WO2002053583A2 - Peptides amphipathiques et leur utilisation pour transferer des substances d'interet dans les cellules - Google Patents

Peptides amphipathiques et leur utilisation pour transferer des substances d'interet dans les cellules Download PDF

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WO2002053583A2
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to amphipathic peptides and their use in the field of the transfer of substances of interest, more particularly nucleic acid molecules, into cells.
  • nucleic acid sequences into cells constitutes the major objective of gene therapy protocols with therapeutic interest aimed at the cure of serious diseases, such as lethal gene deficiencies, cancers and infectious diseases.
  • nucleic acid sequences into cells One of the essential aspects of the transfer of nucleic acid sequences into cells is the penetration of said sequences to their final target.
  • This may be the nucleus for plasmid DNA, and / or the cytoplasm for oligonucleotides.
  • Nucleic acids are large hydrophilic molecules. For example, a 6 kilobase plasmid represents 4.10 6 daltons. They are therefore not molecules conducive to the passage of cell membranes, and the transfer of nucleic acid sequences constitutes a major technical problem in the implementation of gene therapy methods. Many compositions useful for efficiently transfection of eukaryotic cells with selected genetic material have been described in the prior art.
  • transfection vectors There are basically two main types of vectors: - natural transfection vectors, such as viruses (retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes-simplex viruses) which are effective but which have limits on the use of viruses (retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes-simplex viruses) which are effective but which have limits on the use of
  • nucleic acids in eukaryotic cells in a more or less toxic way.
  • the aim of the present invention is to offer a new vectoring system presenting these three functions in an optimal manner and not presenting
  • amphipathic peptide is intended to mean peptides which have a hydrophobic pole and a hydrophilic pole. Such peptides consisting essentially of hydrophilic and hydrophobic amino acids have in particular
  • the subject of the invention is therefore a peptide capable of transferring a substance of interest carrying negative charges inside the cells and / or inside the nucleus of the cells, characterized in that said peptide is an amphipathic peptide from approximately 10 to 30, preferably from 15 to 25, amino acids and corresponding to the following formula:
  • L represents leucine
  • .0 R represents arginine
  • m is an integer between 0 and 2
  • n is 1 or 2.
  • Preferred peptides according to the invention correspond to the following formula: L5 (RLLR) p (L) n (R) n , in which:
  • L leucine
  • R represents arginine
  • p is an integer between 2 and 4
  • n is 1 or 2.
  • a very preferred peptide according to the invention corresponds to the following formula represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO. l: RLLRRLLRRLLRLLRR.
  • the subject of the invention is also vectors capable of transporting in vitro or in vivo a substance of interest carrying negative charges inside the cells and / or inside the nucleus of the cells, said cell.
  • the invention particularly contemplates as a compound capable of condensing a substance of interest carrying negative charges such as a nucleic acid, a pol lysine group comprising about at least 5 and up to 25 lysine residues.
  • the invention envisages very particularly, as a compound exhibiting an affinity for cell membranes, a fatty acid chain, saturated or unsaturated, such as for example palmitoyl.
  • the polylysine group or the residue of fatty acid can be coupled to the N or C-terminal end of the peptide, either directly or via a linker arm.
  • the peptides of the invention and said peptides coupled to a polylysine group can be prepared by chemical synthesis or by techniques of genetic expression.
  • the coupling of the fatty acid type compounds to a peptide of the invention can be carried out by chemical reactions known to those skilled in the art.
  • compositions comprising a peptide or a vector as described above and a substance of interest carrying negative charges.
  • Negative charges of the substance of interest in said composition is equal to or greater than 1.
  • the longer the nucleic acid the higher the number of positive charges provided by the peptide to obtain maximum effect.
  • compositions are useful for the preparation of pharmaceutical, cosmetic or diagnostic compositions depending on the nature of the substance of interest.
  • the peptides of the invention are remarkable in that they are capable of associating by type bonds ionic with a wide variety of substance of interest and transport these into cells.
  • the substance of interest carrying negative charges can be any type of chemical or biological entity carrying negative charges and whose overall charge can be positive, negative or neutral. It can be therapeutic, cosmetic, food or diagnostic substances.
  • the invention is particularly interested in the vectorization of proteins and very particularly in the transfer of nucleic acid molecules into the cytoplasm and / or the nucleus of cells.
  • nucleic acid molecule By nucleic acid molecule is meant both DNA and RNA molecules. It can of course be genes or parts of the gene, possibly inserted into a plasmid and placed under the control of expression sequences adapted to the transfected host. These genes or parts of the gene encode therapeutic proteins. They can also be short nucleic acid sequences, such as oligonucleotides or ribozymes, useful in antisense gene therapy strategies.
  • the peptides, vectors and compositions of the invention are useful for transporting in vivo or in vitro substances of interest and very particularly nucleic acids in cells, in particular eukaryotes.
  • they can make it possible to transfer nucleic acids or proteins into specific cell lines, for example in order to express a protein or to inhibit its production.
  • They can be used for direct administration of the nucleic acid or protein into an organism.
  • They can also be used ex vivo for the transfer of nucleic acid or protein into a specific cell to give it a new property before re-administering it to an organism.
  • the invention therefore also relates to these cells comprising peptides, vectors and compositions described above.
  • compositions of the invention can be used free or incorporated into particles or nanoparticles such as liposomes.
  • FIG. 1 represents the migrations of plasmid DNA obtained on a retardation gel as a function of the amount of peptide associated with said DNA.
  • the H-Orn-Ahx ⁇ RLLRRLLRRLLRLLRR-NH2 peptide is assembled on solid phase using an Fmoc-tBu protocol.
  • the ornitine introduced in the form of Fmoc-Orn (Fmoc) -OH is released by treatment of the peptidyl resin with piperidine (20% in Dimethylformamide DMF). After rinsing with DMF the resin is incubated twice 30 min in DMF containing 6 equivalents of DIEA (Diisopropylamine) and 6 equivalents of palmitic acid chloride.
  • DIEA Diisopropylamine
  • the peptide is then cleaved / deprotected for 3 hours in TFA / H2O / Phenol / Triisopropylsilane 86/5/5/4.
  • the Palm-Orn (Palm) -Ahx-RLLRRLLRRLLRLLRR-NH2 peptide is then purified by a series of successive precipitations, followed by exclusion chromatography, then lyophilized.
  • DMRIE transfecting agent or increasing amounts of peptide are added to the plasmid (1 ⁇ g) in DMSO. After 45 min of incubation, 300 ⁇ l of Optimem medium are added and the whole is spread in 12-well plates. K562 cells are added to the plates at a density of 7.10 5 cells / well and the whole is incubated for 4 hours at 37 ° C. After incubation, 3 ml of RPMI medium containing 12.5% fetal calf serum is added and the incubation is continued for 48 hours. The cells are centrifuged, washed and incubated with a buffer of lysis. After centrifugation, the supernatant is tested for luciferase activity using the Promega Luciferase Assay System test.
  • the oligonucleotide being coupled to the FITC the acquisition is done using the FL1H filter (525 nm). A histogram of the fluorescence intensity (for 1 ⁇ 10 4 cells) is obtained and the mean distribution was considered to be representative of the amount of oligonucleotide associated with 10 cells.
  • Figure 1 shows the migrations obtained on a retardation gel, depending on the amount of transfection peptide. Incubation with 0.32 nmoles (0.7 ⁇ g) of peptide results in a delay in the migration of DNA and the addition of 0.8 nmoles (1.75 ⁇ g) completely stops its migration. 2) Ability of peptides to transfect plasmid DNA into K562 cells.
  • the most important transfection efficiency is observed when there is an excess of about 5 neutralizing peptide charges (positive charges) compared to DNA (negative charges). These results confirm that the transfer of the gene occurs only in the presence of an excess of positive charges.
  • the charge ratio 5 corresponds to a concentration of 1 ⁇ g of plasmid for 4.75 ⁇ g of peptide.
  • a poly-lysine chain or two chains of a fatty acid was coupled to the peptide of the invention.
  • the addition of these chains to peptide 1 allows better condensation of the plasmid DNA as well as a better interaction with the cell membrane.
  • Two peptides were therefore synthesized: Peptide 2 containing poly-L-lysine and Peptide 3 containing two palmitoyls.

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Abstract

La présente invention concerne un peptide capable de transférer une substance d'intérêt portant des charges négatives à l'intérieur des cellules et/ou à l'intérieur du noyau des cellules, caractérisé en ce que ledit peptide répond à la formule suivante: (RLLR)p(L)n(R)n, dans laquelle: L représente la leucine, R représente l'arginine, p est un nombre entier compris entre 2 et 4, n est 1 ou 2. L'invention concerne aussi une composition comprenant ledit peptide et une substance d'intérêt plus particulièrement une molécule d'acide nucléique.

Description

PEPTIDES AMPHIPATHIQUES ET LEUR UTILISATION POUR LE TRANSFERT DE SUBSTANCES D'INTÉRÊT DANS LES CELLULES.
La présente invention concerne des peptides amphipathiques et leur utilisation dans le domaine du transfert de substances d'intérêt, plus particulièrement de molécules d'acide nucléique, dans les cellules.
Le transfert de séquences d'acides nucléiques dans les cellules constitue l'objectif majeur des protocoles de thérapie génique à intérêt thérapeutique visant la guérison de maladies graves, comme les déficiences géniques létales, les cancers et les maladies infectieuses.
L'un des aspects essentiels du transfert de séquences d'acides nucléiques dans les cellules est la pénétration desdites séquences, jusqu'à leur cible finale. Celle-ci peut-être le noyau pour de l'ADN plasmidique, et/ou le cytoplasme pour des oligonucléotides .
Les acides nucléiques sont des molécules hydrophiles de grande taille. A titre d'exemple, un plasmide de 6 kilobases représente 4.106 daltons . Il ne s'agit donc pas de molécules propices au passage des membranes cellulaires, et le transfert des séquences d'acides nucléiques constitue un problème technique majeur à la mise en œuvre des méthodes de thérapie génique. De nombreuses compositions utiles pour transfecter efficacement les cellules eucaryotes avec un matériel génétique sélectionné ont été décrites dans l'art antérieur.
Parmi ces compositions, la présente invention s'intéresse tout particulièrement à celles comprenant des vecteurs de transfection. Il existe essentiellement deux grands types de vecteurs : - les vecteurs de transfection naturels, tels que les virus (les rétrovirus, les adénovirus, les virus adéno-associés , les virus herpes-simplex) qui sont efficaces mais qui présentent des limites d'utilisation du
5 fait d'une non-spécificité tissulaire et de risques potentiels de toxicité qui nécessitent de mettre en place des infrastructures cliniques coûteuses.
- Les vecteurs synthétiques, du type liposomes, lipides cationiques, etc., capables de transférer les
0 acides nucléiques dans les cellules eucaryotes de manière plus ou moins toxique.
Ces vecteurs synthétiques doivent présenter essentiellement trois fonctions : (i) condenser l'ADN à transfecter, (ii) promouvoir sa fixation cellulaire et
.5 (iii) permettre le passage de l'ADN à travers la membrane cellulaire et éventuellement aussi son passage dans le compartiment nucléaire. Le but de la présente invention est d'offrir un nouveau système de vectorisation présentant ces trois fonctions de manière optimale et ne présentant
0 pas les inconvénients des vecteurs viraux.
Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse sur des séquences peptidiques capables de transférer in vitro ou in vivo des substances d'intérêt et tout particulièrement des molécules d'acide nucléique, lui
:5 ont permis de mettre au point des peptides de transfection dérivant de peptides amphipathiques. La Demanderesse a en effet démontré que ces séquences peptidiques cationiques pouvaient former des interactions ioniques avec les groupements phosphates des acides nucléiques et que ces
10 complexes étaient capables de pénétrer dans les cellules.
On entend par peptide amphipathique, des peptides qui présente un pôle hydrophobe et un pôle hydrophile. De tels peptides constitués essentiellement d'acides aminés hydrophiles et hydrophobes ont notamment
!5 décrits dans la demande de brevet français publiée sous le No. 2 715 847. L'invention a donc pour objet un peptide capable de transférer une substance d'intérêt portant des charges négatives à l'intérieur des cellules et/ou à l'intérieur du noyau des cellules, caractérisé en ce que 5 ledit peptide est un peptide amphipathique d'environ 10 à 30, de préférence de 15 à 25, acides aminés et répondant à la formule suivante :
(L)m(R)n(L)n(R)n(L)m, dans laquelle :
L représente la leucine, .0 R représente l' arginine, m est un nombre entier compris entre 0 et 2 , n est 1 ou 2.
Des peptides préférés selon l'invention répondent à la formule suivante : L5 (RLLR)p(L)n(R)n, dans laquelle :
L représente la leucine,
R représente l' arginine, p est un nombre entier compris entre 2 et 4, n est 1 ou 2 .
> 0
Un peptide tout préféré selon l ' invention répond à la formule suivante représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO . l : RLLRRLLRRLLRLLRR .
>5
L ' invention a également pour objet des vecteurs capables de transporter in vitro ou in vivo une substance d ' intérêt portant des charges négatives à l ' intérieur des cellules et/ou à l ' intérieur du noyau des cellules , ledit
30 vecteur étant constitué d ' au moins un peptide décrit précédemment couplé à au moins un composé présentant une af f inité pour les membranes cellulaires ou capable de condenser la substance d ' intérêt portant des charges négatives .
35 L ' invention envisage tout particulièrement à titre de composé capable de condenser une substance d'intérêt portant des charges négatives comme un acide nucléique, un groupe pol lysine comprenant environ au moins 5 et jusqu'à 25 résidus de lysine.
L'invention envisage tout particulièrement à titre de composé présentant une affinité pour les membranes cellulaires, une chaîne d'acide gras, saturé ou insaturé, comme par exemple le palmitoyle.
Dans les vecteurs de l'invention, le groupe polylysine ou le reste d'acide gras peut être couplé à l'extrémité N ou C-terminale du peptide, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras de liaison.
Les peptides de l'invention et lesdits peptides couplés à un groupe polylysine peuvent être préparés par synthèse chimique ou par des technique d'expression génétique. Le couplage des composés du type acide gras sur un peptide de l'invention peut être réalisé par des réactions chimiques connues de l'homme du métier.
L'invention a encore pour objet des compositions comprenant un peptide ou un vecteur comme décrit précédemment et une substance d'intérêt portant des charges négatives. Avantageusement, le rapport :
Charges positives du peptide ou du vecteur
Charges négatives de la substance d'intérêt dans ladite composition, est égal ou supérieur à 1.
Ainsi, plus l'acide nucléique est long, plus le nombre de charges positives apportées par le peptide doit être élevé pour obtenir un effet maximum.
Ces compositions sont utiles pour la préparation de compositions pharmaceutiques, cosmétiques ou de diagnostic selon la nature de la substance d'intérêt. En effet, les peptides de l'invention sont remarquables en ce qu'ils sont capables de s'associer par des liaisons de type ionique avec une grande variété de substance d'intérêt et de transporter celles-ci dans les cellules.
Ainsi, la substance d'intérêt portant des charges négatives peut être tout type d'entité chimique ou biologique portant des charges négatives et dont la charge globale peut être positive, négative ou neutre. Il peut s'agir de substances thérapeutiques, cosmétiques, alimentaire ou de diagnostic. L'invention s'intéresse notamment à la vectorisation de protéines et tout particulièrement au transfert de molécules d'acide nucléique dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules.
On entend par molécule d'acide nucléique tant des molécules d'ADN que d'ARN. Il peut s'agir bien-entendu de gènes ou de parties de gène, éventuellement insérés dans un plasmide et placés sous le contrôle de séquences d'expression adaptées à l'hôte transfecté. Ces gènes ou parties de gène codent des protéines thérapeutiques. Il peut aussi s'agir de courtes séquences d'acide nucléique, comme des oligonucléotides ou des ribozymes, utiles dans des stratégies de thérapie génique antisens.
Les peptides, vecteurs et compositions de l'invention sont utiles pour transporter in vivo ou i n vitro des substances d'intérêt et tout particulièrement des acides nucléiques dans des cellules, notamment eucaryotes. In vitro, ils peuvent permettre de transférer des acides nucléiques ou des protéines dans des lignées cellulaires spécifiques, par exemple dans le but d'exprimer une protéine ou d'inhiber sa production. Ils peuvent être utilisés pour l'administration directe de l'acide nucléique ou de la protéine dans un organisme. Ils peuvent être également utilisés ex vivo pour le transfert de l'acide nucléique ou de la protéine dans une cellule spécifique pour lui conférer une nouvelle propriété avant de la réadministrer à un organisme. L'invention a donc également pour objet ces cellules comprenant des peptides, vecteurs et compositions décrits précédemment. Il s'agit tout particulièrement de cellules transfectées au moyen d'un peptide ou d'un vecteur de l'invention. Ces cellules sont obtenues soient in vitro par incubation dans des conditions adéquates desdites cellules avec une composition selon l'invention, soit in vivo en administrant, par tout moyen approprié, lesdites compositions à un organisme ou partie d'organisme. Les compositions de l'invention peuvent être utilisées libres ou incorporées dans des particules ou nanoparticules comme des liposomes.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent dans lesquels il sera fait référence à la figure 1 qui représente les migrations d'ADN plasmidique obtenues sur un gel de retardement en fonction de la quantité de peptide associée audit ADN.
I - CONDITIONS EXPERIMENTALES,
1 ) Peptides.
Les peptides préparés et utilisés pour la transfection dans le cadre de la présente invention sont donnés dans le tableau 1.
Tableau 1
Figure imgf000007_0001
En ce qui concerne la synthèse du peptide N°3, le peptide H-Orn-Ahx~RLLRRLLRRLLRLLRR-NH2 est assemblé sur phase solide en utilisant un protocole Fmoc-tBu. L'ornitine introduite sous forme Fmoc-Orn(Fmoc) -OH est débloquée par traitement du peptidyl-résine à la pipéridine (20% dans Diméthylformamide DMF). Après rinçage par DMF la résine est incubée 2 fois 30 min dans DMF contenant 6 équivalents de DIEA (Diisopropylamine) et 6 équivalents de Chlorure d'acide palmitique. Le peptide est ensuite clivé/déprotégé 3 heures dans TFA/H20/Phénol/Triisopropylsilane 86/5/5/4. Le peptide Palm-Orn(Palm) -Ahx-RLLRRLLRRLLRLLRR-NH2 est ensuite purifié par une série de précipitations successives, suivi d'une chromatographie d'exclusion, puis lyophilisé.
2) Oligonucléotide .
Un oligonucléotide couplé à la fluorescéine (Fluo) de PM 6154 et de séquence SEQ ID NO.3 dans la liste de séquences en annexe suivante a été utilisé : GTG CCG GGG TCT TCG GGC - Fluo
3 ) Gel de retardement.
Un microgramme d'ADN plasmidique, contenant le gène reporter Luciferase, est incubé pendant 45 min avec des concentrations croissantes de peptide dans 100 μl de milieu Optimem afin de former un complexe peptide-DNA. Vingt microlitres de chaque complexe sont ensuite analysés par électrophorese en gel d'agarose 0,8% préparé dans un tampon TBE. Après électrophorese, l'ADN coloré au bromure d'éthidium est visualisé en UV.
4 ) Transfection de l'ADN plasmidique. L'agent transfectant DMRIE ou des quantités croissantes de peptide sont rajoutés au plasmide (1 μg) dans du DMSO. Après 45 min d'incubation, 300 μl de milieu Optimem sont rajoutés et le tout est étalé dans des plaques à 12 puits. Les cellules K562 sont rajoutées aux plaques à une densité de 7.105 cellules/puit et le tout est incubé pendant 4 heures à 37°C. Après incubation, 3 ml de milieu RPMI contenant 12,5% sérum de veau fœtal sont rajoutés et l'incubation est poursuivie pendant 48 heures. Les cellules sont centrifugées, lavées et incubées avec un tampon de lyse. Après centrifugation, le surnageant est testé pour l'activité luciférase en utilisant le test Promega Luciférase Assay System.
5 5) Transfection des oligonucléotides.
Des quantités croissantes de peptides sont rajoutées à l' oligonucléotide marqué au fluorochrome FITC (1 μg) dans du PBS. Après 30 minutes d'incubation sous la hotte, le mélange est rajouté aux cellules K562 dans 500 μl
.0 de milieu Optimem et le tout est incubé pendant 1 heure sous l'étuve à 37°C. Après l'incubation, les cellules sont centrifugées , lavées et ensuite resuspendues dans 0,5 ml de PBS froid. La transfection de 1 'oligonucléotide a été ensuite analysée par cytométrie de flux (FACS).
.5 L' oligonucléotide étant couplé au FITC, l'acquisition se fait à l'aide du filtre FL1H (525 nm) . Un histogramme de l'intensité de fluorescence (pour lxlO4 cellules ) est obtenu et la moyenne de distribution était considérée comme représentative de la quantité d'oligonucléotide associé aux iO cellules.
II - Résultats .
1 ) Capacité des peptides à condenser l'ADN !5 plasmidique.
Dans un premier temps, la capacité des peptides à condenser l'ADN plasmidique a été testée.
Des concentrations croissantes de peptides ont été incubées avec l'ADN et le complexe a été analysé par 50 électrophorese sur gel d'agarose 0,8%.
La Figure 1 représente les migrations obtenues sur un gel de retardement, en fonction de la quantité de peptide de transfection. L'incubation avec 0,32 nmoles (0,7 μg) de peptide entraîne un retardement de la migration de 55 l'ADN et l'addition de 0,8 nmoles (1,75 μg) stoppe complètement sa migration. 2 ) Capacité des peptides à transfecter l'ADN plasmidique dans les cellules K562.
Dans un second temps, la capacité de ces peptides à transfecter l'ADN plasmidique dans les cellules K562 a été testée. Le tableau 2 ci-dessous rapporte l'efficacité de transfection mesurée en fonction du rapport de charges. L'efficacité de transfection du peptide 1 a été également comparée avec celle du DMRIE qui est un agent transfectant commercial.
Tableau 2
Figure imgf000010_0001
L'efficacité de transfection la plus importante est observée lorsque l'on a un excès de l'ordre de 5 de charges neutralisantes peptidiques (charges positives) par rapport à l'ADN (charges négatives). Ces résultats confirment que le transfert du gène n'intervient qu'en présence d'un excès de charges positives. Le rapport de charges 5 correspond à une concentration de 1 μg de plasmide pour 4,75 μg de peptide.
Afin d'améliorer le rendement de transfection, une chaîne de poly-lysine ou deux chaînes d'un acide gras (palmitoyl) a été couplé au peptide l'invention. Comme le montre le tableau 3 ci-dessous, l'addition de ces chaînes au peptide 1 permet une meilleure condensation de l'ADN plasmidique ainsi qu'une meilleure interaction avec la membrane cellulaire. Deux peptides ont été donc synthétisés : Peptide 2 contenant la poly-L-lysine et Peptide 3 contenant deux palmitoyls .
Tableau 3
Figure imgf000011_0001
Il ressort de ces expériences que l'addition d'une queue de poly-Lysine ou de deux chaînes d'acide gras comme le palmitoyl au N-terminal du peptide améliore de façon significative le transfert du plasmide.
3 ) Transfert d'oliqonucélotides .
La capacité de ces peptides pour le transfert de petites séquences d'acides nucléiques tels que les oligonucléotides a ensuite été testée. Les peptides ont été incubés avec l' oligonucléotide de séquence SEQ ID NO.3 et
L5 le transfert à travers la cellule a été mesuré par cytométrie de flux. L'oligonucélotide était fluorescent, le pourcentage de cellules transfectées, c'est-à-dire celles qui contiennent de la fluorescence, a été mesuré. Les résultats du tableau 4 ci-dessous montrent que l 'oligonucléotide seul ne peut pas transfecter les cellules. Par contre, l'addition du peptide 1 résulte en une augmentation significative de cellules transfectées. Cette augmentation est proportionnelle au rapport de charges. Ainsi pour un rapport de charge de 30, environ 24% de cellules étaient transfectées par 1 'oligonucléotide. Comme observé auparavant pour l'ADN plasmidique, l'addition d'une queue de poly-L-lysine au peptide (Peptide 2) ou de deux chaînes d'acide gras (Peptide 3) permet d'améliorer encore plus la transfection. Ainsi, à tous les rapports de charge utilisés, plus de 90 % de cellules ont été transfectées.
Tableau 4
Figure imgf000012_0001
Dans le tableau 4 ci-dessus : 1 μg oligo = 0,00018 μmole Rapport 20 = 0,0036 μmole de peptide Rapport 25 = 0,0045 μmole de peptide Rapport 30 = 0,0054 μmole de peptide

Claims

REVENDICATIONS
1) Peptide capable de transférer une substance d'intérêt portant des charges négatives à l'intérieur des
5 cellules et/ou à l'intérieur du noyau des cellules, caractérisé en ce que ledit peptide répond à la formule suivante :
(RLLR)p(L)n(R)n, dans laquelle : L représente la leucine, .0 R représente l' arginine, p est un nombre entier compris entre 2 et 4, n est 1 ou 2.
2) Peptide selon la revendication 1, .5 caractérisé en ce qu'il répond à la formule suivante représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.l : RLLRRLLRRLLRLLRR.
3 ) Vecteur capable de transporter une substance !0 d'intérêt portant des charges négatives à l'intérieur des cellules et/ou à l'intérieur du noyau des cellules, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 couplé à au moins un composé présentant une affinité pour les !5 membranes cellulaires ou capable de condenser la substance d'intérêt portant des charges négatives.
4) Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que le composé capable de condenser une
50 substance d'intérêt portant des charges négatives est un groupe polylysine comprenant environ au moins 5 et jusqu'à 25 résidus de lysine.
5) Vecteur selon la revendication 3, 55 caractérisé en ce que le composé présentant une affinité pour les membranes cellulaires est une chaîne d'acide gras saturé ou insaturé.
6) Vecteur selon l'une quelconque des
5 revendications 3 à 5, caractérisé en ce que le groupe polylysine ou les composés acides gras sont couplés à l'extrémité N ou C-terminale du peptide, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras de liaison.
L0 7) Composition comprenant un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 3 à 6 et une substance d'intérêt portant des charges négatives.
L5 8) Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le rapport :
Charges positives du peptide ou du vecteur
20
Charges négatives de la substance d'intérêt dans ladite composition, est égal ou supérieur à 1.
15 9 ) Composition selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que la substance d'intérêt portant des charges négatives est une protéine.
10) Composition selon l'une des revendications 30 7 ou 8, caractérisée en ce que la substance d'intérêt portant des charges négatives est une molécule d'acide nucléique.
11) Composition selon la revendication 10, 35 caractérisée en ce que la molécule d'acide nucléique est de l'ADN. 12) Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que la molécule d'acide nucléique est de l'ARN.
13) Composition selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce que la molécule d'acide nucléique est un plasmide.
14) Composition selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que la molécule d'acide nucléique est un oligonucléotide.
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