CN1863558B - 具有向核内转移能力的聚精氨酸修饰的脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供具有向细胞内和核内转移特性的脂质体，为了达到这个目的，提供在表面带有含连续数个精氨酸残基的肽的脂质体，具体来说，上述肽预先用疏水性基团或疏水性化合物修饰，上述疏水性基团或疏水性化合物插入脂质双层中，而上述肽露出上述脂质双层的脂质体。

Description

具有向核内转移能力的聚精氨酸修饰的脂质体 
技术领域
本发明涉及到具有向细胞内和核内转移特性的脂质体，以及利用该脂质体将目的物质输送到细胞内和核内用的载体。 
背景技术
近年来，不断进行着用于将药物、核酸、肽、蛋白质、糖等确实输送到靶部位的载体或媒介物的开发。例如在基因治疗中，作为用于将目的基因导入靶细胞的载体，开发了逆病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒等病毒载体。然而，由于病毒载体存在着大量生产的困难性、抗原性、毒性等问题，而这样的问题少的脂质体载体或肽媒介物引人注目。脂质体载体通过在其表面导入抗体、蛋白质、糖链等功能性分子，具有使对于靶部位的导向性提高的优点。 
作为脂质体载体，例如已经开发了聚精氨酸等凝集剂和核酸的复合物被包囊化的脂质体载体(参照专利文献1)。另外作为肽媒介物，已经开发了具有通膜性的来自HIV-1的Tat蛋白质、聚精氨酸、富含精氨酸肽等肽媒介物(参照专利文献2、3)。 
专利文献1：特表2002-520038号公报 
专利文献2：特开平10-33186号公报 
专利文献3：特开2001-199997号公报 
发明内容
本发明的目的在于提供具有向细胞内和核内转移特性的脂质体，以及利用该脂质体将目的物质输送到细胞内和核内用的载体。 
为了解决上述课题，本发明提供以下的脂质体。 
(1)表面带有含连续多个精氨酸残基的肽的脂质体。 
(2)上述(1)所述的脂质体，其中上述肽含有连续的4～20个精氨酸残基。 
(3)上述(1)或(2)所述的脂质体，其中上述肽由精氨酸残基构成。 
(4)上述(1)～(3)任一项所述的脂质体，其中阳离子性脂质相对于构成脂质双层的总脂的比例为0～40％(摩尔比)。 
(5)上述(1)～(4)任一项所述的脂质体，其中上述肽预先用疏水性基团或疏水性化合物修饰，上述疏水性基团或疏水性化合物插入脂质双层中，而上述肽从上述脂质双层露出。 
(6)上述(5)所述的脂质体，其中上述疏水性基团是硬脂酰基。 
(7)上述(1)～(6)任一项所述的脂质体，其中脂质体内封入了要向细胞内或核内输送的目的物质。 
(8)上述(7)所述的脂质体，其中上述目的物质是药物、核酸、肽、蛋白质、糖或它们的复合物。 
(9)上述(8)所述的脂质体，其中上述目的物质为核酸，上述核酸与聚阳离子性物质的复合物封入内部。 
(10)上述(9)所述的脂质体，其中聚阳离子性物质为硬脂酰基化的聚精氨酸。 
(11)上述(7)～(10)任一项所述的脂质体，该脂质体是将上述目的物质输送到细胞内用的载体。 
(12)上述(7)～(10)任一项所述的脂质体，该脂质体是将上述目的物质输送到核内用的载体。 
本发明的脂质体可以高效地向细胞内和核内转移。 
另外，本发明的脂质体可以在0～40℃的很宽温度区(有效的温度区为4～37℃)发挥向细胞内转移特性和向核内转移特性。 
另外，本发明的脂质体向细胞内转移途径由于只与胞饮作用有关，所以不需要脂质双层中含有阳离子性脂质，可以将阳离子性脂质对细 胞毒性抑制到最小限度。 
另外，本发明的脂质体可以发挥与腺病毒载体同等的基因表达活性，与腺病毒载体不同，不表现出细胞毒性。 
另外，本发明的脂质体通过调节其表面的肽量，通过大胞饮作用向细胞内转移。在大胞饮作用中，细胞外物质作为大胞饮泡的级分进入细胞内，大胞饮泡与核内体不同，不与溶酶体融合，所以大胞饮泡内封物可以避免被溶酶体分解。因此，本发明的脂质体通过大胞饮作用向细胞内转移时，封入到本发明脂质体的目的物质可以高效地被输送到细胞内或核内。 
另外，本发明的脂质体通过控制其表面带有的肽量，可以控制本发明的脂质体向细胞内转移的途径。 
附图的简单说明 
[图1]是表示荧光标记脂质体以及与其一起孵育的细胞用共聚焦激光显微镜观察的结果图。 
[图2]是表示于各种条件下虫荧光素酶表达活性的测定结果图。 
[图3]是表示于各种条件下细胞存活率(％)的测定结果图。 
[图4]是表示对于各种条件下可观察到荧光的细胞内区域面积进行比较的结果图。 
[图5]是表示于各种条件下虫荧光素酶表达活性的测定结果图。 
[图6]是表示于各种条件下虫荧光素酶表达活性的测定结果图。 
[图7]是表示于各种条件下脂质体整合到细胞内的量的测定结果图。 
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。 
本发明的脂质体只要是具有脂质双层膜结构的封闭小泡，对脂质双层数并没有特别限定，可以是多重膜脂质体(MLV)，也可以是SUV(small unilamella vesicle)、LUV(large unilamella vesicle)、GUV(giant unilamella vesicle)等单膜脂质体。而本发明的脂质体的大小虽然没有特别限定，但优选直径50～800nm，更优选直径80～ 150nm。 
在本发明的脂质体中，构成脂质双层的脂质的种类没有特别限定，作为具体的例子，可举出如磷脂酰胆碱(例如，二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等)、磷脂酰甘油(例如，二油酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油)、磷脂酰乙醇胺(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心肌磷脂等磷脂或它们的加氢物；鞘磷脂、神经节苷脂等糖脂，可以使用其中的1种或2种或多种。磷脂可以是来自蛋黄、大豆以及其它动植物的天然脂(例如，蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等)、合成脂或半合成脂中的任一种。 
对于脂质双层，为了使脂质双层物理或化学稳定，调节膜的流动性，可以使膜含有胆甾醇、胆固醇琥珀酸、羊毛固醇、二羟羊毛固醇、24-脱氢胆甾醇、二羟胆固醇等来自动物的胆固醇；豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、菜子甾醇等来自植物的胆固醇(植物固醇)；酵母甾醇、麦角甾醇等来自微生物的胆固醇；甘油、蔗糖等糖类；三油酸甘油酯、三辛酸甘油酯等甘油脂肪酸酯中的1种或2种以上。其含量虽然没有特别限定，但相对于构成脂质双层的总脂质的比例优选为5～40％(摩尔比)，更优选10～30％(摩尔比)。 
可以使脂质双层含有生育酚、没食子酸丙酯、棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基甲苯等抗氧化剂；硬脂酰胺、油酰胺等给出正电荷的带电物质；双十六烷基磷酸酯等给出负电荷的带电物质；膜外周蛋白、膜内在蛋白等膜蛋白质，其含量可以进行适当调节。 
本发明的脂质体在表面具有含有连续的多个精氨酸残基的肽。而对于单膜脂质体，脂质双层的外表面是脂质体的表面，对于多重膜脂质体，最外层的脂质双层的外表面是脂质体的表面。另外本发明的脂质体在表面以外的部分(例如，脂质双层的内表面)还可以含有上述 肽。 
上述肽中的连续的精氨酸残基个数只要是多个，没有特别限定，通常为4～20个，优选6～12个，更优选7～10个。构成上述整个肽的氨基酸残基个数没有特别限定，通常为4～35个，优选6～30个，更优选8～23个。上述肽在连续的多个精氨酸残基的C末端和/或N末端虽然可以含有任意的氨基酸序列，但优选只由精氨酸残基构成。 
附加在连续的多个精氨酸残基的C末端或N末端的氨基酸序列优选是具有刚性的氨基酸序列(例如，聚脯氨酸)。聚脯氨酸与柔和而且呈不规则形状的聚乙二醇(PEG)不同，它是线性的、保持某种程度的刚性。另外在该氨基酸序列中含有的氨基酸残基优选是酸性氨基酸以外的氨基酸残基。因为带有负电荷的酸性氨基酸残基与带有正电荷的精氨酸残基静电相互作用，存在使精氨酸残基的效果减弱的可能性。 
存在于本发明的脂质体表面的上述肽的量相对于构成脂质双层的总脂质的比例通常为0.1～30％(摩尔比)，优选1～25％(摩尔比)、更优选2～20％(摩尔比)。存在于本发明的脂质体的表面的上述肽的量相对于构成脂质双层的总脂质的比例如果不足2％(摩尔比)，优选不足1.5％(摩尔比)、更优选不足1％(摩尔比)的话，本发明的脂质体可以主要借助于内吞作用向细胞内或核内转移。此时上述肽的量的下限值相对于构成脂质双层的总脂质通常为0.1％(摩尔比)，优选0.5％(摩尔比)、更优选0.7％(摩尔比)。存在于本发明的脂质体的表面的上述肽的量相对于构成脂质双层的总脂质如果在2％(摩尔比)或更高，优选3％(摩尔比)或更高、更优选4％(摩尔比)或更高的话，本发明的脂质体可以主要借助于大胞饮作用向细胞内或核内转移。此时上述肽的量的上限值相对于构成脂质双层的总脂质通常为30％(摩尔比)，优选25％(摩尔比)、更优选20％(摩尔比)。在大胞饮作用中，细胞外物质作为所谓大饮液体部分被吸入细胞内，由于大饮液体和核内体不同，与酶溶体不融合，大饮液体内封物可以避免由酶溶体产生的分解。因此，本发明的脂质体在借助于大胞饮作用向细胞内转移的场合，封入本发明的大饮液体中的目的物质可以高 效地被送到细胞内或核内。 
本发明的脂质体可以借助于其表面的上述肽向细胞内或核内转移。脂质体向细胞内转移途径依赖于内吞作用时，脂质双层需要含有作为其主要成分的阳离子性脂质，但本发明的脂质体向细胞内的转移途径由于并不只依赖于内吞作用，所以在脂质双层中不必含有阳离子性脂质。就是说，本发明的脂质体的脂质双层可以由阳离子性脂质以及非阳离子性脂质的任一方构成，也可以由双方构成。但阳离子性脂质由于具有细胞毒性，所以从减少本发明脂质体的细胞毒性观点出发，最好是尽可能减少脂质双层中含有的阳离子性脂质的量，阳离子性脂质相对于构成脂质双层的总脂质的比例优选0～40％(摩尔比)，更优选0～20％(摩尔比)。 
作为阳离子性脂质，例如可举出DODAC(双十八烷基二甲基氯化铵，dioctadecyldimethylammonium chloride)、DOTMA(N-(2，3-二油氧基)丙基-N，N，N-三甲胺，N-(2，3-dioleyloxy)propyl-N，N，N-trimethylammonium)、DDAB(双十二烷基溴化铵，didodecylammonium bromide)、DOTAP(1，2-二油氧基-3-三甲胺丙烷，1，2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniopropane)、DC-Chol(3β-N-(N′，N′-二甲基-氨基乙烷)-氨基甲酰胆固醇，3β-N-(N’，N’，-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol)、DMRIE(1，2-二肉豆蔻酰氧丙基-3-二甲基羟乙基胺，1，2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium)、DOSPA 2，3-二油氧基-N-[2(精胺甲酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-三氟乙酸丙胺酯，2，3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N，N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate)等。 
所谓“非阳离子性脂质”指的是中性脂质或阴离子性脂质，作为中性脂质，如可举出二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、脑苷脂类等，作为阴离子性脂质，如可举出心肌磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺(N-琥珀酰PE)、磷脂酸、磷脂酸肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙二醇、胆固醇琥珀酸等。
作为本发明的脂质体的理想方式，可例示上述肽预先用疏水性基团或疏水性化合物修饰，上述疏水性基团或疏水性化合物插入脂质双层中，而上述肽露出上述脂质双层的脂质体。再者，在本方式中，“肽露出脂质双层”包括可以从脂质双层的外表面或内表面的任一个表面露出的情形，也包括从两个表面都露出的情形。 
疏水性基团或疏水性化合物只要是可以插入到脂质双层的，并没有特别限定。作为疏水性基团，例如硬脂酰基等饱和或不饱和的脂肪酸基、胆固醇基或其衍生物等，其中特别优选碳数为10～20的脂肪酰基(例如，棕榈酰基、油酰基、硬脂酰基、花生四烯酰基等)。而作为疏水性化合物，如上述例举的磷脂质、糖脂质或固醇、长链脂肪族醇(例如，磷脂酰乙醇胺、胆固醇等)、聚氧丙烯烷基醚、甘油脂肪酸酯等。 
本发明的脂质体可以使用例如水合法、超声波处理法、乙醇注入法、乙醚注入法、逆相蒸发法、表面活性剂法、冷冻·融解法等众所周知的方法制作。 
以下给出利用水合法制造脂质体的例子。 
作为构成脂质双层的构成成分的脂质和用疏水性基团或疏水性化合物修饰的上述肽溶解于有机溶剂后，通过蒸发除去有机溶剂可得到脂质膜。此时作为有机溶剂，如戊烷、己烷、庚烷、环己烷等烃类；二氯甲烷、氯仿等卤化烃类；苯、甲苯等芳香族烃类；甲醇、乙醇等低级醇类；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类；丙酮等酮类等，这些化合物可以单独使用，或将2种以上组合后使用。然后使脂质膜水合，通过搅拌或超声波处理，可以制造表面带有上述肽的脂质体。 
以下给出利用水合法的另一个制造脂质体的例子。 
作为构成脂质双层的构成成分的脂质溶解于有机溶剂后，通过蒸发除去有机溶剂得到脂质膜，使该脂质膜水合，通过搅拌或超声波处理，制造脂质体。然后通过向该脂质体的外液添加用疏水性基团或疏水性化合物修饰的上述肽，可以将上述肽导入到脂质体的表面。 
使脂质体通过所定孔径大小的过滤器，可以得到具有一定粒度分布的脂质体。另外根据众所周知的方法可以制造进行由多重膜脂质体向一个膜脂质体的转换，以及由一个膜脂质体向多重膜脂质体的转换。 
在本发明的脂质体的内部可以封入要向细胞内或核内输送的目的物质。 
目的物质的种类没有特别限定，例如药物、核酸、肽、蛋白质、糖或它们的复合物等，可以根据诊断、治疗等目的适当选择。而“核酸”中除了DNA或RNA之外，还包括它们的类似物或衍生物(例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA等)。核酸可以是单链的，也可以是双链的，无论是线状还是环状的，哪一种都可以。 
当目的物质为水溶性时，当制造脂质体，对脂质膜进行水合时，通过向使用的水性溶剂中添加目的物质，可以将目的物质封入到脂质体内部的水相中。另外当目的物质为脂溶性时，在制造脂质体时通过向使用的有机溶剂中添加目的物质，可以将目的物质封入到脂质体的脂质双层中。 
当目的物质为核酸时，优选是预先使要封入的核酸与阳离子性物质形成复合物。在核酸与阳离子性物质的复合物存在下，对脂质膜进行水合，然后通过搅拌或超声波处理，可以简便而且高效地制造封入了核酸与阳离子性物质的复合物的脂质体。 
所谓“阳离子性物质”指的是该分子中具有阳离子性基团的物质，可以通过静电相互作用与核酸形成复合物。阳离子性物质的种类只要是可与核酸形成复合物的并没有特别限定，例如阳离子性脂质(例如，Lipofectamine(Invitrogen公司生产))；带有阳离子性基团的高分子；聚赖氨酸、聚精氨酸、赖氨酸与精氨酸的共聚物等碱性氨基酸单独聚合物或共聚物或它们的衍生物(例如，硬脂酰化衍生物)；聚乙烯亚胺等聚阳离子性聚合物；硫酸鱼精蛋白等，其中特别优选硬脂酰化聚精氨酸。构成聚精氨酸的精氨酸残基数通常为4～20个，优选6～12个，更优选7～10个。阳离子性物质含有的阳离子性基团的数 目没有特别限定，优选2个或更多个。阳离子性基团只要是可带正电荷，并没有特别限定，例如氨基、甲基氨基、乙基氨基等单烷基氨基；二甲基氨基、二乙基氨基等二烷基氨基；亚氨基；胍基等。 
核酸与阳离子性物质的复合物由于其构成比例不同，整体带正电荷或负电荷，所以通过与非阳离子性脂质或阳离子性脂质的静电相互作用，可以有效地将上述复合物封入到脂质体内部。 
作为构成脂质双层构成成分的脂质和用疏水性基团或疏水性化合物修饰的上述肽溶解于有机溶剂后，通过蒸发除去有机溶剂得到的脂质膜由于含有阳离子性物质的上述肽，所以因其组成不同有时存在上述复合物与脂质膜的静电相互作用变弱的情况。在这样的场合下，优选使用不合有上述肽的脂质膜。不含有上述肽的脂质膜通过在有机溶剂中不溶解疏水性基团或疏水性化合物修饰的上述肽，而是将作为构成脂质双层构成成分的脂质溶解于有机溶剂后，经蒸发除去有机溶剂可以获得。向脂质体表面导入上述肽可以在封入上述复合物的脂质体形成后进行。 
封入了目的物质的脂质体可以作为目的物质向细胞内输送用载体或向核内输送用载体使用。 
适合输送目的物质的细胞来自的生物种类没有特别限定，动物、植物、微生物等任一种都可以，优选动物，更优选哺乳动物。作为哺乳动物，例如人、猴、牛、绵羊、山羊、马、猪、兔子、狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠等。另外适合输送目的物质的细胞的种类没有特别限定，例如体细胞、生殖细胞、干细胞或它们的培养细胞等。 
本发明的脂质体可以以例如分散液的状态使用。作为分散溶剂，例如可以使用生理盐水、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液等缓冲液。在分散液中也可以添加例如糖类、多元醇、水溶性高分子、非离子性表面活性剂、抗氧化剂、pH调节剂、水合促进剂等添加剂后使用。 
本发明的脂质体也可以以使分散液干燥(例如冷冻干燥、喷雾干燥等)的状态使用。要干燥的脂质体可以加生理盐水、磷酸缓冲液、 柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液等缓冲液后做成分散液。 
本发明的脂质体无论在体内，还是在体外都可以使用。在体内使用本发明的脂质体时，作为给予途径，如静脉、腹腔内、皮下、经鼻等非经口给予，给予量以及给予次数可以根据封入到脂质体的目的物质的种类以及量等进行适当调节。本发明的脂质体由于可以在0～40℃很宽的温度区域(有效的温度区域为4～37℃)中发挥向细胞内的转移特性以及向核内的转移特性，所以可以根据目的设定温度条件。为了在低温(通常为4～10℃，优选4～6℃)下有效发挥向细胞内的转移特性以及向核内的转移特性，本发明的脂质体必须要不借助于胞饮作用向细胞内或核内转移。存在于本发明的脂质体表面的上述肽的量如果相对于构成脂质双层的总脂的2％(摩尔比)或更高、优选3％(摩尔比)或更高、更优选4％(摩尔比)或更高的话，本发明的脂质体就可以在低温(通常为4～10℃，优选4～6℃)下有效发挥向细胞内的转移特性以及向核内的转移特性。此时上述肽量的上限值相对于构成脂质双层的总脂通常为30％(摩尔比)、优选25％(摩尔比)、更优选20％(摩尔比)。 
实施例 
[实施例1] 
向以下那样通过水合法制备表面含有八精氨酸的脂质体。使硬脂酰化八精氨酸0.75mg溶解于9.0mL乙醇中，另外使卵黄磷脂酰胆碱5.02mg以及胆固醇1.1mg溶解于21mL氯仿中。将两个溶解液混合，装到圆底烧瓶(最终氯仿∶乙醇比＝7∶3)中。通过旋转蒸发器除去溶剂后，收到干燥器中干燥2小时。用预先加温到50℃的1mL磷酸缓冲生理盐水使得到的脂质膜(10μ摩尔)水合，搅拌5秒钟。使脂质分散液分别通过各个400nm、200nm或100nm的聚碳酸酯膜滤器(各11次)。通过过滤可形成表面含有八精氨酸(总脂质的5摩尔％)的脂质体。 
脂质体的荧光标记通过整合1％若丹明(Rho)或1％若丹明标记磷脂酰乙醇胺(Rho-PE)(红色)进行。此时，作为水相标志的Rho 溶于进行中和的溶剂中，作为脂质标志的Rho-PE溶于氯仿溶液中。 
在通过共聚焦激光显微镜的观察下，将NIH3T3细胞(2.5×105 细胞/60mm皿)于含有10％ FBS的DMEM中温育过夜。然后将NIH3T3细胞于含有荧光标记脂质体(最终脂质浓度为0.1μM)的不含血清的DMEM培养液中温育。温育在37℃或4℃下进行1小时或3小时。4℃下，将细胞在4℃下温育30分钟，直至观察之前一直维持这一温度。温育结束后，将细胞洗净，然后不固定通过共聚焦显微镜进行观察。细胞核用荧光色素SYTO24(绿色)进行染色。 
图1给出了共聚焦显微镜的观察结果。图1中，左图表示37℃的结果，右图表示4℃的结果。“R8-Lip”表示表面含有八精氨酸的脂质体的存在位置(黑线包围的小的白色部分)，“Nucleus”表示核的存在位置(大的白色部分)。 
就像图1所表示的那样，在两个温度下，几乎在所有的细胞的细胞质内以及核内都能观察到脂质体。而如果用LipofectAMINE试剂(Invitrogen公司生产)等以往的转染剂，全细胞中只不过有30～50％左右被转染。另外，在4℃温育的细胞中检测出的细胞内荧光大约是在37℃下温育的细胞的场合所检测出的细胞内荧光的70％。 
由这些结果可以判明表面含有八精氨酸的脂质体具有向细胞内转移特性和向核内转移特性，不用说37℃，就是4℃那样的低温也可以向细胞内和核内转移。 
[实施例2]通过脂质体向细胞内输送基因 
通过将含有虫荧光素酶基因及其上游CMV启动子的全长8454bp的质粒(在含有CMV启动子的pQBI质粒中整合了虫荧光素基因的质粒)8μg以及硬脂酰化精氨酸16μg于10mM HEPES缓冲液中搅拌、混合，制备上述质粒与硬脂酰化精氨酸的复合物。 
将使二油酰磷脂酰乙醇胺0.672mg以及胆固醇琥珀酸0.096mg溶解于1mL氯仿中得到的溶解液中的125μL装到玻璃试管中，吹氮气使其蒸发干固，形成脂质膜。 
将含有上述复合物的液体250μL添加到脂质膜中，通过于室温下 放置10分钟，使其水合。水合后通过在超声波槽中进行超声波处理(数秒钟)，制备封入了上述复合物的脂质体。向脂质体的外液中添加1mg/mL硬脂酰化八精氨酸溶液12μL，通过在室温下放置30分钟，将八精氨酸(总脂质的5摩尔％)导入到脂质体的表面。 
将(i)上述质粒与硬脂酰化精氨酸的复合物12.5μL(相当于DNA0.4μg)、(ii)封入上述复合物，表面导入了八精氨酸的脂质体12.5μL(相当于DNA0.4μg)，或(iii)已知现在最强的基因导入试剂LipofectAMINE PLUS试剂(Invitrogen公司生产)、PLUS试剂4μL、上述质粒(相当于DNA0.4μg)以及LipofectAMINE试剂1μL添加到4×104个NIH3T3细胞中，在没有血清存在下于37℃培养3小时。然后再于血清存在下、37℃下培养45小时后，比较虫荧光素酶表达活性(RLU/mg蛋白质)。虫荧光素酶表达活性通过向细胞溶解液中加虫荧光素酶活性测定试剂(luciferase assay system，Promega公司生产)，用荧光仪计测化学发光量测定。 
图2给出了虫荧光素酶表达活性的测定结果。图2中“DNA复合物”相当于上述(i)，而“R8脂质体”相当于上述(ii)，“LipofectAMINEPLUS试剂”相当于上述(iii)。 
就像图2所表示的那样，上述质粒与硬脂酰化精氨酸的复合物由于受到血清中的分解酶的影响，所以虫荧光素酶表达活性最低。 
LipofectAMINE PLUS试剂表现出最高虫荧光素酶表达活性(约1×l010RLU/mg蛋白质)，但确认有细胞毒性。而封入了上述复合物、而且表面导入了八精氨酸的脂质体表现出与LipofectAMINE PLUS试剂相近的活性(约1×108RLU/mg蛋白质)，但确认没有细胞毒性。有关细胞毒性在实施例3中进行了详细研究。 
由这些结果判明通过将基因封入表面导入了八精氨酸的脂质体中，可以有效地将基因输送到细胞内和核内。 
[实施例3]脂质体的细胞毒性的评价 
通过利用活细胞内线粒体的甲
Figure A20048002813500141
色素生成的细胞存活率测定法(MTT分析)，对实施例2(i)、(ii)以及(iii)的细胞毒性进行 了比较、研究。 
具体来说，在与实施例2同样的条件、即将相当于DNA0.4μg的样品暴露于4×104个NIH3T3细胞，于37℃下恒温处理48小时后，通过MTT分析求细胞存活率(％)。作为对照，只是用上述质粒也同样求进行处理时的细胞存活率(％)。 
图3给出了细胞存活率(％)的测定结果。就像图3所表示的那样，用上述质粒与硬脂酰化精氨酸复合物(实施例2(i)，图3中“阳离子/DNA复合物”)以及封入上述复合物、表面导入了八精氨酸的脂质体(实施例2(ii)，图3中“封入R8修饰脂质体的阳离子/DNA复合物”)处理的细胞的存活率虽然降低了若干，但没有意义。可是用LipofectAMINE PLUS试剂(实施例2(iii)，图3中“脂转染胺/DNA”)处理的细胞的细胞存活率可观察到约50％左右的有意义降低。 
这些结果表明表面导入了八精氨酸的脂质体细胞毒性低。 
[实施例4]脂质体向细胞内转移途径的研究 
将NIH3T3细胞在表面导入了八精氨酸的脂质体(硬脂酰化八精氨酸含有量为总脂质的5摩尔％)存在下(最终脂质浓度为0.1mM)进行温育。温育在蔗糖(0.31M)(高渗液)、胞饮作用抑制剂的混合物(1μg/mL抗霉素A、10mMNaF以及0.1％叠氮钠)或制霉菌素(25μg/mL)存在下，于37℃或4℃下实施1小时。NIH3T3细胞在添加脂质体之前，于胞饮作用抑制剂的混合物存在下温育30分钟。温育结束时除去溶剂，将NIH3T3细胞洗3次，用共聚焦显微镜进行观察。 
在各个场合下，对于至少15个细胞合计观察到荧光的细胞内区域面积，求其平均值，算出相对于对照细胞的平均值的比例。图4给出了该结果。图4中“低温”是4℃的结果，“高渗液”、“胞饮作用抑制剂”以及“制霉菌素”都是37℃的结果。 
就像图4所表示的那样，对于观察到荧光的细胞内区域面积，即使用胞饮作用抑制剂处理也没有观察到有意义降低。由此判明表面导入八精氨酸的脂质体的向细胞内转移途径并不只是依赖于胞饮作用。 
[实施例5]与腺病毒载体的比较 
与实施例2同样，制备封入了含有虫荧光素酶基因以及其上游CMV启动子的质粒与硬脂酰化精氨酸的复合物，表面导入了八精氨酸的脂质体(图5中表示为“R8脂质体”)，将悬浮有该脂质体(相当于DNA0.4μg)的0.25mL的不含血清DMEM培养基添加到用24孔板培养的HeLa细胞或A549细胞(各4×104个细胞/孔)中，于37℃温育3小时。3小时后添加含有10％胎牛血清的培养基1mL，再温育45小时。然后将细胞溶解，向细胞溶解液加虫荧光素酶活性测定试剂(luciferaseassay system，Promega公司生产)，用荧光仪(LuminescencerPSN、ATTO)测定虫荧光素酶活性。细胞溶解液中的蛋白质量使用BCA蛋白质定量试剂盒(PIERCE、ロックフォ-ド(IL))进行测定。作为对照，使用没有封入到脂质体的上述质粒与硬脂酰化精氨酸的复合物(相当于DNA0.4μg)(图5中表示为“DNA复合物”)，与上述同样测定虫荧光素酶活性以及蛋白质量。 
另一方面，制作整合了虫荧光素酶基因的腺病毒(使E1-、E3-以及复制能力缺损、在E1基因的位置含有巨细胞病毒的启动子/增强子以及虫荧光素酶基因的5型腺病毒)。腺病毒使用人胚肾脏细胞HEK293进行扩增，通过氯化铯梯度离心法进行纯化。将腺病毒悬浮液(5×103粒子/细胞或1×105粒子/细胞)添加到用24孔板培养的HeLa细胞或A549细胞(各4×104个细胞/孔)中，在0.25mL不含血清的培养基中于37℃温育3小时。然后添加1mL的10％胎牛血清培养基，温育45小时。温育后与上述同样测定虫荧光素酶活性和蛋白质量。 
图5给出了虫荧光素酶(RLU/mg蛋白质)的测定结果。图5(A)是使用HeLa细胞时的结果，图5(B)是使用A549细胞时的结果。 
5×103粒子/细胞的腺病毒浓度是通常报道中常用的浓度，1×105 粒子/细胞的腺病毒浓度是为了获得更高虫荧光素酶活性果断增加的浓度。腺病毒由于表现出非常强的细胞毒性，所以不能使腺病毒浓度增加到1×105粒子/细胞或更高。 
就像图5所表示的那样，封入了质粒与硬脂酰化精氨酸的复合物、表面导入了八精氨酸的脂质体虽然表现出与腺病毒浓度为1×105粒子 /细胞时大致同等程度的虫荧光素酶活性，但并没有看到细胞毒性。由这些结果判明表面导入了八精氨酸的脂质体与腺病毒载体不同，可以不表现出细胞毒性地发挥与腺病毒载体同等的基因表达活性。 
[实施例6]脂质体向细胞内转移途径的研究 
将NIH3T3细胞用胞饮作用抑制剂蔗糖(0.4M)或大胞饮作用抑制剂氨氯吡咪(Amiloride)(2.5mM)进行10分钟前处理后，添加封入了含有虫荧光素酶及其上游CMV启动子的质粒和硬脂酰化精氨酸的复合物、且表面导入了八精氨酸的脂质体(参照实施例2)(相当于DNA0.4μg)，温育1小时。然后除去培养基，用含有20U/mL肝素的PBS洗3次，再用PBS洗1次。洗净后，于不含血清的培养基中温育70分钟后，再添加1mL含有10％胎牛血清的培养基温育12小时。温育12小时后，与实施例5同样测定虫荧光素酶活性。作为对照使用没有用胞饮作用抑制剂蔗糖以及大胞饮作用抑制剂氨氯吡咪(Amiloride)进行前处理的NIH3T3细胞。 
结果如图6所示。 
就像图6所表示的那样，用胞饮作用抑制剂蔗糖对细胞进行前处理时，没有观察到显著影响，但用大胞饮作用抑制剂氨氯吡咪(Amiloride)进行前处理时，观察到虫荧光素酶活性显著降低。 
人们认为在大胞饮作用中，细胞外物质作为大胞饮泡的级分整合到细胞内，大胞饮泡与核内体不同，不与溶酶体融合，所以大胞饮泡内封物可以避免被溶酶体分解。由此暗示了表面导入八精氨酸的脂质体向细胞内转移途径是借助于大胞饮作用。 
[实施例7]脂质体向细胞内转移途径的研究 
将NIH3T3细胞在能量代谢抑制剂(代谢抑制剂：含有叠氮钠0.1％、氟化钠10mM以及抗霉素A1μg/mL)或胞饮作用抑制剂蔗糖(0.4M)共存下于37℃下温育30分钟、或在大胞饮作用抑制剂氨氯吡咪(Amiloride)(5mM)共存下37℃下温育10分钟、或在没有抑制剂存在下于4℃温育30分钟后，添加表面导入了八精氨酸、内水相封入若丹明色素的脂质体(八精氨酸含有量为总脂质的0.8摩尔％或5摩 尔％)，温育1小时。然后将细胞用含有20U/mL肝素的PBS洗，再用胰蛋白酶处理后，进行离心分离，再用含有肝素的PBS洗2次。将洗干净的细胞经尼龙网过滤后的细胞通过流式细胞仪(FACScan、ベクトン·ディキンソン)进行解析。而作为对照使用没有抑制剂存在下，37℃温育了30分钟的细胞，将对照细胞内整合量作为100％，对各个场合下的细胞内整合量(％)进行评价。 
结果如图7所示。 
就像图7所表示的那样，八精氨酸含有量为总脂质的0.8摩尔％时，在能量代谢抑制剂共存下、胞饮作用抑制剂蔗糖共存下、以及低温(4℃)下，细胞内整合量显著被抑制。另一方面，八精氨酸含有量为总脂质的5摩尔％的场合，在能量代谢抑制剂共存下，以及在大胞饮作用抑制剂氨氯吡咪共存下，细胞内整合量显著被抑制。 
由这些结果暗示了：(1)表面导入八精氨酸的脂质体不管八精氨酸含量如何，都是通过以能量为必需的途径整合到细胞内，(2)八精氨酸含量为总脂质的0.8摩尔％时，表面导入八精氨酸的脂质体借助于胞饮作用整合到细胞内，(3)八精氨酸含量为总脂质的5摩尔％时，表面导入八精氨酸的脂质体借助于大胞饮作用整合到细胞内，(4)在低温(4℃)下向细胞内的整合在八精氨酸含量少时不被诱导。即判明了通过控制八精氨酸含量，可以控制表面导入了八精氨酸的脂质体向细胞内转移途径。 

Claims (12)

1.一种脂质体，是在表面带有含连续的4～20个精氨酸残基的4～35个氨基酸残基构成的肽的脂质体，上述肽预先用可插入脂质双层中的疏水性基团或疏水性化合物修饰，上述疏水性基团插入脂质双层中，上述肽从上述脂质双层露出，上述肽的量相对于构成脂质双层的总脂质的比例以摩尔比表示为2～30％，脂质双层中不含阳离子性脂质。
2.权利要求1所述的脂质体，其中上述肽由精氨酸残基构成。
3.权利要求1所述的脂质体，其中疏水性基团从饱和或不饱和脂肪酸基、以及胆固醇基中选择。
4.权利要求3所述的脂质体，其中上述疏水性基团是硬脂酰基。
5.权利要求1所述的脂质体，其中封入了要向细胞内或核内输送的目的物质。
6.权利要求5所述的脂质体，其中上述目的物质是药物、核酸、肽、蛋白质、糖或它们的复合物。
7.权利要求6所述的脂质体，其中上述目的物质为核酸，内部封入了上述核酸与聚阳离子性物质的复合物。
8.权利要求7所述的脂质体，其中上述聚阳离子性物质为硬脂酰基化聚精氨酸。
9.权利要求5～8任一项所述的脂质体，该脂质体是将上述目的物质输送到细胞内用的载体。
10.权利要求5～8任一项所述的脂质体，该脂质体是将上述目的物质输送到核内用的载体。
11.权利要求1所述的脂质体，其中上述肽是由含有连续的6～12个精氨酸残基的6～30个氨基酸残基构成的肽。
12.权利要求1所述的脂质体，其中上述肽是由含有连续的7～10个精氨酸残基的8～23个氨基酸残基构成的肽。
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