JPH11512704A - 核酸のトランスフェクションに有用な医薬組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸のトランスフェクションに有用な医薬組成物であって、前記核酸と少なくとも１つのトランスフェクション因子とに加えて、ＤＮＡ結合特性とＤＮＡを核内に運搬する能力とを併せて有している少なくとも１つの化合物を含んでいることを特徴とする医薬組成物に関する。この化合物は好ましくはＨＭＧ（“Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ”）タンパク質のファミリーに属している。本発明は更に、核酸の試験管内、生体外及び／または生体内導入を目的とする前記組成物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸のトランスフェクションに有用な医薬組成物及びその使用 本発明は遺伝子治療の分野に関する。より特定的には本発明は遺伝物質の試験 管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）及び／または生体内（ｉ ｎ ｖｉｖｏ）導入に関する。本発明は特に、細胞に対するトランスフェクショ ンを効率よく行うために有用な新規な医薬組成物を提案する。本発明はまたこの 組成物の使用に関する。 染色体の欠陥及び／または異常（突然変異、異常発現など）は遺伝性または非 遺伝性の多くの疾病の原因である。従来の医学は長い間このような疾病に対して 無力であった。現在では遺伝子治療の発達に伴って、この種の染色体異常の矯正 または予防を今後に期待できるようになった。この新しい治療方法は、病気に冒 された細胞または器官に遺伝情報を導入することによって、染色体の欠陥もしく は異常を矯正するかまたはこれらの細胞もしくは器官の内部で有益な治療用タン パク質を発現させる方法である。 標的となる細胞または器官に核酸が侵入するときの主な障害は、核酸の細胞膜 通過を妨げる核酸の大きさ及び核酸のポリア ニオン性である。 この障害を解決するために今日では種々の技術が提案されており、特に重要な 技術としては、細胞膜を生体内通過するヌードＤＮＡを用いるトランスフェクシ ョン（国際特許第９０／１１０９２号）、及びトランスフェクションベクターを 用いてＤＮＡを導入するトランスフェクションがある。 ヌードＤＮＡのトランスフェクションの場合、その効率はまだ極めて低い。ヌ ード核酸は酵素によって分解され尿路から排泄されるので血漿中の半減期が極め て短いからである。 第二の技術に関しては、主として２種類の計画が提案されている。 第一の計画では、ウイルスから成る天然のトランスフェクションベクターを用 いる。ベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス 及びより最近にはアデノ関連ウイルスの使用が提案されている。これらのベクタ ーはトランスフェクションという面では十分な成果を与えることができるが、残 念ながらウイルスであることに固有のいくつかの危険性、例えば、病原性、複製 及び／または免疫原性のような危険性をこれらのベクターから完全に排除するこ とができない。 より有利な第二の計画では、真核生物細胞内へのＤＮＡの導入及び真核生物細 胞内でのＤＮＡの発現を促進する能力を有している非ウイルス性物質を使用する 。 本発明の目的は特にこの第二の計画に含まれる。 化学的または生化学的ベクターは、特に免疫応答及び／またはウイルス組換え が存在しないので、天然ウイルスよりも有利な代替手段となり得る。化学的また は生化学的ベクターには病原性能力がなく、これらのベクターの内部でＤＮＡが 複製される危険がなく、また、トランスフェクトすべきＤＮＡの大きさに関して も理論的な制約は全く存在しない。 これらの合成ベクターは、２つの主要な機能、即ち、トランスフェクトすべき ＤＮＡとの複合体を形成する機能と、該ＤＮＡの細胞結合及び細胞膜透過場合に よっては核の二重膜透過を促進する機能とを有している。 また、ＤＮＡは、ポリアニオン性であるため、細胞の同じくポリアニオン性の 細胞膜に対する親和性を必然的に全く有していない。この欠点を解消するために 、非ウイルス性ベクターのほぼすべてがポリカチオン性電荷を有している。 開発された合成ベクターのうちでは、ポリリシン及びＤＥＡＥ デキストラン型のカチオン性ポリマー、または、カチオン性脂質もしくはリポフ ェクタントが最も有利である。これらのベクターはＤＮＡとの複合体を形成しＤ ＮＡの細胞膜結合を促進する特性を有している。より最近になって、レセプター に媒介されるターゲット化トランスフェクションの構想が開発された。この技術 は、カチオン性ポリマーがＤＮＡとの複合体を形成するという原理を利用し、同 時に導入の対象である細胞類型の表面に存在する膜レセプターのリガンドとカチ オン性ポリマーとの化学結合を援用して複合体を膜に結合させるものである。し たがって、トランスフェリン、インシュリンに対するレセプターまたは肝細胞の アシアログリコプロテインのレセプターのターゲット化も述べられる。 しかしながら、今日までに提案された合成ベクターはウイルスベクターと同じ 成果には遠く及ばない。その理由は特に、トランスフェクトすべきＤＮＡの複合 体形成が十分でないこと、及び／または、トランスフェクトされたＤＮＡがエン ドソームから出て細胞核に入るのが難しいことにある。実際、核膜孔の寸法は分 子量６０，０００Ｄａ未満のタンパク質だけを通過させ得る大きさであるため、 休止中の真核生物細胞の核にＤＮＡ を導入することは明らかに難しい問題である（Ｉ．Ｄａｖｉｓら，Ａｎｎ．Ｒｅ ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５；６４；８６５−８９６）。従って必然的に、１ ０⁶を上回る分子量を有しているプラスミドＤＮＡは単なる拡散によって細胞核 に侵入することは勿論できない。 本発明の目的はまさに上記のような問題に対する有利な解決方法を提案するこ とである。 より正確には本発明は、少なくとも１つの核酸のトランスフェクションに有用 な医薬組成物であって、上記核酸と少なくとも１つのトランスフェクション因子 とに加えて、ＤＮＡ結合特性と該ＤＮＡを核に運搬する能力とを併せて有してい る少なくとも１つの化合物を含んでいることを特徴とする医薬組成物を提案する 。 本発明において、ＤＮＡ結合特性を有している化合物という表現は、運搬すべ きＤＮＡに少なくとも部分的に結合し得る任意の化合物を意味する。本発明にお いて特に、化合物のＤＮＡ運搬適性という表現は、種々の細胞膜及び／または核 膜を経由して有効に誘導され治療すべき細胞の核の内部に到達したＤＮＡの効率 を意味する。本発明の化合物はまた、ＤＮＡ結合ドメイ ンと核に取込まれるドメインとを組合せたキメラ分子の形態を有していてもよい 。この特定の場合のＤＮＡ結合ドメインとしては、例えば特異的配列に結合し得 る調節タンパク質に由来のドメイン、または逆に、ＤＮＡに対して配列非依存的 な親和性を有することが判っているタンパク質に由来のドメインを選択し得る。 核に取込まれるドメインに関して詳細に考察すると、このドメインは例えばｎｌ ｓ（nuclear localization sequence,核局在配列）と呼ばれる配列によって表さ れる。このような配列は、ヌクレオプラスミンに由来の２分節（bipartite）コ ンセンサスまたはＳＶ４０のＴ抗原のコンセンサスに類似しているか、あるいは 、これらのコンセンサスから誘導され得る。 特定実施態様によれば、本発明は、少なくとも１つの核酸のトランスフェクシ ョンに有用な医薬組成物であって、前記核酸と少なくとも１つのトランスフェク ション因子とに加えて、ＨＭＧのファミリーに属する少なくとも１つの化合物ま たはその誘導体の１つを含むことを特徴とする医薬組成物に関する。 “Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ”を表すＨＭＧ型のタンパク質は 荷電アミノ酸に富み３０，０００Ｄａ未満の分子量を有するタンパク質である。 この型のタンパク質は、２ 〜５％の過塩素酸に可溶性なので、従来は０．３５ＭのＮａＣｌによってクロマ チンから抽出されている。 従来からＨＭＧタンパク質は３つのファミリー、即ち分子量約２５，０００の ＨＭＧ１／２型と、分子量約１０〜１２，０００のＨＭＧ１４／１７型と、ＨＭ Ｇ１４／１７型のタンパク質に近い組成を有しているが個体発生過程の組織内分 布が違っているＨＭＧＩ／Ｙ型とに分類されている。これらの３つのファミリー の各々の内部では進化過程でタンパク質の一次配列が保存されていることが判明 している。 特にＨＭＧ１／２ファミリーのタンパク質に関して考察すると、このファミリ ーのタンパク質の特徴は、塩基優性（正味電荷＋２０）の８０個のアミノ酸から 成る“ＨＭＧボックス”と呼ばれる配列が存在し、この配列がＤＮＡ結合ドメイ ンを構成していることである。このファミリーのタンパク質は、二重鎖ＤＮＡの 特異的配列に結合し得るタンパク質と、ＤＮＡの特定三次元構造に結合特異性を 有しているタンパク質とに分類できる。第一類のタンパク質としては、特異的遺 伝子の転写を増進するタンパク質ＵＢＦ、ＳＲＹ、ＴＣＦ１、ＡＢＦ２が見出さ れている（Ｇｒｅｉｓｓ Ｅ．Ａ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ． （１９９３）３７：２０４−２１０）。これらの各タンパク質の配列は１つまた は複数の“ＨＭＧボックス”を含んでいる。第二類のタンパク質はタンパク質Ｈ ＭＧ１及びＨＭＧ２によって代表される。これらのタンパク質の一次配列の特徴 は、２つの“ＨＭＧボックス”と１つのＣ末端酸性配列とを有することである（ Ｂｕｓｔｉｎ Ｍ．Ｂ．Ｂ．Ａ．（１９９０）１０４９：２３１−２４３）。こ れらのタンパク質は、十字形構造（パリンドロームの処の鎖内対合）に押出され たパリンドロームＤＮＡ配列に特異的に結合するか、または、極度に湾曲したＤ ＮＡ配列に特異的に結合する。これらの２種類のＤＮＡ配列の構造に共通の特徴 は、ＤＮＡの小さい溝が拡大され、ＨＭＧ１／２型タンパク質との結合に適応し 易いことである。タンパク質ＨＭＧ１及びＨＭＧ２の生理的機能は今日までは殆 ど解明されていない。しかしながら、ウシのＨＭＧ１タンパク質が哺乳動物細胞 の核に活性状態で運搬されることは証明されていた（Ｌ．Ｋｕｅｈｌら；Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５；２６０，１０３６１−１０３６８）。 予想外にも出願人は、ＨＭＧタンパク質のこれらの能力、即ち、ＤＮＡに結合 して活性状態で核に運搬されるという特性を 利用し、異種核酸配列を少なくとも１つのトランスフェクタント因子に結合させ ることによって、治療すべき細胞の核内へのトランスフェクションを有効に促進 できることを証明した。 本発明において、誘導体なる用語は、遺伝的及び／または化学的な１つまたは 複数の修飾によって得られた前記に定義の化合物以外の任意のペプチド、プソイ ドペプチド（非生化学的エレメントを取込んだペプチド）またはタンパク質を意 味する。遺伝的及び／または化学的な修飾という表現は、例えば、検討対象であ るタンパク質の１つまたは複数の残基の任意の突然変異、置換、欠失、付加及び ／または修飾を意味する。より正確には化学的修飾は、（１つまたは複数の）生 物分子または非生物分子の化学反応または化学的グラフトによってタンパク質の 任意数の残基に生じたペプチドまたはタンパク質の任意の修飾を意味する。遺伝 的修飾という表現は、任意のペプチド配列について、そのＤＮＡが異種核酸配列 またはそのフラグメントとハイブリダイズでき且つその産物が指定された活性を 有しているときに該ペプチド配列に対して用いられる。このような誘導体は種々 の目的、例えば、ＤＮＡリガンドに対する対応ポリペプチドの親和性を増強する 目的、ポリペプチドの産生レベルを 向上させる目的、ポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増強する目的、ポリペプチ ドの活性の１つを増強及び／または修飾する目的、あるいは、ポリペプチドに新 規な薬剤動態学的特性及び／または生物学特性を与える目的で作製され得る。付 加によって得られる誘導体の例としては、末端に結合した異種増補部分を含むキ メラペプチド配列がある。誘導体なる用語はまた、検討中の配列に相同の配列で あって他の細胞ソース、特にヒト起原または他の生物の細胞に由来し同種の活性 を有しているタンパク質配列を意味する。このような相同配列は対応するＤＮＡ のハイブリダイゼーション実験によって得られる。ハイブリダイゼーションは、 核酸バンクを出発材料とし、天然型配列またはそのフラグメントをプローブとし て使用し、慣用の緊縮性条件（Ｍａｎｉａｔｉｓら）（分子生物学の汎用技術参 照）または好ましくは高緊縮性条件で行うことができる。 本発明では更に、ＨＭＧファミリーのいくつかのタンパク質またはその誘導体 が二重鎖ＤＮＡに存在する二次構造に対して高い親和性をもつことを利用し得る 。この例としては特に四本鎖構造があり、ラットのＨＭＧ１はこの構造に対して 極めて高い親和性を有していることが証明された（Ｂｉａｎｃｈｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８９，２４３，１０５６−１０５９）。このような構造 はまた、アデノウイルスに関連のウイルスのＩＴＲ（逆方向末端反復配列）のよ うな天然配列から得られてもよく、または人工ポリンドロームから得られた完全 に合成の構造でもよい。 本発明の好ましい実施態様によれば、使用される化合物は、ＨＭＧ１、２、Ｉ 、Ｙ、１４及び１７型のタンパク質並びにそれらの誘導体から選択される。より 好ましくは化合物は、ヒトＨＭＧ１タンパク質の全部もしくは一部または前記の 定義のようなその誘導体もしくは相同体の１つから選択される。 特に有利な実施態様において、本発明の組成物は更に、核酸の適正な導入を導 くターゲッティングエレメントを含む。このターゲッティングエレメントは、望 ましい幾つかの細胞類型または幾つかの組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞など ）に対する核酸の適正な導入を導き得る細胞外ターゲッティングエレメントでも よい。また、重要ないくつかの細胞区画（ミトコンドリア、核など）に対する核 酸の適正な導入を導き得る細胞内ターゲッティングエレメントでもよい。 より好ましくは、ターゲッティングエレメントは本発明の化 合物に共有結合的または非共有結合的に結合している。また、ターゲッティング エレメントを核酸に結合させてもよい。本発明の好ましい実施態様によれば、本 発明の化合物は、その末端に１つに結合された異種増補部分を介して、糖、トラ ンスフェリン、インシュリンまたはアシアロオロソムコイドタンパク質のような 細胞類型の表面に存在している細胞性レセプターのリガンドに結合する。ターゲ ッティングエレメントはまた、トランスフェクトされたＤＮＡを核の内部に適正 に蓄積する核局在シグナルｎｌｓ配列のような細胞内在型リガンドでもよい。 本発明の範囲内で使用可能なターゲッティングエレメントとしては、塘、ペプ チド、オリゴヌクレオチドまたは脂質を例示し得る。好ましくは、糖及び／また はペプチド、例えば、抗体もしくは抗体フラグメント、細胞性レセプターのリガ ンドもしくはそのフラグメント、レセプターもしくはレセプターのフラグメント 、などがある。特に、成長因子レセプター、サイトカインレセプター、細胞性レ クチンのレセプターまたは接着タンパク質レセプターのリガンドを例示し得る。 また、トランスフェリン、ＨＤＬ及びＬＤＬのレセプターも例示し得る。ターゲ ッティングエレメントはまた、アシアログリコプロテインレセ プターのようなレクチンをターゲッティングする糖であってもよく、または、免 疫グロブリンのＦｃフラグメントのレセプターをターゲッティングする抗体のＦ ａｂフラグメントであってもよい。 有利には本発明の化合物は更に、ポリグリコシル化、スルホン化及び／または リン酸化してもよい。及び／または、複合糖または多炭素鎖もしくはコレステロ ール誘導体のような脂肪親和性化合物にグラフトしてもよい。 本発明の組成物はもちろん異なる種類の複数の本発明の化合物を含み得る。ま た、本発明の化合物を、前述の核ターゲッティング化合物に加えて、ＤＮＡを複 合体化する能力を有している第二化合物に結合させ得ることも証明されている。 このような化合物は特にフランス特許出願第９５／０１８６５号に記載されてい る。 本発明の化合物は本発明の核酸と反応すべく十分な量で存在する。即ち、化合 物／核酸の比（重量比）は０．０１〜５の範囲であり、より好ましくは０．２５ 〜０．５の範囲である。 本発明の組成物中に存在するトランスフェクション因子に関して考察すると、 トランスフェクション因子はカチオン性ポリ マー及びリポフェクタントから選択されるのが好ましい。 本発明によれば、カチオン性ポリマーは好ましくは一般式Ｉ： 〔式中、 Ｒは、水素原子、または、式： の基を示し、 ｎは２〜１０の整数であり、 ｐ及びｑは整数であり、 但し、ｐ＋ｑの和はポリマーの平均分子量が１００〜１０⁷Ｄａになるような 値である〕の化合物である。 勿論、式（Ｉ）中のｎは、種々の基本単位ｐに従って異なる値を有し得る。従 って、式（Ｉ）はホモポリマー及びヘテロポリマーの双方を包含する。 より好ましくは、式（Ｉ）中のｎは２〜５の範囲である。特に、ポリエチレン イミン（ＰＥＩ）及びポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）のポリマーが極めて有利 な特性を有している。本発明で使用される好ましいポリマーは、１０³〜５×１ ０⁶の範囲の分子量を有しているポリマーである。例えば、平均分子量５０，０ ００Ｄａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０Ｋ）または平均分子量８００，００ ０Ｄａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００Ｋ）がある。 ＰＥＩ５０ＫまたはＰＥＩ８００Ｋは市販されている。一般式Ｉで示されるそ の他のポリマーは、フランス特許出願第９４／０８７３５号に記載の方法で製造 できる。 本発明の組成物によって最適効果を得るためには、ポリマー及び核酸の夫々の 割合を、好ましくはモル比（Ｒ＝ポリマーのアミン／核酸のリン酸塩）０．５〜 ５０、より好ましくは５〜３０となるように決定する。核酸の電荷あたり５〜１ ５当量のポリマーアミンを使用すると特に有利な結果が得られる。 リポフェクタントに関してより詳細に説明すると、リポフェクタントは、例え ばポリアミンのような少なくとも１つのカチオン性親水性領域と脂肪親和性領域 とを含む両性分子である。 好ましくは正電荷をもつポリアミンのカチオン性領域は負電荷をもつ核酸分子に 可逆的に結合し得る。この相互作用によって核酸が顕著に複合体化される。脂肪 親和性領域は脂質膜から形成された核脂質粒子を被覆することによって外部水性 媒体がこのイオン性相互作用に接近できないようにする。 これらのリポフェクタントはまた、一般式ＩＩ： 〔式中、ｍは２以上の整数、ｎは１以上の整数であり、ｍは２つのアミン間に含 まれる種々の炭素基に従って変化し得る〕 で示されるポリアミン領域を有しているリポポリアミンから選択されるのが有利 である。好ましくは、ｍは２〜６（両端値を含む）であり、ｎは１〜５（両端値 を含む）である。より好ましいポリアミン領域の代表例は、スペルミン、テルミ ン、または、ＤＮＡ結合特性を維持しているそれらの類似体の１つである。脂肪 親和性領域の代表例は、コレステロールの飽和もしくは不飽和の少なくとも１つ の炭化水素鎖、または、層状もしくは六角形の相を形成し得る天然脂質もしくは 合成脂質であり、これらが親水性領域に共有結合的に結合している。 欧州特許出願第３９４１１１号は、本発明の範囲内で使用できる一般式ＩＩＩ ： 〔式中、Ｒは特に一般式（Ｒ₁Ｒ₂）Ｎ−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＯ−の基を示す 〕で表される別のリポポリアミンを記載している。 これらのリポポリアミンの代表例としては特に、ジオクタデシルアミドグリシ ルスペルミン（ＤＯＧＳ）及びパルミトイルホスファチジルエタノールアミンの ５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）がある。 また、フランス特許出願第９４／１４５９６号に記載のリポポリアミンも本発 明のトランスフェクション因子として有利に使用できる。これらのリポポリアミ ンは前出の一般式ＩＩＩ中のＲが式ＩＶ： 〔式中、 Ｘ及びＸ′は互いに独立に、酸素原子、メチレン基−（ＣＨ₂）_q−（但し、ｑ は０、１、２または３）、または、アミノ基−ＮＨ−もしくは−ＮＲ′−基（但 し、Ｒ′はＣ₁〜Ｃ₄のアルキル基）を表し、 Ｙ及びＹ′は互いに独立に、メチレン基、カルボニル基または基Ｃ＝Ｓを表し 、 Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅は互いに独立に、水素原子、または、Ｃ₁〜Ｃ₄の置換もしく は未置換のアルキル基（但し、ｐは０〜５の範囲）を表し、 Ｒ₆はコレステロールの誘導体またはアルキルアミノ基−ＮＲ₁Ｒ₂（但し、Ｒ₁ 及びＲ₂は互いに独立にＣ₁₂〜Ｃ₂₂の飽和または不飽和の直鎖状または分枝状の 脂肪族基）を表す〕で示される化合物である。 これらのリポポリアミンの代表例としては特に、２，５−ビス−（３−アミノ −プロピルアミノ）−ペンチル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）− アセテート及び１，３−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−２−プロピル −（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテートがある。 欧州特許出願第３９４１１１号及びフランス特許出願第９４号もまた、対応す るリポポリアミンの製造に使用できる方法を記載している。 本発明の範囲内では、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ） 、パルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５−カルボキシスペルミルア ミド（ＤＰＰＥＳ）、２，５−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−ペンチ ル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテートまたは１，３−ビ ス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−２−プロピル−（ジオクタデシル−カル バモイルメトキシ）−アセテートを特に有利に使用できる。 本発明の組成物の最適効果を得るために、ポリアミン及び核酸の夫々の割合を 、トランスフェクション因子の正電荷／核酸の負電荷の比Ｒが好ましくは０．１ 〜１０、より好ましくは０．５〜２の範囲になるように決定する。 トランスフェクタント組成物の内部に本発明の化合物が存在することはいくつ かの点で有利である。特に、結果的に組成物の毒性が著しく低下するので、トラ ンスフェクション因子に本来は感受性の細胞、例えば造血細胞に対してもリポポ リアミン を用いたトランスフェクションを行うことが可能になる。 本発明の組成物中の核酸はデオキシリボ核酸でもよくリボ核酸でもよい。この 核酸は天然起原配列または人工配列のいずれでもよく、特にゲノムＤＮＡ、ｃＤ ＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列、合成配列または半合 成配列のいずれでもよい。これらの核酸の起原は、ヒト、動物、植物、細菌、ウ イルスなどのいずれでもよい。これらの核酸は、当業者に公知の任意の技術、特 に、ライブラリースクリーニング、化学合成、または、ライブラリースクリーニ ングによって得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む混成方法によって 得られてもよい。更にこれらの核酸を、プラスミドベクターのようなベクターに 組込んでもよい。 デオキシリボ核酸についてより詳細に考察すると、デオキシリボ核酸は一本鎖 でも二重鎖でもよい。これらのデオキシリボ核酸は、治療用遺伝子、転写調節配 列、複製調節配列、アンチセンス配列、他の細胞成分への結合領域などをコード し得る。 本発明において、治療用遺伝子という用語は特に、治療効果を有するタンパク 質産物をコードする任意の遺伝子を意味する。コードされているタンパク質産物 は、タンパク質、ペプチドな どである。このタンパク質産物は標的細胞に同種でもよい（即ち、標的細胞が病 原性を全く有していないときに標的細胞中で正常に発現される産生物）。この場 合にはタンパク質の発現によって、例えば細胞内の不十分な発現の緩和または修 飾に起因する不活性もしくは低活性タンパク質の発現の緩和などの効果が得られ たり、あるいは、このようなタンパク質の超発現などの効果が得られる。治療用 遺伝子はまた、細胞性タンパク質に比べて安定性が強化された突然変異体または 活性の修飾を生じた突然変異体をコードし得る。タンパク質産物はまた、標的細 胞に異種であってもよい。この場合にはタンパク質の発現によって、細胞の闘病 を支援するために、細胞の欠損活性を補完または援助する効果、あるいは、免疫 応答を増進する効果が得られる。 本発明に包含される治療用物質としては特に、酵素；血液誘導体；ホルモン； インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなどのリンフォカイン（フランス 特許第９２０３１２０号）；成長因子；神経伝達物質またはそれらの前駆体また はそれらの合成酵素；ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ 、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオト ロフィンなどの栄養因子；ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなどのアポリポ タンパク質（フランス特許第９３０１５１２５号）；ジストロフィンまたはミニ ジストロフィン（フランス特許第９１１１９４７号）；脾臓線維症に関連したＣ ＦＴＲタンパク質；ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなどの腫瘍 抑制遺伝子（フランス特許第９３０４７４５号）：ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、 ＩＸ因子のような凝固関与因子をコードする遺伝子；ＤＮＡ修復に関与する遺伝 子；自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）などを例示できる 。 治療用遺伝子はまた、標的細胞中で発現したときに遺伝子の発現または細胞性 ｍＲＮＡの転写をコントロールし得るアンチセンス遺伝子またはアンチセンス配 列でもよい。このような配列は例えば細胞性ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡとして標的 細胞中にて転写され、その結果として細胞性ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される ことを阻止する。この技術は欧州特許第１４０３０８号に記載されている。アン チセンスはまた、標的ＲＮＡを選択的に破壊し得るリボザイムをコードする配列 を含む（欧州特許第３２１２０１号）。 また、前述のように、核酸がヒトまたは動物の体内で免疫応 答を誘発し得る抗原性ペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を含んでい てもよい。従って本発明のこの特定実施態様によれば、特に微生物、ウイルスも しくは癌に対するヒトもしくは動物用のワクチンの作製または免疫療法的治療が 可能になる。このようなペプチドの例としては特に、エプスタイン・バールウイ ルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂウイルス（欧州特許第１８５５７３号）、偽狂犬 病ウイルスに特異的な抗原性ペプチド、あるいは、腫瘍特異的抗原性ペプチド（ 欧州特許第２５９２１２号）がある。 好ましくは核酸が更に、所望の細胞または器官の内部における治療用遺伝子及 び／または抗原性ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列を含む。 これらの配列は、核酸が取込まれた細胞中で機能し得るとき、必然的に当該遺伝 子を発現させる。これらの配列はまた、異なる起原の配列でもよい（別のタンパ ク質の発現を担当する配列または合成配列でもよい）。これらの配列は特に、真 核生物細胞またはウイルスの遺伝子のプロモーター配列でもよい。例えば、取込 ませるべき細胞のゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。また、ウイルスの ゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。この例としては、 Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶなどの遺伝子のプロモーターが挙げられる。更 に、これらの発現担当配列を活性化配列、調節配列などの付加によって修飾して もよい。 更に、核酸配列はまた、特に治療用遺伝子の上流に、合成された治療用産生物 を標的細胞の分泌路に案内するシグナル配列を含み得る。このシグナル配列は治 療用産生物の天然のシグナル配列でもよいが、他の任意の機能性シグナル配列で もよくまたは人工のシグナル配列でもよい。 より好ましくは、本発明の組成物は更に、１つまたは複数の中性脂肪を含有し ている。このような組成物は、特に比Ｒが小さい値であるときに特に有利である 。出願人は実際、中性脂肪の付加によって核脂質粒子の形成が促進されることを 知見し、また意外にも、中性脂肪の付加が細胞膜を不安定にすることによって粒 子の細胞内侵入を助長することも知見した。 より好ましくは、本発明の範囲内で使用される中性脂肪は２つの脂肪鎖をもつ 脂質である。 生理的条件で両性であるかまた電荷が欠けている天然または合成の脂質を使用 するのが特に有利である。脂質は特に、ジオレオイルホスファチジルエタノール アミン（ＤＯＰＥ）、オレ オイル−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステ アロイル、−パルミトイル、−ミリストイルホスファチジルエタノールアミン、 及びそれらを１〜３回Ｎ−メチル化した誘導体、ホスファチジルグリセロール、 ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特に ガラクトセレブロシド）、スフィンゴリピド（特にスフィンゴミエリン）、また は、アシアロガングリオシド（特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）から選択される 。 これらの種々の脂質は、当業者に公知の従来の技術を用い、合成によって得ら れてもよく、器官（例えば脳）または卵からの抽出によって得られてもよい。特 に、天然脂質の抽出は有機溶媒によって行うことができる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙも参照）。 リポフェクタントをトランスフェクション因子として用いた本発明の組成物は 、好ましくはリポポリアミン１当量あたり０．１〜２０当量の中性脂肪、より好 ましくは１〜５当量の中性脂肪を含有している。カチオン性ポリマーをトランス フェクション因子として用いた場合には、本発明の組成物は、前出の割合のカチ オン性ポリマーに加えて、核酸のリン酸塩１モル当 量あたり０．１〜２０モル当量の中性脂肪、より好ましくは１〜５モル当量の中 性脂肪を含有する。 本発明の組成物は、局所、皮膚、経口、直腸、膣内、非経口、鼻腔内、静脈内 、筋肉内、皮下、眼内、経皮、などの経路で投与される製剤の形態に調製され得 る。好ましくは本発明の医薬組成物は、注射可能な製剤、特に所望の器官の処に 直接注入するため、または、局所経路で（皮膚及び／または粘膜に）投与するた めに、医薬として許容されるビヒクルを含有している。このような組成物として は特に、無菌液、等張液、または乾燥組成物、特に滅菌水もしくは生理的食塩水 を適宜添加することによって注射可能な溶質を復元し得る凍結乾燥組成物がある 。注入に使用される核酸の用量及び投与回数は種々のパラメーターに従って、特 に、使用される投与形態、対象となる疾病、発現させる遺伝子、または、所望の 治療期間に従って適宜選択される。 これらの組成物は、例えば造血細胞、リンパ球、肝細胞、内皮細胞、黒色腫細 胞、癌細胞、肉腫細胞、平滑筋細胞、ニューロン及び星状細胞腫のような広範な 細胞類型をトランスフェクトするために有利に使用され得る。 従って本発明は、カチオン性ポリマーまたはリポフェクタント型のトランスフ ェクション因子と前記に定義の化合物とに結合した治療用核酸の試験管内、生体 外または生体内トランスフェクションを用いる特に有利な病気の治療方法を提供 する。より特定的にはこの方法は、タンパク質産物または核産生物の欠損を原因 とする病気を適用対象とし、投与される核酸はこのタンパク質産物をコードして いるかまたはこの核産生物に対応する配列を含んでいる。本発明の組成物はその 生体内利用適性及びそれらのトランスフェクションレベルの面から特に有益であ る。 本発明はまた、本発明の化合物を細胞性レセプターのリガンド、抗体または抗 体誘導体に結合させ、対応するレセプターまたは抗原を発現している細胞に核酸 を適正に取込ませる化合物の使用方法に関する。この場合、有力なリガンド、抗 体または抗体誘導体を本発明の化合物に結合させ、得られたキメラ分子のトラン スフェクション効率を化合物単独の場合に比較して評価する。 非限定的代表例として示された実施例に基づいて本発明を更に十分に以下に説 明する。図面の簡単な説明 図１は、種々の細胞類型中で本発明によって得られたトランスフェクション効 率を光の量によって示すグラフである。 図２は、ＨＭＧ１の存在下及び非存在下で得られたトランスフェクション効率 を示すグラフである。材料及び方法 本発明の組成物の活性を証明するために使用した構築物は、ルシフェラーゼを コードする遺伝子（Ｌｕｃ）を含むプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃである。 プラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃは、制限酵素ＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断 することによってベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）か ら抽出され、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流に配置され、ベクターｐ ＧＬｂａｓｉｃＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＭｕｌＩ部位及びＨｉｎＩＩ Ｉ部位に挿入されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを含む。実施例１：ラットのＨＭＧ１タンパク質の調製 １．１：大腸菌におけるＨＭＧ１タンパク質の発現 哺乳動物に由来のこの組換えタンパク質を大腸菌中の超発現 によって調製した。 ラットのＨＭＧ１タンパク質をコードしているプラスミドＴ７−ＲＮＨＭＧ１ （Ｍ．Ｅ．Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｇｅｎｅ，１０４（１９９１）２７１−２７５）を 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入する。次いでこの菌株を、アンピシリン（２ ５ｍｇ／リットル）を加えたＬＢ培地中で３７℃で培養する。単離コロニーから プレカルチャーを得る。このプレカルチャーから５００ｍｌの培養物が得られる 。培養物の６００ｎｍの吸光度が０．７の値に達したときに、ＩＰＴＧを最終濃 度０．５ｍＭまで添加することによってＨＭＧ１の合成を誘発する。ＨＭＧ１産 生株をＩＰＴＧの存在下で更に２時間３０分培養する。次に遠心（５０００×ｇ ，２０分）によって細胞を収集し、２００ｍｌの蒸留水で洗浄し、再度遠心する 。精製するまでは細胞残渣を−８０℃で保存する。１．２：組換えＨＭＧ１タンパク質の精製 実施例１．１に記載の大腸菌株の培養物を、例えば以下のプロトコルを用いて クロマトグラフィー処理することによってＨＭＧ１タンパク質を精製し得る。 特に注釈がない限り、以下に記載の精製はすべて４℃で行う。 ５００ｍｌの培養物から得られた細胞を、５００μＭのＥＤＴＡと５ｍＭのＤＴ Ｔと２００μＭのＰｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ〔４−（２−アミノエチル）−ベンゼ ンスルホニルフルオリド塩酸塩〕と１０％（ｗ／ｖ）のグリセロールとを含む５ ０ｍＭのトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．７から成る１５ｍｌのバッファに再浮遊させ る。１５分間音波処理して細胞を破壊し、次いで、細胞デブリスを遠心（５０， ０００×ｇ；１時間）によって分離する。非細胞性抽出物を次に、バッファＡ〔 ４００ｍＭの塩化ナトリウムと、２００ｍＭのＥＤＴＡと、１ｍＭのＤＴＴと、 ２００μＭのＰｅｆａｂｌｏｃ ＳＣと、０．２％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０と 、１０％のグリセロールとを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．９〕で平衡及 び溶出させるセファデックスＧ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でクロマト グラフィー処理する。タンパク質を含有する画分を回収し、バッファＡで平衡さ せたＤＥＡＥセファデックスＡ−２５ゲルカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でクロ マトグラフィー処理する。このカラムに保持されなかったタンパク質画分に固体 硫酸アンモニウムを最終濃度２．８Ｍまで徐々に混合する。２時間後、この懸濁 液を遠心する（３０，０００×ｇ；１５分）。２００ｍＭのＥＤＴＡと、５００ ｐＭのＤＴＴ と、２．８Ｍの硫酸アンモニウムとを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ，ｐＨ ７．９で平衡させたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ５／５カラム（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）によって上清を２０℃でクロマトグラフィー処理する。同じバ ッファ中の硫酸アンモニウムの直線減少勾配（２．８Ｍから０Ｍまで）によって カラムからタンパク質を溶出させる。ＨＭＧ１タンパク質を含有する画分を集め て、１ｍＭのＥＤＴＡと５００μＭのＤＴＴとを含む５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ バッファ，ｐＨ７．７に十分に透析させる。次に、このサンプルをＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに注入し、次いで５０ｍＭのト リス／ＨＣｌバッファ，ｐＨ７．７−５００μＭのＤＴＴ中の塩化ナトリウムの ０−０．５Ｍの直線勾配でカラムを溶出させる。２８０ｎｍに対称吸光ピークを 形成するＨＭＧ１タンパク質がこのバッファに回収される。次にＨＭＧ１タンパ ク質をＣｅｎｔｒｉｋｏｎ １０内で遠心し、次いで１４０ｍＭのＮａＣｌと５ ００μＭのＤＴＴとを含む１０ｍＭのＭｅｓバッファ，ｐＨ６．２に入れる。使 用するまではＨＭＧ１タンパク質を−８０℃で保存する。非変性条件下（ＳＤＳ ）の電気泳動及びクーマシーブルー染色によって分析すると、この調製物は 見掛け分子量３１，０００に泳動する単一タンパク質バンドを有している。総精 製効率は５００ｍｌの出発培養物あたり８５０μｇの純ＨＭＧ１タンパク質が得 られるような値である。実施例２：哺乳動物の細胞に対する核酸の試験管内導入 この実施例は、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションを増進するために、 ＤＮＡに結合して活性状態で核に導入されるＨＭＧ１型タンパク質を使用する方 法を示す。 本発明の組成物の活性を試験するための構築物として、前記のルシフェラーゼ をコードする遺伝子（Ｌｕｃ）を含むプラスミドを使用した。 ２４ウェル（直径１６ｍｍ）のプレートでトランスフェクションの２日後に（ 集密状態の細胞を）回収するようにプロトコルを設定する。全部のパラメーター を釣合うように調整する。 Ｊ日目に細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５８）、３ＬＬ（Ｉｓａｋ ｏｖ Ｎら，ＪＮＣＩ ７１（１９８３）１３９−１４５）、Ｈ４６０（Ｍａｘ ｗｅｌｌら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８（１９９３），３４２１−３４２９）をウェ ルあたり１０⁵細胞の割合で播種する。 Ｊ＋２日目に、細胞をＰＢＳで洗浄し（残留血清を除去する ため）、１０％のウシ胎仔血清（ＳＦＶ）を添加するかまたは非添加の２５０ｍ ｌのＲＰＭＩ（３ＬＬ及びＨ４６０）またはＤＭＥＭ（ＮＩＨ３Ｔ３）に入れる 。 トランスフェクションに使用する組成物を調製するためには、等価のウェルに よって試験管に、 総量を２０ｍｌにする量のＨ₂Ｏと、 最終濃度を１４０ｍＭにするＮａＣｌと、 ０．５ｍｇのプラスミドＤＮＡと、 １２５ｎｇのＨＭＧＩと、 を入れ、次いで穏やかに撹拌し、室温で１５分間インキュベートした後、１．５ ナノモルのリポフェクタントＤＯＧＳを添加する。再度穏やかに撹拌し、室温で １５分間インキュベートする。 細胞の培養培地に２０ｍｌのＤＮＡ／ＨＭＧ１／リポフェクタント混合物を添 加することによってトランスフェクトし、細胞を３７℃で２〜４時間インキュベ ートする。この培地を次に完全培地に交換する。 Ｊ＋４日目に、細胞を室温の２５０ｍｌのＰＢＳによって洗浄し、１００ｍｌ の専用バッファ（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ） ＋ＴＣＫとアプロチニン）に溶解する。１０ｍｌの溶解物と５０ｍｌの基質（Ｐ ｒｏｍｅｇａ）とを使用して合成ルシフェラーゼの活性を測定する。 図１及び図２に示す結果は、独立に２回繰り返した４つの実験の平均である。 この結果を得るために、トランスフェクトされた細胞中でＬｕｃ遺伝子の発現に よって生じた光の量（Ｕｎｉｔｅｅｓ Ｌｕｍｉｎｅｕｓｅｓ、ＵＬ）を測定す る。 図１は、種々の量のＨＭＧ１タンパク質の存在下で前記の３つの細胞類型によ って得られた値を示す。 図２は、種々の量のＨＭＧ１タンパク質の添加によって得られたトランスフェ クションの増進率を概略的に示すグラフである。ＨＭＧ１タンパク質によるトラ ンスフェクション効率の増加は細胞類型によって異なっている。 トランスフェクションに必要な組成物を含有する培地に１０％のＳＦＶを補充 したときにトランスフェクション効率が最大であることが観察される。生体内条 件ではＳＦＶの存在が観察されるのでこれは極めて有利である。他方で、特にＨ ＭＧ１タンパク質の非存在下ではＳＦＶの存在がトランスフェクション効率を低 下させることが明らかである。培養培地中のＳＦＶ の存在は内部取込みによって細胞に取込まれるＤＮＡの量を減少させると考えら れる。従って、ＤＮＡの量が限定要因であるような条件下のトランスフェクショ ンに対してはＨＭＧ１が特に有利であると結論し得る。 トランスフェクションに最適なＨＭＧ１／ＤＮＡ比（重量）は０．２５〜０． ５である。このような条件がＤＮＡを複合体化できるとは記載されていない（Ｂ ｏｔｔｇｅｒ Ｍ．ら，Ｂ．Ｂ．Ａ．９５０（１９８８），２２１−２２８）； Ｓｔｒｏｓ Ｍら，Ｎ．Ａ．Ｒ．２２（１９９４），１０４４−１０５１）。実 際、プラスミドはＨＭＧ１によって飽和されない（Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ Ｌ． Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３（１９９４），１２７０２−１２７０ ７）。従って、ＨＭＧ１タンパク質の効果は、ＤＮＡに結合し細胞の核内に運搬 されるこのタンパク質の能力によって説明される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１１月１９日 【補正内容】 好ましくは、ｍは２〜６（両端値を含む）であり、ｎは１〜５（両端値を含む） である。より好ましいポリアミン領域の代表例は、スペルミン、テルミン、また は、ＤＮＡ結合特性を維持しているそれらの類似体の１つである。脂肪親和性領 域の代表例は、コレステロールの飽和もしくは不飽和の少なくとも１つの炭化水 素鎖、または、層状もしくは六角形の相を形成し得る天然脂質もしくは合成脂質 であり、これらが親水性領域に共有結合的に結合している。 欧州特許出願第３９４１１１号は、本発明の範囲内で使用できる一般式ＩＩＩ ： 〔式中、Ｒは特に一般式（Ｒ₁Ｒ₂）Ｎ−ＣＯ−ＣＨ−ＮＨ−ＣＯ−の基を示す〕 で表される別のリポポリアミンを記載している。 これらのリポポリアミンの代表例としては特に、ジオクタデシルアミドグリシ ルスペルミン（ＤＯＧＳ）及びパルミトイルホスファチジルエタノールアミンの ５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）がある。 また、フランス特許出願第９４／１４５９６号に記載のリポポリアミンも本発 明のトランスフェクション因子として有利に使用できる。これらのリポポリアミ ンは前出の一般式ＩＩＩ中のＲが式ＩＶ： 〔式中、 Ｘ及びＸ′は互いに独立に、酸素原子、メチレン基−（ＣＨ₂）_q−（但し、ｑ は０、１、２または３）、または、アミノ基−ＮＨ−もしくは−ＮＲ′−基（但 し、Ｒ′はＣ１〜Ｃ４のアルキル基）を表し、 Ｙ及びＹ′は互いに独立に、メチレン基、カルボニル基または基Ｃ＝Ｓを表し 、 Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅は互いに独立に、水素原子、または、Ｃ₁〜Ｃ₄の置換もしく は未置換のアルキル基（但し、ｐは０〜５の範囲）を表し、 Ｒ₆はコレステロールの誘導体またはアルキルアミノ基−ＮＲ₁Ｒ₂（但し、Ｒ₁ 及びＲ₂は互いに独立にＣ₁₂〜Ｃ₂₂の飽 和または不飽和の直鎖状または分枝状の脂肪族基）を表す〕で示される化合物で ある。 これらのリポポリアミンの代表例としては特に、２，５−ビス−（３−アミノ −プロピルアミノ）−ペンチル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）− アセテート及び１，３−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−２−プロピル −（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテートがある。 欧州特許出願第３９４１１１号及びフランス特許出願第９４／１４５９６号も また、対応するリポポリアミンの製造に使用できる方法を記載している。 本発明の範囲内では、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ） 、パルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５−カルボキシスペルミルア ミド（ＤＰＰＥＳ）、２，５−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−ペンチ ル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテートまたは１，３−ビ ス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−２−プロピル−（ジオクタデシル−カル バモイルメトキシ）−アセテートを特に有利に使用できる。 本発明の組成物の最適効果を得るために、ポリアミン及び核 酸の夫々の割合を、トランスフェクション因子の正電荷／核酸の負電荷の比Ｒが 好ましくは０．１〜１０、より好ましくは０．５〜２の範囲になるように決定す る。 トランスフェクタント組成物の内部に本発明の化合物が存在することはいくつ かの点で有利である。特に、結果的に組成物の毒性が著しく低下するので、トラ ンスフェクション因子に本来は感受性の細胞、例えば造血細胞に対してもリポポ リアミンを用いたトランスフェクションを行うことが可能になる。 これらの組成物は、例えば造血細胞、リンパ球、肝細胞、内皮細胞、黒色腫細 胞、癌細胞、肉腫細胞、平滑筋細胞、ニューロン及び星状細胞腫のような広範な 細胞類型をトランスフェクトするために有利に使用され得る。 従って本発明は、カチオン性ポリマーまたはリポフェクタント型のトランスフ ェクション因子と前記に定義の化合物とに結合した治療用核酸の試験管内、生体 外または生体内トランスフェクションを用いる特に有利な病気の治療方法を提供 する。より特定的にはこの方法は、タンパク質産物または核産生物の欠損を原因 とする病気を適用対象とし、投与される核酸はこのタンパク質産物をコードして いるかまたはこの核産生物に対応する配列を含んでいる。本発明の組成物はその 生体内利用適性及びそれらのトランスフェクションレベルの面から特に有益であ る。 本発明はまた、対応するレセプターまたは抗原を発現している細胞に核酸を適 正に取込ませるために、本発明の化合物を細胞性レセプターのリガンド、抗体ま たは抗体誘導体に結合させる化合物の使用方法に関する。この場合、有力なリガ ンド、抗体または抗体誘導体を本発明の化合物に結合させ、得られたキ メラ分子のトランスフェクション効率を化合物単独の場合に比較して評価する。 非限定的代表例として示された実施例に基づいて本発明をより十分に以下に説 明する。図面の簡単な説明 図１は、種々の細胞類型中で本発明によって得られたトランスフェクション効 率を光の量によって示すグラフである。 図２は、ＨＭＧ１の存在下及び非存在下で得られたトランスフェクション効率 を示すグラフである。 請求の範囲 １．少なくとも１つの核酸のトランスフェクションに有用な医薬組成物であって 、前記核酸に加えて、ＤＮＡ結合特性と前記ＤＮＡを核内に運搬する能力とを併 せて有している少なくとも１つの化合物と、カチオン性ポリマー及びリポフェク タントから選択された少なくとも１つのトランスフェクション因子とを含んでい ることを特徴とする医薬組成物。 ２．少なくとも１つの核酸のトランスフェクションに有用な医薬組成物であって 、前記核酸に加えて、ＨＭＧのファミリーに属する少なくとも１つの化合物また はその誘導体の１つと、カチオン性ポリマー及びリポフェクタントから選択され た少なくとも１つのトランスフェクション因子とを含んでいることを特徴とする 医薬組成物。 ３．化合物が、ＨＭＧ１、２、Ｉ、Ｙ、１４及び１７型のタンパク質並びにそれ らの誘導体から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成 物。 ４．化合物が、ヒトＨＭＧ１タンパク質の全部または一部、その誘導体または同 族体の１つによって表されることを特徴とす る請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。 ５．前記化合物が更に、ポリグリコシル化、スルホン化、リン酸化されるか、及 び／または、複合糖もしくは脂肪親和性物質にグラフトされていることを特徴と する請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。 ６．前記化合物が更に、細胞性レセプターまたは核レセプターのリガンドに結合 されていることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物 。 ７．トランスフェクション因子が、一般式（Ｉ）： 〔式中、 Ｒは、水素原子、または、式： の基を示し、 ｎは２〜１０の整数であり、 ｐ及びｑは整数であり、 但し、ｐ＋ｑの和はポリマーの平均分子量が１００〜１０⁷Ｄａとなるような 値である〕で示される少なくとも１つのカチオン性ポリマーであることを特徴と する請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。 ８．トランスフェクション因子が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリプロ ピレンイミン（ＰＰＩ）から選択されるカチオン性ポリマーであることを特徴と する請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。 ９．平均分子量５０，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０Ｋ）または平均 分子量８００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００Ｋ）であることを特 徴とする請求項８に記載の医薬組成物。 １０．トランスフェクション因子が、一般式ＩＩ： 〔式中、ｍは２以上の整数、ｎは１以上の整数であり、ｍはコレステロールの飽 和もしくは不飽和の炭化水素鎖型の少なくとも１つの脂肪親和性領域または層状 もしくは六角形の相を形成 し得る天然もしくは合成の脂質に共有結合的に結合した２つのアミン間に含まれ る種々の炭素基に従って変化し得る〕で示される少なくとも１つの脂肪親和性ポ リアミン領域を含む少なくとも１つのリポフェクタントであることを特徴とする 請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。 １１．ポリアミン領域が、好ましくはスペルミン、テルミン、または、核酸結合 特性を維持しているそれらの類似体の１つによって表されることを特徴とする請 求項１０に記載の医薬組成物。 １２．脂肪親和性領域が、一般式ＩＶ： 〔式中、 Ｘ及びＸ′は互いに独立に、酸素原子、メチレン基−（ＣＨ₂）_q−（但し、ｑ は０、１、２または３）、または、アミノ基−ＮＨ−または−ＮＲ′−基（但し 、Ｒ′はＣ₁〜Ｃ₄のアルキル基）を表し、 Ｙ及びＹ′は互いに独立に、メチレン基、カルボニル基また は基Ｃ＝Ｓを表し、 Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅は互いに独立に、水素原子、または、Ｃ₁〜Ｃ₄の置換もしく は未置換のアルキル基（但し、ｐは０〜５の値）を表し、 Ｒ₆はコレステロール誘導体またはアルキルアミノ基−ＮＲ₁Ｒ₂（但し、Ｒ₁及 びＲ₂は互いに独立にＣ₁₂〜Ｃ₂₂の飽和もしくは不飽和の直鎖状もしくは分枝状 の脂肪族基）を表す〕によって表されることを特徴とする請求項１０または１１ に記載の医薬組成物。 １３．トランスフェクション因子が好ましくは、ジオクタデシルアミドグリシル スペルミン（ＤＯＧＳ）、パルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５− カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）、２，５−ビス−（３−アミノ−プ ロピルアミノ）−ペンチル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセ テートまたは１，３−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−２−プロピル− （ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテートから選択されたリポポ リアミンであることを特徴とする請求項１から６及び１０から１２のいずれか一 項に記載の医薬組成物。 １４．トランスフェクション因子がジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ ＤＯＧＳ）であることを特徴とする請求項１から６及び１０から１３のいずれが 一項に記載の医薬組成物。 １５．核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする請求項１から１４のいず れか一項に記載の医薬組成物。 １６．核酸がリボ核酸であることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項 に記載の医薬組成物。 １７．核酸が化学的に修飾されていることを特徴とする請求項１５または１６に 記載の医薬組成物。 １８．核酸がアンチセンスであることを特徴とする請求項１５から１７のいずれ か一項に記載の医薬組成物。 １９．核酸が治療用遺伝子を含むことを特徴とする請求項１５から１８のいずれ か一項に記載の医薬組成物。 ２０．更に１種または複数の中性脂肪を含むことを特徴とする請求項１から１９ のいずれか一項に記載の医薬組成物。 ２１．前記１種または複数の中性脂肪が生理的条件下で両性であるかまたはイオ ン電荷が欠けている合成または天然の脂質から選択されることを特徴とする請求 項２０に記載の医薬組成物。 ２２．前記１種または複数の中性脂肪が、ジオレオイルホスフ ァチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイル−パルミトイルホスファチ ジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイル、−パルミトイル、−ミ リストイルホスファチジルエタノールアミン、及び、１〜３回Ｎ−メチル化した それらの誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコ シルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシド）、スフ ィンゴリピド（特にスフィンゴミエリン）、及び、アシアロガングリオシド（特 にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）から選択されることを特徴とする請求項２０また は２１に記載の医薬組成物。 ２３．核酸の試験管内、生体外及び／または生体内導入を目的とする請求項１か ら２２のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。 ２４．対応するレセプターまたは抗原を発現する細胞に核酸を適正に導入するた めの、細胞性レセプターのリガンド、抗体または抗体誘導体に結合した請求項１ または２に記載の化合物の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 チユイリエ，バンサン フランス国、エフ−75005・パリ、ブルバ ール・ポール−ロワイヤル、96

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１つの核酸のトランスフェクションに有用な医薬組成物であって 、前記核酸と少なくとも１つのトランスフェクション因子とに加えて、ＤＮＡ結 合特性と前記ＤＮＡを核内に運搬する能力とを併せて有している少なくとも１つ の化合物を含んでいることを特徴とする医薬組成物。 ２．少なくとも１つの核酸のトランスフェクションに有用な医薬組成物であって 、前記核酸と少なくとも１つのトランスフェクション因子とに加えて、ＨＭＧの ファミリーに属する少なくとも１つの化合物またはその誘導体の１つを含んでい ることを特徴とする医薬組成物。 ３．化合物が、ＨＭＧ１、２、Ｉ、Ｙ、１４及び１７型のタンパク質並びにそれ らの誘導体から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成 物。 ４．化合物が、ヒトＨＭＧ１タンパク質の全部または一部、その誘導体または同 族体の１つによって表されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に 記載の医薬組成物。 ５．前記化合物が更に、ポリグリコシル化、スルホン化、リン 酸化されるか、及び／または、複合糖もしくは脂肪親和性物質にグラフトされて いることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。 ６．前記化合物が更に、細胞性レセプターまたは核レセプターのリガンドに結合 されていることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物 。 ７．トランスフェクション因子がカチオン性ポリマーまたはリポフェクタントで あることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。 ８．カチオン性ポリマーが好ましくは一般式（Ｉ）： 〔式中、 Ｒは、水素原子、または、式： の基を示し、 ｎは２〜１０の整数であり、 ｐ及びｑは整数であり、 但し、ｐ＋ｑの和はポリマーの平均分子量が１００〜１０⁷Ｄａとなるような 値である〕の化合物であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。 ９．カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリプロピレン イミン（ＰＰＩ）から選択されることを特徴とする請求項７または８に記載の医 薬組成物。 １０．ポリマーが、平均分子量５０，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０ Ｋ）または平均分子量８００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００Ｋ） から選択されることを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物。 １１．リポフェクタントが、一般式ＩＩ： 〔式中、ｍは２以上の整数、ｎは１以上の整数であり、ｍはコレステロールの飽 和もしくは不飽和の炭化水素鎖型の少なくとも１つの脂肪親和性領域または層状 もしくは六角形の相を形成し得る天然もしくは合成の脂質に共有結合的に結合し た２つの アミン間に含まれる種々の炭素基に従って変化し得る〕で示される少なくとも１ つの脂肪親和性ポリアミン領域を含むことを特徴とする請求項７に記載の医薬組 成物。 １２．ポリアミン領域が、スペルミン、テルミン、または、核酸結合特性を維持 しているそれらの類似体の１つによって表されることを特徴とする請求項１１に 記載の医薬組成物。 １３．その脂肪親和性領域が、一般式ＩＶ： 〔式中、 Ｘ及びＸ′は互いに独立に、酸素原子、メチレン基−（ＣＨ₂）_q−（但し、ｑ は０、１、２または３）、または、アミノ基−ＮＨ−または−ＮＲ′−基（但し 、Ｒ′はＣ₁〜Ｃ₄のアルキル基）を表し、 Ｙ及びＹ′は互いに独立に、メチレン基、カルボニル基または基Ｃ＝Ｓを表し 、 Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅は互いに独立に、水素原子、または、Ｃ₁〜Ｃ₄の置換もしく は未置換のアルキル基（但し、ｐは０〜５ の値）を表し、 Ｒ₆はコレステロール誘導体またはアルキルアミノ基−ＮＲ₁Ｒ₂（但し、Ｒ₁及 びＲ₂は互いに独立にＣ₁₂〜Ｃ₂₂の飽和もしくは不飽和の直鎖状もしくは分枝状 の脂肪族基）を表す〕によって表されることを特徴とする請求項１１に記載の医 薬組成物。 １４．リポポリアミンが好ましくは、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン （ＤＯＧＳ）、パルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５−カルボキシ スペルミルアミド(ＤＰＰＥＳ)、２，５−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ ）−ペンチル−（ジオクタデシル−カルバモイルメトキシ）−アセテートまたは １，３−ビス−（３−アミノ−プロピルアミノ）−２−プロピル−（ジオクタデ シル−カルバモイルメトキシ）−アセテートから選択されることを特徴とする請 求項１１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。 １５．トランスフェクション因子がジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ ＤＯＧＳ）であることを特徴とする請求項１〜７、１１、１２及び１４のいずれ か一項に記載の医薬組成物。 １６．核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする請求項１から１５のいず れか一項に記載の医薬組成物。 １７．核酸がリボ核酸であることを特徴とする請求項１から１６のいずれか一項 に記載の医薬組成物。 １８．核酸が化学的に修飾されていることを特徴とする請求項１６または１７に 記載の医薬組成物。 １９．核酸がアンチセンスであることを特徴とする請求項１６から１８のいずれ か一項に記載の医薬組成物。 ２０．核酸が治療用遺伝子を含むことを特徴とする請求項１６から１９のいずれ か一項に記載の医薬組成物。 ２１．更に１種または複数の中性脂肪を含むことを特徴とする請求項１から２０ のいずれか一項に記載の医薬組成物。 ２２．前記１種または複数の中性脂肪が生理的条件下で両性であるかまたはイオ ン電荷が欠けている合成または天然の脂質から選択されることを特徴とする請求 項２１に記載の医薬組成物。 ２３．前記１種または複数の中性脂肪が、ジオレオイルホスファチジルエタノー ルアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイル−パルミトイルホスファチジルエタノールア ミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイル、−パルミトイル、−ミリストイルホスフ ァチジルエタノールアミン、及び、１〜３回Ｎ−メチル化したそれらの誘導体、 ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、 グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシド） 、スフィンゴリピド（特にスフィンゴミエリン）、及び、アシアロガングリオシ ド（特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）から選択されることを特徴とする請求項２ １または２２に記載の医薬組成物。 ２４．核酸の試験管内、生体外及び／または生体内導入を目的とする請求項１か ら２３のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。 ２５．対応するレセプターまたは抗原を発現する細胞に核酸を適正に導入するこ とを目的とする、細胞性レセプターのリガンド、抗体または抗体誘導体に結合し た請求項１または２に記載の化合物の使用。