SK40098A3 - Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof - Google Patents

Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof Download PDF

Info

Publication number
SK40098A3
SK40098A3 SK400-98A SK40098A SK40098A3 SK 40098 A3 SK40098 A3 SK 40098A3 SK 40098 A SK40098 A SK 40098A SK 40098 A3 SK40098 A3 SK 40098A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
pharmaceutical composition
composition according
nucleic acid
group
compound
Prior art date
Application number
SK400-98A
Other languages
English (en)
Inventor
Francis Blanche
Beatrice Cameron
Joel Crouzet
Vincent Thuillier
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer Sa filed Critical Rhone Poulenc Rorer Sa
Publication of SK40098A3 publication Critical patent/SK40098A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka oblasti génovej terapie a vzťahuje sa predovšetkým na in vitro, ex vivo a/alebo 'in vivo prenos genetického materiálu. Je tu navrhnutá predovšetkým nová farmaceutická kompozícia vhodná na účinnú transfekciu buniek. Vynález sa týka predovšetkým použitia tejto zlúčeniny.
Doterajší stav techniky
Nedostatočnosť alebo anomália na úrovni chromozómov (mutácie, aberantné expresie, atď.) sú príčinou mnohých dedičných alebo nededičných ochorení. Z tohto hľadiska je konvenčná medicína už dlho bezmocná. V súčasnosti, keď dochádza k rozvoju génovej terapie, sa predpokladá, že bude možné uvedený typ chromozómovej aberácie v budúcnosti korigovať alebo týmto aberáciám dokonca predchádzať. Tento nový typ liečebnej metódy spočíva v tom, že sa do bunky alebo orgánu s aberáciou uvedeného typu vnesie genetická informácia na korekciu uvedenej nedostatočnosti alebo anomálie, alebo tiež na expresiu zainteresovaného terapeutického proteínu.
Hlavnú prekážku, ktorá bráni preniknutiu nukleovej kyseliny do cieľovej bunky alebo do cieľového orgánu, predstavuje veľkosť a polyaniónový charakter uvedenej nukleovej kyseliny, ktoré bránia prieniku nukleovej kyseliny naprieč bunkovou membránou.
Na odstránenie tejto prekážky boli v súčasnosti navrhnuté rôzne techniky, z ktorých možno uviesť predovšetkým transfekciu nahej DNA cez plazmatickú membránu in vivo (W090/11092) a transfekciu DNA pomocou transfekčného vektora.
Pokial ide o transfekciu nahej DNA, dosahuje sa tu ešte stále velmi nízka účinnosť. Nahé nukleové kyseliny majú krátky polčas života vzhľadom na ich degradáciu pôsobením enzýmov a ich vylučovanie močovými cestami.
Pokiaľ ide o druhú z uvedených techník, táto navrhuje v podstate dve základné stratégie.
Prvá z týchto stratégií využíva prirodzené transfekčné vektory, ako sú vírusy. Takto sa navrhlo použitie adenovírusov, herpesvírusov, retrovírusov a v nedávnej dobe aj adenopríbuzných vírusov ako vektorov na uvedenú transfekciu. Ukázalo sa, že tieto vektory sú účinné z hľadiska transfekcie, avšak bohužiaľ nie je možné úplne vylúčiť určité riziká patogénnosti, repllkácie alebo imunogénnosti, ktoré sú prirodzenou vlastnosťou ich vírusového charakteru.
Výhoda druhej z uvedených stratégií spočíva v tom, že sa používajú nevirulentné činidlá, ktoré sú schopné podporiť prenos DNA do eukaryotických buniek a jej expresiu.
Predmet vynálezu sa dotýka tejto druhej stratégie.
Chemické alebo biochemické vektory predstavujú výhodnú alternatívu prirodzeným vírusom a to predovšetkým vzhladom na to, že pri týchto chemických alebo biochemických vektoroch neexistuje možnosť imunologickej odpovede alebo rekombinácie vírusu. Tieto vyššie uvedené vektory nie sú potenciálne patogénne, riziko pomnoženia DNA vo vnútri týchto vektorov je nulové a nie je im pripisované žiadne obmedzenie, pokiaľ ide o velkosť transfekovanej DNA.
Tieto syntetické vektory majú dve základné funkcie, ktorými sú kondenzácia DNA určenej na transfekciu a podpora jej väzby na bunku, prienik cez plazmatickú' membránu a prípadne cez obe jadrové membrány.
Vzhladom na polyaniónový charakter DNA, nemá DNA žiadnu prirodzenú afinitu k plazmatickej membráne buniek s rovnakým polyaniónovým charakterom. Na elimináciu tohto nedostatku nevírusové vektory majú všeobecne všetky náboje polykatiónové.
Z dosial vyvinutých syntetických vektorov sú najvýhodnejšie vektory katiónové polyméry typu polylyzín a DEAE-dextrán alebo takisto katiónové, či lipofekčné lipidy. Tieto vektory majú schopnosť kondenzovať DNA a podporiť jej schopnosť viazať sa na bunkovú membránu. V nedávnom čase sa navrhla cielená transfekcia, ktorá je sprostredkovaná receptorom. Táto technika využíva princíp kondenzácie DNA vďaka katiónovému polyméru, pričom sa dosahuje viazanie získaného komplexu pomocou chemickej kopulácie, ktorá prebieha medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora prítomného na povrchu typu bunky, ktorá je modifikovaná. Takisto sa popísalo vytriedenie receptorov na transferín, inzulín alebo receptory asialoglykoproteínov hepatocytov.
Napriek uvedenému, všetky doteraz navrhované syntetické vektory sú ešte velmi vzdialené tomu, kedy budú rovnako účinné ako vírusové vektory. Môže to byť predovšetkým dôsledok nedostatočnej kondenzácie DNA určenej na transfekciu alebo dôsledok ťažkostí, s ktorými sa transfekovaná DNA stretáva pri výstupe z endozómu a pri prenikaní do bunkového jadra. V skutočnosti transport DNA do jadra eukaryotickej bunky v pokojovom stave spôsobuje evidentné problémy, pretože rozmery jadrových pórov umožňujú difúziu proteínov iba s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 60 000 kDA (pozri bližšie: Davis a kol.. Ann. Rev. Biochem., 1995, 64, 865-896). Plazmatická DNA, ktorá má molekulovú hmotnosť vyššiu ako 106, nie je teda schopná preniknúť prirodzeným spôsobom do jadra bunky iba jednoduchou difúziou.
Cieľom vynálezu je navrhnúť riešenie tohto problému.
Podstata vynálezu
Vynález navrhuje farmaceutickú kompozíciu použiteľnú na transfekciu minimálne jednej nukleovej kyseliny a jej podstata spočíva v tom, že okrem uvedenej nukleovej kyseliny a aspoň jedného transfekčného činidla, obsahuje minimálne jednu zlúčeninu, ktorá je schopná viazať DNA a preniesť ju do jadra.
Zlúčenina, ktorá je schopná viazať DNA, zahŕňa v rámci vynálezu akúkoľvek zlúčeninu schopnú viazať sa aspoň čiastočne na DNA, ktorá má byť prenášaná. Pokial ide o schopnosť prenášať uvedenú DNA, touto schopnosťou sa rozumie v rámci vynálezu schopnosť účinne niesť uvedenú DNA naprieč rôznymi bunkovými membránami alebo jadrovými membránami, až ju nakoniec dopraviť do jadra ošetrovanej bunky. V tomto špecifickom prípade je možné oblasť väzby DNA zvoliť z množstva špecifických regulačných proteinov, ktoré sú schopné viazať sa napríklad na špecifické sekvencie alebo naopak z proteinov, o ktorých je známe, že majú sekvenčne nezávislú afinitu k DNA. Pokial ide o oblasť, ktorá sprostredkováva transport do jadra, môže to byť napríklad sekvencia označovaná ako nls (nuclear localisation sequence). Takéto sekvencie môžu byť odvodené v bipartitnej zhode odvodenej z nukleoplazmínu alebo v zhode antigénu T odvodeným z SV40.
V rámci uskutočnenia špecifickej formy sa vynález dotýka farmaceutickej kompozície použiteľnej na transfekciu minimálne jednej nukleovej kyseliny, ktorej podstata spočíva v tom, že okrem uvedenej nukleovej kyseliny a aspoň jedného transfekčného činidla, obsahuje minimálne jednu zlúčeninu, ktorá patrí ku skupine proteinov HMG, alebo niektorému z jeho derivátov.
Proteíny typu HMG (High Mobility Group) sú proteíny bohaté na nabité aminokyseliny a s molekulovou hmotnosťou menšou ako 30000 kDa. Sú rozpustné v 2 až 5% kyseline chloristej a sú klasicky extrahované s 0,35M chloridom sodným z chromatínu.
Proteíny HMG sú klasicky rozdelené na tri skupiny: proteíny HMG1/2 s hmotnosťou okolo 25000, proteíny HMG14/17 s molekulovou hmotnosťou okolo 10-12000 a proteíny HMGI/Y, ktoré majú zloženie podobné proteínom HMG14/17, avšak majú inú tkanivovú distribúciu v priebehu ontogenézy. Je známe, že u všetkých troch skupín primárna sekvencia v priebehu evolúcie zostala zachovaná.
Pokial ide o konkrétne proteíny skupiny HMG1/2, sú tieto proteíny charakteristické prítomnosťou sekvencie 80 aminokyselín s bázickou prevahou (náboj +20), ktorá je označovaná ako HMG box a ktorá tvorí DNA väzbovú oblasť. V rámci tejto skupiny sa rozlišujú proteíny schopné viazať sa na špecifické sekvencie dvojvláknovej DNA a proteíny, ktorých väzbová špecifickosť spočíva v špecifickej trojrozmernej štruktúre DNA. Do prvej h5 kategórie patria proteíny UBF; SRY; TCF1, ABF2, ktoré stimulujú transkripciu špecifických génov (Greiss . E.A. a kol., J. Mol. Evol. (1993) 37: 204-210). Sekvencia každého z týchto proteínov obsahuje jeden alebo niekoľko HMG boxov. Do druhej kategórie patria proteíny HMG1 a HMG2. Ich primárna sekvencia je charakteristická prítomnosťou dvoch HMG boxov a jednej kyslej sekvencie na C-konci (Bustin M., B.B.A (1990) 1094: 231-243).
Tieto proteíny sa špecifickým spôsobom viažu na palindrómové sekvencie DNA prečnievajúce do krížovej štruktúry na alebo (medzivláknové párovanie na úrovni palindrómu) sekvencie DNA, ktoré majú značné zakrivenie. Obidva tieto typy štruktúr majú spoločné to, že tu existuje rozšírenie malej ryhy DNA, ktorý sa takto stane schopnou prispôsobiť sa väzbe proteínov typu HMG1/2. Fyziologická funkcia proteínov HMG1 a HMG2 nebola až doteraz objasnená. No prinajmenšom sa dokázalo, že teľací proteín je aktívne transportovaný do jadra cicavčích buniek (L. Kuehl a kol., J. Biol. Chem. 1985, 260, 10361-10368).
Prihlasovateľ teraz úplne nečakane dokázal, že je možné využiť uvedenú vlastnosť proteínov HMG, a to ich schopnosť na účinnú podporu kyselín do jadra aktívneho transportu do jadra buniek, transfekcie heterologických nukleových ošetrovaných buniek s minimálne jedným pripojeným transfekčným činidlom.
Vyššie uvedený výraz derivát zahŕňa v rámci vynálezu ľubovoľný peptid, pseudopeptid (peptid s nebiochemickými prvkami) alebo proteín odlišný od zlúčeniny, tak ako bola definovaná vyššie, získaný jednou alebo niekoľkými modifikáciami genetického alebo chemického charakteru. Pod pojmom modifikácie genetického alebo chemického charakteru sa tu rozumie akákoľvek mutácia, substitúcia, delécia, adícia alebo modifikácia jedného či niekoľkých zvyškov napríklad uvažovaného proteínu. Presnejšie vyjadrené, chemickou modifikáciou sa rozumie modifikácia peptidu alebo proteínu uskutočnená reakciou alebo chemickým modifikovaním biologickej či nebiologickej molekuly, alebo biologických či nebiologických molekúl na určitom počte proteínových zvyškov. Pod pojmom akákoľvek chemickou genetická modifikácia sa tu rozumie akákoľvek peptidová sekvencia, ktorej DNA hybridizuje s uvedenými sekvenciami alebo fragmentmi týchto sekvencií a jej produkt vykazuje indikované aktivity. Takýto derivát môže byť vytvorený na rôzne účely, napríklad na zvýšenie afinity zodpovedajúceho polypeptidu k jeho DNA ligandu, na zlepšenie jeho produkčnej hladiny, na zvýšenie jeho rezistencie voči proteázam, na zvýšenie alebo modifikáciu niektorého z jeho účinkov alebo na získanie nových farmakokinetických alebo biologických vlastností.
Z derivátov získaných adíciou je možné uviesť napríklad chimérické peptidové sekvencie obsahujúce dodatkovú heterologickú časť pripojenú k jednému koncu. Výraz derivát rovnako zahŕňa proteínové sekvencie, ktoré sú homologické s uvažovanou sekvenciou a ktoré pochádzajú z iných bunkových zdrojov, predovšetkým z ľudských buniek alebo z buniek iných organizmov a majú účinnosť rovnakého typu. Takéto homologické sekvencie môžu byť získavané hybridizačnými pokusmi s DNA. Tieto hybridizácie môžu byť uskutočňované s použitím bánk nukleových kyselín a s použitím sondy tvorenej natívnou sekvenciou alebo fragmentom tejto natívnej sekvencie za konvenčných rigoróznych podmienok (Maniatis a kol.) (pozri všeobecné techniky molekulárnej biológie) alebo výhodne za sprísnených podmienok.
Okrem toho sa v rámci vynálezu predpokladá takisto využitie výraznej afinity niektorých proteínov skupiny HMG alebo ich derivátov k sekundárnym štruktúram prítomným na dvojvláknovej DNA. Môže ísť hlavne o štvorvláknové štruktúry, u ktorých sa zistilo, že HMGl potkana má k nim veľmi silnú afinitu (Bianchi a kol., Science 1989, 243, 1056-1059). Takéto štruktúry môžu byť tiež získané z prirodzených sekvencií, ako sú ITR sekvencie vírusov príbuzných s adenovírusmi, alebo môžu byť získané úplne synteticky z umelých palindrómov.
V rámci výhodnej formy uskutočnenia vynálezu je použitá zlúčenina vybraná zo skupiny proteínov typu HMGl, 2, I, Y, 14 a 17 a ich derivátov. Táto zlúčenina je najvýhodnejšie vytváraná celkom alebo časťou ľudského proteínu HMGl alebo niektorého z derivátov alebo homológov, ktoré boli definované vyššie.
. ľ ··*; v ‘
V rámci výnimočne výhodnej formy uskutočnenia vynálezu obsahujú kompozície podlá vynálezu ešte smerovací prvok, ktorý umožňuje orientovať prenos nukleovej kyseliny. Tento smerovací prvok môže byť mimobunkovým smerovacím prvkom umožňujúcim orientovať prenos nukleovej kyseliny do určitých typov buniek alebo do určitých požadovaných tkanív (nádorové bunky, pečeňové bunky, hematopoetické bunky atď.). Môže takisto ísť o vnútrobunkový smerovací prvok umožňujúci orientovať prenos nukleovej kyseliny do niektorých uprednostnených častí bunky (mitochondrie, jadro, atď.).
Podlá vynálezu je výhodnejšie viazať uvedený smerovací prvok kovalentne alebo nekovalentne na zlúčeninu. Tento smerovací prvok môže byť takisto viazaný na nukleovú kyselinu. V rámci výhodnej formy uskutočnenia vynálezu je uvedená zlúčenina viazaná prostredníctvom dodatkovej heterologickej časti, viazanej na jeden z jej koncov, k bunkovému receptorovému ligandu prítomnému na povrchu bunkového typu, ako je napríklad cukor, transferín, inzulín, alebo asialo-orosomukoidný proteín. Môže tiež ísť o ligand vnútrobunkového typu, akým je signálna sekvencia lokalizácie v jadre, nls, ktorá uprednostňuje akumuláciu transfekovanej DNA v jadre.
Zo smerovacích prvkov použiteľných v rámci vynálezu je možné uviesť cukry, peptidy, oligonukleotidy alebo lipidy. Výhodne ide cukry alebo peptidy, akými sú protilátky alebo fragmenty protilátok, bunkové receptorové ligandy alebo fragmenty týchto ligandov, receptory alebo fragmenty týchto receptorov, atď. Predovšetkým môže ísť o receptory rastových faktorov, receptorov cytokínov, receptorov bunkových lektínov, alebo o receptory adhéznych proteínov. Môže takisto ísť o receptor transferínu, HDL a LDL. Smerovacím prvkom môže byť tiež cukor umožňujúci zacielenie lektínov, ako sú asialoglykoproteínové receptory, alebo tiež fragment protilátky Fab, ktorý umožňuje zacielenie receptorov Fc fragmentu imunoglobulínov.
Zlúčenina môže byť podľa vynálezu navyše výhodne polyglykozylovaná, sulfónovaná alebo fosforylovaná, alebo modifikovaná s komplexnými cukrami či lipofilnou zlúčeninou, ako je napríklad polyuhlíkatý reťazec alebo derivát cholesterolu.
Kompozícia podlá vynálezu môže samozrejme obsahovať niekoľko zlúčenín rôznej povahy podlá vynálezu. Rovnako sa ukázalo, že okrem vyššie popísaných zlúčenín usmerňujúcich prenos do jadra, je možné pripojiť k zlúčenine podlá vynálezu ešte druhú zlúčeninu, charakteristickú jej schopnosťou kondenzovať DNA. Takéto zlúčeniny sú menovite popísané v prihláške FR 95/01865.
Zlúčenina podlá vynálezu je prítomná v množstve, ktoré je dostatočné na reakciu s nukleovou kyselinou podlá vynálezu. Takto sa hmotnostný pomer zlúčenina/nukleová kyselina pohybuje v rozsahu od 0,01 po 5 a výhodnejšie od 0,25 po 0,5.
Pokial ide o transfekčné činidlo prítomné v kompozícii podlá vynálezu, je toto činidlo zvolené zo skupiny, ktorá zahŕňa katiónové polyméry a lipofekčné činidlá.
V rámci vynálezu je katiónovým polymérom výhodne zlúčenina so všeobecným vzorcom I (I) v ktorom
R môže znamenať atóm vodíka alebo skupinu všeobecného vzorca
n znamená celé číslo od 2 do 10 a p a q sú celé čísla, pričom platí, že súčet p+q ma takú hodnotu, že molekulová hmotnosť polyméru sa pohybuje v rozsahu 100 a 107 Da.
Je samozrejmé, že sa hodnota všeobecného substituenta n môže meniť v jednotlivých štruktúrnych podjednotkách, ktorých počet v zlúčenine všeobecného vzorca I je vyjadrený všeobecným symbolom. Takýto všeobecný vzorec zahŕňa ako homopolyméry, tak aj heteropolyméry.
Výhodnejšie vo všeobecnom vzorci n znamená číslo od 2 po 5. Mimoriadne výhodné vlastnosti majú polyméry polyetylénimínu. (PEI) a polypropylénimínu (PPI) . Vhodnými polymérmi na realizáciu vynálezu sú polyméry, ktorých molekulová hmotnosť sa pohybuje medzi 103 až 5.106. Ako príklad je možné uviesť polyetylénimín s molekulovou hmotnosťou 50000 Da (PEI50K) alebo polyetylénimín s molekulovou hmotnosťou 800000 Da (PEI800K).
Polyetylénimíny PEI50K a PEI800K sú komerčne dostupné. Pokiaľ ide o ostatné polyméry všeobecného vzorca I, môžu byť tieto polyméry pripravené postupom, ktorý je popísaný v patentovej prihláške FR 94 08735.
Aby sa dosiahol optimálny účinok kompozícií podľa vynálezu, sú príslušné podiely polyméru a nukleovej kyseliny vybrané tak, že molárny pomer R amínov polyméru k fosfátom nukleovej kyseliny sa pohybuje od 0,5 do 50, výhodnejšie od 5 do 30. Mimoriadne výhodné výsledky sa dosiahli s použitím 5 až 15 amínových ekvivalentov na náboj nukleovej kyseliny.
Pokiaľ ide o lipofekčné činidlá, ide o amfifilné molekuly, ktoré obsahujú minimálne jednu katiónovú hydrofilnú oblasť, napríklad polyamín, a lipofilnú oblasť. Katiónová oblasť, tvorená výhodne polyamínom s katiónovým nábojom, je schopná viazať sa reverzibilne s nukleovou kyselinou, ktorá ma negatívny náboj. Táto interakcia silne kondenzuje nukleovú kyselinu. Lipofilná oblasť túto iónovú interakciu zneprístupňuje pred vonkajším vodným prostredím tým, že vytvorenú nukleolipidovú časticu pokrýva lipidovým povlakom.
Tieto lipofekčné činidlá môžu byť výhodne vybrané z (II) polyamínov, ktorých oblasť zodpovedá všeobecnému vzorcu II v ktorom m znamená celé číslo väčšie alebo rovné 2 a n je celé číslo väčšie alebo rovné 1, pričom hodnota m sa môže meniť v jednotlivých štruktúrnych jednotkách, ktorých počet v zlúčenine so všeobecným vzorcom II je vyjadrený všeobecným symbolom n. Výhodne sa m pohybuje od 2 do 6 a n sa pohybuje od 1 po 5. Ešte výhodnejšie je polyamínová oblasť tvorená spermínom, thermínom alebo ich analógmi, ktoré si zachovali schopnosť viazať sa na DNA. Pokial ide o lipofilnú oblasť, je táto oblasť tvorená aspoň jedným nasýteným alebo nenasýtením reťazcom cholesterolu, prírodným alebo syntetickým lipidom schopným tvoriť lamelárne alebo hexagonálne fázy, pričom uvedený uhlovodíkový reťazec je kovalentne viazaný na hydrofilnú oblasť.
Patentová prihláška EP 394 111 popisuje ďalšie lipopolyamíny so všeobecným vzorcom III
R (III) v ktorom R znamená konkrétne skupinu so všeobecným vzorcom (RXR2) N-CO-CH-NH-CO-, ktoré je možné použiť v rámci vynálezu.
Ako príklad týchto lipopolyamínov možno menovite uviesť dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS) a 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidyletanolamín (DPPES).
Lipopolyamíny popísané v patentovej prihláške FR 9414596 môžu byť takisto výhodne použité ako transfekčné činidlo podlá vynálezu. Tieto lipopolyamíny majú vyššie uvedený všeobecný vzorec III, v ktorom R znamená skupinu (IV)
kde
X a X' nezávisle jeden na druhom znamenajú atóm kyslíka, metylénovú skupinu -(CH2)q, v ktorej q je rovné 0, 1, 2 alebo 3, alebo amínovú skupinu -NH- alebo -NR'-, kde R' znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy
Y a Y' nezávisle jeden na druhom znamenajú metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo skupinu C=S,
R3, R4 a R' nezávisle jeden na druhom znamenajú atóm vodíka alebo substituovanú či nesubstituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy
Rb znamená derivát cholesterolu alebo alkylamínovú skupinu -NR'R2, kde R1 a R2 nehzávisle jeden na druhom znamenajú nasýtenú alebo nenasýtenú, priamu alebo rozvetvenú alifatickú skupinu obsahujúcu 12 až 22 uhlíkových atómov a
P znamená číslo od 0 do 5
Ako zástupcu lipopolyamínov možno menovite uviesť 2,5-bis(3-aminopropylamino) pentyl (dioktadecylkarbamoylmetoxy) acetát a 1,3-bis- (3-aminopropylamino) -2-propyl (dioktadecylkarbamoylmetoxy) acetát.
Patentové prihlášky EP 394 111 a RF 94/14596 takisto opisujú spôsob použiteľný na prípravu zodpovedajúcich lipopolyamínov.
Mimoriadne výhodne možno v rámci vynálezu použiť dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS), 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidyletanolamín (DPPES), 2,5-bis-(3-aminopropylamino) pentyl (dioktadecylkarbamoylmetoxy) acetát alebo 1,3-bis-(3-a12 minopropylamino)-2-propyl(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát.
Na dosiahnutie optimálneho účinku zlúčeniny podlá vynálezu sú podiely polyaminov a nukleových kyselín výhodne určené tak, aby sa pomer R kladných nábojov transfekčného činidla k záporným nábojom nukleovej kyseliny pohyboval od 0,1 do 10 a výhodnejšie od 0,5 do 2.
Prítomnosť zlúčeniny podlá vynálezu v transfekčnej kompozícii je výhodná z niekoľkých dôvodov. Predovšetkým dôsledkom jej prítomnosti je výrazne nižšia toxicita, čo v budúcnosti napríklad umožňuje transfekciu buniek, ktoré sú citlivé na charakter transfekčného činidla, ako sú napríklad hematopoetické bunky, ak sa použijú lipopolyamíny.
V kompozíciách podľa vynálezu môže nukleovou kyselinou byť tak kyselina deoxyribonukleová, ako aj kyselina ribonukleová. Môže ísť o sekvencie prirodzeného alebo umelého pôvodu, menovite o genómovú DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA alebo o hybridné, syntetické alebo polosyntetické sekvencie. Tieto nukleové kyseliny môžu byť ľudského, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho, vírusového alebo iného pôvodu. Môžu byť získané akoukoľvek známou technikou, menovite vytriedením génových bánk, chemickou syntézou alebo enzýmovou modifikáciou sekvencií získaných s vytriedením bánk. Inak môžu byť zabudované do vektorov, ako sú plazmidové vektory.
Pokiaľ ide o deoxyribonukleové kyseliny, tieto kyseliny môžu byť jednovláknové alebo dvojvláknové. Tieto deoxyribonukleové kyseliny môžu kódovať terapeutické gény, regulačné sekvencie transkripcie alebo replikácie, antimediátorové sekvencie (antisens sekvencie), oblasti väzby na iné bunkové zložky, atď.
Terapeutickým génom sa v rámci vynálezu rozumie menovite každý gén kódujúci proteínový produkt, ktorý má terapeutický účinok. Takto kódovaným proteínovým produktom môže byť proteín, peptid a podobne. Tento proteínový produkt môže byť homologický vzhladom na cielovú bunku (t.j. produkt, ktorý je normálne exprimovaný v cieľovej bunke v prípade, že táto bunka nevykazuje žiadnu patológiu). V tomto prípade expresia proteínu napríklad lieči nedostatočnú expresiu tohto proteínu alebo proteínu s obmedzenou aktivitou z dôvodu určitej modifikácie alebo uvedená expresia nadprodukuje uvedený proteín. Terapeutický gén môže tiež kódovať mutant bunkového proteínu, ktorý má vyššiu stabilitu, modifikovanú aktivitu a podobne. Uvedený proteínový produkt môže byť tiež heterologický vzhľadom na cieľovú bunku. V tomto prípade môže napríklad exprimovaný proteín čiastočne doplňovať alebo úplne substituovať nedostatočnú účinnosť v bunke, čím bunke umožňuje bojovať proti danej patológii alebo v nej stimulovať imunitnú odpoveď.
Ako príklady terapeutických produktov možno v rámci vynálezu uviesť menovite enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF a podobne (FR 92 03120), rastové faktory, neurotransmitery (prenášače nervových vzruchov) alebo ich prekurzory, alebo enzýmy syntézy, tropické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotropín, atď., apolyproteíny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atď. (FR 93 05125), dystrofín alebo minidystrofin (FR 9111947), proteín CFTR spojený s mukoviscidózou, gény potláčajúce nádory (tumorsupresívne gény): p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, atď. (FR 93 04745), gény kódujúce faktory ovplyvňujúce koaguláciu (zrážanie krvi) : faktory VII, VIII, IX, gény zúčastnené na distribúcii DNA, sebevražedné gény (tymidín-kináza, cytozín-deamináza), atď.
Terapeutickým génom môže byť tiež antimediátorový gén alebo antimediátorová sekvencia, ktorá v cieľovej bunke umožňuje reguláciu expresie génov alebo transkripcie bunkových mRNA. Takéto sekvencie . môžu byť prepísané v bunke napríklad vo forme RNA, ktoré sú komplementárne k bunkovým mRNA a blokovať tak ich transláciu na proteíny s použitím techniky popísanej v patente EP 140 308. Uvedené antimediátory takisto obsahujú sekvencie kódujúce ribozómy, ktoré sú schopné selektívne zničiť cieľové RNA (EP 321 201).
Ako už bolo vyššie uvedené, nukleová kyselina môže niesť jeden alebo niekoľko génov kódujúcich antigénový peptid, ktorý je schopný vyvolať v človeku alebo zvierati imunitnú odpoveď. V rámci tejto špecifickej formy uskutočnenia vynálezu, vynález teda umožňuje realizáciu buď vakcín alebo imunoterapeutickej liečby človeka alebo zvieraťa, zameranú najmä proti mikroorganizmom, vírusom, alebo rakovine. Menovite môže ísť o špecifické antigénové peptidy Epstein-Barrovej vírusu, vírusu HIV, vírusu hepatitídy B (EP 185 573), vírusu pseudobesnoty alebo o špecifické nádorové peptidy (EP 259 212) .
Uvedená nukleová kyselina výhodne tiež obsahuje sekvencie umožňujúce expresiu terapeutického génu alebo génu kódujúceho antigénový peptid v žiadanej bunke alebo v žiadanom orgáne. Môže ísť o sekvencie, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu uvažovaného génu v prípade, keď sú tieto sekvencie schopné fungovať v infikovanej bunke. Môže tiež ísť o sekvencie iného pôvodu (zodpovedné za expresiu ostatných proteínov alebo dokonca o syntetické sekvencie). Menovite môže ísť o promótorové sekvencie eukaryotických alebo vírusových génov. Napríklad môže ísť o promótorové sekvencie pochádzajúce z genómu bunky, ktorá má byť infikovaná. Rovnako môže ísť o promótorové sekvencie pochádzajúce z genómu vírusov. Z tohto hľadiska možno napríklad uviesť promótory génov E1A, MLP, CMV, RSV, atď. . Okrem toho môžu byť tieto sekvencie modifikované pridaním aktivačných sekvencií, regulačných sekvencií, atď..
Nukleová kyselina inakšie môže takisto niesť signálnu sekvenciu, konkrétne pred terapeutickým génom, smerujúcu terapeutický produkt, ktorý sa syntetizoval, do sekrečných ciest bunky. Touto signálnou sekvenciou môže byť prirodzená signálna sekvencia terapeutického produktu, alebo môže takisto ísť o každú inú funkčnú signálnu jednotku alebo o umelú signálnu sekvenciu.
Kompozícia podľa vynálezu výhodne obsahuje navyše jeden alebo niekoľko neutrálnych lipidov. Takéto kompozície sú mimoriadne výhodné, hlavne v prípade, keď je pomer R nízky. Prihlasovateľ v skutočnosti dokázal, že pridanie neutrálneho lipidu umožňuje zlepšiť tvorbu nukleolipidových častíc, a čo je prekvapujúce, priaznivo ovplyvniť prenikanie častice do bunky v dôsledku stabilizácie membrány uvedenej bunky.
Výhodne sa použili neutrálne lipidy zo skupiny lipidov s dvomi mastnými reťazcami.
Mimoriadne výhodne sa používajú prírodné a syntetické lipidy, zwitteriónové lipidy alebo lipidy zbavené iónového náboja za fyziologických podmienok. Uvedený lipid môže byť výhodne vybraný zo skupiny zahŕňajúcej dioleoylfosfatidyletanolamín (DOPE), di-stearoyl,-palmitoyl, mirystoylfosfatidyletanolamín, ako aj ich 1- až 3-krát N-metylové deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykozyldiacylglyceroly, cerebrozidy (akými sú menovite galaktocerebrozidy) , sfingolipidy (akými sú menovite sfingomyelíny) alebo tiež asialogangliozidy (akými sú menovite asialoGMl a GM2) .
Tieto jednotlivé lipidy sa môžu získať buď syntézou alebo extrakciou z orgánov (napríklad z mozgu), alebo z vajec známymi klasickými technikami. Extrakcia lipidov sa môže uskutočniť použitím organických rozpúšťadiel (pozri o tom takisto Lehninger, Biochemistry).
Kompozícia používaná ako transfekčné činidlo podľa vynálezu výhodne obsahuje lipofekčný polymér obsahujúci 0,1 až 20 ekvivalentov neutrálneho lipidu na jeden ekvivalent lipopolyamínov a výhodnejšie 1 až 5 ekvivalentov neutrálneho lipidu na jeden ekvivalent lipopolyamínov. V prípade, že transfekčné činidlo je katiónový polymér, potom kompozícia podľa vynálezu obsahuje okrem katiónového polyméru vo vyššie uvedených pomeroch 0,1 až 20 molárnych ekvivalentov neutrálneho lipidu na jeden molárny ekvivalent fosfátu nukleovej kyseliny, výhodnejšie 1 až 5 molárnych ekvivalentov neutrálneho lipidu na jeden molárny ekvivalent fosfátu nukleovej kyseliny.
Kompozície podľa vynálezu môžu byť formulované do foriem, ktoré sú vhodné pre topické kutánne, perorálne, rektálne, vaginálne, parenterálne, intranasálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, intraokulárne, transdermálne a iné podanie. Tieto farmaceutické kompozície podlá vynálezu výhodne obsahujú farmaceutický prijateľný nosič na injektovatelné kompozície, menovite na priamu injekciu na úrovni požadovaného orgánu, alebo na podanie topickou cestou (na pokožku alebo sliznicu). Môže ísť menovite o izotonické sterilné roztoky alebo o suché kompozície, konkrétne získané lyofilizáciou, ktoré po pridaní vody alebo fyziologického roztoku umožňujú rekonštitúciu injektovatelných tekutín..Dávky nukleovej kyseliny na injekciu, ako aj počet podaní, môžu byť prispôsobené rôznym ukazovateľom a sú závislé na konkrétnom použitom spôsobe podania, na liečenom patologickom stave, na type génu, ktorý má byť exprimovaný, alebo tiež na požadovanom čase liečby.
Tieto kompozície môžu byť použité s výhodou na transfekciu širokého spektra bunkových typov, medzi ktoré patria napríklad hematopoetické bunky, lymfocyty, hepatocyty, endotelové bunky, melanómové bunky, bunky karcinómov a sarkómov, bunky hladkých svalov, neuróny a astrocyty.
Vynález takto poskytuje mimoriadne výhodnú metódu na liečenie chorôb, ktorá využíva in vitro, ex vivo alebo in vivo transfekciu nukleovej kyseliny, ktorá je schopná korigovať uvedenú chorobu, v kombinácii s transfekčným činidlom katiónového typu alebo lipofekčným polymérom a vyššie definovanou zlúčeninou. Táto metóda je konkrétne použiteľná na choroby spôsobené nedostatočnosťou proteínového alebo DNA produktu, pričom nukleová kyselina, ktorá je podaná v rámci uvedenej kompozície, kóduje uvedený proteínový produkt alebo obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu uvedenému DNA produktu. Kompozície podlá vynálezu sú mimoriadne zaujímavé kvôli ich biologickej schopnosti a ich transfekčnej úrovni.
Vynález sa tiež dotýka použitia podlá vynálezu zlúčeniny spojenej s receptorovým ligandom, protilátkou, alebo derivátom protilátky na zacielenie nukleovej kyseliny k bunkám exprimujúcim zodpovedajúce receptory alebo antigény. V rámci tejto stratégie sa ligand, protilátka alebo derivát protilátky naviaže na uvedenú zlúčeninu a dôjde ku zlepšeniu transfekčnej schopnosti takto získanej chimérickej molekuly v porovnaní so samotnou zlúčeninou.
V nasledujúcej časti popisu budé vynález bližšie objasnený pomocou príkladov jeho konkrétneho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a vôbec neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne definovaný patentovými nárokmi.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na pripojených výkresoch • obr.l znázorňuje v hodnotách svetelnej intenzity účinnosti transfekcií uskutočnených podľa vynálezu v rôznych bunkových typoch a • obr.2 znázorňuje vyhodnotenie účinnosti transfekcií uskutočnených v prítomnosti a neprítomnosti HMG1
Príklady uskutočnenia vynálezu
Materiál a metódy
Štruktúra použitá na overenie kompozícií je podľa vynálezu plazmid nesúci gén kódujúci luciferázu (Luc), ktorý je označený pCMV-Luc.
Uvedený plazmid pCMV-Luc obsahuje promótor z cytomegalovírusu (CMV) vybraný z plazmidového vektora pcDNA3 (Invitrogen) štiepením s enzýmami Mlul a HindlII a umiestnený pred génom kódujúcim luciferázu·, vloženým v miestach Mlul a HindlII do vektora pGL basic Vector (Promega).
Príklad 1
Príprava potkanieho proteínu HMG
1.1. Expresia proteínu HMG1 v E. coli
Tento rekombinantný proteín pochádzajúci z cicavca bol pripravený nadprodukciou v E. coli.
Plazmid T7-RHMG1 kódujúci potkaní proteín HMG1 (M.E.
Bianchi, Gene, 104 (1991) 271-271) sa vnesie do kmeňa E. coli
BL21(DE3). Tento kmeň sa potom kultivuje pri teplote 37 °C v kultivačnom LB médiu + Ampicillin (25 mg/L). Z izolovanej kolónie sa potom získa inokulum, ktorým sa naočkuje na 500 ml. Keď absorbancia kultúry pri 600 nm dosiahne hodnotu 0,7, indukuje sa syntéza HMG1 pridaním IPTG do konečnej koncentrácie 0,5 mM. Produkčný kmeň HMG1 sa potom ešte kultivuje ďalšie 2 hodiny a 30 minút v prítomnosti IPTG. Potom sa bunky zozbierajú odstredením (5000xg 20 minút) , izolované bunky sa premyjú resuspendovaním v 200 ml vody a opakovane odstredia. Bunkový pelet získaný po odstredení sa uskladňuje pri teplote -80 °C až do okamžiku purifikácie.
1.2. Purifikácia rekombinantného proteínu HMG1
Purifikácia proteínu HMG1 môže byť uskutočnená chromatograf iou kultúry kmeňa E. coli popísanej v príklade 1.1, napríklad s použitím nasledujúcej metodiky.
Pokial nie je výslovne inak uvedené, sú všetky purifikačné stupne, popísané nižšie, uskutočňované pri teplote 4 °C. Bunky získané z 500 ml kultúry sa resuspendujú v 15 ml 50 mM Tris/HClpufra, pH 7,7, ktorý obsahuje 500 μΜ EDTA, 5 mM DTT, 200 μΜ produktu Pefabloc SC (4-(2-aminoetyl)benzensulfonylfluoridhydrochlorid) a 10% (hmotn./obj.) glycerol. Po dezintegrácii buniek pôsobením ultrazvuku počas 15 minút sa rozbité bunky oddelia odstredením (50000xg počas jednej hodiny). Získaný bunkový extrakt sa potom delí chromatografiou na kolóne Sephadex G25 (Pharmacia) v ekvilibrovanom stave, pričom elúcia kolóny sa uskutočňuje s použitím pufru A (20 mM Hepes, pH 7,9 obsahujúci 400 mM NaCl, 200 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 μΜ Pefabloc SC, 0,2% Nonidet P40 a 10% glycerol). Frakcie obsahujúce proteín sa oddelene zozbierajú a následne sa táto frakcia delí chromatografiou na kolóne DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia), ktorá sa ekvilibruje s pufrom A. Proteínová frakcia nezachytená na
kolóne sa postupne mieša s pevným síranom amónnym až do
dosiahnutia konečnej koncentrácie 2,8 M. Po dvoch hodinách sa
suspenzia odstredí (30000xg počas 15 minút). Supernatant sa
potom delí chromatografiou na kolóne Phenyl-Superose HR 5/5
(Pharmacia) ekvilibrovanej s pufrom 20 mM Hepes, pH 7 ,9,
obsahujúcom 200 mM EDTA, 500 μΜ DTT a 2,8 M síran amónny.
Proteíny sa potom z kolóny eluujú s použitím lineárne klesajúceho gradientu síranu amónneho (2,8M po 0 M) v rovnakom pufri. Frakcie obsahujúce proteín HMG1 sa spoja a ďalej sa dialyzujú proti pufru 50 mM Tris/HCl, pH 7,7, obsahujúcom 1 mM EDTA a 500 μΜ DTT. Táto vzorka sa potom nanesie na kolónu MonoQ HR 5/5 (Pharmacia), ktorá sa potom eluuje s použitím lineárneho gradientu chloridu sodného (0 až 0,5M) v pufri 50 mM Tris/HCl, pH 7,7 obsahujúcom 500 μΜ DTT. Proteín HMG1, ktorý tvorí symetrický absorpčný pík (280 nm), sa oddelene zbiera v uvedenom pufri. Proteín HMG1 sa potom po zahustení odstredením v odstredivke Centrikon 10 vyberie s pufrom 10 mM Mes, pH 6,2 obsahujúcom 140 mM NaCl a 500 μΜ DTT. Proteín HMG1 sa uskladňuje pri teplote -80 °C až do chvíle jeho ďalšieho použitia. Tento preparát vykazuje jediný migrujúci proteínový pás a má molekulovú hmotnosť 31 000 (stanovenú analýzou uskutočnenou elektroforézou za denaturačných podmienok (SDS) a po vyfarbení s Coomassie). Celkový výťažok purifikácie je 850 μg čistého proteínu HMG1 z 500 ml východiskovej kultúry.
Príklad. 2
In vitro prenos nukleovej kyseliny do cicavčích buniek
Tento príklad ukazuje, ako môže byť proteín typu HMG1, ktorý sa viaže na DNA a ktorý je importovaný aktívnym spôsobom do jadra, použiť na stimuláciu transfekcie plazmidovej DNA.
Plazmid obsahujúci gén kódujúci luciferázu (Luc), ktorý bol popísaný vyššie, sa použil ako konštrukcia na demonštrovanie účinnosti.
Protokol predpokladá všetky platničky s 24 jamkami (0
16mm) , na ktorých sa uskutočňuje zber 2 dni po transfekcii (konfluencia buniek). Všetky parametre môžu byť úmerne modifikované.
V deň J sa bunky NIH 3T3 (ATCC: CRL1658), 3LL (Isakov N. a kol., JNCI 71 (1983) 139-145), H460 (Maxwell a kol., Oncogene 8 (1993), 3421-3429) sa naočkujú v množstve 105 na jamku.
V deň J+2 sa bunky prepláchnu PBS (kvôli odstráneniu stôp séra) a zozbiera sa 250 ml RPMI (3LL a H460) alebo DMEM (NIH 3T3), prípadne obohateného s 10% fetálnym telacím sérom (SFV, sérum fetal de veau).
Kompozícia použitá na transfekciu: na ekvivalent jamky sa pridá do kyvety:
H2O doplniť do 20 ml,
NaCl doplniť do konečnej koncentrácie 140 mM
0,5 mg plazmidovej DNA
125 ng HMGl a následne sa zmes mierne mieša a inkubuje pri izbovej teplote počas 15 minút, potom sa pridá k zmesi 1,5 nmólu lipofekčného činidla DOGS. Získaná zmes sa znovu mierne mieša a inkubuje pri izbovej teplote počas 15 minút.
Bunky sa. transfekujú pridaním 20 ml zmesi DNA/HMG1lipofektant v kultivačnom prostredí a inkubáciou počas 2 až 4 hodín pri teplote 37 °C. Toto prostredie sa potom nahradí s kompletným prostredím.
V deň J+4 sa bunky opláchnu pri izbovej teplote s 250 ml PBS, podrobia sa lýze v 100 ml pufru ad hoc (Reportér (Promega) + TCK a Aprotinin). Na meranie aktivity syntetizovanej luciferázy sa použije 10 ml lyzátu a 50 ml substrátu (Promega).
Na obr.l sú zhrnuté výsledky získané pre tri vyššie uvedené bunkové typy v prítomnosti meniaceho sa množstva proteínu HMGl.
Na obr.2 sú prehľadným spôsobom uvedené stimulačné faktory transfekcie získané pridaním rôznych množstiev proteínu HMGl.
Zvýšenie účinnosti transfekčie š prôťéínom HMGl je premenlivé a závisí na bunkovom type.
Takto možno pozorovať, že maximálne zlepšenie sa dosiahne v prípade, keď je prostredie obsahujúce kompozíciu nevyhnutnú na transfekciu, obohatené s 10% SVF. Je to zaujímavé, pretože prítomnosť SVF predstavuje podmienky, s ktorými sa stretávame in vivo. Na druhej strane je významné, že prítomnosť SVF zníži účinnosť transfekčie v prípade, keď nie je prítomný proteín HMGl. Možno predpokladať, že prítomnosť SVF v kultivačnom prostredí zmenší množstvo DNA schopné preniknúť do buniek. V rámci tejto úvahy možno urobiť záver, že HMGl je mimoriadne výhodný na transfekciu za podmienok, keď je množstvo DNA limitujúcim faktorom.
Optimálny hmotnostný pomer HMGl/DNA na transfekciu sa pohybuje od 0,25 po 0,5. Takéto podmienky nie sú popísané ako podmienky schopné kondenzovať DNA (Bottger M. a kol., B.B.A. 950 (1988), 221-228; Stros M. a kol., N.A.R. 22 (1994), 1044-1051). V skutočnosti plazmid nie je nasýtený proteínom HMGl (Kohlstaedt L.A. a kol., Biochemistry 33 (1994), 12702-12707). Účinok proteínu BMG1 je teda vysvetlený jeho schopnosťou viazať sa na DNA a byť transportovaný k jadru bunky.

Claims (24)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Farmaceutická kompozícia použitelná na transfekciu aspoň jednej nukleovej kyseliny, vyznačená tým, že okrem uvedenej nukleovej kyseliny obsahuje zlúčeninu spájajúcu schopnosť smerovania tejto DNA do jadra skupiny aspoň jednu viazať DNA a schopnosť a aspoň jedno transfekčné katiónových polymérov a činidlo vybrané zo lipofekčných činidiel.
  2. 2. Farmaceutická kompozícia použitelná na transfekciu aspoň jednej nukleovej kyseliny, vyznačená tým, že okrem uvedenej nukleovej kyseliny obsahuje aspoň jednu zlúčeninu, ktorá patrí ku skupine HMG alebo niektorému z ich derivátov a aspoň jedno transfekčné činidlo vybrané zo skupiny katiónových polymérov a lipofekčných činidiel.
  3. 3. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 1 alebo 2, vyznačená t ý m, že zlúčenina je vybraná zo skupiny proteínov typu HMG1, 2, I, Y, 14 a '17 a ich derivátov.
  4. 4. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačená tým, že zlúčenina je tvorená celkom alebo časťou ludského proteínu HMG1 alebo niektorým z jeho derivátov alebo homológov.
  5. 5. Farmaceutická kompozícia podlá nárokov niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačená tým, že uvedená zlúčenina je navyše polyglykozylovaná, sulfónovaná, fosforylovaná alebo modifikovaná buď s komplexnými cukrami alebo s lipofilným činidlom.
  6. 6. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z nárokov 1 až 5, vyznačená tým, že uvedená zlúčenina je navyše spojená s bunkovým alebo jadrovým receptorovým ligandom.
  7. 7. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 6 , vyznačená tým, že transfekčným činidlom je aspoň jeden katiónový polymér so všeobecným vzorcom I
    -n-(ch2)q7_ (I) v ktorom
    R môže znamenať atóm vodíka alebo skupinu so všeobecným vzorcom y<CH2)n-Nn znamená celé číslo od 2 po 10 a p a q znamenajú celé čísla, pričom súčet p+q má takú hodnotu, že stredná molekulová hmotnosť polyméru sa pohybuje do 100 po 10'
  8. 8. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačená .tým, že transfekčné činidlo je katiónový polymér vybraný zo skupiny zahrňujúcej polyetylénimín (PEI) a polypropylénimín (PPI) .
  9. 9. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 8, vyznačená tým, že ide o polyetylénimín so strednou molekulovou hmotnosťou 50 000 (PEI50K) alebo o polyetylénimín so strednou molekulovou hmotnosťou 800 000 (PEI800K).
  10. 10. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z nárokov 1 až 6, vyznačená tým, že transfekčným činidlom je aspoň jedno lipofekčné činidlo obsahujúce aspoň jednu polyamínovú hydrofilnú oblasť so všeobecným vzorcom II v ktorom m znamená celé číslo vyššie alebo rovné 2 a n znamená celé číslo vyššie alebo rovné 1, pričom hodnota m sa môže meniť v jednotlivých uhlíkových skupinách nachádzajúcich sa v medzi dvoma amínovými skupinami, kovalentne viazanou s lipofilnou oblasťou typu nasýteného alebo nenasýteného uhlovodíkového reťazca cholesterolu, prírodného lipidu alebo syntetického lipidu schopného tvoriť lamelárne alebo hexagonálne fázy.
  11. 11. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 10, vyznačená tým, že polyamínová oblasť je výhodne tvorená spermínom, thermínom alebo ich analógmi, ktoré si zachovali schopnosť viazať nukleovú kyselinu.
  12. 12. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 10 alebo 11, vyznačená tým, že lipofilná oblasť má všeobecný vzorec IV kde
    X a X' nezávisle jeden na druhom znamenajú atóm kyslíka, metylénovú skupinu -(CH2)q, v ktorej q je rovné 0, 1,
    2 alebo 3, alebo amínovú skupinu -NH- alebo -NR'-, kde
    R' znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy,
    Y a Y' nezávisle jeden na druhom znamenajú metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo skupinu C=S,
    R3, R4 a R° nezávisle jeden na druhom znamenajú atóm vodíka alebo substituovanú alebo nesubstituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy,
    Rs znamená derivát cholesterolu alebo alkylamínovú skupinu -NRŽR2, kde R1 a R2 nezávisle jeden na druhom znamenajú nasýtenú alebo nenasýtenú, priamu alebo rozvetvenú alifatickú skupinu obsahujúcu 12 až 22 uhlíkových atómov a p znamená číslo od 0 po 5.
  13. 13. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z nárokov 1 až 6 a
    10 až 12, vyznačená tým, že transfekčné činidlo je výhodne tvorené lipopolyamínom vybraným zo skupiny zahrňujúcej dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS), 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidyletanolamín (DPPES), 2,5-bis(3-aminopropyiamino)pentyl(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát alebo 1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl(dioktadecylkarbamoylmetoxy) acetát.
  14. 14. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z nárokov 1 až 6 a
    10 až 13, vyznačená tým, že transfekčným činidlom je dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS).
  15. 15. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačená tým, že nukleová kyselina je deoxyribonukleová kyselina.
  16. 16. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačená tým, že nukleová kyselina je ribonukleová kyselina.
  17. 17. Farmaceutická kompozícia pódia nároku 15, vyznačená tým, že nukleová kyselina je chemicky modifikovaná.
  18. 18. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 15, 16 alebo 17, v yznačená tým, že nukleová kyselina je antimediátorová.
  19. 19. Farmaceutická kompozícia podía niektorého z nárokov 15 až 18, vyznačená tým, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gén,
  20. 20. Farmaceutická kompozícia podía niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačená tým, že obsahuje navyše jeden alebo niekoľko neutrálnych lipidov.
  21. 21. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 20, vyznačená tým, že jeden alebo niekoľko neutrálnych lipidov je vybraných zo skupiny zahrňujúcej syntetické alebo prírodné lipidy, zwitteriónové lipidy alebo lipidy zbavené iónového náboja za fyziologických podmienok.
  22. 22. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 20 alebo 21, vyznačená tým, že jeden alebo niekolko neutrálnych lipidov je vybraných z množiny zahrňujúcej dioleoylfosfatidyletanolamín (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidyletanolamín (POPE) di-stearoyl, -palmitoyl, mirystoylfosfatidyletanolamín a ich 1- až 3-krát N-metylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykozyldiacylglyceroly, cerebrozidy (ako sú menovite galaktocerebrozidy), sfingolipidy (ako sú menovite sfingomyelíny) a asialogangliozidy (ako sú menovite asialoGMl a GM2) .
  23. 23. Použitie farmaceutickej kompozície podľa niektorého z nárokov 1 až 22 na in vitro, ex vivo alebo in vivo prenos nukleových kyselín.
  24. 24. Použitie zlúčeniny definovanej v nároku 1 alebo 2, viazanej s bunkovým receptorovým ligandom, protilátkou alebo s derivátom protilátky na zacielenie nukleových kyselín do buniek exprimujúcich receptory alebo antigény.
SK400-98A 1995-09-28 1996-09-27 Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof SK40098A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9511411A FR2739292B1 (fr) 1995-09-28 1995-09-28 Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations
PCT/FR1996/001516 WO1997012051A1 (fr) 1995-09-28 1996-09-27 Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK40098A3 true SK40098A3 (en) 1998-09-09

Family

ID=9483020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK400-98A SK40098A3 (en) 1995-09-28 1996-09-27 Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6153597A (sk)
EP (1) EP0854930A1 (sk)
JP (1) JPH11512704A (sk)
KR (1) KR19990063814A (sk)
AU (1) AU720697B2 (sk)
BR (1) BR9610719A (sk)
CA (1) CA2231064A1 (sk)
CZ (1) CZ94798A3 (sk)
FR (1) FR2739292B1 (sk)
HU (1) HUP9900317A3 (sk)
IL (1) IL123849A0 (sk)
NO (1) NO981322L (sk)
SK (1) SK40098A3 (sk)
WO (1) WO1997012051A1 (sk)
ZA (1) ZA968109B (sk)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2750704B1 (fr) 1996-07-04 1998-09-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de production d'adn therapeutique
US6383811B2 (en) * 1997-12-30 2002-05-07 Mirus Corporation Polyampholytes for delivering polyions to a cell
IT1299583B1 (it) * 1998-05-19 2000-03-16 Vander Way Limited Uso di proteine hmg-i per la preparazione di medicamenti ad attivita' citotossica
DE19925143A1 (de) * 1999-06-02 2000-12-07 Aventis Pharma Gmbh Neue liposomale Vektorkomplexe und deren Verwendung für die Gentherapie
DE19929104A1 (de) * 1999-06-24 2000-12-28 Aventis Pharma Gmbh Neue Vektorkomplexe und deren Verwendung für die Gentherapie
FR2814370B1 (fr) * 2000-09-22 2004-08-20 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei pour le ciblage de cellules souches du cerveau
CA2430653A1 (en) * 2000-11-27 2002-08-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University In Jerusalem Transfection of human embryonic stem cells
ATE388691T1 (de) * 2001-07-10 2008-03-15 Univ North Carolina State Träger zur freisetzung von nanopartikeln
FR2829136B1 (fr) 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
ITMI20011986A1 (it) * 2001-09-25 2003-03-25 San Raffaele Centro Fond Metodo e composizione per l'attivazione di cellule presentanti l'antigene
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
CA2665403C (en) 2006-10-04 2015-06-23 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof
EP3034539A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2646161B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5286634A (en) * 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5631237A (en) * 1992-12-22 1997-05-20 Dzau; Victor J. Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
SG54115A1 (en) * 1993-04-27 1998-11-16 Gerber Scient Products Inc Thermal printing apparatus with improved power supply
FR2722506B1 (fr) * 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
FR2739292A1 (fr) 1997-04-04
US6153597A (en) 2000-11-28
BR9610719A (pt) 1999-07-13
EP0854930A1 (fr) 1998-07-29
WO1997012051A1 (fr) 1997-04-03
NO981322D0 (no) 1998-03-24
FR2739292B1 (fr) 1997-10-31
MX9801920A (es) 1998-08-30
CA2231064A1 (fr) 1997-04-03
JPH11512704A (ja) 1999-11-02
HUP9900317A2 (hu) 1999-05-28
AU7136196A (en) 1997-04-17
IL123849A0 (en) 1998-10-30
HUP9900317A3 (en) 2001-10-29
KR19990063814A (ko) 1999-07-26
ZA968109B (en) 1997-04-21
CZ94798A3 (cs) 1998-07-15
AU720697B2 (en) 2000-06-08
NO981322L (no) 1998-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6200956B1 (en) Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof
US6172048B1 (en) Composition containing nucleic acids, preparation and uses
US7682626B2 (en) Polyvinylethers for delivery of polynucleotides to mammalian cells
JPH10502918A (ja) 核酸を含有する組成物、その製造および使用
JP2002515418A (ja) 肝細胞を標的とするポリエチレングリコール接合ポリ−ｌ−リシンのポリマー遺伝子キャリヤー
US6407178B1 (en) Cationic polymers, complexes associating said cationic polymers with therapeutically active substances comprising at least a negative charge, in particular nucleic acids, and their use in gene therapy
JPH10506001A (ja) 核酸複合体を高等真核生物の細胞に導入するための組成物
SK40098A3 (en) Pharmaceutical composition useful for nucleic acid transfection, and use thereof
WO1998046274A2 (en) Cationic polymers for nucleic acid transfection
MXPA01012802A (es) Copolimeros para el transporte de acidos nucleicos a las celulas.
AU737846B2 (en) Transfectant composition useful in gene therapy associating with a recombinant virus incorporating an exogenous nucleic acid and a non-viral and non-plasmid transfection agent
MXPA98001920A (en) Pharmaceutical composition useful for the transfection of nucleic acids and its u
AU737314B2 (en) Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same
MXPA97006016A (en) Composition containing nucleic acids, preparation and use
JP3095248B2 (ja) 核酸運搬体
FR2766194A1 (fr) Polymeres cationiques, complexes associant lesdits polymeres cationiques et des substances therapeutiquement actives comprenant au moins une charge negative, notamment des acides nucleiques, et leur utilisation en therapie genique