JP2004536089A - 物質を細胞内に導入するための配合物及び方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、物質を細胞内に導入するためのアルコール性脂質の配合物に関し、詳しくは、医療、美容、調査、診断、獣医、農業、又は製薬に使用される配合物に関する。前記配合物は、リン脂質、エタノール（又は他のＣ２−Ｃ４などの揮発性アルコール）、水、少なくとも１つの活性分子、任意的に追加するグリコール又は／及び他の添加物を含んでおり、物質を、取り込まれた、付着した、吸着した、複合した分子の細胞に導入する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質を細胞内に導入するためのアルコール性脂質の配合物に関し、詳しくは、医療、美容、調査、診断、獣医、農業、又は製薬に使用される配合物に関する。前記配合物は、リン脂質、エタノール（又は他のＣ２−Ｃ４などの揮発性アルコール）、水、少なくとも１つの活性分子、任意的に追加するグリコール又は／及び他の添加物を含んでおり、物質を、取り込まれた、付着した、吸着した、複合した分子の細胞に導入する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜は、生理的恒常性において、他の分子の浸透を阻んでいる間に、選択された分子の浸透を許可するのに、重要な役割を果たす。他の不透過性活性物質の導入が望まれる場合でも、透過障壁を破壊することが有用である。製薬の目的、遺伝子治療、ワクチン接種、微生物への導入、又は生物医学研究又は農業用の植物細胞のトランスフォーメーションでは、分子の細胞内への導入は、近年の研究では、多大な関心が持たれている。従来、この浸透の障害を克服するための１つの方法として、脂質濾胞方法がある。従来のリポソームでは、不浸透性分子の細胞膜障壁に対する浸透性を向上させることはできないが、いくつかの特別にデザインされた脂質濾胞によれば、それらの内容物を細胞質に効率良く導入することができる、ということが知られている。
【０００３】
濾胞方法による細胞内導入を向上させるための試みが、いくつか開示されている。それらの試みの１つとして、脂質濾胞を荷電させることにより、分子の封入能力を向上させたものがある。単一の陽イオン脂質を含んでいるリポソームは、インビトロ又はインビボにて、ＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に形質移入するのに使用される（Wrobel and Collins, 1995）。同様に、他の不浸透性物質の取り込み量を増加させるためにも使用される（Garrett et al. , 1999）。脂質と細胞膜とを混合させることができる陽イオンのリポソームは、複合したＤＮＡを細胞に導入することが報告されている。これは、たいがい、エンドサイトーシス・プロセスにより行われる（Miller et al. , 1998）。ポリカチオンのリポソームは、ｐ−ガラクトシダーゼと人胎盤のアルカリホスファターゼの、様々な細胞培養への導入を向上させることが知られている（Sells et al. , 1995）。他の試みとしては、例えばＰＥＧのような立体スタビライザを組み込むことにより、濾胞における脂質の組成を変更したものがある（Duzgunes and Nir, 1999; Miller et al. , 1998）。他には、特にｐＨ感応性リポソームに関して、細胞内に封入された分子に影響を及ぼすことを試みている（Chu et al. , 1990; Kono et al. , 1997）。また、ジメチル・スルホキシドと共にリポソームを投与することにより、ある濾胞方法による導入が向上することが知られている（Jain and Gewirtz, 1998; Kawai and Nishizawa, 1984）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヨーロッパ特許第0 804 160号、及び米国特許第5,716,638号には、様々なリポフィリシティ（lypophilicity）を膜の内部に導入する又は通り抜けさせるための高性能キャリアになると考えられる方法（Ethosomes）が開示されている。皮膚内に分子を浸透させる主な経路は、細胞間であり、細胞を経てではない。
【０００５】
したがって、調合することが容易で、細胞の取り込み及び輸送を向上させ、物質を細胞、腺、組織、及び他に導入することができ、細胞核又は他の細胞小器官に導入することができる配合物が求められている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、生体膜を通り抜けて浸透させるための、方法及び配合物に関する。前記配合物は、水性アルコール又は水性／アルコール性／グルコール脂質配合物であり、少なくとも、リン脂質、エタノール（又は他のＣ２−Ｃ４揮発性アルコール）、水を含んでいる。また、本発明の方法及び配合物は、取り込まれた又は複合した分子を、生体及び細胞膜を通り抜けて、細胞と細胞小器官（例えば細胞核）に導入するのを容易にするためのものである。
【０００７】
他の実施形態では、前記配合物は、さらに有機陽イオン小分子を含んでいる。
【０００８】
他の実施形態では、前記配合物は、分子量が１００〜６００の小分子量陽イオン（有機陽イオン小分子）を含んでいる。
【０００９】
他の実施形態では、前記配合物は、非リン脂質の有機陽イオン小分子を含んでいる。
【００１０】
本発明の配合物及び方法は、製薬、美容、医療、獣医、診断、農業、及び調査の用途に使用することができる。
【００１１】
本発明の配合物及び方法の利点は、次のとおりである。細胞の取り込み及び輸送を向上させる。前記配合物は調合するのが容易である。細胞、組織、腺、濾胞、及び器官に導入することができる。細胞核（又は他の細胞小器官）に導入することができる。
【００１２】
ある実施形態では、前記配合物は、リン脂質、エタノール、水、及び非リン脂質の有機両親媒性陽イオンを含んでいる。このことにより、生体膜を通り抜けて浸透させることができる。また、取り込まれた又は複合した分子を、生体及び細胞膜を通り抜けて、細胞と細胞小器官に導入するのが容易となる。
【００１３】
エタノールの存在は、１０〜５０％の量により、濾胞に負電荷を与える。また、陽イオンがそれらの配合物と結合することにより、濾胞に正電荷を与える。
【００１４】
他の実施形態では、前記配合物は、他の揮発性のＣ２−Ｃ４アルコールも含んでいる。
【００１５】
他の実施形態では、前記配合物は、エタノールの代わりに、他のＣ２−Ｃ４揮発性アルコールを含んでいる。
【００１６】
前記配合物は、リン脂質、１０％以上のエタノール（又は他のＣ２−Ｃ４揮発性アルコール）、０〜３０％のグリコール及び水から成る。
【００１７】
他の実施形態では、前記配合物は、０〜４０％のポリオールも含んでいる。
【００１８】
他の実施形態では、前記配合物は、リン脂質、エタノール（ＥｔＯＨ）、水（ＤＤＷ）、及びプロピレングリコール（ＰＧ）から成る。
【００１９】
他の実施形態では、陽イオンの配合物は、リン脂質、１０％以上のエタノール（又は他のＣ２−Ｃ４揮発性アルコール）、０〜３０％のグリコール及び水、非リン脂質陽イオン両親媒性分子を加えて調合される。本発明の非リン脂質陽イオン両親媒性分子は、リン脂質のグループに属さない比較的に小さな分子量（ＭＷ １００−６００）のものであり、例えば、プロプラノロールＨＣＬのようなものである（なお、これに限定されるわけではない）。
【００２０】
他の実施形態では、前記配合物は、インビトロ、生体外又は生体内のいずれの場合でも、物質を、細胞（培養物）、細胞膜、腺、毛包、毛幹、脂腺、組織、又は動植物の全ての器官に導入するのに使用することができる。
【００２１】
前記配合物は、生体及び細胞膜を通り抜けて浸透する。前記配合物は、取り込まれた又は複合した分子が生体及び細胞膜を通り抜けて浸透することを容易にする。
【００２２】
また、本発明の配合物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、水素化ＰＣ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、それらの混合物、リン脂質陽イオン、セラミド、及び他の脂質のような、異なるリン脂質を含んでいてもよい（なお、これらのリン脂質に限定されるものではない）。加えて、前記配合物は、コレステロールや界面活性剤などの他の添加物を含んでいてもよい。
【００２３】
リン脂質は、エマルションの調合における乳化剤と同様に、リポソーム系において、その幅広い使途で知られている。製薬又は美容の目的に使用されるこれらの全ての系は、水性の系である。前記系は、製剤の保存及び／又は質感の向上のためのアルコール及び／又はグリコールをいくらか含む。
【００２４】
前記リン脂質の原料としては、卵、大豆、半合成物、及び合成物を用いることができる。
【００２５】
最終生成物におけるアルコール（例えばＥｔＯＨ）の濃度は、１５〜５０％の範囲である。また、非水相（アルコールとグリコールの化合）における前記濃度は、１２〜７０％の範囲である。また、キャリアの残りには、水及び可能性がある添加物が含まれる。
【００２６】
前記配合物は、分子を細胞内に効果的に導入することができる。
【００２７】
本発明の配合物により導入することができる分子は、抗菌薬、駆虫薬、殺虫剤、治療薬、化学療法薬、生物学的製剤、診断用薬、ペプチド系抗生物質、抗にきび剤、有糸分裂性物質、抗有糸分裂性物質、ステロイド、抗多毛剤、発毛剤、ビタミン、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス薬、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド）、タンパク質／ペプチド／アミノ酸、脂質、糖、糖タンパク、糖脂質、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＯＤＮｓ）、ポリ陰イオン性高分子とその派生物、核酸、ＯＮ'ｓ、ＤＮＡとＲＮＡのオリゴヌクレオチド、裸のＯＤＮｓ、ビタミン、抗生物質、様々な高分子である（なお、これらに限定されるものではない）。
【００２８】
図１〜４に示すように、本発明の配合物は、細胞膜を通り抜けて、分子を細胞質に効果的に導入することができる。
【００２９】
前記配合物は、細胞核及び／又は他の細胞小器官（後に実施例１で説明する）に、分子を効果的に導入することができる。
【００３０】
前記配合物は、微生物、細菌、病原体などに、分子を効果的に導入することができる。
【００３１】
前記配合物は、ＩＰ、ＩＭ、ＳＣ、ＩＶ、腫瘍内、又は皮膚内に投与することができる。
【００３２】
前記配合物の形態としては、固形、スプレー状、パッチ状、又は半液状をとることができる。
【００３３】
他の実施形態では、前記配合物は、イオントフォレーゼ、音波泳動法、マイクロポレーション、極微針、エレクトロポレーション、ジェット、又はレーザにより投与される。
【００３４】
他の実施形態では、前記配合物は、培養に、１０−２００μｌ／ウエルの量で添加される。ウエルの容積は、１〜２ｍｌである。ウエルのサイズが異なる場合でも、同様の比率が保たれる。
【００３５】
本発明の配合物は、植物のどの部分にも投与することができる。例えば、葉、根、外皮、茎、アース、花、芽に投与される。
【００３６】
遺伝子治療に使用する場合は、本発明の配合物は、非リン脂質有機陽イオンを含んでいる。このことにより、選択された真核細胞内に、ＤＮＡを導入することができる。形質移入された細胞のゲノム内に組み込まれたＤＮＡの発現及びトランスフォーメーションを安定させる方法は知られている。リポソーム仲介トランスフェクションのための代表的な方法は、Ausebel 他によるCurrent Protocols in Molecular Biology,Volume 1, Unit 9.4.1に記載されている。哺乳類細胞へのＤＮＡの導入については、第９章を参照されたい。前記配合物の、細胞のトランスフェクションを容易にするための能力は、実施例４に示す。
【００３７】
本発明の核酸配合物は、核ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又は様々な組み合わせの混成物であろうとなかろうと、生物源（遺伝子組み換え型を含む）又はインビトロでの合成物から単離される。本発明の核酸は、形質転換された又は形質移入された全細胞、形質転換された又は形質移入された全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された又は十分に純粋なものに存在する。脂質と複合させる際は、前記核酸は、概ね十分なものが用いられる。
【００３８】
本発明の複合物において封入に使用される核酸は、癌関連の治療に用いることができる。例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、the tumor suppressor E1A from adenovirus 5）のような腫瘍遺伝子の発現を抑制する核酸や、細胞増殖又は分化を制御する核酸は、本発明の脂質：核酸複合物の好ましい成分である。例えば、サイトカイン、炎症性分子、増殖因子、テロメラーゼ、成長因子受容体、癌遺伝子産物、インターロイキン、インターフェロン、alpha-FGF、IGF-I、IGF-II、beta-FGF、PDGF、TNF、TGF-alpha、TGF-beta、KGF、SCF/c-Kit リガンド、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-l/LFA-1、及びhyalurinCD44の発現をエンコードした核酸、シグナル・トランスフェクション分子と対応する腫瘍遺伝子製品(例えば、Mos、Ras、Raf、及びMet)、転写活性化因子及びサプレッサ（例えば、p53、p21、Tat、ステロイド・ホルモン受容体（エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、及びコルチコステロンなどのような））が知られており、好ましく、幅広く利用できる。上記したいかなるｍＲＮＡのトランスレーションを認識し抑制するアンチセンスＲＮＡやリボザイムのような、それら分子の阻止因子をエンコードした核酸も好ましい。最終的には、アポトーシス又は他の形態の細胞死を引き起こす自殺遺伝子をエンコードしている核酸が好ましい。特に、急速に分裂する細胞（例えば、癌細胞）において最も活動的な自殺遺伝子、ガンシクロビルと組み合わせて単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノウイルス由来のＥ１Ａ細胞生成物、又は様々な他のウイルス遺伝子が好ましい。反作用剤が添加されるまで活性化しないネガティブの各種のマーカも適している。細胞増殖制御因子と結合する分子をエンコードしたおとり核酸は、ある用途に対しては適している。トランスドミナント分子をエンコードした核酸は、同様に、用途によっては適している。
【００３９】
本発明の配合物は、例えば、従来の手法による原核細胞のプロトプラスト（原形質体）へのプラスミドＤＮＡ導入のような、核酸を導入するにも使用することができる。
【００４０】
本発明の配合物は、植物細胞のプロトプラスト内に、核酸を導入するのに使用することができる。リン脂質の水泡は、リポソーム内容物を植物細胞へ細胞内導入するのに使用される（例えばタバコプロトプラスト）。タバコモザイク病ウイルス（ＴＭＶ）、ＲＮＡは、SzokaとPapahadjopoulosにより開発されたリバース蒸着法を使用して、リポソーム調合液に封入される。PNAS USA 75:4194-4198（1978）を参照されたい。トマト、ユリ、甘草、タマネギ、エンドウ、ペチュニアのような、様々な植物種（花と野菜）を対照にした研究が報告されている。Genetic Engineering of Plants, Ed. Kosuge, Merideith and Hollaender(出版:Plenum Press、著者:FraleyとHorsch)の表題「In vitro Plant Transformation Systems Using Liposomes and Bacterial Co-Cultivation」, Vol. 26, pps. 177-194(1983)や他の項目を参照されたい。同じように、本発明の配合物の当業者による目的に応じた適切な改良は、植物を形質転換するのに使用される。
【００４１】
ＤＮＡプラスミドのような活性物質を含む本発明の配合物は、患者の腫瘍疾患に直接噴射するのに適している。そのような配合物は、嚢胞性線維症の患者の気管、鼻、又は他の体腔などの、気道内へのエアロゾルに適用することができる。同じように、そのような配合物は、腹膜腔に転移した卵巣癌の患者への腹膜注入に用いられる。アルツハイマー病の治療には、欠陥標的遺伝子の治療コピーの発現を引き起こすための脳細胞のトランスフェクションと直接注入に、多大な関心が持たれている。本発明の配合物は、同様に、欠陥遺伝子が原因となる、筋ジストロフィー、Ｂ型血友病、及びいくつかの他の病気に対しての遺伝子治療に有用であると考えられる。前記配合物は、本発明の陽イオン分子を１つ以上含んでいる。なお、これは、他の陽イオン分子の使用を除外するものではない。製剤を提供することは、細胞のトランスフェクションに対して十分に安定的及び効果的である。本発明の陽イオン分子の特性に関する知識（及び他の脂質に関する知識）を有する当業者は、特殊な細胞のトランスフェクションに最適となるように、配合物を容易に形成することが可能であろう。
【００４２】
他の実施形態では、前記配合物は、細胞に導入するために、概して、ポリアニオン化合物（核酸を含む）と混ぜる。複合物は、陽イオン配合物と負電荷のポリアニオン化合物との荷電相互作用により形成される。特定の用途のポリアニオンは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの化合物の核酸を含む。中性脂質は、前記複合物に随意的に添加される。
【００４３】
他の実施形態では、本発明は、本発明の配合物を投与することにより、細胞内へ物質を導入する方法を提供する。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、本発明の配合物を投与することにより、細胞核へ核酸配列を導入する方法を提供する。
【００４５】
本発明のさらなる理解を容易にするために、本発明の詳細な説明を主な目的として、下記の実施例を挙げる。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：蛍光プローブの細胞内導入）
《実験方法》
〈材料〉
ローダミン・赤・ジヘキサデカノイルグリセロホスホエタノールアミン（ＲＲ）、４−（４−ジエチルアミノ）スチリル−Ｎ−メチルピリジニウム・ヨードデ（Ｄ−２８９）、カルセイン、及び、リブ／デッド 生存可能性／細胞傷害性・キット（Molecular Probes Eugene, Oregon, USAより購入）。
【００４７】
螢光ホスファチジルコリン［ｌ−パルミトイル−２−［１２−７−ニトロ−２−１，３−ベンズオキサジアジル１−４イル・アミノ［ドデカニル］ｓｎ−グリセロ−３］］−ホスファチジルコリン（AvantiPolar Lipids, USAより購入）。
【００４８】
ホスホリポン９０（Natterman GMBH, Germanyより購入）。
【００４９】
エタノール（Frutarom, Israelより購入）。
【００５０】
Dulbecco社製の調整済最小必須培養液（DMEM）、Dulbecco社製のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Biological Industries, Beit HaEmek, Israel）より購入）。
【００５１】
他の全ての材料は分析的な品質で用意した。
【００５２】
〈配合物の調合〉
ホスホリポン９０（ＰＬ）とプローブ（０．０３％ ｗ／ｗ）をエタノール中に溶解させる。陽イオン小分子（プロプラノロールＨＣｌ又はトリヘキシフェニジルＨＣｌ（ＴＨＰ）のような）を添加する実験では、前記化合物もエタノール相に溶解させる。Heidolph digital 2000 RZR-2000（Heidolph Digital, Germany）により攪拌しながら、水をアリコートに添加する（望ましい濃度となるまで）。従来の合成手法によりリポソームを調合する。簡単に説明すると、ＰＬと蛍光プローブをクロロホルム中に溶解させる。続いて、Ｒ−ロータリ蒸発装置（Buchi, Germany）を使用して、溶媒を蒸発させる。そして、フラスコの内壁に残留している薄膜を水和させる。
【００５３】
本明細書中では次の略語を使用している。
【００５４】
ＰＣ：ホスファチジルコリン［ｌ−パルミトイル−２−［１２−７−ニトロ−２−１，３−ベンズオキサジアジル１−４イル・アミノ［ドデカニル］ｓｎ−グリセロ−３］］−ホスファチジルコリン
ＰＬ：ホスホリポン９０（卵ホスファチジルコリン）
ＲＲ：ローダミン・赤・ジヘキサデカノイルグリセロホスホエタノールアミン
Ｄ−２８９：４−（４−ジエチルアミノ）スチリル−Ｎ−メチルピリジニウム・ヨードデ
ＤＤＷ：再蒸留水
ＥｔＯＨ：エタノール
ＴＨＰ：トリヘキシフェニジル（HCl or at a pH when the molecule is ionized）
プロプラノロール：（HCl or at a pH when the molecule is ionized）
【００５５】
〈配合物Ｉ〉
２ｇのＰＬと、０．０３ｇのＤ−２８９を３ｇのエタノールに溶解させる。
【００５６】
Heidolph digital 2000 RZR-2000により攪拌しながら、ＤＤＷをアリコートに１０ｇになるまで添加する。
【００５７】
〈配合物ＩＩ〉
Ｄ−２８９の代わりＰＣを使用する。方法は、配合物Ｉの場合と同じである。
【００５８】
〈配合物ＩＩＩ〉
Ｄ−２８９の代わりＲＲを使用する。手法は、配合物Ｉの場合と同じである。
【００５９】
〈対照系〉
（Ａ）プローブの水性エタノール溶液：０．０３ｇのプローブ（ＲＲ又はＤ−２８９又はカルセイン）を、３ｇのエタノールに溶解させ、１０ｇになるまでＤＤＷを添加する。
（Ｂ）リポソーム：リポソームは従来の手法により調合される（New,1990）。簡単に説明すると、ＰＬと蛍光プローブをクロロホルム（Frutarom ,Israel）より中に溶解させる。続いて、Ｒ−ロータリ蒸発装置（Buchi, Germany）を使用して、溶媒を蒸発させる。そして、フラスコの内壁に残留している薄膜をＤＤＷにより水和させる。
（Ｃ）プローブを含んでいないシステム：２ｇのＰＬを３ｇのエタノールに溶解させる。Heidolph digital 2000 RZR-2000により攪拌しながら、ＤＤＷをアリコートに１０ｇになるまで添加する。
【００６０】
〈細胞培養〉
Subconfluent Swissアルピノマウス線維芽細胞（３Ｔ３）を、Dulbecco社製の調整済イーグル培地（ＤＭＥＭ）の、カバースリップの直径３．５ｃｍのウエルにて成長させる。前記ウエルは、共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）用である。また、流動細胞分析用に、プラスチック製の６穴プレートが用いられる。
【００６１】
〈ＣＬＳＭ実験〉
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により２度洗浄し、インキュベーター内で摂氏３７度に調整した後、再度洗浄する。２ｍｌのＰＢＳを各ウエルに添加した後、５０μｌの試液を添加する（配合物Ｉ−ＩＩＩ、対照系Ａ−Ｂ、又はＰＣ、ＲＲ、又はＤ−２８９を含んでいる他の配合物）。細胞を、試験製剤と共に、０、３、７、１０、又は３０分間培養する。培養後、培地を取り除き、前記細胞を１ｍｌのメタノールに３分間定着させた後、ＰＢＳにより２回洗浄する。蛍光放射は、ＲＲでは５６０ｎｍ以上のときに、Ｄ−２８９では５２７ｎｍのときに、カルセインでは４８８ｎｍのときに検出される。
【００６２】
〈フローサイトメトリー〉
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により２度洗浄し、インキュベーター内で摂氏３７度に調整した後、再度洗浄する。２ｍｌのＰＢＳを各ウエルに添加した後、５０μｌの試液を添加する（配合物Ｉ又は対照系Ｃ）。細胞は、試験系と共に、穏やかに攪拌しつつ、０、３、７、１０、又は３０分間培養する。培養後、培地を取り除き、前記細胞をトリプシン処理する（摂氏３７度，２分）。細胞は、１．５ｍｌのＰＢＳとウシ胎仔血清（ＦＣＳ）によりさらに処理した後、試験管に集められる。遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分）した後、上清を取り除き、前記細胞をホルムアルデヒドに定着させる。前記細胞を、最終的に濃度が０．５ｘ１０６となるように、３００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させる。Ｄ−２８９の流動細胞分析は、４色ＦＡＣＳスキャン（Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, USA）とＬｙｓｙｓＩＩソフトウェアを使用して行う。各分析では、５０，０００〜２００，０００範囲の事象が集められる。Ｄ−２８９の蛍光は、１０２４チャンネルの分解度で対数尺上に集計する。蛍光強度の平均値は、ＬｙｓｙｓＩＩソフトウェアにより線形値として示される。
【００６３】
《実験結果》
配合物ＩＩに由来する両親媒性蛍光色素Ｄ−２８９の時間依存性の浸透は、ＣＬＳＭにより計測される。蛍光強度により決定される最大浸透（２７．５±１．２ 任意のユニット）は、１０分間で到達し、少なくとも２０分間一定に保たれる。対照系Ｃの蛍光レベル（プローブを含んでいない）は、実験中は不変である。配合物Ｉに封入されたＤ−２８９の線維芽細胞への導入は、ＦＡＣＳにより評価される。プラトー・レベルを表すための、１０分間の導入時間は、ＦＡＣＳにより測定される。最初の（ｔ＝０ｍｉｎ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は２２．４７±１１．５６であり、１０分後には４７４．６０±６８．２４まで増加した。ＦＡＣＳとＣＬＳＭの両実験で、プローブの浸透が培養の３分以内に観測されたことは、注目に値するものである。
【００６４】
３つの異なるプローブであるＤ−２８９、ＲＲ、及びＰＣ（配合物Ｉ〜ＩＩＩ及び対照系Ａ，Ｂに由来する）の導入を、さらに試験した（図１参照）。適用した１０分後、配合物Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩにより処理された細胞にのみ蛍光が観測され、対照系では蛍光は観測されなかった。蛍光性脂質（ＲＲ及びＰＣ）の浸透は、それらの系の配合物は、それ自体が線維芽細胞に浸透することを示している。プローブＤ−２８９では、さらに細胞核内に蛍光が観測された。蛍光プローブが小有機陽イオンを含んでいる系から導入された場合、蛍光が観測されるレベルは、細胞核において観測される高レベルの蛍光と同様に、さらに強度である。これらの検出結果を、図２及び図３に示す。
【００６５】
〈ＰＣにより調合された配合物（図２）〉
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
【００６８】
【表３】
【００６９】
【表４】
【００７０】
【表５】
【００７１】
【表６】
【００７２】
【表７】
【００７３】
【表８】
【００７４】
〈Ｄ−２８９により調合された配合物（図３）〉
【００７５】
【表９】
【００７６】
【表１０】
【００７７】
【表１１】
【００７８】
【表１２】
【００７９】
【表１３】
【００８０】
（実施例２：培養細胞の生存可能性における導入システムの効果）
《実験方法》
〈リブ／デッド 生存可能性／細胞傷害性テスト〉
細胞内エステラーゼ活性と細胞膜の保全性を、リブ／デッド 生存可能性／細胞傷害性・キット（Molecular Probes Eugene, Oregon, USA）を使用して調べる。細胞を、前述した様々な試験系にて培養する。試液は、エチジウムホモダイマー（２０μｌ）、１０ｍｌのＰＢＳ、及び５μｌのカルセイン溶液から調合される。培養の終わりには、培地を取り除き、１ｍｌの試薬をウエルに添加する。プレートは室温にて、３０分間置かれる。カバースリップを取り除き、前述したようにしてＣＬＳＭにより観察する。
【００８１】
《実験結果》
この実験は、上記した蛍光プローブの浸透は、結果として、細胞の生存可能性の損失よりも、浸透を強化したかのかどうかを判断する目的で実施する。培養された細胞を、リブ／デッド 生存可能性／細胞傷害性・キットを使用して、細胞膜の保全性と生存可能性を試験する。この試験は、（ａ）カルセインの細胞内エステラーゼとの反応と、（ｂ）損傷した細胞膜を通り抜けたエチジウムホモダイマーの核酸との反応とに基づいて行われる。緑色の発色は生存可能性を示し、赤色の発色は死細胞を示す。この試験の結果は、様々な製剤が適用された場合でも、処理された細胞が生存できることを明確に実証する。
【００８２】
（実施例３：感受性テスト）
〈配合物ＩＶ〉
エリスロマイシン（Trima, Israel）ストックを、エタノール性溶液内に調合する。０．２ｇのＰＬ（ホスホリポン９０, Natterman GMBH, Germany）を、２ｇのエタノール（Frutarom, Israel）に溶解させる。前記エタノールに、前記薬剤の望ましい量のエタノール性原液を、最終的な濃度に達するまで添加する。そして、アリコート内に６．８ｇのＤＤＷが添加されているエタノールと共に、Heidolph digital 2000 RZR-2000（Heidolph Digital, Germany）により攪拌しながら３ｇにする。前記調合液を、０．２μのフイルタに通すことにより消毒する。
【００８３】
〈配合物Ｖ〉
エリスロマイシン（Trima, Israel）ストックを、エタノール性溶液内に調合する。０．２ｇのＰＬ（ホスホリポン９０, Natterman GMBH, Germany）と、０．１ｇのＮ−デシルメチルスルホキシド（Division Alameda Laboratories, Los Angles, USA）を、２ｇのエタノール（Frutarom, Israel）に溶解させる。望ましい量のエタノール性原液の薬剤を添加し、アリコート内に６．７ｇのＤＤＷが添加されているエタノールと共に、Heidolph digital 2000 RZR-2000 （Heidolph Digital, Germany）により攪拌しながら３ｇにする。前記調合液を、０．２μのフイルタに通すことにより消毒する。
【００８４】
〈標準液〉
滅菌水内の、様々な濃度のエリスロマイシン（１．２５，７．５，１０，１２．５ｇ／ｍｌ）。
【００８５】
〈使用される菌株〉
枯草菌 ＡＴＣＣ−６６３３
黄色ブドウ球菌 ＡＴＣＣ−２９２１３
エリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌（臨床株）
【００８６】
各エリスロマイシン濃縮液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Biological Industries, BeitHaEmek， Israel）と共に、配合物Ｉ、配合物ＩＩ、及び標準液と、１：１の容量で混合される。様々な抗生物質濃縮物を含んでいる、２０μｌの配合物Ｉ，ＩＩ，標準液を、ペトリ板上の６ｍｍのウエルに添加する。前記ペトリ板は微生物が接種されたトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）を含んでいる。調合液は、好気的に、摂氏３７度にて２４時間培養される。各サンプルの抑制域を測定する。
【００８７】
《実験結果》
〈枯草菌 ＡＴＣＣ−６６３３〉
エリスロマイシン濃度 １．２５マイクログラム／ｍｌ
【００８８】
エリスロマイシン濃度 ７．５マイクログラム／ｍｌ
【００８９】
〈黄色ブドウ球菌 ＡＴＣＣ−２９２１３〉
エリスロマイシン濃度 １．２５マイクログラム／ｍｌ
【００９０】
エリスロマイシン濃度 １０マイクログラム／ｍｌ
【００９１】
〈エリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌（臨床株）〉
エリスロマイシン濃度 １０マイクログラム／ｍｌ
【００９２】
エリスロマイシン濃度 １２．５マイクログラム／ｍｌ
【００９３】
（実施例４：インビボでの細胞内への遺伝子導入）
〈配合物ＶＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを２．５ｇのエタノールに溶解させ、その後、アリコート内の６．３ｇのＤＤＷと共に攪拌する（Heidolph digital 2000 RZR-20000により）ことにより調合する。実験を実施する前に（１５分前に）、１８０マイクロリットルの原液（４ｍｇのＰＬを含む）を、アリコート内の、６マイクログラムのＥＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルの水溶液に添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、ｃＤＮＡの濃度は、６マイクログラム／２００マイクロリットルになる。
【００９４】
〈配合物ＶＩＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを２．５ｇのエタノールに溶解させ、その後、攪拌しながら（Heidolph digital 2000 RZR-20000により）、６．３ｇのＤＤＷをアリコート内に添加する。実験を実施する前に（１５分前に）、１８０マイクロリットルの原液（４ｍｇのＰＬを含む）を、アリコート内の、６マイクログラムのｐ５３ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルの水溶液へ添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、ｃＤＮＡの濃度は、６マイクログラム／２００マイクロリットルになる。
【００９５】
〈配合物ＶＩＩＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを２．５ｇのエタノールに溶解させ、その後、攪拌しながら（Heidolph digital 2000 RZR-20000により）、６．３ｇのＤＤＷをアリコート内に添加する。実験を実施する前に（１５分前に）、１８０マイクロリットルの原液（４ｍｇのＰＬを含む）を、アリコート内の、６０マイクログラムのＥＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルの水溶液へ添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、ｃＤＮＡの濃度は、６０マイクログラム／２００マイクロリットルになる。
【００９６】
〈配合物ＶＩＸ〉
原液：０．２ｇのＰＬを２．５ｇのエタノールに溶解させ、その後、攪拌しながら（Heidolph digital 2000 RZR-20000により）、６．３ｇのＤＤＷをアリコート内に添加する。実験を実施する前に（１５分前に）、１８０マイクロリットルの原液を、アリコート内の、６０マイクログラムのｐ５３ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルの水溶液へ添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、ｃＤＮＡの濃度は、６０マイクログラム／２００マイクロリットルになる。
【００９７】
〈細胞培養〉
Subconfluent Osteosarcoma South細胞を、カバースリップ上のＤＭＥＭ内で成長させる（直径５ｃｍのペトリ皿に５つづつ）。
【００９８】
〈トランスフェクション方法〉
細胞をＰＢＳにより２度洗浄し、２ｍｌのＤＭＥＭを各プレート（５つのカバースリップを含んでいる）に添加する。１００マイクロリットルの配合物ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＶをプレートに添加し、プレートを摂氏３７度にて３０分間培養する。そして、２ｍｌの２０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を各プレートに添加し、２４時間培養を継続する。続く培養では、培地を取り除き、プレートを冷たいＰＢＳにより２度洗浄し、４ｍｌのメタノールを添加することにより細胞を定着させ、少なくとも１時間摂氏−２０度に保つ。細胞をＰＢＳで２度洗浄し、再水和するために、少なくとも１０分間放置する。ＧＦＰ発現を検出するために、カバースリップをＣＬＳ顕微鏡により観察する。次のパラメータは、実験の前に設定する。ピンホールの大きさ、獲得する電子、減光フイルタ、そしてバックグラウンドのレベル。ｐ５３発現を測定するためには、第１にｐ５３免疫染色を（anti p53 1801+DO-1）行い、第２に抗体（antimouse Cy-3）とカバースリップをＣＬＳ顕微鏡により観察する。
【００９９】
《実験結果》
この実験の結果を図４に示す。ＣＬＳ顕微鏡は、培養細胞が配合物ＶＩＩから導入されたｐ５３プラスミドにより効果的にトランスフェクトされたことを実証する。
【０１００】
【表１４】
【０１０１】
【表１５】
【０１０２】
（実施例５：インビボでの細胞内への遺伝子導入）
〈配合物Ｘ〉
原液：０．２ｇのＰＬを３ｇのエタノールに溶解させ、その後、Heidolph digital 2000 RZR-20000により攪拌しながら、４．３ｇのＤＤＷをアリコートに添加する。調合液を、抗菌加工の０．２μｍのフイルタに通す。実験を実施する前に（１５分前に）、６０マイクロリットルの原液を、アリコート内の、２０マイクログラムのＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルのＤＤＷに添加し、穏やかに攪拌する。最終的には、ｃＤＮＡの濃度を、２．５マイクログラム／１０マイクロリットルにする。
【０１０３】
〈配合物ＸＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを３ｇのエタノールに溶解させ、その後、Heidolph digital 2000 RZR-20000により攪拌しながら、４．３ｇのＤＤＷをアリコートに添加する。調合液を、抗菌加工の０．２μｍのフイルタに通す。実験を実施する前に（１５分前に）、６０マイクロリットルの原液を、アリコート内の、４０マイクログラムのＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルのＤＤＷに添加し、穏やかに攪拌する。最終的には、ｃＤＮＡの濃度を、５マイクログラム／１０マイクロリットルにする。
【０１０４】
〈配合物ＸＩＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを３ｇのエタノールに溶解させ、その後、Heidolph digital 2000 RZR-20000により攪拌しながら、４．３ｇのＤＤＷをアリコートに添加する。調合液を、抗菌加工の０．２μｍのフイルタに通す。実験を実施する前に（１５分前に）、６０マイクロリットルの原液を、アリコート内の、２００マイクログラムのＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルのＤＤＷに添加し、穏やかに攪拌する。最終的には、ｃＤＮＡの濃度を、２５マイクログラム／１０マイクロリットルにする。
【０１０５】
【表１６】
【０１０６】
【表１７】
【０１０７】
〈使用方法〉
配合物Ｘ，ＸＩ，ＸＩＩを含んでいる配合物、プロパラノロールを含んでいる配合物、又はＴＨＰを含んでいる配合物を、２０，４０又は６０マイクロリットル、ＣＤ−１ヌードマウス（メス、生後５週間）の背部の皮膚表面に塗る。塗られた範囲を、ヒルトップパッチにより覆う。包帯は４８時間内に取り除かれる。動物は３週間後に屠殺する。処理された皮膚を取り除き、細胞内の全ての組織に遺伝子を導入した後に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の構造を、前述のＣＬＳＭにより視覚化する。
【０１０８】
《実験結果》
ＣＬＳ顕微鏡写真は、配合物ＶIIIから導入されたＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡの全ての組織（皮膚）をトランスフェクションした後の、ＧＦＰの細胞内発現を実証する（図５参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】配合物Ｉ〜ＩＩＩ及び対照系から、蛍光プローブ導入後の、線維芽細胞内での細胞内蛍光発光を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。
【０１１０】
Ａ−ｌ，Ａ−２，Ａ−３：配合物Ｉ〜ＩＩＩに由来する
Ｂ−１，Ｂ−２，Ｂ−３：リポソーム対照系から導入される（対照系Ｂ）
Ｃ−１，Ｃ−２，Ｃ−３：水性エタノール対照系から導入される（対照系Ａ）
【図２】有機陽イオンを含んでいる配合物及び対照系から、蛍光ＰＣ導入後の、３Ｔ３線維芽細胞内での細胞内蛍光発光を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。対照系は、（ａ）はリポソーム、（ｂ）は製剤１、（ｃ）はプロプラノロール製剤、（ｃ）はＴＨＰ製剤である。
【図３】有機陽イオン（ＴＨＰ）を含んでいる配合物及（ａ）、及び対照系（ｂ：水性エタノール水溶液、ｃ：リポソーム）からＲＲ導入後の、３Ｔ３線維芽細胞内での細胞内蛍光発光を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。
【図４】配合物及ＩＶを使用したｐ５３プラスミドによる線維芽細胞内のトランスフェクション後に、二次抗体の細胞内蛍光発光を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。
【図５】配合物ＶＩＩＩ（Ｍ２）と対照（ＭＩ）由来のＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡによる全組織のトランスフェクション後の、ＧＦＰ細胞内発現を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。
【０００１】
本発明は、物質を細胞内に導入するためのアルコール性脂質の配合物に関し、詳しくは、医療、美容、調査、診断、獣医、農業、又は製薬に使用される配合物に関する。前記配合物は、リン脂質、エタノール（又は他のＣ２−Ｃ４などの揮発性アルコール）、水、少なくとも１つの活性分子、任意的に追加するグリコール又は／及び他の添加物を含んでおり、物質を、取り込まれた、付着した、吸着した、複合した分子の細胞に導入する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜は、生理的恒常性において、他の分子の浸透を阻んでいる間に、選択された分子の浸透を許可するのに、重要な役割を果たす。他の不透過性活性物質の導入が望まれる場合でも、透過障壁を破壊することが有用である。製薬の目的、遺伝子治療、ワクチン接種、微生物への導入、又は生物医学研究又は農業用の植物細胞のトランスフォーメーションでは、分子の細胞内への導入は、近年の研究では、多大な関心が持たれている。従来、この浸透の障害を克服するための１つの方法として、脂質濾胞方法がある。従来のリポソームでは、不浸透性分子の細胞膜障壁に対する浸透性を向上させることはできないが、いくつかの特別にデザインされた脂質濾胞によれば、それらの内容物を細胞質に効率良く導入することができる、ということが知られている。
【０００３】
濾胞方法による細胞内導入を向上させるための試みが、いくつか開示されている。それらの試みの１つとして、脂質濾胞を荷電させることにより、分子の封入能力を向上させたものがある。単一の陽イオン脂質を含んでいるリポソームは、インビトロ又はインビボにて、ＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に形質移入するのに使用される（Wrobel and Collins, 1995）。同様に、他の不浸透性物質の取り込み量を増加させるためにも使用される（Garrett et al. , 1999）。脂質と細胞膜とを混合させることができる陽イオンのリポソームは、複合したＤＮＡを細胞に導入することが報告されている。これは、たいがい、エンドサイトーシス・プロセスにより行われる（Miller et al. , 1998）。ポリカチオンのリポソームは、ｐ−ガラクトシダーゼと人胎盤のアルカリホスファターゼの、様々な細胞培養への導入を向上させることが知られている（Sells et al. , 1995）。他の試みとしては、例えばＰＥＧのような立体スタビライザを組み込むことにより、濾胞における脂質の組成を変更したものがある（Duzgunes and Nir, 1999; Miller et al. , 1998）。他には、特にｐＨ感応性リポソームに関して、細胞内に封入された分子に影響を及ぼすことを試みている（Chu et al. , 1990; Kono et al. , 1997）。また、ジメチル・スルホキシドと共にリポソームを投与することにより、ある濾胞方法による導入が向上することが知られている（Jain and Gewirtz, 1998; Kawai and Nishizawa, 1984）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヨーロッパ特許第0 804 160号、及び米国特許第5,716,638号には、様々なリポフィリシティ（lypophilicity）を膜の内部に導入する又は通り抜けさせるための高性能キャリアになると考えられる方法（Ethosomes）が開示されている。皮膚内に分子を浸透させる主な経路は、細胞間であり、細胞を経てではない。
【０００５】
したがって、調合することが容易で、細胞の取り込み及び輸送を向上させ、物質を細胞、腺、組織、及び他に導入することができ、細胞核又は他の細胞小器官に導入することができる配合物が求められている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、生体膜を通り抜けて浸透させるための、方法及び配合物に関する。前記配合物は、水性アルコール又は水性／アルコール性／グルコール脂質配合物であり、少なくとも、リン脂質、エタノール（又は他のＣ２−Ｃ４揮発性アルコール）、水を含んでいる。また、本発明の方法及び配合物は、取り込まれた又は複合した分子を、生体及び細胞膜を通り抜けて、細胞と細胞小器官（例えば細胞核）に導入するのを容易にするためのものである。
【０００７】
他の実施形態では、前記配合物は、さらに有機陽イオン小分子を含んでいる。
【０００８】
他の実施形態では、前記配合物は、分子量が１００〜６００の小分子量陽イオン（有機陽イオン小分子）を含んでいる。
【０００９】
他の実施形態では、前記配合物は、非リン脂質の有機陽イオン小分子を含んでいる。
【００１０】
本発明の配合物及び方法は、製薬、美容、医療、獣医、診断、農業、及び調査の用途に使用することができる。
【００１１】
本発明の配合物及び方法の利点は、次のとおりである。細胞の取り込み及び輸送を向上させる。前記配合物は調合するのが容易である。細胞、組織、腺、濾胞、及び器官に導入することができる。細胞核（又は他の細胞小器官）に導入することができる。
【００１２】
ある実施形態では、前記配合物は、リン脂質、エタノール、水、及び非リン脂質の有機両親媒性陽イオンを含んでいる。このことにより、生体膜を通り抜けて浸透させることができる。また、取り込まれた又は複合した分子を、生体及び細胞膜を通り抜けて、細胞と細胞小器官に導入するのが容易となる。
【００１３】
エタノールの存在は、１０〜５０％の量により、濾胞に負電荷を与える。また、陽イオンがそれらの配合物と結合することにより、濾胞に正電荷を与える。
【００１４】
他の実施形態では、前記配合物は、他の揮発性のＣ２−Ｃ４アルコールも含んでいる。
【００１５】
他の実施形態では、前記配合物は、エタノールの代わりに、他のＣ２−Ｃ４揮発性アルコールを含んでいる。
【００１６】
前記配合物は、リン脂質、１０％以上のエタノール（又は他のＣ２−Ｃ４揮発性アルコール）、０〜３０％のグリコール及び水から成る。
【００１７】
他の実施形態では、前記配合物は、０〜４０％のポリオールも含んでいる。
【００１８】
他の実施形態では、前記配合物は、リン脂質、エタノール（ＥｔＯＨ）、水（ＤＤＷ）、及びプロピレングリコール（ＰＧ）から成る。
【００１９】
他の実施形態では、陽イオンの配合物は、リン脂質、１０％以上のエタノール（又は他のＣ２−Ｃ４揮発性アルコール）、０〜３０％のグリコール及び水、非リン脂質陽イオン両親媒性分子を加えて調合される。本発明の非リン脂質陽イオン両親媒性分子は、リン脂質のグループに属さない比較的に小さな分子量（ＭＷ １００−６００）のものであり、例えば、プロプラノロールＨＣＬのようなものである（なお、これに限定されるわけではない）。
【００２０】
他の実施形態では、前記配合物は、インビトロ、生体外又は生体内のいずれの場合でも、物質を、細胞（培養物）、細胞膜、腺、毛包、毛幹、脂腺、組織、又は動植物の全ての器官に導入するのに使用することができる。
【００２１】
前記配合物は、生体及び細胞膜を通り抜けて浸透する。前記配合物は、取り込まれた又は複合した分子が生体及び細胞膜を通り抜けて浸透することを容易にする。
【００２２】
また、本発明の配合物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、水素化ＰＣ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、それらの混合物、リン脂質陽イオン、セラミド、及び他の脂質のような、異なるリン脂質を含んでいてもよい（なお、これらのリン脂質に限定されるものではない）。加えて、前記配合物は、コレステロールや界面活性剤などの他の添加物を含んでいてもよい。
【００２３】
リン脂質は、エマルションの調合における乳化剤と同様に、リポソーム系において、その幅広い使途で知られている。製薬又は美容の目的に使用されるこれらの全ての系は、水性の系である。前記系は、製剤の保存及び／又は質感の向上のためのアルコール及び／又はグリコールをいくらか含む。
【００２４】
前記リン脂質の原料としては、卵、大豆、半合成物、及び合成物を用いることができる。
【００２５】
最終生成物におけるアルコール（例えばＥｔＯＨ）の濃度は、１５〜５０％の範囲である。また、非水相（アルコールとグリコールの化合）における前記濃度は、１２〜７０％の範囲である。また、キャリアの残りには、水及び可能性がある添加物が含まれる。
【００２６】
前記配合物は、分子を細胞内に効果的に導入することができる。
【００２７】
本発明の配合物により導入することができる分子は、抗菌薬、駆虫薬、殺虫剤、治療薬、化学療法薬、生物学的製剤、診断用薬、ペプチド系抗生物質、抗にきび剤、有糸分裂性物質、抗有糸分裂性物質、ステロイド、抗多毛剤、発毛剤、ビタミン、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス薬、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド）、タンパク質／ペプチド／アミノ酸、脂質、糖、糖タンパク、糖脂質、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＯＤＮｓ）、ポリ陰イオン性高分子とその派生物、核酸、ＯＮ'ｓ、ＤＮＡとＲＮＡのオリゴヌクレオチド、裸のＯＤＮｓ、ビタミン、抗生物質、様々な高分子である（なお、これらに限定されるものではない）。
【００２８】
図１〜４に示すように、本発明の配合物は、細胞膜を通り抜けて、分子を細胞質に効果的に導入することができる。
【００２９】
前記配合物は、細胞核及び／又は他の細胞小器官（後に実施例１で説明する）に、分子を効果的に導入することができる。
【００３０】
前記配合物は、微生物、細菌、病原体などに、分子を効果的に導入することができる。
【００３１】
前記配合物は、ＩＰ、ＩＭ、ＳＣ、ＩＶ、腫瘍内、又は皮膚内に投与することができる。
【００３２】
前記配合物の形態としては、固形、スプレー状、パッチ状、又は半液状をとることができる。
【００３３】
他の実施形態では、前記配合物は、イオントフォレーゼ、音波泳動法、マイクロポレーション、極微針、エレクトロポレーション、ジェット、又はレーザにより投与される。
【００３４】
他の実施形態では、前記配合物は、培養に、１０−２００μｌ／ウエルの量で添加される。ウエルの容積は、１〜２ｍｌである。ウエルのサイズが異なる場合でも、同様の比率が保たれる。
【００３５】
本発明の配合物は、植物のどの部分にも投与することができる。例えば、葉、根、外皮、茎、アース、花、芽に投与される。
【００３６】
遺伝子治療に使用する場合は、本発明の配合物は、非リン脂質有機陽イオンを含んでいる。このことにより、選択された真核細胞内に、ＤＮＡを導入することができる。形質移入された細胞のゲノム内に組み込まれたＤＮＡの発現及びトランスフォーメーションを安定させる方法は知られている。リポソーム仲介トランスフェクションのための代表的な方法は、Ausebel 他によるCurrent Protocols in Molecular Biology,Volume 1, Unit 9.4.1に記載されている。哺乳類細胞へのＤＮＡの導入については、第９章を参照されたい。前記配合物の、細胞のトランスフェクションを容易にするための能力は、実施例４に示す。
【００３７】
本発明の核酸配合物は、核ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又は様々な組み合わせの混成物であろうとなかろうと、生物源（遺伝子組み換え型を含む）又はインビトロでの合成物から単離される。本発明の核酸は、形質転換された又は形質移入された全細胞、形質転換された又は形質移入された全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された又は十分に純粋なものに存在する。脂質と複合させる際は、前記核酸は、概ね十分なものが用いられる。
【００３８】
本発明の複合物において封入に使用される核酸は、癌関連の治療に用いることができる。例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、the tumor suppressor E1A from adenovirus 5）のような腫瘍遺伝子の発現を抑制する核酸や、細胞増殖又は分化を制御する核酸は、本発明の脂質：核酸複合物の好ましい成分である。例えば、サイトカイン、炎症性分子、増殖因子、テロメラーゼ、成長因子受容体、癌遺伝子産物、インターロイキン、インターフェロン、alpha-FGF、IGF-I、IGF-II、beta-FGF、PDGF、TNF、TGF-alpha、TGF-beta、KGF、SCF/c-Kit リガンド、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-l/LFA-1、及びhyalurinCD44の発現をエンコードした核酸、シグナル・トランスフェクション分子と対応する腫瘍遺伝子製品(例えば、Mos、Ras、Raf、及びMet)、転写活性化因子及びサプレッサ（例えば、p53、p21、Tat、ステロイド・ホルモン受容体（エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、及びコルチコステロンなどのような））が知られており、好ましく、幅広く利用できる。上記したいかなるｍＲＮＡのトランスレーションを認識し抑制するアンチセンスＲＮＡやリボザイムのような、それら分子の阻止因子をエンコードした核酸も好ましい。最終的には、アポトーシス又は他の形態の細胞死を引き起こす自殺遺伝子をエンコードしている核酸が好ましい。特に、急速に分裂する細胞（例えば、癌細胞）において最も活動的な自殺遺伝子、ガンシクロビルと組み合わせて単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノウイルス由来のＥ１Ａ細胞生成物、又は様々な他のウイルス遺伝子が好ましい。反作用剤が添加されるまで活性化しないネガティブの各種のマーカも適している。細胞増殖制御因子と結合する分子をエンコードしたおとり核酸は、ある用途に対しては適している。トランスドミナント分子をエンコードした核酸は、同様に、用途によっては適している。
【００３９】
本発明の配合物は、例えば、従来の手法による原核細胞のプロトプラスト（原形質体）へのプラスミドＤＮＡ導入のような、核酸を導入するにも使用することができる。
【００４０】
本発明の配合物は、植物細胞のプロトプラスト内に、核酸を導入するのに使用することができる。リン脂質の水泡は、リポソーム内容物を植物細胞へ細胞内導入するのに使用される（例えばタバコプロトプラスト）。タバコモザイク病ウイルス（ＴＭＶ）、ＲＮＡは、SzokaとPapahadjopoulosにより開発されたリバース蒸着法を使用して、リポソーム調合液に封入される。PNAS USA 75:4194-4198（1978）を参照されたい。トマト、ユリ、甘草、タマネギ、エンドウ、ペチュニアのような、様々な植物種（花と野菜）を対照にした研究が報告されている。Genetic Engineering of Plants, Ed. Kosuge, Merideith and Hollaender(出版:Plenum Press、著者:FraleyとHorsch)の表題「In vitro Plant Transformation Systems Using Liposomes and Bacterial Co-Cultivation」, Vol. 26, pps. 177-194(1983)や他の項目を参照されたい。同じように、本発明の配合物の当業者による目的に応じた適切な改良は、植物を形質転換するのに使用される。
【００４１】
ＤＮＡプラスミドのような活性物質を含む本発明の配合物は、患者の腫瘍疾患に直接噴射するのに適している。そのような配合物は、嚢胞性線維症の患者の気管、鼻、又は他の体腔などの、気道内へのエアロゾルに適用することができる。同じように、そのような配合物は、腹膜腔に転移した卵巣癌の患者への腹膜注入に用いられる。アルツハイマー病の治療には、欠陥標的遺伝子の治療コピーの発現を引き起こすための脳細胞のトランスフェクションと直接注入に、多大な関心が持たれている。本発明の配合物は、同様に、欠陥遺伝子が原因となる、筋ジストロフィー、Ｂ型血友病、及びいくつかの他の病気に対しての遺伝子治療に有用であると考えられる。前記配合物は、本発明の陽イオン分子を１つ以上含んでいる。なお、これは、他の陽イオン分子の使用を除外するものではない。製剤を提供することは、細胞のトランスフェクションに対して十分に安定的及び効果的である。本発明の陽イオン分子の特性に関する知識（及び他の脂質に関する知識）を有する当業者は、特殊な細胞のトランスフェクションに最適となるように、配合物を容易に形成することが可能であろう。
【００４２】
他の実施形態では、前記配合物は、細胞に導入するために、概して、ポリアニオン化合物（核酸を含む）と混ぜる。複合物は、陽イオン配合物と負電荷のポリアニオン化合物との荷電相互作用により形成される。特定の用途のポリアニオンは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの化合物の核酸を含む。中性脂質は、前記複合物に随意的に添加される。
【００４３】
他の実施形態では、本発明は、本発明の配合物を投与することにより、細胞内へ物質を導入する方法を提供する。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、本発明の配合物を投与することにより、細胞核へ核酸配列を導入する方法を提供する。
【００４５】
本発明のさらなる理解を容易にするために、本発明の詳細な説明を主な目的として、下記の実施例を挙げる。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：蛍光プローブの細胞内導入）
《実験方法》
〈材料〉
ローダミン・赤・ジヘキサデカノイルグリセロホスホエタノールアミン（ＲＲ）、４−（４−ジエチルアミノ）スチリル−Ｎ−メチルピリジニウム・ヨードデ（Ｄ−２８９）、カルセイン、及び、リブ／デッド 生存可能性／細胞傷害性・キット（Molecular Probes Eugene, Oregon, USAより購入）。
【００４７】
螢光ホスファチジルコリン［ｌ−パルミトイル−２−［１２−７−ニトロ−２−１，３−ベンズオキサジアジル１−４イル・アミノ［ドデカニル］ｓｎ−グリセロ−３］］−ホスファチジルコリン（AvantiPolar Lipids, USAより購入）。
【００４８】
ホスホリポン９０（Natterman GMBH, Germanyより購入）。
【００４９】
エタノール（Frutarom, Israelより購入）。
【００５０】
Dulbecco社製の調整済最小必須培養液（DMEM）、Dulbecco社製のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Biological Industries, Beit HaEmek, Israel）より購入）。
【００５１】
他の全ての材料は分析的な品質で用意した。
【００５２】
〈配合物の調合〉
ホスホリポン９０（ＰＬ）とプローブ（０．０３％ ｗ／ｗ）をエタノール中に溶解させる。陽イオン小分子（プロプラノロールＨＣｌ又はトリヘキシフェニジルＨＣｌ（ＴＨＰ）のような）を添加する実験では、前記化合物もエタノール相に溶解させる。Heidolph digital 2000 RZR-2000（Heidolph Digital, Germany）により攪拌しながら、水をアリコートに添加する（望ましい濃度となるまで）。従来の合成手法によりリポソームを調合する。簡単に説明すると、ＰＬと蛍光プローブをクロロホルム中に溶解させる。続いて、Ｒ−ロータリ蒸発装置（Buchi, Germany）を使用して、溶媒を蒸発させる。そして、フラスコの内壁に残留している薄膜を水和させる。
【００５３】
本明細書中では次の略語を使用している。
【００５４】
ＰＣ：ホスファチジルコリン［ｌ−パルミトイル−２−［１２−７−ニトロ−２−１，３−ベンズオキサジアジル１−４イル・アミノ［ドデカニル］ｓｎ−グリセロ−３］］−ホスファチジルコリン
ＰＬ：ホスホリポン９０（卵ホスファチジルコリン）
ＲＲ：ローダミン・赤・ジヘキサデカノイルグリセロホスホエタノールアミン
Ｄ−２８９：４−（４−ジエチルアミノ）スチリル−Ｎ−メチルピリジニウム・ヨードデ
ＤＤＷ：再蒸留水
ＥｔＯＨ：エタノール
ＴＨＰ：トリヘキシフェニジル（HCl or at a pH when the molecule is ionized）
プロプラノロール：（HCl or at a pH when the molecule is ionized）
【００５５】
〈配合物Ｉ〉
２ｇのＰＬと、０．０３ｇのＤ−２８９を３ｇのエタノールに溶解させる。
【００５６】
Heidolph digital 2000 RZR-2000により攪拌しながら、ＤＤＷをアリコートに１０ｇになるまで添加する。
【００５７】
〈配合物ＩＩ〉
Ｄ−２８９の代わりＰＣを使用する。方法は、配合物Ｉの場合と同じである。
【００５８】
〈配合物ＩＩＩ〉
Ｄ−２８９の代わりＲＲを使用する。手法は、配合物Ｉの場合と同じである。
【００５９】
〈対照系〉
（Ａ）プローブの水性エタノール溶液：０．０３ｇのプローブ（ＲＲ又はＤ−２８９又はカルセイン）を、３ｇのエタノールに溶解させ、１０ｇになるまでＤＤＷを添加する。
（Ｂ）リポソーム：リポソームは従来の手法により調合される（New,1990）。簡単に説明すると、ＰＬと蛍光プローブをクロロホルム（Frutarom ,Israel）より中に溶解させる。続いて、Ｒ−ロータリ蒸発装置（Buchi, Germany）を使用して、溶媒を蒸発させる。そして、フラスコの内壁に残留している薄膜をＤＤＷにより水和させる。
（Ｃ）プローブを含んでいないシステム：２ｇのＰＬを３ｇのエタノールに溶解させる。Heidolph digital 2000 RZR-2000により攪拌しながら、ＤＤＷをアリコートに１０ｇになるまで添加する。
【００６０】
〈細胞培養〉
Subconfluent Swissアルピノマウス線維芽細胞（３Ｔ３）を、Dulbecco社製の調整済イーグル培地（ＤＭＥＭ）の、カバースリップの直径３．５ｃｍのウエルにて成長させる。前記ウエルは、共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）用である。また、流動細胞分析用に、プラスチック製の６穴プレートが用いられる。
【００６１】
〈ＣＬＳＭ実験〉
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により２度洗浄し、インキュベーター内で摂氏３７度に調整した後、再度洗浄する。２ｍｌのＰＢＳを各ウエルに添加した後、５０μｌの試液を添加する（配合物Ｉ−ＩＩＩ、対照系Ａ−Ｂ、又はＰＣ、ＲＲ、又はＤ−２８９を含んでいる他の配合物）。細胞を、試験製剤と共に、０、３、７、１０、又は３０分間培養する。培養後、培地を取り除き、前記細胞を１ｍｌのメタノールに３分間定着させた後、ＰＢＳにより２回洗浄する。蛍光放射は、ＲＲでは５６０ｎｍ以上のときに、Ｄ−２８９では５２７ｎｍのときに、カルセインでは４８８ｎｍのときに検出される。
【００６２】
〈フローサイトメトリー〉
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により２度洗浄し、インキュベーター内で摂氏３７度に調整した後、再度洗浄する。２ｍｌのＰＢＳを各ウエルに添加した後、５０μｌの試液を添加する（配合物Ｉ又は対照系Ｃ）。細胞は、試験系と共に、穏やかに攪拌しつつ、０、３、７、１０、又は３０分間培養する。培養後、培地を取り除き、前記細胞をトリプシン処理する（摂氏３７度，２分）。細胞は、１．５ｍｌのＰＢＳとウシ胎仔血清（ＦＣＳ）によりさらに処理した後、試験管に集められる。遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分）した後、上清を取り除き、前記細胞をホルムアルデヒドに定着させる。前記細胞を、最終的に濃度が０．５ｘ１０６となるように、３００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させる。Ｄ−２８９の流動細胞分析は、４色ＦＡＣＳスキャン（Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, USA）とＬｙｓｙｓＩＩソフトウェアを使用して行う。各分析では、５０，０００〜２００，０００範囲の事象が集められる。Ｄ−２８９の蛍光は、１０２４チャンネルの分解度で対数尺上に集計する。蛍光強度の平均値は、ＬｙｓｙｓＩＩソフトウェアにより線形値として示される。
【００６３】
《実験結果》
配合物ＩＩに由来する両親媒性蛍光色素Ｄ−２８９の時間依存性の浸透は、ＣＬＳＭにより計測される。蛍光強度により決定される最大浸透（２７．５±１．２ 任意のユニット）は、１０分間で到達し、少なくとも２０分間一定に保たれる。対照系Ｃの蛍光レベル（プローブを含んでいない）は、実験中は不変である。配合物Ｉに封入されたＤ−２８９の線維芽細胞への導入は、ＦＡＣＳにより評価される。プラトー・レベルを表すための、１０分間の導入時間は、ＦＡＣＳにより測定される。最初の（ｔ＝０ｍｉｎ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は２２．４７±１１．５６であり、１０分後には４７４．６０±６８．２４まで増加した。ＦＡＣＳとＣＬＳＭの両実験で、プローブの浸透が培養の３分以内に観測されたことは、注目に値するものである。
【００６４】
３つの異なるプローブであるＤ−２８９、ＲＲ、及びＰＣ（配合物Ｉ〜ＩＩＩ及び対照系Ａ，Ｂに由来する）の導入を、さらに試験した（図１参照）。適用した１０分後、配合物Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩにより処理された細胞にのみ蛍光が観測され、対照系では蛍光は観測されなかった。蛍光性脂質（ＲＲ及びＰＣ）の浸透は、それらの系の配合物は、それ自体が線維芽細胞に浸透することを示している。プローブＤ−２８９では、さらに細胞核内に蛍光が観測された。蛍光プローブが小有機陽イオンを含んでいる系から導入された場合、蛍光が観測されるレベルは、細胞核において観測される高レベルの蛍光と同様に、さらに強度である。これらの検出結果を、図２及び図３に示す。
【００６５】
〈ＰＣにより調合された配合物（図２）〉
【００６６】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
〈Ｄ−２８９により調合された配合物（図３）〉
【００７５】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
（実施例２：培養細胞の生存可能性における導入システムの効果）
《実験方法》
〈リブ／デッド 生存可能性／細胞傷害性テスト〉
細胞内エステラーゼ活性と細胞膜の保全性を、リブ／デッド 生存可能性／細胞傷害性・キット（Molecular Probes Eugene, Oregon, USA）を使用して調べる。細胞を、前述した様々な試験系にて培養する。試液は、エチジウムホモダイマー（２０μｌ）、１０ｍｌのＰＢＳ、及び５μｌのカルセイン溶液から調合される。培養の終わりには、培地を取り除き、１ｍｌの試薬をウエルに添加する。プレートは室温にて、３０分間置かれる。カバースリップを取り除き、前述したようにしてＣＬＳＭにより観察する。
【００８１】
《実験結果》
この実験は、上記した蛍光プローブの浸透は、結果として、細胞の生存可能性の損失よりも、浸透を強化したかのかどうかを判断する目的で実施する。培養された細胞を、リブ／デッド 生存可能性／細胞傷害性・キットを使用して、細胞膜の保全性と生存可能性を試験する。この試験は、（ａ）カルセインの細胞内エステラーゼとの反応と、（ｂ）損傷した細胞膜を通り抜けたエチジウムホモダイマーの核酸との反応とに基づいて行われる。緑色の発色は生存可能性を示し、赤色の発色は死細胞を示す。この試験の結果は、様々な製剤が適用された場合でも、処理された細胞が生存できることを明確に実証する。
【００８２】
（実施例３：感受性テスト）
〈配合物ＩＶ〉
エリスロマイシン（Trima, Israel）ストックを、エタノール性溶液内に調合する。０．２ｇのＰＬ（ホスホリポン９０, Natterman GMBH, Germany）を、２ｇのエタノール（Frutarom, Israel）に溶解させる。前記エタノールに、前記薬剤の望ましい量のエタノール性原液を、最終的な濃度に達するまで添加する。そして、アリコート内に６．８ｇのＤＤＷが添加されているエタノールと共に、Heidolph digital 2000 RZR-2000（Heidolph Digital, Germany）により攪拌しながら３ｇにする。前記調合液を、０．２μのフイルタに通すことにより消毒する。
【００８３】
〈配合物Ｖ〉
エリスロマイシン（Trima, Israel）ストックを、エタノール性溶液内に調合する。０．２ｇのＰＬ（ホスホリポン９０, Natterman GMBH, Germany）と、０．１ｇのＮ−デシルメチルスルホキシド（Division Alameda Laboratories, Los Angles, USA）を、２ｇのエタノール（Frutarom, Israel）に溶解させる。望ましい量のエタノール性原液の薬剤を添加し、アリコート内に６．７ｇのＤＤＷが添加されているエタノールと共に、Heidolph digital 2000 RZR-2000 （Heidolph Digital, Germany）により攪拌しながら３ｇにする。前記調合液を、０．２μのフイルタに通すことにより消毒する。
【００８４】
〈標準液〉
滅菌水内の、様々な濃度のエリスロマイシン（１．２５，７．５，１０，１２．５ｇ／ｍｌ）。
【００８５】
〈使用される菌株〉
枯草菌 ＡＴＣＣ−６６３３
黄色ブドウ球菌 ＡＴＣＣ−２９２１３
エリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌（臨床株）
【００８６】
各エリスロマイシン濃縮液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Biological Industries, BeitHaEmek， Israel）と共に、配合物Ｉ、配合物ＩＩ、及び標準液と、１：１の容量で混合される。様々な抗生物質濃縮物を含んでいる、２０μｌの配合物Ｉ，ＩＩ，標準液を、ペトリ板上の６ｍｍのウエルに添加する。前記ペトリ板は微生物が接種されたトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）を含んでいる。調合液は、好気的に、摂氏３７度にて２４時間培養される。各サンプルの抑制域を測定する。
【００８７】
《実験結果》
〈枯草菌 ＡＴＣＣ−６６３３〉
エリスロマイシン濃度 １．２５マイクログラム／ｍｌ
エリスロマイシン濃度 ７．５マイクログラム／ｍｌ
〈黄色ブドウ球菌 ＡＴＣＣ−２９２１３〉
エリスロマイシン濃度 １．２５マイクログラム／ｍｌ
エリスロマイシン濃度 １０マイクログラム／ｍｌ
〈エリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌（臨床株）〉
エリスロマイシン濃度 １０マイクログラム／ｍｌ
エリスロマイシン濃度 １２．５マイクログラム／ｍｌ
（実施例４：インビボでの細胞内への遺伝子導入）
〈配合物ＶＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを２．５ｇのエタノールに溶解させ、その後、アリコート内の６．３ｇのＤＤＷと共に攪拌する（Heidolph digital 2000 RZR-20000により）ことにより調合する。実験を実施する前に（１５分前に）、１８０マイクロリットルの原液（４ｍｇのＰＬを含む）を、アリコート内の、６マイクログラムのＥＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルの水溶液に添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、ｃＤＮＡの濃度は、６マイクログラム／２００マイクロリットルになる。
【００９４】
〈配合物ＶＩＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを２．５ｇのエタノールに溶解させ、その後、攪拌しながら（Heidolph digital 2000 RZR-20000により）、６．３ｇのＤＤＷをアリコート内に添加する。実験を実施する前に（１５分前に）、１８０マイクロリットルの原液（４ｍｇのＰＬを含む）を、アリコート内の、６マイクログラムのｐ５３ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルの水溶液へ添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、ｃＤＮＡの濃度は、６マイクログラム／２００マイクロリットルになる。
【００９５】
〈配合物ＶＩＩＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを２．５ｇのエタノールに溶解させ、その後、攪拌しながら（Heidolph digital 2000 RZR-20000により）、６．３ｇのＤＤＷをアリコート内に添加する。実験を実施する前に（１５分前に）、１８０マイクロリットルの原液（４ｍｇのＰＬを含む）を、アリコート内の、６０マイクログラムのＥＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルの水溶液へ添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、ｃＤＮＡの濃度は、６０マイクログラム／２００マイクロリットルになる。
【００９６】
〈配合物ＶＩＸ〉
原液：０．２ｇのＰＬを２．５ｇのエタノールに溶解させ、その後、攪拌しながら（Heidolph digital 2000 RZR-20000により）、６．３ｇのＤＤＷをアリコート内に添加する。実験を実施する前に（１５分前に）、１８０マイクロリットルの原液を、アリコート内の、６０マイクログラムのｐ５３ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルの水溶液へ添加し、穏やかに攪拌する。最終的に、ｃＤＮＡの濃度は、６０マイクログラム／２００マイクロリットルになる。
【００９７】
〈細胞培養〉
Subconfluent Osteosarcoma South細胞を、カバースリップ上のＤＭＥＭ内で成長させる（直径５ｃｍのペトリ皿に５つづつ）。
【００９８】
〈トランスフェクション方法〉
細胞をＰＢＳにより２度洗浄し、２ｍｌのＤＭＥＭを各プレート（５つのカバースリップを含んでいる）に添加する。１００マイクロリットルの配合物ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＶをプレートに添加し、プレートを摂氏３７度にて３０分間培養する。そして、２ｍｌの２０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を各プレートに添加し、２４時間培養を継続する。続く培養では、培地を取り除き、プレートを冷たいＰＢＳにより２度洗浄し、４ｍｌのメタノールを添加することにより細胞を定着させ、少なくとも１時間摂氏−２０度に保つ。細胞をＰＢＳで２度洗浄し、再水和するために、少なくとも１０分間放置する。ＧＦＰ発現を検出するために、カバースリップをＣＬＳ顕微鏡により観察する。次のパラメータは、実験の前に設定する。ピンホールの大きさ、獲得する電子、減光フイルタ、そしてバックグラウンドのレベル。ｐ５３発現を測定するためには、第１にｐ５３免疫染色を（anti p53 1801+DO-1）行い、第２に抗体（antimouse Cy-3）とカバースリップをＣＬＳ顕微鏡により観察する。
【００９９】
《実験結果》
この実験の結果を図４に示す。ＣＬＳ顕微鏡は、培養細胞が配合物ＶＩＩから導入されたｐ５３プラスミドにより効果的にトランスフェクトされたことを実証する。
【０１００】
【表１４】
【表１５】
（実施例５：インビボでの細胞内への遺伝子導入）
〈配合物Ｘ〉
原液：０．２ｇのＰＬを３ｇのエタノールに溶解させ、その後、Heidolph digital 2000 RZR-20000により攪拌しながら、４．３ｇのＤＤＷをアリコートに添加する。調合液を、抗菌加工の０．２μｍのフイルタに通す。実験を実施する前に（１５分前に）、６０マイクロリットルの原液を、アリコート内の、２０マイクログラムのＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルのＤＤＷに添加し、穏やかに攪拌する。最終的には、ｃＤＮＡの濃度を、２．５マイクログラム／１０マイクロリットルにする。
【０１０３】
〈配合物ＸＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを３ｇのエタノールに溶解させ、その後、Heidolph digital 2000 RZR-20000により攪拌しながら、４．３ｇのＤＤＷをアリコートに添加する。調合液を、抗菌加工の０．２μｍのフイルタに通す。実験を実施する前に（１５分前に）、６０マイクロリットルの原液を、アリコート内の、４０マイクログラムのＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルのＤＤＷに添加し、穏やかに攪拌する。最終的には、ｃＤＮＡの濃度を、５マイクログラム／１０マイクロリットルにする。
【０１０４】
〈配合物ＸＩＩ〉
原液：０．２ｇのＰＬを３ｇのエタノールに溶解させ、その後、Heidolph digital 2000 RZR-20000により攪拌しながら、４．３ｇのＤＤＷをアリコートに添加する。調合液を、抗菌加工の０．２μｍのフイルタに通す。実験を実施する前に（１５分前に）、６０マイクロリットルの原液を、アリコート内の、２００マイクログラムのＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡを含んでいる２０マイクロリットルのＤＤＷに添加し、穏やかに攪拌する。最終的には、ｃＤＮＡの濃度を、２５マイクログラム／１０マイクロリットルにする。
【０１０５】
【表１６】
【表１７】
〈使用方法〉
配合物Ｘ，ＸＩ，ＸＩＩを含んでいる配合物、プロパラノロールを含んでいる配合物、又はＴＨＰを含んでいる配合物を、２０，４０又は６０マイクロリットル、ＣＤ−１ヌードマウス（メス、生後５週間）の背部の皮膚表面に塗る。塗られた範囲を、ヒルトップパッチにより覆う。包帯は４８時間内に取り除かれる。動物は３週間後に屠殺する。処理された皮膚を取り除き、細胞内の全ての組織に遺伝子を導入した後に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の構造を、前述のＣＬＳＭにより視覚化する。
【０１０８】
《実験結果》
ＣＬＳ顕微鏡写真は、配合物ＶIIIから導入されたＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡの全ての組織（皮膚）をトランスフェクションした後の、ＧＦＰの細胞内発現を実証する（図５参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】配合物Ｉ〜ＩＩＩ及び対照系から、蛍光プローブ導入後の、線維芽細胞内での細胞内蛍光発光を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。
【０１１０】
Ａ−ｌ，Ａ−２，Ａ−３：配合物Ｉ〜ＩＩＩに由来する
Ｂ−１，Ｂ−２，Ｂ−３：リポソーム対照系から導入される（対照系Ｂ）
Ｃ−１，Ｃ−２，Ｃ−３：水性エタノール対照系から導入される（対照系Ａ）
【図２】有機陽イオンを含んでいる配合物及び対照系から、蛍光ＰＣ導入後の、３Ｔ３線維芽細胞内での細胞内蛍光発光を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。対照系は、（ａ）はリポソーム、（ｂ）は製剤１、（ｃ）はプロプラノロール製剤、（ｃ）はＴＨＰ製剤である。
【図３】有機陽イオン（ＴＨＰ）を含んでいる配合物及（ａ）、及び対照系（ｂ：水性エタノール水溶液、ｃ：リポソーム）からＲＲ導入後の、３Ｔ３線維芽細胞内での細胞内蛍光発光を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。
【図４】配合物及ＩＶを使用したｐ５３プラスミドによる線維芽細胞内のトランスフェクション後に、二次抗体の細胞内蛍光発光を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。
【図５】配合物ＶＩＩＩ（Ｍ２）と対照（ＭＩ）由来のＣＭＶ−ＧＦＰ ｃＤＮＡによる全組織のトランスフェクション後の、ＧＦＰ細胞内発現を表すＣＬＳＭ顕微鏡写真を示す。
Claims (19)
- 物質を細胞内に導入するための配合物であって、
０．５〜ｌ０％（ｗ／ｗ）のリン脂質、１０〜５０％（ｗ／ｗ）のエタノール又は他のＣ２−Ｃ４揮発性アルコール、及び水を含むことを特徴とする配合物。 - ０．０５〜３％（ｗ／ｗ）の有機陽イオン小分子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の配合物。
- 前記陽イオン小分子は、非リン脂質の陽イオンであることを特徴とする請求項２に記載の配合物。
- ０〜３０％のグリコールをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の配合物。
- 前記物質は、駆虫薬、抗菌薬、抗有糸分裂性物質、有糸分裂性物質、ペプチド系抗生物質、ニュートロフィン、ステロイド、成長ホルモン、抗ヒスタミン薬、抗多毛剤、発毛剤、殺虫剤、化学療法薬、診断用薬、ホルモン、ビタミン、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス薬、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖、糖タンパク、糖脂質、アンチセンス、及びオリゴヌクレオチドのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の配合物。
- 前記物質は、核酸配列であることを特徴とする請求項１に記載の配合物。
- 前記核酸を、前記配合物と複合させたことを特徴とする請求項６に記載の配合物。
- 前記核酸は、ＤＮＡであることを特徴とする請求項７に記載の配合物。
- 前記配合物を、トランスフェクションのために、哺乳類細胞と混合させたことを特徴とする請求項６に記載の配合物。
- 前記配合物を、トランスフェクションのために、植物細胞と混合させたことを特徴とする請求項６に記載の配合物。
- 請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の配合物を投与することにより、物質を細胞内に導入することを特徴とする方法。
- 請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の配合物を投与することにより、核酸配列を細胞核内に導入することを特徴とする方法。
- 核酸配列により、細胞をトランスフェクションする方法。
- 請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の配合物を投与することにより、脂腺、濾胞、毛包、又は毛幹細胞に物質を導入する方法。
- 前記配合物は、ＩＰ、ＩＭ、ＳＣ、ＩＶ、腫瘍内、又は皮膚内に投与されることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の配合物。
- 前記配合物の形態は、パッチ状、スプレー状、半固体、又は液体であることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の配合物。
- 前記配合物は、イオントフォレーゼ、音波泳動法、マイクロポレーション、極微針、エレクトロポレーション、ジェット、又はレーザにより投与されることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の配合物。
- 前記配合物は、細胞培養に、１０−２００μｌ／ウエルの量で添加されることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の配合物。
- 前記配合物は、葉、根、外皮、茎、アース、花、芽に投与されることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の配合物。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009511571A (ja) * | 2005-10-11 | 2009-03-19 | イッサム リサーチ ディヴェロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシティー オブ エルサレム | 経鼻投与用組成物 |
| JP2010516816A (ja) * | 2007-01-29 | 2010-05-20 | トランスダーム， インコーポレイテッド | ヌクレオチドの経皮送達のための方法および組成物 |
| JP2010522741A (ja) * | 2007-03-29 | 2010-07-08 | イッサム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム・リミテッド | 経鼻デリバリー用組成物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05508626A (ja) * | 1990-04-19 | 1993-12-02 | バイカル・インコーポレイテッド | 生物学的活性分子の細胞内配達のための陽イオン脂質 |
| US5540934A (en) * | 1994-06-22 | 1996-07-30 | Touitou; Elka | Compositions for applying active substances to or through the skin |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1245988A (en) * | 1984-11-02 | 1988-12-06 | Richard H. Roydhouse | Oral fine dispersion sprays and emulsions |
| US5947921A (en) * | 1995-12-18 | 1999-09-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Chemical and physical enhancers and ultrasound for transdermal drug delivery |
| AU2845599A (en) * | 1998-03-05 | 1999-09-20 | Phares Pharmaceutical Research N.V. | Pharmaceutical compositions and their use |
| US6818227B1 (en) * | 1999-02-08 | 2004-11-16 | Alza Corporation | Liposome composition and method for administration of a radiosensitizer |
| AU765788B2 (en) * | 1999-02-10 | 2003-10-02 | Gmp Drug Delivery, Inc. | Iontophoresis, electroporation and combination patches for local drug delivery |
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2010
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05508626A (ja) * | 1990-04-19 | 1993-12-02 | バイカル・インコーポレイテッド | 生物学的活性分子の細胞内配達のための陽イオン脂質 |
| US5540934A (en) * | 1994-06-22 | 1996-07-30 | Touitou; Elka | Compositions for applying active substances to or through the skin |
| US5716638A (en) * | 1994-06-22 | 1998-02-10 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Composition for applying active substances to or through the skin |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6009005015, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ, １９９８， Ｖｏｌ．８， Ｎｏ．１, ｐａｇｅｓ １１３−１１４ * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009511571A (ja) * | 2005-10-11 | 2009-03-19 | イッサム リサーチ ディヴェロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシティー オブ エルサレム | 経鼻投与用組成物 |
| JP2010516816A (ja) * | 2007-01-29 | 2010-05-20 | トランスダーム， インコーポレイテッド | ヌクレオチドの経皮送達のための方法および組成物 |
| JP2010522741A (ja) * | 2007-03-29 | 2010-07-08 | イッサム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム・リミテッド | 経鼻デリバリー用組成物 |
| JP2018501812A (ja) * | 2014-10-24 | 2018-01-25 | アヴェクタス リミテッド | 細胞原形質膜を越える送達方法 |
| US10612042B2 (en) | 2014-10-24 | 2020-04-07 | Avectas Limited | Delivery across cell plasma membranes |
| JP2021007404A (ja) * | 2014-10-24 | 2021-01-28 | アヴェクタス リミテッド | 細胞原形質膜を越える送達方法 |
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