JP2001514485A

JP2001514485A - 外来核酸を組込んだ組換えウイルスと非ウイルス性非プラスミド性トランスフェクション用物質との組合せから成る遺伝子治療に有用なトランスフェクション用組成物

Info

Publication number: JP2001514485A
Application number: JP52437898A
Authority: JP
Inventors: オベリー，ナタリー; ブノワ，パトリツク; ブラネレク，デイデイエ; ル・ルー，オード; マフデイ，アブデライム; ラテ・ナタリー
Original assignee: ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-11-28
Publication date: 2001-09-11
Also published as: FR2756491A1; NO992577L; EP0948636A1; SK70999A3; FR2756491B1; HUP9904201A3; IL130053A0; AU737846B2; AU7401098A; CZ188299A3; KR20000057307A; HUP9904201A1; NO992577D0; BR9713434A; WO1998023765A1; CA2272637A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの外来核酸をそのゲノムに含むエンベロープのない１つまたは複数の組換えウイルスと、少なくとも１つの非ウイルス性非プラスミド性トランスフェクション用物質との組合せから成ることを特徴とする遺伝子治療に有用なトランスフェクション用組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】外来核酸を組込んだ組換えウイルスと非ウイルス性非プラスミド性トランスフェクション用物質との組合せから成る遺伝子治療に有用なトランスフェクション用組成物本発明は遺伝子治療の分野に関する。より特定的には本発明は、遺伝物質のｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ及び／またはｉｎｖｉｖｏ導入に関する。本発明は特に、細胞に対する効率的なトランスフェクションに有用な新規な組成物を提案する。染色体の欠損及び／または異常（突然変異、異常発現など）は遺伝性または非遺伝性の多くの疾病の原因である。長年、従来の医薬はこれらの疾病に対して無力であった。今日では、遺伝子治療の発達に伴ってこの種の染色体異常の治療または予防も期待できるようになっている。この新規な治療方法は、疾病に罹患した細胞または器官に遺伝情報を導入し、欠損もしくは異常を矯正するかまたは有益なタンパク質を発現させる方法である。ターゲットとなる細胞または器官に核酸が侵入するときに主要な障害となるものは、核酸の細胞膜透過を妨げるような核酸のサイズ及びそのポリアニオン性である。この難点を解消するために、今日では様々な技術が提案されており、例えば、細胞質膜を透過するヌードＤＮＡのｉｎｖｉｖｏトランスフェクション（ＷＯ９０／１１０９２）及びトランスフェクションベクターによるＤＮＡトランスフェクションがある。上記の第二の技術をより詳細に考察すると、この技術では主として２つの戦略が提案されている。第一の戦略てはウイルスから成る天然トランスフェクションベクターを使用し、第二の戦略では化学的または生化学的ベクターを使用する。ウイルス由来のベクターに関して考察すると、この種のベクターは、（組換えタンパク質の産生、スクリーニング試験の実施、遺伝子調節の研究などの目的で）ｉｎｖｉｔｒｏで、（動物モデルの作製または治療用有効遺伝子の導入などの目的で）ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏで、遺伝子のクローニング、導入及び発現に広く使用されている。これらのウイルスとしては特に、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスがある。アデノウイルス科のウイルスは哺乳類、鳥類などに広く伝播しており、正二十面体様対称性のキャプシドを有するエンベロープのない二重鎖ＤＮＡウイルスであり、１００種類以上の異なる血清型で存在する（Ｈｏｒｗｉｔｚ，ＦｉｅｌｄｓＢＮ，ＫｎｉｐｅＤＭ，ＨｏｗｌｅｙＰＭ，ｅｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＲａｖｅｎＰｕｂ１ｉｓｈｅｒｓ，１９９６：２１４９−２１７１）。これらのウイルスのゲノムは特に、各末端の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）とキャプシド形成配列（Ｐｓｉ）と初期遺伝子と後期遺伝子とを含む。主要な初期遺伝子は領域Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４に含まれている。これらの初期遺伝子のうち、領域Ｅ１に含まれている遺伝子はウイルス増殖に必要である。主要な後期遺伝子は領域Ｌ１〜Ｌ５に含まれている。アデノウイルスＡｄ５のゲノムは完全配列が解明されており、データベースでアクセスできる（特に、ＧｅｎｅｂａｎｋＭ７３２６０参照）。同様に、他のアデノウイルスゲノム（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２、など）についても配列の一部または全部が解明されている。アデノウイルスは、無毒性であるだけでなく、極めて広範囲の細胞に向性を有している。細胞分裂に依存するサイクルをもつレトロウイルスにはないアデノウイルスの利点は、アデノウイルスが分裂中の活動細胞及び休止細胞の双方に感染でき、そのゲノムがエピソーム形態に維持されていることである。更に、アデノウイルスは高い力価（１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌ）で産生され得る。これらの有利な条件を有しているので、アデノウイルスは異種遺伝子のクローニング及び発現に最も好適なベクターとして選択されている。グループＣ、特に２型及び５型のアデノウイルス、並びに、分子生物学的に最も解明が進んでいるＣＡＶ−２型のイヌのアデノウイルスが、現在使用されているベクターの出発材料になっている。このような理由から、アデノウイルスベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏで遺伝子をクローニング及び発現するため（Ｇｌｕｚｍａｎら，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ１１７２４，ｐ．１８７）、トランスジェニック動物を作製するため（国際特許ＷＯ９５／２２６１６）、ｅｘｖｉｖｏで細胞に遺伝子を導入するため（国際特許ＷＯ９５／１４７８５；ＷＯ９５／０６１２０）、または、ｉｎｖｉｖｏで細胞に遺伝子を導入するため（特に国際特許ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２４２９７、ＷＯ９４／０８０２６参照）、などの目的に使用されてきた。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に関して考察すると、これらは、比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスであり、安定に且つ比較的部位特異的に感染細胞のゲノムに取込まれる。これらのウイルスは広いスペクトルの細胞に感染し得る。ＡＡＶのゲノムはクローニングされ、配列決定され、特性決定されている。これらのウイルスは約４，７００塩基から構成され、各末端に、ウイルスの複製起点として機能する約１４５塩基の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有している。ゲノムの残りの部分はキャプシド形成機能を担う２つの主要領域に分割される。ゲノムの左側部分はウイルス複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで遺伝子を導入するためにＡＡＶ由来のベクターを使用することは文献に記載されている（特に、国際特許ＷＯ９１／１８０８８；ＷＯ９３／０９２３９；米国特許ＵＳ４，７９７，３６８；ＵＳ５，１３９，９４１；欧州特許ＥＰ４８８，５２８）。これらのベクター、特にアデノウイルスは、高いトランスフェクションレベルを実現し得ることが判明した。ウイルス性トランスフエクションベクターを用いる従来の細胞感染方法は一般に２段階で行われる。第一段階で、組換えウイルスが結合し得る細胞表面のターゲットレセプターが認識される。細胞の型に応じたこれらのレセプターの種類及びその分布は特にアデノウイルスに関しては文献にもあまり記載されていないが、この結合段階にはアデノウイルスの外面のファイバータンパク質が関与すると考えられる。次いで、第二段階で、ファイバーの基部に存在するウイルスのペントンタンパク質がペプチドモチーフＲＧＤを介して細胞インテグリンａｖｂ３及び／またはａｖｂ５と相互作用し、ビリオンの細胞内取込みに導かれる。組換えウイルスの細胞感染効率（形質導入効率）は、培養中の被験細胞の型によって、または、ｉｎｖｉｖｏ治療のためにターゲッティングされるべき組織によって、異なった値を示す。いずれの場合にも、第一段階で生じる結合がビリオンの細胞内取込み効率を左右する。このように細胞表面のレセプターの量が感染プロセスの限定要因となるので、この結合段階を回避する方法またはこの結合を促進する方法がこの障害を解消し得ることは明らかである。従って、より詳細には本発明の第一の目的は、治療すべきターゲット細胞に対する最適な細胞内取込みを達成することによってこれらのウイルスベクターのトランスフェクション効率を向上させることである。本発明によって追求され達成された別の目的は、処理された細胞がウイルスベクターに対して従来は示していた免疫応答を軽減、より好ましくは削除することである。実際、すべての既知のウイルスと同様に、複製欠陥のある組換えアデノウイルスのような組換えウイルスの投与はかなりの免疫応答を誘発する（Ｙａｎｇら，ＰＮＡＳ（１９９４）４４０７）。実際、免疫系の主要な作用の１つは非自己要素または変質した自己要素を破壊することにある。ウイルス起原の遺伝子治療ベクターの投与は生物体内に非自己モチーフを導入する。また、このようなベクターに感染しその結果として外来遺伝子を発現する細胞は、変質した自己要素となる。従って、このような感染細胞に対して生じる免疫応答は、（ｉ）感染細胞の破壊を誘発することによって遺伝子の発現期間、従って治療有効期間を短縮する、（ｉｉ）同時に、かなりの炎症性応答を誘発する、（ｉｉｉ）反復注射後に感染細胞の迅速な除去を惹起する、などの理由によってこれらのベクターの開発に対する主要な障害となる。本発明は、考察中の組換えウイルスを、該ウイルスの形質導入を有効に支援しかつ該ウイルスとの接触によって生じる免疫系の反応を防御する化学的または生化学的な化合物に組合せることによって、上記の２つの目的を有利に達成し得る。前述のように、遺伝子治療のレベルでは、ウイルスベクターと並行して、非ウイルス性トランスフェクションベクターも開発されている。より特定的には、これらは化学的または生化学的ベクターである。これらの合成ベクターは２つの主要な機能、即ち、トランスフェクトすべきＤＮＡを圧縮する機能、及び、該ＤＮＡが細胞に結合し、細胞質膜及び必要な場合には２つの核膜を透過することを促進する機能を有している。これらの化学的ベクターはウイルスベクターよりも性能は劣るが、反面、免疫の観点からはより有利である。化学的ベクターは病原性を示さない。これらのベクターの内部でＤＮＡが増幅される危険は全くない。また、これらのベクターを用いてトランスフェクトされるＤＮＡのサイズに関する理論的制約は全く存在しない。開発された合成ベクターのうちでは、ポリリシンもしくはＤＥＡＥデキストランの種類のカチオン性ポリマーまたはリポフェクタントが最も有利である。これらは、ＤＮＡを縮合し、細胞膜との結合を促進する特性を有している。より最近には、レセプターによって介在されるターゲット化トランスフェクションの構想が展開された。この技術は、カチオン性ポリマーとＤＮＡとを縮合し、同時に、ＤＮＡが導入される細胞型の表面に存在する膜レセプターのリガンドとカチオン性ポリマーとを化学結合させることによって複合体を膜に結合させるという原理を利用している。トランスフェリンもしくはインスリンに対するレセプター、または、肝細胞のアシアログリコタンパク質のレセプターのターゲッティングは既に記載されている。より詳細には本発明の主な目的は、細胞に対する組換えウイルスの形質導入をより効率的に促進するために、これらの化学的または生化学的ベクターの少なくとも１つと、少なくとも１つの外来核酸をそのゲノムに含む組換えウイルスとを組合せることである。予想外にも出願人は、治療用遺伝子の発現を効率的に誘発するためにこれらの２種類のトランスフェクションベクターの夫々の特性を同時に利用できることを知見した。本発明の利点は、リポソームまたはリポフェクタントの種類の化学的ベクターが有している広範囲の細胞型に融合し得るというビヒクル特性と、特にアデノウイルスのような組換えウイルスが有している細胞内取込み効率とを同時に利用することである。その結果として、有益な治療用遺伝子の形質導入媒体であるビリオンとトランスフェクション助剤であるリポフェクタントとの相乗効果が得られる。この相乗効果は２つのレベルで有利に現れる。第一には、組換えウイルスの局部的濃度の極めて有意な増加として現れる。例えば、線維のレセプターの発現が極めて難しい血管の平滑筋細胞のような細胞型においても、リポソームに組合せた組換えアデノウイルスのトランスフェクションが促進され、組換えアデノウイルス単独で観察されたトランスフェクション効率の５０〜１００倍のトランスフェクション効率が観察される。この観察は更に種々の組換えアデノウイルスによって確認された。従って、化学的または生化学的ベクターの存在下では、優越はしないまでも少なくとも等しい効率を得るために組換えウイルスの使用量を減少させ得ることが判明した。第二には、組換えウイルスに接触した免疫系によって通常は誘発される中和現象が、化学的ベクターと組換えアデノウイルスとの組合せによって有効に減衰されるという予想外の観察が得られた。抗Ａｄ中和抗体を含むヒト血清中に単離形態のアデノウイルスが存在するときは形質導入効率の顕著な低下が観察される。リポフェクタントの種類の化学的ベクターの存在下では意外にも上記のような中和が明らかに阻害される。使用されるリポフェクタントの用量次第で、形質導入は、有利な条件下のアデノウイルスの形質導入の１０〜２０倍まで回復または増加する。従って、本発明の第一の目的は、少なくとも１つの外来核酸をそのゲノムに含む１つまたは複数のエンベロープのない組換えウイルスと非ウイルス性非プラスミド性の少なくとも１つのトランスフェクション用物質との組合せから成ることを特徴とする遺伝子治療に有用な組成物を提供することである。非ウイルス性トランスフェクション用物質は好ましくはカチオン性ポリマー及びリポフェクタントから選択される。特にリポフェクタントに関して考察すると、本発明で使用されたリポフェクタントなる用語は、核酸の細胞トランスフェクションに有効な物質であることが判明していた既知の任意の脂質化合物を意味する。一般的にこの用語は、任意に親水性領域と共存する少なくとも１つの親油性領域を含む両親媒性分子を意味する。これらの化合物の第一のグループの代表例としては、ＰＯＰＣ、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロール、リポフェクトアミン、マレイミドフェニルブチリルホスファチジルエタノールアミン、ラクトシルセラミドのようなリポソームを形成し得る脂質を挙げることができる。これらの脂質は、ポリエチレングリコールの存在下または非存在下で易溶性リポソームを形成したり、あるいは、抗体またはリガンドと共にまたは単独でイムノリポソームまたはターゲット化リポソームを形成したりする。本発明の特定実施態様によれば、使用される脂質物質はカチオン性領域を有している。正電荷をもつこのカチオン性領域、好ましくはポリアミンは、組換えウイルスと可逆的に会合すると考えられる。この種のカチオン性脂質は例えば以下の構造をモデルとして構築される。親油性基がいわゆる“スペーサー”アームを介してアミノ基に会合する構造のカチオン性脂質の代表例としては特にＤＯＴＭＡがある。また、親油性基として２つの脂肪酸またはコレステロール誘導体を含み、更に必要に応じてアミノ基として第四アンモニウム基を含むカチオン性脂質の代表例としては特にＤＯＴＰ、ＤＯＢＴ及びＣｈＯＴＢがある。ＤＯＳＣ及びＣｈＯＳＣのような別の化合物は、第四アンモニウム基の代わりにコリン基が存在することを特徴とする。好ましくは、本発明に好適なリポフェクタントはまた、一般式：〔式中、ｍは２以上の整数を表し、ｎは１以上の整数を表し、ｍは２つのアミン間に含まれている種々の炭素基次第で異なる値を有し得る〕で示されるポリアミン領域をもつリポポリアミンから選択され得る。このポリアミン領域は、コレステロールの飽和または不飽和の炭化水素鎖型の親油性領域、または、層状もしくは六角形の相を形成し得る天然もしくは合成の脂質に共有結合的に会合し得る。このポリアミン領域のより好ましい代表例は、スペルミン、テルミンまたはその核酸結合特性を保存しているそれらの類似体の１つである。欧州特許出願ＥＰ３９４１１１は、本発明の範囲内で使用され得るこのグループのリポポリアミンを記載している。これらのリポポリアミンの代表例としては特に、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）及びパルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）がある。国際特許出願ＷＯ９６／１７８２３に記載されたリポポリアミンもまた本発明に有利に使用され得る。これらは一般式：によって示される。式中のＲは、式：によって表され、この式中、Ｘ及びＸ’は互いに独立に、酸素原子、メチレン基−（ＣＨ₂）_q−｛ｑは０、１、２または３に等しい｝、または、アミノ基−ＮＨ−もしくは−ＮＲ’−｛Ｒ ’はＣ₁〜Ｃ₄のアルキル基｝を表し、Ｙ及びＹ’は互いに独立に、メチレン基、カルボニル基、または基Ｃ＝Ｓを表し、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅は互いに独立に、水素原子、置換もしくは未置換のＣ₁〜Ｃ₄ のアルキル基を表し、ｐは、０〜５の範囲であり、Ｒ₆は、コレステロール誘導体またはアルキルアミノ基−ＮＲ₁Ｒ₂｛Ｒ₁及びＲ₂ は互いに独立に、飽和または不飽和の直鎖状または分枝状のＣ₁₂〜Ｃ₂₂の脂肪族基｝を表す。これらのリポポリアミンの代表例としては特に、２−５−ビス−（３−アミノ −プロピルアミノ）ペンチル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテート及び２−〔１，３−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）〕−プロピル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテートがある。最後に、より最近になって本発明の範囲内で同様に有効な新規なリポポリアミン類がフランス特許出願ＦＲ９５／１３４９０に記載された。これらは一般式：で示される化合物である。式中のＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃は互いに独立に、水素原子または基−（ＣＨ₂）_q−ＮＲＲ’｛ｑは、１、２、３、４、５または６の整数であり、基Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は独立に異なるｑの値を有し得る｝を表し、Ｒ及びＲ’ は互いに独立に水素原子または基（ＣＨ₂）_q'−ＮＨ₂｛ｑ’は、１、２、３、４、５または６の整数であり、基Ｒ及びＲ’は独立に異なるｑ’の値を右し得る｝を表し、ｍ、ｎ及びｐは互いに独立に０〜６の整数を表し、但し、ｎが１よりも大きいときはｍは種々の値を表しかつＲ₃は一般式に定義された種々の意味を有することができ、Ｒ₄は一般式：で示される基を表し、式中の、Ｒ₆及びＲ₇は互いに独立に水素原子または飽和もしくはは干飽和のＣ₁₀〜Ｃ₂₂の脂肪族基を表し、２つの基の少なくとも一方が水素原子ではなく、ｕは０〜１０から選択された整数であり、但し、ｕが１よりも大きい整数のときは、Ｒ₅ 、Ｘ、Ｙ及びｒはモチーフ〔Ｘ−（ＣＨＲ₅）_r−Ｙ〕に定義された種々の意味を有することができ、Ｘは水素原子、イオウ原子または任意にモノアルキル化したアミン基を表し、Ｙはカルボニル基またはメチレン基を表し、Ｒ₅は水素原子または必要に応じて置換された天然アミノ酸側鎖を表し、ｒは１〜１０の整数を表し、但し、ｒが１のとき、Ｒ₅は置換または未置換の天然アミノ酸側鎖を表し、ｒが１よりも大きいとき、Ｒ₅は水素原子を表す。これらのリポポリアミンの代表例として特に以下のリポポリアミンを挙げることができる：｛Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃｝₂Ｎ（ＣＨ₂）₄Ｎ｛（ＣＨ₂）₃ＮＨ₂｝（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₇−ＣＨ₃〕₂（ＲＰ１２０５２５）；Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃ＮＨ（ＣＨ₂）₄ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₈〕₂（ＲＰ１２０５３５）；Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃ＮＨ（ＣＨ₂）₄ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＡｒｇＮ〔（ＣＨ₂）₁₈〕（ＲＰ１２０５３１）。本発明の別の特定実施態様において、非ウイルス性ベクターは、少なくとも１つのカチオン性ポリマー及びより好ましくは一般式：の化合物によって表される。式中のＲは水素原子または式：の基であり、ｎは２〜１０の整数であり、ｐ及びｑは整数である。但し、ｐ＋ｑの和は、ポリマーの平均分子量が１００〜１０⁷Ｄａの範囲となるように選択される。このような化合物は特に国際特許出願ＷＯ９６／０２６５５に記載されている。特に、ポリエレンイミン（ＰＥＩ）及びポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）のポリマーは極めて有利な特性を有している。本発明の実施に好ましいポリマーは、１０³〜５×１０⁶の範囲の分子量を有するポリマーである。例えば、平均分子量５０，０００Ｄａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０Ｋ）または平均分子量８００，０００Ｄａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００Ｋ）が好ましい。ＰＥＩ５０ＫまたはＰＥＩ８００Ｋは市販されている。上記の一般式によって表される他のポリマーに関しては、フランス特許出願ＦＲ９４０８７３５に記載の方法によって製造できる。特に好ましくは、本発明の範囲内で、リポフェクトアミン、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、パルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）、２−５−ビス−（３ −アミノ−プロピルアミノ）−ペンチル（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテート、２−〔１，３−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）〕− プロピル（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテート、｛Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃｝₂Ｎ（ＣＨ₂）₄Ｎ｛（ＣＨ₂）₃ＮＨ₂｝（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₇−ＣＨ₃〕₂、Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃ＮＨ（ＣＨ₂）₄ＮＨ（ＣＨ₂）₃ ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₈〕₂、Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃ＮＨ（ＣＨ₂）４ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＡｒｇＮ〔（ＣＨ₂）₁₈〕₂及び／またはＨ₂Ｎ（ＣＨ₂ ）₃ＮＨ（ＣＨ₂）₄ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₇ＣＨ₃〕₂を使用し得る。本発明で使用される組換えウイルスは欠陥ウイルス、即ち、ターゲット細胞中で自律複製できないウイルスである。一般に、本発明の範囲内で使用される欠陥ウイルスのゲノムは、感染細胞中でウイルスが複製するために必要な配列を少なくとも欠損している。これらの領域は、（その全部または一部が）除去されてもよく、非機能性になっていてもよく、または、別の配列、特に挿入核酸によって置換されていてもよい。しかしながら好ましくは、欠陥ウイルスがウイルス粒子のキャプシド形成に必要な配列をそのゲノムに保存している。本発明の範囲内で使用される組換えウイルスはエンベロープのあるウイルスに由来する。この種のウイルスの非限定的代表例としては特に、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）がある。好ましい実施態様によれば、ウイルスがアデノウイルスである。アデノウイルスは構造及び特性が多少異なる種々の血清型として存在する。本発明の範囲内ではこれらの血清型のうちの２型もしくは５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物由来のアデノウイルス（国際特許９４／２６９１４参照）が好ましく使用される。本発明の範囲内で使用できる動物由来のアデノウイルスとしては、イヌ、ウシ、ネズミ（例えば、Ｍａｖ１，Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル（例えばＳＡＶ）に由来のアデノウイルスがある。好ましい動物由来のアデノウイルスはイヌのアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２〔例えばマンハッタン株またはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣＶＲ−８００）〕である。好ましくは、本発明の範囲内でヒトまたはイヌ由来のアデノウイルスまたは混成アデノウイルスを使用する。好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノムの少なくとも領域Ｅ１が非機能性である。考察中のウイルス遺伝子は当業者に公知の任意の技術、特に考察中の１つまたは複数の遺伝子中の１つまたは複数の塩基の完全削除、置換、部分欠失または付加によって非機能性になる。また、他の領域、特に領域Ｅ３（国際特許ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２（国際特許ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４（国際特許ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）及びＬ５（国際特許ＷＯ９５／０２６９７）が修飾されてもよい。好ましい実施態様によれば、本発明のアデノウイルスは少なくとも領域Ｅ１及び領域Ｅ４に欠失を含む。別の好ましい実施態様によれば、領域Ｅ４とコーディング配列とが挿入されているレベルでアデノウイルスは領域Ｅ１に欠失を含む。本発明のウイルス中の領域Ｅ１の欠失は好ましくはアデノウイルスＡｄ５の配列のヌクレオチド４５５から３３２９までの範囲である。好ましい別の実施態様によれば、外来核酸配列が領域Ｅ１の欠失の処に挿入されている。本発明の欠陥組換えアデノウイルスは当業者に公知の任意の技術によって作製できる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５，欧州特許ＥＰ１８５，５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯＪ．３（１９８４）２９１７）。特にこれらのアデノウイルスは、アデノウイルスと特に外来核酸を含むプラスミドとの間の相同組換えによって作製され得る。アデノウイルスとプラスミドとを適当な細胞系にコトランスフェクションすることによって相同組換えを惹起する。使用される細胞系は好ましくは、（ｉ）上記要素によって形質転換可能な細胞系、及び、（ｉｉ）欠陥アデノウイルスのゲノムの部分を相補し得る配列を、好ましくは組換えが生じる危険のない組込み形態で含む細胞系、である。細胞系の例としては特に、アデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）が細胞系のゲノムに組込まれたヒト２９３腎肝細胞系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）、または、特に国際特許出願ＷＯ９４／２６９１４及びＷＯ９５／０２６９７に記載されているようなＥ１及びＥ４の機能を相補し得る細胞系がある。次いで、増殖したアデノウイルスを、実施例に示すように分子生物学の慣用技術によって回収し精製する。本発明で使用されるアデノウイルスはまた、そのゲノム中に本来は存在しない１つまたは複数の制限酵素部位が境界となっている組換えアデノウイルスゲノムを含む原核性プラスミドをシャトルプラスミドとして使用する国際特許出願ＷＯ９６／２５５０６に記載の独創的な方法で作製され得る。請求の範囲に記載の組成物の非限定的代表例は特に、少なくとも１つの外来核酸をゲノムに含む組換えアデノウイルスと細胞に対するその形質導入を改良するために十分な量のリポフェクトアミンとの組合せから成る組成物である。本発明の組成物中で、組換えウイルスのゲノムの処に組込まれる核酸は、デオキシリボ核酸でもよくリボ核酸でもよい。これは、特に天然起原または人工のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡの配列、ハイブリッド配列、または、修飾もしくは被修飾のオリゴヌクレオチドの合成もしくは半合成の配列でもよい。これらの核酸はヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどに由来し得る。これらの核酸は当業者に公知の任意の技術、特にバンクスクリーニング、化学合成、あるいは、バンクスクリーニングによって得られた配列の化学的または酵素的修飾を含む混成方法によって得られる。デオキシリボ核酸に関してより詳細に考察すると、これらは一本鎖でも二重鎖でもよく、また短いオリゴヌクレオチドでもよく、より長い配列でもよい。これらのデオキシリボ核酸は、治療用遺伝子、転写または複製の調節配列、修飾または被修飾のアンチセンス配列、他の細胞成分に対する結合領域などを含み得る。本発明の定義によれば治療用遺伝子なる用語は特に、治療効果を有するタンパク質性産物をコードする任意の遺伝子を意味すると理解されたい。このような遺伝子によってコードされるタンパク質性産物は、タンパク質、ペプチドなどである。このタンパク質性産物はターゲット細胞に対して同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る（即ち、ターゲット細胞が病因を全く有していないときにターゲット細胞中で正常に発現される産物である）。このタンパク質性産物の発現は、細胞内の不十分な発現の解消、修飾によって不活性もしくは弱活性になったタンパク質の発現の回復、または、このようなタンパク質の超発現などの効果を与える。治療用遺伝子はまた、安定性が強化されたり活性が修飾されたりした細胞タンパク質の突然変異体をコードし得る。タンパク質性産物はまた、ターゲット細胞に対して異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る。このタンパク質性産物の発現は、細胞の欠損活性を補完または付与し、例えば、病因に対する抵抗または免疫応答の刺激などの効果を有し得る。本発明の定義に含まれる治療用産物としては特に、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど(フランス特許ＦＲ９２０３１２０)、成長因子、神経伝達物質またはそれらの前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、など、ジストロフィンまたはミニジストロフィン（フランス特許ＦＲ９１１１９４７）、膵線維症関連のＣＦＴＲタンパク質、細胞分裂の停止に関与する遺伝子特にｇａｘ遺伝子、腫瘍抑制遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（フランス特許ＦＲ９３０４７４５）、疑固関与因子をコードする遺伝子：ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビンまたはその他のタンパク質運搬体の遺伝子、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びアポ（ａ）から選択されたアポリポタンパク質型の脂質の代謝に関与するタンパク質に対応する遺伝子、リポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ、７アルファコレステロールヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼのような代謝酵素、あるいは、コレステロールエステル転移タンパク質、リン脂質転移タンパク質のような脂質転移タンパク質、ＨＤＬ結合タンパク質、あるいは、ＬＤＬレセプター、キロミクロンレムナントレセプター及びスカベンジャーレセプターなどから選択されたレセプターなどがある。治療用核酸はまた、ターゲット細胞中で発現したときに遺伝子の発現または細胞性ｍＲＮＡの転写をコントロールし得る遺伝子またはアンチセンス配列でもよい。このような配列は例えば欧州特許出願ＥＰ１４０３０８に記載の技術に従って、細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡとしてターゲット細胞中にて転写され、細胞ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを阻止する。治療用遺伝子はまた、ターゲットＲＮＡを選択的に破壊し得るリボザイムをコードする配列を含む（欧州特許ＥＰ３２１２０１）。上述のように、核酸はまた、ヒトまたは動物の体内で免疫応答を誘発し得る抗原性ペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み得る。本発明のこの特定実施態様によれば、特に微生物、ウイルスまたは癌に対抗するためにヒトまたは動物に投与されるワクチンまたは免疫治療薬が得られる。特に、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂ型ウイルス（欧州特許ＥＰ１８５５７３）、偽狂犬病ウイルス、“シンシチウム形成ウイルス”、その他の腫瘍特異的ウイルス(欧州特許ＥＰ２５９２１２)に特異的な抗原性ペプチドが得られる。好ましくは、核酸はまた、治療用遺伝子及び／または抗原性ペプチドをコードする遺伝子を所望の細胞または器官内で発現させ得る配列を含む。これらの配列は、感染細胞中で機能し得る遺伝子本来の発現担当配列でもよい。また、（他のタンパク質の発現を担当する）種々の起原の配列でもよい（または合成配列でもよい）。特に、真核生物またはウイルスの遺伝子のプロモーター配列であってもよい。例えば、感染目的細胞のゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。同様に、ウイルスのゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶなどの遺伝子のプロモーターを挙げることができる。更に、これらの発現配列を、活性化配列、調節配列などの付加によって修飾してもよい。また、プロモーターは誘導配列でもよくまたは抑制配列でもよい。更に、核酸はまた、合成された治療用物質をターゲット細胞の分泌経路に案内するシグナル配列を特に治療用遺伝子の上流に含み得る。このシグナル配列は、治療用物質の天然のシグナル配列でもよいが、また、他の任意の機能性シグナル配列でもよく、または、人工のシグナル配列でもよい。核酸はまた、合成された治療用物質を細胞の特定区画に案内するシグナル配列を含み得る。別の実施態様においては、請求の範囲に記載の組成物は更に、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレイル−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイル、−パルミトイル、−ミリストイルホスファチジルエタノールアミン、並びに、１〜３回Ｎ−メチル化したそれらの誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシド）、スフィンゴリピド(特にスフィンゴミエリン)またはアシアロガングリオシド(特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２)のような種類のアジュバントを含み得る。極めて最近になって出願人は、核酸の縮合のレベルに直接または間接に関与する化合物をトランスフェクション用組成物中でアジュバントとして使用するのが特に有利であることを知見した。この化合物はその全部または一部が、ペプチドモチーフ（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）及び／または（ＡＴＰＡＫＫＡＡ）から構成され、モチーフの数は２〜１０の範囲の種々の値でよい。このような物質はまた、ヒストン、ヌクレオリン、プロタミンの全部または一部及び／またはそれらの誘導体の１つに由来してもよい（国際特許ＷＯ９６／２５５０８）。このようなアジュバントは、請求の範囲に記載の組成物中の組換えウイルスの細胞内輸送を改善するために利用できる。本発明の組成物はまた、ウイルス性または非ウイルス性のベクターを細胞表面のレセプターまたはリガンドに案内し得る１つまたは複数のターゲッティング要素を含み得る。例えば本発明の組成物が、細胞表面分子に対する１つまたは複数の抗体を含んでもよく、または、インスリン、トランスフェリン、葉酸または他の任意の成長因子、サイトカインまたはビタミンのような膜レセプターに対する１つまたは複数のリガンドを含んでもよい。好ましくは組成物が、細胞表面または近隣の細胞外マトリックスの特定多糖類をターゲッティングするために修飾または非修飾のレクチンを使用し得る。従って、モチーフＲＧＤをもつタンパク質、一対のモチーフＲＧＤを含む環状または非環状のペプチド、及び、ポリリシンペプチドを使用し得る。これらのターゲッティング物質は、組換えウイルス及び／または非ウイルス性トランスフェクションベクターに結合し得る。投与に使用されるウイルスの用量は種々のパラメーター、特に、使用される投与形態、関連する疾病、あるいは、所望の治療期間などに応じて調節され得る。一般的には、本発明の組換えウイルスが１０４〜１０１４ｐｆｕの用量となるように配合し投与する。ｐｆｕ（“プラーク形成単位”）なる用語は、ビリオン懸濁液の感染能に相当し、適当な細胞培養物を感染させ通常は４８時間後に感染細胞のプラークの数を測定することによって決定する。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の決定方法は文献にも十分に記載されている。組合せ組成物に使用される非ウイルス性トランスフェクションベクターの量に関して考察すると、この量は勿論、ベクターの種類、組合せるウイルスベクターの種類、ターゲット細胞の型に従って調節される。一般的に、ｉｎｖｉｔｒｏでは５０ｎｇ〜１μｇの範囲の量を使用する。ｅｘｖｉｖｏに使用するときは、組合せるウイルス性トランスフェクションベクターの量を、トランスフェクトされる組織細胞の量及び型に従って調節する。この量は６０ｎｇ／ｍｌ〜５００ μｇ／ｍｌの範囲である。本発明の組合せ組成物はまた、外用、皮内、経口、経直腸、膣内、非経口、鼻孔内、静注、筋肉内、皮下、眼内、経皮、などの経路で投与される剤形に調製され得る。好ましくは本発明の組合せ医薬組成物は、特に所望器官の処に直接注射するためまたは（皮膚及び／または粘膜に）局所投与するための医薬として許容される注射剤用ビヒクルを含有している。ビヒクルは特に、等張性の無菌の溶液であるか、または、必要に応じて滅菌水もしくは生理的血清を添加して注射液を形成し得る乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物である。注射に使用される核酸の用量及び投与回数は種々のパラメーター、特に使用される投与形態、対象となる疾病、発現させるべき遺伝子、あるいは、所望の治療期間に従って調節し得る。特に投与形態に関しては、組織または循環経路への直接注射でもよく、培養細胞を処理し次いで注射または移植によってｉｎｖｉｖｏに再挿入してもよい。従って、本発明は更に、ｅｘｖｉｖｏで使用するために本発明の組成物によって処理された細胞に関する。本発明を以下の実施例及び図面に基づいてより十分に説明する。これらの実施例及び図面は本発明の非限定実施例であることを理解されたい。図面の簡単な説明図１は、ＶＳＭＣ細胞に対するＡｄ−βｇａｌの形質導入効率に対するリポフェクトアミンの効果を示す。図２は、リポフェクトアミンの存在下及び非存在下のＡｄ−ｌｕｃの形質導入効率の比較を示す。図３は、０．１２５μｇのリポフェクトアミンの存在下及び非存在下でＡｄ− Ｔｋによって形質導入しＧＣＶによって処理したＣＭＶ細胞のクリスタルバイオレットによる検出を示す。図４は、リポフェクトアミンを用量０〜０．５μｇ（図４Ａ）及び１〜１０μ ｇ（図４Ｂ）の範囲で使用したときのＦＣＳまたはＡＨＳ培地中のＡｄ−ｌｕｃの中和に対するリポフェクトアミンの効果を示す。図５は、アデノウイルス単独使用（Ｉ）またはＣＬＡＡＴ使用（ＩＩ）の場合のＧａｘタンパク質の超発現による平滑筋細胞の増殖阻害を示す。図６は、漸増用量のリポフェクトアミンと組合せたときの単離動脈に対するアデノウイルスのｅｘｖｉｖｏトランスフェクションを示す。材料及び方法血管平滑筋細胞の初代培養物の形質導入における組換えアデノウイルスとカチオン性リポソームとの相乗効果を証明するために以下に記載の種々の方法を使用した。Ａ−血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の初代培養ＶＳＭＣは、Ｃｈａｍｌｅｙらの応用方法（ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ．１９７，５０３−５２２）に従ってウサギの大動脈を酵素消化し、次いで初代培養することによって得られる。このために、ウサギの大動脈を摘出し、コラゲナーゼ（ＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＩ，ＣｏｏｐｅｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）の存在下で３７℃で４５分間インキュベートする。第二の消化物はコラゲナーゼ及びエラスターゼ（Ｂｉｏｓｙｓ）の存在下で３７℃で２時間処理する。これらの２つの消化物から、実質的にＶＳＭＣから成る細胞懸濁液が得られる。ＶＳＭＣを、２０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養し、１０回目の継代が生じる前に全実験に使用する。各継代毎に、平滑筋細胞特異的アルファ−アクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いた免疫蛍光によってＶＳＭＣの表現型のタイピングを行う。Ｂ−組換えアデノウイルス（Ａｄ）ＶＳＭＣに種々の形質導入を行うために種々の組換えアデノウイルスを使用する。使用した組換えＡｄはいずれも第一世代であり、領域Ｅ１の欠失による複製欠陥がある。Ａｄ−ｌｕｃは、ルシフェラーゼ遺伝子をＣＭＶプロモーターのコントロール下に含む発現カセットを担持している。この発現カセットは、市販のプラスミドｐＵＴ６５０（Ｃａｙｌａ，ＴｏｕｌｏｕｓｅＦｒａｎｃｅ）に由来し、ｚｅｏ耐性遺伝子に融合したルシフェラーゼ遺伝子をＣＭＶプロモーターのコントロール下に含む。発現カセットをアデノウイルスＩｎ３４０の領域Ｅ１に挿入した（Ｆｅｌｄｍａｎら，“アデノウイルスベクターのビヒクルとしてポロキサマー４０７を使用することによる動脈遺伝子導入効率の改善（Ｉｍｐｒｏｖｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆａｒｔｅｒｉａｌｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｂｙｕｓｅｏｆｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７ａｓａｖｅｈｉｃｌｅｆｏｒａｄｅｎｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ）”，ＧｅｎｅＴｈｅｒ，１９９７．４：１８０−９８；Ｒｏｂｅｒｔ，ＪＪら，ＧｅｎｅＮｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，Ｖｏｌ６８，ｐｐ２１５２−２１６０；Ｈｅａｒｉｎｇら，１９８３，Ｃｅｌｌ３３ｐ．６９５−７０３）。Ａｄ−βＧａｌは、ＬＴＲ−ＲＳＶプロモーターのコントロール下のＳＶ４０ウイルスのＴ抗原の配列に等しい核局在配列（ＮＬＳ）にＮ末端部で融合した大腸菌のβ−ガラクトシダーゼの遺伝子をコードするカセットを含む（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，“マウス骨格筋及び心臓に対する広範囲及び長期間の遺伝子導入（Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｔｏｍｏｕｓｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓａｎｄｈｅａｒｔ）”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９２．９０：６２６−６３０）。Ａｄ−ｔｋはＬＴＲ−ＲＳＶのコントロール下の単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの遺伝子をコードしている（Ｍａｒｏｎら，“単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のアデノウイルス介在導入を用いるラット神経膠腫の遺伝子治療：核磁気共鳴造影による長期間追跡（ＧｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｏｆｒａｔＣ６ｇｌｉｏｍａｕｓｉｎｇａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｔｈｅｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ：ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｆｏｌｌｏｗ−ｕｐｂｙｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ）”，ＧｅｎｅＴｈｅｒ，１９９６．３：３１５−２２）。Ｃ−単独の組換えＡｄまたはカチオン性リポソームとの複合体を形成した組換えＡｄによるＶＳＭＣの形質導入１０％のＦＣＳを含む１ｍｌのＤＭＤＭ（ＤＭＥＭ−ＦＣＳ）中、２４ウェルの培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）にウェルあたり５０，０００細胞の密度でＶＳＭＣを播種する。２０〜２４時間後、ＶＳＭＣのＤＭＥＭ−ＦＣＳを３００μｌの無血清ＤＭＥＭで置換する。次いで細胞に、組換えウイルス単独またはリポソームと複合体を形成した組換えウイルスを実験毎に異なる感染多重度（ＭＯＩ）で感染させる。このアデノウイルス調製物を室温で３０分間インキュベーション後に、所望のＭＯＩのＡｄを単独で含有しているかまたは種々の量のカチオン性リポソーム（リポフェクトアミン、Ｇｉｂｃｏ）と共に含有している１００μｌの水または燐酸塩バッファ（ＰＢＳ）の懸濁液に添加する。１００μｌのＡｄまたはＡｄ−リポフェクトアミン複合体を３００μｌのＤＭＥＭ中のＶＳＭＣに直接添加する。形質導入効率に対する中和ヒト血清（ＡＨＳ）の効果をＦＣＳとの比較によって測定する実験では、３７℃で１時間の期間後に、形質導入混合物を０．５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで置換する。感染の２４時間後、血清富化培地（１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ）の添加によって細胞増殖を誘発する。感染の７２時間後、細胞の生存率をＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）試験によって評価する。Ａｄ−ｔｋで形質導入したＶＳＭＣの場合、細胞を２５μＭのガンシクロビル（ＧＣＶ）と共に４８時間培養する。同時に、非感染細胞またはＡｄ−βＧａｌで形質導入した細胞をＧＣＶ処理対照または非処理対照として平行試験する。Ｄ−ルシフェラーゼ遺伝子をコードするアデノウイルスの単離動脈内導入過量のペンタバルビタールナトリウムで安楽死させたニュージーランド白ウサギの腹部動脈を摘出する。０．１５ｍｌの空気で膨らませたｆｏｇａｌｔｙ３Ｆのプローブを用いて動脈を研磨する。動脈を５ｍｍの断片に裁断し、長手方向に開く。各断片を１ｍｌの無血清培地中の１２ウェルプレートのウェルに配置する。採取当日に感染させる。アデノウイルス（ＡＶ_1.0ＣＭＶｌｕｃまたはＡＶ_1.0 ＣＭＶβＧａｌ、１０⁸ｐｆｕ）とリポフェクトアミンとの混合物の量をＰＢＳを用いて８０μｌ／ウェルに調節する。次いで溶液を室温で３０分間インキュベートし、１２ウェルプレートのウェルに配置された１ｍｌの無血清培地中の動脈断片に載せる。次に、断片を３７℃で１時間インキュベートし、新しい１２ウェルプレートに移し、２ｍｌの２０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中でインキュベートする。導入結果を、感染３日後のルシフェラーゼ活性の測定（ＡＶ_1.0ＣＭＶｌｕｃ）または組織化学（ＡＶ_1.0ＣＭＶβＧａｌ）によって評価する。ＡＶ_1.0ＣＭＶｌｕｃのＭＯＩの１つの値に対してリポフェクトアミンの複数の用量を試験した。Ｅ−リポソーム添加または無添加の組換えＡｄによるＶＳＭＣの形質導入効率の分析ルシフェラーゼ活性の定量Ａｄ−Ｌｕｃによって形質導入したＶＳＭＣを２００μｌのルシフェラーゼ試験用溶菌バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に採取する。１５分の溶菌期間後、キット（ルシフェラーゼアッセイキット、Ｐｒｏｍｅｇａ）及び光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて１０μｌの各サンプルのルシフェラーゼ活性を定量する。ルシフェラーゼ活性をＲＬＵ（相対的光量単位）で表す。単離した動脈に対するルシフェラーゼ活性を測定するためには、抗プロテアーゼを含む５００μｌの溶菌バッファ中で動脈断片を粉砕し、次いで撹拌下に室温で２０分間インキュベートする必要がある。次に、１０，０００回転で５分間遠心する。５０μｌの基質の存在下の１０μｌの抽出物に対して１０秒間の読取りを行う。細胞抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性の定量Ａｄ−βＧａｌで形質導入されたＶＳＭＣのβ−ガラクトシダーゼ活性を、Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．のＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｔｈｔｐｌｕｓキットを用いて蛍光によって定量する。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．８）及び０．２％のトリトンＸ−１００を含む２５０μｌの溶菌バッファに収集する。溶菌液を１０，０００ｇで２分間遠心し、次いで５μｌの各サンプルを５０μｌのＧａｌｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ（登録商標）反応バッファに混合し、室温で１時間インキュベートする。発光を測定するために、混合物を光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）に入れ、次いで５０μｌの促進剤（ＬｉｇｈｔＥｍｉｓｓｉｏｎＡｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）を加え、発光を測定してＲＬＵで表す。細胞中のβ−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検出培養支持体に維持させるかまたはトリプシン処理によって支持体から分離させたＶＳＭＣをＰＢＳで洗浄し、次いで４％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で保存する。１０分後に保存液を除去し、次いで細胞を４ｍＭのフェリシアン化カリウム、４ｍＭのフェロシアン化カリウム、２００ｍＭの塩化マグネシウム及び０．４ｍｇ／ｍｌのＸ −Ｇａｌ基質を含むＰＢＳ中で３７℃で１〜４時間染色する。懸濁液の形態のＶＳＭＣ調製物については青色細胞のパーセンテージを計算し、培養支持体上の染色ＶＳＭＣについては写真撮影する。組織切片のβ−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検出感染３日後に組織断片（動脈）を４％ＰＢＳ−Ｆｏｒｍｏｌ中で３時間保存する。次いで以下の手順で洗浄し処理する。ＰＢＳ３×２０分ＰＢＳ−ＭｇＣｌ₂ ３０分ＰＢＳ−ＭｇＣｌ₂ ４℃で３０分透過溶液４℃で３０分（２ｍＭのＰＢＳ−ＭｇＣｌ₂、０．０１％のデオキシコール酸ナトリウム及び０．０２％のＮＰ４０）染色溶液３７℃で４〜２２時間（透過溶液＋３５ｍＭのＫ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆３Ｈ₂Ｏ及び３５ｍＭのＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆）。次に、ＰＢＳで洗浄し、次いでカセットに入れて、以下の手順で脱水する。６０％エタノール１時間８０％エタノール１時間１００％エタノール１時間１００％エタノール１時間１００％エタノール１時間キシレン１時間キシレン１時間キシレン１時間キシレン２時間パラフィン２時間パラフィン３時間断片を次にパラフィンに封入し、ミクロトームによって切断する。クリスタルバイオレット染色による細胞生存率の測定Ａｄ−ｔｋによる形質導入の効率を評価するために、ＶＳＭＣを前述のようにＧＣＶで処理する。この処理後に得られた生存細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で保存する。１５分後に保存液を除去し、次いで細胞を“クリスタルバイオレット”の０．１％水溶液中で２０分間染色する。染色後、細胞を３回水洗し、写真撮影する。実施例１この実施例は、Ａｄ−βｇａｌをリポフェクトアミンのようなカチオン性リポソームに組合せたときのＶＳＭＣの形質導入の増進を示す。材料と方法の項に記載のプロトコルに従って、０〜０．５μｇの範囲で漸増する用量のリポフェクトアミンの存在下でＭＯＩ１０のＡｄ−βｇａｌをＶＳＭＣに形質導入する。β−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検出によれば、リポフェクトアミンの用量が０．１２５μｇ以上になるとＡｄ−βｇａｌによるＶＳＭＣの形質導入効率が極めて顕著に増加することが明らかである。形質導入効率のこのような増加を定量するために、材料及び方法の項に記載のプロトコルに従って懸濁液中の細胞を組織化学的に染色し、β−ガラクトシダーゼ活性が陽性を示す細胞のパーセンテージを測定する。図１はこれらの結果を示す。ＭＯＩ１０のＡｄ−βｇａｌを単独使用した場合、陽性のＶＳＭＣは僅か１〜２％にすぎないが、リポフェクトアミンを添加した場合、０．１２５μｇ以上のリポフェクトアミン用量で陽性細胞が４０％以上になる。この形質導入効率は化学発光によって測定された β−ガラクトシダーゼ活性に完全に相関する（図１）。しかしながら、リポフェクトアミン用量を増加させるとこの活性が若干減少することが観察される。細胞カウント数から判断してこの減少の原因は軽度の毒性にあると考えられる（図１、点線グラフ）。しかしながらこの毒性はリポフェクトアミンが最大用量０．５ μｇのときにのみ出現し、２５％以上の細胞には影響を与えない。これらの結果は、Ａｄ−βｇａｌとカチオン性リポフェクトアミンとの組合せによる形質導入の改善をはっきりと示す。実施例２実施例２では、ＭＯＩ１０のＡｄ−βｇａｌのＶＳＭＣに対する形質導入を増進させ得るリポフェクトアミンの用量を決定した。このために、種々の値のＭＯＩでＡｄ−ＬｕｃをＶＳＭＣに形質導入し、次いで、材料及び方法の項に記載の手順でルシフェラーゼ活性を定量する。ルシフェラーゼ活性は、ＶＳＭＣの形質導入に使用したＡｄ−ＬｕｃのＭＯＩの値の関数としてほぼ直線状に増加する（図２、白丸）。Ａｄ−Ｌｕｃに０．１２５μｇのリポフェクトアミンを添加したとき、使用したＭＯＩの値に関わりなく、誘発されたルシフェラーゼ活性が１００倍の増加を示すことに注目されたい（図２、黒菱形）。これは、ＭＯＩ１００以下でＡｄ−Ｌｕｃを使用した場合、０．１２５μｇという少量のリポフェクトアミンがＶＳＭＣの形質導入に極めて顕著な相乗効果を十分に発揮することを示す。実施例３この実施例で使用したアデノウイルスはアデノウイルスＡｄ−ＴＫであり、ガンシクロビル（ＧＣＶ）の存在下の単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子の細胞障害性を利用する。材料及び方法の項に記載の手順で、それぞれＭＯＩ１、１０及び１００のＡｄ−ＴＫをＶＳＭＣに形質導入し、ＧＣＶで処理した。ＭＯＩ１００のＡｄ−βｇａｌを対照として使用する。Ａｄ−ＴＫ及びＡＤ−βｇａｌを単独で使用するかまたは０．１２５μｇのリポフェクトアミンとの複合体として使用する。図３は形質導入しＧＣＶで処理したＶＳＭＣのクリスタルバイオレットによる染色を示す。予測通り、ＧＣＶはリポフェクトアミンの存在下でも非存在下でもＡｄ−βｇａｌによって形質導入された細胞に対して全く毒性を有していない。Ａｄ−ＴＫをＶＳＭＣに形質導入し、次いでＧＣＶで処理したとき、ＭＯＩが最高値、即ち１００のときにのみ毒性が検出される（生存率３０〜５０％）。０．１２５μｇのリポフェクトアミンと複合させたＭＯＩ１のＡｄ−ＴＫのＧＣＶ処理後の形質導入効率はＭＯＩ１００のＡｄ−ＴＫ単独で得られた効率にほぼ等しいことに注目されたい。ＭＯＩ１０または１００のＡｄ−ＴＫはリポフェクトアミンと組合せたときにもＧＣＶの存在下で高度に毒性である。この実施例は、本発明の配合製剤の利点を証明する。本発明の配合製剤を用いると、投与すべき組換えＡｄ−ＴＫウイルスの用量をかなり少なくすることができ、しかもＡｄ−ＴＫ単独で観察された治療効率に比べても同等またはそれ以上の治療効率が得られる。実施例４形質導入効率が改善されることは先行の実施例で示した。それ以外に、組換えアデノウイルスの最適効率に対する主要な障害の１つとして免疫系による中和がある。実際、動物体内への最初の導入後の細胞溶解、または、ヒト体内のアデノウイルスとの最初の接触が生じると、免疫系は血流中のウイルスを効率的に中和して、ウイルスの再注入の可能性を低下させる。この実施例はヒト血清プールによる組換えアデノウイルスの中和をｉｎｖｉｔｒｏで再現し、組換えアデノウイルスとリポソームとの組合せが中和を有利に阻止し、更にリポソームの用量次第ではウイルス単独の場合よりも高い効率で形質導入が生じることを示す。図４Ａ及びＢは、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）または成人血清（ＡＨＳ）の存在下のＤＭＥＭ培養培地中のＭＯＩ１００のＡｄ−Ｌｕｃを形質導入したＶＳＭＣを使用した試験の結果を示している。ＤＭＥＭを基準として、１０％のＦＣＳの存在下ではＡｄ−Ｌｕｃ単独による形質導入効率は有意に変化しないが、１０％ＡＨＳの存在下ではルシフェラーゼ活性が極度に減少する。漸増量のリポフェクトアミンをＡｄ−Ｌｕｃに添加するとルシフェラーゼ活性が回復し、リポフェクトアミンが最大用量まで増加するに伴って、ウイルス単独で観察された値に等価のルシフェラーゼ活性、更にこの値を顕著に上回るルシフェラーゼ活性が観察される（図４Ｂ）。従ってこの実施例は、請求の範囲に記載の組成物が、一方では中和抗体または中和血清による組換えアデノウイルスの中和を完全になくし、他方では先行実施例に既に示したように中和血清の存在下の形質導入効率を増進することを示す。実施例５この実施例は、アデノウイルスＡＶ_1.0ＣＭＶｒＧａｘとリポフェクチンのようなカチオン性脂質との組合せ（ＣＬＡＡＴ）によって得られるウサギ平滑筋細胞に対する治療用遺伝子（ｇａｘ）の形質導入の増進を示す。１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ培地中、ウサギ平滑筋細胞をＭＷ４８のウェルあたり５×１０⁴細胞の割合で播種する。２４時間後、無血清ＤＭＥＭ培地中で感染させる。種々の希釈度のアデノウイルスを６０ｎｇのリポフェクトアミンと混合し、ＰＢＳによって最終用量２５μｌに調節する。この溶液を室温で３０分間インキュベートする。培養培地をウェルあたり１７５μｌの無血清培地で交換し、アデノウイルスとリポフェクトアミンとの混合物を細胞に添加する。感染を３７℃で１時間継続する。ウイルス含有培地を０．５％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭで交換する。感染２４時間後、血清富化培地（１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ）の添加によって細胞増殖を誘発する。感染７２時間後にＡｌａｍａｒＢｌｕｅテスト（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）によって細胞の生存率を測定する。結果は、ＣＬＡＡＴに必要な用量のリポフェクトアミンの単独使用が細胞生存率に有効でないことを示す。しかしながら、ＡＶ_1.0ＣＭＶｒＧａｘとリポフェクトアミンとの混合物を使用した場合のＳＭＣの５０％増殖阻害を達成するために必要なＭＯＩは、ＡＶ_1.0ＣＭＶｒＧａｘ単独使用の場合の十分の一でよい。図５は、（Ｉ）アデノウイルス単独使用の場合、または、（ＩＩ）ＣＬＡＡＴ使用の場合のＧａｘタンパク質の超発現による平滑筋細胞の増殖阻害を比較する。０〜１０⁵ＶＰ／細胞に対応するＭＯＩのＡＶ_1.0ＣＭＶ（ａ）またはＡＶ_1.0ＣＭＶｒＧａｘ（ｂ）を単独で細胞に感染させる。０〜３×１０⁴ＶＰ／細胞に対応するＭＯＩの同じウイルスをＣＬＡＡＴを使用して細胞に感染させる（ＩＩのａ及びｂ）。感染後の細胞を０．５％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ培地中で２４時間インキュベートする。次に培地を血清富化培地で交換する。感染の７２時間後の細胞の生存率を測定する。従ってこの実施例は、アデノウイルスＡＶ_1.0ＣＭＶｒＧａｘとリポフェクトアミンとの組合せによって得られるウサギ平滑筋細胞に対する治療用遺伝子（ｇａｘ）の形質導入の増進を示す。この実施例はまた、カチオン性脂質とアデノウイルスとの組合せによってウイルス用量の低減が得られることを示す。実施例６この実施例は、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼをコードするアデノウイルスとリポフェクトアミンとの組合せ（ＣＬＡＡＴ）を用いた単離動脈断片に対する遺伝子導入を記載する。材料及び方法の項（Ｄ）に記載のプロトコルで動脈断片を採取し感染させる。細胞抽出物を調製しルシフェラーゼ活性を測定するために、動脈断片を抗プロテアーゼ含有の５００μｌの溶菌バッファ中で粉砕し、次いで撹拌下に室温で２０分間インキュベートする。次いで１０，０００ｒｐｍで５分間遠心する。キット（ルシフェラーゼアッセイキット、Ｐｒｏｍｅｇａ）と光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）とを用いて５０μｌの基質の存在下の１０μｌの抽出物を１０秒間読取る。図６に示す結果から、一方でルシフェラーゼ活性が顕著に増加するという結論、他方でＣＬＡＡＴを用いて単離動脈にアデノウイルスを導入したときのルシフェラーゼ活性はリポフェクトアミンの使用量に依存するという結論が得られる。 β−ガラクトシダーゼ活性の検出は材料及び方法の項（Ｅ）に記載の手順で行う。得られた組織化学的結果は、ＣＬＡＡＴを用いて単離動脈に導入したときに β−ガラクトシダーゼを発現する細胞は線維芽細胞型の外膜細胞であることを示す。更に、導入された細胞の数は同じＭＯＩのアデノウイルス単独で得られた数よりも多いと考えられる。この実施例は、ＣＬＡＡＴを使用する単離動脈に対する遺伝子導入が可能であることを示す。更に、ｅｘｖｉｖｏで使用されたこの技術は、一方では遺伝子導入を改善し、他方では外膜細胞を得ることを可能にする。この技術の望ましい用途は、アデノウイルスベクターによって担持されたＦＧＦ因子のような有益な遺伝子を用いる静脈移植治療である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１２月２２日（１９９８．１２．２２）【補正内容】請求の範囲１．少なくとも１つの外来核酸をそのゲノムに含む１つまたは複数のエンベロープのない組換えウイルスと非ウイルス性非プラスミド性の少なくとも１つのトランスフェクション用物質との組合せから成ることを特徴とする遺伝子治療に有用なトランスフェクション用組成物。２．非ウイルス性トランスフェクション用物質がカチオン性ポリマー及びリポフェクタントから選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。３．非ウイルス性トランスフェクション用物質がリポフェクタントであることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。４．リポソーム、易溶性リポソーム、イムノリポソームまたはターゲット化リポソームを形成し得る脂質であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。５．一般式：〔式中、ｍは２以上の整数を表し、ｎは１以上の整数を表し、ｍは２つのアミン間に含まれる種々の炭素基次第で異なる値を有し得る〕で示される少なくとも１つのポリアミン領域を有しており、前記ポリアミン領域が、コレステロールの飽和または不飽和の炭化水素鎖型の親油性領域または層状もしくは六角形の相を形成し得る天然もしくは合成の脂質に共有結合的に会合し得るリポフェクタントであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。６．ポリアミン領域が、スペルミン、テルミンまたはその核酸結合特性を保存しているそれらの類似体の１つによって表されることを特徴とする請求項５に記載の組成物。７．一般式：〔式中、Ｒは、一般式：によって表され、式中の、Ｘ及びＸ’は互いに独立に、酸素原子、メチレン基−（ＣＨ₂）_q−｛ｑは０、１、２または３に等しい｝、または、アミノ基−ＮＨ−もしくは−ＮＲ’−｛Ｒ ’はＣ₁〜Ｃ₄のアルキル基｝を表し、Ｙ及びＹ’は互いに独立に、メチレン基、カルボニル基、または基Ｃ＝Ｓを表し、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅は互いに独立に、水素原子、置換もしくは未置換のＣ₁〜Ｃ₄ のアルキル基を表し、ｐは、０〜５の範囲であり、Ｒ₆は、コレステロール誘導体またはアルキルアミノ基−ＮＲ₁Ｒ₂｛Ｒ₁及びＲ₂ は互いに独立に、飽和または不飽和の直鎖状または分枝状のＣ₁₂〜Ｃ₂₂の脂肪族基｝を表す〕のリポフェクタントであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。８．一般式：〔式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は互いに独立に、水素原子または基−（ＣＨ₂）_q−ＮＲＲ’｛ｑは１、２、３、４、５または６の数を表し、基Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は独立に異なるｑの値を有し得る｝を表し、Ｒ及びＲ’は互いに独立に水素原子または基（ＣＨ₂）_q'−ＮＨ₂｛ｑ’は１、２、３、４、５または６の数を表し、基Ｒ及びＲ’は独立に異なるｑ’の値を有し得る｝を表し、ｍ、ｎ及びｐは互いに独立に０〜６の整数を表し、但し、ｎが１よりも大きいときは、ｍは種々の値を有しかつＲ₃は一般式ＩＩＩに定義された種々の意味を有することができ、Ｒ₄は一般式：で示される基を表し、式中のＲ₆及びＲ₇は互いに独立に水素原子または飽和もしくは不飽和のＣ₁₀〜Ｃ₂₂の脂肋族基を表し、但し、双方の基の少なくとも一方が水素原子でなく、ｕは０〜１０の範囲から選択された整数であり、但し、ｕが１よりも大きい整数のときは、Ｒ₅、Ｘ、Ｙ及びｒはモチーフ〔Ｘ−（ＣＨＲ₅）_r −Ｙ〕に定義された種々の意味を有することができ、Ｘは水素原子、イオウ原子または任意にモノアルキル化したアミン基を表し、Ｙはカルボニル基またはメチレン基を表し、Ｒ₅は水素原子または必要に応じて置換された天然アミノ酸側鎖を表し、ｒは１〜１０の整数を表し、但し、ｒが１のときはＲ₅は置換または未置換の天然アミノ酸側鎖を表し、ｒが１よりも大きいときはＲ₅は水素原子を表す〕のリポフェクタントであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。９．非ウイルス性トランスフェクション用物質がポリアルキレンイミンから選択されたカチオン性ポリマーであることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。１０．ポリエレンイミン（ＰＥＩ）またはポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。１１．非ウイルス性トランスフェクション用物質か好ましくは、リポフェクトアミン、平均分子量５０，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０Ｋ）、平均分子量８００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００Ｋ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、パルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）、２−５−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−ペンチル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテート、２−〔１，３−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）〕−プロピル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテート、｛Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃｝₂Ｎ（ＣＨ₂）₄Ｎ｛（ＣＨ₂）₃ＮＨ₂｝（ＣＨ₂）₃ ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₇−ＣＨ₃〕₂、Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃ＮＨ（ＣＨ₂ ）₄ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₈〕₂、Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃ ＮＨ（ＣＨ₂）４ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＡｒｇＮ〔（ＣＨ₂）₁₈〕₂及びＨ₂ Ｎ（ＣＨ₂）₃ＮＨ（ＣＨ₂）₄ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂ ）₁₇ＣＨ₃〕₂から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。１２．組換えウイルスに含まれている核酸が、デオキシリボ核酸であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。１３．組換えウイルスに含まれている核酸が、リボ核酸であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。１４．核酸が化学的に修飾されていることを特徴とする請求項１２または１３に記載の組成物。１５．核酸がアンチセンス核酸であることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の組成物。１６．核酸が治療用遺伝子を含むことを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。１７．治療用遺伝子が、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、成長因子、神経伝達物質またはそれらの前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、など、ジストロフィンまたはミニジストロフィン、ＣＦＴＲタンパク質から選択された物質をコードすることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。１８．治療用遺伝子が、細胞分裂の停止に関与する遺伝子、特にｇａｘ遺伝子、腫瘍抑制遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ、凝固関与因子をコードする遺伝子：ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビンまたはその他のタンパク質運搬体の遺伝子、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びアポ（ａ）から選択されたアポリポタンパク質型の脂質の代謝に関与するタンパク質に対応する遺伝子、リポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ、７−アルファコレステロールヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼのような代謝酵素、あるいは、コレステロールエステル転移タンパク質、リン脂質転移タンパク質のような脂質転移タンパク質、ＨＤＬ結合タンパク質、あるいは、ＬＤＬレセプター、キロミクロンレムナントレセプター及びスカベンジャーレセプターなどから選ばれるレセプターから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。１９．エンベロープのない組換えウイルスが、感染細胞中で複製されるために必要なゲノムの領域の少なくとも１つを欠損していることを特徴とする請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。２０．エンベロープのない組換えウイルスが、アデノウイルスまたはＡＡＶに由来することを特徴とする請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。２１．エンベロープのない組換えウイルスが、好ましくは動物またはヒト起原のアデノウイルスに由来することを特徴とする請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。２２．組換えウイルスが、Ａｄ５型またはＡｄ２型のアデノウイルスに由来することを特徴とする請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。２３．少なくとも１つの外来核酸をゲノムに含む組換えアデノウイルスと、細胞形質導入を改善するために十分な量のリポフェクトアミンとの組合せから成ることを特徴とする請求項１から４及び１２から２２のいずれか一項に記載の組成物。２４．更に、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイル、−パルミトイルもしくは−ミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン並びに１〜３回Ｎ−メチル化したそれらの誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシド）、スフィンゴリピド（特にスフィンゴミエリン）またはアシアロガングリオシドの種類のアジュバントを含むことを特徴とする請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。２５．核酸の縮合レベルに直接または間接に関与する化合物を更に含むことを特徴とする請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物。２６．前記化合物はその全部または一部が、ペプチドモチーフ（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）及び／または（ＡＴＰＡＫＫＡＡ）から構成され、モチーフの数は２〜１０の範囲であることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。２７．更に、前記ベクターにターゲッティング要素が結合されていることを特徴とする請求項１から２６のいずれか一項に記載の組成物。２８．前記ターゲッティング要素が、細胞表面分子に対する抗体、インスリン、トランスフェリン、葉酸または他の任意の成長因子のような膜レセプターのリガンド、サイトカインまたはビタミン、修飾または非修飾のレクチン、モチーフＲＧＤをもつタンパク質、一対のモチーフＲＧＤを含む環状または非環状のペプチド、並びに、ポリリシンペプチドから選択されることを特徴とする請求項２７に記載の組成物。２９．細胞に核酸を導入するための請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物の使用。３０．請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物を接触させることによって得られる組換え細胞。３１．請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物に細胞を接触させる処理から成る核酸の細胞内導入方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｎ 1/15 Ａ６１Ｋ 37/48 1/19 37/24 1/21 37/62 5/10 37/66 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ブラネレク，デイデイエフランス国、エフ―94210・ラ・バレンヌ・サン―テイレール、アブニユ・ドウ・セバストポル、39 (72)発明者ル・ルー，オードフランス国、エフ―94320・テイエス、アレ・シユナール・エ・バルケー、13 (72)発明者マフデイ，アブデライムフランス国、エフ―94440・マロル・アン・ブリ、リユ・デ・パストウロー、42 (72)発明者ラテ・ナタリーフランス国、エフ―75012・パリ、リユ・エリザ・ルモニエ、７

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つの外来核酸をそのゲノムに含む１つまたは複数のエンベロープのない組換えウイルスと非ウイルス性非プラスミド性の少なくとも１つのトランスフェクション用物質との組合せから成ることを特徴とする遺伝子治療に有用なトランスフェクション用組成物。２．非ウイルス性トランスフェクション用物質がカチオン性ポリマー及びリポフェクタントから選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。３．非ウイルス性トランスフェクション用物質がリポフェクタントであることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。４．リポソーム、易溶性リポソーム、イムノリポソームまたはターゲット化リポソームを形成し得る脂質であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。５．一般式：〔式中、ｍは２以上の整数を表し、ｎは１以上の整数を表し、ｍは２つのアミン間に含まれる種々の炭素基次第で異なる値を有し得る〕で示される少なくとも１つのポリアミン領域を有しており、前記ポリアミン領域が、コレステロールの飽和または不飽和の炭化水素鎖型の親油性領域または層状もしくは六角形の相を形成し得る天然もしくは合成の脂質に共有結合的に会合し得るリポフェクタントであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。６．ポリアミン領域が、スペルミン、テルミンまたはその核酸結合特性を保存しているそれらの類似体の１つによって表されることを特徴とする請求項５に記載の組成物。７．一般式：〔式中、Ｒは、一般式：によって表され、式中の、Ｘ及びＸ’は互いに独立に、酸素原子、メチレン基−（ＣＨ₂）_q−｛ｑは０、１、２または３に等しい｝、または、アミノ基−ＮＨ−もしくは−ＮＲ’−｛Ｒ ’はＣ₁〜Ｃ₄のアルキル基｝を表し、Ｙ及びＹ’は互いに独立に、メチレン基、カルボニル基、または基Ｃ＝Ｓを表し、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅は互いに独立に、水素原子、置換もしくは未置換のＣ₁〜Ｃ₄ のアルキル基を表し、ｐは、０〜５の範囲であり、Ｒ₆は、コレステロール誘導体またはアルキルアミノ基−ＮＲ₁Ｒ₂｛Ｒ₁及びＲ₂ は互いに独立に、飽和または不飽和の直鎖状または分枝状のＣ₁₂〜Ｃ₂₂の脂肪族基｝を表す〕のリポフェクタントであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。８．一般式：〔式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は互いに独立に、水素原子または基−（ＣＨ₂）_q−ＮＲＲ’｛ｑは１、２、３、４、５または６の数を表し、基Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は独立に異なるｑの値を有し得る｝を表し、Ｒ及びＲ’は互いに独立に水素原子または基（ＣＨ₂）_q'−ＮＨ₂｛ｑ’は１、２、３、４、５または６の数を表し、基Ｒ及びＲ’は独立に異なるｑ’の値を有し得る｝を表し、ｍ、ｎ及びｐは互いに独立に０〜６の整数を表し、但し、ｎが１よりも大きいときは、ｍは種々の値を有しかつＲ₃は一般式ＩＩＩに定義された種々の意味を有することができ、Ｒ₄は一般式：で示される基を表し、式中のＲ₆及びＲ₆は互いに独立に水素原子または飽和もしくは不飽和のＣ₁₀〜Ｃ₂₂の脂肪族基を表し、但し、双方の基の少なくとも一方が水素原子でなく、ｕは０〜１０の範囲から選択された整数であり、但し、ｕが１よりも大きい整数のときは、Ｒ₅、Ｘ、Ｙ及びｒはモチーフ〔Ｘ−（ＣＨＲ₅）_r −Ｙ〕に定義された種々の意味を有することができ、Ｘは水素原子、イオウ原子または任意にモノアルキル化したアミン基を表し、Ｙはカルボニル基またはメチレン基を表し、Ｒ₅は水素原子または必要に応じて置換された天然アミノ酸側鎖を表し、ｒは１〜１０の整数を表し、但し、ｒが１のときはＲ₅は置換または未置換の天然アミノ酸側鎖を表し、ｒが１よりも大きいときはＲ₅は水素原子を表す〕のリポフェクタントであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。９．非ウイルス性トランスフェクション用物質がポリアルキレンイミンから選択されたカチオン性ポリマーであることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。１０．ポリエレンイミン（ＰＥＩ）またはポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。１１．非ウイルス性トランスフェクション用物質が好ましくは、リポフェクトアミン、平均分子量５０，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０Ｋ）、平均分子量８００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００Ｋ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、パルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）、２−５−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−ペンチル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテート、２−〔１，３−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）〕−プロピル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテート、｛Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃｝₂Ｎ（ＣＨ₂）₄Ｎ｛（ＣＨ₂）₃ＮＨ₂｝（ＣＨ₂）₃ ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₇−ＣＨ₃〕₂、Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃ＮＨ（ＣＨ₂ ）₄ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₈〕₂、Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃ ＮＨ（ＣＨ₂）₄ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＡｒｇＮ〔（ＣＨ₂）₁₈〕₂及びＨ₂ Ｎ（ＣＨ₂）₃ＮＨ（ＣＨ₂）₄ＮＨ（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＨ₂ＣＯＧｌｙＮ〔（ＣＨ₂）₁₇ ＣＨ₃〕₂から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。１２．組換えウイルスに含まれている核酸が、デオキシリボ核酸であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。１３．組換えウイルスに含まれている核酸が、リボ核酸であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。１４．核酸が化学的に修飾されていることを特徴とする請求項１２または１３に記載の組成物。１５．核酸がアンチセンス核酸であることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の組成物。１６．核酸が治療用遺伝子を含むことを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。１７．治療用遺伝子が、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、成長因子、神経伝達物質またはそれらの前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、など、ジストロフィンまたはミニジストロフィン、ＣＦＴＲタンパク質から選択された物質をコードすることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。１８．治療用遺伝子が、細胞分裂の停止に関与する遺伝子、特にｇａｘ遺伝子、腫瘍抑制遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ、凝固関与因子をコードする遺伝子：ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビンまたはその他のタンパク質運搬体の遺伝子、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びアポ（ａ）から選択されたアポリポタンパク質型の脂質の代謝に関与するタンパク質に対応する遺伝子、リポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ、７−アルファコレステロールヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼのような代謝酵素、あるいは、コレステロールエステル転移タンパク質、リン脂質転移タンパク質のような脂質転移タンパク質、ＨＤＬ結合タンパク質、あるいは、ＬＤＬレセプター、キロミクロンレムナントレセプター及びスカベンジャーレセプターなどから選ばれるレセプターから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。１９．エンベロープのない組換えウイルスが、感染細胞中で複製されるために必要なゲノムの領域の少なくとも１つを欠損していることを特徴とする請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。２０．エンベロープのない組換えウイルスが、アデノウイルスまたはＡＡＶに由来することを特徴とする請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。２１．エンベロープのない組換えウイルスが、好ましくは動物またはヒト起原のアデノウイルスに由来することを特徴とする請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。２２．組換えウイルスが、Ａｄ５型またはＡｄ２型のアデノウイルスに由来することを特徴とする請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。２３．少なくとも１つの外来核酸をゲノムに含む組換えアデノウイルスと、細胞形質導入を改善するために十分な量のリポフェクトアミンとの組合せから成ることを特徴とする請求項１から４及び１２から２２のいずれか一項に記載の組成物。２４．更に、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイル、−パルミトイルもしくは−ミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン並びに１〜３回Ｎ−メチル化したそれらの誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシド）、スフィンゴリピド（特にスフィンゴミエリン）またはアシアロガングリオシドの種類のアジュバントを含むことを特徴とする請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。２５．核酸の縮合レベルに直接または間接に関与する化合物を更に含むことを特徴とする請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物。２６．前記化合物はその全部または一部が、ペプチドモチーフ（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）及び／または（ＡＴＰＡＫＫＡＡ）から構成され、モチーフの数は２〜１０の範囲であることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。２７．更に、前記ベクターにターゲッティング要素が結合されていることを特徴とする請求項１から２６のいずれか一項に記載の組成物。２８．前記ターゲッティング要素が、細胞表面分子に対する抗体、インスリン、トランスフェリン、葉酸または他の任意の成長因子のような膜レセプターのリガンド、サイトカインまたはビタミン、修飾または非修飾のレクチン、モチーフＲＧＤをもつタンパク質、一対のモチーフＲＧＤを含む環状または非環状のペプチド、並びに、ポリリシンペプチドから選択されることを特徴とする請求項２７に記載の組成物。２９．外来核酸が形質導入によって細胞のゲノムに挿入されることを特徴とする請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物。３０．生体外使用されることを特徴とする請求項１から２９のいずれか一項に記載の組成物によって処理された細胞。