下降在30％之内认为细胞株是稳定的。
本发明方法的技术有益效果如下：
(1)实现了GS表达系统细胞株的高通量筛选：该筛选方法运用了ClonePix2高通量筛选系统，相较于用传统有限稀释单克隆化筛选的通量提高了50倍以上，筛选周期缩短了至少1/3，机械化操作，直接排除95％以上的低产克隆。
(2)克隆形成率高，提高筛选成功率：用传统有限稀释单克隆化细胞活力>95％的细胞池，克隆效率通常为3～4％，使用该筛选方法单克隆化细胞活力在25％～35％的细胞池，不添加与添加条件培养基的克隆效率分别约为60％和100％，在克隆效率方面提升幅度很大。
(3)表达量高：比常规使用细胞活力>95％的细胞池进行筛选更容易筛选出更多的高表达细胞株。
(4)稳定性好：由细胞活力在25％～35％的细胞池单克隆化筛选得到的细胞株，相较于由活力>95％的细胞池单克隆化筛选得到的细胞株，稳定性显著提高。
附图说明
图1是细胞池A(活力为25.28％)、细胞池B(活力为34.36％)与细胞池C(活力为98.33％)单克隆化筛选过程中各组克隆在96孔板培养阶段抗体表达量分布的比较图；
图2是细胞池A(活力为25.28％)、细胞池B(活力为34.36％)与细胞池C(活力为98.33％)单克隆化筛选过程中各组克隆在6孔板批培养阶段抗体表达量分布的比较图；
图3是细胞池A(活力为25.28％)、细胞池B(活力为34.36％)与细胞池C(活力为98.33％)单克隆化筛选过程中各组克隆在500mL摇瓶批培养阶段表达量分布的比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例子仅为了阐明本发明，而非为了限制本发明的应用范围。
实施例1 制备细胞池A及细胞池A单克隆化筛选高表达稳定细胞株
1.表达构建体的构建
参照WO 2007/014162 A2专利和GS XceedTMGene Expression System(购自Lonza公司)使用说明书自主制备得到Anti-VEGF人源化抗体GS双基因表达载体。
2.转染哺乳动物细胞
用HiPure Plasmid DNA Purification Kit(Invitrogen，K2100-04)抽提Anti-VEGF人源化抗体的双基因表达载体，经PvuI(TaKaRa，1242A)线性化并提纯后，以总量40μg DNA/电转体系，用电穿孔仪(Bio-Rad Gene Pulser Xcell Eukaryotic System，参数300V，900μF)电击转染处于对数生长期的CHOK1SV GS-KO细胞(Lonza，GS XceedTMGeneExpression System)，将三次电击后的细胞重悬于含有30mL CD CHO Medium(Invitrogen，12490-25)的125mL锥形培养烧瓶(corning，431143-50EA)中，140rmp，37℃，8.0％CO2条件下振荡培养。
3.制备细胞池A
上述的细胞培养24小时后离心换液，将细胞重悬于30mL含有50μM MSX(Sigma，M5379-250MG，SLBF5342V)的CD CHO Medium(Invitrogen，12490-25)中于140rmp，37℃，8.0％CO2条件下振荡培养，在培养的第8天开始每天取样台盼蓝染色法测试细胞活力，观察细胞活力的变化，在培养的第12天，细胞活力为25.28％，取此时的细胞培养液10mL铺板待用，即为细胞池A(活力为25.28％)。
4.半固体培养基的配制
条件培养基的制备方法：取含GS空载体pXC17.4-18.4(本实验室保存)稳转的GS稳定细胞株进行批培养，细胞培养至密度在0.9×107～1.1×107cells/mL之间且活力>95％时，经过离心分离细胞培养液的上清和细胞，取上清用膜过滤处理后待用。
其中，GS空载体pXC17.4-18.4参照GS XceedTMGene Expression System(购自Lonza公司)使用说明书，由pXC17.4和pXC18.4经过分子克隆构建而成，pXC17.4和pXC18.4是GS XceedTMGene ExpressionSystem中的表达载体。
同时，按照表1的配方配制半固体培养基。
表1：单克隆化细胞池A的半固体培养基配方
室温下大力混匀，等待气泡慢慢消失。
5.将细胞池铺至半固体培养基
将细胞池A(活力25.28％)的适量细胞离心，重悬于4.0mL 2×CD CHO Medium(Invitrogen，12490-25)，保证细胞的密度为3000cells/mL。
将该细胞悬液取1.5mL与配制体系1的半固体培养基混合，轻柔混匀后，以2mL/孔加入至2块6孔培养板中(Greiner，657185)，命名为PK(1)～(2)，静置培养10～12天，37℃，5.0％CO2条件下，待细胞团慢慢形成。
将剩下的细胞悬液充分混匀后，取1.5mL与配制体系2的半固体培养基混合，轻柔混匀后，以2mL/孔加入至2块6孔培养板中(Greiner，657185)，命名为PK(3)～(4)，静置培养10～12天，37℃，5.0％CO2条件下，待细胞团慢慢形成。
6.ClonePix2挑取单克隆
细胞在6孔板PK(1)～(4)中培养12天后，肉眼能见分布均匀、大小适中(0.3～0.6mm2)的细胞团，此时方可用ClonePix2System(Molecular Devices)挑选荧光强度高的克隆。
(1)按照ClonePix2的操作说明书，逐步对仪器进行Prepare For Pick Run，这个过程以确保针头正确击发，相机、针头和微孔板匹配，液体系统无菌且可以立即使用。
(2)继而运行Pick Run，这个过程依次为：包括设置(包括成像设置、挑选设置、灭菌设置、克隆识别设置)。
(3)分别对PK(1)～(2)(铺板时添加了10％条件培养基)与PK(3)～(4)(铺板时没有添加了10％条件培养基)进行了成像，其克隆形成效率见表2。PK(3)～(4)仅作为不添加条件培养基铺板的对照组实验，不再进行后续的实验。
(4)分析PK(1)～(2)的成像结果，分析的依据是以细胞团的大小、规则程度和荧光强度设置阈值，对克隆进行分组。其中，细胞团的规则程度以周长/面积比值，细胞边沿的光滑两个参数度来衡量，目的是使细胞团的形状接近于圆形；细胞团的荧光程度包括多种算法，例如：外部平均荧光强度Exterior MeanIntensity、外部中位数荧光强度ExteriorMedian Intensity、外部总荧光强度Exterior Total Intensity、内部荧光强度标准差Interior Intensity SD、内部平均中央荧光强度Interior Mean Centre Intensity、内部平均荧光强度Interior Mean Intensity、内部中位数荧光强度Interior MedianIntensity、内部总荧光强度Interior Total Intensity、标准化荧光强度NormalizedIntensity、总荧光强度Sum Total Intensity，根据CHO细胞分泌性表达的特点，一般选择外部平均荧光强度作为标准来设置High FITC组。
(5)将PK(1)～(2)来源的High FITC组的克隆挑取至目标板96孔板(Greiner，657185)PKC96(1)～(5)中，其荧光强度值范围为：285.246<外部荧光强度<4888.502。将PKC96(1)～(5)于37℃，5.0％CO2条件下，静置培养5～7天。
(6)结束程序，把目标板细胞PKC96(1)～(5)放置培养箱中培养，一般5～7天后成活的克隆汇合度可长至15％以上。
表2：是否添加条件培养基克隆情况比较
由表2可以看出：同为将细胞池A铺于半固体培养基上，添加10％了条件培养基的实验组克隆形成率接近100％。
7.克隆的扩大培养及筛选
(1)汇合度的标定：待96孔板细胞PKC96(1)～(5)培养5天后，用CloneSelectImager(Molecular devices)对克隆进行成像，将汇合度数据导出。
(2)取样，测定抗体浓度：依次对汇合度≥15％的克隆取样，Fortebio(PALL，QKe)测定Anti-VEGF人源化抗体表达量，这98株克隆的表达量分布见图1，其中，柱形图表示在一定抗体表达量范围的克隆数，曲线表示克隆表达量分布的范围及频率。
(3)96孔板扩培至24孔板：参照克隆在96孔板中的表达量，将表达量>29mg/L的30个与相对表达量>116mg/L(且表达量≤29mg/L)的18个克隆转至24孔板PKC24(1)～(2)中。
(4)24孔板扩培至6孔板：全部转入，命名为PKC6(1)～(8)。
(5)6孔板批培养：48株全部参与6孔板批培养，命名为PKC6(1)～(8)，培养7天，Fortebio测定累计表达量，这48株克隆的表达量分布见图2，其中，柱形图表示在一定抗体表达量范围的克隆数，曲线表示克隆表达量分布的范围及频率。
(6)6孔板扩培至125mL摇瓶：参照克隆在6孔板中批培养的表达量，将表达量>230mg/L的7株与SPR>19pcd(且表达量≤230mg/L)的3株传代至125mL摇瓶P125(1)～(10)中，于140rmp，37℃，8.0％CO2条件下振荡培养。
(7)细胞冻存及扩培至500mL批培养：选自步骤(6)筛选出来的10株细胞。
(8)500mL批培养：P500(1)～(10)，从批培养的第三天开始取样测定细胞密度、活力及HPLC测定抗体表达量，直至细胞活力低于60％方可停止。细胞株的表达量在280～420mg/L之间，具体见表3的0世代数据和图3，柱形图表示在一定抗体表达量范围的克隆数。
8.细胞株的稳定性评估
将克隆(1)～(10)的细胞继续传代至60世代，取各细胞株20世代、40世代和60世代的细胞，做500mL批培养评估。比较细胞株在不同代次的表达量水平，细胞株表达量下降在30％之内认为细胞株是稳定的。在(1)～(10)中，稳定的有9株。结果见表3。
表3：由细胞池A筛选的克隆(1)～(10)的稳定性评估表
实施例2 制备细胞池B及细胞池B单克隆化筛选高表达稳定细胞株
1.表达构建体的构建
参照WO 2007/014162A2专利和GS XceedTMGene Expression System(购自Lonza公司)使用说明书自主制备得到Anti-VEGF人源化抗体GS双基因表达载体。
2.转染哺乳动物细胞
用HiPure Plasmid DNA Purification Kit(Invitrogen，K2100-04)抽提Anti-VEGF人源化抗体的双基因表达载体，经PvuI(TaKaRa，1242A)线性化并提纯后，以总量40μg DNA/电转体系，用电穿孔仪(Bio-Rad Gene Pulser Xcell Eukaryotic System，参数300V，900μF)电击转染处于对数生长期的CHOK1SV GS-KO细胞(Lonza，GS XceedTMGeneExpression System)，将三次电击后的细胞重悬于含有30mL CD CHO Medium(Invitrogen，12490-25)的125mL锥形培养烧瓶(corning，431143-50EA)中，140rmp，37℃，8.0％CO2条件下振荡培养。
3.制备细胞池B
上述的细胞培养24小时后离心换液，将细胞重悬于30mL含有50μM MSX(Sigma，M5379-250MG，SLBF5342V)的CD CHO Medium(Invitrogen，12490-25)中于140rmp，37℃，8.0％CO2条件下振荡培养，在培养的第8天开始每天取样台盼蓝染色法测试细胞活力，观察细胞活力的变化，在培养的第13天，细胞活力为34.36％，取此时的细胞培养液5mL铺板待用，即为细胞池B(活力为34.36％)。
4.半固体培养基的配制
条件培养基的制备方法：取含GS空载体pXC17.4-18.4(本实验室保存)稳转的GS稳定细胞株进行批培养，细胞培养至密度在0.9×107～1.1×107cells/mL之间且活力>95％时，经过离心分离细胞培养液的上清和细胞，取上清用膜过滤处理后待用。
其中，GS空载体pXC17.4-18.4参照GS XceedTMGene Expression System(购自Lonza公司)使用说明书，由pXC17.4和pXC18.4经过分子克隆构建而成，pXC17.4和pXC18.4是GS XceedTMGene Expression System中的表达载体。
同时，按照表4的配方配制半固体培养基。
表4：单克隆化细胞池B的半固体培养基配方
室温下大力混匀，等待气泡慢慢消失。
5.将细胞池铺至半固体培养基
将细胞池B(活力为34.36％)的适量细胞离心，重悬于1.5mL 2×CD CHO Medium(Invitrogen，12490-25)，保证细胞的密度为3000cells/mL。
将该细胞悬液取1.5mL与配制体系4的半固体培养基混合，轻柔混匀后，以2mL/孔加入至2块6孔培养板中(Greiner，657185)，命名为PK(5)～(6)，静置培养10～12天，37℃，5.0％CO2条件下，待细胞团慢慢形成。
6.ClonePix2挑取单克隆
细胞在6孔板PK(5)～(6)中培养12天后，肉眼能见分布均匀、大小适中(0.3～0.6mm2)的细胞团，此时方可用ClonePix2 System(Molecular Devices)挑选荧光强度高的克隆。
(1)按照ClonePix2的操作说明书，逐步对仪器进行Prepare For Pick Run，这个过程以确保针头正确击发，相机、针头和微孔板匹配，液体系统无菌且可以立即使用。
(2)继而运行Pick Run，这个过程依次为：包括设置(包括成像设置、挑选设置、灭菌设置、克隆识别设置)。
(3)对PK(5)～(6)进行了成像，其克隆形成效率为99.8％。
(4)分析PK(5)～(6)的成像结果，分析的依据是以细胞团的大小、规则程度和荧光强度设置阈值，对克隆进行分组。其中，细胞团的规则程度以周长/面积比值，细胞边沿的光滑两个参数度来衡量，目的是使细胞团的形状接近于圆形；细胞团的荧光程度包括多种算法，例如：外部平均荧光强度Exterior Mean Intensity、外部中位数荧光强度ExteriorMedian Intensity、外部总荧光强度Exterior Total Intensity、内部荧光强度标准差Interior Intensity SD、内部平均中央荧光强度Interior Mean Centre Intensity、内部平均荧光强度Interior Mean Intensity、内部中位数荧光强度Interior MedianIntensity、内部总荧光强度Interior Total Intensity、标准化荧光强度NormalizedIntensity、总荧光强度Sum Total Intensity，根据CHO细胞分泌性表达的特点，一般选择外部平均荧光强度作为标准来设置High FITC组。
(5)将PK(5)～(6)来源的High FITC组的克隆挑取至目标板96孔板(Greiner，657185)PKC96(6)～(10)中，其荧光强度值范围为：283.556<外部荧光强度<4750.326。将PKC96(6)～(10)于37℃，5.0％CO2条件下，静置培养5～7天。
(6)结束程序，把目标板细胞PKC96(6)～(10)放置培养箱中培养，一般5～7天后成活的克隆汇合度可长至15％以上。
7.克隆的扩大培养及筛选
(1)汇合度的标定：待96孔板细胞PKC96(6)～(10)培养5天后，用CloneSelectImager(Molecular devices)对克隆进行成像，将汇合度数据导出。
(2)取样，测定抗体浓度：依次对汇合度≥15％的克隆取样，Fortebio(PALL，QKe)测定Anti-VEGF人源化抗体表达量，这101株克隆的表达量分布见图1，其中，柱形图表示在一定抗体表达量范围的克隆数，曲线表示克隆表达量分布的范围及频率。
(3)96孔板扩培至24孔板：参照克隆在96孔板中的表达量，将表达量>28.7mg/L的30个与相对表达量>110mg/L(且表达量≤28.7mg/L)的18个克隆转至24孔板PKC24(3)～(4)中，这48株克隆的表达量见图1。
(4)24孔板扩培至6孔板：全部转入，命名为PKC6(9)～(16)。
(5)6孔板批培养：48株全部参与6孔板批培养，命名为PKC6(9)～(16)，培养7天，Fortebio测定累计表达量，这48株克隆的表达量分布见图2，其中，柱形图表示在一定抗体表达量范围的克隆数，曲线表示克隆表达量分布的范围及频率。
(6)6孔板扩培至125mL摇瓶：参照克隆在6孔板中批培养的表达量，将表达量>226mg/L的7株与SPR>20pcd(且表达量≤226mg/L)的3株传代至125mL摇瓶P125(11)～(20)中，于140rmp，37℃，8.0％CO2条件下振荡培养。
(7)细胞冻存及扩培至500mL批培养：选自步骤(6)筛选出来的10株细胞。
(8)500mL批培养：P500(11)～(20)，从批培养的第三天开始取样测定细胞密度、活力及HPLC测定抗体表达量，直至细胞活力低于60％方可停止。细胞株的表达量在270～415mg/L之间，具体见表5的0世代数据和图3，柱形图表示在一定抗体表达量范围的克隆数。
8.细胞株的稳定性评估
将克隆(11)～(20)的细胞继续传代至60世代，取各细胞株20世代、40世代和60世代的细胞，做500mL批培养评估。比较细胞株在不同代次的表达量水平，细胞株表达量下降在30％之内认为细胞株是稳定的。在(11)～(20)中，稳定的有9株。结果见表5。
表5：由细胞池B筛选的克隆(11)～(20)的稳定性评估表
9.细胞池A(活力为25.28％)、细胞池B(活力为34.36％)、与细胞池C(活力为98.33％)单克隆化筛选高表达稳定细胞株的比较
1)细胞池C单克隆化筛选高表达稳定细胞株参照实施例2的步骤，不同点在于细胞池C是MSX加压至第20天的细胞，此时细胞活力为98.33％，由细胞池筛选的克隆(21)～(30)的稳定性评估数据见表6。
表6：由细胞池C筛选的克隆(21)～(30)的稳定性评估表
2)将细胞池A(数据来源于实施例1)、细胞池B(数据来源于本实施)、与细胞池C单克隆化筛选高表达稳定细胞株不同阶段的数据汇总在表7和图1～3。
表7：不同细胞池单克隆化筛选高表达稳定细胞株在不同阶段的比较
由表7和表1～3可以看出：细胞池A和细胞池B同为细胞活力在25％～35％的细胞池，由它们筛选出来的细胞株表达量及稳定性相差不大，但是都比由细胞池C(活力>95％)筛选出来的细胞株表达量高，稳定性更好。

Claims (3)

1.一种GS表达系统细胞株的高通量筛选方法，其特征在于，由以下步骤组成：
(1)在氨基亚砜蛋氨酸加压后，选择细胞活力在25％～35％的细胞池进行单克隆化筛选；
(2)将步骤(1)所述的细胞池加入到含有条件培养基和甲基纤维素的半固体培养基上形成单克隆，细胞终浓度为150cells/mL；其中所述的条件培养基的体积比为10％，甲基纤维素的浓度为0.9～1.5g/mL；
(3)利用高通量细胞筛选系统筛选细胞株；
(4)对步骤(3)中筛选出来的细胞株进行稳定性评估；
其中，步骤(2)所述条件培养基的制备方法为：取含GS空载体稳转的GS稳定细胞株进行批培养，细胞培养至密度在0.9×107～1.1×107cells/mL之间且细胞活力>95％时，经过离心分离上清和细胞，取上清用膜过滤处理后待用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GS表达系统为携带GS基因的并且GS基因下游插入了外源基因的表达载体转染至NS0细胞或者敲除了GS基因的CHO细胞，其中所述的敲除了GS基因的CHO细胞是CHOK1SV GS-KO。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量细胞筛选系统为MolecularDevices的ClonePix2。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2018032464A1 (zh) * 2016-08-18 2018-02-22 广东东阳光药业有限公司 一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法
CN108085337B (zh) * 2017-12-28 2020-10-16 未名生物医药有限公司 一种gs表达系统细胞株的筛选方法
CN112037853B (zh) * 2019-10-30 2021-12-10 深圳太力生物技术有限责任公司 筛选能够表达期望产物细胞株的方法
CN118006685B (zh) * 2024-04-07 2024-07-23 上海碧博生物医药科技有限公司 一种快速的高表达单克隆细胞株构建方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533656A (zh) * 2010-12-29 2012-07-04 嘉和生物药业有限公司 一种细胞株的筛选方法
CN102586190A (zh) * 2011-01-11 2012-07-18 北京华安科创生物技术有限公司 高效表达重组人神经生长因子的cho细胞株及其构建方法
CN103509823A (zh) * 2012-06-25 2014-01-15 上海复宏汉霖生物技术有限公司 一种利用cho细胞生产重组蛋白的真核表达载体及系统
CN104087612A (zh) * 2013-06-13 2014-10-08 广州优联康医药科技有限公司 高表达外源蛋白的哺乳动物细胞株快速筛选
CN104404082A (zh) * 2014-11-19 2015-03-11 上海美百瑞生物医药技术有限公司 一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8765370B2 (en) * 2009-06-11 2014-07-01 Scinopharm Taiwan, Ltd Inhibition-based high-throughput screen strategy for cell clones

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533656A (zh) * 2010-12-29 2012-07-04 嘉和生物药业有限公司 一种细胞株的筛选方法
CN102586190A (zh) * 2011-01-11 2012-07-18 北京华安科创生物技术有限公司 高效表达重组人神经生长因子的cho细胞株及其构建方法
CN103509823A (zh) * 2012-06-25 2014-01-15 上海复宏汉霖生物技术有限公司 一种利用cho细胞生产重组蛋白的真核表达载体及系统
CN104087612A (zh) * 2013-06-13 2014-10-08 广州优联康医药科技有限公司 高表达外源蛋白的哺乳动物细胞株快速筛选
CN104404082A (zh) * 2014-11-19 2015-03-11 上海美百瑞生物医药技术有限公司 一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法

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