CA2272637A1 - Composition transfectante utile en therapie genique associant a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exogene, un agent de transfection non viral et non plasmidique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une composition transfectante utile en thérapie génique caractérisée en ce qu'elle associe à un ou plusieurs virus non enveloppés recombinants et comprenant dans leur génome au moins un acide nucléique exogène, au moins un agent de transfection non viral et non plasmidique.

Description

I
COMPOSITION TRANSFECTANTE UTILE EN THÉRAPIE GENIOUE

NUCLEIOUE EXOGENE. UN AGENT DE TRANSFECTION NON VIRAL ET
NON PLASMIDI(~UE.
La présente invention concerne ie domaine de la thérapie génique et s'intéresse plus particulièrement au transfert in vitro, ex vivo et/ou in vivo de matériel génétique.
Elle propose notamment une nouvelle composition utile pour transfecter efficacement des cellules.
Des déficiences et/ou anomalies (mutation, expression aberrante, etc) chromosomiques sont à l'origine de nombreuses maladies, à caractère héréditaire ou non. Pendant longtemps, la médecine conventionnelle est demeurée impuissante à
leur égard. Aujourd'hui, avec le développement de la thérapie génique, on espère pouvoir désormais corriger ou prévenir ce type d'aberration chromosomique. Cette nouvelle médication consiste à introduire une information génétique, dans la cellule ou l'organe affecté, en vu de corriger cette déficience ou anomalie ou encore, d'y exprimer une protéine d'intérêt .
L'obstacle majeur à la pénétration d'un acide nucléique dans une cellule ou un organe cible, repose sur la taille et la nature polyanionique de cet acide nucléique qui s'opposent à son passage à travers les membranes cellulaires.
Pour lever cette difficulté, diverses techniques sont aujourd'hui proposées dont plus particulièrement la transfection d'ADN nu à travers la membrane plasmique in vivo (W090/11092) et la transfection d'ADN via un vecteur de transfection.

2 En ce qui concerne plus particulièrement cette seconde technique, elle propose principalement deux stratégies:
La première met en oeuvre les vecteurs de transfection naturels que sont les virus et la seconde repose sur l'emploi de vecteurs chimiques ou biochimiques.
En ce qui concerne les vecteurs d'origine virale, ils sont aujourd'hui largement utilisés pour le clonage, le transfert et l'expression de gènes in vitro (pour la production de protéines recombinantes, la réalisation de tests de criblage, l'étude de la régulation de gènes, etc), ex vivo ou in vivo (pour la création de modèles animaux, ou dans des approches de transfert de gènes d'intérêt thérapeutique). Parmi ces virus, on peut citer notamment les adénovirus, les virus adéno-associés (AAV), les rétrovirus, les virus de l'herpès ou encore de la vaccine. La famille des Adénoviridae est largement répandue chez les mammifères et les oiseaux et regroupe plus de cent sérotypes différents de virus non-enveloppés à ADN bicaténaire, possédant une capside de symétrie icosaédrique (Horwitz, In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed.
Virology.
Third edition ed. Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2149-2171 ). Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation {Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions E1, E2, E3 et E4.
Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région E 1 sont nécessaires à la propagation virale.
Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions L 1 à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquencé et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité
d'autres génomes d'adénoviraux (Ad2, Ad7, Adl2, etc.) ont également été séquencées.
En plus de son innocuité, fadénovirus possède un tropisme cellulaire très large. Contrairement au rétrovirus dont le cycle est dépendant de 1a division cellulaire, .._.._.._. . _ .. ~__ _.T_.~..~_.. . __._. ___~

3 il peut avantageusement infecter les cellules en division active comme les cellules quiescentes et son génome se maintient sous forme épisomale. De plus il peut être produit avec des titres élevés ( 1 O 11 ufp/ml). Ces atouts majeurs en ont fait un vecteur de choix pour le clonage et l'expression de gènes hétérologues. Les adénovirus du groupe C, notamment de type 2 et 5, ainsi que les adénovirus canins de type CAV-2, dont la biologie moléculaire est la mieux connue, sont à l'origine des vecteurs actuellement utilisés. C'est ainsi que des vecteurs adénoviraux ont été
utilisés pour le clonage et l'expression de gènes in vitro (Gluzman et al., Cold Spring Harbor, New York 11724, p. 187), pour la création d'animaux transgéniques (W095/22616) pour le transfert de gènes dans des cellules ex vivo (W095/14785; W095/06120) ou encore pour le transfert de gènes dans des cellules in vivo (voir notamment W093/19191, W094/24297, W094/08026).
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et relativement site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé.
Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été
décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528).

4 Ces vecteurs et plus particulièrement les adénovirus s'avèrent performants sur le plan de la transfection. Classiquement, le processus d'infection des cellules par un vecteur de transfection viral se fait généralement en deux étapes. Il y a dans un premier temps, reconnaissance de récépteurs cibles à la surface des cellules pour permettre l'attachement du virus recombinant. La nature de ces récepteurs ainsi que leur répartition selon les types cellulaires restent peu documentés toutefois dans le cas particulier de l'adénovirus, il semble que c'est la fibre, une protéine à la surface externe de l'adénovirus, qui soit impliquée pour cet étape d'attachement. La seconde étape consiste alors en une interaction de la protéine viral penton, à la base de la fibre, via un motif peptidique RGD avec les integrines cellulaires avb3 et/ou avb5 conduisant à
l'internalisation du virion.
L'efficacité avec laquelle les virus recombinants peuvent infecter une cellule (efficacité de transduction) est très variable selon les types cellulaires étudiés en culture ou les tissus dont le ciblage est important pour un traitement in vivo. Dans tous les cas, c'est la première étape d'attachement qui détermine l'eff cacité
d'internalisation du virion. La quantité de recepteurs à la surface de la cellule constitue ainsi le facteur limitant dans le processus d'infection et il est clair que toute approche visant à
contourner ou à rendre plus facile cette étape d'attachement permettra de franchir cet obstacle.
Un premier objectif de la présente invention vise précisément à accroître l'efficacité de transfection de ces vecteurs viraux en optimisant leur internalisation au niveau de la cellule cible à traiter.
Un autre objectif visé et atteint par la présente invention se rapporte à la réduction voire la suppression de la réponse immunitaire manifestée classiquement par les cellules traitées à l'encontre du vecteur viral. En effet, comme pour tous les virus

5 PCT/FR97/02157 connus, l'administration de virus recombinants comme les adénovirus recombinants défectifs pour la réplication (Yang et al., PNAS ( 1994) 4407) induit une réponse immunitaire importante. L'un des rôles majeurs du système immunitaire consiste en effet à détruire les éléments non-soi ou soi-altéré. L'administration d'un vecteur de 5 thérapie génique d'origine virale introduit des motifs non-soi dans l'organisme. De même, les cellules infectées par un tel vecteur et exprimant de ce fait un gène exogène deviennent des éléments soi-altérés. La réponse immunitaire développée contre ces cellules infectées constitue donc un obstable majeur au développement de ces vecteurs viraux puisque (i) en induisant une destruction des cellules infectées elle limite la durée d'expression du gène et donc l'effet thérapeutique, (ü) elle induit parallèlement une réponse inflammatoire importante) et (iii) elle entraîne l'élimination rapide des cellules infectées après des injections répétées.
Avantageusement, la présente invention permet d'atteindre ces deux objectifs en associant au virus recombinant considéré un composé chimique ou biochimique qui 1 S l'assiste efficacement dans sa transduction et le protège des réactions du système immunitaire manifestées à son encontre.
Comme il l'est mentionné précédemment, parallèlement aux vecteurs viraux, il est également développé au niveau de la thérapie génique des vecteurs de transfection non viraux. Il s'agit plus précisément de vecteurs chimiques ou biochimiques.
Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'ADN à
transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane - plasmique et, le cas échéant, à travers les deux membranes nucléaires.
Pas aussi performants que les vecteurs viraux, ces vecteurs chimiques sont en revanche plus avantageux sur le plan immunitaire. Ils ne manifestent pas de pouvoir pathogène, le risque de multiplication de l'ADN au sein de ces vecteurs est nul et il ne

6 leur est attaché aucune limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN
à
transfecter.
Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine et DEAE dextran ou encore les lipofectants sont les plus avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur. Cette technique met à profit le principe de condenser l'ADN, grâce au polymère cationique, tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane à l'aide d'un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Les ciblages du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes ont ainsi été décrits.
L'objet principal de la présente invention repose précisément sur l'association d'au moins un de ces vecteurs chimiques ou biochimiques avec un virus recombinant comprenant dans son génome au moins une séquence nucléique exogène en vu de promouvoir plus efficacement la transduction cellulaire de ce virus recombinant.
De manière inattendue, la demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de tirer avantage simultanément des propriétés respectives de ces deux types de vecteurs de transfection pour induire efficacement l'expression de gènes thérapeutiques.
La présente invention met avantageusement à profit à la fois la proprieté de véhicules des vecteurs chimiques de type liposomes ou lipofectants capables de fusionner avec une large gamme de types cellulaires et l'efficacité
d'internalisation des virus recombinants comme plus particulièrement l'adénovirus. Il s'en suit une synergie

7 entre le virion comme agent de transduction d'un gène d'intérêt thérapeutique et le lipofectant comme assistant de transfection. Cette synergie se manifeste avantageusement à deux niveaux.
Tout d'abord, elle se traduit par une augmentation très significative de la concentration locale en virus recombinants. On assiste ainsi avec un adénovirus recombinant associé à un liposome à une efficacité de transfection 50 à 100 fois supérieure à celle observée avec l'adénovirus recombinant seul, dans un type cellulaire comme les cellules musculaires lisse vasculaires où le recepteur de la fibre est très peu exprimé. Cette observation a en outre été confirmée avec différents adénovirus recombinants. II s'avère donc possible, en présence d'un vecteur chimique ou biochimique, de mettre en oeuvre des quantités plus réduites en virus recombinants pour une efficacité au moins équivalente sinon supérieure.
Enfin, il a été noté de manière inattendue, que l'association d'un vecteur chimique avec un adénovirus recombinant permet d'atténuer ei~cacement le phénomène de neutralisation induit habituellement par le système immunitaire à
l'encontre des virus recombinants. Lorsqu'un adénovirus est mis, sous une forme isolée) en présence d'un sérum humain contenant des anticorps neutralisants anti-Ad, on observe une diminution sevère de l'efficacité de transduction. De manière inattendue, cette neutralisation est levée significativement en présence d'un vecteur chimique de type lipofectant. Selon la dose de lipofectant employée, la transduction est soit restaurée soit augmentée de 10 à 20 fois comparativement à celle de l'adénovirus - en conditions favorables.
La présente invention a donc pour premier objet une composition utile en thérapie génique caractérisée en ce qu'elle associe à un ou plusieurs virus non

8 enveloppés recombinants comprenant dans leur génome au moins un acide nucléique exogène au moins un agent de transfection non viral et non plasmidique.
En ce qui concerne l'agent de transfection non viral, il est préférentiellement choisi parmi les polymères cationiques et les lipofectants.
En ce qui concerne plus particulièrement les lipofectants, on entend couvrir au sens de l'invention, sous cette dénomination, tout composé à caractère lipidique et déjà
proposé à titre d' agent actif à l' égard de la transfection cellulaire d'acides nucléiques.
De manière générale, il s'agit de molécules amphiphiles comprenant au moins une région lipophile associée ou non à une région hydrophile. A titre représentatif de la première famille de composés, on peut notamment proposer les lipides susceptibles de former des liposomes comme les POPC, phosphatidylserine, phosphatidylcholine, cholestérol, lipofectamine, maléimidophénylbutyrylphosphatidyléthanolamine, lactosylcéramide en présence ou non de polyéthylène glycol pour former des liposomes furtifs ou, avec ou sans anticorps ou ligands, pour former des immunoliposomes ou des liposomes ciblés.
Selon un mode particulier de l'invention, l'agent lipidique mis en oeuvre possède une région cationique. Cette région cationique, préférentiellement polyamine, chargée cationiquement, vraisemblablement s'associe de manière réversible avec le virus recombinant.
A titre illustratif de ce type de lipides cationiques construits sur le modèle de structure : groupe lipophile associé à un groupement amino via un bras dit "spacer" on peut plus particulièrement citer le DOTMA et également ceux comprenant à titre de groupement lipophile deux acides gras ou un dérivé du cholestérol, et comportant, en outre, le cas échéant, à titre de groupement amino, un groupement d'ammonium

9 quaternaire. Les DOTAP, DOBT ou le ChOTB peuvent notamment être cités à titre représentatifs de cette catégorie de lipides cationiques. D'autres composés, comme les DOSC et ChOSC, se caractérisent par la présence d'un groupement choline à la place du groupement d'ammonium quaternaire.
Avantageusement, les lipofectants convenant à l'invention peuvent également être choisis parmi des lipopolyamines dont la région polyamine répond à la formule générale H2N-(-(ÇH)m-~')n-H
dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre 2 amines, cette région polyamine étant associée de manière covalente à
une région lipophile de type chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, du cholestérol, ou un lipide naturel ou synthétique capable de former des phases lamellaires ou héxagonales. Cette région polyamine est plus préférentiellement représentée par la spermine, la thermine ou un de leurs analogues ayant conservé ses propriétés de liaison à l'acide nucléique.
La demande de brevet EP 3 94 111 décrit des lipopolyamines de cette famille susceptibles d'être mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention. A
titre représentatif de ces lipopolyamines on peut plus particulièrement citer la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) et la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES).
Les lipopolyamines décrites dans la demande de brevet W096/17823 peuvent également être utilisées avantageusement selon l'invention. Elles sont représentées par la formule générale WO 98/23765 PCT/FIt97/02157 H2N-(-(~H)m-NH-)n-H
R
X,- Y, R3 ~X~--Y-R6 -(çH)p R4 dans laquelle R représente IRS
où -X et X' représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène, un groupement méthylène -(CH2)q- avec q égal à 0, l, 2 ou 3, ou un groupement 5 amino -NH- ou -NR'- avec R' représentant un groupement alkyle en C 1 à C4, -Y et Y' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4 et RS représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, substitué ou non, en C 1 à C4, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - R6 représente un dérivé du cholestérol ou un

10 groupement alkyle amino -NR 1 R2 avec R 1 et R2 représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C ~ 2 à C22.
A titre représentatif de ces lipopolyamines on peut tout particulièrement citer le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 2-S-bis-(3-amino-propylamino)-pentyle et le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 1,3-bis-(3-amino-propylamino)-2 propyle.
Enfin plus récemment, de nouvelles lipopolyamines, valorisables également dans le cadre de la présente invention, ont été décrites dans la demande de brevet FR
95/134 90. Il s'agit de composés de formule générale comme suit R1 N\
\ R4 \ N (CHZ)~ {CHZ) n P

11 Dans laquelle - R l, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH2)q-NRR' avec q pouvant varier entre l, 2, 3, 4, et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements R1, R2 et R3 et R et R' représentant indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un 5 groupement -(CHz)q'-NHz , q' pouvant varier entre l, 2, 3, 4, 5 et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements R et R', - m, n et p représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier pouvant varier entre 0 et 6 avec lorsque n est supérieur à l, m pouvant prendre des valeurs différentes et R3 des significations différentes au sein de la formule générale et -R4 représente un groupement de formule générale RS

X-f- CH) Y ~ N
u R7 dans laquelle - R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical aliphatique, saturé ou non, en C 10 à C22 avec au moins l'un des deux groupements étant différent de l'hydrogène, u est un nombre entier choisi entre 0 et 10 avec lorsque u est un entier supérieur à 1 R5, X, Y et r pouvant avoir des significations différentes au sein des différents motifs [ X-(CHRS)r-Y], -X
représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupement amine monoalkylé ou non, - Y
représente un groupement carbonyle ou un groupement méthylène, - RS représente un atome d'hydrogène ou une chaine latérale d'acide aminé naturel , le cas échéant e 20 substituée et -r représente un entier variant entre 1 et 10 avec lorsque r est égal à 1, RS
représentant une chaine latérale d'acide aminé naturel substitué ou non et lorsque r est supérieur à 1, RS représentant un atome d'hydrogène.

12 A titre représentatif de ces Iipopolyamines on peut plus particulièrement mentionner celles qui suivent:
{ H2N(CH2)3 ) 2N(CH2)4N i (CH2)3~2 i (CH2)3~CH2COGlyN[(CH2) 17-CH3]2 (RP120525) H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)18]2 (RP120535) H2N(CH2)3NH(CH2)çNH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18] (RP120531) Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention Ie vecteur non viral est représenté par au moins un polymère cationique et plus préférentiellement par un composé de formule générale ~ N-(CH2)n ~
R
p dans laquelle R peut être un atome d'hydrogène ou un groupe de formule (CH2)n-N
~q avec n est un nombre entier compris entre 2 et 10, p et q des nombres entiers, étant entendu que la somme p+q est telle que le poids moléculaire moyen du polymère soit compris entre 100 et 10~ Da. De tels composés sont notamment écrits dans la demande de brevet W096/02655.
En particulier, les polymères de polyéthylène imine (PEI) et polypropylène imine (PPI) présentent des propriétés tout à fait avantageuses. Les polymères préférés pour la mise en oeuvre de la présente invention sont ceux dont le poids moléculaire est

13 compris entre 103 et 5.106. A titre d'exemple, on .peut citer le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 50 000 Da (PEISOK) ou le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 800 000 Da (PEI800K). Le PEISOK ou Le PEI800K sont accessibles commercialement. Quant aux autres polymères représentés par la formule générale ci-dessus, ils peuvent être préparés selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR 94 08735.
De manière particulièrement avantageuse, on peut utiliser dans le cadre de l'invention la lipofectamine, la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 2-5-bis-(3-amino-propylamino)-pentyle, le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 1,3-bis-(3-amino-propylamino)-2 propyle, le i H2N(CH2)3 ~ 2N(CH2)4N ~ (CH2)3 NH2 ) (CH2)3~CH2COGIyN[(CH2) 17-CH3 ~2., le H2N(CHZ)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)18~2, le H2N(CH2)3NH(CHZ)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18]2 et/ou le H2N(CH2)3NH(CH2)~NH(CH2)~NHCH2COGIyN[(CH2) 17CH3 ~2.
Les virus recombinants mis en oeuvre selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve

14 néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
Le virus recombinant mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention dérive d'un virus enveloppé. A titre représentatif et non limitatif de ce type de virus, on peut plus particulièrement citer les adénovirus et les virus adéno-associé
(AAV).
Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 ( 1990) 81 ), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV).
De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E

au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697).

Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus comprend une délétion dans les régions E I et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans la région E 1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant. Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région E 1 s'étend 5 préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus AdS.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la séquence d'acide nucléique exogène est insérée au niveau de la délétion dans la région E 1.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene I O 1 ( 1991 ) 10 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre l'acide nucléique exogène. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée.
La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits

15 éléments, et (ü), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 ( 12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E
I et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et W095/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.

16 Les adénovirus mis en oeuvre selon l'invention peuvent également être obtenus selon un procédé original décrit dans la demande de brevet W096/25506 qui met en oeuvre à titre de plasmide navette, un plasmide procaryote comprenant un génome d'adénovirus recombinant bordé par un ou plusieurs sites de restriction non présents) dans ledit génome.
A titre illustratif et non limitatif des compositions revendiquées on peut notamment proposer celle associant à un adénovirus recombinant comprenant dans son génome au moins un acide nucléique exogène, une lipofectamine en quantité
suffisante pour améliorer sa transduction cellulaire Dans les compositions de la présente invention, l'acide nucléique incorporé au niveau du génome du virus recombinant peut être aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. lis peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin de même que des oligonuléotides courts ou des séquences plus longues. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter des gènes thérapeutiques, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des séquences antisens modifiées ou non, des régions dé liaison à d'autres composants cellulaires, etc.

17 Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthêse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NTS, HARP/pléiotrophine, etc la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes associés à l'arrêt de la division cellulaire et notamment le gène gax, les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de fADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux

18 protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apoüpoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholesterol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger.etc.
L'acide nucléique thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprenent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN
cibles (EP 321 201 ).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B

19 (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus, d'autres virus ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. II peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E 1 A, MLP, CMV, RS V, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible.
Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, les compositions revendiquées peuvent comprendre en outre un adjuvant de type dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoyl-palmitoylphos-phatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à
3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment 5 les asialoGM 1 et GM2).
Très récemment, la demanderesse a démontré qu'il était également particulièrement avantageux d' employer à titre d' adjuvant dans des compositions transfectantes, un composé intervenant, directement ou non) au niveau de la condensation d"acides nucléiques. Ce composé est constitué, en tout ou partie, de 10 motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10. Un tel agent peut également dériver en tout ou partie d'une histone, d'une nucléoline, d'une protamine et/ou de l'un de leurs dérivés.
(W096/25508). De tels adjuvants peuvent être mis à profit afin d'améliorer le trafic intracellulaire du virus recombinant dans les compositions revendiqués.
15 Les compositions selon l'invention peuvent également mettre en oeuvre un ou plusieurs élément de ciblage permettant de diriger les vecteurs viraux et non viraux vers des recepteurs ou des ligands à la surface de la cellules. A titre d' exemple, la composition de la présente invention peut comprendre un ou plusieurs anticorps dirigés contre des molécules de la surface cellulaire, ou encore un ou plusieurs ligands

20 de recepteurs membranaires comme l'insuline, la transferrine, !'acide folique ou tout autre facteur de croissance, cytokines ou vitamines. Avantageusement la composition peut utiliser des lectines, modifiées ou non, afin de cibler des polysaccharides particuliers à la surface de la cellule ou sur la matrice extracellulaire avoisinante. Des protéines à motif RGD, des peptides contenant un tandem de motifs RGD, cyclique ou non, ainsi que des peptides polylysine peuvent ainsi être utilisés. Ces agents de ciblages ___ ._ _ . _ ____. r.__._..._._. ~_

21 peuvent être conjugués soit avec le virus recombinant et/ou au vecteur de transfection non viral.
Les doses de virus utilisées pour l'administration peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml.. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
En ce qui concerne les quantités en vecteur de transfection non viral associé, elles varient bien entendu selon sa nature, la nature du vecteur viral qui lui est associé
de même que le type cellulaire visé. De manière générale on utilise in vitro une quantité pouvant varier entre SOng et 1 ~tg . Dans des applications ex-vivo la quantité
de vecteur de transfection non viral associé varie en fonction de la quantité
et du type de cellules tissulaires que l'on désire transfecter. Cette quantité peut varier entre 60 ng /ml et SOOpg/ml.
Les associations selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les associations pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou

22 pour une administration par voie topique {sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. La présente invention concerne donc également des cellules traitées par la composition de l'invention pour une utilisation ex-vivo.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
FIGURES
Figure 1: Effet de la lipofectamine sur l'efficacité de transduction d'un Ad-~igal au niveau de cellules CMLV.
Figure 2: Comparaison de l'efficacité de transduction d'un Ad-luc en présence et en absence de lipofectamine.
Figure 3: Détection au crystal violet des cellules CMV transduites par Ad-Tk et traitées au GCV, en présence et en absence de 0,125pg de lipofectamine.

23 Figures 4: Evaluation de l'effet de la lipofectamine sur la neutralisation de l'Ad-luc en milieu S VF ou SHA pour des doses variant de 0 à 0, 5 p,g de lipofectamine (figure 4A) et de 1 à lOp.g de lipofectamine (figure 4B).
Figure 5: Inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses par surexpression de la protéine Gax à l'aide d'un adénovirus seul (I) ou en utilisant la CLAAT (II).
Figure 6: Transfection ex vivo d'un adénovirus sur des artères isolées en association avec des doses croissantes de lipofectamine.
MATERIELS ET METHODES
Sont décrites ci-dessous les différentes méthodes utilisées pour montrer la synergie entre des adénovirus recombinants et des liposomes cationiques dans la transduction de cellules musculaires lisses vasculaires en culture primaire.
A- Cnltrrre primaire de cellr~les musculaires lisses vasculaires (CMLV) Les CMLV sont obtenues par digestion enzymatique d'aorte de lapin selon une méthode adaptée de Chamley et al (Cell Tissrre Res. 197,177, 503-522) puis mises en culture primaire. Pour ce faire, l'aorte de lapin est prelevée puis incubée pendant 45 minutes en présence de collagénase (Collagénase II, Cooper Biomédical) à
37°C. Une seconde digestion en présence de collagénase et d'élastase (Biosys) est réalisée pendant 2 heures à 37°C. Ces deux digestions permettent d'obtentir une suspension cellulaire constituée essentiellement de CMLV. Les CMLV sont maintenues en culture dans du milieu DMEM (Gibco) contenant 20% de sérum de veau foetal (SVF, Gibco) et utilisées pour l' ensemble des expériences avant le dixième passage. A
chaque WO 98/23765 PCTlFR97/02157

24 passage un phénotypage des CMLV est réalisé par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'alpha-actine spécifique des cellules musculaires lisses (Sigma).
B- Adénovirus recom8inants (Ad) Différents adénovirus recombinants sont mis en oeuvre pour les différents exemples de transduction de CMLV. Tous les Ad recombinants mis en oeuvre sont de première génération, déficients en réplication par délétion de la région E 1.
L'Ad-Luc porte une cassette d' expression contenant le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur CMV. Cette cassette d'expression provient d'un plasmide commercial pUT650 (Cayla,Toulouse France) et contient le géne de la luciférase fusionné au gène de résistance zéo sous controle du promoteur CMV. La cassette d' expression a été inséré dans la région E 1 de l'adénovirus In340 (Feldman et al., Improved efficiency of arterial gene transfer by use of poloxamer 407 as a vehicle for adenoviral vectors Gene Ther, 1997. 4: 189-98; Robert, JJ et al Gene 1 S Neurochemistry., 1997, Vol 68, pp 2152-2160; Hearing et al 1983, Cell 33 p695-703.).
L'Ad-f3Ga1 porte une cassette codant pour le gène de la 13-galctosidase, d'Echerichia Coli, fusionné dans sa partie N-terminale à une séquence de localisation nucléaire (NLS) identique à celle de l' antigène T du virus SV40, sous le contrôle du promoteur LTR-RSV (Stratford-Perricaudet et al. Widespread long-term gene transfer to mouse skeletal muscles and heart. J.CIin.Invest., 1992. 90: 626-630).
L'Ad-tk code pour le gène de la thymidine kinase, du virus Herpes simplex, sous le contrôle du LTR-RSV (Maron et al., Gene therapy of rat C6 glioma using adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene: long-term follow-up by magnetic resonance imaging. Gene Ther, 1996. 3: 315-22).

C- Transduction des CMLV par les Ad recombinants seuls oTi complexés à des liposomes cationiques Les CMLV sont ensemençées dans des plaques de culture de 24 puits (Falcon) à
une densité de 50 000 cellules par puit dans 1 ml de DMEM contenant 10% SVF (DMEM-5 SVF). Après 20 à 24 heures le DMEM-SVF des CMLV est remplacé par 300 pl de DMEM sans sérum. Les cellules sont, ensuite infectées par les virus recombinants, seuls ou complexés avec des liposomes, à des multiplicités d'infection (MOI) variable selon les expériences. Cette préparation adénovirale est ajoutée, après une incubation de 30 minutes à température ambiante, dans une suspension de 100 pl d'eau ou de 10 tampon phosphate (PBS) contenant soit Ad tout seul, à la MOI voulue, soit Ad avec des quantités variables de liposomes cationiques (Lipofectamine, Gibco). Les 100 pl de Ad ou le complexe Ad-lipofectamine sont directement ajoutés aux CMLV dans les 300 pl de DMEM. Pour les expériences destinées à étudier l'effet de sérum humain neutralisant (SHA), comparativement au SVF, sur l'efficacité de transduction.
Après 15 une période de I heure à 3 7°C, le mélange de transduction est remplacé par du DMEM 0.5 %SVF. 24 h après infection, la prolifération cellulaire est induite par ajout de milieu riche en sérum (DMEM 10% SVF). La viabilité cellulaire est estimée 72 h post-infection à l'aide du test Alamar Blue (Biosource).
Dans le cas des CMLV transduites par Ad-tk, les cellules sont mises en présence de 25 20 gM de Ganciclovir (GCV) pendant les 48 heures de culture. Parrallèlement, des cellules non infectées ou transduites par Ad-f3Ga1 servent de contrôles traités ou non par le GCV.

D- Transfert de l 'adénovirus codant pour le gène de la luci férase szn- des artéres isolées Les artères abdominales de lapin New Zélande White sont prélevées après euthanasie par surdose de pentobarbital sodique. L'abrasion des artères est effectuée à
l'aide de la sonde fogarty 3F gonflée avec 0.15 ml d'air. Les artères sont découpées en fragments de 5 mm puis ouvertes longitudinalement. Chaque fragment est déposé dans les puits d'une plaque 12 puits dans 1 ml de milieu sans sérum.
L'infection a lieu le jour même du prélévement. Le volume du mélange adénovirus (AV,.oCMVluc ou AV,.oCMV(3Gal, 10g pfu) et lipofectamine est ajusté à
80p1/puits avec du PBS. La solution est ensuite incubée 30 min à température ambiante puis déposée sur les fragments d'artère contenus dans 1 ml de milieu sans sérum dans un puits de plaque 12 puits. Les fragments sont ensuite incubés lh à 37°C
puis ils sont transférés dans une nouvelle plaque de 12 puits et incubés dans 2 ml de milieu DMEM
20% SVF. L' évaluation du transfert est fait soit par mesure de l' activité
luciférase (AV,.oCMVluc) soit par histochimie (AVi.oCMV(3Gal) 3 jours post infection.
Plusieurs doses de lipofectamine ont été testées pour une MOI constante d'AVi.oCMVluc.
E- Analyse de d'efficacité de transduction des CMLV par les Ad recombirranls associés ou non avec des liposomes.
~ Dosage de l'activité luciférase Les CMLV transduites par Ad-Luc sont recoltées dans 200 pl de tampon de lyse pour test luciférase (Promega). Après une période de I S minutes de lyse, 10 pl de chaque échantillon sont utilisés pour le dosage de l'activité luciférase à l'aide d'un kit (Luciferase assay Kit, Promega) et d'un luminomètre (Berthold). L'activité
luciérase est exprimée en RLU (Relative Right Units).

La mesure de l'activité luciférase sur les artères isolées nécéssite que les fragments d'artères soient broyés dans 500 pl de tampon de lyse contenant des anti-protéases puis incubés 20 min à température ambiante sous agitation. Ils sont ensuite centrifugés min à 10 000 tours. La lecture s'effectue sur 10 pl d'extrait en présence de 50 pl de 5 substrat pendant 10 secondes.
~ Dosage de l'activité f3-galctosidase dans les extraits cellulaires L'activité f3-gaictosidase dans les CMLV transduites par Ad-l3Gal est dosée par chimiluminescence selon le Kit Galacto-Light plus de Tropix, Inc. Briévement, les cellules sont lavées dans du PBS puis récoltées dans 250 pl d'une solution de lyse comprenant du phosphate de potassium 100mM pH 7,8 et 0,2%de Triton X-100. Les lysats sont centrifugés pendant 2 minutes à 10000 g, puis 5 pl de chaque échantillon sont mélangés à 50 pl du tampon de réaction Galcton-PIusTM et incubés pendant I
heure à température ambiante. Pour la mesure de luminescence, les mélanges sont placés dans un luminomètre (Berthold) puis recoivent 50 pl d'accélerateur (Light Emission Accelerator) et la luminescence est mesurée et exprimée en RLU.
~ Révélation histochimique de l' activité l3-galctosidase dans les cellules Les CMLV, sur le support de culture ou décoller par traitement à la trypsine, sont lavées au PBS puis fixées dans du PBS contenant 4% de formaldehyde. La solution de fixation est retirée au bout de 10 min, puis les cellules sont colorées pendant 1 à 4 heures à 37°C dans du PBS contenant du ferricyanure de potassium 4 mM, du ferrocyanure de potassium 4 mM, du Chlorure de magesium 200 mM et 0,4 mg/ml de substrat X-Gal. Le pourcentage de cellules bleues est calculé à
partir des préparations de CMLV en suspension alors que les CMLV colorer sur le support de culture sont photographiés.
~ Révélation histochimique de l' activité f3-galctosidase sur coupe de tissu 3 jours post-inféction les fragments de tissu (artères) sont fixés dans du PBS-Formol 4% pendant 3h. Ils sont ensuite rincés et traités de la façon suivante PB S 3 x 20min PBS-MgClz 30 min PBS-MgCl2 30 min à 4°C
Solution de perméabilisation 30 min à 4°C
(PBS-MgCl2, 2mM, Sodium desoxycholate 0.01 % et NP40 0.02 %) Solution de coloration 4 à 22 h à 37°C
(solution de perméabilisation plus K4Fe(CN)~ 3H20 35 mM et K~Fe(CN)6 35 mM) Ils sont ensuite lavés avec du PBS puis mis dans une cassettes et deshydratés comme suit 60% Ethanol 1 h 1$ 80% Ethanol 1 h 100% Ethanol 1 h 100% Ethanol 1 h 100% Ethanol 1 h Xyine 1 h Xylne 1 h Xylne 1 h Xylne 2h Paraffine 2h Paraffine 3h Ils sont ensuite inclus dans la para~ne et coupés au microtome.
~ Mesure de la viabilité cellulaire par coloration au Crystal Violet Pour évaluer l' efficacité de transduction par Ad-tk, les CMLV sont soumises à
un traitement par le GCV comme décrit plus haut. Les cellules viables, à l'issu de ce traitement, sont lavées au PBS puis fixées dans du PBS contenant 4% de formaldehyde. La solution de fixation est retirée au bout de 15 min, puis les cellules sont colorées pendant 20 minutes dans une solution de "crystal violet" à 0,1%
dans de l'eau. Après coloration, les cellules sont lavées trois fois dans de l'eau puis photographiées.

Cet exemple montre l'augmentation de la transduction des CMLV lorsque Ad-f3ga1 est associé à un liposome cationique comme la lipofectamine.
Les CMLV sont transduites selon le protocole décrit en MATERIEL ET
METHODES, par Ad-figal à une MOI de 10 en présence de doses croissantes de lipofectamine allant de 0 à 0, 5 pg. La révélation histochimique de l' activité
l3galactosidase montre clairement que dès la dose de 0,125 pg la lipofectamine augmente de manière très significative l' efficacité de transduction des CMLV
par Ad-13ga1. Pour quantifier cette augmentation de l'e~'icacité de transduction, le pourcentage de cellules positives pour l'activité l3galactosidase est déterminé après coloration histochimique des cellules en suspension selon le protocole décrit en MATERIEL ET MÉTHODE. La figure 1 illustre ces résultats.
Lorsque Ad-f3ga1 est utilisé seul à une MOI de 10, seules 1 à 2% de CMLV sont positives mais dès que la lipofectamine est ajoutée et ceci dès la dose de 0,125 pg le nombre de cellules positives atteint plus de 40 %. Cette efficacité de transduction est en corrélation parfaite avec l'activité l3galactosidase mesurée par chimiluminescence (figure 1 ). Une legère diminution de cette activité est, cependant, observée lorsque la quantité de lipofectamine est augmentée. Cette diminution est probablement due à une WO 98/23?65 PCT/FR97/0215?
légère toxicité comme le montre le comptage de cellules (figure l, courbe en pointillés). Cette toxicité,toutefois, et seulement à la dose la plus élevée de lipofectamine 0,5gg, ne touche pas plus de 25% des cellules.
Ces résultats montrent clairement le gain de transduction du à la combinaison d'un Ad-5 llgal à un lipofectant cationique.

L'exemple 2 a permis de determiner une dose de lipofectamine permettant d'augmenter la transduction des CMLV par Ad-f3gal à une MOI de 10. Pour se faire) l' Ad-Luc est mis en oeuvre à des MOI variables pour la transduction des CMLV et l'on procède 10 ensuite à un dosage de l'activité luciférase comme décrit en MATERIEL ET
MÉTHODE. L'activité luciférase augmente presque linéairement en fonction des MOI
de Ad-Luc utilisées pour transduire les CMLV (figure 2, cercles vides). De manière intéressante, et quelque soit la MOI utilisée, l'ajout de 0,125 pg de lipofectamine à
l'Ad-Luc ( figure 2, losanges plein) induit une augmentation d'un facteur de 100, de 15 (activité luciférase enregistrée. Ceci montre que, jusqu à une MOI 100 de Ad-Luc, une faible quantité de lipofectamine i. e. 0,125 ug subit pour potentialiser très significativement la transduction des CMLV.

L'adénovirus mis en oeuvre dans cet exemple est l'adénovirus Ad-TK, utilisé
pour la 20 propriété cytotoxique du gène de la thymidine kinase de I'Herpés simplex en présence de ganciclovir (GCV). Les CMLV ont été transduites avec des MOI de 1,10 et 100 de Ad-TK et traitées au GCV comme décrit en MATÉRIEL ET MÉTHODE. L'Ad-l3gal à une MOI 100 est utilisé comme contrôle.

Les Ad-TK et AD-f3gal sont utilisés soit seuls soit complexés avec 0,125 pg de lipofectamine. La figure 3 montre une coloration des CMLVau crystal violet après transduction et traitement au GCV.
Le GCV, comme attendu, n'a aucune toxicité vis à vis des cellules transduites par Ad-l3gal en présence ou en absence de lipofectamine. La transduction des CMLV par Ad-TK, suivie d'un traitement par le GCV, ne présente une toxicité visible (30 à

viables) qu'à la MOI la plus élevée i.e. MOI 100. De manière intéressante, lorsque Ad-TK est complexé avec 0,125 pg de lipofectamine le traitement au GCV à une efficacité
à MOI 1 comparable à celle obtenu avec Ad-TK seul à MOI 100. A MOI 10 ou 100, l'Ad-TK associé à la lipofectamine est hautement toxique en présence de GCV.
Cet exemple témoigne de l'intérêt de la présente formulation. Elle permet à la fois de réduire significativement la quantité en virus recombinants Ad-TK à
administrer et ceci pour une ei~~cacité thérapeutique égale ou supérieure comparativement à celle observée avec l'Ad-TK seul.

Au delà de l'efficacité de transduction qui peut être améliorée comme le montrent les exemples précédents, l'un des obstacles majeures à une efficacité optimale d'un adénovirus recombinant est sa neutralisation par le système immunitaire. En effet, suite à une lyse cellulaire après un premier transfert chez l'animal ou suite à un premier contact avec un adénovirus chez l'homme, le système immunitaire peut neutraliser de manière efficace le virus dans la circulation diminuant ainsi les possibilités de réinjection de virus.
Cet exemple reproduit in vitro la neutralisation de l'adénovirus recombinant par un pool de sérums humain, et montre de maniére avantageuse que l'association d'un adénovirus recombinant avec des liposomes permet d'abroger cette neutralisation et, selon la dose de liposomes, la transduction peut être supérieure à celle observée avec le virus seul.
Les figures 4A et B utilisent des CMLV transduites avec Ad-Luc à MOI 100 en présence de sérum de veau foetal (SVF) ou de sérum humain adulte (SHA) dans le milieu de culture DMEM.
Alors que IO% SVF ne modifie pas significativement l'eWcacité de transduction par Ad-Luc seul par rapport au DMEM, l'activité luciférase est sévèrement réduite en présence de 10 %de SHA. Des doses croissantes de lipofectamine, ajoutées à
l'Ad-Luc permettent de restaurer une activité luciférase équivalente et même nettement supérieure à celle observée avec le virus seul, aux doses de lipofectamine les plus élevées (figure 4B).
Cet exemple montre donc que la composition revendiquée permet d'une part d'abroger totalement la neutralisation d un adénovirus recombinant par des anticorps ou un sérum neutralisants et, d autre part, d'augmenter l'effcacité de transduction, en présence de sérum neutralisant, comme déjà montré dans les exemples précédents.

Cet exemple montre l'augmentation de la transduction d'un gène thérapeutique (gax) dans les cellules musculaires lisses de lapin par association de l'adénovirus AV i.oCMVrGax et d'un lipide cationique comme la lipofectine (CLAAT).
Les cellules musculaires lisses de lapin sont ensemmencées à raison de 5 104 cellules par puits d'un MW 48 dans du milieu DMEM 10% SVF. L'infection est effectuée 24h plus tard dans du milieu DMEM sans serum. Différentes dilutions d' adénovirus sont mélangées avec 60 ng de lipofectamine dans un volume final de 25 pl ajusté avec du PBS. Cette solution est incubée 30 min à température ambiante. Le milieu de culture est remplacé par 175 pl de milieu sans sérum par puits et le mélange de l'adénovirus et de la lipofectamine est aj outé sur les cellules. L' infection dure 1 h à
37°C. Le milieu contenant du virus est remplacé par du DMEM 0.5 %SVF.
24 h après infection, la prolifération cellulaire est induite par ajout de milieu riche en sérum (DMEM 10% SVF). La viabilité cellulaire est estimée 72 h post-infection à
l'aide du test Alamar Blue (Biosource).
Les résultats montrent que la lipofectamine, seule et à la dose nécessaire pour la CLAAT, n' a pas d' effet sur la viabilité des cellules. Cependant, la MOI
nécessaire pour atteindre 50% d'inhibition de croissance des SMC est 10 fois plus faible lorsque un mélange AV,.oCMVrGax et lipofectamine comparé à l'AVI.oCMVrGax seul est utilisé. La Figure 5 compare l'inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses par surexpression de la protéine Gax à l'aide d'un adénovirus seul (I) ou en utilisant la CLAAT (II). Les cellules ont été infectées à des MOI variant entre 0 et 105 PV/cellule avec l'AVI.oCMV (a) ou avec l'AVI.oCMVrGax seul (b). En utilisant la CLAAT les MOI varient de 0 à 3 10'' PV/cellule avec les mêmes virus (II-a et b).
Après infection les cellules sont incubées dans du milieu DMEM 0,5% SVF
pendant 24h. Le milieu est ensuite changé pour du milieu riche en sérum. La viabilité
cellulaire est estimée 72h post infection.
Cet exemple montre ainsi l'augmentation de la transduction du gène thérapeutique gax dans les cellules musculaires lisses de lapin par association de l'adénovirus AV,.oCMVrGax et de la lipofectamine. Cet exemple démontre également que la l'association d'un lipide cationic et d'un adénovirus permet d'utiliser des doses de virus plus faibles.

WO 98/23765 PCTlFR97/02157 Cet exemple décrit le transfert de gènes sur des fragments d'artères isolées en utilisant l'association d'un adénovirus codant pour la luciférase ou la (3Galactosidase et la lipofectamine ( CLAAT).
Les fragments d'artères sont obtenus et infectées suivant le protocole défini dans MATÉRIEL ET METHODE (D).
Pour la préparation des extraits cellulaires et la mesure de l'activité
luciférase, ies fragments d'artère sont broyés dans 500 gl de tampon de lyse contenant des anti-protéases puis incubés 20 min à température ambiante sous agitation. Ils sont ensuite centrifugés 5 min à 10 000 tours. La lecture s'effectue sur 10 pl d'extrait en présence de 50 ~1 de substrat pendant 10 secondes à l'aide d'un kit (Luciferase assay Kit, Promega) et d'un luminomètre (Berthold).
Les résultats présentés en figure 6 permettent de conclure que l'activité
luciférase est d'une pan nettement augmentée et d'autre part qu'elle est dépendante de la dose de lipofectamine utilisée lorsque le transfert de l' adénovirus sur des artères isolées est réalisé au moyen de la CLAAT.
La révélation de l'activité (3Galactosidase est réalisée comme décrit en MATÉRIEL ET
MÉTHODE (E). Les résultats histochimiques obtenus indiquent que les cellules, qui expriment la (3Galactosidase après transfert en utilisant la CLAAT sur des artères isolées, sont situées dans l'adventice et sont de type fibroblastique. De plus, le nombre de cellules transférées apparaît plus important que celui obtenu avec de l'adénovirus seul à la même MOI.
Cet exemple démontre que le transfert de gènes est possible sur des artères isolées en utilisant la CLAAT. De plus, ex-vivo, cette technique pérmet d'une part d' améliorer le transfert de gène et d'autre part d' atteindre les cellules de I' adventice.
ll peut être envisager d'utiliser cette technique pour le traitement des greffons veineux à
l'aide de gènes d'intérêt, comme par exemple le facteur FGF, portés par un vecteur adénoviral.

Claims (31)

REVENDICATIONS

1. Composition transfectante utile en thérapie génique caractérisée en ce qu'elle associe à un ou plusieurs virus non enveloppés recombinants et comprenant dans leur génome au moins un acide nucléique exogène, au moins un agent de transfection non viral et non plasmidique.

2. Composition selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'agent de transfection non viral est choisi parmi les polymères cationiques et les lipofectants.

3. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'agent de transfection non viral est un lipofectant.

4. Composition selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un lipide susceptible de former des liposomes, des liposomes furtifs, des immunoliposomes ou des liposomes ciblés.

5. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un lipofectant comprenant au moins une région polyamine de formule générale dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre 2 amines associée de manière covalente à une région lipophile de type chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, du cholestérol, ou un lipide naturel ou synthétique capable de former des phases lamellaires ou héxagonales.

6. Composition selon la revendication 5 caractérisée en ce que la région polyamine est représentée par la spermine, la thermine ou un de leurs analogues ayant conservé ses propriétés de liaison à l'acide nucléique.

7. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un lipofectant de formule générale dans laquelle R figurant la région lipophile est représenté par la formule générale dans laquelle - X et X' représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'oxygène, un groupement méthylène -(CH2)q- avec q égal à 0, 1, 2 ou 3, ou un groupement amino, -NH- ou -NR'- avec R' représentant un groupement alkyle en C1 à
C4, - Y et Y' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement méthylène, un groupement carbonyle ou un groupement C=S, - R3, R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, substitué
ou non, en C1 à C4, avec p pouvant varier entre 0 et 5, - R6 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino -NR1R2 avec R1 et R2 représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22.

8. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un lipofectant de formule générale Dans laquelle R1, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH2)q-NRR' avec q pouvant varier entre 1, 2, 3, 4, 5 et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements R1, R2 et R3 et R et R' représentant indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH2)q'-NH2, q' pouvant varier entre 1, 2, 3, 4, 5 et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements R et R', m, n et p représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier pouvant varier entre 0 et 6 avec lorsque n est supérieur à 1, m pouvant prendre des valeurs différentes et R3 des significations différentes au sein de la formule générale III et R4 représente un groupement de formule générale dans laquelle R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical aliphatique, saturé ou non, en C10 à C22 avec au moins l'un des deux groupements étant différent de l'hydrogène, u est un nombre entier choisi entre 0 et 10 avec lorsque u est un entier supérieur à 1 R5, X, Y et r pouvant avoir des significations différentes au sein des différents motifs [X-(CHR5)r-Y], X
représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupement amine monoalkylé ou non, Y
représente un groupement carbonyle ou un groupement méthylène, R5 représente un atome d'hydrogène ou une chaine latérale d'acide aminé naturel, le cas échéant substituée et r représente un entier variant entre 1 et 10 avec lorsque r est égal à 1, R5 représentant une chaine latérale d'acide aminé naturel substitué ou non et lorsque r est supérieur à 1, R5 représentant un atome d'hydrogène.

9. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'agent de transfection non viral est un polymère cationique choisi parmi les polyalkylèneimines.

10. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un polyéthylène imine (PEI) ou d'un polypropylène imine (PPI).

11. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'agent de transfection non viral est de préférence choisi parmi la lipofectamine, le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 50 000 (PEISOK), le polyéthylène imine de poids moléculaire moyen 800 000 (PEI800K), la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 2-5-bis-(3-amino-propylamino)-pentyle ou le (Dioctadécyl-carbamoylméthoxy)-acétate de 1,3-bis-(3-amino-propylamino)-2 propyle, le {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2, le H2N{CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)18]2, le H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18]2 et le H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2.

12. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique contenu dans le virus recombinant est un acide désoxyribonucléique.

13. Composition selon l'une des revendications précédentes 1 à 11 caractérisée en ce que l'acide nucléique contenu dans le virûs recombinant est un acide ribonucléique.

14. Composition selon la revendication 12 ou 13 caractérisée en ce que l'acide nucléique est modifié chimiquement.

15. Composition selon la revendication 12, 13 ou 14 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un antisens.

16. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique.

17. Composition selon la revendication 16 caractérisée en ce que le gène thérapeutique code pour un produit choisi parmi les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc la dystrophine ou une minidystrophine, la protéine CFTR.

18. Composition selon la revendication 16 caractérisée en ce que le gène thérapeutique est choisi parmi les gènes associés à l'arrêt de la division cellulaire et notamment le gène gax, les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation :
Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholesterol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger.

19. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le virus recombinant non enveloppé est dépourvu au moins des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule infectée.

20. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le virus recombinant non enveloppé dérive d'un adénovirus ou d'un AAV.

21. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le virus recombinant non enveloppé dérive de préférence d'un adénovirus d'origine animale ou humaine.

22. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le virus recombinant dérive d'un adénovirus de type Ad 5 ou Ad 2.

23. Composition selon l'une des revendications 1 à 4 et 12 à 22 caractérisée en ce qu'elle associe à un adénovirus recombinant comprenant dans son génome au moins un acide nucléique exogène, une lipofectamine en quantité suffisante pour améliorer sa transduction cellulaire.

24. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un adjuvant de type dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoyl-palmitoylphos-phatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à
3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides.

25. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un composé intervenant, directement ou non, au niveau de la condensation d'acides nucléiques.

26. Composition selon la revendication 25 caractérisée en ce que ce composé
est constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10.

27. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle associe en outre auxdits vecteurs un élément de ciblage.

28. Composition selon la revendication 27 caractérisée en ce que cet élément de ciblage est choisi parmi les anticorps dirigés contre des molécules de la surface cellulaire, des ligands de recepteurs membranaires comme l'insuline, la transferrine, l' acide folique ou tout autre facteur de croissance, cytokines ou vitamines.
des lectines, modifiées ou non, des protéines à motif RGD, des peptides contenant un tandem de motifs RGD, cyclique ou non, ainsi que des peptides polylysine.

29. Utilisation des compositions selon l'une des revendications 1 à 28 pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules.

30. Cellule recombinante caractérisée en ce qu'elle est obtenue par mise en contact avec une composition telle que décrite dans l'une des revendications 1 à 28.

31. Méthode de transfert d'un acide nucléique dans l'intérieur d'une cellule caractérisée en ce l'on met en contact ladite cellule avec une composition telle que décrite dans l'une des revendications 1 à 28.