SK40098A3 - Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof - Google Patents
Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- SK40098A3 SK40098A3 SK400-98A SK40098A SK40098A3 SK 40098 A3 SK40098 A3 SK 40098A3 SK 40098 A SK40098 A SK 40098A SK 40098 A3 SK40098 A3 SK 40098A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- pharmaceutical composition
- composition according
- nucleic acid
- group
- compound
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Oblasť technikyTechnical field
Vynález sa týka oblasti génovej terapie a vzťahuje sa predovšetkým na in vitro, ex vivo a/alebo 'in vivo prenos genetického materiálu. Je tu navrhnutá predovšetkým nová farmaceutická kompozícia vhodná na účinnú transfekciu buniek. Vynález sa týka predovšetkým použitia tejto zlúčeniny.The invention relates to the field of gene therapy and relates in particular to the in vitro, ex vivo and / or in vivo transfer of genetic material. In particular, there is provided a new pharmaceutical composition suitable for efficient transfection of cells. In particular, the invention relates to the use of this compound.
Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Nedostatočnosť alebo anomália na úrovni chromozómov (mutácie, aberantné expresie, atď.) sú príčinou mnohých dedičných alebo nededičných ochorení. Z tohto hľadiska je konvenčná medicína už dlho bezmocná. V súčasnosti, keď dochádza k rozvoju génovej terapie, sa predpokladá, že bude možné uvedený typ chromozómovej aberácie v budúcnosti korigovať alebo týmto aberáciám dokonca predchádzať. Tento nový typ liečebnej metódy spočíva v tom, že sa do bunky alebo orgánu s aberáciou uvedeného typu vnesie genetická informácia na korekciu uvedenej nedostatočnosti alebo anomálie, alebo tiež na expresiu zainteresovaného terapeutického proteínu.Insufficiency or anomaly at chromosome level (mutations, aberrant expression, etc.) is the cause of many hereditary or non-hereditary diseases. In this respect, conventional medicine has long been powerless. Now that gene therapy is developing, it is expected that this type of chromosome aberration can be corrected in the future or even prevented. This new type of treatment method consists in introducing genetic information into a cell or organ with aberration of said type to correct said deficiency or anomaly, or also to express the therapeutic protein of interest.
Hlavnú prekážku, ktorá bráni preniknutiu nukleovej kyseliny do cieľovej bunky alebo do cieľového orgánu, predstavuje veľkosť a polyaniónový charakter uvedenej nukleovej kyseliny, ktoré bránia prieniku nukleovej kyseliny naprieč bunkovou membránou.The major obstacle to preventing the nucleic acid from penetrating the target cell or target organ is the size and polyanionic nature of said nucleic acid, which hinder the penetration of the nucleic acid across the cell membrane.
Na odstránenie tejto prekážky boli v súčasnosti navrhnuté rôzne techniky, z ktorých možno uviesť predovšetkým transfekciu nahej DNA cez plazmatickú membránu in vivo (W090/11092) a transfekciu DNA pomocou transfekčného vektora.Various techniques have been proposed to overcome this obstacle, including, in particular, transfection of naked DNA across the plasma membrane in vivo (WO90 / 11092) and transfection of DNA using a transfection vector.
Pokial ide o transfekciu nahej DNA, dosahuje sa tu ešte stále velmi nízka účinnosť. Nahé nukleové kyseliny majú krátky polčas života vzhľadom na ich degradáciu pôsobením enzýmov a ich vylučovanie močovými cestami.When it comes to naked DNA transfection, there is still very low efficiency. Naked nucleic acids have a short half-life due to their degradation by enzymes and their excretion via the urinary tract.
Pokiaľ ide o druhú z uvedených techník, táto navrhuje v podstate dve základné stratégie.As regards the latter, it essentially proposes two basic strategies.
Prvá z týchto stratégií využíva prirodzené transfekčné vektory, ako sú vírusy. Takto sa navrhlo použitie adenovírusov, herpesvírusov, retrovírusov a v nedávnej dobe aj adenopríbuzných vírusov ako vektorov na uvedenú transfekciu. Ukázalo sa, že tieto vektory sú účinné z hľadiska transfekcie, avšak bohužiaľ nie je možné úplne vylúčiť určité riziká patogénnosti, repllkácie alebo imunogénnosti, ktoré sú prirodzenou vlastnosťou ich vírusového charakteru.The first of these strategies utilizes natural transfection vectors such as viruses. Thus, it has been proposed to use adenoviruses, herpesviruses, retroviruses and, more recently, adenoviruses as vectors for said transfection. These vectors have been shown to be effective in transfection, but unfortunately, certain risks of pathogenicity, replication or immunogenicity, which are a natural property of their viral nature, cannot be completely excluded.
Výhoda druhej z uvedených stratégií spočíva v tom, že sa používajú nevirulentné činidlá, ktoré sú schopné podporiť prenos DNA do eukaryotických buniek a jej expresiu.An advantage of the latter strategy is that non-virulent agents are used which are capable of promoting the transfer of DNA into eukaryotic cells and its expression.
Predmet vynálezu sa dotýka tejto druhej stratégie.The present invention relates to this second strategy.
Chemické alebo biochemické vektory predstavujú výhodnú alternatívu prirodzeným vírusom a to predovšetkým vzhladom na to, že pri týchto chemických alebo biochemických vektoroch neexistuje možnosť imunologickej odpovede alebo rekombinácie vírusu. Tieto vyššie uvedené vektory nie sú potenciálne patogénne, riziko pomnoženia DNA vo vnútri týchto vektorov je nulové a nie je im pripisované žiadne obmedzenie, pokiaľ ide o velkosť transfekovanej DNA.Chemical or biochemical vectors represent a preferred alternative to natural viruses, especially since there is no possibility of immunological response or recombination of the virus in these chemical or biochemical vectors. These above-mentioned vectors are not potentially pathogenic, the risk of DNA amplification within these vectors is zero and they are not ascribed any restriction on the size of the transfected DNA.
Tieto syntetické vektory majú dve základné funkcie, ktorými sú kondenzácia DNA určenej na transfekciu a podpora jej väzby na bunku, prienik cez plazmatickú' membránu a prípadne cez obe jadrové membrány.These synthetic vectors have two basic functions which are the condensation of the DNA to be transfected and the promotion of its binding to the cell, penetration through the plasma membrane and possibly both nuclear membranes.
Vzhladom na polyaniónový charakter DNA, nemá DNA žiadnu prirodzenú afinitu k plazmatickej membráne buniek s rovnakým polyaniónovým charakterom. Na elimináciu tohto nedostatku nevírusové vektory majú všeobecne všetky náboje polykatiónové.Due to the polyanionic nature of DNA, DNA has no natural affinity for the plasma membrane of cells of the same polyanionic nature. To eliminate this deficiency, non-viral vectors generally have all polycationic charges.
Z dosial vyvinutých syntetických vektorov sú najvýhodnejšie vektory katiónové polyméry typu polylyzín a DEAE-dextrán alebo takisto katiónové, či lipofekčné lipidy. Tieto vektory majú schopnosť kondenzovať DNA a podporiť jej schopnosť viazať sa na bunkovú membránu. V nedávnom čase sa navrhla cielená transfekcia, ktorá je sprostredkovaná receptorom. Táto technika využíva princíp kondenzácie DNA vďaka katiónovému polyméru, pričom sa dosahuje viazanie získaného komplexu pomocou chemickej kopulácie, ktorá prebieha medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora prítomného na povrchu typu bunky, ktorá je modifikovaná. Takisto sa popísalo vytriedenie receptorov na transferín, inzulín alebo receptory asialoglykoproteínov hepatocytov.Of the synthetic vectors developed so far, the most preferred vectors are cationic polymers of the polylysine and DEAE-dextran type, or also cationic or lipofectional lipids. These vectors have the ability to condense DNA and enhance its ability to bind to the cell membrane. Recently, targeted transfection has been proposed that is mediated by the receptor. This technique utilizes the principle of DNA condensation due to the cationic polymer, whereby the complex obtained is bound by chemical coupling that occurs between the cationic polymer and the membrane receptor ligand present on the cell-type surface that is modified. Sorting of transferrin, insulin or hepatocyte asialoglycoprotein receptors has also been described.
Napriek uvedenému, všetky doteraz navrhované syntetické vektory sú ešte velmi vzdialené tomu, kedy budú rovnako účinné ako vírusové vektory. Môže to byť predovšetkým dôsledok nedostatočnej kondenzácie DNA určenej na transfekciu alebo dôsledok ťažkostí, s ktorými sa transfekovaná DNA stretáva pri výstupe z endozómu a pri prenikaní do bunkového jadra. V skutočnosti transport DNA do jadra eukaryotickej bunky v pokojovom stave spôsobuje evidentné problémy, pretože rozmery jadrových pórov umožňujú difúziu proteínov iba s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 60 000 kDA (pozri bližšie: Davis a kol.. Ann. Rev. Biochem., 1995, 64, 865-896). Plazmatická DNA, ktorá má molekulovú hmotnosť vyššiu ako 106, nie je teda schopná preniknúť prirodzeným spôsobom do jadra bunky iba jednoduchou difúziou.Despite this, all synthetic vectors hitherto proposed are still far from being as effective as viral vectors. In particular, this may be due to insufficient condensation of the DNA to be transfected or to the difficulty that the transfected DNA encounters in exiting the endosome and in penetrating the cell nucleus. In fact, the transport of DNA to the nucleus of a eukaryotic cell at rest causes evident problems, since the core pore dimensions allow for diffusion of proteins with only a molecular weight of less than 60,000 kDA (see more in: Davis et al. Ann. Rev. Biochem., 1995, 64 , 865-896). Plasma DNA, having a molecular weight greater than 10 6 , is therefore unable to penetrate naturally into the cell nucleus by simple diffusion only.
Cieľom vynálezu je navrhnúť riešenie tohto problému.It is an object of the invention to propose a solution to this problem.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Vynález navrhuje farmaceutickú kompozíciu použiteľnú na transfekciu minimálne jednej nukleovej kyseliny a jej podstata spočíva v tom, že okrem uvedenej nukleovej kyseliny a aspoň jedného transfekčného činidla, obsahuje minimálne jednu zlúčeninu, ktorá je schopná viazať DNA a preniesť ju do jadra.The present invention provides a pharmaceutical composition useful for transfecting at least one nucleic acid, and comprising, in addition to said nucleic acid and at least one transfecting agent, at least one compound capable of binding DNA and transferring it to the nucleus.
Zlúčenina, ktorá je schopná viazať DNA, zahŕňa v rámci vynálezu akúkoľvek zlúčeninu schopnú viazať sa aspoň čiastočne na DNA, ktorá má byť prenášaná. Pokial ide o schopnosť prenášať uvedenú DNA, touto schopnosťou sa rozumie v rámci vynálezu schopnosť účinne niesť uvedenú DNA naprieč rôznymi bunkovými membránami alebo jadrovými membránami, až ju nakoniec dopraviť do jadra ošetrovanej bunky. V tomto špecifickom prípade je možné oblasť väzby DNA zvoliť z množstva špecifických regulačných proteinov, ktoré sú schopné viazať sa napríklad na špecifické sekvencie alebo naopak z proteinov, o ktorých je známe, že majú sekvenčne nezávislú afinitu k DNA. Pokial ide o oblasť, ktorá sprostredkováva transport do jadra, môže to byť napríklad sekvencia označovaná ako nls (nuclear localisation sequence). Takéto sekvencie môžu byť odvodené v bipartitnej zhode odvodenej z nukleoplazmínu alebo v zhode antigénu T odvodeným z SV40.A compound capable of binding DNA includes within the scope of the invention any compound capable of binding at least partially to the DNA to be transferred. With respect to the ability to transmit said DNA, this ability is to be understood, within the scope of the invention, the ability to efficiently carry said DNA across different cell membranes or nuclear membranes until it is ultimately delivered to the nucleus of the cell to be treated. In this specific case, the DNA binding region may be selected from a number of specific regulatory proteins that are capable of binding, for example, to specific sequences, or vice versa, from proteins known to have sequence-independent affinity for DNA. For example, if it is a region that mediates transport to the nucleus, it may be a sequence referred to as nls (nuclear localization sequence). Such sequences may be derived in nucleoplasmin-derived bipartite consensus or SV40-derived antigen T consensus.
V rámci uskutočnenia špecifickej formy sa vynález dotýka farmaceutickej kompozície použiteľnej na transfekciu minimálne jednej nukleovej kyseliny, ktorej podstata spočíva v tom, že okrem uvedenej nukleovej kyseliny a aspoň jedného transfekčného činidla, obsahuje minimálne jednu zlúčeninu, ktorá patrí ku skupine proteinov HMG, alebo niektorému z jeho derivátov.In a specific embodiment, the invention relates to a pharmaceutical composition for the transfection of at least one nucleic acid, comprising, in addition to said nucleic acid and at least one transfecting agent, at least one compound belonging to the HMG family of proteins or one of the HMG proteins. of its derivatives.
Proteíny typu HMG (High Mobility Group) sú proteíny bohaté na nabité aminokyseliny a s molekulovou hmotnosťou menšou ako 30000 kDa. Sú rozpustné v 2 až 5% kyseline chloristej a sú klasicky extrahované s 0,35M chloridom sodným z chromatínu.High Mobility Group (HMG) type proteins are proteins rich in charged amino acids and having a molecular weight of less than 30,000 kDa. They are soluble in 2 to 5% perchloric acid and are classically extracted with 0.35M sodium chloride from chromatin.
Proteíny HMG sú klasicky rozdelené na tri skupiny: proteíny HMG1/2 s hmotnosťou okolo 25000, proteíny HMG14/17 s molekulovou hmotnosťou okolo 10-12000 a proteíny HMGI/Y, ktoré majú zloženie podobné proteínom HMG14/17, avšak majú inú tkanivovú distribúciu v priebehu ontogenézy. Je známe, že u všetkých troch skupín primárna sekvencia v priebehu evolúcie zostala zachovaná.HMG proteins are classically divided into three groups: HMG1 / 2 proteins weighing about 25000, HMG14 / 17 proteins having a molecular weight of about 10-12000, and HMGI / Y proteins having a composition similar to HMG14 / 17 but having a different tissue distribution in the ontogenesis. It is known that in all three groups, the primary sequence was retained during evolution.
Pokial ide o konkrétne proteíny skupiny HMG1/2, sú tieto proteíny charakteristické prítomnosťou sekvencie 80 aminokyselín s bázickou prevahou (náboj +20), ktorá je označovaná ako HMG box a ktorá tvorí DNA väzbovú oblasť. V rámci tejto skupiny sa rozlišujú proteíny schopné viazať sa na špecifické sekvencie dvojvláknovej DNA a proteíny, ktorých väzbová špecifickosť spočíva v špecifickej trojrozmernej štruktúre DNA. Do prvej h5 kategórie patria proteíny UBF; SRY; TCF1, ABF2, ktoré stimulujú transkripciu špecifických génov (Greiss . E.A. a kol., J. Mol. Evol. (1993) 37: 204-210). Sekvencia každého z týchto proteínov obsahuje jeden alebo niekoľko HMG boxov. Do druhej kategórie patria proteíny HMG1 a HMG2. Ich primárna sekvencia je charakteristická prítomnosťou dvoch HMG boxov a jednej kyslej sekvencie na C-konci (Bustin M., B.B.A (1990) 1094: 231-243).With respect to particular HMG1 / 2 family proteins, these proteins are characterized by the presence of an 80 amino acid sequence with a basic predominance (+20 charge), referred to as the HMG box, which forms the DNA binding region. Within this group, proteins capable of binding to specific double-stranded DNA sequences and proteins whose binding specificity lies in the specific three-dimensional DNA structure are distinguished. The first h5 category includes UBF proteins; SRY; TCF1, ABF2, which stimulate transcription of specific genes (Greiss. E.A. et al., J. Mol. Evol. (1993) 37: 204-210). The sequence of each of these proteins comprises one or more HMG boxes. The second category includes the HMG1 and HMG2 proteins. Their primary sequence is characterized by the presence of two HMG boxes and one acidic sequence at the C-terminus (Bustin M., B.B.A (1990) 1094: 231-243).
Tieto proteíny sa špecifickým spôsobom viažu na palindrómové sekvencie DNA prečnievajúce do krížovej štruktúry na alebo (medzivláknové párovanie na úrovni palindrómu) sekvencie DNA, ktoré majú značné zakrivenie. Obidva tieto typy štruktúr majú spoločné to, že tu existuje rozšírenie malej ryhy DNA, ktorý sa takto stane schopnou prispôsobiť sa väzbe proteínov typu HMG1/2. Fyziologická funkcia proteínov HMG1 a HMG2 nebola až doteraz objasnená. No prinajmenšom sa dokázalo, že teľací proteín je aktívne transportovaný do jadra cicavčích buniek (L. Kuehl a kol., J. Biol. Chem. 1985, 260, 10361-10368).These proteins bind specifically to palindrome DNA sequences that cross into a cross-structure to or (inter-strand pairing at the palindrome level) DNA sequences that have a significant curvature. Both these types of structures have in common that there is a widening of the small DNA groove, which thus becomes able to adapt to the binding of HMG1 / 2 type proteins. The physiological function of the HMG1 and HMG2 proteins has not yet been elucidated. However, at least it has been shown that the calf protein is actively transported into the nucleus of mammalian cells (L. Kuehl et al., J. Biol. Chem. 1985, 260, 10361-10368).
Prihlasovateľ teraz úplne nečakane dokázal, že je možné využiť uvedenú vlastnosť proteínov HMG, a to ich schopnosť na účinnú podporu kyselín do jadra aktívneho transportu do jadra buniek, transfekcie heterologických nukleových ošetrovaných buniek s minimálne jedným pripojeným transfekčným činidlom.The Applicant has now unexpectedly demonstrated that it is possible to utilize said property of HMG proteins, namely, their ability to efficiently support acids into the nucleus of active transport into the nucleus of cells, transfecting heterologous nucleic acid treated cells with at least one transfection agent attached.
Vyššie uvedený výraz derivát zahŕňa v rámci vynálezu ľubovoľný peptid, pseudopeptid (peptid s nebiochemickými prvkami) alebo proteín odlišný od zlúčeniny, tak ako bola definovaná vyššie, získaný jednou alebo niekoľkými modifikáciami genetického alebo chemického charakteru. Pod pojmom modifikácie genetického alebo chemického charakteru sa tu rozumie akákoľvek mutácia, substitúcia, delécia, adícia alebo modifikácia jedného či niekoľkých zvyškov napríklad uvažovaného proteínu. Presnejšie vyjadrené, chemickou modifikáciou sa rozumie modifikácia peptidu alebo proteínu uskutočnená reakciou alebo chemickým modifikovaním biologickej či nebiologickej molekuly, alebo biologických či nebiologických molekúl na určitom počte proteínových zvyškov. Pod pojmom akákoľvek chemickou genetická modifikácia sa tu rozumie akákoľvek peptidová sekvencia, ktorej DNA hybridizuje s uvedenými sekvenciami alebo fragmentmi týchto sekvencií a jej produkt vykazuje indikované aktivity. Takýto derivát môže byť vytvorený na rôzne účely, napríklad na zvýšenie afinity zodpovedajúceho polypeptidu k jeho DNA ligandu, na zlepšenie jeho produkčnej hladiny, na zvýšenie jeho rezistencie voči proteázam, na zvýšenie alebo modifikáciu niektorého z jeho účinkov alebo na získanie nových farmakokinetických alebo biologických vlastností.As used herein, the term derivative includes any peptide, pseudopeptide (non-biochemical peptide) or protein other than the compound as defined above, obtained by one or more modifications of a genetic or chemical nature. By genetic or chemical modification is meant herein any mutation, substitution, deletion, addition or modification of one or more residues of, for example, a protein of interest. More specifically, chemical modification means modification of a peptide or protein by reaction or chemical modification of a biological or non-biological molecule or biological or non-biological molecules on a number of protein residues. By any chemical genetic modification is meant herein any peptide sequence whose DNA hybridizes to said sequences or fragments of these sequences and its product exhibits the indicated activities. Such a derivative may be made for various purposes, for example, to increase the affinity of a corresponding polypeptide for its DNA ligand, to improve its production level, to increase its protease resistance, to enhance or modify any of its effects, or to acquire new pharmacokinetic or biological properties.
Z derivátov získaných adíciou je možné uviesť napríklad chimérické peptidové sekvencie obsahujúce dodatkovú heterologickú časť pripojenú k jednému koncu. Výraz derivát rovnako zahŕňa proteínové sekvencie, ktoré sú homologické s uvažovanou sekvenciou a ktoré pochádzajú z iných bunkových zdrojov, predovšetkým z ľudských buniek alebo z buniek iných organizmov a majú účinnosť rovnakého typu. Takéto homologické sekvencie môžu byť získavané hybridizačnými pokusmi s DNA. Tieto hybridizácie môžu byť uskutočňované s použitím bánk nukleových kyselín a s použitím sondy tvorenej natívnou sekvenciou alebo fragmentom tejto natívnej sekvencie za konvenčných rigoróznych podmienok (Maniatis a kol.) (pozri všeobecné techniky molekulárnej biológie) alebo výhodne za sprísnených podmienok.Among the derivatives obtained by the addition, for example, chimeric peptide sequences containing an additional heterologous moiety attached to one end may be mentioned. The term derivative also includes protein sequences that are homologous to the sequence of interest and that are derived from other cellular sources, particularly human cells or cells of other organisms, and have the same type of activity. Such homologous sequences can be obtained by DNA hybridization experiments. These hybridizations can be performed using nucleic acid banks and using a probe consisting of a native sequence or a fragment of the native sequence under conventional rigorous conditions (Maniatis et al.) (See general molecular biology techniques) or preferably under more stringent conditions.
Okrem toho sa v rámci vynálezu predpokladá takisto využitie výraznej afinity niektorých proteínov skupiny HMG alebo ich derivátov k sekundárnym štruktúram prítomným na dvojvláknovej DNA. Môže ísť hlavne o štvorvláknové štruktúry, u ktorých sa zistilo, že HMGl potkana má k nim veľmi silnú afinitu (Bianchi a kol., Science 1989, 243, 1056-1059). Takéto štruktúry môžu byť tiež získané z prirodzených sekvencií, ako sú ITR sekvencie vírusov príbuzných s adenovírusmi, alebo môžu byť získané úplne synteticky z umelých palindrómov.In addition, it is contemplated within the scope of the invention to utilize the significant affinity of some HMG family proteins or derivatives thereof to the secondary structures present on the double stranded DNA. These may be, in particular, four-stranded structures which have been found to have a very strong affinity for rat HMG1 (Bianchi et al., Science 1989, 243, 1056-1059). Such structures may also be obtained from natural sequences, such as ITR sequences of adenovirus-related viruses, or may be obtained wholly synthetically from artificial palindromes.
V rámci výhodnej formy uskutočnenia vynálezu je použitá zlúčenina vybraná zo skupiny proteínov typu HMGl, 2, I, Y, 14 a 17 a ich derivátov. Táto zlúčenina je najvýhodnejšie vytváraná celkom alebo časťou ľudského proteínu HMGl alebo niektorého z derivátov alebo homológov, ktoré boli definované vyššie.In a preferred embodiment of the invention, the compound used is selected from the group of HMG1, 2, I, Y, 14 and 17 type proteins and derivatives thereof. Most preferably, the compound is formed by all or part of the human HMG1 protein or any of the derivatives or homologs as defined above.
. ľ ··*; v ‘. ¾ ·· *; in '
V rámci výnimočne výhodnej formy uskutočnenia vynálezu obsahujú kompozície podlá vynálezu ešte smerovací prvok, ktorý umožňuje orientovať prenos nukleovej kyseliny. Tento smerovací prvok môže byť mimobunkovým smerovacím prvkom umožňujúcim orientovať prenos nukleovej kyseliny do určitých typov buniek alebo do určitých požadovaných tkanív (nádorové bunky, pečeňové bunky, hematopoetické bunky atď.). Môže takisto ísť o vnútrobunkový smerovací prvok umožňujúci orientovať prenos nukleovej kyseliny do niektorých uprednostnených častí bunky (mitochondrie, jadro, atď.).In a particularly preferred embodiment of the invention, the compositions according to the invention also comprise a targeting element which makes it possible to orient the transfer of the nucleic acid. This targeting element may be an extracellular targeting element allowing the nucleic acid transfer to be directed to certain cell types or to certain desired tissues (tumor cells, liver cells, hematopoietic cells, etc.). It may also be an intracellular targeting element that allows the nucleic acid transfer to be directed to some preferred parts of the cell (mitochondria, nucleus, etc.).
Podlá vynálezu je výhodnejšie viazať uvedený smerovací prvok kovalentne alebo nekovalentne na zlúčeninu. Tento smerovací prvok môže byť takisto viazaný na nukleovú kyselinu. V rámci výhodnej formy uskutočnenia vynálezu je uvedená zlúčenina viazaná prostredníctvom dodatkovej heterologickej časti, viazanej na jeden z jej koncov, k bunkovému receptorovému ligandu prítomnému na povrchu bunkového typu, ako je napríklad cukor, transferín, inzulín, alebo asialo-orosomukoidný proteín. Môže tiež ísť o ligand vnútrobunkového typu, akým je signálna sekvencia lokalizácie v jadre, nls, ktorá uprednostňuje akumuláciu transfekovanej DNA v jadre.It is more preferred according to the invention to bind said targeting element covalently or non-covalently to the compound. This targeting element may also be linked to a nucleic acid. In a preferred embodiment of the invention said compound is bound via an additional heterologous moiety bound to one of its ends to a cell receptor ligand present on a cell type surface, such as a sugar, transferrin, insulin, or asialo-orosomucoid protein. It may also be an intracellular type ligand, such as the nucleus localization signal sequence, nls, which favors the accumulation of transfected DNA in the nucleus.
Zo smerovacích prvkov použiteľných v rámci vynálezu je možné uviesť cukry, peptidy, oligonukleotidy alebo lipidy. Výhodne ide cukry alebo peptidy, akými sú protilátky alebo fragmenty protilátok, bunkové receptorové ligandy alebo fragmenty týchto ligandov, receptory alebo fragmenty týchto receptorov, atď. Predovšetkým môže ísť o receptory rastových faktorov, receptorov cytokínov, receptorov bunkových lektínov, alebo o receptory adhéznych proteínov. Môže takisto ísť o receptor transferínu, HDL a LDL. Smerovacím prvkom môže byť tiež cukor umožňujúci zacielenie lektínov, ako sú asialoglykoproteínové receptory, alebo tiež fragment protilátky Fab, ktorý umožňuje zacielenie receptorov Fc fragmentu imunoglobulínov.The targeting elements useful in the present invention include sugars, peptides, oligonucleotides or lipids. Preferably, sugars or peptides such as antibodies or antibody fragments, cell receptor ligands or fragments thereof, receptors or fragments thereof, etc. are used. In particular, they may be growth factor receptors, cytokine receptors, cell lectin receptors, or adhesion protein receptors. It may also be a transferrin receptor, HDL and LDL. The targeting element may also be a sugar enabling targeting of lectins, such as asialoglycoprotein receptors, or alternatively a Fab antibody fragment that allows targeting of Fc receptors of the immunoglobulin fragment.
Zlúčenina môže byť podľa vynálezu navyše výhodne polyglykozylovaná, sulfónovaná alebo fosforylovaná, alebo modifikovaná s komplexnými cukrami či lipofilnou zlúčeninou, ako je napríklad polyuhlíkatý reťazec alebo derivát cholesterolu.In addition, the compound according to the invention may advantageously be polyglycosylated, sulfonated or phosphorylated, or modified with complex sugars or a lipophilic compound, such as a polycarbonate chain or a cholesterol derivative.
Kompozícia podlá vynálezu môže samozrejme obsahovať niekoľko zlúčenín rôznej povahy podlá vynálezu. Rovnako sa ukázalo, že okrem vyššie popísaných zlúčenín usmerňujúcich prenos do jadra, je možné pripojiť k zlúčenine podlá vynálezu ešte druhú zlúčeninu, charakteristickú jej schopnosťou kondenzovať DNA. Takéto zlúčeniny sú menovite popísané v prihláške FR 95/01865.The composition of the invention may, of course, contain several compounds of different nature according to the invention. It has also been shown that, in addition to the nucleotide transfer regulating compounds described above, it is possible to attach to the compound of the invention a second compound, characterized by its ability to condense DNA. Such compounds are specifically disclosed in FR 95/01865.
Zlúčenina podlá vynálezu je prítomná v množstve, ktoré je dostatočné na reakciu s nukleovou kyselinou podlá vynálezu. Takto sa hmotnostný pomer zlúčenina/nukleová kyselina pohybuje v rozsahu od 0,01 po 5 a výhodnejšie od 0,25 po 0,5.The compound of the invention is present in an amount sufficient to react with the nucleic acid of the invention. Thus, the weight ratio of compound / nucleic acid ranges from 0.01 to 5 and more preferably from 0.25 to 0.5.
Pokial ide o transfekčné činidlo prítomné v kompozícii podlá vynálezu, je toto činidlo zvolené zo skupiny, ktorá zahŕňa katiónové polyméry a lipofekčné činidlá.The transfection agent present in the composition of the invention is selected from the group consisting of cationic polymers and lipofectants.
V rámci vynálezu je katiónovým polymérom výhodne zlúčenina so všeobecným vzorcom I (I) v ktoromWithin the scope of the invention, the cationic polymer is preferably a compound of formula I (I) wherein:
R môže znamenať atóm vodíka alebo skupinu všeobecného vzorcaR can be hydrogen or a radical of formula
n znamená celé číslo od 2 do 10 a p a q sú celé čísla, pričom platí, že súčet p+q ma takú hodnotu, že molekulová hmotnosť polyméru sa pohybuje v rozsahu 100 a 107 Da.n is an integer from 2 to 10 and p and q are integers, it being understood that the sum p + q being such that the molecular weight of the polymer is between 100 and 10 7 Da.
Je samozrejmé, že sa hodnota všeobecného substituenta n môže meniť v jednotlivých štruktúrnych podjednotkách, ktorých počet v zlúčenine všeobecného vzorca I je vyjadrený všeobecným symbolom. Takýto všeobecný vzorec zahŕňa ako homopolyméry, tak aj heteropolyméry.It is understood that the value of the general substituent n may vary in the individual structural subunits, the number of which in the compound of the formula I is represented by the general symbol. Such a general formula includes both homopolymers and heteropolymers.
Výhodnejšie vo všeobecnom vzorci n znamená číslo od 2 po 5. Mimoriadne výhodné vlastnosti majú polyméry polyetylénimínu. (PEI) a polypropylénimínu (PPI) . Vhodnými polymérmi na realizáciu vynálezu sú polyméry, ktorých molekulová hmotnosť sa pohybuje medzi 103 až 5.106. Ako príklad je možné uviesť polyetylénimín s molekulovou hmotnosťou 50000 Da (PEI50K) alebo polyetylénimín s molekulovou hmotnosťou 800000 Da (PEI800K).More preferably, in the formula, n is a number from 2 to 5. Polyethyleneimine polymers have particularly advantageous properties. (PEI) and polypropyleneimine (PPI). Suitable polymers for carrying out the invention are polymers having a molecular weight of between 10 3 and 5 × 10 6 . Examples are polyethyleneimine with a molecular weight of 50000 Da (PEI50K) or polyethyleneimine with a molecular weight of 800000 Da (PEI800K).
Polyetylénimíny PEI50K a PEI800K sú komerčne dostupné. Pokiaľ ide o ostatné polyméry všeobecného vzorca I, môžu byť tieto polyméry pripravené postupom, ktorý je popísaný v patentovej prihláške FR 94 08735.The polyethyleneimines PEI50K and PEI800K are commercially available. With respect to the other polymers of the general formula I, these polymers can be prepared by the process described in patent application FR 94 08735.
Aby sa dosiahol optimálny účinok kompozícií podľa vynálezu, sú príslušné podiely polyméru a nukleovej kyseliny vybrané tak, že molárny pomer R amínov polyméru k fosfátom nukleovej kyseliny sa pohybuje od 0,5 do 50, výhodnejšie od 5 do 30. Mimoriadne výhodné výsledky sa dosiahli s použitím 5 až 15 amínových ekvivalentov na náboj nukleovej kyseliny.In order to achieve an optimum effect of the compositions according to the invention, the respective proportions of polymer and nucleic acid are chosen such that the molar ratio R of the amines of the polymer to the phosphates of the nucleic acid is from 0.5 to 50, more preferably from 5 to 30. using 5 to 15 amine equivalents per nucleic acid charge.
Pokiaľ ide o lipofekčné činidlá, ide o amfifilné molekuly, ktoré obsahujú minimálne jednu katiónovú hydrofilnú oblasť, napríklad polyamín, a lipofilnú oblasť. Katiónová oblasť, tvorená výhodne polyamínom s katiónovým nábojom, je schopná viazať sa reverzibilne s nukleovou kyselinou, ktorá ma negatívny náboj. Táto interakcia silne kondenzuje nukleovú kyselinu. Lipofilná oblasť túto iónovú interakciu zneprístupňuje pred vonkajším vodným prostredím tým, že vytvorenú nukleolipidovú časticu pokrýva lipidovým povlakom.With respect to lipofectants, these are amphiphilic molecules that comprise at least one cationic hydrophilic region, for example a polyamine, and a lipophilic region. The cationic region, preferably formed by a cationically charged polyamine, is capable of binding reversibly to a nucleic acid having a negative charge. This interaction strongly condenses the nucleic acid. The lipophilic region makes this ionic interaction inaccessible to the external aqueous environment by covering the formed nucleolipid particle with a lipid coating.
Tieto lipofekčné činidlá môžu byť výhodne vybrané z (II) polyamínov, ktorých oblasť zodpovedá všeobecnému vzorcu II v ktorom m znamená celé číslo väčšie alebo rovné 2 a n je celé číslo väčšie alebo rovné 1, pričom hodnota m sa môže meniť v jednotlivých štruktúrnych jednotkách, ktorých počet v zlúčenine so všeobecným vzorcom II je vyjadrený všeobecným symbolom n. Výhodne sa m pohybuje od 2 do 6 a n sa pohybuje od 1 po 5. Ešte výhodnejšie je polyamínová oblasť tvorená spermínom, thermínom alebo ich analógmi, ktoré si zachovali schopnosť viazať sa na DNA. Pokial ide o lipofilnú oblasť, je táto oblasť tvorená aspoň jedným nasýteným alebo nenasýtením reťazcom cholesterolu, prírodným alebo syntetickým lipidom schopným tvoriť lamelárne alebo hexagonálne fázy, pričom uvedený uhlovodíkový reťazec je kovalentne viazaný na hydrofilnú oblasť.These lipofectants may preferably be selected from (II) polyamines whose region corresponds to formula II wherein m is an integer greater than or equal to 2 and n is an integer greater than or equal to 1, wherein m may vary in individual structural units whose the number in the compound of formula II is represented by the symbol n. Preferably, m ranges from 2 to 6 and n ranges from 1 to 5. Even more preferably, the polyamine region is comprised of spermine, thermin, or analogs thereof that retain the ability to bind to DNA. As regards the lipophilic region, the region comprises at least one saturated or unsaturated cholesterol chain, a natural or synthetic lipid capable of forming lamellar or hexagonal phases, said hydrocarbon chain being covalently bonded to the hydrophilic region.
Patentová prihláška EP 394 111 popisuje ďalšie lipopolyamíny so všeobecným vzorcom IIIPatent application EP 394 111 describes further lipopolyamines of the general formula III
R (III) v ktorom R znamená konkrétne skupinu so všeobecným vzorcom (RXR2) N-CO-CH-NH-CO-, ktoré je možné použiť v rámci vynálezu.R (III) wherein R is a particular group of the general formula (R X R 2 ) N-CO-CH-NH-CO- which can be used in the invention.
Ako príklad týchto lipopolyamínov možno menovite uviesť dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS) a 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidyletanolamín (DPPES).Examples of such lipopolyamines include, but are not limited to, dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS) and 5-carboxyspermylamide palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES).
Lipopolyamíny popísané v patentovej prihláške FR 9414596 môžu byť takisto výhodne použité ako transfekčné činidlo podlá vynálezu. Tieto lipopolyamíny majú vyššie uvedený všeobecný vzorec III, v ktorom R znamená skupinu (IV)The lipopolyamines described in patent application FR 9414596 can also advantageously be used as a transfection agent according to the invention. These lipopolyamines have the above general formula (III) in which R is a group (IV)
kdewhere
X a X' nezávisle jeden na druhom znamenajú atóm kyslíka, metylénovú skupinu -(CH2)q, v ktorej q je rovné 0, 1, 2 alebo 3, alebo amínovú skupinu -NH- alebo -NR'-, kde R' znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómyX and X 'independently of one another represent an oxygen atom, a methylene group - (CH 2 ) q in which q is 0, 1, 2 or 3, or an amino group -NH- or -NR'-, wherein R' represents alkyl having 1 to 4 carbon atoms
Y a Y' nezávisle jeden na druhom znamenajú metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo skupinu C=S,Y and Y 'independently of one another are methylene, carbonyl or C = S,
R3, R4 a R' nezávisle jeden na druhom znamenajú atóm vodíka alebo substituovanú či nesubstituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómyR 3 , R 4 and R 'independently of one another represent a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group containing 1 to 4 carbon atoms
Rb znamená derivát cholesterolu alebo alkylamínovú skupinu -NR'R2, kde R1 a R2 nehzávisle jeden na druhom znamenajú nasýtenú alebo nenasýtenú, priamu alebo rozvetvenú alifatickú skupinu obsahujúcu 12 až 22 uhlíkových atómov aR b is a cholesterol derivative or an alkylamino group -NR'R 2 , wherein R 1 and R 2 independently of each other represent a saturated or unsaturated, straight or branched aliphatic group having 12 to 22 carbon atoms, and
P znamená číslo od 0 do 5P is a number from 0 to 5
Ako zástupcu lipopolyamínov možno menovite uviesť 2,5-bis(3-aminopropylamino) pentyl (dioktadecylkarbamoylmetoxy) acetát a 1,3-bis- (3-aminopropylamino) -2-propyl (dioktadecylkarbamoylmetoxy) acetát.Representative lipopolyamines include, but are not limited to, 2,5-bis (3-aminopropylamino) pentyl (dioctadecylcarbamoylmethoxy) acetate and 1,3-bis- (3-aminopropylamino) -2-propyl (dioctadecylcarbamoylmethoxy) acetate.
Patentové prihlášky EP 394 111 a RF 94/14596 takisto opisujú spôsob použiteľný na prípravu zodpovedajúcich lipopolyamínov.Patent applications EP 394 111 and RF 94/14596 also disclose a method applicable to the preparation of the corresponding lipopolyamines.
Mimoriadne výhodne možno v rámci vynálezu použiť dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS), 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidyletanolamín (DPPES), 2,5-bis-(3-aminopropylamino) pentyl (dioktadecylkarbamoylmetoxy) acetát alebo 1,3-bis-(3-a12 minopropylamino)-2-propyl(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát.Particularly preferably within the scope of the invention, dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS), 5-carboxyspermylamide palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), 2,5-bis- (3-aminopropylamino) pentyl (dioctadecylcarbamoylmethoxy) acetate or 1,3-bis- (3) - may be used. 2-propyl (dioctadecylcarbamoylmethoxy) acetate.
Na dosiahnutie optimálneho účinku zlúčeniny podlá vynálezu sú podiely polyaminov a nukleových kyselín výhodne určené tak, aby sa pomer R kladných nábojov transfekčného činidla k záporným nábojom nukleovej kyseliny pohyboval od 0,1 do 10 a výhodnejšie od 0,5 do 2.For optimal performance of the compound of the invention, the proportions of polyamines and nucleic acids are preferably determined such that the ratio R of the positive charge of the transfecting agent to the negative charge of the nucleic acid is from 0.1 to 10, and more preferably from 0.5 to 2.
Prítomnosť zlúčeniny podlá vynálezu v transfekčnej kompozícii je výhodná z niekoľkých dôvodov. Predovšetkým dôsledkom jej prítomnosti je výrazne nižšia toxicita, čo v budúcnosti napríklad umožňuje transfekciu buniek, ktoré sú citlivé na charakter transfekčného činidla, ako sú napríklad hematopoetické bunky, ak sa použijú lipopolyamíny.The presence of a compound of the invention in the transfection composition is advantageous for several reasons. In particular, its presence results in a significantly lower toxicity, which, in the future, for example, allows the transfection of cells which are sensitive to the nature of the transfection agent, such as hematopoietic cells, when lipopolyamines are used.
V kompozíciách podľa vynálezu môže nukleovou kyselinou byť tak kyselina deoxyribonukleová, ako aj kyselina ribonukleová. Môže ísť o sekvencie prirodzeného alebo umelého pôvodu, menovite o genómovú DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA alebo o hybridné, syntetické alebo polosyntetické sekvencie. Tieto nukleové kyseliny môžu byť ľudského, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho, vírusového alebo iného pôvodu. Môžu byť získané akoukoľvek známou technikou, menovite vytriedením génových bánk, chemickou syntézou alebo enzýmovou modifikáciou sekvencií získaných s vytriedením bánk. Inak môžu byť zabudované do vektorov, ako sú plazmidové vektory.In the compositions of the invention, the nucleic acid may be both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid. These may be sequences of natural or artificial origin, namely genomic DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, or hybrid, synthetic or semisynthetic sequences. These nucleic acids may be of human, animal, plant, bacterial, viral or other origin. They may be obtained by any known technique, namely by gene bank screening, chemical synthesis, or by enzymatic modification of the sequences obtained with bank screening. Alternatively, they may be incorporated into vectors such as plasmid vectors.
Pokiaľ ide o deoxyribonukleové kyseliny, tieto kyseliny môžu byť jednovláknové alebo dvojvláknové. Tieto deoxyribonukleové kyseliny môžu kódovať terapeutické gény, regulačné sekvencie transkripcie alebo replikácie, antimediátorové sekvencie (antisens sekvencie), oblasti väzby na iné bunkové zložky, atď.With regard to deoxyribonucleic acids, these acids may be single-stranded or double-stranded. These deoxyribonucleic acids can encode therapeutic genes, transcription or replication regulatory sequences, antisense sequences (antisens sequences), regions of binding to other cellular components, etc.
Terapeutickým génom sa v rámci vynálezu rozumie menovite každý gén kódujúci proteínový produkt, ktorý má terapeutický účinok. Takto kódovaným proteínovým produktom môže byť proteín, peptid a podobne. Tento proteínový produkt môže byť homologický vzhladom na cielovú bunku (t.j. produkt, ktorý je normálne exprimovaný v cieľovej bunke v prípade, že táto bunka nevykazuje žiadnu patológiu). V tomto prípade expresia proteínu napríklad lieči nedostatočnú expresiu tohto proteínu alebo proteínu s obmedzenou aktivitou z dôvodu určitej modifikácie alebo uvedená expresia nadprodukuje uvedený proteín. Terapeutický gén môže tiež kódovať mutant bunkového proteínu, ktorý má vyššiu stabilitu, modifikovanú aktivitu a podobne. Uvedený proteínový produkt môže byť tiež heterologický vzhľadom na cieľovú bunku. V tomto prípade môže napríklad exprimovaný proteín čiastočne doplňovať alebo úplne substituovať nedostatočnú účinnosť v bunke, čím bunke umožňuje bojovať proti danej patológii alebo v nej stimulovať imunitnú odpoveď.In the context of the invention, a therapeutic gene is understood to mean, in particular, any gene encoding a protein product having a therapeutic effect. The protein product thus encoded may be a protein, a peptide and the like. This protein product may be homologous to the target cell (i.e., a product that is normally expressed in the target cell if the cell exhibits no pathology). In this case, protein expression, for example, treats under-expression of the protein or protein with limited activity due to some modification, or said expression overproduces said protein. The therapeutic gene may also encode a mutant of a cellular protein having greater stability, modified activity, and the like. Said protein product may also be heterologous to the target cell. In this case, for example, the expressed protein may partially or completely substitute the lack of efficacy in the cell, thereby allowing the cell to combat the pathology or stimulate the immune response therein.
Ako príklady terapeutických produktov možno v rámci vynálezu uviesť menovite enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF a podobne (FR 92 03120), rastové faktory, neurotransmitery (prenášače nervových vzruchov) alebo ich prekurzory, alebo enzýmy syntézy, tropické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotropín, atď., apolyproteíny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atď. (FR 93 05125), dystrofín alebo minidystrofin (FR 9111947), proteín CFTR spojený s mukoviscidózou, gény potláčajúce nádory (tumorsupresívne gény): p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, atď. (FR 93 04745), gény kódujúce faktory ovplyvňujúce koaguláciu (zrážanie krvi) : faktory VII, VIII, IX, gény zúčastnené na distribúcii DNA, sebevražedné gény (tymidín-kináza, cytozín-deamináza), atď.Examples of therapeutic products include, but are not limited to, enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF and the like (FR 92 03120), growth factors, neurotransmitters or their precursors, or synthesis enzymes, tropical factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotropin, etc., apolyproteins: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc. (FR 93 05125), dystrophin or minidystrophin (FR 9111947), mucoviscidosis-associated CFTR protein, tumor suppressor genes (tumorsuppressive genes): p53, Rb, RapIA, DCC, k-rev, etc. (FR 93 04745), genes encoding factors affecting coagulation (blood clotting): factors VII, VIII, IX, genes involved in DNA distribution, suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase), etc.
Terapeutickým génom môže byť tiež antimediátorový gén alebo antimediátorová sekvencia, ktorá v cieľovej bunke umožňuje reguláciu expresie génov alebo transkripcie bunkových mRNA. Takéto sekvencie . môžu byť prepísané v bunke napríklad vo forme RNA, ktoré sú komplementárne k bunkovým mRNA a blokovať tak ich transláciu na proteíny s použitím techniky popísanej v patente EP 140 308. Uvedené antimediátory takisto obsahujú sekvencie kódujúce ribozómy, ktoré sú schopné selektívne zničiť cieľové RNA (EP 321 201).The therapeutic gene may also be an antisense gene or an antisense sequence that allows regulation of gene expression or transcription of cellular mRNAs in a target cell. Such sequences. they may be transcribed in a cell, for example, in the form of RNAs that are complementary to cellular mRNAs and block their translation into proteins using the technique described in EP 140 308. Said antisense agents also contain ribosome-encoding sequences capable of selectively destroying target RNAs 321 201).
Ako už bolo vyššie uvedené, nukleová kyselina môže niesť jeden alebo niekoľko génov kódujúcich antigénový peptid, ktorý je schopný vyvolať v človeku alebo zvierati imunitnú odpoveď. V rámci tejto špecifickej formy uskutočnenia vynálezu, vynález teda umožňuje realizáciu buď vakcín alebo imunoterapeutickej liečby človeka alebo zvieraťa, zameranú najmä proti mikroorganizmom, vírusom, alebo rakovine. Menovite môže ísť o špecifické antigénové peptidy Epstein-Barrovej vírusu, vírusu HIV, vírusu hepatitídy B (EP 185 573), vírusu pseudobesnoty alebo o špecifické nádorové peptidy (EP 259 212) .As mentioned above, the nucleic acid may carry one or more genes encoding an antigenic peptide that is capable of eliciting an immune response in a human or animal. Accordingly, within this specific embodiment of the invention, the invention allows for the realization of either vaccines or immunotherapeutic treatments of a human or animal, particularly directed against microorganisms, viruses or cancer. Namely, they may be specific antigenic peptides of Epstein-Barr virus, HIV virus, hepatitis B virus (EP 185 573), pseudo-platelet virus or specific tumor peptides (EP 259 212).
Uvedená nukleová kyselina výhodne tiež obsahuje sekvencie umožňujúce expresiu terapeutického génu alebo génu kódujúceho antigénový peptid v žiadanej bunke alebo v žiadanom orgáne. Môže ísť o sekvencie, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu uvažovaného génu v prípade, keď sú tieto sekvencie schopné fungovať v infikovanej bunke. Môže tiež ísť o sekvencie iného pôvodu (zodpovedné za expresiu ostatných proteínov alebo dokonca o syntetické sekvencie). Menovite môže ísť o promótorové sekvencie eukaryotických alebo vírusových génov. Napríklad môže ísť o promótorové sekvencie pochádzajúce z genómu bunky, ktorá má byť infikovaná. Rovnako môže ísť o promótorové sekvencie pochádzajúce z genómu vírusov. Z tohto hľadiska možno napríklad uviesť promótory génov E1A, MLP, CMV, RSV, atď. . Okrem toho môžu byť tieto sekvencie modifikované pridaním aktivačných sekvencií, regulačných sekvencií, atď..Preferably, said nucleic acid also comprises sequences allowing expression of the therapeutic gene or gene encoding the antigenic peptide in the desired cell or organ. These may be sequences that are naturally responsible for the expression of the gene of interest in case these sequences are able to function in the infected cell. They may also be sequences of a different origin (responsible for the expression of other proteins or even synthetic sequences). Namely, they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences derived from the genome of the cell to be infected. They may also be promoter sequences derived from the genome of viruses. For example, the promoters of the E1A, MLP, CMV, RSV, etc. genes may be mentioned. . In addition, these sequences can be modified by adding activation sequences, regulatory sequences, etc.
Nukleová kyselina inakšie môže takisto niesť signálnu sekvenciu, konkrétne pred terapeutickým génom, smerujúcu terapeutický produkt, ktorý sa syntetizoval, do sekrečných ciest bunky. Touto signálnou sekvenciou môže byť prirodzená signálna sekvencia terapeutického produktu, alebo môže takisto ísť o každú inú funkčnú signálnu jednotku alebo o umelú signálnu sekvenciu.Alternatively, the nucleic acid may also carry a signal sequence, in particular upstream of the therapeutic gene, directing the therapeutic product that has been synthesized into the secretory pathways of the cell. The signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, or it may also be any other functional signal unit or an artificial signal sequence.
Kompozícia podľa vynálezu výhodne obsahuje navyše jeden alebo niekoľko neutrálnych lipidov. Takéto kompozície sú mimoriadne výhodné, hlavne v prípade, keď je pomer R nízky. Prihlasovateľ v skutočnosti dokázal, že pridanie neutrálneho lipidu umožňuje zlepšiť tvorbu nukleolipidových častíc, a čo je prekvapujúce, priaznivo ovplyvniť prenikanie častice do bunky v dôsledku stabilizácie membrány uvedenej bunky.The composition of the invention preferably comprises in addition one or more neutral lipids. Such compositions are particularly advantageous, especially when the R ratio is low. In fact, the Applicant has shown that the addition of a neutral lipid makes it possible to improve the production of nucleolipid particles and, surprisingly, to favor the penetration of the particle into the cell by stabilizing the membrane of said cell.
Výhodne sa použili neutrálne lipidy zo skupiny lipidov s dvomi mastnými reťazcami.Preferably, two lipid chain neutral lipids were used.
Mimoriadne výhodne sa používajú prírodné a syntetické lipidy, zwitteriónové lipidy alebo lipidy zbavené iónového náboja za fyziologických podmienok. Uvedený lipid môže byť výhodne vybraný zo skupiny zahŕňajúcej dioleoylfosfatidyletanolamín (DOPE), di-stearoyl,-palmitoyl, mirystoylfosfatidyletanolamín, ako aj ich 1- až 3-krát N-metylové deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykozyldiacylglyceroly, cerebrozidy (akými sú menovite galaktocerebrozidy) , sfingolipidy (akými sú menovite sfingomyelíny) alebo tiež asialogangliozidy (akými sú menovite asialoGMl a GM2) .Particularly preferred are natural and synthetic lipids, zwitterionic lipids or ion-free lipids under physiological conditions. Said lipid may preferably be selected from the group consisting of dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), di-stearoyl, -palmitoyl, mirystoylphosphatidylethanolamine, as well as 1- to 3-fold N-methyl derivatives, phosphatidylglycerols, diacylglycerols, glycosyldiacylglycerides and cerebrosideids , sphingolipids (such as sphingomyelins) or asialogangliosides (such as asialoGM1 and GM2).
Tieto jednotlivé lipidy sa môžu získať buď syntézou alebo extrakciou z orgánov (napríklad z mozgu), alebo z vajec známymi klasickými technikami. Extrakcia lipidov sa môže uskutočniť použitím organických rozpúšťadiel (pozri o tom takisto Lehninger, Biochemistry).These individual lipids can be obtained either by synthesis or extraction from organs (e.g., the brain) or from eggs by known classical techniques. Lipid extraction can be performed using organic solvents (see also Lehninger, Biochemistry).
Kompozícia používaná ako transfekčné činidlo podľa vynálezu výhodne obsahuje lipofekčný polymér obsahujúci 0,1 až 20 ekvivalentov neutrálneho lipidu na jeden ekvivalent lipopolyamínov a výhodnejšie 1 až 5 ekvivalentov neutrálneho lipidu na jeden ekvivalent lipopolyamínov. V prípade, že transfekčné činidlo je katiónový polymér, potom kompozícia podľa vynálezu obsahuje okrem katiónového polyméru vo vyššie uvedených pomeroch 0,1 až 20 molárnych ekvivalentov neutrálneho lipidu na jeden molárny ekvivalent fosfátu nukleovej kyseliny, výhodnejšie 1 až 5 molárnych ekvivalentov neutrálneho lipidu na jeden molárny ekvivalent fosfátu nukleovej kyseliny.The composition used as the transfection agent of the invention preferably comprises a lipofection polymer comprising 0.1 to 20 equivalents of neutral lipid per equivalent of lipopolyamines, and more preferably 1 to 5 equivalents of neutral lipid per equivalent of lipopolyamines. When the transfecting agent is a cationic polymer, the composition of the invention contains, in addition to the cationic polymer, in the above ratios 0.1 to 20 molar equivalents of neutral lipid per molar equivalent of nucleic acid phosphate, more preferably 1 to 5 molar equivalents of neutral lipid per molar. equivalent of nucleic acid phosphate.
Kompozície podľa vynálezu môžu byť formulované do foriem, ktoré sú vhodné pre topické kutánne, perorálne, rektálne, vaginálne, parenterálne, intranasálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, intraokulárne, transdermálne a iné podanie. Tieto farmaceutické kompozície podlá vynálezu výhodne obsahujú farmaceutický prijateľný nosič na injektovatelné kompozície, menovite na priamu injekciu na úrovni požadovaného orgánu, alebo na podanie topickou cestou (na pokožku alebo sliznicu). Môže ísť menovite o izotonické sterilné roztoky alebo o suché kompozície, konkrétne získané lyofilizáciou, ktoré po pridaní vody alebo fyziologického roztoku umožňujú rekonštitúciu injektovatelných tekutín..Dávky nukleovej kyseliny na injekciu, ako aj počet podaní, môžu byť prispôsobené rôznym ukazovateľom a sú závislé na konkrétnom použitom spôsobe podania, na liečenom patologickom stave, na type génu, ktorý má byť exprimovaný, alebo tiež na požadovanom čase liečby.The compositions of the invention may be formulated in forms suitable for topical cutaneous, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal and other administration. The pharmaceutical compositions of the invention preferably comprise a pharmaceutically acceptable carrier for injectable compositions, namely, for direct injection at the desired organ level, or for administration topically (to the skin or mucosa). These may include, but are not limited to, isotonic sterile solutions or dry compositions, in particular obtained by lyophilization, which, upon addition of water or saline, allow for reconstitution of injectable fluids. Nucleic acid doses for injection as well as number of administrations may be adapted to different parameters and dependent the method of administration used, the pathological condition being treated, the type of gene to be expressed, or also at the desired time of treatment.
Tieto kompozície môžu byť použité s výhodou na transfekciu širokého spektra bunkových typov, medzi ktoré patria napríklad hematopoetické bunky, lymfocyty, hepatocyty, endotelové bunky, melanómové bunky, bunky karcinómov a sarkómov, bunky hladkých svalov, neuróny a astrocyty.These compositions can be advantageously used to transfect a wide variety of cell types, including, for example, hematopoietic cells, lymphocytes, hepatocytes, endothelial cells, melanoma cells, carcinoma and sarcoma cells, smooth muscle cells, neurons and astrocytes.
Vynález takto poskytuje mimoriadne výhodnú metódu na liečenie chorôb, ktorá využíva in vitro, ex vivo alebo in vivo transfekciu nukleovej kyseliny, ktorá je schopná korigovať uvedenú chorobu, v kombinácii s transfekčným činidlom katiónového typu alebo lipofekčným polymérom a vyššie definovanou zlúčeninou. Táto metóda je konkrétne použiteľná na choroby spôsobené nedostatočnosťou proteínového alebo DNA produktu, pričom nukleová kyselina, ktorá je podaná v rámci uvedenej kompozície, kóduje uvedený proteínový produkt alebo obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu uvedenému DNA produktu. Kompozície podlá vynálezu sú mimoriadne zaujímavé kvôli ich biologickej schopnosti a ich transfekčnej úrovni.The invention thus provides a particularly preferred method for the treatment of diseases which utilizes in vitro, ex vivo or in vivo transfection of a nucleic acid capable of correcting said disease in combination with a cationic type transfection agent or lipofection polymer and a compound as defined above. In particular, the method is applicable to diseases caused by protein or DNA deficiency, wherein the nucleic acid which is administered within said composition encodes said protein product or comprises a sequence corresponding to said DNA product. The compositions of the invention are of particular interest because of their biological ability and their transfection level.
Vynález sa tiež dotýka použitia podlá vynálezu zlúčeniny spojenej s receptorovým ligandom, protilátkou, alebo derivátom protilátky na zacielenie nukleovej kyseliny k bunkám exprimujúcim zodpovedajúce receptory alebo antigény. V rámci tejto stratégie sa ligand, protilátka alebo derivát protilátky naviaže na uvedenú zlúčeninu a dôjde ku zlepšeniu transfekčnej schopnosti takto získanej chimérickej molekuly v porovnaní so samotnou zlúčeninou.The invention also relates to the use of a compound of the invention associated with a receptor ligand, antibody, or antibody derivative for targeting nucleic acid to cells expressing the corresponding receptors or antigens. In this strategy, the ligand, antibody, or antibody derivative binds to said compound and improves the transfection capacity of the thus obtained chimeric molecule as compared to the compound itself.
V nasledujúcej časti popisu budé vynález bližšie objasnený pomocou príkladov jeho konkrétneho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a vôbec neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne definovaný patentovými nárokmi.In the following, the invention will be explained in more detail by way of examples of a specific embodiment thereof, these examples being illustrative only and not limiting the scope of the invention, which is clearly defined by the claims.
Prehľad obrázkov na výkresochBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Na pripojených výkresoch • obr.l znázorňuje v hodnotách svetelnej intenzity účinnosti transfekcií uskutočnených podľa vynálezu v rôznych bunkových typoch a • obr.2 znázorňuje vyhodnotenie účinnosti transfekcií uskutočnených v prítomnosti a neprítomnosti HMG1In the accompanying drawings, Fig. 1 shows, in light intensity values, the transfection efficiencies performed according to the invention in different cell types; and Fig. 2 shows an evaluation of the transfection efficiencies performed in the presence and absence of HMG1.
Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Materiál a metódyMaterial and methods
Štruktúra použitá na overenie kompozícií je podľa vynálezu plazmid nesúci gén kódujúci luciferázu (Luc), ktorý je označený pCMV-Luc.According to the invention, the structure used to verify the compositions is a plasmid carrying a gene encoding luciferase (Luc), which is designated pCMV-Luc.
Uvedený plazmid pCMV-Luc obsahuje promótor z cytomegalovírusu (CMV) vybraný z plazmidového vektora pcDNA3 (Invitrogen) štiepením s enzýmami Mlul a HindlII a umiestnený pred génom kódujúcim luciferázu·, vloženým v miestach Mlul a HindlII do vektora pGL basic Vector (Promega).Said plasmid pCMV-Luc comprises a cytomegalovirus (CMV) promoter selected from the plasmid vector pcDNA3 (Invitrogen) by digestion with the MluI and HindIII enzymes and upstream of the luciferase encoding gene inserted at the MluI and HindIII sites in the pGL basic Vector (Promega).
Príklad 1Example 1
Príprava potkanieho proteínu HMGPreparation of rat HMG protein
1.1. Expresia proteínu HMG1 v E. coli1.1. Expression of HMG1 protein in E. coli
Tento rekombinantný proteín pochádzajúci z cicavca bol pripravený nadprodukciou v E. coli.This mammalian recombinant protein was prepared by overproduction in E. coli.
Plazmid T7-RHMG1 kódujúci potkaní proteín HMG1 (M.E.Plasmid T7-RHMG1 encoding rat HMG1 protein (M.E.
Bianchi, Gene, 104 (1991) 271-271) sa vnesie do kmeňa E. coliBianchi, Gene, 104 (1991) 271-271) is introduced into an E. coli strain
BL21(DE3). Tento kmeň sa potom kultivuje pri teplote 37 °C v kultivačnom LB médiu + Ampicillin (25 mg/L). Z izolovanej kolónie sa potom získa inokulum, ktorým sa naočkuje na 500 ml. Keď absorbancia kultúry pri 600 nm dosiahne hodnotu 0,7, indukuje sa syntéza HMG1 pridaním IPTG do konečnej koncentrácie 0,5 mM. Produkčný kmeň HMG1 sa potom ešte kultivuje ďalšie 2 hodiny a 30 minút v prítomnosti IPTG. Potom sa bunky zozbierajú odstredením (5000xg 20 minút) , izolované bunky sa premyjú resuspendovaním v 200 ml vody a opakovane odstredia. Bunkový pelet získaný po odstredení sa uskladňuje pri teplote -80 °C až do okamžiku purifikácie.BL21 (DE3). This strain is then cultured at 37 ° C in LB culture medium + Ampicillin (25 mg / L). An inoculum is then obtained from the isolated colony and inoculated to 500 ml. When the absorbance of the culture at 600 nm reaches 0.7, the synthesis of HMG1 is induced by adding IPTG to a final concentration of 0.5 mM. The production strain HMG1 is then cultured for a further 2 hours and 30 minutes in the presence of IPTG. Cells are then harvested by centrifugation (5000xg for 20 minutes), isolated cells are washed by resuspension in 200 ml of water and centrifuged again. The cell pellet obtained after centrifugation is stored at -80 ° C until purification.
1.2. Purifikácia rekombinantného proteínu HMG11.2. Purification of recombinant HMG1 protein
Purifikácia proteínu HMG1 môže byť uskutočnená chromatograf iou kultúry kmeňa E. coli popísanej v príklade 1.1, napríklad s použitím nasledujúcej metodiky.Purification of the HMG1 protein may be accomplished by chromatography of the E. coli strain described in Example 1.1 using, for example, the following methodology.
Pokial nie je výslovne inak uvedené, sú všetky purifikačné stupne, popísané nižšie, uskutočňované pri teplote 4 °C. Bunky získané z 500 ml kultúry sa resuspendujú v 15 ml 50 mM Tris/HClpufra, pH 7,7, ktorý obsahuje 500 μΜ EDTA, 5 mM DTT, 200 μΜ produktu Pefabloc SC (4-(2-aminoetyl)benzensulfonylfluoridhydrochlorid) a 10% (hmotn./obj.) glycerol. Po dezintegrácii buniek pôsobením ultrazvuku počas 15 minút sa rozbité bunky oddelia odstredením (50000xg počas jednej hodiny). Získaný bunkový extrakt sa potom delí chromatografiou na kolóne Sephadex G25 (Pharmacia) v ekvilibrovanom stave, pričom elúcia kolóny sa uskutočňuje s použitím pufru A (20 mM Hepes, pH 7,9 obsahujúci 400 mM NaCl, 200 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 μΜ Pefabloc SC, 0,2% Nonidet P40 a 10% glycerol). Frakcie obsahujúce proteín sa oddelene zozbierajú a následne sa táto frakcia delí chromatografiou na kolóne DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia), ktorá sa ekvilibruje s pufrom A. Proteínová frakcia nezachytená naUnless otherwise indicated, all purification steps described below are performed at 4 ° C. The cells obtained from the 500 ml culture are resuspended in 15 ml of 50 mM Tris / HCl buffer, pH 7.7 containing 500 μΜ EDTA, 5 mM DTT, 200 μΜ Pefabloc SC (4- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride) and 10% (w / v) glycerol. After ultrasound disintegration of the cells for 15 minutes, the broken cells are separated by centrifugation (50000xg for one hour). The cell extract obtained is then separated by chromatography on a Sephadex G25 column (Pharmacia) equilibrated, eluting with Buffer A (20 mM Hepes, pH 7.9 containing 400 mM NaCl, 200 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 mM Hepes). μΜ Pefabloc SC, 0.2% Nonidet P40 and 10% glycerol). The protein-containing fractions are collected separately and then separated by chromatography on a DEAE Sephadex A-25 column (Pharmacia), which is equilibrated with buffer A.
Proteíny sa potom z kolóny eluujú s použitím lineárne klesajúceho gradientu síranu amónneho (2,8M po 0 M) v rovnakom pufri. Frakcie obsahujúce proteín HMG1 sa spoja a ďalej sa dialyzujú proti pufru 50 mM Tris/HCl, pH 7,7, obsahujúcom 1 mM EDTA a 500 μΜ DTT. Táto vzorka sa potom nanesie na kolónu MonoQ HR 5/5 (Pharmacia), ktorá sa potom eluuje s použitím lineárneho gradientu chloridu sodného (0 až 0,5M) v pufri 50 mM Tris/HCl, pH 7,7 obsahujúcom 500 μΜ DTT. Proteín HMG1, ktorý tvorí symetrický absorpčný pík (280 nm), sa oddelene zbiera v uvedenom pufri. Proteín HMG1 sa potom po zahustení odstredením v odstredivke Centrikon 10 vyberie s pufrom 10 mM Mes, pH 6,2 obsahujúcom 140 mM NaCl a 500 μΜ DTT. Proteín HMG1 sa uskladňuje pri teplote -80 °C až do chvíle jeho ďalšieho použitia. Tento preparát vykazuje jediný migrujúci proteínový pás a má molekulovú hmotnosť 31 000 (stanovenú analýzou uskutočnenou elektroforézou za denaturačných podmienok (SDS) a po vyfarbení s Coomassie). Celkový výťažok purifikácie je 850 μg čistého proteínu HMG1 z 500 ml východiskovej kultúry.Proteins are then eluted from the column using a linearly decreasing ammonium sulfate gradient (2.8 M to 0 M) in the same buffer. Fractions containing HMG1 protein were pooled and further dialyzed against 50 mM Tris / HCl buffer, pH 7.7 containing 1 mM EDTA and 500 μΜ DTT. This sample is then loaded onto a MonoQ HR 5/5 column (Pharmacia), which is then eluted using a linear gradient of sodium chloride (0 to 0.5M) in 50 mM Tris / HCl buffer, pH 7.7 containing 500 μΜ DTT. The HMG1 protein, which forms a symmetrical absorption peak (280 nm), is separately collected in said buffer. The HMG1 protein is then taken up by centrifugation in a Centrikon 10 centrifuge with 10 mM Mes buffer, pH 6.2 containing 140 mM NaCl and 500 μΜ DTT. The HMG1 protein is stored at -80 ° C until use. This preparation exhibits a single migrating protein band and has a molecular weight of 31,000 (as determined by denaturing conditions (SDS) electrophoresis analysis and Coomassie staining). The total purification yield is 850 µg of pure HMG1 protein from 500 ml of starting culture.
Príklad. 2Example. 2
In vitro prenos nukleovej kyseliny do cicavčích buniekIn vitro transfer of nucleic acid into mammalian cells
Tento príklad ukazuje, ako môže byť proteín typu HMG1, ktorý sa viaže na DNA a ktorý je importovaný aktívnym spôsobom do jadra, použiť na stimuláciu transfekcie plazmidovej DNA.This example illustrates how a HMG1 protein that binds to DNA and which is actively imported into the nucleus can be used to stimulate transfection of plasmid DNA.
Plazmid obsahujúci gén kódujúci luciferázu (Luc), ktorý bol popísaný vyššie, sa použil ako konštrukcia na demonštrovanie účinnosti.A plasmid containing the gene encoding luciferase (Luc) described above was used as a construct to demonstrate efficacy.
Protokol predpokladá všetky platničky s 24 jamkami (0The protocol assumes all 24 - well plates (0
16mm) , na ktorých sa uskutočňuje zber 2 dni po transfekcii (konfluencia buniek). Všetky parametre môžu byť úmerne modifikované.16mm) harvested 2 days after transfection (cell confluence). All parameters can be modified accordingly.
V deň J sa bunky NIH 3T3 (ATCC: CRL1658), 3LL (Isakov N. a kol., JNCI 71 (1983) 139-145), H460 (Maxwell a kol., Oncogene 8 (1993), 3421-3429) sa naočkujú v množstve 105 na jamku.On day J, NIH 3T3 cells (ATCC: CRL1658), 3LL (Isakov N. et al., JNCI 71 (1983) 139-145), H460 (Maxwell et al., Oncogene 8 (1993), 3421-3429) inoculate at 10 5 per well.
V deň J+2 sa bunky prepláchnu PBS (kvôli odstráneniu stôp séra) a zozbiera sa 250 ml RPMI (3LL a H460) alebo DMEM (NIH 3T3), prípadne obohateného s 10% fetálnym telacím sérom (SFV, sérum fetal de veau).On day J + 2, cells are rinsed with PBS (to remove serum traces) and harvested with 250 ml RPMI (3LL and H460) or DMEM (NIH 3T3), optionally enriched with 10% fetal calf serum (SFV, fetal de veau serum).
Kompozícia použitá na transfekciu: na ekvivalent jamky sa pridá do kyvety:Composition used for transfection: add per well to the cuvette:
H2O doplniť do 20 ml,H 2 O make up to 20 ml,
NaCl doplniť do konečnej koncentrácie 140 mMNaCl was added to a final concentration of 140 mM
0,5 mg plazmidovej DNA0.5 mg plasmid DNA
125 ng HMGl a následne sa zmes mierne mieša a inkubuje pri izbovej teplote počas 15 minút, potom sa pridá k zmesi 1,5 nmólu lipofekčného činidla DOGS. Získaná zmes sa znovu mierne mieša a inkubuje pri izbovej teplote počas 15 minút.125 ng HMG1, followed by gently stirring and incubating at room temperature for 15 minutes, then added to the mixture is 1.5 nmoles of DOGS lipofection reagent. The resulting mixture is gently stirred again and incubated at room temperature for 15 minutes.
Bunky sa. transfekujú pridaním 20 ml zmesi DNA/HMG1lipofektant v kultivačnom prostredí a inkubáciou počas 2 až 4 hodín pri teplote 37 °C. Toto prostredie sa potom nahradí s kompletným prostredím.The cells are. transfected by adding 20 ml of DNA / HMG1 lipofectant mixture in culture medium and incubating for 2-4 hours at 37 ° C. This environment is then replaced with the complete environment.
V deň J+4 sa bunky opláchnu pri izbovej teplote s 250 ml PBS, podrobia sa lýze v 100 ml pufru ad hoc (Reportér (Promega) + TCK a Aprotinin). Na meranie aktivity syntetizovanej luciferázy sa použije 10 ml lyzátu a 50 ml substrátu (Promega).On day J + 4, cells are rinsed at room temperature with 250 ml PBS, lysed in 100 ml ad hoc buffer (Reporter (Promega) + TCK and Aprotinin). 10 ml of lysate and 50 ml of substrate (Promega) were used to measure the synthesized luciferase activity.
Na obr.l sú zhrnuté výsledky získané pre tri vyššie uvedené bunkové typy v prítomnosti meniaceho sa množstva proteínu HMGl.Figure 1 summarizes the results obtained for the three cell types listed above in the presence of varying amounts of HMG1 protein.
Na obr.2 sú prehľadným spôsobom uvedené stimulačné faktory transfekcie získané pridaním rôznych množstiev proteínu HMGl.FIG. 2 shows the transfection stimulation factors obtained by adding different amounts of HMG1 protein in a clear manner.
Zvýšenie účinnosti transfekčie š prôťéínom HMGl je premenlivé a závisí na bunkovom type.The increase in efficacy of HMG1 transfection is variable and cell type dependent.
Takto možno pozorovať, že maximálne zlepšenie sa dosiahne v prípade, keď je prostredie obsahujúce kompozíciu nevyhnutnú na transfekciu, obohatené s 10% SVF. Je to zaujímavé, pretože prítomnosť SVF predstavuje podmienky, s ktorými sa stretávame in vivo. Na druhej strane je významné, že prítomnosť SVF zníži účinnosť transfekčie v prípade, keď nie je prítomný proteín HMGl. Možno predpokladať, že prítomnosť SVF v kultivačnom prostredí zmenší množstvo DNA schopné preniknúť do buniek. V rámci tejto úvahy možno urobiť záver, že HMGl je mimoriadne výhodný na transfekciu za podmienok, keď je množstvo DNA limitujúcim faktorom.Thus, it can be observed that maximum improvement is achieved when the medium containing the composition necessary for transfection is enriched with 10% SVF. This is interesting because the presence of SVF represents conditions encountered in vivo. On the other hand, it is significant that the presence of SVF will reduce transfection efficiency in the absence of HMG1 protein. It can be assumed that the presence of SVF in the culture medium will reduce the amount of DNA capable of penetrating cells. In this regard, it can be concluded that HMG1 is particularly advantageous for transfection under conditions where the amount of DNA is a limiting factor.
Optimálny hmotnostný pomer HMGl/DNA na transfekciu sa pohybuje od 0,25 po 0,5. Takéto podmienky nie sú popísané ako podmienky schopné kondenzovať DNA (Bottger M. a kol., B.B.A. 950 (1988), 221-228; Stros M. a kol., N.A.R. 22 (1994), 1044-1051). V skutočnosti plazmid nie je nasýtený proteínom HMGl (Kohlstaedt L.A. a kol., Biochemistry 33 (1994), 12702-12707). Účinok proteínu BMG1 je teda vysvetlený jeho schopnosťou viazať sa na DNA a byť transportovaný k jadru bunky.The optimal mass ratio of HMG1 / DNA for transfection ranges from 0.25 to 0.5. Such conditions are not described as capable of condensing DNA (Bottger M. et al., B.B.A. 950 (1988), 221-228; Stros M. et al., N.A.R. 22 (1994), 1044-1051). In fact, the plasmid is not saturated with the HMG1 protein (Kohlstaedt L.A. et al., Biochemistry 33 (1994), 12702-12707). The effect of BMG1 protein is therefore explained by its ability to bind to DNA and be transported to the nucleus of the cell.
Claims (24)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9511411A FR2739292B1 (en) | 1995-09-28 | 1995-09-28 | PHARMACEUTICAL COMPOSITION USEFUL FOR TRANSFECTING NUCLEIC ACIDS AND USES THEREOF |
| PCT/FR1996/001516 WO1997012051A1 (en) | 1995-09-28 | 1996-09-27 | Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK40098A3 true SK40098A3 (en) | 1998-09-09 |
Family
ID=9483020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK400-98A SK40098A3 (en) | 1995-09-28 | 1996-09-27 | Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6153597A (en) |
| EP (1) | EP0854930A1 (en) |
| JP (1) | JPH11512704A (en) |
| KR (1) | KR19990063814A (en) |
| AU (1) | AU720697B2 (en) |
| BR (1) | BR9610719A (en) |
| CA (1) | CA2231064A1 (en) |
| CZ (1) | CZ94798A3 (en) |
| FR (1) | FR2739292B1 (en) |
| HU (1) | HUP9900317A3 (en) |
| IL (1) | IL123849A0 (en) |
| NO (1) | NO981322L (en) |
| SK (1) | SK40098A3 (en) |
| WO (1) | WO1997012051A1 (en) |
| ZA (1) | ZA968109B (en) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2750704B1 (en) | 1996-07-04 | 1998-09-25 | Rhone Poulenc Rorer Sa | PROCESS FOR PRODUCING THERAPEUTIC DNA |
| US6383811B2 (en) * | 1997-12-30 | 2002-05-07 | Mirus Corporation | Polyampholytes for delivering polyions to a cell |
| IT1299583B1 (en) * | 1998-05-19 | 2000-03-16 | Vander Way Limited | USE OF HMG-I PROTEIN FOR THE PREPARATION OF MEDICATIONS WITH CYTOTOXIC ACTIVITY |
| DE19925143A1 (en) * | 1999-06-02 | 2000-12-07 | Aventis Pharma Gmbh | New liposomal vector complexes and their use for gene therapy |
| DE19929104A1 (en) * | 1999-06-24 | 2000-12-28 | Aventis Pharma Gmbh | Vector complex, useful for gene therapy of e.g. tumors, comprises nucleic acid, cationic carrier, charged polymer and targeting ligand |
| FR2814370B1 (en) * | 2000-09-22 | 2004-08-20 | Centre Nat Rech Scient | USE OF A NUCLEIC ACID / PEI COMPLEX FOR TARGETING STEM CELLS OF THE BRAIN |
| IL156132A0 (en) * | 2000-11-27 | 2003-12-23 | Yissum Res Dev Co | Transfection of human embryonic stem cells |
| JP2005511761A (en) * | 2001-07-10 | 2005-04-28 | ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ | Nanoparticle delivery vehicle |
| FR2829136B1 (en) | 2001-08-29 | 2006-11-17 | Aventis Pharma Sa | LIPID DERIVATIVES OF AMINOGLYCOSIDES |
| ITMI20011986A1 (en) * | 2001-09-25 | 2003-03-25 | San Raffaele Centro Fond | METHOD AND COMPOSITION FOR THE ACTIVATION OF CELLS PRESENTING THE ANTIGEN |
| US7060498B1 (en) | 2001-11-28 | 2006-06-13 | Genta Salus Llc | Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers |
| JP5407862B2 (en) * | 2006-10-04 | 2014-02-05 | サントル・ナシオナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィーク（セーエヌエールエス） | Composition comprising siRNA and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivative and use thereof |
| EP3034539A1 (en) * | 2014-12-19 | 2016-06-22 | Ethris GmbH | Compositions for introducing nucleic acid into cells |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2646161B1 (en) * | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | NEW LIPOPOLYAMINES, THEIR PREPARATION AND THEIR USE |
| FR2645866B1 (en) * | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | NEW LIPOPOLYAMINES, THEIR PREPARATION AND THEIR USE |
| US5286634A (en) * | 1989-09-28 | 1994-02-15 | Stadler Joan K | Synergistic method for host cell transformation |
| US5334761A (en) * | 1992-08-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
| US5631237A (en) * | 1992-12-22 | 1997-05-20 | Dzau; Victor J. | Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes |
| SG54115A1 (en) * | 1993-04-27 | 1998-11-16 | Gerber Scient Products Inc | Thermal printing apparatus with improved power supply |
| FR2722506B1 (en) * | 1994-07-13 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | COMPOSITION CONTAINING NUCLEIC ACIDS, PREPARATION AND USES |
-
1995
- 1995-09-28 FR FR9511411A patent/FR2739292B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-09-26 ZA ZA968109A patent/ZA968109B/en unknown
- 1996-09-27 KR KR1019980702282A patent/KR19990063814A/en not_active Application Discontinuation
- 1996-09-27 SK SK400-98A patent/SK40098A3/en unknown
- 1996-09-27 CZ CZ98947A patent/CZ94798A3/en unknown
- 1996-09-27 WO PCT/FR1996/001516 patent/WO1997012051A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-09-27 US US09/043,856 patent/US6153597A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-27 BR BR9610719A patent/BR9610719A/en unknown
- 1996-09-27 HU HU9900317A patent/HUP9900317A3/en unknown
- 1996-09-27 JP JP9513192A patent/JPH11512704A/en not_active Ceased
- 1996-09-27 AU AU71361/96A patent/AU720697B2/en not_active Ceased
- 1996-09-27 EP EP96932668A patent/EP0854930A1/en not_active Withdrawn
- 1996-09-27 CA CA002231064A patent/CA2231064A1/en not_active Abandoned
- 1996-09-28 IL IL12384996A patent/IL123849A0/en unknown
-
1998
- 1998-03-24 NO NO981322A patent/NO981322L/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0854930A1 (en) | 1998-07-29 |
| FR2739292B1 (en) | 1997-10-31 |
| JPH11512704A (en) | 1999-11-02 |
| FR2739292A1 (en) | 1997-04-04 |
| HUP9900317A3 (en) | 2001-10-29 |
| WO1997012051A1 (en) | 1997-04-03 |
| MX9801920A (en) | 1998-08-30 |
| BR9610719A (en) | 1999-07-13 |
| CZ94798A3 (en) | 1998-07-15 |
| KR19990063814A (en) | 1999-07-26 |
| IL123849A0 (en) | 1998-10-30 |
| AU720697B2 (en) | 2000-06-08 |
| AU7136196A (en) | 1997-04-17 |
| NO981322D0 (en) | 1998-03-24 |
| ZA968109B (en) | 1997-04-21 |
| CA2231064A1 (en) | 1997-04-03 |
| US6153597A (en) | 2000-11-28 |
| NO981322L (en) | 1998-03-24 |
| HUP9900317A2 (en) | 1999-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6200956B1 (en) | Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof | |
| US6172048B1 (en) | Composition containing nucleic acids, preparation and uses | |
| US7682626B2 (en) | Polyvinylethers for delivery of polynucleotides to mammalian cells | |
| JPH10502918A (en) | Compositions containing nucleic acids, their production and use | |
| JP2002515418A (en) | Polymer gene carrier for polyethylene glycol conjugated poly-L-lysine targeting hepatocytes | |
| US6407178B1 (en) | Cationic polymers, complexes associating said cationic polymers with therapeutically active substances comprising at least a negative charge, in particular nucleic acids, and their use in gene therapy | |
| JPH10506001A (en) | Compositions for introducing nucleic acid complexes into higher eukaryotic cells | |
| SK40098A3 (en) | Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof | |
| MXPA01012802A (en) | Copolymers for the transfer of nucleic acids to the cell. | |
| AU737846B2 (en) | Transfectant composition useful in gene therapy associating with a recombinant virus incorporating an exogenous nucleic acid and a non-viral and non-plasmid transfection agent | |
| MXPA98001920A (en) | Pharmaceutical composition useful for the transfection of nucleic acids and its u | |
| AU737314B2 (en) | Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same | |
| MXPA97006016A (en) | Composition containing nucleic acids, preparation and use | |
| JP3095248B2 (en) | Nucleic acid carrier |