CN105754026B - 实现细胞膜修饰的糖胺聚糖类似物及其合成方法及其体外诱导干细胞定向分化的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实现细胞膜修饰的糖胺聚糖类似物及其合成方法及其体外诱导干细胞定向分化的应用方法,该类似物能够插入到细胞膜表面,并在较短周期内可以促使干细胞定向高效地分化成成熟的神经元细胞。本发明中磷脂锚定的糖胺聚糖类似物首先通过可逆加成‑断裂链转移聚合(RAFT)制备一种糖胺聚糖类似物,进一步利用马来酰亚胺化的磷脂分子实现糖胺聚糖类似物的磷脂化。磷脂化的糖胺聚糖类似物通过磷脂基团与细胞膜之间的亲和作用,将糖胺聚糖类似物引入到干细胞的表面,从而更有利于促进干细胞高效地分化成成熟的神经元细胞。本发明合成过程简单,提供了一种可以实现几乎任何RAFT聚合物磷脂化的强大手段。
Description
技术领域
本发明属于小分子、聚合物合成以及生物医学应用领域,具体涉及一种马来酰亚胺化的磷脂分子、绿色荧光素标记的糖胺聚糖类似物以及磷脂锚定的糖胺聚糖类似物的合成方法,利用化学活性基团之间的反应以及RAFT技术获得了可以插入到细胞膜上并能够在短周期内高效促进胚胎干细胞定向分化成成熟神经元的高分子物质。
背景技术
胚胎干细胞(ESCs)是从囊胚期的内细胞团中分离获得的一类全能性细胞,它能自我更新,并在一定条件下可以分化成几乎所有的体细胞,因此ESCs成为目前最具有发展前途的细胞治疗和组织移植的细胞源。天然糖胺聚糖(GAG)是一种由糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖组成的二糖单元构成的高度结构异质的高硫酸化多糖,被广泛认为是能够调节干细胞分化行为的重要物质。然而无论是天然的GAG分子还是化学合成的GAG类似物,虽然在与细胞发生作用的过程中可以获得一定的生物活性,但是这些聚合物分子在短时间内都会被细胞内在化,而使得功能性聚合物分子不能直接与特异性生长因子以及细胞表面相应的受体作用,因此,通过细胞膜表面工程技术制备一种磷脂基团锚定的GAG类似物,利用磷脂与细胞膜表面的亲和作用将GAG类似物直接引入到细胞膜定向诱导ESCs的分化,其应用于组织工程具有重要的科学价值和社会意义。
目前,人们制备磷脂基团锚定的GAG类似物的主要方法如下:首先合成一种含有磷脂基团(常用的分子为DPPE)的RAFT试剂,之后将一定结构的乙烯基单体进行RAFT聚合得到一种分子链末端带有磷脂基团的聚合物,最后将特定结构的单糖或二糖分子通过化学反应接枝到聚合物链上得到磷脂基团锚定的聚糖分子,该方法虽然可以获得不同类别GAG的生物活性,但是其基于天然结构糖类的衍生物而导致主链上磺化度的不可控,并且制备过程往往涉及到后续引入荧光基团以及脱保护等过程,使得合成及提纯过程较复杂,限制了该方法的广泛应用。
因此,开发一种操作简单、适用性广并且易于控制主链结构的磷脂锚定的GAG类似物的合成方法,将其插入到细胞膜表面应用于体外诱导ESCs定向分化成成熟的神经元,具有十分重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种磷脂基团锚定的GAG类似物的合成方法,实现其对细胞膜的修饰以及在体外诱导ESCs短期内定向高效地分化成成熟的神经元。
为达到上述目的,本发明采用的一种技术方案为:一种磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物,其特征在于,
其分子结构式具体为:
本发明采用的一种技术方案为:糖胺聚糖类似物的合成方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将对乙烯基苯磺酸钠单体(SS)、2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体(MAG)和荧光素O-异丁烯酸酯(FluMA)以一定摩尔比溶于溶剂中,利用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)技术进行聚合得到具有三种单体的共聚物(pSMF);
(2)将二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)与马来酰亚胺化的琥珀酰亚胺(MAL-Ahx-NHS)以一定摩尔比溶于溶剂中,反应后得到马来酰亚胺化的磷脂分子(MAL-DPPE);
(3)将共聚物(pSMF)与马来酰亚胺化的磷脂分子(MAL-DPPE)以一定摩尔比溶于溶剂中,加入伯胺类还原剂,反应后得到磷脂锚定的糖胺聚糖类似物(DPPE-pSMF)。
本发明一个较佳实施例,步骤(1)中的溶剂为水和氮氮二甲基甲酰胺的混合溶剂。
本发明一个较佳实施例,步骤(2)中的溶剂为二氯甲烷。
本发明一个较佳实施例,步骤(3)中的溶剂为二甲基亚砜。
本发明一个较佳实施例,步骤(2)和(3)中均加入三乙胺作为催化剂。
本发明采用的一种技术方案为:应用糖胺聚糖类似物进行体外诱导干细胞定向分化成神经元的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)向种有对象真核细胞的培养板内加入含有磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物的培养液,培养孵育若干小时;
(2)向培养孵育后的对象真核细胞中加入诱导神经分化培养基,培养若干天。
本发明一个较佳实施例,所述培养板内预先铺满明胶。
本发明一个较佳实施例,培养孵育的条件为恒温孵育,温度范围为20-40℃,优选37℃。
本发明一个较佳实施例,所述对象真核细胞为:胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或神经干细胞。
本发明采用的一种技术方案为:一种磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物,将SS、MAG和FluMA以一定摩尔比添加到水和氮氮二甲基甲酰胺的混合溶剂中,利用RAFT技术得到三元共聚物pSMF;将DPPE与MAL-Ahx-NHS溶于纯化的二氯甲烷中,利用伯胺与琥珀酰亚胺基团之间的反应得到MAL-DPPE;最后以乙醇胺为还原剂,将MAL-DPPE和pSMF溶于二甲基亚砜中,利用pSMF还原后生成的巯基与马来酰亚胺之间的加成反应得到DPPE-pSMF。
本发明的另一种技术方案为:一种磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物的合成方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备聚合物:将SS、MAG和FluMA以单体以一定投料比添加到水和氮氮二甲基甲酰胺的混合溶剂中,利用RAFT技术进行聚合得到三种单体的共聚物;
(2)合成小分子:将DPPE与MAL-Ahx-NHS以一定摩尔比溶于纯化的二氯甲烷中,加入少量纯化三乙胺,室温下反应,纯化后得到MAL-DPPE;
(3)制备磷脂锚定的聚合物:将pSMF与MAL-DPPE以一定摩尔比溶于二甲基亚砜中,乙醇胺为还原剂,加入少量纯化三乙胺,室温下反应,纯化后得到DPPE-pSMF。
本发明的进一步的技术方案为:一种使用磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物对细胞膜进行修饰的应用方法,其特征在于,包括以下步骤:向种有模型细胞Hela的细胞爬片板上加入含有磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物的无血清培养液,37℃恒温培养箱孵育若干小时,无菌PBS清洗2~3次。
本发明的进一步的技术方案为:一种使用磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物在体外定向诱导ESCs高效分化成成熟的神经元的应用方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)向种有胚胎干细胞的孔板内加入含有磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物的无血清培养液,37℃恒温培养箱孵育若干小时,无菌PBS清洗2~3次;
(2)向清洗后的胚胎干细胞中加入诱导神经分化培养基,培养若干天。
进一步,所述的孔板预先铺满明胶。
由于上述技术方案的应用,与现有技术相比,本发明具有以下突出特点:
1.本发明由于将含有糖单元和磺酸单元的两种单体进行共聚来模拟GAG,因此糖胺聚糖类似物的磺化度易于控制;
2.本发明所述的磷脂锚定的合成方法和提纯过程简单,普适性强,适用于几乎任何RAFT聚合物。
附图说明
图1中为实施例一中所获得的磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物DPPE-pSMF的1H-NMR谱图;
图2中为实施例二中利用单纯的糖胺聚糖类似物分子pSMF以及本方法合成的磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物DPPE-pSMF对Hela细胞膜修饰的结果对比;
图3是实施例三中qPCR定量分析分别经过肝素、pSMF和DPPE-pSMF三种物质孵育/培养的胚胎干细胞βIII-tubulin基因表达量。
具体实施方式
以下实施例提供了磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物的合成方法,包括绿色荧光素标记的糖胺聚糖类似物的制备,马来酰亚胺化的磷脂分子的合成,以及磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物的合成,同时利用体外细胞培养染色和神经分化检测技术验证了所获得的聚合物对细胞膜的修饰以及促进胚胎干细胞定向高效地分化成神经元的作用。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明,但不限制本发明。
一种的磷脂基团锚定的糖胺基团类似物的合成方法,包括以下步骤:
(1)利用RAFT技术制备SS、MAG和FluMA三种单体的共聚物(分子量在6000-10000范围内),利用活性基团之间的化学反应合成MAL-DPPE和DPPE-pSMF;
(2)将制备得到的DPPE-pSMF按一定浓度溶于无血清的培养液中,37℃恒温培养箱中对Hela细胞孵育一定时间后,研究其对细胞膜表面的修饰情况;
(3)将DPPE-pSMF溶于无血清的培养液中,37℃恒温培养箱中对ESCs孵育一定时间,清洗后加入新鲜的诱导神经分化培养液,若干天后研究其促进ESCs定向分化成神经元的情况。
本发明的原理是:采用RAFT技术制备了绿色荧光素标记的糖胺聚糖类似物pSMF,通过伯胺与琥珀酰亚胺官能团之间的化学反应合成间隔臂分子MAL-DPPE,利用RAFT聚合物还原后生成的巯基与马来酰亚胺基团之间的加成反应合成DPPE-pSMF,并通过磷脂基团与细胞膜之间的亲和性对细胞膜表面进行修饰,进一步将其引入到胚胎干细胞表面在体外定向诱导ESCs的神经分化。
一种磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物的合成方法,包括以下步骤:
(1)制备聚合物:将SS、MAG和FluMA以单体以一定投料比添加到水和氮氮二甲基甲酰胺的混合溶剂中,利用RAFT技术进行聚合得到三种单体的共聚物pSMF;
(2)合成小分子:将DPPE与MAL-Ahx-NHS以一定摩尔比溶于纯化的二氯甲烷中,加入少量纯化三乙胺,室温下反应,纯化后得到MAL-DPPE;
(3)制备磷脂锚定的聚合物:将pSMF与MAL-DPPE以一定摩尔比溶于二甲基亚砜中,乙醇胺为还原剂,加入少量纯化三乙胺,室温下反应,纯化后得到DPPE-pSMF。
实施例一
(1)选取SS、MAG、FluMA为单体,在DMF/H2O(V/V=1:1)的混合溶剂中进行RAFT聚合,反应一定时间后,将反应液透析纯化后得到三元共聚物pSMF,将其与MAL-DPPE进行加成反应得到磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物DPPE-pSMF;
(2)通过核磁共振氢谱和红外光谱对所得物质进行表征。
结果如图1所示,磷脂锚定的糖胺聚糖类似物DPPE-pSMF的1H-NMR谱图。
将磷脂锚定的糖胺聚糖类似物对模型细胞进行细胞膜修饰,包括以下步骤:
(1)将模型细胞Hela种植于细胞爬片板上,配制一定浓度的含有磷脂锚定的糖胺聚糖类似物的无血清培养液,37℃下孵育Hela细胞一定时间;
(2)无菌PBS清洗2~3次,对细胞表面引入的聚合物分子情况进行研究。
实施例二
(1)将Hela细胞种植于细胞爬片板上,分别加入含有3.4μM的三元共聚物pSMF和磷脂基团锚定的聚合物DPPE-PSMF的无血清高糖DMEM培养液,37℃恒温培养箱中孵育1h,未加任何聚合物的无血清高糖DMEM孵育的细胞作为对照组;
(2)弃去上述孵育细胞的培养液,无菌PBS清洗细胞2~3次除去过量的聚合物,用4%多聚甲醛溶液对爬片板上的细胞进行固定,利用DAPI试剂对细胞核进行染色,在共聚焦荧光显微镜下观察磷脂锚定聚合物在细胞膜表面的修饰。
结果如图2所示,Hela细胞分别在含有pSMF和DPPE-pSMF以及未加聚合物的培养液环境中孵育1h后,细胞膜表面聚合物修饰的情况。
利用磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物引入到胚胎干细胞表面,应用于体外定向诱导ESCs分化成神经元,包括以下步骤:
(1)将小鼠胚胎干细胞种植于预先铺满明胶的孔板中,将DPPE-pSMF溶于无血清的培养液中,37℃恒温培养箱中对ESCs孵育一定时间;
(2)无菌PBS清洗后加入新鲜的诱导神经分化培养液,分别培养7days和14days;
(3)对培养7days和14days后的细胞进行βIII-tubulin免疫荧光染色实验,通过图像定性观察胚胎干细胞定向分化成神经细胞的情况;
(4)对培养7days和14days后的细胞进行荧光定量PCR实验,定量比较不同对照组下胚胎干细胞定向分化成神经细胞的情况。
实施例三
(1)将小鼠胚胎干细胞种植于预先铺满明胶的孔板中,加入含有1.7μM的磷脂锚定聚合物DPPE-pSMF的无血清高糖DMEM培养基,37℃恒温培养箱中孵育1h后利用无菌PBS清洗细胞2~3次,再加入新鲜的诱导神经分化的培养液分别培养7days和14days;以加入分别含有1.7μM的pSMF和5μg/mL的天然肝素的神经分化培养液培养7days和14days的细胞分化情况作为对照组。
(2)弃去原培养液,依次使用4%多聚甲醛溶液、0.1%Triton X-100/PBS溶液及3%牛血清白蛋白(BSA)溶液对细胞进行固定、破膜及封闭处理,随后利用含有神经分化后期所表达的标志物βIII-tubulin的特异性抗体对细胞进行免疫荧光染色处理,DAPI对细胞核染色后在倒置荧光显微镜下观察细胞7days和14days后定向分化的情况。(注:由于在1.7μM的低聚合物浓度的培养液中孵育,培养细胞7days后在倒置荧光显微镜下便已观察不到绿色荧光信号,因此不会对FITC-IgG作为二抗的免疫荧光染色过程产生干扰。)
(3)利用RNA全提取试剂盒提取培养7days和14days天后的细胞中全部RNA,并逆转录为cDNA。利用实时PCR系统对细胞中所表达的特异性蛋白进行定量分析。
结果如图3所示,胚胎干细胞培养7days和14days后的神经分化情况。
图3是qPCR定量分析分别经过聚合物pSMF、DPPE-pSMF与肝素培养的细胞分别培养7days和14days后细胞中βIII-tubulin表达量,结果表明14days后,通过DPPE-pSMF将聚合物引入到细胞膜后,对胚胎干细胞的定向诱导神经分化效果相比其他对照组达到了最好的效果。
以上依据本发明的理想实施例为启示,通过上述的说明内容,相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内,进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容,必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。
Claims (9)
1.一种磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物,其特征在于,
分子量为6000-10000,其分子结构式具体为:
2.根据权利要求1所述的糖胺聚糖类似物的合成方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将对乙烯基苯磺酸钠单体、2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体和荧光素O-异丁烯酸酯以一定摩尔比溶于溶剂中,利用可逆加成-断裂链转移聚合技术进行聚合得到具有三种单体的共聚物;
(2)将二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与马来酰亚胺化的琥珀酰亚胺以一定摩尔比溶于溶剂中,反应后得到马来酰亚胺化的磷脂分子;
(3)将共聚物与马来酰亚胺化的磷脂分子以一定摩尔比溶于溶剂中,加入伯胺类还原剂,反应后得到磷脂锚定的糖胺聚糖类似物。
3.根据权利要求2所述的糖胺聚糖类似物的合成方法,其特征在于:步骤(1)中的溶剂为水和氮氮二甲基甲酰胺的混合溶剂。
4.根据权利要求2所述的糖胺聚糖类似物的合成方法,其特征在于:步骤(2)中的溶剂为二氯甲烷。
5.根据权利要求2所述的糖胺聚糖类似物的合成方法,其特征在于:步骤(3)中的溶剂为二甲基亚砜。
6.根据权利要求2所述的糖胺聚糖类似物的合成方法,其特征在于:步骤(2)和(3)中均加入三乙胺作为催化剂。
7.应用如权利要求1所述的糖胺聚糖类似物进行体外诱导干细胞定向分化成神经元的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)向种有对象真核细胞的培养板内加入含有磷脂基团锚定的糖胺聚糖类似物的培养液,培养孵育若干小时;
(2)向培养孵育后的对象真核细胞中加入诱导神经分化培养基,培养若干天。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述培养板内预先铺满明胶。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述对象真核细胞为:胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或神经干细胞。
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Legal Events
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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