JP2021007404A - 細胞原形質膜を越える送達方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞原形質膜を越えて薬剤を送達する方法の提供。【解決手段】細胞の集団を提供する段階;およびペイロードおよび5パーセント濃度超のアルコールを含むある体積の水溶液と細胞の集団を接触させる段階を含み、体積が、(i)細胞集団の曝露表面積;又は(ii)細胞集団中の細胞数の関数である、細胞の原形質膜を越えてペイロードを送達するための方法。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、2014年10月24日付で出願された英国特許出願第1419013.6号の優先権、2014年10月24日付で出願された英国特許出願第1419012.8号の優先権、および2014年10月24日付で出願された英国特許出願第1319011.0号の優先権を主張するものであり、それらの各々の内容全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。

技術分野
本願の主題は、細胞原形質膜に薬剤を送達することに関する。本願の主題は、例えば、細胞、組織または臓器のような標的部位に、分子的、生物学的および薬理学的治療剤を送達することを含みうる。

背景
いくつかの分野における技術的進歩にもかかわらず、ある種の分子の細胞への送達は、分子のサイズまたは電荷のような要因のために未だ課題である。原形質膜または細胞膜は、半透過性の生体膜であり、細胞の化学組成を調節する選択的障壁として作用する。それゆえ、ある種の分子のみが受動拡散により原形質膜を越えて細胞内に移行することができる。小さな疎水性分子(O₂、CO₂およびN₂のような)ならびに小さな非荷電極性分子(H₂Oおよびグリセロールのような)は、原形質膜を越えて受動的に拡散することができる。より大きな非荷電極性分子(アミノ酸、グルコースおよびヌクレオチドのような)ならびにイオン(H⁺、Na⁺、K⁺およびCl^-のような)は、細胞内に受動的に拡散することができない。

概要
本発明は、送達させたい化合物(例えば、ペイロード)および細胞膜を可逆的に透過化または溶解する薬剤を含有する溶液と細胞を接触させることにより、化合物または化合物の混合物(組成物)が真核細胞の細胞質内に送達されるという驚くべき発見に基づく。好ましくは、溶液は、例えば5種類の水性粒子の、噴霧液の形態で細胞に送達される。例えば、細胞は、噴霧液でコーティングされるが、送達化合物を含有する溶液に浸されずまたは浸漬されない。真核細胞膜を透過または溶解する例示的な薬剤としては、アルコールおよび界面活性剤、例えばそれぞれエタノールおよびトライトンX-100などが挙げられる。他の例示的な界面活性剤、例えば表面活性剤としては、ポリソルベート20(例えば、Tween 20)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート(CHAPSO)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)およびオクチルグルコシドが挙げられる。

コーティングされる細胞集団のコーティングを達成するための条件の例としては、微粒子噴霧液の送達が挙げられ、例えば、かなりの細胞集団がある体積の流体に浸されるまたは浸漬されるようなボーラス体積の水溶液を細胞に滴下またはピペッティングすることは、条件から除外される。したがって、ミストまたは噴霧液には、流体の体積と細胞体積とのある比率のものが含まれる。あるいは、条件には、ミストまたは噴霧液の体積と曝露される細胞面積、例えば、組織培養容器の底部、例えば組織培養プレート、例えばマイクロタイター組織培養プレートのウェルなどの実質的に平坦な表面上にコンフルエントなまたは実質的にコンフルエントな層として細胞が存在する場合に曝露される細胞膜の面積との比率が含まれる。

したがって、原形質膜を越えて細胞内に、生物学的に関連するペイロード、例えば、化合物または組成物を送達するための、ベクターを含まない、例えばウイルスベクターを含まない手法を提供する必要がある。「カーゴ」または「ペイロード」は、水溶液を介し細胞原形質膜を越えて細胞の内部に送達される化合物または組成物を記述するために用いられる用語である。

1つの局面において、細胞の原形質膜を越えてペイロードを送達することは、細胞の集団を提供すること、および細胞の集団をある体積の水溶液と接触させることを含む。水溶液は、ペイロードおよび5パーセント濃度超のアルコール含量を含む。水溶液の体積は、細胞集団の曝露表面積の関数であってもよく、または細胞集団中の細胞数の関数であってもよい。

別の局面において、細胞の原形質膜を越えてペイロードを送達するための組成物は、ペイロード、5パーセント濃度超のアルコール、46 mM未満の塩、121 mM未満の糖、および19 mM未満の緩衝剤を含んだ水溶液を含む。例えば、アルコール、例えばエタノール濃度は50%を超えない。

以下の特徴のうち1つまたは複数を、任意の実現可能な組み合わせで含めることができる。細胞に送達されるある体積の水溶液は、複数の単位、例えば、噴霧液、例えば、水性粒子の複数の小滴である。体積は、個々の細胞に対して、またはコンフルエントもしくは実質的にコンフルエント(例えば、少なくとも75%、少なくとも80%コンフルエント、例えば85%、90%、95%、97%、98%、100%コンフルエント)な細胞集団の曝露表面積に対して記述される。例えば、体積は、細胞あたり6.0×10^-7マイクロリットル〜細胞あたり7.4×10^-4マイクロリットルでありうる。体積は、細胞あたり4.9×10^-6マイクロリットル〜細胞あたり2.2×10^-3マイクロリットルである。体積は、細胞あたり9.3×10^-6マイクロリットル〜細胞あたり2.8×10^-5マイクロリットルでありうる。体積は細胞あたり約1.9×10^-5マイクロリットルであり得、約10パーセント以内である。体積は、細胞あたり6.0×10^-7マイクロリットル〜細胞あたり2.2×10^-3マイクロリットルである。体積は、曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり2.6×10^-9マイクロリットル〜曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり1.1×10^-6マイクロリットルでありうる。体積は、曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり5.3×10^-8マイクロリットル〜曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり1.6×10^-7マイクロリットルでありうる。体積は、曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり約1.1×10^-7マイクロリットルでありうる。約は10パーセント以内とすることができる。

細胞のコンフルエンシーは、表面上で互いに接触している細胞を指す。例えば、それは推定された(または計数された)割合として表すことができ、例えば、10%コンフルエンシーは、例えば組織培養容器の、表面の10%が細胞で覆われていることを意味し、100%は、それが完全に覆われていることを意味する。例えば、接着細胞は、組織培養ウェル、プレートまたはフラスコの表面上で二次元的に増殖する。非接着細胞はスピンダウンされ得、減圧、もしくは細胞集団の上部からの組織培地吸引によりプルダウンされ得、または容器の底部からの吸引もしくは真空除去により取り出され得る。

ある体積の水溶液と細胞の集団を接触させることは、水溶液をガス噴射して噴霧液を形成させることにより行うことができる。ガスは、窒素、周囲空気、または不活性ガスを含むことができる。噴霧液は、直径が1 nm〜100 μm、例えば30〜100 μmのサイズ範囲の、体積の不連続単位を含むことができる。噴霧液は、約30〜50 μmの直径を有する、体積の不連続単位を含む。20 μlの水溶液の全体積を、約1.9 cm²の細胞占有面積、例えば24ウェル培養プレートの1ウェルに噴霧液で送達することができる。10 μlの水溶液の全体積を約0.95 cm²の細胞占有面積、例えば48ウェル培養プレートの1ウェルに送達する。典型的には、前記水溶液は、細胞膜を越えて細胞内に送達させたいペイロードを含み、第二の体積は、ペイロードを含有しない緩衝液または培地である。あるいは、第二の体積(緩衝液または媒体)がペイロードを含有することもできる。いくつかの態様において、水溶液はペイロードおよびアルコールを含み、第二の体積はアルコールを含有しない(および任意でペイロードを含有しなくてもよい)。細胞の集団を0.1〜10分間前記水溶液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加することができる。緩衝液または培地は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)とすることができる。細胞の集団を2秒〜5分間前記水溶液と接触させた後に、細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加することができる。細胞の集団を30秒〜2分間例えばペイロードを含有する前記水溶液と接触させた後に、細胞の集団を浸漬または懸濁させるための例えばペイロードを有しない第二の体積の緩衝液または培地を添加することができる。細胞の集団を、約1〜2分間噴霧液と接触させた後に、細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加することができる。細胞への噴霧と緩衝液または培地の添加との間の時間中に、細胞は噴霧液体積からの水分の層によって水和されたままである。

水溶液は、5〜30%のエタノール濃度を含むことができる。水溶液は、75〜98%のH₂O、2〜45%のエタノール、6〜91 mMのスクロース、2〜35 mMのKCl、2〜35 mMの酢酸アンモニウム、および1〜14 mMの(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)のうち1つまたは複数を含むことができる。

細胞の集団は、接着細胞または非接着細胞を含むことができる。接着細胞は、初代間葉幹細胞、線維芽細胞、単球、マクロファージ、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍静脈(HUVEC)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞およびヒト胎児腎臓(HEK)細胞、または細胞株のような不死化細胞のうち少なくとも1つを含むことができる。細胞の集団は、非接着細胞を含むことができる。非接着細胞は、初代造血幹細胞(HSC)、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、サイトカイン誘導キラー(CIK)細胞、ヒト臍帯血CD34+細胞、B細胞、またはJurkatT細胞株のような細胞株のうち少なくとも1つを含むことができる。

ペイロードは、低分子量化学分子、ペプチドもしくはタンパク質、または核酸を含むことができる。低分子量化学分子は1,000 Da未満とすることができる。化学分子は、ミトトラッカー(登録商標)レッドCMXRos、ヨウ化プロピジウム、メトトレキサート、および/またはDAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)を含むことができる。ペプチドは約5,000 Daとすることができる。ペプチドは、エカランタイド(商品名カルビトール(Kalbitor)、遺伝性血管浮腫の処置用のおよび心臓胸部外科手術における失血阻止用の60アミノ酸のポリペプチド)、リラグルチド(ビクトーザ(Victoza)というブランド名で販売されており、II型糖尿病の処置のために用いられる、および肥満の処置用のサクセンダ(Saxenda))、ならびにイカチバント(Icatibant)(商品名フィラザイヤー(Firazyer)、遺伝性血管浮腫の急性発作の処置用ペプチド模倣体)を含むことができる。低分子干渉リボ核酸(siRNA)分子は、長さを、約20〜25塩基対とすることができ、または約10,000〜15,000 Daとすることができる。siRNA分子は、任意の遺伝子産物の発現を低減させることができ、例えば、臨床的に関連する標的遺伝子のまたはモデル遺伝子の遺伝子発現をノックダウンさせることができ、例えば、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) siRNA、GAPDH siRNA-FITC、サイクロフィリンB siRNA、および/またはラミンsiRNAである。タンパク質治療薬は、ペプチド、酵素、構造タンパク質、受容体、細胞タンパク質もしくは循環血中タンパク質、またはそれらの断片を含むことができる。タンパク質またはポリペプチドは約100〜500,000 Da、例えば、1,000〜150,000 Daとすることができる。タンパク質は、任意の治療用、診断用または研究用のタンパク質またはペプチド、例えば、β-ラクトグロブリン、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン(BSA)、および/または西洋ワサビペルオキシダーゼを含むことができる。他の例において、タンパク質は、がん特異的アポトーシスタンパク質、例えば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導タンパク質(TRAIL)を含むことができる。

抗体は一般的に、分子量が約150,000 Daである。抗体は、抗アクチン抗体、抗GAPDH抗体、抗Src抗体、抗Myc抗体(ab)、および/または抗Raf抗体を含むことができる。抗体は、緑色蛍光タンパク質(GFP)プラスミド、GLucプラスミド、およびBATEMプラスミドを含むことができる。DNA分子は、5,000,000 Da超とすることができる。いくつかの例において、抗体は、ネズミ由来のモノクローナル抗体、例えば、イブリツモマブチウキセタン、ムロモマブ-CD3、トシツモマブ、ヒト抗体、またはヒト化マウス(もしくは他の起源種)抗体とすることができる。他の例において、抗体はキメラモノクローナル抗体、例えばアブシキシマブ、バシリキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、またはリツキシマブとすることができる。さらに他の例において、抗体はヒト化モノクローナル抗体、例えばアレムツザマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、ゲンツズマブオゾガマイシン、トラスツズマブ、トシリズマブ、イピリムマブ、またはパニツムマブとすることができる。抗体は抗体断片、例えばアバタセプト、アフリベルセプト、アレファセプト、またはエタネルセプトを含むことができる。本発明は、インタクトなモノクローナル抗体だけでなく、免疫学的に活性な抗体断片、例えば、Fabもしくは(Fab)2断片; 操作された単鎖Fv分子; またはキメラ分子（例えば、一方の抗体、例えばネズミ由来の抗体の結合特異性部分と、もう一方の抗体、例えばヒト由来の抗体の残りの部分とを含む抗体）も包含する。

ペイロードは、治療剤を含むことができる。治療剤、例えば薬物または活性剤は、治療または診断の目的に有用な任意の化合物を意味することができ、この用語は、状態の処置のために患者に投与される任意の化合物を意味すると理解されることができる。したがって、治療剤は、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、および小分子を含むことができる。米国特許第7,667,004号(参照により本明細書に組み入れられる)に記述されている治療剤を、本明細書において記述される方法において用いることができる。治療剤は、シスプラチン、アスピリン、スタチン系薬剤(例えば、ピタバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、プロマジンHCl、クロルプロマジンHCl、チオリダジンHCl、硫酸ポリミキシンB、クロロキシン、ベンフルオレックスHClおよびフェナゾピリジンHCl)、ならびにフルオキセチンのうち少なくとも1つを含むことができる。ペイロードは、診断剤を含むことができる。診断剤は、メチレンブルー、パテントブルーV、およびインドシアニングリーンのうち少なくとも1つのような、検出可能な標識またはマーカーを含むことができる。ペイロードは、蛍光分子を含むことができる。ペイロードは、検出可能なナノ粒子を含むことができる。ナノ粒子は、量子ドットを含むことができる。

細胞の集団は、75パーセント超コンフルエントのような、実質的にコンフルエントとすることができる。細胞のコンフルエンシーは、表面上で互いに接触している細胞を指す。例えば、それは推定された(または計数された)割合として表すことができ、例えば、10%コンフルエンシーは、例えば組織培養容器の、表面の10%が細胞で覆われていることを意味し、100%は、それが完全に覆われていることを意味する。例えば、接着細胞は、組織培養ウェル、プレートまたはフラスコの表面上で二次元的に増殖する。非接着細胞はスピンダウンされ、減圧、もしくは細胞集団の上部からの組織培地吸引によりプルダウンされ、または容器の底部からの吸引もしくは真空除去により除去されうる。細胞の集団は細胞の単層を形成することができる。

アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールおよびベンジルアルコールから選択することができる。塩は、NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、およびC₂H₃O₂NHから選択することができる。糖は、スクロースを含むことができる。緩衝剤は4-2-(ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含むことができる。

本発明の主題は、原形質膜を越えて分子を送達するための方法に関する。本発明の主題は、細胞内送達の分野において有用性を見出し、例えば、細胞、組織または臓器のような標的部位への分子生物学的および薬理学的治療剤の送達において適用される。本発明の主題の方法は、分子を水性組成物に導入してマトリックスを形成させる段階; マトリックスを噴霧用に霧化する段階; およびマトリックスを原形質膜と接触させる段階を含む。

本発明の主題は、原形質膜を越えて分子を送達する際に用いるための組成物に関する。本発明の主題は、細胞内送達の分野において有用性を見出し、例えば、細胞、組織または臓器のような標的部位への分子生物学的および薬理学的治療剤の送達において適用される。本発明の主題の組成物は、アルコール; 塩; 砂糖; 緩衝剤; および酢酸アンモニウムを含む。

いくつかの実施形態において、分子および細胞型に左右されない、分子の細胞内送達を促進する透過化技法が実証されている。ナノ粒子、小分子、核酸、タンパク質および他の分子は、低細胞毒性で、初代細胞および幹細胞を含めて浮遊細胞または接着細胞にインサイチューで効率的に送達されることができ、この技法はハイスループットかつ自動化された、細胞に基づくアッセイ法と適合する。

本明細書において記述される実例の方法には、ペイロードが含まれ、ここでペイロードはアルコールを含む。用語「アルコール」とは、少なくとも1つの炭素原子に結合したヒドロキシル(-OH)官能基を含む多原子有機化合物を意味する。アルコールは一価アルコールであってもよく、少なくとも1個の炭素原子、例えばメタノールを含んでもよい。アルコールは少なくとも2個の炭素原子(例えばエタノール)を含んでもよい。他の局面において、アルコールは少なくとも3個の炭素(例えばイソプロピルアルコール)を含む。アルコールは少なくとも4個の炭素原子(例えば、ブタノール)、または少なくとも7個の炭素原子(例えば、ベンジルアルコール)を含んでもよい。実例のペイロードは50% (v/v)以下のアルコールを含んでもよく、より好ましくは、ペイロードは2〜45% (v/v)のアルコール、5〜40%のアルコール、および10〜40%のアルコールを含む。ペイロードは20〜30% (v/v)のアルコールを含んでもよい。

最も好ましくは、ペイロードは25% (v/v)のアルコールを含む。あるいは、ペイロードは2〜8% (v/v)のアルコール、または2%のアルコールを含むことができる。アルコールはエタノールを含んでもよく、ペイロードは5、10、20、25、30または40% (v/v)のエタノールを含む。実例の方法は、メタノールをアルコールとして含んでもよく、ペイロードは5、10、20、25、30または40% (v/v)のメタノールを含んでもよい。ペイロードは2〜45% (v/v)のメタノール、20〜30% (v/v)、または25% (v/v)のメタノールを含んでもよい。好ましくは、ペイロードは20〜30% (v/v)のメタノールを含む。さらにあるいは、アルコールはブタノールであり、ペイロードは2、4または8% (v/v)のブタノールを含む。

本発明の主題のいくつかの局面において、ペイロードは低張溶液または緩衝液中にある。ペイロード溶液は、171 mOsm/Lの浸透圧濃度を有しうる。実例の方法によれば、ペイロード溶液は、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度を有する。

本発明の主題によれば、ペイロードは、少なくとも1つの塩を含みうる。塩はNaCl、KCl、Na₂HPO₄、C₂H₃O₂NH₄およびKH₂PO₄から選択されうる。実例の方法によれば、ペイロードは、NaCl、KCl、Na₂HPO₄およびKH₂PO₄の各々を含む。ペイロードは、46 mM未満の塩を含みうる。さらに、ペイロードは、2〜35 mMの塩、または10〜15 mMの塩(例えば、12 mMの塩)を含む。実例の方法によれば、塩はKClであり、ペイロードは2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8または33.6 mM KCl、およびより好ましくは12 mM KClを含む。

本発明の主題の実例の方法によれば、ペイロードは、糖(例えば、スクロースまたは二糖類)含みうる。実例の方法によれば、ペイロードは、121 mM未満の糖、6〜91 mM、または26〜39 mMの糖を含む。さらに、ペイロードは、32 mMの糖(例えば、スクロース)を含む。任意で、糖はスクロースであってもよく、ペイロードは6.4、12.8、19.2、25.6、32、64、76.8または89.6 mMのスクロースを含んでもよい。

本発明の主題の実例の方法によれば、ペイロードは、緩衝剤(例えば弱酸または弱塩基)を含みうる。緩衝剤は両性イオンを含みうる。実例の方法によれば、緩衝剤は4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸である。ペイロードは、19 mM未満の緩衝剤(例えば、1〜15 mM、または4〜6 mMもしくは5 mMの緩衝剤)を含みうる。実例の方法によれば、緩衝剤は4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であり、ペイロードは1、2、3、4、5、10、12、14 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。さらに好ましくは、ペイロードは、5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。

本発明の主題の実例の方法によれば、ペイロードは、酢酸アンモニウムを含む。ペイロードは、46 mM未満の酢酸アンモニウム(例えば、2〜35 mM、10〜15 mM、または12 mMの酢酸アンモニウム)を含みうる。ペイロードは、2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8または33.6 mMの酢酸アンモニウムを含みうる。

本明細書において記述される方法は、68 mM NaCl、1.4 mM KCl、5 mM Na₂HPO₄および0.9 mM KH₂PO₄を含む第二のペイロード(例えば水溶液)が提供される、本発明の主題の第二の局面を含む。第二のペイロードのpHは、pH 7.4でありうる。

水溶液をガス噴射することにより行われるある体積の水溶液は、圧縮空気(例えば大気)を含むことができ、その他の実施形態では、不活性ガス、例えば、ヘリウム、ネオンおよびアルゴンを含むことができる。

本発明の主題のある種の局面において、細胞の集団は、接着細胞(例えば、肺、腎臓、マクロファージのような免疫細胞)または非接着細胞(例えば、浮遊細胞)を含みうる。

本発明の主題のある種の局面において、細胞の集団は、実質的にコンフルエントであり得、実質的には75パーセント超のコンフルエントを含みうる。好ましい実施形態において、細胞の集団は単一の単層を形成しうる。

実例の方法によれば、送達させたいペイロードは、最大20,000,000 Daの平均分子量を有する。いくつかの例において、送達させたいペイロードは、最大2,000,000 Daの平均分子量を有することができる。いくつかの実施形態において、送達させたいペイロードは、最大150,000 Daの平均分子量を有しうる。さらなる実施形態において、送達させたいペイロードは最大15,000 Da、5,000 Daまたは1,000 Daの平均分子量を有する。

細胞の原形質膜を越えて送達させたいペイロードは、低分子量化学分子、ペプチドもしくはタンパク質、多糖類または核酸またはナノ粒子を含みうる。低分子量化学分子は1,000 Da未満であり、ペプチドは約5,000 Daの分子量を有し、siRNAは15,000 Da前後の分子量を有し、抗体は約150,000 Daの分子量を有し、DNAは5,000,000 Da以上の分子量を有しうる。

実例の方法によれば、ペイロードは、3.0〜150.0 μMの送達させたい分子、より好ましくは、6.6〜150.0 μMの送達させたい分子(例えば3.0、3.3、6.6または150.0 μMの送達させたい分子)を含む。いくつかの実施形態において、送達させたいペイロードは、最大15,000 Daの平均分子量を有し、ペイロードは3.3 μMの送達させたい分子を含む。

実例の方法によれば、送達させたいペイロードは、最大15,000 Daの平均分子量を有し、ペイロードは6.6 μMの送達させたい分子を含む。いくつかの実施形態において、送達させたいペイロードは、最大1,000 Daの平均分子量を有し、ペイロードは150.0 μMの送達させたい分子を含む。

本発明の主題の局面により、送達させたいペイロードは、最大15,000 Daの平均分子量を有することが実現される。ペイロードは、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有し、かつ25% (v/v)のエタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; 12 mMの酢酸アンモニウム; および6.6 μMの送達させたい分子を含んだ水溶液を含みうる。

実例の方法によれば、送達させたいペイロードは、最大15,000 Daの平均分子量を有する。ペイロードは、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有する水溶液を含みうる; かつ20% (v/v)のメタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; 12 mMの酢酸アンモニウム; および6.6 μMの送達させたい分子を含む。

いくつかの実施形態において、送達させたい分子は、最大15,000 Daの平均分子量を有する。ペイロードは、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有する水溶液を含みうる; かつ25% (v/v)のメタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; 12 mMの酢酸アンモニウム; および6.6 μMの送達させたい分子を含む。

実例の方法によれば、送達させたいペイロードは、最大1,000 Daの平均分子量を有し、ペイロードは、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有する水溶液を含み; かつ25% (v/v)のエタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; 12 mMの酢酸アンモニウム; および150 μMの送達させたい分子を含む。

いくつかの実施形態において、送達させたい分子は、最大1,000 Daの平均分子量を有する。実例の方法によれば、ペイロードは、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有する水溶液を含みうる; かつ25% (v/v)のエタノール; 34 mMのNaCl、0.7 mMのKCl、2.5 mMのNa₂HPO₄および0.5 mMのKH₂PO₄; ならびに150.0 μMの送達させたい分子を含む。

送達させたいペイロードは、最大1,000 Daの平均分子量を有することができる。実例の方法によれば、ペイロードは、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有する水溶液を含むことができ; かつ2% (v/v)のブタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; 12 mMの酢酸アンモニウム; および150 μMの送達させたい分子を含むことができる。

本発明の主題のさらなる局面によれば、1を超える分子量の分子を原形質膜を越えて送達するための方法であって; 1を超える分子量の分子を水溶液に導入する段階; および水溶液を原形質膜と接触させる段階を含む、該方法が提供される。

いくつかの実施形態において、本方法は、第一の分子量を有する第一の分子および第二の分子量を有する第二の分子をペイロードに導入する段階を含み、ここで第一および第二の分子は異なる分子量を有してもよく、またはここで、第一および第二の分子は同じ分子量を有してもよい。実例の方法によれば、第一および第二の分子は異なる分子でありうる。

いくつかの実施形態において、送達させたいペイロードは、例えば、シスプラチン、アスピリン、さまざまなスタチン系薬剤(例えば、ピタバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、プロマジンHCl、クロルプロマジンHCl、チオリダジンHCl、硫酸ポリミキシンB、クロロキシン、ベンフルオレックスHClおよびフェナゾピリジンHCl)、ならびにフルオキセチンを含む、治療剤、または診断剤を含みうる。他の治療剤は、抗菌剤(アミノグリコシド(例えばゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン)、ペニシリン(例えば、アモキシシリン、アンピシリン)、糖ペプチド(例えば、アボパルシン、バンコマイシン)、マクロライド(例えば、エリスロマイシン、チルミコシン、タイロシン)、キノロン(例えば、サラフロキサシン、エンロフロキシン)、ストレプトグラミン(例えば、バージニアマイシン、キヌプリスチン・ダルホプリスチン)、カルバペネム、リポペプチド、オキサゾリジノン、シクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、パラアミノサリチル酸およびピラジンアミド)を含む。いくつかの例では、抗ウイルス薬(例えば、アバカビル、アシクロビル、エンフビルチド、エンテカビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル、オセルタミビル、ラルテグラビル、リトナビル、スタブジンおよびバラシクロビル)。治療法は、さまざまな疾患、例えば、がん、感染性疾患、血友病、貧血、多発性硬化症、およびB型肝炎またはC型肝炎の処置のためのタンパク質に基づく療法を含みうる。

さらなる例示的なペイロードはまた、メチレンブルー、パテントブルーV、およびインドシアニングリーンのような、検出可能なマーカーまたは標識を含むことができる。

本明細書において記述される方法はまた、検出可能な部分または検出可能なナノ粒子(例えば、量子ドット)を含むペイロードを含みうる。検出可能な部分は、蛍光分子または放射性物質(例えば、¹²⁵I)を含みうる。蛍光分子が適切な波長の光に曝露されると、その存在を蛍光によって検出することができる。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、p-フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。分子はまた、¹⁵²Euのような蛍光発光金属、またはランタニド系列の他のものを用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)のような金属キレート基を用いて分子に結合することができる。分子はまた、それを化学発光化合物にカップリングさせることによって検出可能に標識することができる。次いで、化学反応の間に生じる発光の存在を検出することによって、化学発光タグ付き分子の存在が確認される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル(theromatic acridinium ester)、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。

1つの局面において、本発明の主題は、固体支持体(例えば、ストリップ、ポリマー、ビーズ、またはナノ粒子)に結合された細胞について記述する。支持体または足場は、多孔性または非多孔性固体支持体でありうる。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロ(gabbro)およびマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の主題の目的のため、ある程度は可溶性か、または不溶性かのいずれかとすることができる。支持体材料は、事実上あらゆる可能な構造配置を有しうる。したがって、支持体配置は、ビーズのように球形であり、または試験管の内面もしくはロッドの外面のように円筒形でありうる。あるいは、表面は、シートまたは試験ストリップなどのような、平面でありうる。好ましい支持体は、ポリスチレンビーズを含む。

他の局面において、固体支持体は、細胞が化学的に結合され、固定され、分散され、または会合されているポリマーを含む。ポリマー支持体は、ポリマーのネットワークであってもよく、ビーズ形態で(例えば、懸濁重合により)調製されてもよい。そのような足場上の細胞は、足場の細胞質に所望の化合物を送達するために、本発明による水溶液を含有するペイロードを噴霧することができる。例示的な足場としては、ステントおよび他の移植可能な医療装置または構造が挙げられる。

本発明の主題はさらに、原形質膜を越えてのペイロードの送達のための機器、システム、技法および物品に関する。本発明の主題はまた、原形質膜を越えてタンパク質またはタンパク質複合体のようなペイロードを送達するための機器に関する。本主題は、細胞内送達の分野において有用性を見出すことができ、例えば、細胞、組織または臓器のような標的部位への分子生物学的および薬理学的治療剤の送達において適用される。

いくつかの実施形態において、原形質膜を越えてペイロードを送達するための機器は、少なくとも1つの霧化器エミッタを有する霧化器と、霧化器に対して配向された支持体とを含むことができる。本方法はさらに、原形質膜をペイロードと接触させる前にペイロードを霧化する段階を含む。

霧化器は、機械式霧化器、超音波霧化器、エレクトロスプレイ、噴霧器、およびベンチュリ管から選択することができる。霧化器は、市販の霧化器とすることができる。霧化器は、鼻腔内粘膜霧化装置とすることができる。霧化器は、米国ノースカロライナ州(NC, USA)のLMAテレフレックス(LMA Teleflex)から市販されている鼻腔内粘膜霧化装置とすることができる。霧化器は、米国ノースカロライナ州のLMAテレフレックスから市販されている鼻腔内粘膜霧化装置（カタログ番号MAD300）とすることができる。

霧化器は、原形質膜をペイロードと接触させる前に、30〜100 μmの直径を有する粒子のコロイド懸濁液を提供するように適合させることができる。霧化器は、30〜80 μmの直径を有する粒子のコロイド懸濁液を提供するように適合させることができる。霧化器は、50〜80 μmの直径を有する粒子のコロイド懸濁液を提供するように適合させることができる。

霧化器は、ガス貯蔵器を含むことができる。霧化器は、ガスが加圧下に維持されたガス貯蔵器を含むことができる。ガスは、空気、二酸化炭素、およびヘリウムから選択することができる。ガス貯蔵器は、固定された圧力ヘッド発生器を含むことができる。ガス貯蔵器は霧化器エミッタと流体連通することができる。ガス貯蔵器は、霧化器エミッタと流体連通することができるガスガイドを含むことができる。ガスガイドは、それを通してガスの通過を可能とするように適合させることができる。ガスガイドは、中空体を含むことができる。ガスガイドは、開口端部を有する中空体とすることができる。ガスガイドは、第一および第二の開口端部を有する中空体を含むことができる。ガスガイドは、第一および第二の反対側の開口端部を有する中空体とすることができる。第一の開口端部の直径は第二の開口端部の直径と異なることができる。第一の開口端部の直径は第二の開口端部の直径と異なることができる。第一の開口端部の直径は、第二の開口端部の直径よりも大きくてもよい。第一の開口端部は、ガス貯蔵器と流体連通することができる。第二の開口端部は、霧化器エミッタと流体連通することができる。

機器は、サンプル貯蔵器を含むことができる。サンプル貯蔵器は霧化器と流体連通することができる。サンプル貯蔵器は、霧化器エミッタと流体連通することができる。ガス貯蔵器およびサンプル貯蔵器は両方とも、霧化器エミッタと流体連通することができる。

機器は、サンプル貯蔵器とガス貯蔵器との間に設置されたサンプル弁を含むことができる。機器は、サンプル貯蔵器とガスガイドとの間に設置されたサンプル弁を含むことができる。サンプル弁は、サンプル貯蔵器からのサンプル流を調整するように適合させることができる。サンプル弁は、連続的または半連続的なサンプル流を可能とするように適合させることができる。サンプル弁は、半連続的なサンプル流を可能とするように適合させることができる。サンプル弁は、規定量の半連続的なサンプル流を可能とするように適合させることができる。サンプル弁は、0.5〜100 μLの半連続的なサンプル流を可能とするように適合される。サンプル弁は、10 μLの半連続的なサンプル流を可能とするように適合させることができる。サンプル弁は、0.065〜0.085 cm²の面積に1 μLの半連続的なサンプル流を可能とするよう適合させることができる。

霧化器および支持体は離間させることができる。支持体は、固体支持体を含むことができる。支持体は、サンプルウェルを含むプレートを含むことができる。支持体は、1、6、9、12、24、48、384および1536ウェルから選択されるサンプルウェルを含むプレートを含むことができる。固体支持体は、不活性材料から形成することができる。固体支持体は、プラスチック材料、または金属もしくは金属合金、あるいはそれらの組み合わせから形成することができる。支持体は、加熱素子を含むことができる。支持体は、抵抗素子を含むことができる。支持体は、機器に往復して搭載可能とすることができる。支持体は、機器に対して往復するように移動可能とすることができる。支持体は、霧化器に対して往復して移動可能とすることができる。支持体は、霧化器エミッタに対して往復して移動可能とすることができる。支持体は、霧化器に対して支持体を往復して移動させる支持体アクチュエータを含むことができる。支持体は、霧化器エミッタに対して支持体を往復して移動させる支持体アクチュエータを含むことができる。支持体は、霧化器エミッタの縦軸に対して支持体を往復して移動させる支持体アクチュエータを含むことができる。支持体は、霧化器エミッタの縦軸に対して支持体を横方向に往復して移動させる支持体アクチュエータを含むことができる。

噴霧域の縦軸は、ペイロードを送達させたい、支持体および/または支持体の円形ウェルの縦軸または中心点と同軸とすることができる。霧化器エミッタの縦軸は、支持体および/または支持体の円形ウェルの縦軸または中心点と同軸とすることができる。霧化器エミッタの縦軸、支持体の縦軸、および噴霧域の縦軸は、それぞれ同軸とすることができる。噴霧域の縦方向の長さは、噴霧域の円形基部(例えば、ペイロードを送達させたい細胞の面積)の直径より大きくてもよい(2倍より大きくてもよい)。

機器は、ガス貯蔵器と霧化器との間に設置された弁を含むことができる。弁は、電磁的に操作される弁とすることができる。弁は、電磁弁とすることができる。弁は、空気弁とすることができる。弁は、ガスガイドに設置することができる。弁は、ガスガイド内のガス流を調整するように適合させることができる。弁は、連続的または半連続的なガス流を可能とするように適合させることができる。弁は、半連続的なガス流を可能とするように適合させることができる。弁は、規定の時間間隔の半連続的なガス流を可能とするように適合させることができる。弁は、1秒の時間間隔の半連続的なガス流を可能とするように適合させることができる。機器は、少なくとも1つのフィルタを含むことができる。フィルタは、10 μm未満の細孔径を含むことができる。フィルタは、10 μmの細孔径を有することができる。フィルタはガスガイドに設置することができる。フィルタは、ガスガイドと流体連通することができる。

機器は、少なくとも1つの調節器を含むことができる。調節器は、電気調節器とすることができる。調節器は、機械調節器とすることができる。調節器は、ガスガイドに設置することができる。調節器は、ガスガイドと流体連通することができる。調節器は、調節弁とすることができる。ガスガイド内の圧力は、1.0〜2.0バールとすることができる。ガスガイド内の圧力は、1.5バールとすることができる。ガスガイド内の圧力は1.0〜2.0バールとすることができ、霧化器と支持体との間の距離は31 mm以下とすることができる。ガスガイド内の圧力は1.5バールとすることができ、霧化器と支持体との間の距離は31 mmとすることができる。ガスガイド内の圧力は、霧化器と支持体との間の距離1ミリメートルあたり0.05バールとすることができる。調節弁は、ガスガイド内の圧力を1.0〜2.0バールに調整するように適合させることができる。調節弁は、ガスガイド内の圧力を1.5バールに調整するように適合させることができる。調節弁または各調節弁は、ガスガイド内の圧力を1.0〜2.0バールに維持するように適合させることができる。調節弁または各調節弁は、ガスガイド内の圧力を1.5バールに維持するように適合させることができる。

機器は、2つの調節器を含むことができる。機器は、第一および第二の調節器を含むことができる。第一および第二の調節器は、ガスガイドに設置することができる。第一および第二の調節器は、ガスガイドと流体連通することができる。第一の調節器は、ガス貯蔵器とフィルタとの間に設置することができる。第一の調節器は、ガスガイド内のガス貯蔵器からの圧力を2.0バールに調整するように適合させることができる。第一の調節器は、ガスガイド内の圧力を2.0バールに維持するように適合させることができる。第二の調節器は、フィルタと弁との間に設置することができる。

霧化器エミッタは円錐形(conical)の噴霧域(例えば一般的に円錐形(circular conical)の噴霧域)を提供するように適合させることができる。霧化器エミッタは、30°の円錐形の噴霧域を提供するように適合させることができる。機器は、機器のいずれかまたは全ての部分を制御するためのマイクロプロセッサをさらに含むことができる。マイクロプロセッサは、サンプル弁、支持体アクチュエータ、弁、および調節器のいずれかまたは全てを制御するように構成することができる。機器は、少なくとも1つの霧化器エミッタを有する霧化器; および霧化器に対して配向された支持体を含むことができ; 霧化器は、機械式霧化器、超音波霧化器、エレクトロスプレイ、噴霧器、およびベンチュリ管から選択することができる。霧化器は、30〜100 μmの直径を有する粒子のコロイド懸濁液を提供するように適合させることができる。機器は、サンプル貯蔵器およびガスガイド、ならびにサンプル貯蔵器とガスガイドとの間に設置されたサンプル弁を含むことができる。サンプル弁は、10〜100 μLの半連続的なサンプル流を可能とするように適合させることができる。霧化器および支持体は、離間させることができ、その間に一般的に円錐形の噴霧域を規定することができ; 霧化器と支持体との間の距離は、分子を送達させたい細胞面積の円形基部の直径のおよそ2倍とすることができ; 霧化器と支持体との間の距離は、31 mmとすることができ、分子を送達させたい細胞面積の円形基部の直径は、15.5 mmとすることができる。機器はガスガイドを含むことができ、ガスガイド内の圧力は1.0〜2.0バールである。機器は、10 μm未満の細孔径を有する少なくとも1つのフィルタを含むことができる。

本明細書において記述される主題の1つまたは複数の変化形の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本明細書において記述される主題の他の特徴および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

これから添付の図面を参照して、本発明の主題の非限定的な態様を説明する。

本発明の主題による方法を実施するための機器の概略図である。 本発明の主題による方法を実施するための機器の斜視図である。 サンプルを1つまたは複数の標的細胞の細胞質に送達するためのコロイド液滴を生成するプロセスを示すプロセスフロー図である。 本発明の主題による、原形質膜を越えて最大15,000 Daの平均分子量を有する分子を送達することの効果を示すグラフである。 本発明の主題による、原形質膜を越えて最大1,000 Daの平均分子量を有する分子を送達することの効果を示すグラフである。 図6Aは、668 Daの平均分子量を有する分子の送達を示す顕微鏡写真である。図6Bは、40,000 Daの平均分子量を有する分子の送達を示す顕微鏡写真である。図6Cは、図6Aおよび6Bの重ね合わせを示す顕微鏡写真である; 668 Da (図6A)および40,000 Da (図6B)の平均分子量を有する分子の送達を示す。 本発明の主題による、原形質膜を越えて最大500,000 Daの平均分子量を有する分子を送達することの効果を示すグラフである。 本発明の主題による、68 mMのNaCl、1.4 mMのKCl、5 mMのNa₂HPO₄および0.9 mMのKH₂PO₄を含む第二の組成物と細胞を接触させる効果を示すグラフである。 本発明の主題による方法を用いてさまざまな分子量の分子を送達することを示す顕微鏡写真である。 最大15,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼす溶質含量の効果を示すグラフである。 最大15,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼすアルコール濃度の効果を示すグラフである。 最大15,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼすアルコール濃度の効果を示すグラフである。 最大15,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼす塩濃度の効果を示すグラフである。 最大1,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼすアルコール濃度の効果を示すグラフである。 最大1,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼすアルコール濃度の効果を示すグラフである。 最大1,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼすアルコール濃度の効果を示すグラフである。 24ウェルプレート中のA549細胞への、送達溶液200 μL中のペイロードの、マイクロピペットによる送達を示し、蛍光顕微鏡検査法によって観察した顕微鏡写真である。ヨウ化プロピジウム(PI)取り込みは細胞集団全体を通して見られたが、siRNA-FITCまたは10 kDaデキストランAlexa488の取り込みは明らかでなかった。全ての顕微鏡写真は倍率10倍で示されている。 24ウェルプレート中のA549細胞への、送達溶液20 μL中のペイロードの、マイクロピペットによる送達を示し、蛍光顕微鏡検査法によって観察した顕微鏡写真である。PIの取り込みは、いくつかのウェル域で明らかであったが、その他の領域では明らかでなかった。全ての顕微鏡写真は倍率10倍で示されている。 24ウェルプレート中のA549細胞への、送達溶液200 μLまたは20 μL中のペイロードの、マイクロピペットによる送達を示すグラフである。取り込み効率はフローサイトメトリー(5% m bar)によって測定し、毒性は溶解細胞の陽性対照と比較して乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出によって測定した。ペイロードが200 μl中で送達された場合、取り込みはフローサイトメトリーによって検出されたが、毒性レベルは高かった(40〜50%)。ペイロードが20 μl中で送達された場合、毒性は低減されたが、取り込みも低減され、一貫性がなかった; (n=3)。MP=マイクロピペット; PI=ヨウ化プロピジウム; Dex=10 kDaデキストラン-Alexa488; SBO=緩衝液のみ噴霧。 器具を示す画像である。細胞への送達溶液の噴霧による送達を可能にする器具を構築した。器具には、レトルトスタンドの適切な位置に保持された噴霧ヘッドに圧縮空気を送達する空気圧縮機を含めた。培養プレートを噴霧ヘッド下方のステージ上に配置した。 本発明の主題の実例の実施形態によるA549細胞への10 kDaデキストラン-Alexa488の送達を示す顕微鏡写真である。本主題の方法を用いて、10 kDaデキストラン-Alexa488のA549細胞への送達に成功した。取り込みは全細胞単層で明らかであった。顕微鏡写真では10倍の倍率を示す。 本主題の送達方法の効率および毒性を示すグラフである。10 kDaのデキストラン-Alexa488の50%超の送達効率のレベルが、A549細胞において達成された。毒性レベルは、未処理対照と同様であった。ペイロードを含有する送達溶液が培地にスパイクされた場合に、いくつかの陽性細胞も検出された(n=3)。 A549細胞における透過処理の時間経過を示す顕微鏡写真である。ペイロードの非存在下で送達溶液を噴霧し、続いてPIを噴霧後60分までの時点で培地に添加して透過化細胞を検出した。PI取り込みは噴霧後5分で可視化されたが、PI陽性細胞の数は噴霧後30分および60分までに実質的に低減された。顕微鏡写真では10倍の倍率を示す。 送達効率および細胞毒性に及ぼす噴霧ヘッドと細胞との間の距離の効果を示すグラフである。10 kDaのデキストラン-Alexa488をA549細胞に送達させた。噴霧ヘッドと細胞との間の距離を変化させた(21 mm、31 mmおよび41 mmを含めた)。31 mmの距離が、効率と毒性の両方に対して最適であった(n=3)。 送達効率および細胞毒性に及ぼす噴霧圧の効果を示すグラフである。10 kDaのデキストラン-Alexa488をA549細胞に送達させ、噴霧圧を変化させた(0.5バール、1.5バールおよび2.5バールを含めた)。1.5バールの圧力が、送達効率と細胞毒性の両方に対して最適であった(n=3)。 送達効率および細胞毒性に及ぼすある体積の送達溶液の効果を示すグラフである。10 kDaのデキストラン-Alexa488を48ウェルプレート中80〜90%コンフルエンシーのA549細胞に送達させ、送達溶液の体積を変化させた(5 μL、10 μLおよび20 μLを含めた)。体積10 μlが、送達効率と細胞毒性の両方に対して最適であった(n=3)。 送達効率および細胞毒性に及ぼすある体積送達溶液の効果を示すグラフである。10 kDaのデキストラン-Alexa488を48ウェルプレート中80〜90%コンフルエンシーのCHO細胞に送達させ、送達溶液の体積を変化させた(5 μL、10 μLおよび20 μLを含めた)。体積10 μlが、送達効率と細胞毒性の両方に対して最適であった(n=3)。 送達効率および細胞毒性に及ぼすエタノール濃度の効果を示すグラフである。10 kDaのデキストラン-Alexa488をA549細胞に送達させ、送達溶液中のエタノールの濃度を変化させた。25%の濃度が、効率と毒性の両方に対して最適であった(n=3)。 本主題の方法によって送達できる超高分子量のデキストラン(2,000 kDa)を含む、広範囲の分子サイズのデキストランの送達を示す顕微鏡写真である。顕微鏡写真は倍率10倍を示す。 本主題の方法によって送達できる全長抗体を含む、広範囲の分子サイズの分子の送達を示す顕微鏡写真である。顕微鏡写真は倍率10倍を示す。 A549細胞への4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、ミトトラッカーレッドCMXRosおよびファロイジン-Alexa488の同時送達の効果を示す顕微鏡写真である。 A549細胞への10 kDaデキストラン-Alexa488およびDAPIの両方の同時送達の効果を示す顕微鏡写真である。顕微鏡写真は倍率10倍を示す。 A549細胞にスプレイフェクション(sprayfect)されたGFP mRNAの送達の効果を示す顕微鏡写真である。蛍光顕微鏡検査法によってGFPタンパク質発現を観察した。顕微鏡写真は倍率10倍を示す。 本主題の例示的な方法を用いてルシフェラーゼmRNAがA549細胞に送達された場合のルシフェラーゼの発現の定量化(発光分析(luminometry)による)を示す棒グラフである。 A549細胞にスプレイフェクション(sprayfect)されたpGFPプラスミドDNAの送達の送達効果を示す顕微鏡写真である。蛍光顕微鏡検査法によってGFPタンパク質の発現を観察した。顕微鏡写真は倍率10倍を示す。 本主題の例示的な方法を用いてpGlucプラスミドDNAがA549細胞に送達された場合のルシフェラーゼの発現の定量化(発光分析による)を示す棒グラフである。 10 kDaのデキストラン-Alexa488が初代線維芽細胞に送達された場合の効果を示す顕微鏡写真である。蛍光顕微鏡検査法により線維芽細胞においてデキストランが可視化された。倍率10倍を示す。 フローサイトメトリーおよびLDHアッセイ法によりそれぞれ定量化した場合の、初代線維芽細胞に送達された10 kDaデキストランAlexa488の送達の効率および毒性の効果を示す棒グラフである。 10 kDaのデキストラン-Alexa488が間葉幹細胞(MSC)に送達された場合の効果を示す顕微鏡写真である。デキストランは蛍光顕微鏡検査法によりMSCにおいて、倍率10倍で可視化された。 フローサイトメトリーおよびLDHアッセイ法によりそれぞれ定量化した場合の、MSCに送達された10 kDaデキストランAlexa488の送達の効率および毒性の効果を示す棒グラフである。 図41Aは、U226ヒト多発性骨髄腫細胞へのsiRNA (上パネル)、BSA (中パネル)、およびOVA (下パネル)の送達の効果を示す顕微鏡写真である。図41Bは、Jurkat細胞へのDAPI (上パネル)およびミトトラッカーレッド(中パネル)の送達の効果を示す顕微鏡写真である。さらに、緑色蛍光タンパク質(GFP)のmRNAをJurkat細胞に送達し、送達後24時間でGFP発現が観察された。 フローサイトメトリーおよびLDHアッセイ法によりそれぞれ定量化した場合の、U226ヒト多発性骨髄腫細胞へのsiRNA (上パネル)、BSA (中パネル)、およびOVA (下パネル)の送達効率および細胞毒性の効果を示す棒グラフである。 チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へのタンパク質送達の効果を示す顕微鏡写真である。β-ラクトグロブリン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン(BSA)、カタラーゼおよびアポフェリチンを含めて、広範囲のタンパク質をFITCで標識し、CHO細胞に送達した。 本主題の例示的な方法によるCHO細胞への広範囲のタンパク質の送達の効率を示すグラフである。フローサイトメトリーによって効率を定量化した。 CHO細胞に送達されたオボアルブミン-FITCの免疫蛍光検出を示す顕微鏡写真である。オボアルブミン-FITCのCHO細胞への送達を、抗オボアルブミン抗体を用いた免疫蛍光によって確認した。 β-ラクトグロブリンのCHO細胞への送達に対する用量応答を示すグラフである。本主題の方法によってCHO細胞に送達されるβ-ラクトグロブリン-FITCの濃度が増加すると、送達効率の増加が見られた(n=3)。 細胞に送達されたHRPの活性および局在を示す顕微鏡写真である。Alexa488標識チラミド基質を用いて、本主題の方法によるHRPの送達後のCHO細胞におけるHRPの活性および局在を実証した。 CHO細胞に送達されるHRPの用量増加によって検出された蛍光DCF産物の産生増加を示す棒グラフである。 LDH分析によりアッセイ法が細胞に対して有毒ではないことが実証されたことを示す棒グラフである。 研究を追跡するためのQ-ドットによるMSCの標識化を示す顕微鏡写真である。初代MSCはインビトロでQ-ドット625とともに送達された。 研究を追跡するためのQ-ドットによるMSCの標識化を示す顕微鏡写真である。MSCをエクスビボでマウス脾臓に注射した。Cryovis器具を用いてQ-ドット蛍光を分析した。 本主題の実例の実施形態によって細胞あたりに送達されるおおよその体積を示す表である。 曝露される細胞表面積の1平方マイクロメートルあたりに送達されるおおよその体積を示す表である。 いくつかの細胞型のおおよその平均的性質を示す表である。 3つの異なる細胞株(A549、CHOおよびMCS)の実験的に計算され測定された面積を示す表である。 図56Aは、ピペットを用いて適用されたある体積の水溶液を有するウェルを図解する断面図である。図56Bは、噴霧技法によって適用されたある体積の水溶液を有するウェルを図解する断面図である。

各種図面における同様の参照記号は同様の要素を示す。

詳細な説明
本発明の主題は、原形質膜を越える、ペイロードの、ベクターを含まない(例えば、ウイルスベクターを含まない)送達法を提供する。詳細には、材料の細胞内送達は、アルコールおよび送達材料(例えば、ペイロード)を含む水溶液と細胞(および/または細胞の集団)を接触させることにより達成できることが発見された。アルコールは、膜を透過化し、膜を越えてペイロードを移行可能とするように作用する。しかし、細胞と接触する水溶液の体積が大きすぎる場合、および/または曝露が非常に長い時間行われる場合には、細胞に対する永続的または重篤な(例えば、不可逆的な)損傷が起こりうる(細胞生存に悪影響を与えうる)。逆に、細胞と接触する水溶液の体積が小さすぎる場合、および/または曝露が非常に短い時間行われる場合には、材料の細胞内送達は達成されない。したがって、細胞生存を維持しながら原形質膜を越えてのペイロードの送達を達成するために、適切な体積の水溶液を適用することができ、および/または曝露の長さを制御することができる。

細胞の集団に接触される水溶液の適切な体積は、意図された用途に基づき、例えば、集団中の細胞の数(例えば、その関数)、曝露される細胞表面積、細胞サイズ、水溶液の構成、ペイロード、水溶液を細胞の集団に接触させる技法などに基づき、変化しうる。いくつかの実施形態において、水溶液の体積は、細胞あたり6.0×10^-7〜7.4×10^-4マイクロリットルとすることができる(さらなる範囲が本明細書の他の箇所に記述されている)。これらの範囲は、実質的に単層に配置された細胞の集団を有する48ウェルプレート中のウェルに0.5マイクロリットル〜100マイクロリットルの水溶液を送達することに対応する(細胞はそれぞれ、30マイクロメートルおよび15マイクロメートルの平均直径を有する)。水溶液の体積は、細胞集団の曝露表面積1平方マイクロメートルあたり2.6×10^-9〜1.1×10^-6マイクロリットルとすることができる(さらなる範囲が本明細書の他の箇所に記述されている)。これらの範囲は、それぞれ、実質的に単層に配置された細胞の集団を有する、24ウェルプレートおよび48ウェルプレート中のウェルに0.5マイクロリットル〜100マイクロリットルの水溶液を送達することに対応する。

細胞の集団を水溶液と接触させるための技法は、変化させることができる。例えば、水溶液は、細胞の集団上にピペッティングすることができる(例えば、細胞がウェル内に配置される場合)。例えば、図56Aは、マイクロピペットを用いてある体積の水溶液が適用された、細胞の単層を有するウェルを示す断面図である。水溶液がこのように適用されると、水溶液はウェルの面積一面に不均等に分配されることがあり、その結果、ウェルの中心近く(5605で示した領域)に位置する細胞は死滅する一方で、ウェルの外縁近く(5615で示した領域)に位置する細胞は生存可能だが、ペイロードの取り込みを示さない。内側領域と外側領域(それぞれ5605と5615)との間の領域5610中の細胞は、ペイロードの取り込みを有効かつ確実に示しながら生存可能である。

いくつかの実施形態において、水溶液は細胞の集団上に噴霧される。例えば、図56Bは、噴霧技術によってある体積の水溶液が適用されたウェルを示す断面図である。噴霧液は、ウェルの面積(5620で示した領域)一面に水溶液を均等に分配することができる。このように(および本明細書においてさらに詳細に記述されるように)処理された細胞は、細胞膜を越えての、細胞の細胞質へのペイロードの取り込みを有効かつ確実に示しながら生存可能である。噴霧は、制御された様式で細胞の集団を水溶液と接触させるための手段を提供することができ、ペイロードの送達の効率を改善し、細胞生存を改善することが示された。噴霧は、サイズが異なる、体積の不連続単位(例えば、液滴)を作製するように制御することができる。例えば、ある実施形態において、体積の不連続単位は、直径が30〜100 μmのサイズ範囲である。他のサイズも可能であり、いくつかの変化形が本明細書の他の箇所に記述されている。

細胞の集団と水溶液(ペイロード含有)との接触は一時的とすることができる。換言すれば、水溶液が細胞の集団と接触する時間の長さを、変化させることができる。例えば、曝露時間の長さは、少なくとも6秒、12秒、30秒などとすることができる。他の時間の長さも可能であり、いくつかの変化形が本明細書の他の箇所に記述されている。水溶液への細胞の過剰曝露は、より低い細胞生存をもたらしうるので、細胞の集団を水溶液に曝露した後で緩衝液または培地で洗浄することができる。緩衝液は、ペイロードを含んでもまたは含まなくてもよい。緩衝液はアルコール不含でありうる。細胞の集団を浸漬または懸濁するために、細胞を緩衝液または培地で洗浄することができる。いくつかの実施形態において、ガスを細胞に吹き付けて細胞との接触から水溶液を押し出してもよいが、ガスへの細胞の過剰曝露は細胞を脱水させ、細胞生存を低下させうる。

水溶液は、H₂O、アルコールおよびペイロードを含むことができる。アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールまたはベンジルアルコールを含むことができる。水溶液はまた、糖、塩および緩衝剤のうち1つまたは複数を含むことができる。塩は、NaCl、KCl、Na₂HPO₄およびKH₂PO₄から選択することができる。糖は、二糖類(例えば、スクロース)を含みうる。緩衝剤は、弱酸または弱塩基を含み、両性イオン(例えば、(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(hepes))でありうる。水溶液はまた、酢酸アンモニウムを含むことができる。例えば、水溶液は、例えば、Medepalliら(Medepalli, K., et al., Nanotechnology 2013; 24:20, 参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)により記述されているように、低張緩衝液、130 mMのスクロース、50 mMの塩化カリウム、50 mMの酢酸カリウム、20 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(hepes), pH 7.4である。いくつかの例では、緩衝液を改変して、酢酸カリウムを酢酸アンモニウムに置き換える。いくつかの例では、ペイロード送達に用いられる緩衝液は、サポニンを含んでいない。

水溶液の成分は、細胞の原形質膜を破壊し、原形質膜を越えて、より大きな生体分子を導入することを可能にする働きをすることができる。例えば、アルコールは原形質膜内で脂質を溶解し、界面活性剤は原形質膜内に細孔を作製し、酵素はタンパク質を消化して原形質膜内に細孔を作製する。

ペイロードは、細胞の細胞質内に、ならびに特定の細胞器官(例えば、核およびミトコンドリア)に送達されることができる。ペイロードは、送達に適した、および/または送達を意図した任意の分子を含むことができる。ミトコンドリアを標的とする分子は、がんのようないくつかの疾患において有益であり、このような分子の送達は、エネルギー生成およびアポトーシスを含むミトコンドリアの機能に関連することができる。例えば、蛍光標識された(例えば、タグ付けされた)分子を用いて、ミトコンドリア成分、ミトコンドリア透過性転移(MPT)を標的とする分子(例えば、透過性遷移孔複合体(PTPC)開口の内在性阻害剤を枯渇させる化学的阻害剤またはペプチド)、ミトコンドリア透過性転移(MPT)を誘発する低分子量化学分子、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ(ANT)を調節するリガンド、活性酸素種(ROS)の過剰産生を誘導する化合物、がん細胞の高血糖状態を逆転させる分子、がん細胞を刺激して細胞死の誘導につなげる分子などの存在および位置を視覚化することができる。

ペイロードは、低分子量化学分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子、抗体、およびDNA(例えばプラスミドDNA)を含むことができるが、これらに限定されることはない。例示的な低分子量化学分子としては、3 kDaデキストラン、40 kDaデキストラン、70 kDaデキストランもしくは500 kDaデキストランを含めて、最大2,000,000 Daの漸増サイズのデキストラン、ヨウ化プロピジウム、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、ファロトキシン、ミトトラッカーレッドまたはそれらの任意の組み合わせ(例えば、ミトトラッカーレッドは、10 kDaデキストラン-Alexa488およびDAPIと同様に、ファロトキシンと同時送達することができる)、メトトレキサートが挙げられる。例示的なペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質またはその断片としては、β-ラクトグロブリン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、カタラーゼおよびアポフェリチンを含めて、最大500 kDaの漸増サイズのタンパク質が挙げられる。例示的なペプチドとしては、エカランチド、リラグルチドおよびイカチバントが挙げられうる。例示的な核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)のようなポリヌクレオチド、および適切な場合にはリボ核酸(RNA)を指し得る。この用語はまた、等価体、ヌクレオチド類似体から作製されたDNAまたはRNAのいずれかの類似体を含み、本発明の主題に適用できる場合、一本(センスまたはアンチセンス)および二本鎖ポリヌクレオチドでありうる。さらなる核酸の例としては、siRNA分子(例えば、GAPDH siRNA-FITC)、サイクロフィリンB siRNA、もしくはラミンsiRNA分子)、二本鎖核酸分子、例えば二本鎖RNA分子、一本鎖核酸分子、または単離された核酸分子)を挙げることができる。本主題の実例のDNAペイロードは、5,000,000 Da以上のDNAサンプル(例えば、pGFP、pGLuc、およびpBATEM)を含む。本発明の主題の例示的な抗体としては、抗アクチン抗体、抗GAPDH (グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ)抗体、抗Src (がん原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼSrc)抗体、抗Myc抗体または抗Raf抗体を挙げることができる。本発明の抗体は、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体とすることができる。本発明の主題は、インタクトなモノクローナル抗体だけでなく、抗体断片、例えば、Fabもしくは(Fab)2断片; 操作された単鎖FV分子; またはキメラ分子、例えば、一方の抗体の、例えばネズミ由来の抗体の、結合特異性、およびもう一方の抗体の、例えばヒト由来の抗体の、残りの部分を含む抗体も包含することができる。抗体はヒト化抗体であってもよく、ここで抗体は非ヒト種由来であり、そのタンパク質配列が、ヒトにおいて天然に産生される抗体変種とのその類似性を高めるように改変されている。一般に、ヒト化抗体はそれに、ヒト以外のものである供給源から導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、本明細書において「移入(import)」残基といわれ、これは典型的には「移入」抗体ドメイン、特に可変ドメインから得られる。

細胞の集団は、培養プレートの増殖表面積上にコンフルエント(例えば、75%コンフルエント)な単層を形成するように増殖する接着細胞を含みうる。接着細胞は、原核生物であろうと真核生物であろうと、細胞、細胞株および細胞系を指すことができる。接着細胞として増殖することができる細胞の例は、肝臓または肝臓由来のもの(例えば、初代肝細胞および肝上皮細胞)、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、間葉細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、がん由来細胞、骨髄細胞、ランゲルハンス島、副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、Tリンパ球、ニューロン、グリア細胞、神経節細胞、網膜細胞、肺細胞(例えば、A549細胞)、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈細胞(HUVEC)、線維芽細胞、卵巣細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞)、胎児腎臓細胞(例えば、ヒト胎児腎臓細胞)、および筋芽細胞である。幹細胞(例えば、初代間葉幹細胞、神経幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、マウス胚性幹細胞、およびヒト胚性幹細胞)も用いることができる。

細胞の集団はまた、非接着(例えば、浮遊)細胞を含むことができる。例示的な非接着細胞としては、幹細胞(例えば、造血幹細胞)、前駆細胞(例えば造血前駆細胞)、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、サイトカイン誘導キラー(CIK)細胞、ヒト臍帯血CD34+細胞、B細胞およびJurkat細胞が挙げられる。

本明細書において記述されるように、細胞の集団は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC), Celeromics Technologiesおよび他の分子生物学の参考文献で特定されるように、計算されたその直径に基づいたサイズ(例えば、小、中および大)によって記述されている。本明細書においておよび非限定的な形で言及されるように、いくつかの例では、小細胞(例えば、脾細胞または小ニューロン)は最大10 μmの直径を有し、中細胞(例えば、A549細胞、CHO細胞またはMCF7細胞)は10 μm〜20 μmの直径を有し、大細胞(例えば、K562細胞およびMSC)は20 μm超の直径を有する。一般に、分類(範囲)は限定することを意味するものではなく、実験条件は細胞の測定直径に影響を与えうる。

いくつかの実施形態において、細胞の集団は、噴霧され得る(または別の技法を用いて細胞にペイロードを送達できる)三次元の足場上に位置することができる。三次元の足場は、エクスビボまたはインビボで用いるためでありうる。本主題の他の局面は、エクスビボまたはインビボで適用できることも企図される。

曝露表面積および細胞数の関数としての体積の算出
本明細書においてさらに十分に記述されるように、48ウェルプレートのウェル中のA549細胞へのペイロードの効率的な送達は、噴霧技法によって細胞の集団に水溶液10 μLを接触させ、およそ2分後に緩衝溶液とともに細胞をインキュベートすることによって達成された。しかしながら、送達は、48ウェルプレートのウェル中のさまざまなタイプの細胞に水溶液0.5 μL〜100 μLを接触させることにより、例えば、細胞の集団に水溶液0.5 μL、5 μL、10 μL、15 μLまたは100 μLを接触させることにより達成することができる。しかし、送達は、48 (または24)ウェルプレート中のウェルを用いることに限定されず、その代わりに、細胞の集団と接触させたい水溶液の体積は、曝露される細胞表面積および/または集団中の細胞数の関数とすることができる。例えば、細胞あたりに送達する水溶液の体積を算出するため、以下に、細胞あたりにおよび曝露される細胞表面積1マイクロメートルあたりに送達される体積を計算する非限定的な実例の方法を記述する。

例示的な接着細胞は、約10〜30 μmの平均直径を有する。例えば、A549細胞は、15 μm (0.015 cmに相当)の平均直径を有する。したがって、A549細胞の平均面積は約1.8×10^-6 cm²である。標準の48ウェル細胞培養プレートの単一ウェルの面積は、0.95 cm²の増殖面積を含む。したがって、100%コンフルエントと仮定して、15 μmの直径を有する細胞(例えば、A549細胞)の数は、およそ約500,000〜500,500個の細胞(例えば、537,691個の細胞)である。一例として、ウェルあたり水溶液10 μLが送達されると、水溶液およそ1.9×10^-5 μLが各細胞(例えば、A549細胞)に送達されたことになる。したがって、細胞あたり約1.9×10^-5マイクロリットルが細胞の集団と接触したことになる。水体積(aqueous volume) (例えば、0.5 μL、5 μL、10 μL、15 μLおよび100 μL)およびさまざまな細胞サイズ(例えば、およそ30 μm (MSC)、およそ15 μm (A549細胞)およびおよそ10 μm (U266細胞))を用いて、細胞あたりに送達された水体積の範囲を算出した。これらのおよび追加の実例値は、図52および図53に示されている。

曝露表面の関数としての送達体積の例示的な計算は細胞の集団のものであるので、細胞培養プレートの増殖面積を利用した。24ウェルプレートの単一ウェルの表面積は、19000 μm² (48ウェルプレートでは9500 μm²、および96ウェルプレートでは3200 μm²)である。0.5 μL、5 μL、10 μL、15 μLおよび100 μLを含む水体積を用いて、1ウェルあたりに送達される水体積の範囲を算出した。したがって、1平方マイクロメートルあたりに送達される水溶液の体積(例えば、ウェルあたり10 μL)は、24ウェルプレートではウェルあたり5.3×10^-4 μL、48ウェルプレートではウェルあたり1.1×10^-3 μLおよび96ウェルプレートではウェルあたり3.1×10^-3 μLを含む。これらのおよび追加の実例値は、図52に示されている。いくつかの実例細胞の特性を示す追加の表は、図53に示されている。

水溶液および送達
水溶液(本明細書において組成物ともいわれる)は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールおよびベンジルアルコールから選択されるアルコールを含む。組成物は、50% (v/v)以下のアルコールを含むことができる。ある種の態様において、アルコールはエタノールであり、組成物は5、10、20、25、30または40% (v/v)のエタノールを含む。あるいは、アルコールはメタノールであり、組成物は5、10、20、25、30または40% (v/v)のメタノールを含む。さらに、アルコールはブタノールであってもよく、組成物は2、4または8% (v/v)のブタノールを含む。好ましい態様において、組成物は、アルコールを含む水溶液である。組成物は好ましくは低張であり、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有し、NaCl、KCl、Na₂HPO₄およびKH₂PO₄から選択される少なくとも1つの塩を含む。好ましい態様において、塩はKClであり、組成物は2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8、または33.6 mM KClを含む。組成物は、スクロースでありうる糖を含むことができ、組成物は6.4、12.8、19.2、25.6、32、64、76.8または89.6 mMのスクロースを含むことができる。そのような好ましい態様において、組成物は、弱酸または弱塩基から選択できる緩衝剤をさらに含む。好ましい態様において、緩衝剤は4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であり、組成物は1、2、3、4、5、10、12、14 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。さらに、組成物は酢酸アンモニウム、例えば、2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8または33.6 mMの酢酸アンモニウムを含むことができる。

本発明の方法は、最大150,000 Daの平均分子量、最大15,000 Daの平均分子量、最大5,000 Daの平均分子量、および/または最大1,000 Daの平均分子量のような、最大2,000,000 Daの平均分子量を有する分子を送達するために用いることができる。

本方法の導入段階は、送達させたい3.0〜150.0 μMの分子、任意で3.3〜150.0 μM、さらに任意で送達させたい6.6〜150.0 μMの分子を導入する段階を含むことができる。任意で、本方法の導入段階は、送達させたい3.0、3.3、6.6、または150.0 μMの分子を導入する段階を含んでもよい。送達させたい分子が最大15,000 Daの平均分子量を有する場合、導入段階は、送達させたい3.3 μMの分子、あるいは送達させたい6.6 μMの分子を導入する段階を含むことができる。あるいは、送達させたい分子が最大1,000 Daの平均分子量を有する場合、導入段階は、送達させたい150 μMの分子を導入する段階を含む。導入段階において導入される分子の量を選択することができる。

ある種の態様において、送達させたい分子は、最大15,000 Daの平均分子量を有し; 本方法は、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有し、かつ25% (v/v)のエタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; および12 mMの酢酸アンモニウムを含んだ水溶液を含む組成物に、送達させたい6.6 μMの分子を導入する段階を含む。

別の態様において、送達させたい分子は、最大15,000 Daの平均分子量を有し、本方法は、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有し、かつ20% (v/v)のメタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; および12 mMの酢酸アンモニウムを含んだ水溶液を含む組成物に、送達させたい6.6 μMの分子を導入する段階を含む。

送達させたい分子が最大1,000 Daの平均分子量を有する場合、本方法は、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有し、かつ25% (v/v)のエタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; および12 mMの酢酸アンモニウムを含んだ水溶液を含む組成物に、送達させたい150 μMの分子を導入する段階を含むことができる。

別の態様において、本方法は、送達させたい分子が最大1,000 Daの平均分子量を有する場合、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有し、かつ20% (v/v)のメタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; および12 mMの酢酸アンモニウムを含んだ水溶液を含む組成物に、送達させたい150 μMの分子を導入する段階を含む。

送達させたい分子が最大1,000 Daの平均分子量を有する場合、本方法は、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有し、かつ2% (v/v)のブタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; および12 mMの酢酸アンモニウムを含んだ水溶液を含む組成物に、送達させたい150 μMの分子を導入する段階を含むことができる。

1つの態様において、送達させたい分子は、最大1,000 Daの平均分子量を有し、本方法は、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有し、かつ25% (v/v)のエタノール; 34 mMのNaCl、0.7 mMのKCl、2.5 mMのNa₂HPO₄および0.5 mMのKH₂PO₄を含んだ水溶液を含む組成物に、送達させたい150 μMの分子を導入する段階を含む。

実例の方法によれば、送達させたい分子は最大1,000 Daの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、組成物はアルコールを含み、少なくとも2個の炭素原子(例えばエタノール)を含みうる。組成物は、2〜45% (v/v)のアルコール、任意で20〜30% (v/v)のアルコール(例えば25% (v/v)のアルコール)を含みうる。さらに任意で、組成物は、2〜45% (v/v)のエタノール、20〜30% (v/v)のエタノール、および25% (v/v)エタノールを含んでもよい。好ましくは、組成物は20〜30% (v/v)のエタノールを含む。組成物は、溶液(例えば、水溶液)とすることができる。いくつかの実施形態において、組成物は、任意で室温で、171 mOsm/Lの浸透圧濃度を有する。好ましくは、組成物は室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度を有する。いくつかの実施形態において、組成物は、NaCl、KCl、Na₂HPO₄およびKH₂PO₄から選択される少なくとも1つの塩を含む。組成物は、46 mM未満の塩(例えば、2〜35 mMの塩、10〜15 mMの塩、または12 mMの塩)を含むことができる。好ましくは、組成物は12 mMのKClを含む。任意で、組成物は約7.4のpHを有してもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、糖、任意で二糖類(例えば、スクロース)を含む。組成物は、121 mM未満の糖(例えば、6〜91 mMの糖、26〜39 mMの糖、または32 mMの糖)を含むことができる。さらに好ましくは、組成物は32 mMのスクロースを含みうる。いくつかの実施形態において、組成物は、弱酸および弱塩基から選択される緩衝剤を含むことができる。任意で、緩衝剤は、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であってもよい。任意で、組成物は、19 mM未満の緩衝剤、例えば、1〜14 mMの緩衝剤、4〜6 mMの緩衝剤、または5 mMの緩衝剤を含んでもよい。さらに好ましくは、組成物は5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含むことができる。実例の方法によれば、組成物は、46 mM未満の酢酸アンモニウム、例えば、2〜35 mMの酢酸アンモニウム、10〜15 mMの酢酸アンモニウム、または12 mMの酢酸アンモニウムを含む。好ましくは、組成物は、送達させたい150.0 μMの分子を含む。

いくつかの実施形態において、送達させたい分子は、最大1,000 Daの平均分子量を有する。いくつかの例において、組成物は、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有する水溶液を含み; かつ25% (v/v)のエタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; 12 mMの酢酸アンモニウム; および送達させたい150.0 μMの分子を含む。

実例の方法によれば、送達させたい分子は最大1,000 Daの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも1個の炭素原子を含むアルコール(例えば、メタノール)を含むことができる。好ましくは、組成物はエタノールを含む。組成物は、2〜45% (v/v)のアルコール、20〜30% (v/v)のアルコール、または25% (v/v)のアルコールを含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、2〜45% (v/v)のメタノール、20〜30% (v/v)のメタノール、または任意で20% (v/v)メタノールを含む。好ましくは、組成物は20〜30% (v/v)のメタノールを含む。いくつかの実施形態において、組成物は溶液(例えば、水溶液)である。任意でまたはさらに、組成物は、任意で室温で、171 mOsm/Lの浸透圧濃度を有する。好ましくは、組成物は室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度を有する。いくつかの実施形態において、組成物は、NaCl、KCl、Na₂HPO₄およびKH₂PO₄から選択される少なくとも1つの塩を含む。組成物は、46 mM未満、2〜35 mMの塩、10〜15 mMの塩、または12 mMの塩(例えば、12 mMのKCl)を含むことができる。組成物は、約7.4のpHを有することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、糖、二糖類、またはスクロースを含む。組成物は、121 mM未満の糖、6〜91 mMの糖、26〜39 mMの糖、または32 mMの糖(例えば、32 mMのスクロース)を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、弱酸および弱塩基から選択される緩衝剤を含む。任意で、緩衝剤は、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であってもよい。組成物は、19 mM未満の緩衝剤、1〜14 mMの緩衝剤、4〜6 mMの緩衝剤、および5 mMの緩衝剤を含むことができる。さらに好ましくは、組成物は5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、46 mM未満の酢酸アンモニウム、2〜35 mMの酢酸アンモニウム、10〜15 mMの酢酸アンモニウム、または12 mMの酢酸アンモニウムを含む。好ましくは、組成物は、送達させたい150.0 μMの分子を含む。

送達させたい分子は、最大1,000 Daの平均分子量を有することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有する水溶液を含み; かつ20% (v/v)のメタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; 12 mMの酢酸アンモニウム; および送達させたい150.0 μMの分子を含む。

実例の方法によれば、送達させたい分子は最大1,000 Daの平均分子量を有する。組成物は、少なくとも4個の炭素原子を含むアルコール(例えば、ブタノール)を含む。さらに、組成物は2〜8% (v/v)のアルコール、または2、4もしくは8% (v/v)のアルコールを含む(例えば、好ましくは、組成物は2% (v/v)のブタノールを含む)。いくつかの実施形態において、組成物は溶液(例えば、水溶液)である。いくつかの実施形態において、組成物は、任意で室温で、171 mOsm/Lの浸透圧濃度を有する。好ましくは、組成物は室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度を有する。いくつかの実施形態において、組成物は、NaCl、KCl、Na2HPO4およびKH2PO4から選択される少なくとも1つの塩を含む。組成物は、46 mM未満、例えば、2〜35 mMの塩、10〜15 mMの塩、または12 mMの塩を含むことができる。好ましくは、組成物は12 mMのKClを含む。組成物は、約7.4のpHを有することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、糖、任意で二糖類、任意でスクロースを含む。任意で、組成物は、121 mM未満の糖、6〜91 mMの糖、26〜39 mMの糖、または32 mMの糖(例えば、32 mMのスクロース)を含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、弱酸および弱塩基から選択される緩衝剤を含む。緩衝剤は、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸でありうる。組成物は、19 mM未満の緩衝剤、1〜14 mMの緩衝剤、4〜6 mMおよび5 mMの緩衝剤を含むことができる。さらに好ましくは、組成物は5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、46 mM未満の酢酸アンモニウム、2〜35 mMの酢酸アンモニウム、10〜15 mMの酢酸アンモニウム、または12 mMの酢酸アンモニウムを含む。好ましくは、組成物は、送達させたい150.0 μMの分子を含む。

送達させたい分子は、最大1,000 Daの平均分子量を有することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、室温で171 mOsm/Lの浸透圧濃度および約7.4のpHを有する水溶液を含み; かつ2% (v/v)のブタノール; 12 mMのKCl; 32 mMのスクロース; 5 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸; 12 mMの酢酸アンモニウム; および送達させたい150.0 μMの分子を含む。

実例の方法によれば、送達させたい分子は最大1,000 Daの平均分子量を有する。組成物は、少なくとも2個の炭素原子を含むアルコール(例えば、エタノール)を含みうる。いくつかの実施形態において、組成物は、2〜45% (v/v)のアルコール(例えば、20〜30% (v/v)または25% (v/v)のアルコール)を含む。さらに、組成物は、2〜45% (v/v)のエタノール(例えば、20〜30% (v/v)または25% (v/v)のエタノールを含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は溶液(例えば水溶液)である。実例の方法によれば、組成物は171 mOsm/Lの浸透圧濃度を有しうる(例えば、室温で)。実例の方法によれば、組成物は、NaCl、KCl、Na₂HPO₄およびKH₂PO₄から選択される少なくとも1つの塩を含む。組成物は34 mMのNaClまたは0.7 mMのKClを含むことができる。組成物は2.5 mMのNa₂HPO₄を含むことができる。組成物は0.5 mMのKH₂PO₄を含む。好ましくは、組成物は、34 mMのNaCl、0.7 mMのKCl、2.5 mMのNa₂HPO₄および0.5 mMのKH₂PO₄のうち少なくとも1つを含む。好ましくは、組成物は、34 mMのNaCl、0.7 mMのKCl、2.5 mMのNa₂HPO₄および0.5 mMのKH₂PO₄を含む。好ましくは、組成物は、送達させたい150.0 μMの分子を含む。

好ましい態様において、本方法は、分子と組成物とを導入してマトリックスを形成させる段階; マトリックスを霧化する段階; および0.065〜0.085 cm²の面積にエアロゾルの形態でマトリックス1 μLを送達することによってマトリックスを原形質膜と接触させる段階を含む。

本方法は、細胞0.065〜0.085 cm²の面積に、任意で細胞0.065〜0.085 cm²の面積にマトリックス1 μLを送達する段階を含む、マトリックスを原形質膜と接触させる段階を含むことができる。ある種の態様において、マトリックスを原形質膜と接触させる段階は、マトリックス10〜100 μLを送達する段階、任意でマトリックス20 μLを送達する段階を含む。好ましい態様において、マトリックスを原形質膜と接触させる段階は、エアロゾルの形態でマトリックスを送達する段階を含み、ここで該方法は、マトリックスを原形質膜と接触させる前にマトリックスを霧化する段階をさらに含む。霧化する段階は、本明細書において記述されるように霧化器を用いて達成することができる。本方法は、好ましくは、マトリックスを原形質膜と接触させる前に、マトリックスを霧化して30〜100 μmの直径を有する粒子のコロイド懸濁液を提供する段階を含む。

主題の方法では、霧化段階は、図1に概略的に示されるように、一般的に(円形の)円錐形の噴霧域を提供する段階を含む。好ましい態様において、霧化段階は、噴霧域の縦方向の長さが噴霧域の円形基部の直径よりも大きい、概して円錐形の噴霧域を提供する。特に好ましい態様において、霧化段階は、噴霧域の縦方向の長さが噴霧域の円形基部の直径のおよそ2倍である、概して円錐形の噴霧域を提供する段階を含む。噴霧域の円形基部は、一般に、分子を送達させたい細胞面積の円形基部に等しい。したがって、ある種の態様において、霧化段階は、噴霧域の縦方向の長さが31 mm以下であり、分子を送達させたい細胞面積の円形基部の直径が15.5 mmである、概して円錐形の噴霧域を提供する段階を含む。接触段階は、好ましくは、マトリックスを送達させたい面積の中心点で行われ、例えば、ここで噴霧域の縦軸は、分子を送達させたい細胞面積の円形基部の縦軸または中心点と同軸である。

本方法は、マトリックスを原形質膜と接触させる段階の前に、マトリックスを送達させたい細胞を曝露するさらなる段階を含むことができる。ある種の態様において、曝露する段階は、細胞を取り囲む相当量の液体を、例えば吸引によって、除去する段階を含む。さらに好ましい態様において、本方法は、分子と組成物とを導入してマトリックスを形成させる段階; マトリックスを霧化する段階; マトリックスを送達させたい細胞を曝露する段階; および0.065〜0.085 cm²の面積にエアロゾルの形態でマトリックス1 μLを送達することによってマトリックスを原形質膜と接触させる段階を含む。

本方法は、曝露細胞を、任意でリン酸緩衝生理食塩水のような緩衝溶液とともに、インキュベートする段階をさらに含むことができる。したがって、本発明の主題の1つの態様では、分子と組成物とを導入してマトリックスを形成させる段階; マトリックスを霧化する段階; マトリックスを送達させたい細胞から上清を除去する段階; 細胞を洗浄する段階; および0.065〜0.085 cm²の面積にエアロゾルの形態でマトリックス1 μLを送達することによってマトリックスを原形質膜と接触させる段階を含む方法を規定する。

本方法は、室温で0.1秒〜2分間、任意で2分間、細胞をインキュベートするさらなる段階を含むことができる。

有利には、本方法は、68 mMのNaCl、1.4 mMのKCl、5 mMのNa₂HPO₄および0.9 mMのKH₂PO₄を含む第二の組成物と細胞を接触させるさらなる段階を含むことができるものと判明した。第二の組成物は溶液であり、任意で7.4のpHを有する水溶液であってもよい。好ましい態様において、さらなる接触段階は、室温で30秒間0.0052〜0.0068 cm²の面積に第二の組成物1 μLを送達する段階を含む。

さらなる接触段階の後、本方法は、例えば、細胞を取り囲む相当量の液体を吸引によって除去することにより、マトリックスを送達させたい細胞を曝露する段階をさらに含むことができる。

本方法は、例えば、適当な培地を細胞に導入し、37℃で5% CO2とともに加湿雰囲気中で細胞をインキュベートすることにより、曝露段階の後に細胞を培養する段階をさらに含む。

したがって、好ましい態様において、本方法はさらに、68 mMのNaCl、1.4 mMのKCl、5 mMのNa₂HPO₄および0.9 mMのKH₂PO₄を含む第二の組成物と細胞を接触させる段階; マトリックスを送達させたい細胞を曝露する段階; および曝露段階の後に細胞を培養する段階を含む。

それゆえ、本発明の主題はまた、68 mMのNaCl、1.4 mMのKCl、5 mMのNa₂HPO₄および0.9 mMのKH₂PO₄を含む第二の組成物であって、水溶液とすることができる該組成物が提供される、本発明の主題の第二の局面に関する。

本発明の主題はまた、1を超える分子量の分子を、原形質膜を越えて送達するための方法であって; 1を超える分子量の分子を組成物に導入してマトリックスを形成させる段階; およびマトリックスを原形質膜と接触させる段階を含む、該方法に関する。

実例の送達用装置
本主題は、例えば、コロイド液滴サイズを制御することによって、原形質膜を越えてコロイド懸濁粒子を送達することにさらに関する。詳細には、ある体積の水溶液を細胞の集団に接触させると、材料の細胞内送達を達成できることが発見された。集団に接触する水溶液の体積は、例えば、水溶液の制御噴霧をもたらすことにより、制御することができる。特定のサイズ(またはサイズの範囲)のコロイド懸濁液滴を用いて、材料のコロイド懸濁液を細胞膜に適用することができる。しかし、コロイド液滴が細胞膜に適用され、コロイド液滴サイズが大きすぎる(および/または全体積が大きすぎる)場合、細胞への損傷が起きることもあり、細胞生存に悪い影響がある。逆に、コロイド液滴が細胞膜に適用され、コロイド液滴サイズが小さ過ぎる(および/または全体積が小さすぎる)場合、材料の細胞内送達は達成されない。それゆえ、コロイド液滴サイズの制御(またはコロイド液滴のサイズ範囲またはサイズ範囲内での生成)は、材料の細胞内送達を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、ペイロードは、サイズがコロイドサイズではないもの、例えば、直径が1ナノメートル未満または1000ナノメートル超とすることができる。

次に図1を参照して、本主題の実施例による、原形質膜を越えて分子を送達するための機器10の概略図が示されている。

霧化器は、サンプル(例えば、送達材料のコロイド懸濁液)が例えばシリンジを用いて圧力下で注入されると、液滴を生成する。生成された液滴のサイズは、より低い注入圧力がより大きな液滴サイズをもたらすように加えられる圧力の量に相関することができる。注入圧力を瞬間的に変えることができないため、すなわち、ゼロ圧または低圧から高圧へと傾斜(例えば、移行)させ、同様に、高圧から低圧へと傾斜(例えば、移行)させるため、生成された液滴は、広範囲のサイズを有する。生成されたコロイド液滴の一部分は、所与の細胞内送達の適用のためには大きすぎる可能性がある。生成されたコロイド液滴の一部分が大きすぎるため、適切なサイズのコロイド液滴の生成にもかかわらず、細胞死が起きうる。上記のように、細胞死は、いくつかの用途にとって望ましくない。さらに、霧化器によって生成されたコロイド液滴の一部分は、小さすぎる可能性があり、これが材料の非効率的または非効果的な細胞内送達につながる。

本主題により、特定のサイズまたはサイズ範囲のコロイド液滴の生成が可能になる。さらに、生成されたコロイド液滴のサイズには一貫性があり得、すなわち、所望のサイズまたはサイズ範囲外の液滴の生成が低減されおよび/または実質的に排除される。コロイド液滴サイズの制御は、空洞を有する高速切り替え速度弁を用いて、および/または注入給気に十分なヘッドルームを確実に存在させて達成することができ、これによって霧化器の迅速な注入圧増減時間が可能とされる。霧化器はシリンジでの使用を対象としうる。

大きすぎたり、小さすぎたりする液滴を構成することは、用途(例えば、送達させたい材料および標的細胞のタイプ)に基づいて変化しうる。それゆえ、材料の細胞内送達は、コロイド液滴を生成し、コロイド液滴のサイズを制御することにより達成することができる。いくつかの実施形態において、コロイド液滴は、標的細胞に適用される実質的に全てのコロイド液滴が、細胞内送達を達成する既知の/所望の範囲内のサイズを有するように生成される。いくつかの実施形態において、既知の/所望の範囲外のコロイド液滴の形成が最小限に抑えられる。

機器10は、少なくとも1つの霧化器エミッタ14を有する霧化器12; および細胞を支持するための支持体16を含む。

マトリックスを原形質膜と接触させることは、エアロゾルの形態でマトリックスを送達することを含むことができ、これは霧化器を用いて達成することができる。

霧化器12は、機械式霧化器、超音波霧化器、エレクトロスプレイ、噴霧器、およびベンチュリ管から選択することができ; 原形質膜を越えて分子を送達する必要性に基づいて霧化器を選択することは、当業者の検討事項の範囲内である。霧化器12は、米国ノースカロライナ州のLMAテレフレックスから市販されている霧化器のような、市販の霧化器とすることができる。

霧化器12は、各粒子が30〜100 μmの直径を有する、粒子のコロイド懸濁液を提供するように適合される。ある種の態様において、霧化器12は、粒子の各々が50〜80 μmの直径を有する、粒子のコロイド懸濁液を提供するように適合される。粒子は、細胞に送達させたい分子を含む液滴である。

霧化器12は、ガス貯蔵器18を含むことができる。機器10は、空気圧発生器またはガス貯蔵器18 (空気圧発生器ともいわれる)を含むことができる。ガス貯蔵器18内のガスは加圧下で維持される。ガスは、空気、二酸化炭素、およびヘリウムから選択することができる; しかし当業者によって任意の適当なガスが、選択され使用されうるものと理解される。ガス貯蔵器18は、ガス貯蔵器18内のガスを圧縮し、それでガスを加圧下で維持するための圧力ヘッド発生器、任意で固定圧力ヘッド発生器を含むことができる。ガス貯蔵器18の例としては、ボンベ入りガスが含まれる。

ガス貯蔵器18は、霧化器エミッタ14と流体連通している。ガス貯蔵器18は、ガスがガス貯蔵器18から霧化器エミッタ14へ流れることができるように、霧化器エミッタ14と流体連通することができる。ある種の態様において、ガス貯蔵器18は、霧化器エミッタ14と流体連通するガスガイド20を含む。したがって、ガスガイド20は、それを通してガスの通過を可能とするように適合される。ガスガイド20は、開口端部を有する中空体のような、中空体とすることができる。1つの実施形態において、ガスガイド20は、第一の開口端部22および第二の開口端部22'、任意で第一の開口端部22および第二の開口端部22'の反対側の開口端部を有する中空体である。

1つの実施形態において、第一の開口端部22の直径は第二の開口端部22'の直径と異なる。好ましくは、第一の開口端部22の直径は、第二の開口端部22'の直径よりも大きい。第一の開口端部22は、ガス貯蔵器18と流体連通することができる。第二の開口端部22'は、好ましくは霧化器エミッタ14と流体連通している。ガスがガス貯蔵器18からガスガイド20を通して加圧下で注入されると、第一の開口端部22の直径が第二の開口端部22'の直径よりも大きいことから生じるガスガイド20の減少部分は、ガス流の速度を増加させ、それによって第二の開口端部22'での圧力低下を生じさせる。

機器10は、サンプル貯蔵器24をさらに含むことができる。サンプル貯蔵器24は、霧化器12と流体連通している。例示的な実施形態において、サンプル貯蔵器24は、霧化器エミッタ14と流体連通している。好ましい態様において、ガス貯蔵器18およびサンプル貯蔵器24は両方とも、霧化器エミッタ14と流体連通している。そのような構成では、ガスガイド20の第二の開口端部22'での圧力低下により、サンプルをサンプル貯蔵器24から引き出すことができる。サンプルを次いで、ガス貯蔵器18から霧化器エミッタ14までガスガイド20を通過するガス流に導入することができる。

例示的な実施形態において、機器10は、サンプル貯蔵器24とガス貯蔵器18との間に設置されたサンプル弁26をさらに含む。サンプル弁26は、サンプル貯蔵器24からのサンプル流を調整するように適合させることができる。サンプル弁26を用いて連続的または半連続的なサンプル流を可能にすることができる。例示的な実施形態において、サンプル弁26は、規定量のサンプルの半連続的なサンプル流を可能とするように適合される。例えば、サンプル弁は、サンプル貯蔵器24からのサンプル0.5〜100 μLの半連続的なサンプル流を可能とするように適合させることができる。例示的な実施形態において、サンプル弁26は、サンプル貯蔵器24からのサンプル20 μLの半連続的なサンプル流を可能とするように適合される。しかしながら、当業者がサンプル流を選択することができ、それによって0.065〜0.085 cm²の面積に1 μLの半連続的なサンプル流を可能とするようにサンプル弁を適合させることができるものと理解される。

霧化器12および支持体16は離間している。支持体16は、霧化器12によって生成された噴霧プルーム(噴霧域)が支持体16の位置または上で受容されるように、霧化器12の方に向けることができる。支持体16は固体支持体を含む。いくつかの実施形態において、支持体16は、サンプルウェルを含むプレートを含む。別の態様において、支持体16は、サンプルウェルを含むプレートを受容かつ保持するための固体支持体を含む。支持体16またはプレートは、1、6、9、12、24、48、96、384および1536ウェルから選択されるサンプルウェルを含むことができ、例えば、支持体16またはプレートは、1ウェル、6ウェル、9ウェル、12ウェル、24ウェル、48ウェル、96ウェル、384ウェルまたは1536ウェルのプレートとすることができる。支持体16は、例えば、生体組織、例えば皮膚組織もしくは気管組織のような、生体膜であってもよく; またはいくつかの態様において、生体臓器であってもよい。固体支持体は、不活性材料から形成することができる。

例示的な実施形態において、固体支持体は、プラスチック材料または金属もしくは金属合金から形成される; とはいえ、当業者によって任意の適当な材料が選択され使用されうるものと理解される。支持体16は、いくつかの態様において、アルミニウム膜またはプラスチック膜のような、合成膜でありうる。

例示的な実施形態において、支持体16は、支持体16の位置または上の温度を上昇または低下させることができる、抵抗素子であってもよい、加熱素子を含む。

支持体16は、支持体16を機器10に対して往復して移動可能とするために、機器10に往復するように搭載可能とすることができる。いくつかの実施形態において、支持体16は、霧化器12または霧化器エミッタ14に対して往復して移動可能である。そのような構成では、支持体16を霧化器エミッタ14に対して移動させて、原形質膜を越えての分子の送達のために最適な噴霧プルーム(噴霧域)を達成することができる。支持体16は、霧化器12または霧化器エミッタ14に対して、任意で霧化器エミッタ14の縦軸に対して支持体16を往復して移動させる支持体アクチュエータを含み、それによって支持体16と霧化器エミッタ14との間の距離を調整することができる。支持体16は、霧化器エミッタ14の縦軸に対して支持体16を横方向に往復して移動させる支持体アクチュエータをさらに含み、それによって支持体16と霧化器エミッタ14の相対位置を調整することができる。

例示的な実施形態において、霧化器12または霧化器エミッタ14と支持体16との間の距離は31 mm以下である。離間した霧化器12および支持体16は、その間に噴霧域を画定する。1つの実施形態において、噴霧域の縦方向の長さは31 mmである。

噴霧域の縦軸は、好ましくは支持体16の縦軸と同軸である。さらに、霧化器エミッタ14の縦軸は、好ましくは支持体16の縦軸と同軸である。そのような構成では、霧化器エミッタ14の縦軸、支持体16の縦軸、および噴霧域の縦軸はそれぞれ同軸であり、それによって霧化器エミッタ14、および霧化器エミッタ14に関連する噴霧域が、送達のために支持体(例えば、プレートの円形ウェル) 16の中心に置かれることを確実にする。

機器10は、ガス貯蔵器18と霧化器12との間に配置された弁28をさらに含むことができる。弁28は、電磁弁のような、電磁的に操作される弁とすることができる。あるいは、弁28は、空気弁であってもよい。弁28は、好ましくは、ガスガイド20に設置され、ガスガイド20内のガス流を調整するように適合させることができる。例えば、弁28は、ガスが霧化器12を作動させるのを防止するための閉鎖位置と、加圧されたガスが霧化器12を作動させてコロイド液滴を生成させるための開口位置の間で切り替え可能とすることができる。開口位置は、霧化器12によって受容される圧力を制御するように部分的に開口することができる。弁28は、連続的または半連続的なガス流を可能とするように適合させることができる。1つの実例の実施形態において、弁28は、規定の時間間隔の半連続的なガス流、例えば、1秒の時間間隔の半連続的なガス流を可能とするように適合される。

弁28は、連続的または半連続的なガス流を可能とするように適合させることができる。好ましい態様において、弁28は、規定の時間間隔の半連続的なガス流、例えば、1秒の時間間隔の半連続的なガス流を可能とするように適合される。

滅菌を確実にし、外来粒子を除去するために、機器10は、少なくとも1つのフィルタ30をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、各フィルタ30は10 μm未満の細孔径を有するが、当業者は、使用および選択される細孔径を容易に決定することができる。各フィルタ30はガスガイド20に設置され、各フィルタ30はガスガイド20と流体連通している。

機器10は、電気調節器または機械調節器とすることができる少なくとも1つの調節器32を含むことができる。各調節器32は、ガスガイド20に設置され、ガスガイド20と流体連通している。各調節器32は、調節弁とすることができ、ガスガイド20内の圧力を1.0〜2.0バールに調整するように適合させることができる。各調節弁は、ガスガイド20内の圧力を1.0〜2.0バールに維持することもできる。実例の実施形態において、各調節弁は、ガスガイド20内の圧力を1.5バールに維持する。本主題の例示的な実施形態は、2つの調節器32を含むことができる。例えば、機器10は、第一の調節器32および第二の調節器32'を含むことができる。第一の調節器32および第二の調節器32'は、ガスガイド20に設置され、それぞれガスガイド20と流体連通している。例示的な実施形態において、第一の調節器32は、ガス貯蔵器18とフィルタ30との間に設置される。第一の調節器32は、ガスガイド20内のガス貯蔵器18からの圧力を2.0バールに調整し、ガスガイド20内の圧力を2.0バールに維持するように適合される。第二の調節器32'は、フィルタ30と弁28との間に設置される。

いくつかの実施形態によれば、霧化器エミッタ14は、円錐形の噴霧域を提供するように適合される。霧化器エミッタ14は、30°の円錐形の噴霧域を提供するように適合させることができる。

機器10は、機器10のいずれかまたは全ての部分を制御するためのマイクロプロセッサをさらに含むことができる; 例えば、マイクロプロセッサは、サンプル弁26、支持体アクチュエータ、弁28、および調節器32のいずれかまたは全てを制御するように構成することができる。

いくつかの実施形態において、機器10は、0.065〜0.085 cm²の面積に1 μLのサンプルを送達し、任意で細胞0.065〜0.085 cm²の面積に1 μLのマトリックスを送達するように構成される。サンプルは、サンプルを原形質膜と接触させる前に、サンプルを霧化することによってエアロゾルの形態で送達されされうる。霧化器12は、各液滴が30〜100 μm、またはより好ましくは、50〜80 μmの断面寸法を有する、サンプルの液滴を形成することができる。任意でまたは追加で、霧化器は、各液滴が10 μm未満の断面寸法を有する、サンプルの液滴を形成する。機器10は、好ましくは、サンプルを送達させたい面積の中心点で送達が行われるように構成される。

材料および方法
特に指定のない限り、使用された全ての無機材料は「AnalaR」等級のものであった。全ての材料は、組織培養等級のものであり、特に指定のない限り、Sigmaから購入した。

第一の溶液(溶液A) 100 mlを、分子等級の水中、終濃度が43 mMのスクロース、16 mMの塩化カリウム、16 mMの酢酸アンモニウムおよび7 mMのHepesとなるように調製し、1 MのNaOH 1.15 mlを添加することによってpH 7.4に調整し、エタノールと3:1の比率で混合する前に、細孔径0.2 μmのフィルタを用いてろ過滅菌した。

第二の溶液(溶液B) 100 mlを、分子等級の水中、終濃度が68 mMのNaCl、1.4 mMのKCl、5 mMのNa₂HPO₄および0.9 mMのKH₂PO₄となるように調製した。得られた溶液のpHを、1 MのNaOH 1.13 mlを添加することによってpH 7.4に調整し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した。

細胞に送達させたい分子には、ヨウ化プロピジウム(668 Da)、miRNA (15,000 Da) (Thermo Scientific)、siRNA分子(15,000 Da) (Life Technologies)、デキストラン(3000〜2,000,000 Da) (Life Technologies)を含めた。

ヨウ化プロピジウム溶液(水中1.0 mg/ml)は、Sigma Aldrich（カタログ番号: P4864）から入手し; Dy547で標識した非標的化miRNAは、ThermoScientific（カタログ番号: CP-004500-01-05）から入手し; フルオレセイン標識二本鎖RNAオリゴマー(siRNA)は、Biosciences（カタログ番号: 13750062）から入手し; フルオレセイン標識デキストランは、Life Technologiesから、Dextran 40,000（カタログ番号D1845）; Dextran 70,000（カタログ番号D1823）; Dextran 2,000,000（カタログ番号D7137）; およびDextran 500,000（カタログ番号D7139）を入手した。

細胞に送達させたい分子を溶液Aに添加して、マトリックスを形成させた。送達させたい分子の量は、溶液Aに添加された分子の量とは無関係であった。本実験において、溶液Aに添加された分子の量は、マトリックスが150 μMのヨウ化プロピジウム(668 Da)、3.3または6.6 μMのmiRNA (15,000 Da)、および3.3または6.6 μMのsiRNA分子(15,000 Da)を含むようなものであった。

細胞および細胞培養
T24ヒト膀胱がん、U373膠芽腫、SKBR3ヒト高異数三倍体(hypertriploid)、HeLaヒト上皮腺がん、CHO-K1チャイニーズハムスター卵巣、COS-7 SV40形質転換腎線維芽細胞、C2C12マウス筋芽細胞; A549腺がんヒト肺胞上皮およびBeas2Bヒト気管支上皮の細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手した。HEK-nヒト表皮ケラチノサイト-新生児およびHDF正常ヒト真皮線維芽細胞株は、Caltag MedSystemsから入手した。

全ての細胞株を、37℃で5% CO₂とともに加湿雰囲気中で増殖させた。細胞の常套的な無菌継代培養を、72時間毎または75〜90%コンフルエント到達時のいずれか早い方で行った。

実験のため、細胞を24ウェルプレート中におよそ4×10³個の細胞/ウェルの密度で播種し、送達の日に細胞が75〜90%コンフルエントに達するように24時間接着させた。

分子の送達
米国ノースカロライナ州のLMAテレフレックスから市販され、霧化器エミッタを含んでいる鼻腔内粘膜霧化装置（カタログ番号MAD300）を、以下のように設定した: 霧化器エミッタを24ウェルプレートの基部から31 mm、 プレートの各円形ウェルの中心点の上方に位置付けた。1.5バールの圧力を許容するように霧化器エミッタを調整した。タイマーを利用して1秒間、霧化器エミッタから噴霧液を分配した。霧化器エミッタを、送達させたい分子を含有する溶液Aで3回すすぐことによりプライミングした。

プレートの各ウェルを以下のように処理した: マイクロピペットを用いてウェルから細胞培地を除去した。任意で、マイクロピペットを用いてリン酸緩衝生理食塩水(PBS) 250 μLでウェルを2回すすいだ。霧化器を用いて、送達させたい分子を含有する溶液A 20 μLを細胞に送達した。プレートを、送達させたい分子のサイズに応じて、室温で30秒〜2分間インキュベートし、これに続きマイクロピペットを用いて溶液B 250 μLをウェルに添加した。次いで、プレートを室温で30秒間インキュベートし、その時点で、マイクロピペットを用いてウェルから溶液Bを除去した。マイクロピペットを用いてウェルに培地500 μLを添加した。次いで細胞を、37℃で5% CO₂を有する加湿雰囲気に戻した。

蛍光顕微鏡検査法
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識およびDyLightホスホラミダイト(DY547)標識分子を、製造元の使用説明書にしたがって用いた。細胞に送達させたい標識分子を溶液Aに添加し、本明細書において上述のように細胞に送達した。送達後、プレートを蛍光顕微鏡(Olympus CKX 41)のステージ上に置き、蛍光を可視化するためにフィルタを用いて細胞を観察した。顕微鏡写真を得た。

フローサイトメトリー
送達後、トリプシン200 μLを用いてプレートの各ウェルから細胞を取り出した。トリプシンを不活性化するために培地200 μLを用いた。259相対遠心力(RCF)で5分間の遠心分離によって細胞をペレット化し、マイクロピペットチップを用いてペレットをPBS 200 μLに再懸濁した。細胞懸濁液をフローサイトメーター[Accuri Flow Cytometyer, BD Biosciences]にロードし、蛍光を製造元の使用説明書にしたがって分析した。

細胞生存性
送達後、CellTiter 96 (登録商標) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega)を製造元の使用説明書にしたがって用い、細胞生存性を評価した。手短に説明すると、吸引によってウェルから培地を除去し、MTS試薬40 μLを添加した新鮮培地200 μLと交換した。プレートを光から保護して、1時間37℃でインキュベートした。溶液100 μLをウェルから取り出し、96ウェルプレートに入れ、GloMax 96マイクロプレート照度計[Promega]を用い450 nmで吸光度を読み取った。

共局在の可視化
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識およびDyLightホスホラミダイト(DY547)標識分子を、製造元の使用説明書にしたがって用いた。送達後、プレートを蛍光顕微鏡[Olympus CKX 41]のステージ上に置き、蛍光を可視化するためにフィルタを用いて細胞を観察した。顕微鏡写真を得た。

本主題は、例えば、コロイド液滴サイズを制御することによって、原形質膜を越えてコロイド懸濁粒子を送達することにさらに関する。詳細には、特定のサイズ(またはサイズの範囲)のコロイド懸濁液滴を用いて、材料のコロイド懸濁液を細胞膜に適用すると、材料の細胞内送達を達成できることが発見された。しかし、コロイド液滴が細胞膜に適用され、コロイド液滴サイズが大きすぎる場合、細胞への損傷が起きることもあり、細胞生存に悪影響がある。逆に、コロイド液滴が細胞膜に適用され、コロイド液滴サイズが小さ過ぎる場合、材料の細胞内送達は達成されない。それゆえ、コロイド液滴サイズの制御(またはコロイド液滴のサイズ範囲またはサイズ範囲内での生成)は、材料の細胞内送達を可能にすることができる。

霧化器は、サンプル(例えば、送達材料のコロイド懸濁液)が、例えばシリンジを用いて、圧力下で注入されると、液滴を生成する。生成された液滴のサイズは、より低い注入圧力がより大きな液滴サイズをもたらすように加えられる圧力の量に相関することができる。注入圧力を瞬間的に変えることができないため、すなわち、ゼロ圧または低圧から高圧へと傾斜(例えば、移行)させ、同様に、高圧から低圧へと傾斜(例えば、移行)させるため、生成された液滴は、広範囲のサイズを有する。生成されたコロイド液滴の一部分は、所与の細胞内送達の適用のためには大きすぎる可能性がある。生成されたコロイド液滴の一部分が大きすぎるため、適切なサイズのコロイド液滴の生成にもかかわらず、細胞死が起きうる。上記のように、細胞死は、いくつかの用途にとって望ましくない。さらに、霧化器によって生成されたコロイド液滴の一部分は、小さすぎる可能性があり、これが材料の非効率的または非効果的な細胞内送達につながる。

本主題により、特定のサイズまたはサイズ範囲のコロイド液滴の生成が可能になる。さらに、生成されたコロイド液滴のサイズは、一貫性があり得、すなわち、所望のサイズまたはサイズ範囲外の液滴の生成が低減されおよび/または実質的に排除される。コロイド液滴サイズの制御は、空洞を有する高速切り替え速度弁を用いて、および/または注入給気に十分なヘッドルームを確実に存在させて達成することができ、これによって霧化器の迅速な注入圧増減時間が可能とされる。霧化器はシリンジでの使用を対象としうる。

大きすぎたり、小さすぎたりする液滴を構成することは、用途(例えば、送達させたい材料および標的細胞のタイプ)に基づいて変化しうる。それゆえ、材料の細胞内送達は、コロイド液滴を生成し、コロイド液滴のサイズを制御することにより達成することができる。いくつかの実施形態において、コロイド液滴は、標的細胞に適用される実質的に全てのコロイド液滴が、細胞内送達を達成する既知の/所望の範囲内のサイズを有するように生成される。いくつかの実施形態において、既知の/所望の範囲外のコロイド液滴の形成が最小限に抑えられる。

機器10は、ガス貯蔵器18と霧化器12との間に配置された弁28をさらに含むことができる。弁28は、電磁弁のような、電磁的に操作される弁とすることができる。弁28は、空気弁であってもよい。弁28は、ガスガイド20に設置することができ、ガスガイド20内のガス流を調整するように適合させることができる。例えば、弁28は、ガスが霧化器12を作動させるのを防止するための閉鎖位置と、加圧されたガスが霧化器12を作動させてコロイド液滴を生成させるための開口位置の間で切り替え可能とすることができる。開口位置は、霧化器12によって受容される圧力を制御するように部分的に開口することができる。弁28は、連続的または半連続的なガス流を可能とするように適合させることができる。1つの実例の実施形態において、弁28は、規定の時間間隔の半連続的なガス流、例えば、1秒の時間間隔の半連続的なガス流を可能とするように適合される。

いくつかの実施形態において、弁28の切り替え速度は250ミリ秒未満とすることができる。切り替え速度は、弁28が閉鎖位置と開口位置との間で移行するのに必要な時間であってもよい(および/またはその逆でもよい)。いくつかの実施形態において、弁28は、200ミリ秒未満の切り替え速度を有する。いくつかの実施形態において、弁28は、50〜200ミリ秒の切り替え速度を有する。他の実施形態も可能である。

弁28は空洞を含むことができる。

いくつかの実施形態において、霧化器12は、30〜100マイクロメートルの直径を有するコロイド液滴を生成することができる。いくつかの実施形態において、霧化器12は、30〜50マイクロメートルの直径を有するコロイド液滴を生成することができる。いくつかの実施形態において、機器10の特性(例えば、高速弁26の切り替え時間のような)のため、霧化器12に注入する圧力により、霧化器12によって生成されたコロイド液滴の80パーセント超が30〜100マイクロメートルの直径を有するようになる(弁が少なくとも1回、閉鎖位置から開口位置へまたは開口位置から閉鎖位置へ移行する1秒間にわたって測定した場合)。いくつかの実施形態において、霧化器12に注入する圧力により、霧化器12によって生成されたコロイド液滴の99パーセント超が30〜100マイクロメートルの直径を有するようになる(弁が少なくとも1回、閉鎖位置から開口位置へまたは開口位置から閉鎖位置へ移行する1秒間にわたって測定した場合)。

現行で、本主題は、分子の細胞内送達を可能にすることができる。図3は、サンプルを1つまたは複数の標的細胞の細胞質に送達するためのコロイド液滴を生成するプロセス800を示すプロセスフロー図である。810において、ガスは、空気発生器またはガス貯蔵器18によって生成することができる。ガスは、加圧下とすることができる。820において、弁は、加圧ガスが霧化器12を作動させることを防止する閉鎖位置および加圧ガスが霧化器を作動させてコロイド液滴を生成させる開口位置から切り替えることができる。弁28は、空気圧発生器またはガス貯蔵器8と霧化器12との間にあってもよい。霧化器用のサンプル貯蔵器からサンプルを供給して、コロイド液滴を生成することができる。他の実施形態も可能である。

さらなる実例の実施形態を続ける。

実施例1: 技法の開発
生細胞への分子の送達は、広範囲の用途に非常に望ましい。一般に、関与する分子のタイプは、分子の質量にしたがって分類することができる: (i) 低分子量化学分子は一般に、1,000 Da未満の平均分子量を有する; (ii) ペプチドは一般に、およそ5,000 Daの平均分子量を有する; (iii) siRNA分子は一般に、およそ15,000 Daの平均分子量を有する; (iv) 抗体は一般に、およそ150,000 Daの平均分子量を有する; および(v) DNAのような核酸は一般に、およそ5,000,000 Daの平均分子量を有する。

原形質膜を越えて細胞内に分子を送達するために種々の手法がとられており、各手法は送達させたい分子のサイズおよび化学的性質に依っている。低分子量化学分子を送達するために、DMSOのような有機溶媒が使用されてきた。原形質膜上でのDMSOの作用の分子的基盤は依然として不明であるが、DMSOは、それぞれが異なる濃度範囲にわたって、3つの異なる作用様式を示すことが知られている。低濃度では、DMSOは原形質膜の薄層化を誘導し、原形質膜の疎水性コアの流動性を増加させる。より高い濃度では、DMSOは原形質膜中に一時的な水孔を誘導する。さらに高い濃度では、個々の脂質分子が原形質膜から不可逆的に脱離し、続いて原形質膜の二層構造の有害な崩壊が起こる。

オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、および核酸(プラスミドDNA、オリゴヌクレオチド、およびsiRNAのような)のような、より大きな生体分子の導入は「トランスフェクション」といわれる。DMSOのような、従来の送達組成物の使用は、これらのより大きな分子の送達にとって効率的ではない。siRNA分子は、通常、リポソームによるトランスフェクション(リポフェクション)によって送達される。プラスミドDNAは、通常、生物学的(ウイルス)、化学的(脂質に基づいたもしくは化学的な重合体)または物理的(エレクトロポレーション、マグネトフェクション、注入)方法を用いて送達される。しかしながら、これらの方法は、タンパク質およびペプチドにあまり適しておらず、さらに、多くの細胞型、特に初代細胞および幹細胞は、高い毒性レベルが問題となることが多い核酸分子でさえ、「トランスフェクションするのが難しい」ままである。

また、細胞および組織を化学的に「透過化する」ために広範囲の方法が用いられる。しかしながら、これらの方法の大部分は、「可逆的な透過化」および生細胞への送達を目的としていない。むしろ、これらの方法は、通常、視覚化または定量化(例えば、免疫蛍光)のような目的のために、細胞または組織内の分子または構造に結合する「標識」を送達するための「不可逆的な透過化」を目的としている。これらの状況では、細胞および組織は透過化後に生存できない。これらの方法において典型的に用いられる化学物質には、アルコール(これは原形質膜中の脂質を溶解する)、界面活性剤(これは原形質膜に細孔を作り出す)および酵素(これはタンパク質を消化して原形質膜中に細孔を作り出す)が含まれる。

少数の研究によって、界面活性剤を用いた可逆的な透過化の成功が報告されている。界面活性剤(例えば、表面活性剤)は、細胞膜からのタンパク質抽出のためおよび膜透過化剤として生物学において広く使用されている。トライトンX-100 (TX100)は、細胞を溶解するために、またはトランスフェクションのため生細胞膜を透過化するために最も広く使用される非イオン性界面活性剤の1つである。他の例示的な表面活性剤としては、ポリソルベート20 (例えば、Tween 20)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート(CHAPSO)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、およびオクチルグルコシドが挙げられる。しかしながら、狭い範囲の表面活性剤濃度のなかで細胞生存は極めて感受性であり、トランスフェクションのためにTX100濃度を制御することは困難である。Van den Venらは、TX100を用いて、1,000 MWから150,000 MWに及ぶ分子を培養細胞に送達することを報告している(参照により全体が本明細書に組み入れられるvan de Ven K., et al., J. Biomed Opt 2009:14(2))。Medepalliらは、サポニンを低張緩衝液(スクロース、KCl、酢酸カリウム、Hepes)とともに用いて、ナノメートルサイズの量子ドットを培養細胞に送達することを報告している(参照により全体が本明細書に組み入れられるMedepalli, K., et al., Nanotechnology 2013; 24:20)。この低張緩衝液は、細胞にイオンおよびpH緩衝をもたらすことで細胞生存を支持するために用いられるが、水が透過化細胞に流入し、それとともにペイロードを運ぶという意図で低張性でもある(水はそれ自体が細胞にとって有毒であることに留意されたい)。しかしながら、van de VenおよびMedepalli報告の実験は、繰り返すことができていない。

細胞生存性およびペイロード機能性を保持した形で細胞へのペイロードの送達を容易にする可逆的な透過化に基づき、ベクターを含まない送達方法を開発した。他のグループが行ったように、以下の仮説を利用した: 第一に、細胞膜の化学修飾によって透過性を誘導することができるであろう; 第二に、低張送達溶液を用いることでもたらされた浸透圧を介して送達を増強することができ、それによって透過化細胞への水の流入がペイロードの流入を促進させるであろう; 第三に、低張送達溶液がまた、緩衝化され、生理学的であった場合、細胞生存を増強することができるであろう。初期の所見に基づいて、本明細書で後に記述されるように、さらなる仮説を立て、磨きをかけた。化学的透過化の場合、最も一般的な透過化剤は、細胞膜中の特定の成分と相互作用して穴を開ける界面活性剤である(Hapala, I., Crit Rev. Biotech. 1997; 17(2): 105-22)。Medepalliらは、「S緩衝液」(78 mMのスクロース、30 mMのKCl、30 mMの酢酸カリウム、12 mMのHEPES)と呼ばれる特定の低張生理学的緩衝溶液中で細胞を4℃で5分間インキュベートすることによる培養細胞への量子ドットの送達を報告した(Medepalli K. et al., Nanotechnology 2013; 24(20))。いくつかの例では、酢酸カリウムは、「S」緩衝液中の酢酸アンモニウムで置き換えられる。彼らは、サポニンを溶液に添加することで送達を増強することができるとも述べた。しかしながら、これらの条件下では、高いレベルの細胞損傷およびA549細胞剥離が観察され、標識されたsiRNAおよびデキストラン分子の取り込みを認めなかった。アルコールのような有機溶媒は、細胞膜から脂質を溶解することによって細胞を透過化することができる。透過化剤としてエタノールを用いた可逆的透過化プロトコルを作った。

水およびPBSならびにさまざまな濃度のS緩衝液を含むいくつかの希釈剤中のエタノール濃度の範囲を調べた。S緩衝液中の酢酸カリウムを酢酸アンモニウムで置き換えることにより、細胞膜に対する効果のため、より良好な送達効率が得られた。望ましい初期結果を与えた好ましい送達溶液組成物は、75%のH₂O、25%のエタノール、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウムおよび5 mMのHepesであり、特に指定のない限りこの時から使用した。しかしながら、この溶液は、大量に細胞上へ直接ピペッティングされ、それによって細胞を浸たしたまたは浸漬した場合、かなりの毒性を誘導した（図56A）。PIを含有する送達溶液200 μl (24ウェルプレートのウェルあたり)を曝露細胞上へ直接ピペッティングした場合、大部分の細胞はすぐにPIについて陽性に染色された(図17)。送達後24時間で測定したLDH放出は、およそ50%の細胞が損傷したことを示していた(図19)。対照的に、10 kDaのデキストラン-Alexa488またはsiRNA-FITCのような、より大きな分子の送達は観察されなかった(図17)。細胞は、PIが核DNAに侵入し結合しうる致死的な損傷点まで過透過化されていたが、浸透圧勾配を確立させて、より大きなペイロードを送達することはできなかった。

それゆえ、損傷を最小限に抑えるため、実行可能な最小の体積および最短の時間で送達される最大体積のペイロードにより、送達プロセスをできるだけ早くすることができる。0日目に細胞を24ウェルプレートに播種し、送達を行ったとき、1日目に80〜90%コンフルエントとなるようにした。上清を標的ウェルから除去し、PI、10 kDaのデキストラン-Alexa488またはsiRNA-FITCを含有する送達溶液20 μlをウェルにピペッティングした。細胞を室温(RT)で2分間インキュベートして、取り込みを促進した。さらに取り込みを促進し、細胞脱水を防ぐために、次いで0.5×PBS 200 μlを添加し、細胞をさらに30秒間インキュベートした。次いで、この溶液を除去し、培地400 μlを添加した。次に細胞を蛍光顕微鏡検査法によって分析した。この方法では、PIの取り込みはウェルの辺縁部で明らかであったが、中心部では明らかでなかった(図18)。送達結果もこの方法と相反していた。10 kDaのデキストラン-Alexa488またはsiRNA-FITCの送達は観察されなかった(図17および図18)。しかしながら、LDHレベルは、さらに大きな200 μlの体積と比較して低減された(図19)。いくつかの細胞の過度の透過化(Over-permeabilisation)、および他の細胞の未透過化(under-permeabilisation)が起きていた。透過化溶液の全細胞への同時送達は、全ての細胞が同時に標的化されるとは限らないマイクロピペットを用いた体積の「滴下(dropping on)」よりも好ましかった。さらに、細胞に到達する体積は、細胞への水の流入を許容するには十分であるが、細胞を破裂点に至らせるには不十分でなければならない。換言すれば、細胞の吸収能と一致するように体積を調整しなければならない。噴霧による送達はこれらの成果を達成し、それによって噴霧はペイロードと標的細胞の細胞膜との接触を、非常に短い時間枠かつ均一な様式で最大化し、細胞生存性の保存と、細胞膜を越えて細胞の内部へのペイロードの信頼性の高い確実な取り込みをもたらした(図56B)。

器具
この手法を実施するために、x、yおよびzを含む器具を構成した(図20)。この器具を用いて、10 kDaのデキストランをA549細胞に送達した。細胞単層面積を噴霧直径と一致させるために、48ウェルプレートに細胞を播種した。上清を標的ウェルから除去し、10 kDaのデキストランを含有する送達溶液10 μlを細胞に噴霧した。室温で2分間のインキュベーション後、0.5×PBS 200 μlを添加し、細胞をさらに30秒間インキュベートした。次いで、この溶液を除去し、培地400 μlを添加した。この方法は、未処理の細胞と比較して、50%超の効率を有し、かつ全くかほとんど毒性なしに、細胞への10 kDaデキストランの送達を成功させた(図21および図22)。

細胞を可逆的に透過化するための技法を確立したので、細胞の回復に要した時間を調べた。ペイロードの非存在下で送達溶液を噴霧し、続いて、透過化細胞を検出するために、噴霧後1時間までの時点でヨウ化プロピジウム(PI)を培地に添加した。PI取り込みは噴霧後5分で可視化されたが、PI陽性細胞の数は、図23に示すように、噴霧後30分および60分までに実質的に低減された。

実例の最適パラメータ
この技法を開発する過程でいくつかのパラメータが最適化された。細胞からの噴霧ヘッドの距離、噴霧の圧力、ウェルあたりに噴霧される送達溶液の体積およびエタノールの濃度は、毒性を最小にしながら送達効率を最大にするように微調整された(図25〜29)。噴霧ヘッドと細胞との間の距離31 mm、噴霧圧1.5バール、48ウェルプレートの場合の体積10 μlおよびエタノール濃度25%が、最適な送達効率および毒性レベルをもたらしたパラメータであった。

実施例2: 本発明の主題による、原形質膜を越えて最大15,000 Daの平均分子量を有する分子を送達することの効果
本実施例では、15,000 Daの平均分子量を有するFITC標識siRNA分子を、本発明の主題による機器を用いて細胞に送達した。マトリックスを形成させるため、siRNA分子を組成物に導入し、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes, pH約7.4、20、30または40% (v/v)のエタノール; および6.6 μMの送達させたい分子を含む水溶液とした。マイクロピペットを直接用いてまたは本明細書において記述される機器を用いてマトリックスが細胞の原形質膜と接触するように、マトリックス1 μLを0.065〜0.085 cm²の面積に送達した。送達された分子の相対量(蛍光の量)および細胞生存性(生存細胞の量)を評価し、割合として表した。結果を図4に示す。

図4に示すように、本発明の主題の方法を用いて最大15,000 Daの平均分子量を有する分子を送達すると、マイクロピペットを直接用いて細胞の原形質膜と接触させることにより分子を送達する(ハッシュ線)のと比較して、分子の送達率(例えば、分子送達の成功を示す細胞のパーセント)が増加する(黒色バー)。実際に、30または40% (v/v)のエタノールを含む組成物、およびマイクロピペットを直接用いて得られたマトリックスを送達することでは、生存細胞において分子の送達は検出されなかった。

実施例3: 本主題による、原形質膜を越えて最大1,000 Daの平均分子量を有する分子を送達することの効果
本実施例では、668 Daの平均分子量を有するヨウ化プロピジウム分子を、本発明の主題による方法を用いて細胞に送達した。マトリックスを形成させるため、当該分子を組成物に導入し、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes, pH約7.4、20または40% (v/v)のエタノール; および150 μMの送達させたい分子を含む水溶液とした。マイクロピペットを直接用いてまたは本明細書において前述される機器を用いてマトリックスが細胞の原形質膜と接触するように、マトリックス1 μLを0.065〜0.085 cm²の面積に送達した。結果を図4に示す。

図5に示すように、本発明の主題による方法を用いてマトリックス中で最大668 Daの平均分子量を有する分子を送達すると、マイクロピペットを直接用いて細胞の原形質膜と接触させることにより分子を送達する(ハッシュ線)のと比較して、分子の送達率(例えば、分子送達の成功を示す細胞のパーセント)が増加する(黒色バー)(y軸は送達されたパーセント、およびx軸はエタノールのパーセントを示す)。実際に、40% (v/v)のエタノールを含む組成物、およびマイクロピペットを直接用いて得られたマトリックスを送達することでは、生存細胞において分子の送達は検出されなかった。

実施例4: 原形質膜を越える、1超の分子量の分子の送達
本実施例では、第一の分子である、668 Daの平均分子量を有するヨウ化プロピジウム、および第二の分子である、40,000の分子量を有するFITC標識デキストランを共に、本発明の主題の機器を用いて細胞に同時送達した。マトリックスを形成させるため、第一および第二の分子を組成物に同時に導入し、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes; pH約7.4、25% (v/v)のエタノール; および150 μMの送達させたい分子を含む水溶液とした。本発明の主題の方法を用いてエアロゾルの形態でマトリックスが細胞の原形質膜と接触するように、マトリックス1 μLを0.065〜0.085 cm²の面積に送達した。結果を図6A〜6Cに示す。

図6Aに示すように、本発明の主題を用いてマトリックス中で668 Daの平均分子量を有する第一の分子を送達すると、細胞への分子の送達がもたらされる。図6Bは、本発明の主題を用いて同じマトリックス中で40,000 Daの平均分子量を有する第二の分子を同時送達すると、細胞への分子の同時送達がもたらされることを示す。同時送達を図6Cに示す。

実施例5: 本発明の主題による、原形質膜を越えて最大500,000 Daの平均分子量を有する分子を送達することの効果
本実施例では、10,000 Daの平均分子量を有するFITC標識デキストランの分子を、本発明の主題による機器を用いて細胞に送達した。マトリックスを形成させるため、当該分子を組成物に導入し、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes; pH約7.4; 25% (v/v)のエタノール; および150 μMの送達させたい分子を含む水溶液とした。マイクロピペットを直接用いてまたは本発明の主題の機器を用いてマトリックスが細胞の原形質膜と接触するように、マトリックス1 μLを0.065〜0.085 cm²の面積に送達した。結果を図7に示す。

図7に示すように、本発明の主題の方法を用いてマトリックス中で最大500,000 Daの平均分子量を有する分子を送達すると、マイクロピペットを直接用いて細胞の原形質膜と接触させることにより分子を送達する(ハッシュ線)のと比較して、分子の送達率(例えば、分子送達の成功を示す細胞のパーセント)が増加する(黒色バー)(y軸は送達されたパーセント、およびx軸はエタノールのパーセントを示す)。実際に、25% (v/v)のエタノールを含む組成物、およびマイクロピペットを直接用いて得られたマトリックスを送達することでは、生存細胞において分子の送達は検出されなかった。

実施例6: 68 mMのNaCl、1.4 mMのKCl、5 mMのNa₂HPO₄および0.9 mMのKH₂PO₄を含む第二の組成物と細胞を接触させることの効果
本実施例では、15,000 Daの平均分子量を有するFITC標識siRNA分子を、本発明の主題による機器を用いて細胞に送達した。細胞への当該分子の送達後、細胞を30秒間、ウシ胎仔血清(FBS)を有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM); FBSを有しないDMEM; 蒸留水(H₂O); 137 mMのNaCl、2.7 mMのKCl、10 mMのNa₂HPO₄および1.8 mMのKH₂PO₄ (1×PBS)の水溶液; 68 mMのNaCl、1.4 mMのKCl、5 mMのNa₂HPO₄および0.9 mMのKH₂PO₄ (0.5×PBS)の水溶液; または13.7 mMのNaCl、0.3 mMのKCl、1.0 mMのNa₂HPO₄および0.18 mMのKH₂PO₄ (1×PBS)の溶液のうち1つを含む第二の組成物200 μLと接触させた後に、培地の添加および本明細書において記述される蛍光顕微鏡検査法を用いた送達の評価を行った。結果を、実例となる図8に示す。

図8に示すように、本発明の主題による方法において細胞生存性を維持するためには、68 mMのNaCl、1.4 mMのKCl、5 mMのNa₂HPO₄および0.9 mMのKH₂PO₄ (0.5×PBS)の水溶液が好ましい(y軸は送達されたパーセントを示す)。

実施例7: 原形質膜を越える、異なる分子量の分子の送達
本実施例では、ヨウ化プロピジウム(668 Da)、FITC標識siRNA (15,000 Da)、Dy547標識miRNA (15,000 Da)、FITC標識デキストラン(40,000 Da)およびFITC標識デキストラン(500,000 Da)の分子を、本発明の主題による機器を用いて細胞にそれぞれ送達した。マトリックスを形成させるため、これらの分子をそれぞれ別々に組成物に導入し、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes; pH約7.4を含む水溶液とした。ここで該組成物には、25% (v/v)のエタノール; および150 μMの送達させたい分子を含めた。マイクロピペットを直接用いてまたは本発明の主題による方法によってマトリックスが細胞の原形質膜と接触するように、各マトリックス(送達させたい異なる分子を各々が含有する) 1 μLを0.065〜0.085 cm²の面積に送達した。細胞を0時間(ヨウ化プロピジウム)でまたは送達後24時間(siRNA-FITC、miRNA-Dy547およびデキストラン-FITC)で視覚化した。Olympus IX71倒立顕微鏡を用いて、(A) 蛍光および(B) 位相差を示す顕微鏡写真を得た。結果を図9に示す。

図9に示すように、さまざまな分子量の分子を、本発明の主題による機器を用いて細胞にうまく送達することができる。さらに、図29および43にそれぞれ示すように、さまざまな分子量のデキストラン(例えば、3 kDa、40 kDa、70 kDa、500 kDaおよび2,000 kDa)、ならびにタンパク質(例えば、β-ラクトグロブリン、HRP、オボアルブミン、BSA、カタラーゼおよびアポフェリチン)をうまく送達することができる。

それゆえ、本発明の主題は、原形質膜を越えて分子を送達するための機器を提供することができ、それによって細胞または各細胞の可逆的透過化により生細胞への分子の送達を可能にする。可逆的透過化は、各細胞を透過性にさせ、任意で一時的に透過性にさせ、それによって細胞への分子の取り込みを可能にする。有利には、容認できないほど高いレベルの細胞死が起きる前に透過性を元に戻すことができる。

実施例8: 最大15,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼす溶質含量の効果
本実施例では、15,000 Daの平均分子量を有するsiRNA分子を、本明細書において先に一般的に記述したように細胞に送達した。使用した組成物は、pH約7.4を有する水溶液であり、この組成物には25% (v/v)のエタノール; および3.3 μMの送達させたい分子を含めた。終濃度が32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウムおよび5 mMのhepesになるまで、スクロース、KCl、酢酸アンモニウムおよびhepesを添加することにより、1×溶液を調製した。さらなる試験溶液を0.2×、0.4×、0.6×、0.8×、2×、2.4×および2.8×のさまざまな溶質(スクロース、KCl、酢酸アンモニウムおよびhepes)濃度で調製した。結果を図10に示す。

図9に示すように、最大15,000 Daの平均分子量を有する分子の送達(黒色バー)の場合、溶質濃度が1×〜2×、任意で1×である、スクロース、KCl、酢酸アンモニウムおよびhepesを含む組成物が、細胞毒性(白色バー)がこれらの濃度で最小であることを考慮すると、好ましい。これは、32〜64 mMのスクロース、12〜24 mMのKCl、12〜24 mMの酢酸アンモニウムおよび5〜10 mMのhepes; さらに任意で32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウムおよび5 mMのhepesの溶質濃度に等しい。

実施例9: 最大15,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼすアルコール濃度の効果
本実施例では、15,000 Daの平均分子量を有するsiRNA分子を、本明細書において先に一般的に記述したように細胞に送達した。使用した組成物は、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウムおよび5 mMのhepes、pH約7.4、6.6 μMの送達させたい分子、ならびに5、10、20、30および40% (v/v)のエタノールを含む水溶液であった。結果を図11に示す。

図11に示すように、最大15,000 Daの平均分子量を有する分子の送達(黒色バー)の場合、細胞毒性(白色バー)を最小限に抑えながらも、2〜45% (v/v)のアルコール、任意で20〜30% (v/v)のアルコール、さらに任意で25% (v/v)のアルコールを含む組成物が好ましい。

比較試験として、15,000 Daの平均分子量を有するsiRNA分子を、本明細書において先に一般的に記述したように細胞に送達し、ここでは、使用した組成物は、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes、pH約7.4、6.6 μMの送達させたい分子、ならびに5、10、20および30% (v/v)のメタノールを含む水溶液であった。結果を図12に示す。

図12に示すように、最大15,000 Daの平均分子量を有する分子の送達(黒色バー)の場合、細胞生存性(白色バー)を最小限に抑えながらも2〜45% (v/v)のアルコール、任意で10〜20% (v/v)のアルコール、さらに任意で20% (v/v)のアルコールを含む組成物が好ましい。

実施例10: 最大1,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼす塩含量の効果
本実施例では、668 Daの平均分子量を有するヨウ化プロピジウム分子を、本明細書において先に一般的に記述したように細胞に送達した。使用した組成物は、pH約7.4を有する水溶液であり、この組成物には25% (v/v)のエタノール; 150 μMの送達させたい分子を含めた。試験溶液は、25%の、0.5×、1×、2×および4×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で調製したが、これは19.0 mM、37.9 mM、75.8 mMおよび151.6 mMの塩含量に等しい。結果を図12に示す。

実施例11: 最大1,000 Daの平均分子量を有する分子の送達に及ぼすアルコール濃度の効果
本実施例では、668 Daの平均分子量を有するヨウ化プロピジウム分子を、本明細書において先に一般的に記述したように細胞に送達した。使用した組成物は、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes、pH約7.4、150 μMの送達させたい分子、ならびに5、10、20、30および40% (v/v)のエタノールを含む水溶液であった。結果を図14に示す。

図14に示すように、最大1,000 Daの平均分子量を有する分子の送達の場合、2〜45% (v/v)のアルコール、任意で20〜30% (v/v)のアルコール、さらに任意で25% (v/v)のアルコールを含む組成物が好ましい。

比較試験として、668 Daの平均分子量を有するヨウ化プロピジウム分子を、本明細書において先に一般的に記述したように細胞に送達し、ここでは、使用した組成物は、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes、pH約7.4、150 μMの送達させたい分子、ならびに5、10、20および30% (v/v)のメタノールを含む水溶液であった。結果を図14に示す。

図15に示すように、最大1,000 Daの平均分子量を有する分子の送達(黒色バー)の場合、細胞毒性(白色バー)を最小限に抑えながらも5〜20% (v/v)のアルコール、任意で5、10または20% (v/v)のアルコールを含む組成物が好ましい。

さらなる比較試験として、668 Daの平均分子量を有するヨウ化プロピジウム分子を、本明細書において先に一般的に記述したように細胞に送達し、ここでは、使用した組成物は、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes、pH約7.4、150 μMの送達させたい分子、および2% (v/v)のブタノールを含む水溶液であった。結果を図16に示す。

図16に示すように、最大5,000 Daの平均分子量を有する分子の送達(黒色バー)の場合、細胞毒性(白色バー)を最小限に抑えながらも2% (v/v)のブタノールを含む組成物が好ましい。

従って、本発明の主題は、原形質膜を越えて分子を送達するための方法を提供し、それによって複数の細胞または各細胞の可逆的透過化により生細胞への分子の送達を可能にする。可逆的透過化は、複数の細胞または各細胞を透過性にさせ、任意で一時的に透過性にさせ、それによって細胞への分子の取り込みを可能にする。有利には、容認できないほど高いレベルの細胞死が起きる前に透過性を元に戻すことができる。

実施例12: 本主題による、原形質膜を越えて最大40,000 Daの平均分子量を有する分子を送達することの効果
本実施例では、40,000 Daの平均分子量を有するFITC標識デキストランの分子を、本主題による機器を用いて細胞に送達した。マトリックスを形成させるため、当該分子を組成物に導入し、32 mMのスクロース、12 mMのKCl、12 mMの酢酸アンモニウム、5 mMのhepes; pH約7.4; 40% (v/v)のエタノール; および10 μMの送達させたい分子を含む水溶液とした。マイクロピペットを直接用いてまたは本主題の機器を用いてマトリックスが細胞の原形質膜と接触するように、マトリックス1 μLを0.065〜0.085 cm²の面積に送達した。

図7に示すように、本発明の主題を用いてマトリックス中で最大40,000 Daの平均分子量を有する分子を送達すると、マイクロピペットを直接用いて細胞の原形質膜と接触させることにより分子を送達する(ハッシュ線)のと比較して、分子の送達率が増加する(黒色バー)。実際に、40% (v/v)のエタノールを含む組成物、およびマイクロピペットを直接用いて得られたマトリックスを送達することでは、生存細胞において分子の送達は検出されなかった。

実施例13: さまざまな分子タイプおよびサイズの分子を送達することの効果
本実施例では、広範囲の分子タイプおよびサイズの送達における課題に対処するための噴霧方法の能力について調べた。図29に示すように、3 kDa、40 kDa、70 kDa、500 kDaおよび2,000 kDaを含む、漸増サイズのデキストランについてA549細胞への送達に成功した。図30に示すように、直鎖siRNA分子(およそ15 kDa)および大きな抗体分子(150 kDa)のような種々の寸法を有する他のタイプの分子も送達された。さらに、異なるタイプの分子が広範囲の組み合わせで送達された。例えば、図31に示すように、10 kDaデキストラン-Alexa488およびDAPIの組み合わせと同様に、DAPI、ファロトキシンおよびミトトラッカーレッドについてA549細胞への同時送達に成功した。

噴霧はベクターなしの送達方法であるため、特に注目すべきなのは、この手法でmRNAおよびプラスミドDNAを送達する能力である。緑色蛍光タンパク質(GFP)およびルシフェラーゼをコードするレポーターmRNAをCHO細胞にスプレイフェクション(sprayfect)した。GFP発現は蛍光顕微鏡検査法によって観察し、ルシフェラーゼ発現は発光分析によって検出したところ、リポフェクトアミン(Lipofectamine) 2000対照と同等であった(図33および図34)。同様に、CHO細胞にスプレイフェクション(sprayfect)した場合、GFPおよびルシフェラーゼをコードするDNAプラスミドが発現した(図35および図36)。これらのデータは、細胞への送達後の核酸ペイロードの機能性を実証している。さらに、接着細胞に対処できること、および非常に低い毒性を有することは、多数の細胞を利用できないこともあって最小限の操作および継代段階が望ましい初代細胞集団および幹細胞集団にとって重要である。

実施例14: 接着細胞株、初代線維芽細胞、初代幹細胞および浮遊細胞を含む、複数の細胞型にわたる送達の効果
本実施例では、複数の細胞型にわたる送達方法を評価した。送達技法は、A549細胞株およびCHO細胞株、ならびに図37に示す初代線維芽細胞、および図39に示す初代MSC、を含む広範囲の接着細胞型にわたる展開に成功した。さらに、このプロトコルは、図41Aに示したU226ヒト多発性骨髄腫細胞のような浮遊細胞に対処するように適合に成功した。細胞懸濁液を多孔性細胞培養プレートインサートに入れ、およそ-0.5〜-0.68バールの短時間の穏やかな真空を20〜45秒間適用して、細胞を噴霧する前に上清を除去した(図41Aおよび図42)。

さらに、このプロトコルは、図41Bに示すTリンパ球細胞であるJurkat細胞のような浮遊細胞に対処するように適合に成功した。DAPIおよびミトトラッカーレッドについてJurkat細胞への送達に成功した(それぞれ図41B上部および中パネル)。さらに、GFPをコードするmRNAをJurkat細胞に送達し、送達後24時間でGFP発現を観察した。

実施例15: タンパク質の細胞内送達に関する送達技術の評価
送達技術の注目すべき用途は、タンパク質の細胞内送達である。タンパク質は、そのサイズ、形状および化学的性質に関して非常に多様な群であり、これらの分子の効率的な送達のために現在利用可能な方法はほとんどない。18.3 kDaから443 kDaまでの漸増サイズの広範囲のタンパク質を、FITCまたはAlexa-488のいずれかで標識し、噴霧によるそれらの送達について調べた。全てのタンパク質についてCHO細胞への送達に成功した(図43および図44)。タンパク質のサイズが増大するにつれて、送達効率が低下する一般的な傾向(図44)が観察された。タンパク質が細胞内に送達されたことをさらに確認するため、オボアルブミン-FITCを送達し、続いて抗オボアルブミン抗体を用いた免疫蛍光によって検出した(図45)。所与のタンパク質、この場合はβ-ラクトグロブリンについては、噴霧されたタンパク質の濃度が増加するにつれて、送達効率が増加することは明らかで、用量応答が明らかであった(図46)。

実施例16: 細胞への送達後のタンパク質の機能性の評価
細胞への送達後のタンパク質の機能性について調べた。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)活性の検出にはさまざまなアッセイ法が利用可能であり、2つのアッセイ法を用いてCHO細胞への噴霧後にHRP活性を検出した。第一に、標的タンパク質または核酸配列のインサイチューでの高密度標識を生成するために、HRPの触媒活性を通常用いる、Tyramide Signal Amplification (TSATM)アッセイ法を適合させた。Alexa Fluor(登録商標)488標識チラミド基質を用いて、噴霧による送達後のCHO細胞におけるHRPの活性および局在を実証した(図47)。第二に、DCFH-DAアッセイ法を用いてHRP活性を定量化した。2',7'ジクロロフルオレシン二酢酸塩(DCFH-DA)は疎水性非蛍光分子であり、これは細胞内に速やかに透過し、細胞内エステラーゼにより加水分解されてDCFH分子を生ずるが、これはその蛍光生成物2',7'ジクロロフルオレセイン(DCF)に酸化され得、これを測定することができる。HRPをCHO細胞にスプレイフェクション(sprayfect)し、細胞をDCFH-DAとともにインキュベートした。DCF生成の増加が、送達されるHRPの用量の増加とともに観察された(図48)。このアッセイ法では毒性は観察されなかった(図49)。

実施例17: 標的臓器の追跡のために初代MSCを噴霧により標識することについて評価した
MSCを含む、いくつかの細胞型は、インビボ細胞治療の用途に用いられる。しかしながら、体内での細胞輸送に関する理解が進んでいないためにこれらの戦略の多くでの成功は阻まれてきた。標的臓器への輸送の効率 vs. 非標的臓器における滞留は調べることが困難であり、これらのプロセスを理解するために動物試験での標識細胞の送達が用いられることが多い。細胞の効率的かつ迅速な標識は、現在のところ達成可能ではない。FITCおよび他の発蛍光団のような標準的な蛍光標識は、通常、組織および動物においてインサイチューで検出されるほど十分に明るくない。量子ドット(Q-ドット)のような、より明るい標識が最近開発されたが、満足のいくレベルの標識化を達成するために、これらは長時間の、通常は終夜の、細胞とのインキュベーションを必要とする。本主題の方法は、ペイロードが標的細胞に数分以内に送達される迅速な送達方法である。初代MSCにQ-ドットを送達する当該方法の能力、およびこれらがマウス脾臓におけるエクスビボ注入後にインサイチューで検出されうるかどうかについて調べた。

図50に示すように、Q-ドットを培養初代マウスMSCにスプレイフェクション(sprayfect)した。マウスを切開して脾臓を取り出し、培地100 μl中2×10⁵個のスプレイフェクションMSCを脾臓に注入した。脾臓における蛍光は、Cryovis器具を用いて3次元クリオイメージング(cryoimaging)により調べた。図51に示すように、脾臓においてQ-ドットが検出された。

実施例18: A549細胞、CHO細胞およびMSCにおいて細胞あたりに送達される実験測定体積
3つの異なる細胞株(A549、CHOおよびMCS)の面積を実験的に計算し、測定した(図55)。各細胞株の平均面積は、A549、CHO、およびMCSについて、それぞれ932 μm²、372 μm²および2054 μm²であると測定された。したがって、(48ウェル細胞培養プレートのサイズに基づく)ウェルあたりの細胞の計算数は、A549、CHOおよびMCSについて、それぞれ102,500個、255,000個および46200個であると計算された。10 μLの送達により、細胞あたりおよそ9.8×10^-5 μLがA549細胞に送達され、細胞あたり3.9×10^-5 μLがCHO細胞に送達され、細胞あたり2.2×10^-4 μLがMSCに送達された。これら3例の細胞あたりに送達される実験測定体積は、ATCC、Celeromics Technologies、および当業者によって知られている他の細胞培養の参考文献から得られる細胞直径の推定を利用して理論計算値の範囲内に入る(例えば、細胞あたり6.0×10^-7マイクロリットルおよび細胞あたり7.4×10^-4マイクロリットル)。

上記の説明および特許請求の範囲のなかで、「の少なくとも1つ」または「の1つもしくはそれ以上」のような語句が、接続する要素または特徴のリストに先立って現れる場合がある。2つまたはそれ以上の要素または特徴のリストのなかで「および/または」という用語が現れる場合もある。そのような語句は、それが用いられる文脈によって暗示的または明示的に別段の矛盾がない限り、列挙された要素もしくは特徴のいずれかを個別に意味するよう意図され、または列挙された要素もしくは特徴のいずれかを、その他の列挙された要素もしくは特徴のいずれかと組み合わせて意味するよう意図される。例えば、「AおよびBの少なくとも1つ」; 「AおよびBの1つまたは複数」; ならびに「Aおよび/またはB」という語句は各々、「Aのみ、Bのみ、またはAおよびBを一緒に」を意味するよう意図される。3つまたはそれ以上の項目を含むリストについても同様の解釈が意図される。例えば、「A、BおよびCの少なくとも1つ」; 「A、BおよびCの1つまたはそれ以上」; および「A、Bおよび/またはC」という語句は各々、「Aのみ、Bのみ、Cのみ、AおよびBを一緒に、AおよびCを一緒に、BおよびCを一緒に、またはAおよびBおよびCを一緒に」を意味するよう意図される。さらに、上記および特許請求の範囲での「に基づく」という用語の使用は、言及されていない特徴または要素も許容されるように、「に少なくとも部分的に基づく」を意味するよう意図される。

本明細書において記述される主題は、所望の構成に応じてシステム、機器、方法、および/または物品で具体化することができる。前述の説明において示された実施形態は、本明細書において記述された主題と一致する全ての実施形態を表すものではない。それよりむしろ、それらは、記述された主題に関連する局面と一致する単なる数例にすぎない。2〜3の変化形を上記で詳述したが、その他の修正または追加が可能である。特に、本明細書において記載したものに加えて、さらなる特徴および/または変化形を提供することができる。例えば、上述した実施形態は、開示された特徴のさまざまな組み合わせおよび部分的組み合わせ、ならびに/または上記で開示したいくつかのさらなる特徴の組み合わせおよび部分的組み合わせを対象とすることができる。さらに、添付の図面において描かれ、および/または本明細書において記述された論理の流れは、望ましい結果を達成するために、示された特定順序または連続順序を必ずしも必要としない。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内でありうる。

Claims (99)

1. 細胞の集団を提供する段階;および
   ペイロードおよび5パーセント濃度超のアルコールを含むある体積の水溶液と細胞の集団を接触させる段階
   を含み、
   体積が、
   (i) 細胞集団の曝露表面積;または
   (ii) 細胞集団中の細胞数
   の関数である、細胞の原形質膜を越えてペイロードを送達するための方法。
2. ある体積の水溶液が、噴霧液の形態で細胞の集団に送達される、請求項1記載の方法。
3. 体積が、細胞あたり6.0×10^-7マイクロリットル〜細胞あたり7.4×10^-4マイクロリットルである、請求項1記載の方法。
4. 体積が、細胞あたり9.3×10^-6マイクロリットル〜細胞あたり2.8×10^-5マイクロリットルである、請求項1記載の方法。
5. 体積が、細胞あたり4.9×10^-6マイクロリットル〜細胞あたり2.2×10^-3マイクロリットルである、請求項1記載の方法。
6. 体積が細胞あたり約1.9×10^-5マイクロリットルであり、「約」が10パーセント以内である、請求項1記載の方法。
7. 噴霧液が、1 nm〜100 μmの直径を含むコロイド粒子またはサブ粒子を含む、請求項2記載の方法。
8. 粒子が、30〜100 μmの直径を含む、請求項7記載の方法。
9. 体積が、曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり2.6×10^-9マイクロリットル〜曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり1.1×10^-6マイクロリットルである、請求項1記載の方法。
10. 体積が、曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり5.3×10^-8マイクロリットル〜曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり1.6×10^-7マイクロリットルである、請求項1記載の方法。
11. 体積が曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり約1.1×10^-7マイクロリットルであり、「約」が10パーセント以内である、請求項1記載の方法。
12. ある体積の水溶液と細胞の集団を接触させる段階が、水溶液をガス噴射して噴霧液を形成させることにより行われる、請求項1記載の方法。
13. 噴霧液が、
    直径30〜100 μmのサイズ範囲の、体積の不連続単位
    を含む、請求項12記載の方法。
14. 噴霧液が、
    約30〜50 μmの直径を有する、体積の不連続単位
    を含み、「約」が10パーセント以内である、請求項12記載の方法。
15. 20 μlの水溶液の全体積が約1.9 cm²の細胞占有面積に送達され、「約」が10パーセント以内である、請求項1記載の方法。
16. 10 μlの水溶液の全体積が約0.95 cm²の細胞占有面積に送達され、「約」が10パーセント以内である、請求項1記載の方法。
17. 細胞の集団を0.1〜10分間前記水溶液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加する、請求項1記載の方法。
18. 緩衝液または培地が、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む、請求項17記載の方法。
19. 細胞の集団を2秒〜5分間前記水溶液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加する、請求項1記載の方法。
20. 細胞の集団を30秒〜2分間前記水溶液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加する、請求項1記載の方法。
21. 細胞の集団を約1〜2分間噴霧液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加する、請求項17記載の方法。
22. 水溶液が、5〜30%のエタノール濃度を含む、請求項1記載の方法。
23. 水溶液が、75〜98%のH₂O、2〜45%のエタノール、6〜91 mMのスクロース、2〜35 mMの塩化カリウム、2〜35 mMの酢酸アンモニウム、および1〜14 mMの(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)のうち1つまたは複数を含む、請求項1記載の方法。
24. ガスが、窒素、周囲空気、または不活性ガスを含む、請求項12記載の方法。
25. 細胞の集団が、接着細胞を含む、請求項1記載の方法。
26. 接着細胞が、初代または不死化間葉幹細胞、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍静脈(HUVEC)細胞、およびヒト胎児腎臓(HEK)細胞のうち少なくとも1つを含む、請求項25記載の方法。
27. 細胞の集団が、非接着細胞を含む、請求項1記載の方法。
28. 非接着細胞が、初代または不死化造血幹細胞(HSC)、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、サイトカイン誘導キラー(CIK)細胞、ヒト臍帯血CD34+細胞、B細胞のうち少なくとも1つを含む、請求項27記載の方法。
29. ペイロードが、低分子量化学分子、ペプチドもしくはタンパク質、または核酸を含む、請求項1記載の方法。
30. 低分子量化学分子が、1,000 Da未満の分子量を含む、請求項29記載の方法。
31. 低分子量化学分子が、ミトトラッカー(登録商標)レッドCMXRos、ヨウ化プロピジウム、メトトレキサート、またはDAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)を含む、請求項30記載の方法。
32. ペプチドが、エカランチド、リラグルチドおよびイカチバントを含む、請求項29記載の方法。
33. 核酸が、低分子干渉RNA (siRNA)を含む、請求項29記載の方法。
34. siRNA分子が、約15,000 Daの分子量を含む、請求項33記載の方法。
35. タンパク質が、約1,000〜150,000 Daの分子量を含む、請求項29記載の方法。
36. タンパク質が、抗体またはその断片を含む、請求項29記載の方法。
37. 抗体またはその断片が、抗アクチン抗体、抗GAPDH抗体、抗Src抗体、抗Myc抗体、および抗Raf抗体を含む、請求項36記載の方法。
38. 核酸分子が、5,000,000 Da超を含む、請求項29記載の方法。
39. ペイロードが、治療剤を含む、請求項1記載の方法。
40. 治療剤が、シスプラチン、アスピリン、スタチン系薬剤、およびフルオキセチンのうち少なくとも1つを含む、請求項39記載の方法。
41. ペイロードが、診断剤を含む、請求項1記載の方法。
42. 診断剤が、メチレンブルー、パテントブルーV、およびインドシアニングリーンのうち少なくとも1つを含む、請求項41記載の方法。
43. ペイロードが、蛍光分子を含む、請求項1記載の方法。
44. ペイロードが、検出可能なナノ粒子を含む、請求項1記載の方法。
45. ナノ粒子が、量子ドットを含む、請求項44記載の方法。
46. 細胞の集団が実質的にコンフルエントであり、「実質的」が75パーセント超コンフルエントである、請求項1記載の方法。
47. 細胞の集団が、細胞の単層を形成する、請求項1記載の方法。
48. 細胞の原形質膜を越えてペイロードを送達するための組成物であって、ペイロード、5パーセント濃度超のアルコール、46 mM未満の塩、121 mM未満の糖、および19 mM未満の緩衝剤を含んだ水溶液を含む、組成物。
49. アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールおよびベンジルアルコールから選択される、請求項48記載の組成物。
50. 塩が、NaCl、KCl、Na₂HPO₄、C₂H₃O₂NH₄およびKH₂PO₄からなる群より選択される、請求項48記載の組成物。
51. 糖が、スクロースを含む、請求項48記載の組成物。
52. 緩衝剤が、4-2-(ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む、請求項48記載の組成物。
53. 細胞の原形質膜を越えてペイロードを送達するための機器であって、
    加圧されたガスを生成する空気発生器;
    空気発生器に機能的に連結された霧化器;
    ペイロードおよび5パーセント濃度超のアルコールを含むある体積の水溶液を含有するように構成された貯蔵器; ならびに
    空気発生器と霧化器との間の弁であって、加圧されたガスが霧化器を作動させるのを防止するための閉鎖位置と、加圧されたガスが霧化器を作動させてコロイド液滴を水溶液から生成させるための開口位置の間で切り替え可能であり、250ミリ秒未満の切り替え速度を有する、弁
    を含み、
    該霧化器が細胞の集団を水溶液と接触させるように配向され、かつ該体積が、
    (i) 細胞集団の曝露表面積;または
    (ii) 細胞集団中の細胞数
    の関数である、機器。
54. 細胞あたり6.0×10^-7マイクロリットル〜細胞あたり7.4×10^-4マイクロリットルの全体積を有するコロイド液滴を生成するように構成される、請求項53記載の機器。
55. 体積が、細胞あたり9.3×10^-6マイクロリットル〜細胞あたり2.8×10^-5マイクロリットルである、請求項53記載の機器。
56. 体積が細胞あたり約1.9×10^-5マイクロリットルであり、「約」が10パーセント以内である、請求項53記載の機器。
57. 体積が、曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり2.6×10^-9マイクロリットル〜曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり1.1×10^-6マイクロリットルである、請求項53記載の機器。
58. 体積が、曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり5.3×10^-8マイクロリットル〜曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり1.6×10^-7マイクロリットルである、請求項53記載の機器。
59. 体積が、曝露表面積の1平方マイクロメートルあたり約1.1×10^-7マイクロリットルであり、「約」が10パーセント以内である、請求項53記載の機器。
60. コロイド液滴が、
    直径30〜100 μmのサイズ範囲の、体積の不連続単位
    を含む、請求項53記載の機器。
61. 噴霧液が、
    約30〜50 μmの直径を有する、体積の不連続単位
    を含み、「約」が10パーセント以内である、請求項53記載の機器。
62. 20 μlの水溶液の全体積が約1.9 cm²の細胞占有面積に送達され、「約」が10パーセント以内である、請求項53記載の機器。
63. 10 μlの水溶液の全体積が約0.95 cm²の細胞占有面積に送達され、「約」が10パーセント以内である、請求項53記載の機器。
64. 細胞の集団を0.1〜10分間前記水溶液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加する、請求項53記載の機器。
65. 切り替え速度が、弁が閉鎖位置と開口位置との間で移行するのに必要な時間である、請求項53記載の機器。
66. 弁が、50〜200ミリ秒の切り替え速度を有する、請求項53記載の機器。
67. 霧化器が、弁が開口位置にある場合、30〜100マイクロメートルの直径を有するコロイド液滴を生成する、請求項53記載の機器。
68. 霧化器が、弁が開口位置にある場合、30〜50マイクロメートルの直径を有するコロイド液滴を生成する、請求項53記載の機器。
69. 細胞の集団を0.1〜10分間前記水溶液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加する、請求項53記載の機器。
70. 緩衝液または培地が、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む、請求項69記載の機器。
71. 細胞の集団を2秒〜5分間前記水溶液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加する、請求項53記載の機器。
72. 細胞の集団を30秒〜2分間前記水溶液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加する、請求項53記載の機器。
73. 細胞の集団を約1〜2分間噴霧液と接触させた後に、該細胞の集団を浸漬または懸濁させるための第二の体積の緩衝液または培地を添加する、請求項72記載の機器。
74. 水溶液が、10〜30%のエタノール濃度を含む、請求項53記載の機器。
75. 水溶液が、75〜98%のH₂O、2〜45%のエタノール、6〜91 mMのスクロース、2〜35 mMのKCl、2〜35 mMの酢酸アンモニウム、および1〜14 mMの(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)のうち1つまたは複数を含む、請求項53記載の機器。
76. 細胞の集団が、接着細胞を含む、請求項53記載の機器。
77. 接着細胞が、初代または不死化間葉幹細胞、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍静脈(HUVEC)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、およびヒト胎児腎臓(HEK)細胞のうち少なくとも1つを含む、請求項76記載の機器。
78. 細胞の集団が、非接着細胞を含む、請求項53記載の機器。
79. 非接着細胞が、初代または不死化造血幹細胞(HSC)、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、サイトカイン誘導キラー(CIK)細胞、ヒト臍帯血CD34+細胞、およびB細胞のうち少なくとも1つを含む、請求項78記載の機器。
80. ペイロードが、低分子量化学分子、ペプチドもしくはタンパク質、または核酸を含む、請求項53記載の機器。
81. 低分子量化学分子が、1,000 Da未満の分子量を含む、請求項80記載の機器。
82. 前記化学分子が、ミトトラッカー(登録商標)レッドCMXRos、ヨウ化プロピジウム、メトトレキサート、またはDAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)を含む、請求項81記載の機器。
83. ペプチドが、エカランチド、リラグルチドおよびイカチバントを含む、請求項80記載の機器。
84. 核酸分子が、低分子干渉RNA (siRNA分子)を含む、請求項80記載の機器。
85. siRNA分子が、15,000 Daの分子量を含む、請求項84記載の機器。
86. タンパク質が、1,000〜500,000 Daの分子量を含む、請求項80記載の機器。
87. タンパク質が、抗体またはその断片を含む、請求項80記載の機器。
88. 抗体またはその断片が、抗アクチン抗体、抗GAPDH抗体、抗Src抗体、抗Myc抗体、および抗Raf抗体を含む、請求項87記載の機器。
89. 核酸分子が、5,000,000 Da超の分子量を含む、請求項80記載の機器。
90. ペイロードが、治療剤を含む、請求項53記載の機器。
91. 治療剤が、シスプラチン、アスピリン、スタチン系薬剤、およびフルオキセチンのうち少なくとも1つを含む、請求項90記載の機器。
92. ペイロードが、診断剤を含む、請求項53記載の機器。
93. 診断剤が、メチレンブルー、パテントブルーV、およびインドシアニングリーンのうち少なくとも1つを含む、請求項92記載の機器。
94. ペイロードが、蛍光分子を含む、請求項53記載の機器。
95. ペイロードが、検出可能なナノ粒子を含む、請求項53記載の機器。
96. ナノ粒子が、量子ドットを含む、請求項95記載の機器。
97. 細胞の集団が実質的にコンフルエントであり、「実質的」が75パーセント超コンフルエントである、請求項53記載の機器。
98. 細胞の集団が、細胞の単層を形成する、請求項53記載の機器。
99. 体積が、細胞あたり4.9×10^-6マイクロリットル〜細胞あたり2.2×10^-3マイクロリットルである、請求項53記載の機器。

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