CN107206015A - 透细胞质膜的传递 - Google Patents

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Abstract

有效装载穿过细胞质膜的传递包括提供细胞群，将细胞群与一定体积的水溶液相接触。所述水溶液包括有效装载和浓度大于百分之五的醇类。水溶液的体积可以是细胞群暴露表面积的函数，或者使细胞群中细胞数目的函数。这里还描述了有关的组合物、仪器、系统、技术和物品。

Description

透细胞质膜的传递
相关申请
本申请要求2014年10月24日递交的英国申请第1419013.6号、2014年10月24日递交的英国申请第1419012.8号和2014年10月24日递交的英国申请第1319011.0号的优先权。这些申请的全部内容在此通过引用明确的并入本文。
技术领域
本发明涉及透细胞质膜传递的试剂。本发明的主题内容可以包括，例如，将分子、生物学和药理学治疗剂传递到目标区域，例如，细胞、组织或者器官。
背景技术
尽管在一些领域已经有了技术上的发展，但是由于例如分子尺寸、分子电荷等因素的影响，将某些特定分子传递进入细胞仍然存在挑战。质膜或者细胞膜是一种半渗透性的生物膜，能够起到选择性隔离的作用，调节细胞的化学组成。因此，只有特定的某些分子可以通过被动扩散穿过质膜进入细胞。小的、疏水性的分子(例如，O2、CO2和N2)以及小的、不带电荷的极性分子(例如，H2O和甘油)可以通过被动扩散穿过质膜。大的、不带电的极性分子(比如氨基酸、葡萄糖，和核苷酸)和离子(比如H+、Na+、K+和Cl-)不能被动地扩散入细胞。
发明内容
本发明基于出乎意料的发现，即，通过将细胞与一种包含待传递化合物(例如，有效装载)和能够可逆的渗透或者溶解细胞膜的试剂的溶液相接触，所述化合物或者化合物的混合物(组合物)可以被传递到真核细胞的细胞质中。优选的，所述溶液以喷雾的形式被传递到细胞中，例如，五水和的颗粒。例如，所述细胞被喷雾包覆而不是将所述细胞渗透或者浸没在包含待传递化合物的溶液中。能够渗透或者溶解真核细胞膜的示范性的试剂包括醇类和去污剂，分别例如乙醇和Triton X-100。其他示范性的去污剂(例如，表面活性剂)包括聚山梨酸酯20(例如、吐温20)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基胺]丙烷磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基胺]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)、十二烷基硫酸钠(SDS)，和辛基葡糖苷。
用于实现包覆一群被包覆的细胞的情况的实施例包括传递微细细粉颗粒喷雾，例如，所述情况不包括向细胞上滴入或者通过移液管加入大量的溶液使细胞群基本上被渗透或者被大量流体淹没。因此，所述雾或者喷雾包括一定的液体体积与细胞体积比例。作为选择，所述情况包括雾或者喷雾的体积与暴露的细胞面积(例如，在基本上平的平面上，例如组织培养皿的底部，例如，组织培养皿的小孔中，例如，微滴定组织培养皿中，当细胞以交会层或者基本上交会层的形式存在时暴露的细胞膜面积)的比例。
因此，有需要提供一种不含载体，例如不含病毒载体的方法用于传递生物学上相应的有效装载，例如，化合物或者组合物，使其穿过质膜进入细胞。“负载”或者“有效负载”是用于描述化合物或者组合物的术语，所述化合物或者组合物通过水溶液被传递穿过细胞质膜进入细胞内部。
在一个方面中，将有效装载传递通过细胞质膜包括提供细胞群并将此细胞群与一定体积的水溶液接触。所述水溶液包括有效装载和醇类，含量大于5浓度百分比。所述水溶液的量可以是细胞群暴露表面面积的函数，或者可以是细胞群中细胞数目的函数。
在另一个方面，用于传递有效装载通过细胞质膜的组合物包括一种水溶液，所述水溶液包括有效装载、浓度大约百分之5的醇，小于46mM的盐、小于121mM糖和小于19mM的缓冲剂。例如，所述醇类(例如，乙醇)浓度不超过50％。
一个或者一个以上下列特征可以被归入以下任意可行的结合中。被传递到细胞中的液体的量可以是任意单位，例如，一喷雾；例如，在水性颗粒上的小滴。所述体积相对于单独的细胞或者相对于交会细胞群或者基本上交会的(例如，至少75％，至少80％交会；例如，85％、90％、95％、97％、98％、100％)细胞群体而描述的。例如，所述体积可以在每个细胞6.0x 10-7微升至每细胞7.4x 10-4微升之间。所述体积在每个细胞4.9x 10-6微升和每细胞2.2x 10-3微升之间。所述体积可以在每细胞9.3x10-6微升到2.8x10-5微升之间。.所述体积可以是大约1.9x10-5微升没细胞，并且大约是指在百分之10以内。所述体积在每个细胞6.0x10-7微升和每细胞2.2x 10-3微升之间。所述体积可以在2.6x 10-9微升每平方微米裸露表面面积到1.1x 10-6微升每平方微米裸露表面面积之间。所述体积可以在5.3x 10-8微升每平方微米裸露表面面积到1.6x 10-7微升每平方微米裸露表面面积之间。所述体积可以是1.1x10-7微升每平方微米的暴露表面面积。大约可以是在百分之十之内。
细胞的交会指的是细胞在一个表面上相互接触。例如，它可以被表示为一种估计的(或者计算的)百分比，例如，10％交会指的是10％的表面，例如，10％组织培养容器的表面被细胞覆盖，100％指的是完全覆盖。例如，粘附细胞在组织培养孔、平皿或者烧瓶表面上两个维度上生长。非粘附细胞可以通过真空旋出、拉开，或者从细胞群顶部的组织培养基吸出，或者从容器的底部吸出或者真空除去。
通过气推作用将水溶液形成喷雾，并以此将所述细胞群与大量水溶液相接触。所述气体可以是氮气、环境空气或者惰性气体。所述喷雾是一种离散单元，体积单位的直径在1纳米到100微米，例如，30-100微米范围内。所述喷雾包括直径大约在30-50微米范围内的离散单元。总体积为20微升的水溶液可以以喷雾形式被传递到大约1.9平方厘米被细胞占领的区域内，例如24-孔板的孔内。总体积为10微升的水溶液可以被传递到大约0.95平方厘米的被细胞占领的区域内，例如，一个48-孔板的孔中。通常，所述水溶液包括有效装载，可以穿过细胞膜进入细胞，并且第二体积是不包含有效装载的缓冲剂或者培养基。作为选择，第二体积(缓冲液或者培养基)还可以包含有效装载。在一些实施方案中，所述水溶液包括有效装载和醇类，和不包含醇(和选择性地不包含有效装载)的第二体积。在加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群之前，细胞群可以与所述水溶液接触0.1-10分钟。所述缓冲液或者培养基可以是磷酸盐缓冲液(PBS)。在加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群之前，细胞群可以与所述水溶液接触2秒-5分钟。所述细胞群可以与水溶液相接触，例如，与包含所述有效装载的水溶液接触30秒到2分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基，例如，加入不包括有效装载的缓冲液或者培养基，从而浸没或者悬浮细胞群。在加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群之前，细胞群可以与所述喷雾接触1-2分钟。在向细胞喷雾和加入缓冲液或者培养基这段时间期间，所述细胞通过来自喷雾体的水汽层保持水合状态。
所述水溶液可以包括5到30％的乙醇浓度。所述水溶液还可以包括75％到98％的水、2-45％的乙醇、6-91mM的蔗糖，2到35mM的氯化钾、2到35mM的乙酸铵和1到14mM的(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸)(HEPES)中的一个或者一个以上。
所述细胞群可以包括粘附细胞或者非粘附细胞。所述粘附细胞可以包括间充质干细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、肺细胞、神经元的细胞、成纤维细胞、人脐静脉(HUVEC)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和人胚肾(HEK)细胞或者固定细胞(比如，细胞系)中的至少一种。所述细胞群可以包括非粘附细胞。所述非粘附细胞可以包括主要的造血干细胞(HSC)、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的致死(CIK)细胞、人脐带血CD34+细胞、B细胞、或者细胞系(比如Jurkat T细胞系)中的至少一个。
所述有效装载可以包括小化学品分子、肽或者蛋白质，或者核酸。所述小化学品分子可以小于1,000道。所述化学品分子可以包括MitoTracker、Red CMXRos、碘化丙啶、氨甲蝶呤和/或DAPI(4',6'-二氨基-2-苯基吲哚)。所述肽可以是5,000道尔顿。所述肽可以包括艾卡拉肽(商品名为Kalbitor，这是一种具有60个氨基酸的多肽，用于治疗遗传性血管性水肿并在心胸手术中预防失血)、利拉鲁肽(以商品名Victoza上市销售用于治疗II型糖尿病，以商品名Saxenda上市销售用于治疗肥胖)和艾替班特(商品名为Firazyer，这是一种肽模拟物，用于治疗遗传学血管性水肿的急性发作)。小干扰性核糖核酸(siRNA)分子的长度可以是大约20-25个碱基对，或者可以是大约10,000-15,000道尔顿。所述siRNA分子可以减少任意一种基因产物的表达，例如，降低临床相应目标基因或者模型基因的基因表达，例如，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)siRNA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)siRNA-FITC、亲环蛋白B siRNA、和/或核纤层蛋白siRNA。蛋白质治疗剂可以包括肽、酶、结构蛋白质、受体、细胞蛋白质，或者传播蛋白质、或者其片段。所述蛋白质或者多肽是大约100-500,000道尔顿，例如，是1,000-150,000道尔顿。所述蛋白质可以包括任何治疗剂、诊断、或者研究蛋白质或者核酸，例如，β-乳球蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)，和/或辣根过氧化酶。在其他实施例中，所述蛋白质可以包括癌症特异性凋亡蛋白质，例如，肿瘤坏死因子有关的凋亡诱导蛋白质(TRAIL)。
抗体的分子量通常是150,000道尔顿。所述抗体可以包括抗-肌动蛋白抗体、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、抗Src抗体、抗Myc抗体和/或抗Raf抗体。所述抗体可以包括绿色荧光蛋白质(GFP)质粒、GLuc质粒和BATEM质粒。所述脱氧核糖核酸分子可以大于5,000,000道尔顿。在一些实施例中，所述抗体可以是鼠衍生的单克隆抗体，例如，替伊莫单抗tiuxetin、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、人类抗体，或者人源化的鼠(或者其他种族来源的)抗体。在其他实施例中，所述抗体可以是嵌合的单克隆抗体，例如、阿昔单抗、巴利昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗，或者美罗华。在依旧其他实施例中，所述抗体可以是人源化的单克隆抗体、例如、阿仑单抗、贝伐珠单抗、妥珠单抗、达(克)珠单抗、吉妥单抗、曲妥珠单抗、塔西单抗、伊匹单抗或者帕尼单抗。所述抗体可以包括一种抗体片段，例如，abatecept、阿柏西普、阿法赛特，或者依那西普。本发明不但包括一种完整的单克隆抗体，而且包括一种免疫活性抗体片段，例如Fab或者(Fab)2片段；一种工程设计的单链FV分子；或者嵌合分子，例如，一种既包括一个抗体结合特异性(例如，鼠起源的抗体)又包括另外一个抗体(例如，人起源的抗体)剩余部分的抗体。
所述有效装载可以包括治疗剂。治疗剂，例如，药物，或者活性试剂指的是任意对治疗或者诊断目的有效的化合物，该术语可以被理解为任意能够对患者施用治疗疾病的化合物。因此，治疗剂可以包括蛋白质、肽、抗体、抗体片段和小分子。美国专利第7,667,004号(通过引证在此全部并入本文)中描述的治疗剂可被用于这里所描述的方法中。所述治疗剂可以包括顺式铂氨、阿斯匹林、斯达汀(例如，匹伐他汀、阿伐他汀、洛弗斯特丁、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀、丙嗪盐酸、氯丙嗪盐酸、甲硫哒嗪盐酸、硫酸多粘菌素B、二氯羟喹、苯氟雷司盐酸和苯基偶氮吡啶二胺盐酸)，和氟苯氧丙胺中的至少一个。所述有效装载可以包括诊断剂。所述诊断剂可以包括可检测的标记或者标记物，例如次甲基蓝、专利蓝和靛氰绿中的一个。所述有效装载可以包括荧光分子。所述有效装载可以包括可检测的纳米颗粒。所述纳米颗粒可以包括量子点。
所述细胞群基本上是交会的，例如，大于百分之75的交会。细胞的交会指的是细胞在一个表面上相互接触。例如，她可以被表示为一种估计的(或者计算的)百分比，例如，10％交会指的是10％的表面，例如，10％组织培养容器的表面被细胞覆盖，100％指的是完全覆盖。例如，粘附细胞在组织培养孔、平皿或者烧瓶表面上两个维度上生长。非粘附细胞可以通过真空旋出、拉开，或者从细胞群顶部的组织培养基吸出，或者从容器的底部吸出或者真空除去。所述细胞群可以形成单细胞层。
所述醇类可以选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇和苯甲醇。所述盐选自NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4，和C2H3O2NH。所述糖可以包括蔗糖。所述缓冲剂可以包括4-2-(羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。
本发明主题内容涉及用于传递分子穿过质膜的方法。本发明的主题内容发现在细胞内传递方面的应用，并且已经用于，例如，将分子、生物学和药理学治疗剂传递的到目标区域，例如，细胞、组织或者器官中。本发明主题内容涉及的方法包括将分子引入水性组合物中形成基质；将所述基质雾化为喷雾，并将此基质与质膜相接触。
本发明主题内容涉及用于传递分子穿过质膜的组合物。本发明的主题内容发现在细胞内传递方面的应用，并且已经用于，例如，将分子、生物学和药理学治疗剂传递的到目标区域，例如，细胞、组织或者器官中。本发明主题内容所涉及的组合物包括醇类、盐、糖；缓冲剂；和乙酸铵。
在一些实施方案中，这里说明了一种能够促进分子细胞内传递的渗透技术，不依赖于所述分子和细胞类型。纳米颗粒、小分子、核酸、蛋白质及其他分子可以高效地原位传递入悬浮液细胞或者粘附细胞(包括初级细胞和干细胞在内)中，并具有低细胞毒性，因此所述技术与高流通量和基于自动细胞的试验兼容。
这里所描述的实施例方法包括有效装载，其中所述有效装载包括醇类。术语“醇类”指的是一种包括附着于至少一个碳原子的羟基(-OH)功能性基团的多原子有机化合物。所述醇类可以是一元醇并且可以包括至少一个碳原子，例如，甲醇。所述醇可以包括至少两个碳原子(例如乙醇)。在其他方面，所述醇类包括至少三个碳原子(例如异丙醇)。所述醇类可以包括至少四个碳原子(例如，丁醇)，或者至少七个碳原子(例如，苯甲醇)。示例性的有效装载可以仅仅包括50％(v/v)的醇类，更优选的，所述有效装载包括2-45％(v/v)的醇类，5-40％的醇类，和10-40％的醇类。所述有效装载可以包括20-30％(v/v)的醇类。
最优选的，所述有效装载可以包括25％(v/v)的醇类。作为选择，所述有效装载可以包括2-8％(v/v)的醇类，或者2％的醇类。所述醇类可以包括乙醇并且所述有效装载包括5，10，20，25，30，或者40％(v/v)的所述乙醇。示例性的方法可以包括甲醇当作所述醇类，并且所述有效装载可以包括5，10，20，25，30，或者40％(v/v)的所述甲醇。所述有效装载可以包括2-45％(v/v)的甲醇，20-30％(v/v)，或者25％(v/v)的甲醇。优选的，所述有效装载可以包括20-30％(v/v)的甲醇。进一步地中作为选择，所述醇类是丁醇并且所述有效装载可以包括2、4或者8％(v/v)的丁醇。
在本主题内容的一些方面，所述有效装载处于一种低渗溶液或者缓冲液中。所述有效装载液具有的渗透浓度为171mOsm/L。根据示例性的方法，所述有效装载液在室温下具有的渗透浓度为171mOsm/L。
根据本发明主题内容，所述有效装载可以包括至少一种盐。所述盐选自NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4，和C2H3O2NH。根据实施例方法，所述有效装载包括NaCl，KCl，Na2HPO4，和KH2PO4中的一种。所述有效装载可以包括小于46mM盐。进一步地，所述有效装载包括2-35mM盐，或者10-15mM盐(例如，12mM盐)。根据实施例方法，所述盐是KCl并且所述有效装载包括2.4，4.8，7.2，9.6，12，24，28.8，或者33.6mM KCl，并且更优选的12mM KCl。
根据本发明主题内容的示例性方法，所述有效装载可以包括糖(例如，蔗糖或者二糖)。根据实施例方法，所述有效装载包括小于121mM糖，6-91mM，或者26-39mM糖。更进一步的，所述有效装载包括32mM糖(例如，蔗糖)。选择性地，所述糖是蔗糖并且所述有效装载包括6.4，12.8，19.2，25.6，32，64，76.8，或者89.6mM蔗糖。
根据本发明主题内容的示例性方法，所述有效装载可以包括缓冲剂(例如弱酸或者弱碱)。所述缓冲剂可以包括两性离子。根据实施例方法，所述缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。所述有效装载可以包括小于19mM的缓冲剂(例如，1-15mM，或者4-6mM或者5mM缓冲剂)。根据实施例方法，所述缓冲剂是4-(2-羟乙基)哌嗪乙烷硫酸并且所述有效装载包括1，2，3，4，5，10，12，14mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。进一步地优选的，所述有效装载包括5mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。
根据本发明主题内容的实施例方法，所述有效装载包括乙酸铵。所述有效装载可以包括小于46mM的乙酸铵(例如，在2-35mM，10-15mM，或者12mM的乙酸铵)。所述有效装载可以包括2.4，4.8，7.2，9.6，12，24，28.8，或者33.6mM的乙酸铵。
这里所描述的方法包括第二个主题内容，其中，提供了第二有效装载(例如，水溶液)包括68mM的NaCl，1.4mM KCl、5mM Na2HPO4和0.9mM KH2PO4。有效装载的pH值可能是7.4。
大量水溶液的气推作用可以通过包括压缩空气(例如环境空气)来完成，还可以通过其他方法，包括惰性气体，例如，氦气、氖气和氩气。
在本主题内容的某些方面，所述细胞群可以包括粘附细胞(例如，肺细胞，肾细胞，免疫细胞，比如巨噬细胞)或者非粘附细胞(例如，悬浮细胞)。
本主题内容的某些方面中，所述细胞群是基本上交会的，且基本上可以包括大于75％的交会。在优选的实施方案中，细胞群可以形成单层。
根据实施例方法，被传递的有效装载具有的平均分子量高达20,000,000道尔顿。在一些实施例中，被传递的有效装载具有的平均分子量高达2,000,000道尔顿。在一些实施方案中，被传递的有效装载具有的平均分子量高达150,000道尔顿。在进一步地实施方案中，被传递的有效装载具有的平均分子量高达15,000道尔顿、5,000道尔顿、或者1,000道尔顿。
通过细胞质膜被传递的有效装载可以包括小化学分子、肽或者蛋白质、多糖或者核酸或者纳米颗粒。小化学品分子可以小于1000道尔顿，肽的分子量大约为5000道尔顿，siRNA具有的分子量大约为15,000道尔顿、抗体的分子量大约为150,000道尔顿，并且DNA具有的分子量大于或等于5,000,000道尔顿。
根据实施例方法，所述有效装载包括3.0-150.0微摩的被传递分子，更优选的，6.6-150.0微摩的被传递分子(例如3.0、3.3、6.6，或者150.0微摩的被传递分子)。在一些实施方案中，待传递的有效装载具有的平均分子量高达15,000道尔顿，并且所述有效装载包括3.3微摩待传递的分子。
根据实施例方法，所述被传递的有效装载的平均分子量高达15,000道尔顿，并且所述有效装载包括6.6微摩待传递的分子。在一些实施方案中，所述被传递的有效装载的平均分子量高达1,000道尔顿，并且所述被传递的有效装载包括150.0微摩。
在本发明主题内容的方面，被提供的待传递的有效装载具有的平均分子量高达15,000道尔顿。有效装载可以包括在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mM乙酸铵；和6.6微摩待传递分子。
根据实施例方法，被传递的有效装载具有的平均分子量高达15,000道尔顿。有效装载可以包括在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4的水溶液；并且包括20％(v/v)的甲醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mM乙酸铵；和6.6微摩待传递分子。
在一些实施方案中，被传递的分子具有的平均分子量高达15,000道尔顿。有效装载可以包括在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的甲醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mM乙酸铵；和6.6微摩待传递分子。
根据实施例方法，被传递的有效装载具有的平均分子量高达1,000道尔顿。有效装载可以包括在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mM乙酸铵；和150微摩待传递分子。
在一些实施方案中，被传递的分子具有的平均分子量高达1,000道尔顿。根据实施例方法，有效装载可以包括在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的乙醇；34mM NaCl，0.7mM KCl、2.5mM蔗糖；5mM4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；34mM乙酸铵；和150.0微摩待传递分子。
在一些实施例中，被传递的有效装载具有的平均分子量高达1,000道尔顿。根据实施例方法，所述有效装载可以包括在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4的水溶液；并且包括2％(v/v)的丁醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mM乙酸铵；和150微摩待传递分子。
根据本主题内容的进一步方面，这里提供了用于传递超过一个分子量的分子穿过质膜的方法；所述方法包括以下步骤：向水溶液中引入超过一个分子量的分子；和将水溶液与质膜相接触。
在一些实施方案中，所述方法包括向有效装载中引入具有第一分子量的第一分子和具有第二分子量的第二分子，其中所述第一分子和第二分子可以具有不同的分子量，或者其中，所述第一分子和第二分子具有相同的分子量。根据实施例方法，第一分子和第二分子可以是不同的分子。
在一些实施方案中，待传递的有效装载可以包括治疗剂、或者诊断剂，包括，例如顺式铂氨、阿斯匹林、各种斯达汀(例如，匹伐他汀、阿伐他汀、洛弗斯特丁、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀、丙嗪盐酸、氯丙嗪盐酸、甲硫哒嗪盐酸、硫酸多粘菌素B、二氯羟喹、苯氟雷司盐酸和苯基偶氮吡啶二胺盐酸)，和氟苯氧丙胺。其他治疗剂包括抗菌剂(氨基环苷类(例如庆大霉素、新霉素、链霉素)、青霉素(例如、羟氨苄青霉素、氨苄青霉素)、糖肽(例如、阿佛帕星、万古霉素)、大环内酯(例如、红霉素、替米考星、泰乐菌素)、喹诺酮(例如、沙氟沙星、enrofloxin)、链阳性菌素(例如、维吉尼霉素、喹奴普丁-dalfoprisitin)、碳青霉烯类、脂肽、恶唑烷酮类、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、isoniazrid、对氨基水杨酸，和吡嗪酰胺)。在一些实施例中，包括抗病毒剂(例如、阿巴卡韦、阿昔洛维、恩夫韦地、恩替卡韦、那非那韦、奈韦拉平、Nexavir、奥司他韦、雷特格韦、利托那韦、司他夫定和万乃洛韦)。所述治疗剂可以包括基于蛋白质的治疗剂，用于治疗各种的疾病，例如，癌症，传染性的疾病，血友病，贫血，多发性硬化，并且乙型肝炎或者丙型肝炎。
其他示范性的有效装载还可以包括可检测的标记物或者标记，例如次甲基蓝、专利蓝和靛氰绿。
这里所描述的方法还可以包括有效装载，所述有效装载包括可检测的部分或者可检测的纳米颗粒(例如，量子点)。所述可检测部分可以包括一种荧光分子或者一种放射性试剂(例如，125I).当所述荧光分子暴露于具有固定波长的光时，可以通过荧光检测其是否存在。其中，最常用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、玫瑰精、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、p-苯二甲醛和荧光胺。所述分子还可以被能够发出荧光的金属标记，例如152Eu，或者其他镧系标记。这些金属通过使用金属鳌合基团，例如，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)与所述分子相附着。所述分子还可以通过与一种化学发光化合物耦合来标记。然后通过在化学反应过程中检测是否出现发光作用来确定是否存在化学发光-标记的分子。尤其有效的化学发光标记化合物是鲁注入诺、异氨基苯二酰肼、恒温吖啶酯、咪唑、吖啶酯盐和草酸酯。
在一个方面，本发明的主题内容包括附着于固体载体的细胞，例如条、聚合物、小珠或者纳米颗粒。所述支持物或者脚手架可以是多孔的或者无孔的固体支持物。已知的支持物或者载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然的和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。为了实现本主题内容的目的，载体的性质可以是在某种程度上可溶解的或者不可溶解的。所述支持物材料事实上可以是任何可能的结构构造。因此，所述支持物结构可以是球形的，例如小珠；或者是圆柱形的，例如试管的内表面，或者是竿的外表面。做为选择，所述表面可能是平面，比如试验片条、等等。优选的支持物包括聚苯乙烯磁珠。
在其他方面，所述固体支持物包括聚合物，细胞化学结合、固定在此聚合物上，或者分散在其中，或者与其相关联。聚合物支持物可以是聚合物网络，并且可以以小珠的形式被制备(例如，通过悬浮聚合作用)。在此脚手架上的细胞可以用包含本发明水溶液的有效装载喷雾，从而将理想的化合物传递到所述脚手架的细胞质上。示范性的脚手架包括斯坦及其他可移植性医疗器械或者结构。
本发明主题内容进一步涉及用于传递有效装载通过质膜的仪器、系统、技术和物品。本发明主题内容还涉及用于传递有效装载(例如，蛋白质或者蛋白质复合物)穿过质膜的仪器。目前的主题内容可以发现细胞内传递方面的应用，并且已经用于，例如，将分子、生物学和药理学治疗剂传递的到目标区域，例如，细胞、组织或者器官中。
在一些实施方案中，用于传递有效装载穿过质膜的仪器可以包括喷雾器，所述喷雾器具有至少一个喷雾发射装置和相对于喷雾器固定的支持物。本发明方法进一步包括在将有效装载与质膜相接触之前使有效装载雾化的步骤。
所述喷雾器选自机械喷雾器、超声波雾化器、电喷雾、喷雾器和文杜里管。所述喷雾器可以是市场上可买到的喷雾器。所述喷雾器可以是经鼻粘膜的喷雾器。所述喷雾器可以是经鼻粘膜的喷雾器，可以从美国北开罗莱纳州LMA Teleflex公司市场上购买得到。所述喷雾器可以是经鼻粘膜的喷雾器，可以从美国北开罗莱纳州LMA Teleflex公司以MAD300的产品样本号在市场上购买得到。
在使有效装载和质膜接触之前，所述喷雾器可以用于提供直径为30-100微米的颗粒的胶体悬浮液。所述喷雾器可以用于提供直径为30-80微米的颗粒的胶体悬浮液。所述喷雾器可以用于提供直径为50-80微米的颗粒的胶体悬浮液。
所述喷雾器可以包括气体存储层。所述喷雾器可以包括气体存储层，在一定压力下维持气体。所述气体可以选自空气、二氧化碳和氦气。所述气体存储器包括固定的压力发生器。所述气体存储器可以处于流体通道中，具有喷雾发射器。气体存储器可以包括气体导管，气体导管可以与喷雾发射器一起处于流体通道中。所述气体导管用于允许气体从其中穿过。所述气体导管包括凹型体。所述气体导管可以是具有尾部开口的凹形体。所述气体导管可以包括具有第一和第二尾部开口的凹形体。所述气体导管可以是具有第一和第二相对的尾部开口的凹形体。第一开口端和第二开口端的直径可以不同。第一开口端和第二开口端的直径可以不同。第一开口端的直径可以大于第二开口端的直径。第一开口端处于流体通道中并且具有气体存储器。所述第二开口端可以处于流体通道中，具有喷雾发射器。
所述仪器可以包括一种样品存储器。所述样品存储器可以处于流体通道中，具有喷雾器。所述样品存储器可以处于流体通道中，具有喷雾发射器。所述气体存储器和样品存储器都可以处于流体通道中，并具有喷雾发射器。
所述仪器在样品存储器和其他存储器之间可以包括取样阀。所述仪器在样品存储器和气体导管之间可以包括取样阀。所述取样阀适用于调整来自样品存储器中的样品流。取样阀可以允许持续的或者半持续的样品流动。取样阀可以允许持续的或者半持续的样品流动。取样阀可以允许一定量的样品持续的或者半持续的样品流动。取样阀可以允许0.5-100微升的样品持续的或者半持续的样品流动。取样阀可以允许10微升的样品持续的或者半持续的样品流动。取样器可以允许1微升的样品在0.065-0,085平方厘米范围内半连续的样品流动。
所述喷雾器和支持物可以在空间上相互间隔的。所述支持物包括固体支持物。所述支持物可以包括含有样品孔的平皿。所述支持物可以包括含有1、6、9、12、24、48、384和1536个孔的平皿。所述支持物可以由惰性材料组成。所述载体可以由塑料、金属或者金属合金、或其结合组成。所述支持物包括发热元件。所述支持物包括电阻元件。所述支持物可以被互易的安装在一起上。所述支持物可以相对于所述仪器是可活动的。所述支持物可以相对于所述喷雾器是可活动的。所述支持物可以相对于所述喷雾器发射器是可活动的。所述支持物可以包括支持物制动器，从而使支持物相对于喷雾器移动。所述支持物可以包括支持物制动器，从而使支持物相对于喷雾发射器移动。所述支持物可以包括支持物制动器，从而使支持物相对于喷雾发射器的纵轴移动。所述支持物可以包括支持物制动器，从而使支持物向喷雾发射器的纵轴横向移动。
喷雾区的纵轴可以与支持物的纵轴或者中心点同轴，和/或与支持物的圆孔同轴，所述有效装载被传递至此。喷雾发射器的纵轴可以与支持物的纵轴或者中心点同轴，和/或与支持物的圆孔同轴，他有效装载被传递至此。喷雾发射器的纵轴、支持物的纵轴和喷雾区域的纵轴可以是两两同轴的。喷雾器的纵向长度可以大于(可以大2倍以上)喷雾区的环形部分直径(例如，待传递的有效装载所对应的的细胞面积)。
所述仪器在样品存储器和喷雾器之间可以包括取样阀。所述取样阀可以是电磁操控的阀。所述阀可以是电磁阀。所述阀可以是气动阀。所述阀可以位于气体导管。所述阀可以适用于调整气体导管内的气体流动。所述阀可以允许持续的或者半持续的气流。所述阀可以允许持续的或者半持续的气流。所述阀可以允许一定时段的样品持续的或者半持续的气流。所述阀可以在第二间隔时间内允许半持续的气流。所述仪器可以包括至少一个过滤器。所述过滤器的孔直径小于10微米。所述过滤器的孔直径为10微米。所述过滤器可以位于气体导管中。所述过滤器可以处于具有气体导管的流体通道中。
所述仪器可以包括至少一个调节器。所述调节器可以是电调节器。所述调节器可以是机械调节器。T所述调节器可以位于气体导管中。T所述调节器可以处于具有气体导管的流体通道中。所述调节器可以是调节阀。气体导管内部的压力可以是1.0-2.0bar。气体导管内部的压力可以是1.5bar。气体导管内部的压力可以是1.0-2.0bar，并且喷雾器和支持物之间的距离小于或者等于31mm。气体导管内部的压力可以是1.5bar，并且喷雾器和支持物之间的距离可以是31mm。气体导管内部的压力可以是0.05bar每毫米喷雾器和支持物之间的距离。调节阀可以将气体导管内部的压力调整到1.0-2.0bar。调节阀可以将气体导管内部的压力调整到1.5bar。调节阀可以将气体导管内部的压力保持在1.0-2.0bar。调节阀可以将气体导管内部的压力保持在1.5bar。
所述仪器可以包括两个调节器。所述仪器可以包括第一和第二调节器。T所述第一和第二调节器可以位于气体导管中。所述第一和第二调节器可以处于具有气体导管的流体通道中。第一调节器可以位于气体存储器和过滤器之间。第一调节器可以将气体导管内气体存储器的压力调整到2.0bar。第一个调节器可以适合于将气体导管内的压力维持在2.0bar。第二调节器可以位于气体存储器和阀之间。
喷雾发射器可以用于通过圆锥形的喷雾区(例如，通常是环圆锥形的喷雾区)。所述喷雾发射器可以用于提供30度的圆锥喷雾区。所述仪器进一步包括微处理器，来控制仪器的任意部分或者全部部分。所述微处理器可以被安排控制任何或者全部的取样阀，所述支持物致动器，阀，和调节器。所述仪器可以包括具有至少一个喷雾发射器的喷雾器；和相对于喷雾器固定的支持物；所述喷雾器选自机械喷雾器、超声波喷雾器、电喷雾、喷雾和文杜里管。所述喷雾器可以用于提供直径为30-100微米的颗粒的胶体悬浮液。所述仪器可以包括样品存储器和气体导管，以及在样品存储器和气体导管之间可以包括取样阀。取样阀可以允许10-100微升的样品半持续的样品流动。所述喷雾器和所述支持器可以是空间上相互分离的并且据此定义出一个圆锥喷雾区；和，所述喷雾器和所述支持器之间的距离可以是需要将分子传递进入的细胞面积环形区直径的大约2倍；所述喷雾器和所述支持器之间的距离可以是31mm，并且需要将分子传递进入的细胞面积环形区直径可以是15.5mm。所述仪器可以包括气体导管和气体导管内部的压力是1.0-2.0bar。所述仪器包括至少一个过滤器，所述过滤器的孔直径小于10微米。
结合下面的附图和说明书描述了具有这里所公开的主题内容及其变体的一种或者一种以上实施方案的细节。从说明书和附图中，以及从权利要求书中，具有这里公开的主题内容的其他特征、目的和优势变得显而易见。
附图说明
参照以下附图，本主题内容非限制性的实施方案被进行了描述。
图1是适用于实施本发明方法的仪器的示意图。
图2是适用于实施本发明方法的仪器的透视图。
图3是过程流程图，解释了产生用于将样品传递到一种或者一种以上靶细胞细胞质中的胶体滴的方法。
图4是一种图表，显示了根据本发明将平均分子量高达15000道尔顿的分子传递穿过质膜的作用。
图5是一种图表，显示了根据本发明将平均分子量高达1,000道尔顿的分子传递穿过质膜的作用。
图6A是显微照片，显示了平均分子量为668道尔顿的分子的传递。
图6B是显微照片，显示了平均分子量为40,000道尔顿的分子的传递。
图6C是显微照片，显示了图6A和图6B的重叠，说明平均分子量分别为668道尔顿(图6A)和40000道尔顿(图6B)的分子的传递。
图7是一种图表，显示了根据本发明将平均分子量高达500,000道尔顿的分子传递穿过质膜的作用。
图8是一种图表，显示了根据本发明将细胞与一种第二组合物接触的作用，所述第二组合物包括68mM的NaCl，1.4mM的KCl，5mM的Na2HPO4和0.9mM KH2PO4。
图9是显微照片，显示了使用本发明主题内容的方法传递变化分子量的分子。
图10是一种图表，显示了将平均分子量高达15000道尔顿的分子传递的溶质含量作用。
图11是一种图表，显示了将平均分子量高达15000道尔顿的分子传递的酒精浓度作用。
图12是一种图表，显示了将平均分子量高达15000道尔顿的分子传递的酒精浓度作用。
图13是一种图表，显示了将平均分子量高达15000道尔顿的分子传递的含盐浓度作用。
图14是一种图表，显示了将平均分子量高达1,000道尔顿的分子传递的酒精浓度作用。
图15是一种图表，显示了将平均分子量高达1,000道尔顿的分子传递的酒精浓度作用。
图16是一种图表，显示了酒精浓度对传递平均分子量高达1,000道尔顿的分子的作用。
图17是显微照片，显示了有效装载在200微升传递液中向24孔板中A549细胞的微量吸液管-调节的传递，通过荧光显微镜检查法成像。在整个细胞群中都可以观察到碘化丙啶(PI)吸收，但是没有观察到siRNA-FITC或者10kDa右旋糖苷Alexa488的吸收。所有的显微照片都以10倍放大显示。
图18是显微照片，显示了有效装载在20微升传递液中向24孔板中A549细胞的微量吸液管-调节的传递，通过荧光显微镜检查法成像。在一些孔中观察到了PI吸收，但是在其他孔中没有观察到。所有的显微照片都以10倍放大显示。
图19是图表，显示了有效装载在200微升或20微升传递液中向24孔板中A549细胞的微量吸液管-调节的传递。通过流式细胞仪(5％m bar)来检测吸收效率，通过与溶解细胞阳性参照物比较乳酸脱氢酶(LDH)释放来测定毒性。当有效装载以200微升被传递的，通过流式细胞计检测到吸收但是毒性水平高(40-50％)。当有效装载在20微升中传递时，毒性有所减少但是吸收同样被减少并且不一致(n＝3)。MP＝微量吸液管；PI＝碘化丙啶；Dex＝10KDa葡聚糖-Alexa488；SBO＝喷雾缓冲液。
图20是显示测试仪的图像。测试仪的构造能够实现喷雾调节的传递液向细胞的传递。所述测试仪包括空气压缩机，所述空气压缩机向喷头传递压缩空气，所述喷头安装在铁架上。培养皿放置在喷头的下方。
图21是一显微照片，显示了10KDa的右旋糖苷-Alexa488通过本主题内容示例性的实施方式向A549细胞的传递。使用本主题内容的方法，10KDa右旋糖苷-Alexa488可以成功的传递个A549。吸收被证明穿过单细胞层。显示照片按10倍放大倍数显示。
图22是图表，显示了本发明传递方法的效率和毒性。在A549细胞中实现大于50％的10-KDa右旋糖苷-Alexa488传递的效率水平。毒性水平与未处理的参照物类似。当包含有效装载的传递溶液进入培养基时，还可以检测到一些阳性细胞(n＝3)。
图23是显微照片，显示了在A549细胞在渗透的时间过程。在不存在有效装载的情况下，喷雾传递液，随后在喷雾60分钟之后的时间点向培养基中加入PI，检测被渗透的细胞。尽管PI吸收在喷雾后五分钟开始明显，在喷雾30分钟和60分钟后，PI-阳性细胞的数目基本上开始减少。显示照片按10倍放大倍数显示。
图24是图表，显示了喷头和细胞之间的距离在传递效率和细胞毒性方面的作用。10-kDa右旋糖苷-Alexa488被传递给A549细胞。改变喷头和细胞之间的距离(包括21毫米、31毫米和41毫米)。31毫米的距离对于效率和毒性都是最佳的(n＝3)。
图25是图表，显示了喷雾压力对传递效率和细胞毒性的作用。10-kDa右旋糖苷-Alexa488被传递给A549细胞。,并且所述喷雾压力是改变(包括0.5bar，1.5bar和2.5bar)。1.5bar的压力对于传递效率和毒性都是最佳的(n＝3)。
图26是图表，显示了传递溶液的体积对传递效率和细胞毒性的作用。10-kDa右旋糖苷-Alexa488以80-90％的交会度在48孔班中被传递给A549细胞，并且，传递溶液的体积是变化的(包括，5微升、10微升和20微升)。10微升的体积对于传递效率和毒性都是最佳的(n＝3)。
图27是图表，显示了传递溶液的体积对传递效率和细胞毒性的作用。10-kDa右旋糖苷-Alexa488以80-90％的交会度在48孔板中被传递给CHO细胞，并且，传递溶液的体积是变化的(包括，5微升、10微升和20微升)。10微升的体积对于传递效率和毒性都是最佳的(n＝3)。
图28是图表，显示了乙醇浓度对传递效率和细胞毒性的作用。10-kDa右旋糖苷-Alexa488被传递给A549细胞，并且传递溶液中的乙醇浓度是变化的。25％的浓度对于效率和毒性都是最佳的(n＝3)。
图29是显微照片，显示了右旋糖苷各种分子尺寸的传递，包括非常高分子量的右旋糖苷(2000kDa)，可以被本主题方案所述的方法传递。所述显微照片显示10倍放大。
图30是显微照片，显示了各种分子尺寸的传递，包括全长抗体，可以被本主题方案所述的方法传递。所述显微照片显示10倍放大。
图31是显微照片，显示了4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Mitotracker RedCMXRos和毒伞素-Alexa488向A549细胞共传递的作用。
图32是显微照片，显示了10kDa右旋糖苷-Alexa488和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)向A549细胞共传递的作用。所述显微照片显示10倍放大。
图33是显微照片，显示了被喷雾转染入A549细胞的绿色荧光蛋白质(GFP)mRNA的传递效果。通过荧光显微术观察绿色荧光蛋白质(GFP)蛋白质表达。所述显微照片显示10倍放大。
图34是条形图，显示了当荧光素酶mRNA使用本主题内容示范性的方法被传递到A549细胞中时荧光素酶表达的定量分析(通过发光测试)。
图35是显微照片，显示了被喷雾转染入A549细胞的pGFP质粒DNA的传递效果。所述表达的绿色荧光蛋白质(GFP)蛋白质通过荧光显微照相观察。所述显微照片显示10倍放大。
图36是条形图，显示了当pGluc质粒DNA使用本主题内容示范性的方法被传递到A549细胞中时，荧光素酶表达的定量分析(通过发光测试)。
图37是显微照片，显示了当10-kDa右旋糖苷-Alexa488被送到主要的成纤维细胞是的效果。通过荧光显微术，右旋糖苷在成纤维细胞中是可见的。所述显微照片显示10倍放大。
图38是条形图，显示了被传递进入主要成纤维细胞的10kDa右旋糖苷-Alexa488的传递效率和毒性，分别如流式细胞仪和LDH试验定量。
图39是显微照片，显示了当10-kDa右旋糖苷-Alexa488被送到间充质干细胞(MSC)的效果。通过荧光显微术右旋糖苷在间充质干细胞(MSCs)中是可见的，在10x放大时。
图40是条形图，显示了被传递进入间充质干细胞(MSCs)的10kDa右旋糖苷-Alexa488的传递效率和毒性，分别如流式细胞仪和LDH试验定量。
图41A是显微照片，显示了siRNA(上栏)、BSA(中间)和OVA(下栏)进入U226人多发性骨髓瘤细胞的传递效果。
图41B是显微照片，显示了4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(上栏)和MItotracker红(中栏)向Jurkat细胞中的传递效果。另外，对于绿色荧光蛋白质(GFP)的mRNA被传递给Jurkat细胞，并且在传递后24小时观察绿色荧光蛋白质(GFP)的表达。
图42是显微照片，显示了siRNA(上栏)、BSA(中间)和OVA(下栏)进入U226人多发性骨髓瘤细胞的传递效率和细胞毒性效果，分别通过流式细胞仪和LDH试验定量。
图43是显微照片，显示蛋白质传递进入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的作用。使用FITC标记各种蛋白质，并且传递进入CHO细胞，所述蛋白质包括β-乳球蛋白在内，辣根过氧化酶(HRP)，卵清蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，过氧化氢酶，和去铁铁蛋白。
图44是图表，显示了各种各样的蛋白质通过本主题内容的示范性方法传递入CHO细胞的传递效率，所述效率是通过流式细胞仪来定量的。
图45是显微照片，显示了被传递入CHO细胞的卵清蛋白-FITC的萤光免疫检验。通过萤光免疫检验法，使用抗卵白蛋白抗体确认卵清蛋白-FITC向CHO细胞中的传递。
图46是图表，显示了传递β-乳球蛋白进入CHO细胞的剂量反应。通过本主题内容向CHO中传递的β-乳球蛋白-FITC浓度越高，可以观察到传递的效率越高(n＝3)。
图47是显微照片，显示了被传递入细胞的HRP活性和定位。使用Alexa488-标记的酪胺底物来说明，在使用本主题内容所描述的HRP传递之后，HRP在CHO细胞中的活性和定位。
图48是条形图，显示了随着被传递进入CHO细胞的HRP的剂量越高，荧光DCF产物的产量越高。
图49是条形图，显示了LDH分析，说明实验对细胞没有毒性。
图50是显微照片，显示了用Q-点标记进行追踪研究的间充质干细胞(MSC)。体外传递携带有Q-点625的主要间充质干细胞(MSCs)。
图51是显微照片，显示了用Q-点标记进行追踪研究的间充质干细胞(MSC)。将间充质干细胞(MSCs)体外注射入小鼠脾中。使用所述cryovis测试仪进行Q点荧光分析。
图52是表，显示了根据本主题内容示例性的实施方案，每个细胞被传递的大约的体积。
图53是表，显示了每平方微米暴露细胞表面积传递的大约体积。
图54是表，显示了一些细胞类型近似平均性质。
图55是表，显示了实验计算和测定的三种不同细胞系(A549，CHO和MCSs)的面积。
图56A是剖面图，显示了使用移液管加入一定体积的水溶液的孔。
图56B是剖面图，显示了通过喷药技术加入一定体积的水溶液的孔。
在各个附图中使用的相同的参考符号指相同的元素。
具体实施方式
本主题内容提供了一种不使用载体(例如，不使用病毒载体)将有效装载穿过质膜的传递。特别是，已经发现，可以通过将细胞(和/或细胞群)与包括醇类和传递材料(例如，有效装载)的水溶液相接触来实现材料向细胞内的传递。所述醇类发挥作用来渗透膜，允许有效装载移动穿过所述膜。但是，当与细胞接触的水溶液体积过大和/或每次接触时间过长，则可能严重的(例如，不可逆的)破坏细胞。相反，如果与细胞接触的水溶液的量太小和/或每次接触时间过短，则不能完成材料的细胞内传递。因此，为了实现有效装载穿过质膜的传递并维持细胞活力，应当使用适当量的水溶液和/或控制接触时间。
根据预计的应用，与细胞群接触的水溶液的适当的量可以是变化的，例如，根据(例如，是以下因素的函数)细胞群中的细胞数目、暴露的细胞表面积、细胞尺寸、水溶液的组成、有效装载、向水溶液与细胞群相接触的技术，等等。在一些实施方案中，水溶液的体积为每细胞6.0x10-7和7.4x 10-4微升(本申请其他部分表述了其他的范围)。该范围相当于向具有基本上单层排列的细胞群(所述细胞分别具有30微米和15微米的平均直径)的48孔平皿的小孔中传递0.5微升和100微升的水溶液。水溶液的体积可以是每平方微米细胞群暴露表面积2.6x10-9和1.1x 10-6微升水溶液(本申请其他地方描述了其他范围)。该范围相当于向具有基本上单层排列的细胞群的24孔平皿和48孔平皿中的小孔中传递0.5微升和100微升的水溶液。
将细胞群与水溶液相接触的技术是可以改变的。例如，所述水溶液也可以被移液管移到细胞群上(例如，当细胞排列在小孔中时).
例如，图56A是剖面图，显示了使用微量吸液管加入一定体积的水溶液的单细胞层。当水溶液以这种方式被应用时,水溶液可能在小孔的面积中不平均的分布,并且,结果,位于或者接近小孔中心位置(5605所显示的区域)的细胞被杀死,而位于小孔边缘位置(5615显示的区域)的细胞还存活但是没有显示出更新的有效装载.在5610区域内的细胞,在内部和外部区域(分别5605和5615之间)还处于存活状态,并有效的、可靠的显示出有效装载的吸收。
在一些实施方案中，水溶液被喷雾在细胞群上。例如，图56B是剖面图，显示了通过喷药技术加入一定体积的水溶液的孔。所述喷雾均匀的将水溶液分布在小孔的区域内(5620所示区域)。用这种方式(以及这里描述的其他方式)处理的细胞处于存活状态,并有效的、可靠的显示出有效装载穿过细胞膜进入细胞的细胞质的吸收。所述喷雾可以提供细胞群与水溶液以一种可控的方式均匀接触，并且显示出改善的有效装载的传递效率和改善的细胞活力。所述喷雾可以被控制产生尺寸变化的离散单元(例如，液滴)。例如，在一个实施方案中，所述离散单元的体积范围是直径为30-100微米。也可以使用其他尺寸并且其他部分描述了一些变化方式。
细胞群与水溶液(包含有效装载)相接触的时间可以是短暂的。换句话说，将细胞群与水溶液相接触的持续时间是可以改变的。例如，接触的持续时间可以是最少6秒、12秒、30秒等等。也可以使用其他持续时间并且其他部分描述了一些变化方式。由于细胞与水溶液接触时间过长会导致细胞活力的下降，在于所述水溶液接触后，细胞群可以用缓冲液或者培养基冲洗。所述缓冲液可以包括或者不包括有效装载。所述缓冲液可不含有醇类所述细胞可以用缓冲液或者培养基洗涤，来浸没或者悬浮所述细胞群。在一些实施方案中，可以用气体吹细胞使水溶液脱离与细胞的接触，虽然细胞与气体的过度接触会使细胞干燥导致细胞活力的下降。
所述水溶液可以包括水、醇类和有效装载。所述醇类可以包括甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或者苯甲醇。所述水溶液还可以包括一个或多个糖，盐和缓冲剂。所述盐选自NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4。所述糖可以包括二糖(例如，蔗糖)。所述缓冲剂可以包括弱酸或者弱碱和两性离子(例如，(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸(hepes))。所述水溶液还可以包括乙酸铵。例如，所述水溶液是低渗的缓冲液，例如，Medepalli等的描述(Medepalli,K.,etal.,Nanotechnology 2013；24:20,，通过引证在此全部并入本文),130mM蔗糖，50mM氯化钾，50mM乙酸钾，20mM4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸(hepes)，每小时7.4。在一些实施例中，所述缓冲液被修饰，用乙酸铵替换乙酸钾。在一些实施例中，用来传递有效装载的缓冲液不包括皂角苷。
水溶液的组分可以用于使细胞的质膜发生断裂并允许大生物分子进入穿过质膜。例如，在质膜内，醇溶解脂质，去污剂在质膜内产生孔，酶消化蛋白质在质膜内产生孔。
有效装载可以被送到细胞的细胞质，以及特定的细胞器(例如，细胞核和线粒体)。所述有效装载可以包括任何适合于或者用于传递的分子。靶向线粒体的分子在许多疾病(例如，癌症)中是有益的，并且传递这种分子可以与线粒体的功能相关，包括产生能量和细胞凋亡。例如，荧光标记的(例如，标记的)分子可以被用于穿插线粒体组分是否存在及其存在位置，能够靶向线粒体渗透性变化(MPT)的分子(例如，能够消耗渗透性变化孔复合物(PTPC)开口的化学抑制剂或者肽)、能够引起线粒体渗透性变化(MPT)的小化学分子、能够调节腺嘌呤核苷酸转位酶(ANT)的配位体、能够诱导反应性氧类(ROS)过量生产的化合物、能够逆转癌细胞超糖解状态的分子、能够诱导癌细胞到细胞死亡的分子，等等。
所述有效装载可以包括，但是不局限于小化学品分子、肽、多肽、核酸分子抗体和DNA(例如质粒DNA)。示范性的小化学品分子包括尺寸高达2,000,000道尔顿的右旋糖苷，包括3kDa右旋糖苷、40kDa右旋糖苷、70kDa右旋糖苷，或者500kDa右旋糖苷、碘化丙啶、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI))、毒肽、mitotracker红或者其任何结合(例如，MitoTracker Red可以与毒肽共同传递，例如10kDa右旋糖苷-Alexa488和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI))、氨甲蝶呤。示范性的肽、多肽，和蛋白质或者其片段包括尺寸高达500kDa的蛋白质、包括β乳球蛋白、辣根过氧化酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白、过氧化氢酶和去铁铁蛋白)。示范性的肽可以包括艾卡拉肽、利拉鲁肽和艾替班特。示范性的核酸可以涉及多聚核苷酸，比如脱氧核糖核酸(DNA)，以及适当的核糖核酸(RNA)。所述术语还包括等量的、类似的来自核苷酸类似物的DNA或者RNA，并可用于本主题内容，可以是单链(正义或者反义)或者双链多聚核苷酸。进一步地，核酸实施例可以包括，siRNA分子(例如、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)siRNA-FITC)、亲环蛋白B siRNA，或者核纤层蛋白siRNA分子)、双链的核酸分子，例如双链的RNA分子、单链核酸分子，或者分离的核酸分子)。本主题内容示例性的DNA有效装载包括大于或等于5,000,000Da的DNA样品(例如，pGFP、pGLuc、和pBATEM)。本主题内容示范性的抗体可以包括抗肌动蛋白抗体，抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体，抗-Src(原致癌基因酪氨酸蛋白激酶Src)抗体，抗-Myc抗体或者抗-Raf抗体。本发明的抗体可以是多克隆的抗血清或者单克隆抗体。本主题内容不但包括一种完整的单克隆抗体，而且包括一种免疫活性抗体片段，例如Fab或者(Fab)2片段；一种工程设计的单链FV分子；或者嵌合分子，例如，一种既包括一个抗体结合特异性(例如，鼠起源的抗体)又包括另外一个抗体(例如，人起源的抗体)剩余部分的抗体。所述抗体可能是人源化的抗体，其中所述抗体来自于非人类物种，其蛋白质序列已经修饰以增加他们的与人类天然产生的抗体变体的类似性。通常，人源化的抗体中具有一个或者一个以上非人来源被引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基在这里叫做“引入”残基，其通常来自“引入”抗体结构域，尤其是可变域。
所述细胞群可以包括粘附细胞，粘附细胞生长在培养板的生长表面形成交会(例如，75％交会)单层。粘附细胞可以涉及细胞，细胞系，和细胞系统，不论原核的还是真核的。可以生长成粘附细胞的实施例可以是肝细胞或者肝衍生细胞(例如，主要肝细胞和肝上皮细胞)，上皮细胞，内皮细胞，神经元的细胞，间充质细胞，胰腺细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，癌衍生细胞，骨髓细胞，郎格罕氏细胞，肾上腺髓质细胞，成骨细胞，破骨细胞，胸腺体依赖淋巴细胞，神经元，胶质细胞，神经节细胞，视网膜细胞，肺细胞(例如，A549细胞)，成纤维细胞，人脐静脉细胞(HUVEC)，成纤维细胞，卵巢细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞)，胚肾细胞(例如，人胚肾细胞)，和成肌细胞。还可以使用干细胞(例如，主要的间充质干细胞，神经元干细胞，诱导性多功能干细胞，造血干细胞，小鼠胚胎干细胞，和人胚胎干细胞)。
所述细胞群还可以包括非粘附(例如，悬浮)细胞。示范性的非粘附细胞可以包括干细胞(例如，造血干细胞)、祖细胞(例如造血的祖细胞)、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的致死(CIK)细胞、人脐带血CD34+细胞、B细胞、和Jurkat细胞。
这里所描述的细胞群以及根据其尺寸(例如，小、中、大)、根据其计算的直径进行描述，如通过美国典型菌种保藏中心(ATCC)、Celeromics技术及其他分子生物学参考书目所确定的。如这里所述，以一种非限制性方式，在一些实施例中，小细胞的直径为10微米(例如，脾细胞或者小神经元)、中型细胞的直径在10微米到20微米(例如，A549细胞、CHO细胞或者MCF7细胞)，大细胞直径大于20微米(例如，K562细胞和间充质干细胞(MSCs))。通常，所述种类(范围)不起到限制作用，并且实验条件可以影响所述测量细胞的直径。
在一些实施方案中，所述细胞群位于三维脚手架上，该脚手架可以被喷雾(或者有效装载可以使用其他技术传递到细胞中)。所述三维脚手架被体内或者体外使用。可以预计，本主题内容的其他方面可以体外或者体内应用。
作为接触表面积和细胞数的函数确定体积
如这里充分描述的，通过喷药技术将10微升水溶液与细胞群相接触将有效装载有效传递入48孔板小孔中的A549细胞中并在大约2分钟之后与缓冲溶液一起培养。然而，通过将0.5微升到100微升的水溶液与48孔板中不同种类的细胞相接触实现传递，例如，使细胞群接触0.5微升、5微升、10微升、15微升或者100微升的水溶液。但是传递不局限于在48(或者24)孔板的小孔中进行，反而与细胞群接触的水溶液的体积可以是接触细胞表面积和/或细胞群数目的函数。例如，为了确定传递到每个细胞中水溶液的体积，下面描述了一种非限制性示例性方法，用于计算每细胞传递的体积和每微米接触细胞表面积传递的体积。
示范性的粘附细胞的平均直径大约10-30微米。例如，A549细胞的平均直径为15微米(相当于0.015厘米)。因此，A549细胞的平均面积是大约1.8x10-6平方厘米。标准48孔细胞培养皿中单个孔面积包括0.95平方厘米的生长区。因此，细胞数目(例如，A549细胞的直径为15微米)大约是500,000-500,500个细胞(例如，537,691个细胞)，假定100％交会。举例来说，每孔传递10微升的水溶液，因此，大约1.9x10-5微升的水溶液被传递个每个细胞(例如，A549细胞)。因此、大约每细胞1.9x10-5微升水溶液接触所述细胞群。使用水体积(例如；0.5微升、5微升、10微升、15微升和100微升)和各个细胞尺寸(例如，大约30微升间充质干细胞(MSCs)、大约15微升A549细胞和大约10微升U266细胞)确定每细胞传递的水溶液体积范围。这些和其他示例性的值显示在图52和图53中。
作为细胞接触表面积函数的传递体积示范性的计算方法，使用细胞培养皿的生长区。所述24孔板单个孔的表面积是19000平方微米(在48孔板中是9500平方微米，在96孔板中是3200平方微米)。使用水相体积，包括0.5微升、5微升、10微升、15微升和100微升确定每孔中传递的水体积范围。因此，在24孔板中，每平方微米中传递的水溶液体积(例如，每孔10微升)包括5.3x10-4微升每孔、在48孔板中为1.1x10-3微升每孔，在96孔板中为3.1x10-3微升每孔。这些和其他示例性的值显示在图52中。图53是其他表，显示了一些实施例细胞的性质。
水溶液和传递
所述水溶液(在这里还叫做组合物)包括醇类，所述醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇和苯甲醇。所述组合物可以包括不超过50％(v/v)的醇类。在某些实施方案中，所述醇类是乙醇，并且所述组合物包括5％，10％，20％，25％，30％，或者40％(钒/钒)的所述乙醇。做为选择，所述醇类是甲醇，并且所述组合物包括5％，10％，20％，25％，30％，或者40％(钒/钒)的所述甲醇。进一步地，所述醇类是丁醇并且所述组合物可以包括2、4或者8％(v/v)的丁醇。在优选的实施方案中，所述组合物是包括所述醇类的水溶液。所述组合物优选是低渗的，在室温下及pH值大约为7.4时，其渗透浓度为171毫克渗透压/升，并且包括至少一个盐，选自NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4。在优选的实施方案中，所述盐类是KCl并且所述组合物包括2.4、4.8，7.2，9.6，12，24，28.8，或者33.6mM的KCl。所述组合物可以包括糖，所述糖可以是蔗糖并且所述组合物可以包括6.4，12.8，19.2，25.6，32，64，76.8，或者89.6mM的蔗糖。在这种优选的实施方案中，所述组合物另外包括缓冲剂，所述缓冲剂可以选自弱酸或者弱碱。在一种优选的实施方案中，所述缓冲剂是4-(2-羟乙基)哌嗪乙烷硫酸并且所述组合物包括1，2，3，4，5，10，12，14mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。另外中，所述组合物可以包括乙酸铵，例如，2.4、4.8，7.2，9.6，12，24，28.8，或者33.6mM的乙酸铵。
这里的方法可以用于传递平均分子量高达2,000,000道尔顿的分子，例如，平均分子量高达150,000道尔顿、平均分子量高达15,000道尔顿、平均分子量高达5,000道尔顿和/或平均分子量高达1,000道尔顿的分子。
本方法的引入步骤可以包括引入3.0-150.0微摩的待传递分子，选择性的，3.3-150.0微摩的待传递分子，进一步选择性的6.6-150.0微摩的待传递分子。选择性地，本方法的引入步骤包括引入3.0、3.3、6.6或者150微摩待传递分子。当待传递的分子的平均分子量高达15,000道尔顿时，所述引入步骤可以包括3.3微摩待传递的分子，或者6.6微摩待传递分子。做为选择，当所述待传递分子的平均分子量高达1,000道尔顿时，所述引入步骤包括引入150微摩待传递分子。可以选择引入步骤中被引入分子的量。
在某一实施方案方案中，被传递的分子具有的平均分子量高达15,000道尔顿。并且本方法包括向组合物中引入6.6微摩待传递分子，所述组合物包括水溶液，在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mM乙酸铵。
在另一个实施方案方案中，被传递的分子具有的平均分子量高达15,000道尔顿。并且本方法包括向组合物中引入6.6微摩待传递分子，所述组合物包括水溶液，在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4；并且包括20％(v/v)的甲醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mM乙酸铵。
当被传递的分子具有的平均分子量高达1,000道尔顿时，本方法包括向组合物中引入150微摩待传递分子，所述组合物包括水溶液，在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mM乙酸铵。
在另一个实施方案中，本发明方法包括当待传递分子的平均分子量高达1,000道尔顿时，向组合物中引入150微摩待传递分子，所述组合物包括水溶液，在室温下水溶液渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mM乙酸铵。
本发明方法包括当待传递分子的平均分子量高达1,000道尔顿时，向组合物中引入150微摩待传递分子，所述组合物包括水溶液，在室温下水溶液渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4；并且包括2％(v/v)的丁醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mM乙酸铵。
在一个实施方案中，待传递分子的平均分子量高达1,000道尔顿，并且所述方法包括向组合物中引入150微摩待传递分子，所述组合物包括水溶液，所述水溶液在室温下的渗透浓度为171毫克渗透压/升，pH值大约为7.4，并且包括25％(v/v)乙醇；34mM NaCl；0.7mMKCl、2.5mM Na2HPO4和0.5mM KH2PO4。
根据实施例方法，被传递的分子具有的平均分子量高达1,000道尔顿。在一些实施方案中，所述组合物包括醇类，并且可以包括至少两个碳原子(例如，乙醇)。所述组合物可以包括2-45％(v/v)的所述醇，选择性地20-30％(v/v)的醇类(例如，25％(v/v)的所述醇)。更进一步选择性的，所述组合物包括2-45％(v/v)的乙醇，20-30％(v/v)的乙醇，和25％(v/v)的乙醇。优选的，所述组合物可以包括20-30％(v/v)的乙醇。所述组合物可以是溶液(例如，水溶液)。在一些实施方案中，所述组合物在室温下具有的渗透浓度为171mOsm/L。优选的，所述组合物在室温下具有的渗透浓度为171mOsm/L。在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种盐，选自NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4.所述组合物可以包括小于46mM(例如，2-35mM之间的盐、10-15mM之间的盐、或者12mM的盐)。优选的，所述组合物包括12mM KCl。选择性地、所述组合物的pH值大约为7.4。在一些实施方案中，所述组合物包括糖，选择性地包括二糖(例如、蔗糖)。所述组合物可以包括小于121mM的糖(例如，6-91mM的糖、26-39mM的糖、或者32mM的糖)。进一步地优选的，所述组合物可以包括32毫米蔗糖。在一些实施方案中，所述组合物可以包括缓冲剂，所述缓冲剂可以选自弱酸或者弱碱。选择性地，所述缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。选择性地，所述组合物包括小于19mM的缓冲剂(例如，1-14mM缓冲剂、或者4-6mM缓冲剂或者5mM缓冲剂)。进一步地优选的，所述组合物可以包括5mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。根据实施例方法，所述组合物包括小于46毫米乙酸铵，例如，2-35mM乙酸铵、10-15毫米乙酸铵，或者12mM乙酸铵。优选的，所述组合物包括150.0微摩待传递分子。
在一些实施方案中，被传递的分子具有的平均分子量高达1,000道尔顿。在一些实施例中，组合物可以包括在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mM乙酸铵；和150.0微摩待传递分子。
根据实施例方法，被传递的分子具有的平均分子量高达1,000道尔顿。在一些实施方案中，所述组合物包括醇类，并且可以包括至少一个碳原子(例如，甲醇)。优选的，所述组合物包括乙醇。所述组合物可以包括2-45％(v/v)的所述醇，选择性地20-30％(v/v)的醇类，或者25％(v/v)的所述醇类。在一些实施方案中，所述组合物包括2-45％(v/v)的甲醇，20-30％(v/v)的甲醇，和选择性地20％(v/v)的甲醇。优选的，所述组合物可以包括20-30％(v/v)的甲醇。在一些实施方案中，所述组合物是溶液(例如，水溶液)。选择性地或者另外，所述组合物在室温下具有的渗透浓度为171mOsm/L，选择性地在室温下。优选的，所述组合物在室温下具有的渗透浓度为171毫克渗透压/升。在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种盐，所述盐选自NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4.所述组合物可以包括小于46mM(例如，2-35mM之间的盐、10-15mM之间的盐、或者12mM的盐(例如，12mM的KCl)。所述组合物的pH值大约为7.4。在一些实施方案中，所述组合物包括糖、二糖或者蔗糖。所述组合物可以包括小于121mM的糖，例如，6-91mM的糖、26-39mM的糖、或者32mM的糖(例如，32mM的蔗糖)。在一些实施方案中，所述组合物可以包括缓冲剂，所述缓冲剂可以选自弱酸或者弱碱。选择性地，所述缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。选择性地，所述组合物包括小于19mM的缓冲剂(例如，1-14mM缓冲剂、和4-6mM缓冲剂和5mM缓冲剂)。进一步地优选的，所述组合物可以包括5mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。在一些实施方案中，所述组合物包括小于46毫米乙酸铵，例如，2-35mM乙酸铵、10-15毫米乙酸铵，或者12mM乙酸铵。优选的，所述组合物包括150.0微摩待传递分子。
被传递的分子具有的平均分子量高达1,000道尔顿。在一些实施方案中，组合物可以包括在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4的水溶液；并且包括20％(v/v)的甲醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mM乙酸铵；和150.0微摩待传递分子。
根据实施例方法，被传递的分子具有的平均分子量高达1,000道尔顿。所述组合物包括醇类，所述醇类包括至少四碳原子(例如在内，丁醇)。更进一步，所述组合物包括2-8％(v/v)的醇类，或者2、4或者8％(v/v)的醇类(例如，优选的，所述组合物包括2％(v/v)的丁醇)。在一些实施方案中，所述组合物是溶液(例如，水溶液)。在一些实施方案中，所述组合物在室温下具有的渗透浓度为171mOsm/L。优选的，所述组合物在室温下具有的渗透浓度为171毫克渗透压/升。在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种盐，选自NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4.所述组合物可以包括小于46mM(例如，2-35mM之间的盐、10-15mM之间的盐、或者12mM的盐)。优选的，所述组合物包括12mM KCl。所述组合物的pH值大约为7.4。在一些实施方案中，所述组合物包括糖、选择性地二糖，选择性地蔗糖。选择性地，所述组合物可以包括小于121mM的糖，例如，6-91mM的糖、26-39mM的糖、或者32mM的糖(例如，32mM的蔗糖)。在一些实施方案中，所述组合物可以包括缓冲剂，所述缓冲剂可以选自弱酸或者弱碱。选择性地，所述缓冲剂可能是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。选择性地，所述组合物包括小于19mM的缓冲剂，1-14mM缓冲剂、4-6mM缓冲剂和5mM缓冲剂。进一步地优选的，所述组合物可以包括5mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。在一些实施方案中，所述组合物包括小于46毫米乙酸铵，例如，2-35mM乙酸铵、10-15毫米乙酸铵，或者12mM乙酸铵。优选的，所述组合物包括150.0微摩待传递分子。
被传递的分子具有的平均分子量高达1,000道尔顿。在一些实施方案中，组合物可以包括在室温下渗透浓度为171毫克渗透压/升并且pH值大约为7.4的水溶液；并且包括2％(v/v)的丁醇；12mM KCl；32mM蔗糖；5mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mM乙酸铵；和150.0微摩待传递分子。
根据实施例方法，被传递的分子具有的平均分子量高达1,000道尔顿。所述组合物包括醇类，所述醇类包括至少两个碳原子(例如，乙醇)。在一些实施方案中，所述组合物包括2-45％(v/v)的所述醇，(例如，20-30％(v/v)的所述醇，和25％(v/v)的所述醇)。进一步地方案中，所述组合物包括2-45％(v/v)的所述醇，(例如，20-30％(v/v)的所述醇，或者25％(v/v)乙醇。在一些实施方案中，所述组合物是溶液(例如，水溶液)。根据示例性的方法，所述组合物具有的渗透浓度为171mOsm/L(例如，在室温下)。根据实施例方法，所述组合物包括至少一种选自NaCl，KCl，Na2HPO4，和KH2PO4中的盐。所述组合物可以包括34毫米NaCl或者0.7毫米KCl。所述组合物可以包括2.5mM Na2HPO4。所述组合物包括0.5mM的KH2PO4。优选的，所述组合物包括34mM NaCl、0.7mM KCl、2.5mM Na2HPO4，和0.5mM KH2PO4中的至少一个。优选的，所述组合物包括34mM NaCl、0.7mM KCl、2.5mM Na2HPO4，和0.5mMKH2PO4。优选的，所述组合物包括150.0微摩待传递分子。
在优选的实施方案中，本发明包括以下步骤：向组合物中引入分子形成基质；雾化基质；和通过以喷雾的形式将1微升基质传递到0.065-0.085平方厘米范围内，使基质与质膜相接触。
本发明的方法包括通过以喷雾的形式将1微升的基质传递到0.065-0.085平方厘米范围内，选择性的0.065-0.085平方厘米范围内，使基质与质膜相接触。在某些实施方案中，使基质与质膜相接触包括传递10-100微升的基质，选择性的传递20微升的基质。在一个优选的实施方案中，使基质与质膜相接触包括以烟雾机的形式传递所述基质，其中，本发明进一步包括在使基质与质膜相接触前雾化所述基质的步骤。如这里所述，使用喷雾器可以实现上述雾化步骤。优选的，本发明方法包括在使基质与质膜相接触前雾化所述基质，提供直径为30-100微米的颗粒胶体悬浮液。
在本发明主题内容的方法中，所述雾化步骤包括提供一般(环形)圆锥喷雾带，如图1所示。在优选的实施方案中，所述雾化步骤包括常规圆锥形的喷雾带，其中，所述喷雾带的纵向长度大于所述喷雾带的环形部分直径。在优选的实施方案中，所述雾化步骤包括常规圆锥形的喷雾带，其中，所述喷雾带的纵向长度是所述喷雾带的环形部分直径的大约两倍。喷雾带的环形部分等于将要传递分子的细胞面积的环形部分。因此，在某些实施方案中，所述雾化步骤包括常规圆锥形的喷雾带，其中，所述喷雾带的纵向长度小于或等于31mm，并且要将分子传递到其中的所述喷雾带的环形部分面积是15.5mm。所述接触步骤优选在基质传递面积的中点，例如，其中，所述喷雾带的纵轴与将要传递分子至其中的细胞面积环形部分的纵轴或者中点同轴。
本发明方法可以包括在使基质与质膜接触前进一步将细胞与待传递基质相接触。在某些实施方案中，所述接触步骤包括除去细胞周围液体量，例如，通过抽吸。在另外优选的实施方案中，本发明包括以下步骤：向组合物中引入分子形成基质；雾化基质；将细胞与待传递基质相接触，和通过以喷雾的形式将1微升基质传递到0.065-0.085平方厘米范围内，使基质与质膜相接触。
所述方法可以进一步地包括培养所述暴露细胞、选择性地与缓冲溶液、比如磷酸盐缓冲盐水一起培养。因此，本主题内容的实施方案定义了一种方法，所述方法包括以下步骤：向组合物中引入分子形成基质；雾化基质；去掉要将基质传递至其中的细胞中的上清液，洗涤细胞，和通过以喷雾的形式将1微升基质传递到0.065-0.085平方厘米范围内，使基质与质膜相接触。
本方法还可以包括在室温下进一步培养所述细胞0.1秒-2分钟，选择性的，培养2分钟。
出乎意料的发现，本方法可以包括其他步骤：将细胞与第二组合物相接触，所述第二组合物包括68mM NaCl、1.4mM KCl、5mM Na2HPO4和0.9mM KH2PO4。第二组合物是一种溶液，选择性地所述水溶液的pH值为7.4。在一种优选的实施方案中，所述其他步骤包括在室温下30秒内向0.0052-0.0068平方厘米面积内传递1微升的第二组合物。
在其他接触步骤之后，本方法可以进一步包括暴露基质要传递到其中的细胞，例如通过抽吸作用除去细胞周围大量的液体。
所述方法进一步包括在暴露步骤之后培养细胞，例如，通过向细胞中引入适当的培养基并在潮湿的环境下，5％CO2，37℃下培养细胞。
因此，在一种优选的实施方案中，本方法包括其他步骤：将细胞与第二组合物相接触，所述第二组合物包括68mM NaCl、1.4mM KCl、5mM Na2HPO4和0.9mM KH2PO4；将细胞与待传递基质向接触；并在暴露步骤之后培养细胞。
因此，本主题内容还涉及本主题内容的第二方面，其中提供了一种第二组合物，第二组合物包括68mM的NaCl，1.4mM KCl、5mM Na2HPO4和0.9mM KH2PO4，并且其中所述组合物是水溶液。
本主题内容还涉及用于传递超过一定分子量的分子传递通过质膜的方法；所述方法包括以下步骤：将超过一定分子量的分子引入组合物形成基质；并使所述基质与质膜相接触。
用于传递的示例性装置
本主题内容进一步涉及传递胶体悬浮颗粒穿过质膜，例如，通过控制胶体液滴尺寸。尤其是，已经发现当一定体积的水溶液与细胞群接触时能够实现材料的细胞内传递。可以控制与细胞群接触的水溶液的体积，例如，通过产生水溶液控制的喷雾。使用特定尺寸(或者尺寸范围)的胶体悬浮液滴将材料的胶体悬浮液应用于细胞膜。但是，当胶体液滴被用于细胞膜且胶体液滴尺寸过大(和/或总体积也过大)时，可能发生对细胞的破坏作用，并且细胞活力可逆的受到影响。相反，当胶体液滴被用于细胞膜且所述胶体尺寸过小(和/或总体积也过小)时，则不能实现材料的细胞内传递。因此，控制的胶体液滴尺寸(或者产生的尺寸在一定范围内的胶体液滴)可以实现细胞内材料的传递。在一些实施方案中，所述有效装载在尺寸上可以是非胶体，例如，直径为小于1纳米或者大于1000纳米。
如图1所示，图1显示了仪器10的示意图，根据本主题内容示例性的实施方案，仪器10适用于传递分子通过质膜。
在压力下输入样品(例如，传递材料的胶体悬浮液)可以使用喷雾器产生小滴，例如，使用注射器。产生的液滴尺寸与使用的压力值有关，因此较低的压力产生较大的液滴尺寸。由于输入压力不能立刻改变，所以压力从0缓冲(例如，变化)到低压力再到更高的压力，并且铜盐从较高的压力缓冲(例如，变化)到较低的压力，会产生各种尺寸的液滴。产生的胶体液滴的一部分可能由于太大而不适合特定的细胞内传递应用。由于一部分产生的胶体液滴过大，尽管产生适当规模的胶体液滴也可能发生细胞死亡。如上所述，在一些应用中不希望发生细胞死亡。另外，通过喷雾器产生的胶体液滴部分也可能过小，这会导致材料低效或者无效的细胞内传递。
现有主题内容能够产生特定尺寸或者尺寸范围的胶体液滴。另外，产生的胶体液滴的尺寸可以是一致的，例如，产生的液滴尺寸在需要尺寸或者尺寸范围以外的液滴被减少和/或基本上清除。使用高-开关-速度阀可以实现对胶体液滴尺寸的控制，所述高-开关-速度阀带有一个腔室，和/或确保顶部由足够空间供给输入空气，这能够使喷雾器的输入压力快速上升和下降。所述喷雾器被设计与注射器一起使用。
根据不同的应用(例如，待传递材料和靶细胞种类，液滴的组成，无论是过大还是过小都是可以变化的)。因此，通过产生胶体液滴和控制胶体液滴的尺寸可以实现材料的细胞内传递。在一些实施方案中，以某种方式产生所述胶体液滴从而使基本上所有被应用于靶细胞上的胶体液滴都具有一定的尺寸，或其尺寸在一个已知/理想的范围内，能实现细胞内传递。在一些实施方案中，尺寸在已知/理想范围以外的胶体液体的形成被最小化。
仪器10包括喷雾器12和用于支持细胞的支持物16，喷雾器12具有至少一个喷雾发射器14.
将基质与质膜相接触包括以烟雾剂形式传递所述基质，这可以使用喷雾器实现。
所述喷雾器12选自机械喷雾器、超声波雾化器、电喷雾器、喷雾器和文杜里管；并且，本领域普通技术人员可以根据传递分子穿过质膜的需要来选择喷雾器。所述喷雾器可以是市场上可买到的的喷雾器，例如从美国北开罗莱纳州LMA Teleflex公司市场上购买得到的喷雾器。
所述喷雾器12用于提供颗粒的胶体悬浮液，每个颗粒直径为30-100微米。在某些实施方案中，所述喷雾器12适合于提供胶体悬浮的颗粒，其中颗粒的直径为50-80微米。所述颗粒是包括待传递到细胞中的分子的液滴。
所述喷雾器12可以包括气体存储层18。所述仪器10可以包括气动发生器或者气体存储器18(还被认为是气动发生器)。气体存储器18中的气体在压力下保持。所述气体可以选自空气、二氧化碳和氦；但是可以理解，本领域普通技术人员可以选择或者使用其他合适的气体。气体存储器18可以包括压力头发生器，选择性地包括固定的压力头发生器来压缩气体存储器18中的其他并在压力下维持气体。气体存储器18的实施例包括瓶装气体。
所述气体存储器18处于流体通道中，具有喷雾发射器14。煤气储液器18与喷雾器发射极14一起处于流体通道中，因此气体可以从气体存储器18中流到喷雾发射器14中。在某些实施方案中的，气体存储器18包括气体导管20，气体导管18与喷雾发射器14一起处于流体通道中。因此，所述气体导管20用于允许气体从其中穿过。气体导管20是凹型的，例如具有开口端的凹形体。在一个实施方案中，所述气体导管20是凹形体，具有第一22和第二22'开口端，选择性的第一22和第二22'对向开口。
在一个实施方案中，第一开口端22和第二开口端22'的直径可以不同。优选的，第一开口端22的直径大于和第二开口端22'的直径。第一开口端22处于流体通道中并且具有气体存储器18。所述第二开口端22'可以处于流体通道中，具有喷雾发射器14。当气体在一定压力下从气体存储器18通过气体导管20被注入时，所述气体导管20由于第一开口端22的直径大于第二开口端22'的直径所产生的收缩部分会使气流的速度增加，从而在第二开口端22产生压降。
所述仪器10可以进一步地包括一种样品存储器24。所述样品存储器24处于流体通道中，具有雾化器12。在一个示范性的实施方案中，样品存储器24处于流体通道中，带有雾化器发射体14。在优选的实施方案中，气体存储器18和样品存储器24均处于流体通道中，带有雾化器发射体14。在这种布置中，可以利用气体导管20的第二开口端22'处的压降从样品存储器24中吸取样品。从而将样品引入气流中从气体存储器18穿过气体导管20流动到雾化器发射体14.
在示范性的实施方案中，所述仪器10进一步包括固定在样品存储器24和气体存储器18之间的取样阀26。样品阀26可以调整来自样品存储器的样品流。所述样品阀26可以被用于产生持续的或者半持续的样品流。在一个示范性实施方案中，样品阀适用于产生定义数量的样品的样品流。例如，所述样品阀适合于从样品存储器24中产生0.5-100微升样品的半连续的样品流。在一个示范性实施方案中，样品阀26适用于从样品存储器24中产生20微升样品半连续的样品流。然而，可以理解，所属技术领域的专业人员可以选择样品流，据此样品阀可以使1微升的半连续的样品流被应用到0.065-0.085cm2的面积上。
所述喷雾器12和支持物16在空间上相互间隔的。所述支持物16可以向着雾化器12固定，从而使雾化器12产生的喷雾流(喷雾区域)被支持器接受或者喷在其上。所述支持物16包括固体支持物。在一些实施方案中，所述支持物16包括平皿，平皿中包括样品井。在选择性的实施方案中，所述支持物16包括适合于接受或者维持包括所述样品孔的平皿的固体支持物。所述支持物16或者所述平皿可以包括选自1，6，9，12，24，48，96，384，和1536孔的样品，例如，所述支持物16或者所述平皿可以是1，6-，9-，12-，24-，48-，96-，384-，或者1536孔平皿。所述支持器16可以是，例如生物膜，例如生物组织，例如皮肤组织或者管状组织；或者在一些实施方案中，生物器官。所述支持物可以由惰性材料组成。
在示例性实施方案中，所述固体支持物由塑料或者金属或者合金组成，当然可以理解，本领域普通技术人员可以选择并使用任何其他适当的材料。在一些实施方案中，所述支持物16可以是人工膜，例如铝膜或者塑料膜。
在示范性的实施方案中，所述支持物16包括发热元件，其可以是电阻元件或者可以在支持物16上增加或者降低温度。
所述支持物16可以互易地固定在仪器10上，允许支持物16相对于仪器10可以互动。在一些实施方案中，所述支持物16可以相对于雾化器12或者雾化器发射器14相互活动。在这种布置中，所述支持物16可以相对于雾化器发射器14移动，实现最佳喷雾带(喷雾区)用于传递分子穿过质膜。所述支持物16包括支持物制动器使支持物16相对于雾化器12或者雾化器发射器14(选择性的，雾化器发射器14的纵轴)相互移动，从而调整支持物16和雾化器发射器14之间的距离。另外，所述支持物16可以包括支持器制动器使支持物16沿着雾化器发射器14的纵轴横向相互移动，从而调整支持物16和雾化器发射器的相对位置。
在一个示范性的实施方案中，雾化器12或者雾化器发生器14与支持物16之间的距离小于或等于31mm。雾化器12和支持物16的空间间隔定义了位于期间的喷雾区域。在一个实施方案中，所述喷雾区的纵向长度为31毫米。
喷雾区的纵轴优选与支持物16的纵轴同轴。另外，雾化器发射体14的纵轴优选与支持物16的纵轴同轴。在此布置下，雾化器发射器14的纵轴、支持物16的纵轴和喷雾区的纵轴是同轴的，从而保证雾化器发射体14和与雾化器发射体14相关的喷雾区向支持物16聚集(例如，平皿的环形孔)进行传递。
所述仪器10可以进一步地包括固定在样品存储器18和喷雾器12之间的取样阀。所述阀28可以是一电磁操作阀，比如螺线管操纵阀。做为选择，所述阀28可以是气动阀。优选的，所述阀28位于气体导管20中并且可以用于调整气体导管20内的气流。例如，阀28可以在关闭位置和开放位置之间转化，所述闭合位置用于防止气体从雾化器12中活化，所述开放位置允许一定压力下的气体激活喷雾器12产生胶体液滴。所述开放位置可以部分开放从而控制雾化器12收到的压力。所述阀28可以允许持续的或者半持续的气流。在一个示例性的实施方案中，所述阀28适合于在一定时间间隔内产生半连续的气流，例如，在一秒时间间隔内产生半连续的气流。
所述阀28可以允许持续的或者半持续的气流。在一种优选的实施方案中，所述阀28适合于在一定时间间隔内产生半连续的气流，例如，在一秒时间间隔内产生半连续的气流。
为了确保无菌并除去杂质颗粒，仪器10可以进一步地包括至少一个过滤器30。在一些实施方案中，每个过滤器30都具有小于10微米的孔径，但是本领域技术人员可以容易的确定所需使用或选择的孔径。每个过滤器30位于气体导管20中，并且每个过滤器30在气体导管20的流体通道中。
所述仪器10可以包括至少一个调节器32，其可以是电调节器或者机械调节器。每个调节器32位于气体导管20中，并且每个调节器32在气体导管20的流体通道中。每个调节器32可以是调节阀和可以将气体导管内部20的压力调整到1.0-2.0bar。每个调节阀还可以将气体导管内部20的压力保持在1.0-2.0bar。在示例性的实施方案中，每个调节阀还可以将气体导管内部20的压力保持在1.5bar。本主题内容示范性的实施方案可以包括两个调节器32.例如，所述仪器10可以包括第一调节器32和第二调节器32'。第一调节器32和第二调节器32'位于气体导管20中，并且分别在气体导管20的流体通道中。在一个示范性的实施方案中，第一调节器32位于气体存储器18和过滤器30之间。第一调节器32可以用于在气体导管20内部调整来自气体存储器18的压力到2.0bar，并且维持气体导管20内部的压力在2.0bar。第二调节器32’位于气体存储器30和阀28之间。
根据一些实施方案，所述喷雾发射器14能够提供圆锥形的喷雾区。所述喷雾发射器14可以用于提供30度的圆锥喷雾区。
所述仪器10可以进一步包括微处理器，从而控制仪器10的部分或者全部；例如，所述微处理器可以设置来控制任意或者全部样品阀26、阀28和调节器32.
在一些实施方案中，仪器10被设计将1微升的样品传递到0.065-0.085平方厘米范围内，选择性的传递到0.065-0.085平方厘米范围内。所述样品可以以喷雾的形式被传递，通过在使样品与质膜接触前雾化样品。雾化器12可以形成样品液滴，每个液滴的横截面尺寸为30-100微米，更优选的，为50-80微米。选择性地或者另外，所述雾化器形成样品液滴，每个液滴的横截面尺寸小于10微米。优选的，设置仪器10从而传递在被传递样品所在面积的中心点进行。
材料和方法
除非另有说明，这里使用的所有无机材料都是“Analar”级材料。除非另有说明，所有材料都是组织培养等级并购买自西格马公司。
100毫升的第一溶液(溶液A)被制备，最终在分子级水中含有浓度为43mM的蔗糖、16mM的氯化钾、16mM的乙酸铵和7mM的Hepes，通过加入1.15毫升1M NaOH调节pH值至7.4并使用孔径为0.2微米的过滤器过滤杀菌，随后与乙醇以3:1的比例混合。
制备100毫升的第二溶液(溶液B)，最终在分子级水中具有浓度为68mM的NaCl、1.4mM的KCl、5mM的Na2HPO4和0.9mM的KH2PO4。通过向所得溶液中加入1.13毫升1M的NaOH将所得溶液的pH值调节到pH7.4，并且通过高压锅灭菌。
被传递给细胞的分子包括碘化丙啶(668Da)、miRNA(15,000Da)(ThermoScientific公司)、siRNA分子(15,000Da)(生命技术公司)、右旋糖苷(3000-2,000,000Da)(生命技术公司)。
从Sigma aldrich公司以P4864的商品目录号购入碘化丙啶溶液(在水中1.0毫克/毫升)；从ThermoScientific公司以CP-004500-01-05的商品目录号购入Dy547标记的非目标miRNA；从生物科学公司以13750062的商品目录号获得荧光素-标记的双链RNA低聚物(siRNA)；和从生命技术公司获得荧光素-标记的右旋糖苷，右旋糖苷40,000的商品编目号为D1845；右旋糖苷70,000的商品编目号为D1823；右旋糖苷2,000,000的商品编目号为D7137；和右旋糖苷500,000的商品编目号为D7139。
待传递到细胞中的分子被加入溶液A中形成基质。待传递的分子的量与被加入到溶液A中的分子的量无关。在目前的实施方案中，被加入到溶液A中的分子的量足够使基质包括150微摩碘化丙啶(668Da)、3.3或者6.6微摩miRNA(15,000Da)和3.3或者6.6微摩siRNA分子(15,000Da)。
细胞和细胞培养。从美国典型菌种保藏中心(ATCC)处获得的T24人膀胱癌细胞、U373恶性胶质瘤细胞、SKBR3人超三倍体细胞、HeLa人上皮腺癌细胞、CHO-K1中国仓鼠卵巢细胞、COS-7SV40转化的肾成纤维细胞、C2C12小鼠成肌细胞；A549腺癌人肺泡上皮细胞和Beas2B人支气管上皮细胞系。从Caltag医疗系统(Caltag MedSystems)获得的人胚肾(HEK)细胞-n人表皮角质化细胞-新生和HDF正常人皮肤的成纤维细胞系。
所有细胞系在湿润的气氛下，5％二氧化碳，37摄氏度下生长。每72小时进行常规防腐亚培养，或者实现75-90％交会，以先发生为准。
为了进行实验，在24孔平板中以大约4×103细胞/孔的密度接种细胞，并允许粘附24小时，从而使细胞在传递的时候实现75-90％的交会。
分子的传递。从美国的北卡罗莱纳州LMA Teleflex公司商业购得经鼻粘膜喷雾器，商品编目号为MAD300，并且其中包括喷雾发射器，如下设置：喷雾发射器放置的位置距离24孔板31毫米，并且在平皿每个孔的中点上。调节喷雾发射器的压力至1.5bar。使用计时器将喷雾从喷雾发射器中1秒内分配出来。用包含待传递分子的溶液A漂洗喷雾发射器三次。
平板的每个小孔被如下处理：用微量吸液管除去孔中的细胞培养基。选择性地，所述孔用微量吸液管吸取250微升的磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗两次。使用雾化器将包含待传递分子的20微升的溶液A被传递到细胞中。根据待传递的分子尺寸，在室温下培养孔板30秒至2分钟，随后使用微量吸液管加入250微升的溶液B。然后在室温下培养孔板30秒，在此时，使用微量吸液管从孔中除去溶液B。使用微量吸液管向孔中加入500微升培养基。所有细胞系在湿润的气氛下，5％二氧化碳，37摄氏度下生长。
荧光显微术。按照使用说明书使用异硫氰酸荧光素(FITC)-和DyLight亚磷酰胺(DY547)-标记分子。待传递到细胞中的区的标记分子被加入溶液A中，如上所述被传递到细胞中。在传递后，将孔板放置在荧光显微镜(奥林帕斯CKX 41)上，使用滤光镜观察细胞，目测荧光。获得荧光照片。
流式细胞仪。在传递后，使用200微升胰蛋白酶除去孔板每个孔中的细胞。使用200微升培养基使胰蛋白酶失活。通过离心作用在259相对离心力(RCF)作用下离心细胞5分钟将细胞压制成丸，使用微量吸液管将细胞丸再悬浮在200微升PBS中。将细胞悬浮液装载入流式细胞仪[Accuri流式细胞仪，BD生物科学公司)并根据使用说明书进行荧光分析。
细胞生存能力.传递之后，按照使用说明书使用CellTiter 96AQueous单溶液细胞增殖实验(MTS)(Promega)评价细胞生存能力。简而言之，将培养基从小孔中吸出，并替换为200微升新鲜培养基并向其中加入40微升MTS试剂。在37摄氏度下培养孔板1小时，避光保存。从孔中除去100微升的溶液并放置到96孔板中，使用GloMax 96微板光度计(Promega公司)在450纳米下阅读吸光率。
共-定位观察。按照使用说明书使用异硫氰酸荧光素(FITC)-和DyLight亚磷酰胺(DY547)-标记分子。在传递后，将孔板放置在荧光显微镜奥林帕斯CKX 41上，使用滤光镜观察细胞，目测荧光。获得荧光照片。
本主题内容进一步涉及传递胶体悬浮颗粒穿过质膜，例如，通过控制胶体液滴尺寸。尤其是，已经发现，当使用特定尺寸(或者尺寸范围)的胶体悬浮液液滴将材料的胶体悬浮液应用于细胞膜时，可以实现材料的细胞内传递。但是，当胶体液滴被用于细胞膜且胶体液滴尺寸过大时，可能发生对细胞的破坏作用，并且细胞活力可逆的受到影响。相反，当胶体液滴被用于细胞膜且所述胶体尺寸过小时，则不能实现材料的细胞内传递。因此，控制的胶体液滴尺寸(或者产生的尺寸在一定范围内的胶体液滴)可以实现细胞内材料的传递。
在压力下输入样品(例如，传递材料的胶体悬浮液)可以使用喷雾器产生小滴，例如，使用注射器。产生的液滴尺寸与使用的压力值有关，因此较低的压力产生较大的液滴尺寸。由于输入压力不能立刻改变，所以压力从0缓冲(例如，变化)到低压力再到更高的压力，并且同样从较高的压力缓冲(例如，变化)到较低的压力，会产生各种尺寸的液滴。产生的胶体液滴的一部分可能由于太大而不适合特定的细胞内传递应用。由于一部分产生的胶体液滴过大，尽管产生适当规模的胶体液滴也可能发生细胞死亡。如上所述，在一些应用中不希望发生细胞死亡。另外，通过喷雾器产生的胶体液滴部分也可能过小，这会导致材料低效或者无效的细胞内传递。
现有主题内容能够产生特定尺寸或者尺寸范围的胶体液滴。另外，产生的胶体液滴的尺寸可以是一致的，例如，产生的液滴尺寸在需要尺寸或者尺寸范围以外的液滴被减少和/或基本上清除。使用高-开关-速度阀可以实现对胶体液滴尺寸的控制，所述高-开关-速度阀带有一个腔室，和/或确保顶部由足够空间供给输入空气，这能够使喷雾器的输入压力快速上升和下降。所述喷雾器被设计与注射器一起使用。
根据不同的应用(例如，待传递材料和靶细胞种类，液滴的组成，无论是过大还是过小都是可以变化的)。因此，通过产生胶体液滴和控制胶体液滴的尺寸可以实现材料的细胞内传递。在一些实施方案中，以某种方式产生所述胶体液滴从而使基本上所有被应用于靶细胞上的胶体液滴都具有一定的尺寸，或其尺寸在一个已知/理想的范围内，能实现细胞内传递。在一些实施方案中，尺寸在已知/理想范围以外的胶体液体的形成被最小化。
所述仪器10可以进一步地包括固定在样品存储器18和喷雾器12之间的取样阀。所述阀28可以是电磁操作阀，比如电磁阀。所述阀28可以是气动阀。所述阀28位于气体导管20中并且可以用于调整气体导管20内的气流。例如，阀28可以在关闭位置和开放位置之间转化，所述闭合位置用于防止气体从雾化器12中活化，所述开放位置允许一定压力下的气体激活喷雾器12产生胶体液滴。所述开放位置可以部分开放从而控制雾化器12收到的压力。所述阀28可以允许持续的或者半持续的气流。在一个示例性的实施方案中，所述阀28适合于在一定时间间隔内产生半连续的气流，例如，在一秒时间间隔内产生半连续的气流。
在一些实施方案中，所述阀28的开关速度可以小于250毫秒。所述开关速度可以阀28在关闭位置和开放位置(和/或反之亦然)所需要的时间。在一些实施方案中，所述阀28的开关速度小于200毫秒。在一些实施方案中，所述阀28的开关速度在50和200毫秒之间。也可以有其他实施方案。
所述阀28可以包括腔。
在一些履行，所述雾化器12可以产生直径在30和100微米之间的胶体液滴。在一些实施方案中，所述雾化器12可以产生直径在30和50微米之间的胶体液滴。在一些实施方案中，由于仪器10的特点(例如，比方说快速的阀26开关时间)，输入到雾化器12中的压力导致大于百分之八十的有雾化器12产生的胶体液滴的直径在30微米至100微米之间(当在一秒内测定时，其中阀从关闭位置到开放位置，或者从开放位置至闭合位置至少变化一次)。.在一些实施方案中，输入到雾化器12中的压力导致大于百分之99的有雾化器12产生的胶体液滴的直径在30微米至100微米之间(当在一秒内测定时，其中阀从关闭位置到开放位置，或者从开放位置至关闭位置至少变化一次)。
操作中，本主题内容可以实现分子的细胞内传递。图3是过程流程图，解释了产生用于将样品传递到一种或者一种以上靶细胞细胞质中的胶体滴的方法800。在810中，通过气动发生器或者其他存储器18产生气体，所述气体具有一定压力。在820，阀可以在关闭位置和开放位置之间转化，所述闭合位置用于防止气体在压力下激活喷雾器12，所述开放位置允许一定压力下的气体激活喷雾器12产生胶体液滴。所述阀28可以在气动发生器或者气体存储器8和雾化器12之间。从样品存储器提供样品用于雾化器产生胶体液滴。也可以有其他实施方案。
其他实施例如下进行。
实施例1：技术的发展
将分子传递入活细胞中在多种应用中都是非常需要的。通常，所涉及的分子类型根据分子量可以分为：(i)通常平均分子量<1,000Da的小化学品分子；(ii)通常所具有的平均分子量大约为5000Da的肽；(iii)通常所具有的平均分子量大约为15,000Da的siRNA；(iv)通常所具有的平均分子量大约为150,000Da的抗体；和(v)核酸，例如DNA，通常所具有的平均分子量大约为5,000,000Da。
采取多种方法来传递分子通过质膜进入细胞，各个方法取决于待传递分子的尺寸和化学性质。有机溶剂，比如二甲亚砜，已经被用于传递小化学品分子。而这些分子基于二甲亚砜对质膜的作用，这一作用还不清楚，已知二甲亚砜能够显示出三种不同的作用方式，每种适应不同的浓度范围。在低浓度下，二甲亚砜诱导质膜变薄并增加质膜疏水核的流动性。在更高的浓度下，二甲亚砜在质膜上诱导不稳定的水孔。在依旧更高的浓度下，单独的脂质分子被质膜不可逆的吸收，随后导致质膜双层结构破坏性崩解。
大的、生物分子的引入，例如低聚肽、多肽或者蛋白质和核酸(例如质粒DNA、低聚核苷酸和siRNA)被认为是“转染”。使用传统的传递组合物，例如，二甲亚砜，不能有效实现这些大分子的传递。siRNA分子通常通过脂质体-调解的转染(lipofection)传递。通常使用生物(病毒)、化学品(脂质-基或者化学品聚合物)或者物理(例如电穿孔、磁转染、注射)方法传递质粒DNA。然而，这些方法不能便利的传递蛋白质和肽，并且，许多细胞型，尤其是初级细胞和干细胞，是“难以转染的”即使携带有高毒性的核酸分子，这是一个常见的问题。
各种各样的方法用来从化学上来分析“渗透”细胞和组织。但是，这些方法中的大多数不针对“可逆的渗透作用”并传递入活体细胞。相反，这些方法通常针对“不可逆的渗透作用”，用于传递“标记物”，所述标记物附着在细胞或者组织内部的分子或者结构上，从而实现，例如观测或者定量分析的目的(例如，萤光免疫检验法)。在这些位置，所述细胞和组织在渗透后死亡。通常在这些方法中使用的化学品包括醇类(在质膜中溶解脂质)、去污剂(在质膜上产生孔)和酶(消化蛋白质并在之质膜上产生孔)。
已经有少量研究被报道可以使用去污剂成功的实现可逆渗透。去污剂(例如，表面活性剂)广泛的被被用于生物科学，用于从细胞膜中提取蛋白质并用作膜渗透剂。TritonX-100(TX100)是最广泛使用的非离子型表面活性剂中的一种，用于赖氨酸细胞或者用于渗透活体细胞膜用于转染。其他示范性的表面活性剂包括polysorbae20(例如、吐温20)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基胺]丙烷磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基胺]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)、十二烷基硫酸钠(SDS)，和辛基葡糖苷。然而，细胞生存能力在很小的表面活性剂浓度范围内是极端敏感的，并且很难控制用于转染的TX100浓度。Vanden Ven等人报告了使用TX100将分子量在1000MW到150,000MW的分子传递到培养细胞(vande Ven K.,et al.,J.Biomed Opt 2009:14(2),，通过引证在此全部并入本文)Medepalli等人报道了使用皂角苷和一种低渗缓冲液(蔗糖、KCl、乙酸钾、Hepes)一起将纳米尺寸的量子点传递到培养细胞中(Medepalli,K.,et al.,Nanotechnology 2013；24:20，通过引证在此全部并入本文)。使用这种低渗缓冲液支持细胞存活力，通过向细胞提供离子和pH缓冲液，同时还是低渗的，从而保证水流入所述被渗透的细胞并在其中携带有效装载(请注意水本身对细胞是有毒性的)。然而，van de Ven和Medepalli等人报道的实验不可重复。
基于可逆渗透作用的不含载体的传递方法被开发，从而促进有效装载传递进入细胞，并且传递方式能够保持细胞生存能力和有效装载的功能性。由于其他基团已经进行了，因此使用下列假设：第一，渗透作用可以通过细胞膜上的化学修饰作用诱导；第二，通过使用低渗传递溶液产生渗透压，据此水流入渗透细胞促进了有效装载的流入，从而增加传递；和第三，如果所述低渗溶液同时是缓冲液和生理活性液，则可以增加细胞存活率。根据最初的观察，进一步的假设被开发并改善，如下所述。对于化学渗透作用，最常见的渗透剂是去污剂，其与细胞膜的某些组分相互作用，产生孔洞(Hapala,I.,Crit Rev.Biotech.1997；17(2):105-22).Medepalli等人报道通过在4℃下特异性低渗生理缓冲液(叫做“S缓冲液”(78mM蔗糖、30mM KCl、30mM乙酸钾、12mM mM))中培养细胞5分钟可以将量子点传递进入培养细胞(Medepalli K.et al.,Nanotechnology 2013；24(20)).在一些实施例中，在所述S缓冲液中乙酸钾被替换为乙酸铵。他们还描述了通过向溶液中增加皂角苷可以提高传递。然而，在此条件下会观察到高水平的细胞损坏和分离的A549细胞，而并没有观察到标记的siRNA和右旋糖苷分子的吸收。有机溶剂(例如醇类)可以通过溶解细胞膜的脂质渗透细胞。产生了使用乙醇作为渗透剂的可逆渗透方案。
检测一部分包括水和PBS以及各种浓度的S缓冲液的乙醇浓度系列稀释物。基于对细胞膜的作用，用乙酸铵替换S缓冲液中的乙酸钾并产生更好的传递效力。一种优选的传递溶液组合物包括75％H2O、25％乙醇、32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵和5mM Hepes，其能够产生理想的初始结果，除非另有说明，在此点使用的是这种传递溶液。然而，当使用移液管直接将这种溶液大量滴在细胞上时会产生显著的毒性，从而渗透或者淹没所述细胞，图56A。当200微升包含PI的传递溶液(24孔板中的每孔)被直接滴在暴露细胞上时，绝大多数细胞对PI直接显阳性(图17)。传递后24小时测定LDH释放，说明大约50％细胞被毁坏(图19)。相反，没有观察到大分子，例如10-KDa右旋糖苷-Alexa488或者siRNA-FITC的传递(图17)。所述细胞被过度渗透到致命损伤的程度，其中，PI可以进入并与核DNA相连，但是不能建立渗透压梯度传递所述大的有效装载。
因此，为了使毁坏发生最小化，所述传递过程应该尽可能快，使最大量的有效装载在最小的体积和最短的可行时间内被传递。细胞在第0天被接种到24-孔板中，从而在第1天进行传递时实现80-90％的交会。从目标孔中除去上清液并向小孔中滴入20微升传递溶液，所述传递溶液包含PI、10-KDa右旋糖苷-Alexa488或者siRNA-FITC。在室温下(RT)培养细胞2分钟促进吸收。为了进一步促进吸收并防止细胞脱水，向其中加入200微升0.5X-PBS，并进一步培养细胞30秒。然后去掉该溶液并加入400微升培养基。然后通过荧光显微术分析所述细胞。在此方法中，PI吸收出现在孔的边缘而不在孔中间(图18)。传递结果与该方法不一致。相反，没有观察到10-KDa右旋糖苷-Alexa488或者siRNA-FITC的传递(图17和图18)。然而与较大的200微升体积相比，LDH水平减少(图19)。一些细胞发生过渗透作用和其他细胞发生渗透作用。渗透溶液向所有细胞的同时传递胜过使用微量吸液管的“滴落”体积(其中不是所有的细胞同时作为目标)。而且，所述到达细胞的体积应该足够使水流入细胞，但是不足以将细胞带到破碎点。换句话说，所述体积应当被滴定与细胞的吸收能力相配。喷雾调节的传递可以实现这些结果，据此，喷雾在非常短的时间内以一种均匀的方式最优化有效装载与靶细胞细胞膜的接触，从而保持细胞生存能力以及有效装载通过细胞膜可靠的和强健的吸收进入细胞内(图56B)。
仪器。为了实施该方法，配置包括x、y和z的仪器(图20)。所述仪器用来传递10-kDa右旋糖苷到A549细胞。向48孔平板中接种细胞，从而使细胞单层面积与喷雾之间相配。从目标孔中除去上清液，并向细胞上喷雾10微升的传递溶液，所述传递溶液包含10-KDa右旋糖苷。在室温下培养2分钟之后，加入200微升0.5X-PBS并进一步培养30秒。然后去掉所述溶液并加入400微升培养基。该方法能够成功传递10-KDa右旋糖苷进入细胞，有效率大于50％，与未被处理的细胞相比毒性很小或者没有毒性(图21和图22)。
已经建立了一个用于可逆的渗透细胞的技术，检验细胞恢复所需的时间。在不存在有效装载的情况下，喷雾传递溶液，随后在喷雾之后的1小时内时间点向培养基中加入碘化丙啶(PI)，检测被渗透的细胞。尽管PI吸收在喷雾后五分钟开始明显，在喷雾30分和60分后，PI-阳性细胞的数目基本上开始减少，如图23所示。
实施例最佳参数。
在本技术发展过程中，一些参数被优化。喷雾头到细胞的距离、喷雾压力、向每孔喷雾的传递溶液体积和乙醇浓度被优化实现最佳的传递效率和最小的毒性(图25-29)。喷雾头与细胞之间的距离为31毫米，喷雾压力为1.5bar，对于48孔板体积为10微升且乙醇浓度为25％是产生最佳传递效率和毒性水平的参数。
实施例2:
根据本发明将平均分子量高达15000道尔顿的分子传递穿过质膜的作用。
在此实施例中，FITC-标记的siRNA分子的平均分子量为15,000Da，使用本主题内容的仪器将其传递到细胞中。所述siRNA分子被引入一种组合物，所述组合物是一种水溶液，包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mM hepes，pH大约为7.4，20、30或者40％(体积/体积)的乙醇；和6.6微摩待传递分子；形成基质。1微升的基质被传递到0.065-0.085平方厘米的面积内，从而将基质与细胞的质膜相接触，或者直接用微量吸液管或者使用这里所描述的仪器。评价待传递分子的相对量(荧光值)和细胞的生存能力(活体细胞量)并以百分比表示。结果显示在图4中。
如图4所示，具有平均分子量高达15,000Da的分子通过本主题内容所述的方法完成的传递(黑条带)增加了分子的传递速率(例如，显示分子成功传递的细胞百分比)，与通过微量吸液管直接将分子与细胞质膜相接触的传递相比(灰条带)。实际上，在包括30％或者40％(体积/体积)的乙醇的组合物中，和直接使用微量吸液管完成的基质传递中，在活细胞中没有分子传递。
实施例3：
根据本发明将平均分子量高达1,000道尔顿的分子传递穿过质膜的作用。
在此实施例中，碘化丙啶分子的平均分子量为668Da，使用本主题内容的方法将其传递到细胞中。所述分子被引入一种组合物，所述组合物是一种水溶液，包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mM hepes，pH大约为7.4，20或者40％(体积/体积)的乙醇；和150微摩待传递分子；形成基质。1微升的基质被传递到0.065–0.085平方厘米的面积内，从而将基质与细胞的质膜相接触，或者直接用微量吸液管或者使用这里所如上所述的仪器。结果显示在图4中。
如图5所示，具有平均分子量高达668Da的分子在基质中通过本主题内容所述方法完成传递(黑条带)增加了分子的传递速率(例如，显示分子成功传递的细胞百分比)，(Y轴显示传递百分比，X周显示乙醇百分比)，与通过微量吸液管直接将分子与细胞质膜相接触根据传递相比(灰条带)。实际上，在包括40％(体积/体积)的乙醇的组合物中，和直接使用微量吸液管完成的基质传递中，在活细胞中没有分子传递。
实施例4：
将超过一个分子量的分子传递通过质膜。在此实施例中，具有668Da平均分子量的碘化丙啶作为第一分子，将具有40,000分子量的FITC-标记的葡聚糖作为第二分子，使用本主题内容所述仪器将第一分子和第二分子同时传递到细胞中。所述第一和第二分子同时被引入一种组合物，所述组合物是一种水溶液，包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mMhepes，pH大约为7.4，25％(体积/体积)的乙醇；和150微摩待传递分子；形成基质。1微升的基质被传递到0.065–0.085平方厘米的面积内，使用本主题内容所示的方法以烟雾剂的形式将基质与细胞的质膜相接触。结果显示在图6A-6C中。
如图6A所示，使用本主题内容在基质中具有平均分子量为668Da的第一分子的传递使所述分子被传递入细胞中。如图6B所示，使用本主题内容在相同基质中具有平均分子量为40,000Da的第二分子的传递使所述第二分子同时被传递入细胞中。同时传递的结果显示在图6C中。
实施例5：
根据本发明将平均分子量高达500,000道尔顿的分子传递穿过质膜的作用。
在此实施例中，FITC-标记的葡聚糖分子的平均分子量为10,000Da，使用本主题内容的仪器将其传递到细胞中。所述分子被引入一种组合物，所述组合物是一种水溶液，包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mM hepes，pH大约为7.4，25％(体积/体积)的乙醇；和150微摩待传递分子；形成基质。1微升的基质被传递到0.065–0.085平方厘米的面积内，从而将基质与细胞的质膜相接触，或者直接用微量吸液管或者使用这里所的所述介绍题材的仪器。结果显示在图7中。
如图7所示，具有平均分子量高达500,000Da的分子在基质中通过本主题内容所述方法完成传递(黑条带)增加了分子的传递速率(例如，指示分子成功传递的细胞百分比)，(Y轴显示传递百分比，X轴显示乙醇百分比)，与通过微量吸液管直接将分子与细胞质膜相接触根据传递相比(灰条带)。实际上，在包括25％(体积/体积)的乙醇的组合物中，和直接使用微量吸液管完成的基质传递中，在活细胞中没有分子传递。
实施例6：
将细胞与一种第二组合物接触的作用，所述第二组合物包括68mM的NaCl，1.4mM的KCl，5mM的Na2HPO4和0.9mM KH2PO4。
在此实施例中，FITC-标记的siRNA分子的平均分子量为15,000Da，使用本主题内容的仪器将其传递到细胞中。在将分子传递入细胞中后，将细胞与200微升第二组合物相接触30秒，所述第二组合物包括：含有胎牛血清(FBS)的Dulbecco's修饰的伊格尔培养基(DMEM)；不含有胎牛血清(FBS)的DMEM；蒸馏水(H2O)；包括137mM NaCl、2.7mM KCl、10mMNa2HPO4和1.8mM KH2PO4(1X PBS)的水溶液；或者包括13.7mM NaCl、0.3mM KCl、1.0mMNa2HPO4和0.18mM KH2PO4(1X PBS)的水溶液，随后加入培养基并使用这里所描述的荧光显微术评价传递。所述结果显示在图8中，进行说明。
如图8所示，包括68mM NaCl、1.4mM KCl、5mM Na2HPO4、和0.9mM KH2PO4(0.5XPBS)的水溶液优选用于本发明所述方法中，维持细胞生存能力(Y轴显示传递百分比)。
实施例7：
将不同的分子量的分子传递通过质膜。
在这些实施例中，使用本主题内容介绍的一起将碘化丙啶分子(668道尔顿)、FITC-标记的siRNA(15,000道尔顿)、Dy547-标记的miRNA(15,000道尔顿)、FITC-标记的葡聚糖(40,000道尔顿)和FITC-标记的葡聚糖(500,000道尔顿)分别传递到细胞中。所述分子分别被引入一种组合物，所述组合物是一种水溶液，包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mM hepes，pH大约为7.4，其中所述组合物包括25％(体积/体积)的乙醇；和150微摩待传递分子；形成基质。1微升的各个基质(每个包含不同的待传递分子)被传递到0.065–0.085平方厘米的面积内，从而将基质与细胞的质膜相接触，或者直接用微量吸液管或者使用本主题内容的方法。在0小时(碘化丙啶)或者传递后24小时观察细胞(siRNA-FITC、miRNA-Dy547和葡聚糖-FITC)。使用奥林帕斯IX71倒置显微镜获得显微照片显示(A)荧光和(B)相衬显微镜。结果显示在图9中。
如图9所示，使用本主题内容所述的一起可以成功的将具有改变分子量的分子传递入细胞中。另外，具有改变分子量的葡聚糖(例如，3KDa、40KDa、70KDa、500KDa和2000KDa)、和蛋白质(例如，β-乳球蛋白、HRP、卵清蛋白、BSA、过氧化氢酶和去铁铁蛋白)可以成功的被传递，分别如图29和43所示。
因此，本主题内容提供了用于传递分子穿过质膜的仪器，能够通过对每个细胞进行可逆渗透将分子传递到活体细胞中。可逆的渗透使每个细胞变得可渗透，选择性地暂时可渗透，从而允许吸收的分子进入所述细胞。有益地，在不可接受的大量细胞死亡发生前，所述渗透是可逆的。
实施例8：
将平均分子量高达15000道尔顿的分子传递的溶质含量作用。
在该实施例中，按照上面描述的方法将平均分子量为15,000道尔顿的siRNA分子传递到细胞中。使用的组合物是一种pH值大约为7.4的水溶液，其中，所述组合物包括25％(体积/体积)的乙醇和3.3微摩待传递分子。通过加入蔗糖、KCl、乙酸铵和hepes使其最终浓度为32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵和5mM Hepes可以制得1X溶液。进一步制备具有不同溶解物的检测溶液(蔗糖、KCl、乙酸铵和hepes)，浓度分别为0.2X、0.4X、0.6X、0.8X、2X、2.4X和2.8X。结果显示在图10中。
如图9所示，用于传递的分子的平均分子量高达15,000道尔顿，优选包含1X-2X溶质浓度的蔗糖、KCl、乙酸铵和hepes的组合物，或者1X是优选的(黑条带)，已知在此浓度下细胞毒性(白色条带)最小。这等于32-64mM蔗糖、12-24mM KCl、12-24mM乙酸铵和5-10mMhepes的溶质浓度；进一步选择性的，是32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵和5mM Hepes。
实施例9：
酒精浓度对平均分子量高达15000道尔顿的分子传递的作用。
在该实施例中，按照上面描述的方法将平均分子量为15,000道尔顿的siRNA分子传递到细胞中。使用的组合物是一种水溶液，所述水溶液包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mM hepes，pH大约为7.4，6.6微摩待传递分子，和5、10、20、30或者40％(体积/体积)的乙醇。结果显示在图11中。
如图11所示，用于传递的分子的平均分子量高达15,000道尔顿，优选一种组合物，包括2-45％(体积/体积)的醇类、选择性的20-30％(体积/体积)的醇类，进一步选择性的25％(体积/体积)的醇类(黑条带)，同时具有最小的细胞毒性(白条带)。
在比较试验中，平均分子量为15,000Da的siRNA分子按照如上所述的方法被传递到细胞中，所使用的组合物是一种水溶液，包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mMhepes、pH大约为7.4、6.6微摩待传递分子和5、10、20和30％(v/v)的甲醇。结果显示在图12中。
如图12所示，用于传递的分子的平均分子量高达15,000道尔顿，优选一种组合物，包括2-45％(体积/体积)的醇类、选择性的10-20％(体积/体积)的醇类，进一步选择性的20％(体积/体积)的醇类(黑条带)，同时具有最小的细胞生存能力(白条带)。
实施例10：
含盐量对平均分子量高达1,000道尔顿的分子传递的作用。
在该实施例中，按照上面描述的方法将平均分子量为668道尔顿的碘化丙啶分子传递到细胞中。使用的组合物是一种pH值大约为7.4的水溶液，其中，所述组合物包括25％(体积/体积)的乙醇150微摩待传递分子。用25％的0.5X、1X、2X和4X磷酸盐缓冲盐水(PBS)制备检测溶液，对应的盐含量为19.0mM、37.9mM、75.8mM和151.6mM。结果显示在图12中。
实施例11：
乙醇浓度对平均分子量高达1,000道尔顿的分子传递的作用。
在该实施例中，按照上面描述的方法将平均分子量为668道尔顿的碘化丙啶分子传递到细胞中。使用的组合物是一种水溶液，所述水溶液包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mM hepes，pH大约为7.4，150微摩待传递分子，和5、10、20、30或者40％(体积/体积)的乙醇。结果显示在图14中。
如图14所示，用于传递的分子的平均分子量高达1,000道尔顿，优选一种组合物，包括2-45％(体积/体积)的醇类、选择性的20-30％(体积/体积)的醇类，进一步选择性的25％(体积/体积)的醇类。
在比较试验中，平均分子量为668Da的碘化丙啶按照如上所述的方法被传递到细胞中，所使用的组合物是一种水溶液，包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mM hepes、pH大约为7.4、150微摩待传递分子和5、10、20和30％(v/v)的甲醇。结果显示在图14中。
如图15所示，用于传递的分子的平均分子量高达1,000道尔顿，优选一种组合物，包括5-20％(体积/体积)的醇类、选择性的5、10或20％(体积/体积)的醇类(黑条带)，同时具有最小的细胞生存能力(白条带)。
在比较试验中，平均分子量为668Da的碘化丙啶按照如上所述的方法被传递到细胞中，所使用的组合物是一种水溶液，包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mM hepes、pH大约为7.4、150微摩待传递分子和2％(v/v)的丁醇。结果显示在图16中。
如图16所示，用于传递的分子的平均分子量高达5,000道尔顿，优选包括2％(体积/体积)丁醇的组合物(黑条带)具有最小的细胞毒性(白条带)。
因此，本主题内容提供了用于传递分子穿过质膜的方法，能够通过对每个细胞进行可逆渗透将分子传递到活体细胞中。可逆的渗透使每个细胞变得可渗透，选择性地暂时可渗透，从而允许吸收的分子进入所述细胞。有益地，在不可接受的大量细胞死亡发生前，所述渗透是可逆的。
实施例12：
根据本发明将平均分子量高达40,000道尔顿的分子传递穿过质膜的作用。
在此实施例中，FITC-标记的葡聚糖分子的平均分子量为40,000Da，使用本主题内容的仪器将其传递到细胞中。所述分子被引入一种组合物，所述组合物是一种水溶液，包括32mM蔗糖、12mM KCl、12mM乙酸铵、5mM hepes，pH大约为7.4，40％(体积/体积)的乙醇；和150微摩待传递分子；形成基质。1微升的基质被传递到0.065–0.085平方厘米的面积内，从而将基质与细胞的质膜相接触，或者直接用微量吸液管或者使用这里所的描述的仪器。
如图7所示，具有平均分子量高达40,000Da的分子通过本主题内容所述的方法完成的传递(黑条带)增加了分子的传递速率(例如，显示分子成功传递的细胞百分比)，与通过微量吸液管直接将分子与细胞质膜相接触的传递相比(灰条带)。实际上，在包括40％(体积/体积)的乙醇的组合物中，和直接使用微量吸液管完成的基质传递中，在活细胞中没有分子传递。
实施例13：
具有不同分子种类和尺寸的分子的传递作用
在这些实施例中，检验了喷雾方法解决传递多种分子种类和尺寸的挑战的能力。具有增加尺寸的葡聚糖，包括3kDa、40kDa、70kDa、500kDa和2,000kDa的葡聚糖被成功的传递进入A549细胞，如图29所示。还可以传递其他种类其他尺寸的分子，例如，线性siRNA分子(大约15kDa)和大抗体分子(150kDa)，如图30所示。而且，不同类型的分子以各种结合的方式被传递。例如：，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，毒肽和MitoTracker红被成功地共同传递入A549细胞，如10-KDa葡聚糖-Alexa488和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)组合物的传递一样，如图31所示。
由于喷雾是一种不含载体的方法，尤其注意的是使用本方法能够传递mRNA和质粒DNA。编码绿色荧光蛋白质(GFP)和荧光素酶的报道mRNAs被喷雾转染进入CHO细胞。通过荧光显微术观察绿色荧光蛋白质(GFP)表达并通过发光测试检测荧光素酶表达，使用Lipofectamine 2000作为参照进行对比(图33和图34).同样，当被喷雾转染进入CHO细胞时，编码绿色荧光蛋白质(GFP)和荧光素酶的DNA质粒被表达(图35和图36)。这些数据说明在传递入细胞中之后所述核酸有效装载的功能。而且，能够解决粘附细胞并具有极低的毒性对于主要和干细胞群是十分重要的，这些细胞不能大量获得并且需要最小的处理和通过步骤。
实施例14：
传递穿过不同细胞种类的作用，包括粘附细胞系、主要的成纤维细胞、主要的干细胞和悬浮细胞。
在本实施例中评价了穿过不同细胞种类的传递方法。根据不同种类的粘附细胞类型成功地配置传递技术，所述粘附细胞类型包括A549和CHO细胞系以及主要的成纤维细胞(如图37所示)和主要的间充质干细胞(MSC)(如图39所示)。而且，所述草案可以成功的解决悬浮细胞，例如U226人多发性骨髓瘤细胞，如图41A所示。将细胞悬浮液放入多孔细胞培养平板中并在20-45秒的时间内施加短时温和真空环境，大约-0.5到-0.68bar，在喷雾之前去掉上清液(图41A和图42)。
另外，本方案可以成功用于解决悬浮细胞，例如，Jurkat细胞，T-淋巴细胞，如图41B所示。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和Mitotracker红成功地被传递入jurkat细胞(分别如图41B顶部和中间图所示)。而且，编码绿色荧光蛋白质(GFP)的mRNA被传递给Jurkat细胞，并且在传递后24小时观察绿色荧光蛋白质(GFP)的表达。
实施例15：
评价蛋白质细胞内传递的传递技术。
传递技术的一种显著应用就是细胞内传递蛋白质。根据其尺寸、性质和化学作用不同，蛋白质是一种很多样的基团，限行很少的方法可以有效传递这种分子。用FITC或者Alexa-488标记具有增加尺寸(从18.3kDa到443kDa)的大量蛋白质，并检验其喷雾传递。所有的蛋白质成功地被传递(图43和图44)入CHO细胞。观察到随着蛋白质尺寸的增加传递效率下降(图44)。为了进一步证实蛋白质被传递到细胞中，传递卵清蛋白-FITC并随后用抗卵白蛋白抗体进行萤光免疫检验法检测(图45)。对于给定的蛋白质，在这种情况下，β-乳球蛋白、其剂量反应是喷雾的蛋白质浓度越高传递效率越高(图46)。
实施例16：
评价传递入细胞之后蛋白质的功能。
检验传递入细胞之后蛋白质的功能。多种实验可以用于检测辣根过氧化物酶(HRP)活性，并且喷雾入CHO细胞之后，使用两个实验来检测辣根过氧化物酶活性。第一，采用酪胺信号放大(TSATM)试验，通常使用HRP催化活性产生高密度目标蛋白标记物或者核酸序列原位标记物。Alexa Fluor 488-标记的酪胺底物被用于说明喷雾传递后HRP在CHO细胞中的活性和位置(图47)。第二，DCFH-DA实验被用于定量HRP活性。2′,7′-双氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)是一种疏水性非荧光分子，能够快速穿透细胞并通过细胞内酯酶水解产生DCFH分子，DCFH分子可以被氧化成其荧光产物2′,7′双氯荧光素(DCF)，这是可测量的。HRP被喷雾转染进入CHO细胞并且用DCFH-DA培养所述细胞。传递的HRP剂量越高观察到的DCF产量越高(图48)。此实验未观察到毒性(图49)。
实施例17：
评价了用于进行目标器官追踪的喷雾标记的主要间充质干细胞(MSC)。
一些细胞类型，包括间充质干细胞(MSC)被用于体内细胞疗法应用。然而，由于缺少细胞在体内流动方面的了解，许多方案都因此而不成功。很难调查向靶器官流通的效力以及与非靶器官的多价螯合作用，通常在动物研究中使用标记的细胞来了解这些过程。目前不能实现快速有效的细胞标记。标准荧光标记，例如FITC及其他荧光团，通常亮度不足以在组织和动物中原位检测到。最近研发了一些较亮的标记，例如量子点(Q-点)，但是这要求更长的细胞培养时间，通常是整夜，从而实现满意的标记水平。本主题内容的方法是一种快速传递方法，据此，有效装载可以在几分钟内被传递到靶细胞中。本发明方法将Q点传递到主要间充质干细胞(MSC)的能力被检测，并且检测了这些是否可以在体外注射的小鼠脾脏中被检测到。
Q点被喷雾转染进入培养的主要小鼠间充质干细胞(MSC)中，如图50所示。解剖小鼠脾脏，并且向脾脏中注射处于100微升培养基中的2x 105喷雾转染的间充质干细胞(MSC)。使用Cryovis仪器，通过三维cryo成像技术检验脾中的荧光度。如图51所示，在脾中检测到Q点。
实施例18：
实验测量A549细胞、CHO细胞和间充质干细胞(MSCs)中没细胞传递的体积。
实验计算和测定的三种不同细胞系(A549，CHO和MCSs)的面积(图55)。对于A549细胞、CHO和MCS细胞，每个细胞系的平均面积分别为932平方微米、372平方微米和2054平方微米。因此，对A549、CHO和MCS细胞计算的每孔细胞数(根据48-孔板尺寸)分别为102,500、255,000和46200。在传递10微升时，对A549细胞大约每细胞传递9.8x10-5微升、对于CHO细胞大约每细胞传递3.9x10-5微升，并且对于间充质干细胞(MSCs)大约每细胞传递2.2x10-4微升每细胞。这三个实施例中每细胞实验测量的传递体积在理论计算范围(例如，6.0x 10-7微升每细胞和7.4x 10-4微升每细胞)内，所述理论计算范围是使用ATCC，Celeromics技术公司的细胞直径估计所得，或者根据本领域普通技术人员已知的其他细胞培养参考书获得的。
在如上说明书和权利要求书中，在一系列元素或者特征后常常使用词语例如“至少一个”或者“一个或者一个以上”。术语“和/或”还可以用于两个或者更多元素或者特征之间。除非上下文中另有含蓄的或者明确的相反定义，这些词语指的是任意列出的元素或者特征或者任何叙述的元素或者特征可以与其他任何另一个元素或者特征相结合。例如，所述词语“A和B中的至少一个”“A和B中的一个或者一个以上”以及“A和/或B”值得是只有A、只有B或者A和B一起。类似的解释还可以用于包括三个选项的列表。例如，词语“A、B和C中的至少一个”、“A、B和C的一个或者一个以上”以及“A、B和/或C”指的是只有A、只有B、只有C、A和B、A和C、B和C，或者A和B和C一起。另外，如上所述术语“基于”在上述说明书和权利要求书中的使用指的是“至少部分基于”因此还可以包括未记叙的特征或者元素。
这里所描述的主题内容可以被包括在根据理想结构的系统、仪器、方法和/或物品中。前述描述中阐明的实施方案不代表所有与这里描述的主题内容一种的实施方案。相反，他们仅仅是与本发明描述的主题内容有关的方面的一些实施例。尽管上面已经阐述了一些变化，但是可以进行其他修饰或者加成。尤其是，除了这里所阐述的那些，还可以提供进一步的特征和/或变化。例如，如上所述的实施方案可以指向这里所公开的特征和/或结合的不同的组合和变形，以及这里描述的一些特征的进一步变形。另外，在附图和/或这里所描述的逻辑流程不需要按照显示的具体顺序进行，或者连续进行，只要能实现理想的结果即可。其他实施方案也可以包括在下面权利要求的范围内。

Claims (99)

1.用于传递有效装载通过细胞质膜的方法，包括：
提供细胞群；并且
将所述细胞群与一定体积的水溶液接触，所述水溶液包括有效装载和醇类，浓度大于百分之5，
其中，所述体积是：(i)接触的细胞群表面积；或者(ii)细胞群的细胞数目的函数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，一定体积的水溶液以喷雾的形式被传递到细胞群。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每细胞6.0x10-7微升到每细胞7.4x10-4微升之间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每细胞9.3x10-6微升到每细胞2.8x10-5微升之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每细胞4.9x10-6微升到每细胞2.2x10-3微升之间。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积是大约每细胞1.9x10-5微升，其中，所述大约是10％以内。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述喷雾包括交替或者直接在1纳米到100微米之间的亚颗粒。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述颗粒的直径在30-100微米之间。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每平方微米接触表面积2.6x 10-9微升到每平方微米接触表面积1.1x10-6微升之间。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积在每平方微米接触表面积5.3x 10-8微升到每平方微米接触表面积1.6x10-7微升之间。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积是大约每平方微米接触表面积1.1x 10-7微升，其中，所述大约是10％以内。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，通过气体推动水溶液形成喷雾实现将细胞群与一定体积的水溶液相接触。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述喷雾包括尺寸为直径30-100微米的体积离散单元。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述喷雾包括尺寸为直径大约为30-50微米的体积离散单元，其中，所述大约是10％以内。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，总体积为20微升的水溶液被传递到大约1.9平方厘米的细胞占用面积中，其中，所述大约是10％以内。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，总体积为10微升的水溶液被传递到大约0.95平方厘米的细胞占用面积中，其中，所述大约是10％以内。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，将细胞群与所述水溶液接触0.1-10分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述缓冲液或者培养基包括磷酸缓冲盐水(PBS)。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群与水溶液接触2秒到5分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群与水溶液接触30秒到2分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。
21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞群与水溶液接触1到2分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水溶液包括乙醇，浓度为5-30％。
23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水溶液包括一种或者一种以上的75％到98％的H2O，2％到45％的乙醇，6到91mM的蔗糖，2到35mM的氯化钾，2到35mM的醋酸铵，和1到14mM的(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸)(HEPES)。
24.根据权利要求12所述的方法，其中，所述气体包括氮气、室内空气或者惰性气体。
25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群包括粘附细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述粘附细胞包括主要或者固定的间充质干细胞、肺细胞、神经细胞、纤维母细胞、人脐静脉血管内皮细胞和人胚胎肾细胞(HEK)中的至少一个。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群包括非粘附细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述非粘附细胞包括主要或者固定的造血干细胞(HSC)、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子-诱导的杀伤(CIK)细胞、人脐带血CD34+细胞、B细胞中的至少一种。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效装载包括小化学分子、肽或者蛋白质、或者核酸。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述小化学分子的分子量小于1000道尔顿。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述小化学分子包括MitoRedCMXRos、碘化丙啶、氨甲蝶呤、或者DAPI(4',6-二氨基-2-苯基吲哚)。
32.根据权利要求29所述的方法，其中，所述肽包括艾卡拉肽、利拉鲁肽和Icatiban。
33.根据权利要求29所述的方法，其中，所述核酸包括小干扰性RNA(siRNA)。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述siRNA分子的分子量大约为15000道尔顿。
35.根据权利要求29所述的方法，其中，所述蛋白的分子量大约是1,000-150,000道尔顿。
36.根据权利要求29所述的方法，其中，所述蛋白质包括抗体或其片段。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述抗体或其片段包括抗-肌动蛋白抗体、抗-GAPDH抗体、抗-Src抗体、抗-Myc抗体和抗-Raf抗体。
38.根据权利要求29所述的方法，其中，所述核酸分子的分子量大于5,000,000道尔顿。
39.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效装载包括治疗剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述治疗剂包括顺铂、阿司匹林、他汀、和氟西汀中的至少一个。
41.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效装载包括诊断剂。
42.根据权利要求1所述的方法，其中，所述诊断剂包括亚甲基蓝、专利蓝V，和吲哚菁绿中的至少一种。
43.根据权利要求1所述的方法，其中有效装载包括荧光分子。
44.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效装载包括可检测的纳米颗粒。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述纳米颗粒包括量子点。
46.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群是基本上交回的，其中，所述基本上是指大于75％的交回。
47.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群形成单层细胞。
48.用于将有效装载传递通过细胞质膜的组合物，所述组合物包括一种水溶液，所述水溶液含有有效装载、浓度大于百分之五的醇类、小于46mM的盐、小于121mM的糖和小于19mM的缓冲剂。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇和苯甲醇。
50.根据权利要求48所述的组合物，其中所述盐选自由NaCl,KCl,Na2HPO4,C2H3O2NH4,和KH2PO4所组成的组中。
51.根据权利要求48所述的组合物，其中所述糖包括蔗糖。
52.根据权利要求48所述的组合物，其中所述缓冲剂包括4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。
53.用于传递有效装载通过细胞质膜的仪器，所述仪器包括：
气动发生器，在压力下产生气体；
可操作的与气动发生器相连接的雾化器；
存储器，被配置为包含一定体积的水溶液，所述水溶液包括有效装载和浓度大于百分之五的醇类；并且
位于气动发生器和雾化器之间的阀门，所述阀门在关闭位置和开放位置之间转换，关闭状态可以防止一定压力下的气体激活雾化器，开放状态运气一定压力下的气体激活雾化器，从水溶液中产生胶体液滴，所述阀门的开关速度小于250毫秒；
其中，所述雾化器被设置成将水溶液与细胞群相接触，并且其中，所述体积是(i)接触的细胞群表面积；或者(ii)细胞群的细胞数目的函数。
54.根据权利要求53所述的仪器，其中所述仪器被配置为产生总体积在每细胞6.0x 10-7微升到每细胞7.4x 10-4微升之间的胶体液滴。
55.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述体积在每细胞9.3x10-6微升到每细胞2.8x10-5微升之间。
56.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述体积是大约1.9x10-5微升每细胞，其中，大约是在百分之十范围内。
57.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述体积在每平方微米接触表面积2.6x 10-9微升到每平方微米接触表面积1.1x10-6微升之间。
58.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述体积在每平方微米接触表面积5.3x 10-8微升到每平方微米接触表面积1.6x10-7微升之间。
59.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述体积是大约每平方微米接触表面积1.1x10-7微升，其中，所述大约是10％以内。
60.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述胶体液滴包括尺寸为直径30-100微米的体积离散单元。
61.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述喷雾包括尺寸为直径大约为30-50微米的体积离散单元，其中，所述大约是10％以内。
62.根据权利要求53所述的仪器，其中，总体积为20微升的水溶液被传递到大约1.9平方厘米的细胞占用面积中，其中，所述大约是10％以内。
63.根据权利要求53所述的仪器，其中，总体积为10微升的水溶液被传递到大约0.95平方厘米的细胞占用面积中，其中，所述大约是10％以内。
64.根据权利要求53所述的仪器，其中，将细胞群与所述水溶液接触0.1-10分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。
65.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述开关速度是阀门在关闭位置和开放位置之间转换的时间。
66.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述阀门的开关速度在50毫秒到200毫秒之间。
67.根据权利要求53所述的仪器，其中，当阀门处于开放位置时所述雾化器产生尺寸为直径30-100微米的胶体液滴。
68.根据权利要求53所述的仪器，其中，当阀门处于开放位置时所述雾化器产生尺寸为直径30-50微米的胶体液滴。
69.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述细胞群与水溶液接触0.1-10分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。
70.根据权利要求69所述的仪器，其中，所述缓冲液或者培养基包括磷酸缓冲盐水(PBS)。
71.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述细胞群与水溶液接触2秒或者5分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。
72.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述细胞群与水溶液接触2秒或者3分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。
73.根据权利要求72所述的仪器，其中，所述细胞与与喷雾接触1-2分钟，随后加入第二体积的缓冲液或者培养基浸没或者悬浮所述细胞群。
74.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述水溶液包括乙醇，浓度为10-30％。
75.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述水溶液包括一种或者一种以上的75％到98％的H2O，2％到45％的乙醇，6到91mM的蔗糖，2到35mM的氯化钾，2到35mM的醋酸铵，和1到14mM的(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸)(HEPES)。
76.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述细胞群包括粘附细胞。
77.根据权利要求76所述的仪器，其中，所述粘附细胞包括主要或者固定的间充质干细胞、肺细胞、神经细胞、纤维母细胞、人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和人胚胎肾细胞(HEK)中的至少一个。
78.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述细胞群包括非粘附细胞。
79.根据权利要求78所述的仪器，其中，所述非粘附细胞包括主要或者固定的造血干细胞(HSC)、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子-诱导的杀伤(CIK)细胞、人脐带血CD34+细胞、B细胞中的至少一种。
80.根据权利要求53所述的仪器，其中，有效装载包括小化学分子、肽或者蛋白、或者核酸。
81.根据权利要求80所述的仪器，其中，所述小化学分子的分子量小于1000道尔顿。
82.根据权利要求81所述的仪器，其中，所述化学分子包括MitoRedCMXRos、碘化丙啶、氨甲蝶呤、或者DAPI(4',6-二氨基-2-苯基吲哚)。
83.根据权利要求80所述的仪器，其中，所述肽包括艾卡拉肽、利拉鲁肽和Icatiban。
84.根据权利要求80所述的仪器，其中，所述核酸包括小干扰性RNA(siRNA)。
85.根据权利要求84所述的方法，其中，所述siRNA分子的分子量大约为15000道尔顿。
86.根据权利要求80所述的仪器，其中，所述蛋白的分子量大约是1,000-500,000道尔顿。
87.根据权利要求80所述的仪器，其中，所述蛋白质包括抗体或其片段。
88.根据权利要求87所述的仪器，其中，所述抗体或其片段包括抗-肌动蛋白抗体、抗-GAPDH抗体、抗-Src抗体、抗-Myc抗体和抗-Raf抗体。
89.根据权利要求80所述的仪器，其中，所述核酸分子的分子量大于5,000,000道尔顿。
90.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述有效装载包括治疗剂。
91.根据权利要求90所述的仪器，其中，所述有效装载包括顺铂、阿司匹林、他汀、和氟西汀中的至少一个。
92.根据权利要求53所述的仪器其中，所述有效装载包括诊断剂。
93.根据权利要求92所述的仪器，其中，所述诊断剂包括亚甲基蓝、专利蓝V，和吲哚菁绿中的至少一种。
94.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述有效装载包括荧光分子。
95.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述有效装载包括可检测的纳米颗粒。
96.根据权利要求95所述的仪器，其中，其中，所述纳米颗粒包括量子点。
97.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述细胞群是基本上交回的，其中，所述基本上是指大于75％的交回。
98.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述细胞群形成单层细胞。
99.根据权利要求53所述的仪器，其中，所述体积是在4.9x 10-6微升每细胞至2.2x 10-3微升每细胞之间。
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