CZ94798A3 - Farmaceutická kompozice použitelná pro transfekci nukleových kyselin a její použití - Google Patents

Farmaceutická kompozice použitelná pro transfekci nukleových kyselin a její použití Download PDF

Info

Publication number
CZ94798A3
CZ94798A3 CZ98947A CZ94798A CZ94798A3 CZ 94798 A3 CZ94798 A3 CZ 94798A3 CZ 98947 A CZ98947 A CZ 98947A CZ 94798 A CZ94798 A CZ 94798A CZ 94798 A3 CZ94798 A3 CZ 94798A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
pharmaceutical composition
composition according
nucleic acid
group
compound
Prior art date
Application number
CZ98947A
Other languages
English (en)
Inventor
Francis Blanche
Béatrice Cameron
Joël Crouzet
Vincent Thuillier
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of CZ94798A3 publication Critical patent/CZ94798A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Farmaceutická kompozice použitelná pro transfekci nukleových kyselin a její použití
Oblast techniky
Vynález se týká oblasti genové terapie a vztahuje se zejména k přenosu in vitro, ex vivo nebo/a in vivo genetického materiálu. Zejména je zde navržena nová farmaceutická kompozice vhodná pro účinnou transfekci buněk. Vynález se zejména týká použití této kompozice.
Dosavadní stav techniky
Nedostatečnosti nebo./a anomálie v úrovni chromosomů (mutace, aberantní exprese, atd.) jsou příčinou četných dědičných nebo nedědičných onemocnění. V tomto ohledu je konvenční medicína již dlouho bezmocná. V současné době, kdy dochází k rozvoji genové terapie, se předpokládá, že bude napříště možné korigovat uvedený typ chromosomální aberace nebo těchto aberacím dokonce předcházet. Tento nový typ léčebné metody spočívá v tom, že se do budky nebo orgánu s aberací uvedeného typu zavede genetická informace za účelem korekce uvedené nedostatečnosti nebo anomálie anebo také za účelem exprese zainteresovaného terapeutického proteinu.
Hlavní překážku, která brání proniknutí nukleové kyseliny do cílové buňky nebo do cílového orgánu, představuje velikost a polyaniontový charakter uvedené nukleové kyseliny, které brání průchodu nukleové kyseliny skrze buněčné membrány.
Za účelem odstranění této překážky byly v současné době navrženy různé techniky, ze kterých lze uvést zejména transfekci holé DNA skrze plasmovou membránu in vivo (WO90/ 11092) a transfekci DNA pomocí transfekčního vektoru.
Pokud jde o transfekci holé DNA, dosahuje se zde stá• fl ···· fl flflflfl • · • · «
- 2 le ještě velmi nízké účinnosti. Holé nukleové kyseliny mají krátký plasmatický poločas života vzhledem k jejich degradaci působením enzymů a k jejich vylučování močovými cestami.
Pokud jde o druhou z uvedených technik, navrhuje tato techniky v podstatě dvě základní strategie.
První z těchto strategií využívá přirozené transfekční vektory, jakými jsou viry. Takto bylo navrženo použít adenoviry, herpesviry, retroviry a v nedávné době i adenopřidružené viry jako vektory pro uvedenou transfekci. Ukázalo se, že tyto vektory jsou výkonné v rovině transfekce, avšak nelze u nich bohužel zcela vyloučit určitá rizika patogeničnosti, replikace nebo/a imunogenicity, která jsou vlastní jejich virálnímu charakteru.
Druhá z uvedených strategií výhodně spočívá v tom, že se používají nevirální činidla schopná podpořit přenost a expresi DNA do eukaryontních buněk.
Předmět vynálezu se týká této druhé strategie.
Chemické nebo biochemické vektrory představují výhodnou alternativu přirozených virů a to zejména vzhledem k tomu, že u těchto chemických nebo biochemických vektorů neexistuje možnost imunologické odezvy nebo/a virální rekombinace.
Tyto posledně uvedené vektory nemají patogenní potenci, riziko multiplikace DNA uvnitř těchto vektorů je nulové a není jim připisováno žádné omezení . , pokud jde o velikost transfekované DNA.
Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce, kterými jsou kondenzovat HA určenou k transfekci a podpořit její celulární vazbu a průchod skrze plasmovou membránu a případně skrze obě jádrové membrány.
Vzhledem k polyaniontovému charakteru DNA nemá DNA
- 3 ·· ·♦·· žádnou přirozenou afinitu k plasmové membráně buněk s rovněž polyaniontovým charakterem. Za účelem eliminace tohoto nedostatku mají nevirální vektory obecně všechny náboje polykationtové.
Z dosud vyvinutých syntetických vektorů jsou nejvýhodnějšími vektory kationtové polymery typu polylysinu a DEAEdextranu nebo také kationtové nebo lipofekční lipidy. Tyto vektory mají schopnost kondenzovat DNA a podpořit její schopnost vázat se k buněčné membráně. V nedávné době byla navržena cílená transfekce mediované receptorem. Tato technika využívá princip kondenzace DNA díky kat iontovému polymeru, přičemž se dosáhne vázání získaného komplexu pomocí chemické kopulace probíhající mezi kationtovým polymerem a ligandem membránového receptoru přítomného na povrchu buněčného typu, který má být roubován. Rovněž byla popsána vytřídění receptoru na tranferrin, insulin nebo receptorů asialoglykoproteinů hepatocytů.
Nicméně všechny až dosud navržené syntetické vektory jsou ještě velmi vzdáleny tomu, kdy budou stejně výkonné jako virální vektory. To může být zejména důsledek nedostatečné kondenzace DNA určené k transfekci nebo/a důsledek obtíží, se kterými se transfekovaná DNA setkává při výstupu z endosomu a při pronikání do buněčného jádra. Ve skutečnosti transport DNA do jádra eukaryontní buňky v klidovém stavu způsobuje evidentní problémy, poněvadž rozměny jádrových pórů umožňují pouze difúzi proteinů s molekulovou hmotností nižší než 60 000 Da (o tom viz: I.Davis a kol., Ann.Rev.Biochem., 1995, 64, 865-896). Plasmová DNA mající molekulovou hmotnost vyšší než 10^ není tedy schopna přirozeným způsobem proniknout do jádra buňky pouhou difúzí.
Cílem vynálezu je navrhnou řešení tohoto problému.
• 0 0«··
- 4 Podstata vynálezu
Vynález navrhuje farmaceutickou kompozici použitelnou pro trasfekci alespoň jedné nukleové kyseliny, jejíž podstata spočívá v tom, že kromě uvedené nukleové kyseliny a alespoň jednoho tranfekčního činidla obsahuje alespoň jednu sloučeninu sdružující v sobě schopnost fixovat DNA a schop nost jádrově vektorizovat tuto DNA.
Sloučenina mající schopnost vázat DNA zahrnuje v rámci vynálezu jakoukoliv sloučeninu schopnou vázat se alespoň částečně na DNA, která má být vektorizována. Pokud jde o její schopnost vektorizovat uvedenou DNA, rozumí se touto schop ností v rámci vynálezu schopnost účinně vést uvedenou DNA skrze různé buněčné membrány nebo/a jádrové membrány až jí nakonec dovést do jádra ošetřevané buňky. Sloučenina podle vynálezu může mít rovněž například formu chimérické molekuly sdružující oblast vázání DNA s oblastí umožňující import DNA do jádra ošetřované buňky. V tomto specifickém případu lze oblasti vazby DNA zvolit z množiny zahrnující regulační proteiny schopné vázat se například ke specifickým sekvencím nebo naopak proteiny, o kterých je známo, že mají sekvenčně nedependentní afinitu k DNA. Pokud jde o oblast zprostředkující transport do jádra, může touto oblastí být například sekvence označovaná jako sekvence nls (nuclear lokalisation sequence). Takové sekvence budou moci být odvozeny v bipartit ním konsensu dedukovaného z nukleoplasminu nebo v konsensu antigenu T odvozeného z SV40.
V rámci specifické formy provedení se vynález týká farmaceutické kompozice použitelné pro transfekci alespoň jedné nukleové kyseliny, jejíž podstata spočívá v tom, že kromě uvedené nukleové kyseliny a alespoň jednoho transfekčního činidla obsahuje alespoň jednu sloučeninu náležející ke skupině proteinů typu HMG nebo některý z jejich derivátů.
·· ·· • ·
- 5 ·· ···· ·· ····
Proteiny typu HMG (High Mobility Group) jsou proteiny bohaté na aminokyseliny s nábojem a mají molekulovou hmotnost nižší než 30000 Da. Jsou rozpustné ve 2 až 5% kyselině chloristé a jsou klasicky extrahovány z chromatinu 0,35M chloridem sodným.
Klasicky jsou proteiny HMG rozděleny do třt skupin: proteiny HMG1/2 s molekulovou hmotností blízkou 25000, proteiny HMG14/17 s molekulovou hmotností blízkou 10-12000 a proteiny HMGI./Y, které mají složení blízké proteinům HMG14/17, avšak odlišnou tkáňovou distribuci v průběhu ontogeneze. Je známo, že primární sekvence je v průběhu evoluce zachována u všech těchto tří skupin.
Pokud jde konkrétně o proteiny skupiny HMG1./2, jsou tyto proteiny charakterizovány přítomností sekvence 80 aminokyselin s bázickou predominancí (náboj +20), která je označována jako box HMG a která tvoří vazebnou oblast DNA. V rámci této skupiny se rozlišují proteiny schopné se vázat na specifické sekvence dvouvláknové DNA a proteiny, jejichž vazebná specifičnost spočívá ve specifické trojrozměrné struktuře DNA. Do první kategorie patří proteiny UBF, SRY, TCF1, ABF2, které stimulují transkripci specifických genů (Greiss E.A. a kol.,J.Mol.Evol.(1993)37:204-210. Sekvence každého z těchto proteinu obsahuje jeden nebo několik boxů HMG. Do druhé kategorie patří proteiny HMG1 a HMG2. Jejich primární sekvence je charakterizována přítomností dvou boxů HMG a jedné kyselé sekvence na C-konci (Bustin M. B.B.A.(1990) 1094:231243). Tyto proteiny se specifickým způsobem váží na palindromické sekvence DNA extrudované do křížové struktury (mezivláknové párování v úrovni palindromu) nebo na sekvence DNA, které vykazují značné zakřivení. Oba tyto typy struktur mají společné to, že zde existuje rozšíření malého žlábku DNA, který se takto stane schopným přizpůsobit se k vazbě proteinů typu HMG1/2. Fyziologická úloha proteinů HMG1 a HMG2 nebyla až dosub objasněna. Nicméně bylo prokázáno, že telecí pro·· ···· ·· ···>
·· ·* • · I • · · • · · · « «' · · · · · · · I ···· · ·· ·· *« ··
- δ tein je aktivním způsobem transportován do jádra savčích buněk (L.Kuehl a kol., J.Biol.Chem.1985, 260,10361-10368).
Přihlašovatel nyní zcela neočekávaně prokázal, že je možné využít uvedené vlastnosti proteinů HMG, totiž jejich schopnost vázat DNA a schopnost aktivního transportu do jádra buněk, pro účinné podpoření transfekce heterologních nukleových kyselin sdružených s alespoň jedním transfekčním činidlem do jádra ošetřovaných buněk.
Výše uvedený výraz derivát zahrnuje v rámci vynálezu libovolný peptid, pseudopeptid (peptid zahrnující nebiochemické prvky) nebo protein odlišný od sloučeniny, tak jak byla definována výše, získaný jednou nebo několika modifikacemi genetického nebo./achemického charakteru. Pod pojmem modifikace genetického nebo/a chemického charakteru se zde rozumí jakákoliv mutace, substituce, delece, adice nebo/a modifikace jednoho nebo několika zbytků například uvažovaného proteinu. Přesněji vyjádřeno, chemickou modifikací se rozumí jakákoliv modifikace peptidu nebo proteinu provedená chemickou reakcí nebo chemickým roubováním biologické nebo nebiologické molekuly nebo biologických nebo nebiologických molekul na určitém počtu zbytků proteinu. Pod pojmem genetická modifikace se zde rozumí jakákoliv peptidová sekvence, jejíž DNA hybridizuje s uvedenými sekvencemi nebo s fragmenty těchto sekvencí a jejíž produkt vykazuje indikované aktivity. Takový derivát může být vytvořen za různými účely, například za účelem zvýšení afinity odpovídajícího polypeptidu k jeho ligandu DNA, za účelem zlepšení jeho produkční hladiny, za účelem zvýšení jeho rezistence vůči proteázám, za účelem zvýšení nebo/a modifikace některého z jeho účinků nebo za účelem získání nových farmakokinetických nebo/a biologických vlastností .
Z derivátů získaných adicí lze uvést například chimérické peptidové sekvence obsahující dodatečnou heterologní část přř_pojenou k jednomu konci. Výraz derivát rovněž zahrnu ·« ···· ·· ···· ·· ·· • · · · • · ·· ··· · · ” 4 9 9 9 9 9 9 9 ··· · »· ·· ·· ··
- 7 je proteinové sekvence, které jsou homologní s uvažovanou sekvencí a které pochází z jiných buněčných zdrojů a zejména z lidských buněk nebo z buněk ostatních organismů a mají účinnost stejného typu. Takové homologní sekvence mohou být získány hybridizačními pokusy s DNA. Tyto hybrididace mohou být provedeny za použití bank nukleových kyselin a za použití sondy tvořené nativní sekvencí nebo fragmentem této nativní sekvence za konvenčních rigorózních podmínek (Maniatis a kol.) (viz obecné techniky molekulární biologie) nebo výhodně za zpřísněných podmínek.
Kromě toho se v rámci vynálezu rovněž předpokládá využití výrazné afinity některých proteinů skupiny HMG nebo jejich derivátů k sekundárním strukturám přítomným na dvouvláknové DNA. Může se zejména jednat o čtyřvláknové struktury, u kterých bylo prokázáno, že HMG1 krysy má velmi silnou afinitu (Bianchi a kol. Sciences 1989, 243, 1056-1059). Takové struktury mohou být rovněž získány z přirozených sekvencí, jakými jsou sekvence ITR viru sdruženého s adenoviry, anebo mohou být zcela synteticky získány z umělých palyndromů.
V rámci výhodné formy provedení vynálezu je použitá sloučenina zvolena z množiny zahrnující proteiny typu HMG 1,2, I, Y, 14 a 17 a jejich deriváty. Tato sloučenina je výhodněji tvořena celkem nebo částí lidského proteinu HMG1 nebo některého z jeho derivátů nebo homologů, které byly definovány výše.
V rámci obzvláště výhodné formy provedení vynálezu obsahují kompozice podle vynálezu ještě směrovací prvek umožňující orientovat přenos nukleové kyseliny. Tento směrovací prvek může být mimobuněčným směrovacím prvkem umožňujícím orientovat přenos nukleové kyseliny do určitých typů buněk nebo do určitých požadovaných tkání (nádorové buňky, hepatické buňky, hepatopoesní buňky, atd.) Může se rovněž jednat o nitrobuněčný směrovací prvek umožňující orientovat přenos • · • · · · • ·
- 8 flflfl · · · · nukleové kyseliny do některých upřednostněných části buňky (mitochondrie, jádro, atd.).
Výhodněji je uvedený směrovací prvek vázán kovalentně nebo nekovalentně ke sloučenině podle vynálezu. Tento směrovací prvek může být rovněž vázán k nukleové kyselině.
V rámci výhodné formy provedení vynálezu je uvedená sloučenina vázána prostřednictvím dodatečné heterologní části, vázané k jednomu z jejích konců, k buněčnému receptorovému ligandu přítomnému na povrchu buněčného typu, jako je například cukr, transferrin, insulin nebo asialo-orosomukoidní protein. Může se rovněž jednat o ligand nitrobuněčného typu, jakým je signální sekvence lokalizace v jádře, nls, která uspřednostňuje akumulaci transfekované DNA v jádru.
Ze směrovacích prvků použitelných v rámci vynálezu lze uvést cukry, peptidy, oligonukleotidy nebo lipidy. Výhod ně se jedná o cukry nebo/a peptidy, jakými jsou protilátky nebo fragmenty protilátek, buněčné receptorové ligandy nebo fragmenty těchto ligandu, receptory nebo fragmenty těchto receptorů, atd. Zejména se může jednat o receptory růstových faktorů, receptory cytokinů, receptory buněčných lektinů nebo o receptory adhezních proteinů. Může se rovněž jednat o receptor transferrinu, HDD a LDL. Směrovacím prvkem může být rovněž cukr umožňující zacílení lektinů, jakými jsou asialoglykoproteinové receptory, nebo také fragment protilátky Fab umožňující zacílení receptoru fragmentu Fc imunoglobulínů.
Výhodně může být sloučenina podle vynálezu navíc polyglykosylována, sulfonována nebo./a fosforylována nebo/a naroubována na komplexní cukry nebo na lipofilní sloučeninu, jakou je například polyuhlíkový řetězec nebo derivát cholesterolu .
Kompozice podle vynálezu může samozřejmě obsahovat několik sloučenin podle vynálezu různé povahy. Stejně tak
9
- 9 se ukázalo možné připojit ke sloučenině podle vynálezu kromě výše popsané sloučeniny usměrňující přenos do jádra ještě druhou sloučeninu charakterizovanou její schopnosti kondenzovat DNA. Takové sloučeniny jsou zejména popsané v patentové přihlášce FR 95/01865.
Sloučenina podle vynálezu je přítomna v množství, které je dostatečné pro reakci s nukleovcu kyselinou pcdie vynálezu. Takto se hmotnostní poměr slcučenina/nukleová kyselina pohybuje v rozmezí od 0,01 do 5 a výhodněji v rozmezí od 0,25 do 0,5.
Pokud jde o transfekční činidlo přítomné v kompozici podle vynálezu, je toto transfekční činidlo zvoleno z množiny zahrnující kationtově polymery a lipcfekční činidla.
V rámci vynálezu je kationtovým polymerem výhodně sloučenina obecného vzorce I
N-(CHo)
I ά n R (I) ve kterém
R může znamenat atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce
n znamená celé číslo od 2 do 10 a p a q jsou celá čísla, přičemž platí, že součet p+q má tako vou hodnotu, že molekulová hmotnost polymeru se pchv7 buje mezi 100 a 10 Da.
Je samozřejmé, že se hodnota obecného substituentu • 4 «
4 · 4 • 4
- 10 n může v jednotlivých strukturních jednotkách, jejichž počet ve sloučenině obecného vzorce I je vyjádřen obecným symbolem p, měnit. Takto obecný vzorec I zahrnuje jak homopolymery, tak i heteropolymery.
Výhodněji n v obecném vzorci znamená číslo od 2 do 5. Obzvláště výhodné vlastnosti mají polymery polyethyleniminu (PEI) a polypropyleniminu (PPI). Výhodnými polymery pro reali zaci vynálezu jsou polymery, jejichž molekulová hmotnost se pohybuje mezi 10 a 5.10 . Jakožto příklad lze uvést polyethy lenimin s molekulovou hmotností 50 000 Da (PEI50K) nebo polyethylenimin s molekulovou hmotností 800 000 DA (PEI800K).
Polyethyleniminy PEI50K a PEI800K jsou komerčně dostup né. Pokud jde o ostatní polymery obecného vzorce I, mohou být tyto polymery připraveny postupem, který je popsán v patentové přihlášce FR 94 08735.
Aby se dosáhlo optimálního účinku kompozic podle vynálezu jsou příslušné podíly polymeru a kyseliny nukleové výhod ně zvoleny tak, že molární poměr R aminů polymeru k fosfátům nukleové kyseliny se pohybuje od 0,5 do 50, výhodněji od 5 do 30 . Obzvláště výhodných výsledků se dosáhne za použití 5 až 15 aminových ekvivalentů na náboj nukleové kyseliny.
Pokud jde o lipofekční činidla , jedná se o amfifilní molekuly obsahující alespoň jednu kationtovou hydrofilní oblast, například polyamin, a lipofilní oblast. Kationtová oblast, tvořená výhodně polyaminem a mající kationtový náboj, je schopná vázat se reverzibilně s nukleovou kyselinou mající negativní náboj. Tato interakce nukleovou kyselinu silně kondenzuje. Lipofilní oblast činí tuto iontovou interakci nepřístupnou pro vnější vodní prostředí tím, že vytvořenou nukleolipidovou částici pokrývá lipidovým povlakem.
Výhodně mohou být tato lipofekční činidla zvolena z
-11• · · · • · · ·
lipopolyaminů, jejichž polyaminová oblast odpovídá obecnému vzorci II
H2N-(-(CH)rn-NH-)n-H ve kterém m znamená celé číslo vyšší nebo rovné 2 a n je celé číslo vyšší nebo rovné 1, přičemž hodnota m se může měnit v jednotlivých strukturních jednotkách, jejichž počet ve slou cenině obecného vzorce II je vyjádřen obecným symbolem n. Výhodně se m pohybuje od 2 do 6 a n se pohybuje od 1 do 5. Ještě výhodněji je polyaminová oblast tvořena sperminem, therminem nebo jejich analogy, které si zachovaly schopnost vázat se k DNA. Pokud jde o lipofilní oblast, je tato oblast tvořena alespoň jedním nasyceným nebo nenasyceným řetězcem cholesterolu, přírodním nebo syntetickým lipidem schopným tvořit lamelární nebo hexagonální fáze, přičemž uvedený uhlovodíkový řetězec je kovalentně vázán k hydrofilní oblasti.
Patentová přihláška EP 394 111 popisuje další lipopopolyaminy obecného vzorce III
H-N-(—(CH)->N4- Η (III) 2 | m H n
R ve kterém R znamená zejména skupinu obecného vzorce (R^lNCO-CH-NH-CO-, které jsou schopné použití v rámci vynálezu.
Jako příklad těchto 1ipopolyaminů lze zejména uvést dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS) a 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidylethanolaminu (DPPES).
Lipopolyaminy popsané v patentové přihlášce FR 9414596 mohou být rovněž výhodně použity jakožto transfekční činidlo podle vynálezu. Tyto lipopolyaminy mají výše uvedený obecný
- 12 • · · · • · · ·
vzorec III, ve kterém R znamená skupinu
kde
X a X' nezávisle jeden na druhém znamenají atom kyslíku, methylenovou skupinu -(CH_) , ve které q je rovno 0, 1, z q nebo 3, nebo aminovou skupinu -NH- nebo -NR'-, kde
R' znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,
Y a Y' nezávisle jeden na druhém znamenají methylenovou skupinu, karbonylovou skupinu nebo skupinu C=S,
Rg, R4 a Rg nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,
Rg znamená derivát cholesterolu nebo alkylaminovou skupinu -NR^Rg, kde R^ a Rg nezávisle jeden na druhém znamenají nasycenou nebo nenasycenou, přímou nebo rozvětvenou alifatickou skupinu obsahující 12 až 22 uhlíkových atomů a p znamená číslo od 0 do 5.
Jako zástupce těchto lipopolyaminů lze zejména uvést
2,5-bis-(3-aminopropylamino)pentyl(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetát a 1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl(dioktadecyl karbamoylmethoxy)acetát.
Patentové přihlášky EP 394 111 a RF 94/14596 rovněž popisují způsob použitelný pro přípravu odpovídajících lipopolyaminů .
Obzvláště výhodně lze v rámci vynálezu použít diokta• · • · · · • · • · · ·· · · · · · ·· · · · ···· • · ·· · · · ···· · • · · · · · ··· ····· · · 9 9 9 9 9 9
- 13 decylamidoglycylspermin (DOGS), 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidylethanolaminu (DPPES), 2,5-bis-(3-aminopropylamino)pentyl(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetát nebo 1,3-bis(3-aminopropylamino)-2-propyl(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetát.
Za účelem dosažení optimálního účinku kompozice podle vynálezu jsou podíly polyaminu a nukleové kyseliny výhodně určeny tak, že poměr R kladných nábojů transfekčního činid la k záporným nábojům nukleové kyseliny se pohybuje od 0,1 do 10 a výhodněji Od 0,5 do 2.
Přítomnost sloučeniny podle vynálezu v transfekční kompozici je výhodná z několika důvodů. Především její přítomnost má za následek výrazně nižší toxicitu, což napříště například umožňuje transfekci buněk, které jsou citlivé na charakter transfekčního činidla, jakými jsou například hematopoesní buňky, za použití lipopolyaminů.
Nukleovcu kyselinou v kompozicích podle vynálezu může být jak kyselina descxyribcnukleová, tak i kyselina ribonukleová. Může se jednat o sekvence přirozeného nebo umělého původu, zejména o gencmovcu DNA, DNAc, RNAm, RNAt, RNAr nebo o hybridní, syntetické nebo polosyntetické sekvence. Tyto nukleové kyseliny mohou být lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virálního nebo jiného původu. Mohou být získány jakoukoliv o sobě známou technikou, zejména vytříděním bank, chemickou syntézou nebo také komplexními metodami, zahrnujícími chemickou nebo enzymatickou modifikaci sekvencí získaných vytříděním bank. Jinak mohou být zabudované do vektorů, jakými jsouplasmidové vektory.
Pokud jde o desoxyribonukleové kyseliny, tyto kyseliny mohou být jednovláknové nebo dvouvláknové. Tyto desoxyribonukleové kyseliny mohou kódovat terapeutické geny, regulační sekvence transkripce nebo replikace, antimediátorové sek··· · · • 0 • · • · • * vence (sekvence antisens), oblasti vazby k jiným buněčným složkám, atd..
Terapeutickým genem se v rámci vynálezu rozumí zejména každý gen kódující proteinový produkt mající terapeutický účinek. Takto kódovaným proteinovým produktem může být protein, peptid a podobně. Tento proteinový produkt může být homologní vzhledem k cílové buňce (tj. produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce v případě, že tato buňka nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě exprese proteinu například léčí nedostatečnou expresi tohoto proteinu v buňce nebo expresi neaktivního proteinu nebo proteinu omezeně aktivního v důsledku určité modifikace anebo uvedená exprese superexprimuje uvedený protein. Terapeutický gen může také kódovat mutantbuněčného proteinu, který má vyšší stabilitu, modifikovanou aktivitu a podobně. Uvedený proteinový produkt může být také heterologní vzhledem k cílové buňce. V tomto případě může například exprimovaný protein částečně doplňovat nebo zcela substituovat nedostatečnou účinnost v buňce, čímž buňce umožní bojovat proti dané patologii nebo v ní stimuluje imunitní odezvu.
Jakožto příklady terapeutických produktů lze v rámci vynálezu uvést zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfckiny:interleukiny, interferony, TNF a podobně (FR 9203120), růstové faktory, neurotransmitory (přenašeče nervových vznětů) nebo jejich prekurzory nebo syntézní enzymy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP./pleiotrof in, atd., apolyproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atd. (FR 93 05125), dystrofin nebo minidystrofinn (FR 9111947), protein CFTR sdružený s mukoviscidosou, geny potlačující nádory (tumosupresní geny): p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, atd.
(FR 93 04745), geny kódujícífaktory implikované při koagulaci: faktory VII, VIII, IX, geny zúčastněné na distribuci DNA, sebevražedné geny (thymidin-kináza, cytosin-deamináza), atd.
Terapeutickým genem může být rovněž antimediátorový
- 15 gen nebo antimediátorová sekvence, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje regulovat expresi genů nebo transkripci buněčných RNAm. Takové sekvence mohou být například přepsány v buňce ve formě RNA, které jsou komplementární k buněčným RNAm, a blokovat tak jejich translaci na proteiny za použití techniky popsané v patentu EP 140 308. Uvedené antimediátory rovněž obsahují sekvence kódující ribozcmy, které jsou schopné selektivně zničit cílové RNA (EP 321 201).
Jak již bylo uvedeno výše, může nukleová kyselina rovněž nést jeden nebo několik genů kódujících antigenový peptid, který je schopen vyvdat u člověka nebo zvířete imunitní odezvu. V rámci této specifické formy provedení vynálezu vynález tedy umožňuje realizaci bučí vakcín anebo imunoterapeutické léčby člověka nebo zvířete, zaměřené zejména proti mikroorganismům, virům nebo rakovinám. Může se zejména jednat o specifické antigenové peptidy viru Epstein-Barrové, viru HIV, viru hepatitidv B (EP 185 573), viru pseudovztekliny nebo o specifické nádorové peptidy (EP 259 212).
Výhodně uvedená nukleová kyselina také obsahuje sekvence umožňující expresi terapeutického genu nebo/a genu kódu jícího antigenový peptid v požadované buňce nebo v požadova ném orgánu. Může se jednat c sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné za expresi uvažovaného genu v případě, že jsou tyto sekvence schopné fungovat v infikované buňce. Může se také jednat o sekvence různého původu (zodpovědné za expresi ostatních proteinů nebo dokonce o syntetické sekvence). Zejmé na se může jednat o promoční sekvence eucaryotických nebo virálních genů. Například se může jednat o promoční sekvence pocházející z genomu buňky, která má být infikována. Stejně tak se může jednat o promoční sekvence pocházející z genomu viru. V tomto ohledu lze například uvést promotory genů E1A, MLP, CMV, RSV, atd.. Kromě toho mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním aktivačních sekvencí, regulačních sekvencí, atd..
• · · · • · · · • · • ·
Jinak nuklecvá kyselina může rovněž nést, zejména před terapeutickým genem, signální sekvenci směřující terapeutický produkt, který byl syntezizován, do sekrečních cest buňky. Touto signální sekvencí může být přirozená signální sekvence terapeutického produktu, nebo se může rovněž jednat o každou jinou funkční signální jednotku nebo o umělou signální sekvenci.
Výhodně kompozice podle vynálezu navíc obsahují jeden nebo několik neutrálních lipidů. Takové kompozice jsou obzvláště výhodné, zejména v případě, kdy je poměr R nízký. Přihlašovatel ve skutečnosti prokázal, že přídavek neutrální ho lipidu umožňuje zlepšit tvorbu nukleolipidových částic a, což je překvapivé, příznivě ovlivnit pronikání částice do buňky v důsledku destabilizace membrány uvedené buňky.
Výhodně jsou použitými neutrálními lipidy v rámci vynálezu lipidy se dvěma mastnými řetězci.
Obzvláště výhodně se používají přírodní nebo syntetické lipidy, zwitterioncvé lipidy nebo lipidy zbavené ionto vého náboje za fyziologických podmínek. Uvedený lipid může být výhodně zvolen z množiny zahrnující dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE), oleovl-palmitoylfosfatidylethanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl, -mirystoylfosfatidylethanol amin, jakož i jejich 1- až 3-krát N-methylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (jakými jsou zejména galaktocerebrosidy), sfingolipidy (jakými jsou zejména sfingomyeliny) nebo také asialogangliosidy (jakými jsou zejména asialoGMl a GM2).
Tyto jednotlivé lipidy mohou být získány buč syntézou nebo extrakcí z orgánů (například z mozku) nebo z vajec o sobě známými klasickými technikami. Extrakce lipidů může být zejména provedena za použití organických rozpouštědel (o tom viz rovněž Lehninger, Biochemistry).
• · • ·
- 17 f» ff
Výhodně kompozice podle vynálezu využívající jako transfekční činidlo lipofekční polymer obsahují 0,1 až 20 ekvivalentů neutrálního lipidu na jeden ekvivalent lipopolyaminu a výhodněji 1 ž 5 ekvivalentů neutrálního lipidu na jeden ekvivalent lipolyaminu. V případě, že transfekčním činidlem je kationtový polymer, potom kompozice podle vynálezu obsahují kromě kationtového polymeru ve výše uvedených poměrech 0,1 až 20 molárních ekvivalentů neutrálního lipidu na jeden molární ekvivalent fosfátu nukleové kyseliny, výhodněji 1 až 5 molárních ekvivalentů neutrálního lipidu na jeden molárníekvivalent fosfátu nukleové kyseliny.
Kompozice podle vynálezu mohou být formulovány do forem, které jsou vhodné pro topické kutánní, perorální, rektální, vaginální, parenterálni, intranasální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární, transdermální a jiné podání. Výhodně tyto farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahují farmaticky přijatelný nosič pro injikovatelné kompozice, zejména pro přímou injekci v úrovni požadovaného orgánu, nebo pro podání topickou cestou (na pokožku nebo/a na sliznici). Může se zejména jednat o sterilní isotonické roztoky nebe o suché kompozice, zejména získané lyofilizací, které po přidání vody nebo fyziologického roztoku umožňují rekonstituci injikovatelných tekutin. Dávky kyseliny nukleové použité pro injekci, jakož i počet podání mohou být přizpůsobeny různým ukazatelům a jsou zejména závislé na použitém způsobu podání, na léčeném patologickém stavu, na typu genu, který má být exprimován nebo také na požadované době léčení.
Tyto kompozice mohou být použity s výhodou pro transfekci širokého spektra buněčných typů, mezi které patří například hematopoesní buňky, lymfocyty, hepatocyty, endotheliální buňky, melancmické buňky, buňky karcinomů a sarkomů, buňky hladkých svalů, neurony a astrocyty.
Vynález takto poskytuje obzvláště výhodnou metodu · 9 · · 4
- 18 pro léčení nemocí využívající transfekci in vitro, ex vivo nebo in vivo nukleové kyseliny schopné korigovat uvedenou nemoc v kombinaci s transfekčním činidlem typu katicntového nebo lipofekčního polymeru a výše definovanou sloučeninou. Tato metoda je zejména použitelná u nemocí způsobených nedostatečností proteinového nebo nukleového produktu, přičemž uvedená nukleová kyselina, která je podaná v rámci uvedené kompozice, kóduje uvedený proteinový produkt nebo obsahuje sekvenci odpovídající uvedenému nukleovému produktu. Kompozice podle vynálezu jsou obzvláště zajímavé pro jejich biodisponibilitu a jejich transfekční úroveň.
Vynález se rovněž týká použití sloučeniny podle vynálezu sdružené s buněčným receptorovým ligandem, protilátkou nebo s derivátem protilátky pro zacílení nukleové kyseliny k buňkám exprimujícím odpovídající receptory nebe antigeny.
V rámci této strategie se ligand, protilátka nebo derivát protilátky naváže na uvedenou sloučeninu a dojde ke zlepšení transfekční potence takto získané chimérické molekuly ve srovnání se samotnou sloučeninou.
V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí příkladů jeho konkrétního provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně definován patentovými nároky.
Stručný popis obrázků
Na připojených výkresech
-obr.1 znázorňuje v hodnotách světelné intenzity účinnosti transfekci provedených podle vynálezu u různých buněčných typů a
-obr.2 znázorňuje vyhodnocení účinnosti transfekci provedených v přítomnosti a nepřítomnosti HMG1.
• · • · · ·
Příklady provedení vynálezu
Látky a metody
Strukturou použitou pro prokázání účinnosti kompozic podle vynálezu je plasmid nesoucí gen kódující luciferázu (Luc), který je označován jako pCMV-Luc.
Uvedený plasmid pCMV-luc obsahuje promotor cytomegaloviru (CMV) extrahovaný z plasmidového vektoru pcDNA3 (invitrogen) štěpením restrikčními enzymy Mlu a HindlII a situovaný před genem kódujícím luciferázu, vloženým v místech Mlul a HindlII do vektoru pGL basic Vector (Promega).
Příklad 1
Příprava krysího proteinu HMG1
1.1 Exprese proteinu HMG1 u E.coli
Tento rekombinantní protein pocházející ze savce byl připraven superexpresí v E.coli.
Plasmid T7-RHMG1 kódující krysí protein HMG1 (M.E. Bianchi, Gene, 104(1991)271-275) se zavede do kmene E.coli BL21(DE3). Tento kmen se potom kultivuje při teplotě 37 °C v kultivační prostředí LB+Ampicillin (25 mg./L). Z izolované kolonie se potom získá předkultura, která umožní zaočkovat 500 ml kulturu. Když absorbance kultury při 600 nm dosáhne hodnoty 0,7, indukuje se syntéza HMG1 přidáním IPTG ve finální koncentraci 0,5 mM. Produkční kmen HMG1 se potom ještě kultivuje po dobu 2 hodin a 30 minut v přítomnosti IPTG.
Potom se provede sběr buněk odstředěním (5000 x g po dobu 20 minut), izolované buňky se promyjí resuspendováním ve 200 ml vody a opětovným odstředěním. Buněčná peleta získaná po odstředění se přechovává při teplotě -80 °C až do okamžiku
- 20 • · · · • ·
její purifikace.
1.2 Purifikace rekombinantního proteinu HMG1
Purifikace proteinu HMG1 může být provedena chromatografií kultury kmene E.coli popsané v příkladu 1.1, například za použití následující metodiky.
Pokud není výslovně uvedeno jinak, jsou veškeré purifikační níže popsané stupně provedeny při teplotě 4 °C.
Buňky získané z 500 ml kultury se resuspendují v 15 ml 50nM Tris/HCl-pufru,pH 7,7 obsahujícím 500/UM EDTA, 5 mM DTT,
200/UM produktu Pefabloc SC / 4-(2-aminoethyl)benzensulfonylf luoridhydrochlorid./ a 10% (hm./obj.) glycerolu. Po desintegraci buněk působením ultrazvuku po dobu 15 minut se buněčná tříšt oddělí odstředěním (50 000 x g po dobu jedné hodiny)·.· Získaný buněčný extrakt se potom chromatografuje na sloupci Sephadexu G 25 (Pharmacia) v rovnovážném stavu, přičemž eluce sloupce se provádí za použití pufru A ./20mM Hepes, pH 7,9 obsahující 400 mM chloridu sodného, 200 mM EDTA, 1 mM DTT, 200^uM PefablocuSc, 0,2 % Nonidetu P40 a 10 % glycerolu,/. Frakce obsahující proteiny se jímá ' odděleně, načež se tato frakce chromatografuje na sloupci DEAE Sephadexu A-25 (Pharmaci) uvedeném do rovnováhy s pufrem A. Proteinová frakce nezachycená na sloupci se postupně mísí s pevným síranem amonným až k dosažení finální koncentrace 2,8 M. Po dvou hodinách se suspenze odstředí (30 000 x g po dobu 15 minut). Supernatant se potom chromatografuje při teplotě 20 °C na sloupci produktu Phenyl-Superose HR 5/5 (Pharmacia) v rovnováze 20mM pufrem Hepes, pH 7,9, obsahujícím 200 mM EDTA,
500/UM DTT a 2,8 M síranu amonného. Proteiny se potom ze sloupce eluují za použití lineárně klesajícího gradientu síranu amonného (2,8 M á 0 M) ve stejném pufru. Frakce obsahující protein HMG1 se sloučí a extensivně dialyzují proti 50mM Tris/HCl-pufru, pH7,7, obsahujícím 1 mM EDTA a 500/UM DTT Tento vzorek se potom zavede na sloupec produktu MonoQ HR 5/5 (Pharmacia), který se potom eluuje za použití lineárního
- 21 gradientu (O až 0,5M) chloridu sodného v 50mM Tris/HCl-pufru, pH 7,7 obsahujícím 500/UM DTT. Protein HMG1, který tvoří symetrický absorpční pík (28(hm),se oddělené jímá v uvedeném pufru. Protein HMG1 se potom po zahuštění odstředěním v odstře dívce Centrikon 10 vyjme 10mM Mes-pufrem, pH 6,2 obsahujícím 140 mM NaCl a 500/UM DDT. ProteinHMGl se přechovává při teplotě -80 °C až do okamžiku jeho dalšího použití. Tento preparát vykazuje jednotný migrující proteinový pás a má molekulovou hmotnost 31 000 (stanoveno analýzou provedenou elektroforézou za denaturačních podmínek (SDS) a při vyvolání produktem Coomassie. Celkový výtěžek purifikace činí 850^ug čistého proteinu HMG1 z 500 ml výchozí kultury.
Příklad 2
Přenos nukleové kyseliny in vitro do savčích buněk
Tento příklad ukazuje, jak může být protein typu HMG1, který se váže s DNA a který je importován aktivním způsobem do jádra, použit pro stimulaci transfekce plasmidové DNA.
Použitou konstrukcí pro demonstrování účinnosti podle vynálezu je plasmid obsahující gen kódující luciferázu (Luc), který byl popsán výše.
Protokol předpokládá plotny s 24 jamkami (0 16 mm), na kterých se provádí sběr 2 dny po transfekci (konfluence buněk). Všechny parametry mohou být úměrně modifikovány.
V den J se buňky NIH 3T3 (ATCC: CRL1658), 3LL (Isakov N. a kol. JNCI 71(1983) 139-145) H460 (Maxwell a kol.,Oncogene 8 (1993), 3421-3429) se zaočkují v množství 10^buněk na jamku.
V den J+2 se buňky propláchnou PBS (za účelem odstranění stop séra) a vyjmou 250 ml RPMI (3LL a H460) nebo DMEM (NIH3T3) případně obohaceného 10% fetálním telecím sérem (SFV, • 4 ·· • · · · · · • · · · »>
• ·· ·· « · · • · · · · · «· ·· «·
- 22 sérum fetal de veau).
Kompozice použitá pro transfekci: na ekvivalent jamky se do kyvety přidá:
H20 doplnit do 20 ml,
NaCl doplnit na finální koncentraci 140 mM,
0,5 mg plasmidové DNA,
125 ng HMG1, načež se směs mírně míchá a inkubuje při okolní teplotě po dobu 15 minut, načež se ke směsi přidá 1,5 nmolu lipofekčního činidla DOGS. Získaná směs se znovu mírně míchá a inkubuje při okolní teplotě po dobu 15 minut.
Buňky se transfekují přidáním 20 ml směsi DNA/HMG1/1Ípofektant v kultivační prostředí a inkubací po dobu 2 až 4 hodin při teplotě 37 °C. Toto prostředí se potom nahradí kompletním prostředí.
V den J+4 se buňky opláchnou při okolní teplotě 250 ml PBS, podrobí se lyži ve 100 ml pufru ad hoc (Reportér (Promega)+TCK a Aprotinin). Pro měření aktivity syntetizované luciferázy se použije 10 ml lyzátu a 50 ml substrátu (Promega).
Získané výsledky uvedené na obr.1 a obr.2 jsou průměry ze čtyř měření, která byla nezávisle dvakrát opakována. Exprese genu Luc v transfekovaných buňkách je vyjádřena v získaných světelných jednotkách (UL).
Na obr.1 jsou shrnuté výsledky získané pro tři výše uvedené buněčné typy v přítomnosti měnícího se množství proteinu HMG1 .
Na obr.2 jsou přehledným způsobem uvedeny stimulační faktory transfekce získané přidáním různých množství proteinů HMG1. Zvýšení účinnosti transfekce proteinem HMG1 je proměnlivé a závisí na buněčném typu.
Takto lze pozorovat, že maximálního zlepšení se dosáh«· ·#*· ·· ···· * · % · · ft « · · · ·« · · · · · 0« · · · · ······« • · · · · · · · 9 • ••· * ·· ·· 99 99
- 23 ne v případě, kdy je prostředí obsahující kompozici nezbytnou k transfekcí obohaceno 10 % SVF. To je zajímavé, nebot přítomnost SVF představuje podmínky, se kterými se střetáváme in vivo. Na druhé straně je významné, že přítomnost SVF sníží účinnost transfekce v případě, kdy není přítomen protein HMG1. Lze předpokládat, že přítomnost SVF v kultivačním prostředí zmenší množství DNA schopné internalizace buňkami. V rámci této úvahy lze učinit závěr, že HMG1 je obzvláště výhodný pro transfekci za podmínek, kdy je množství DNA limitujícím faktorem.
Optimální hmotnostní poměr HMG1/DNA pro transfekci se pohybuje od 0,25 do 0,5. Takové podmínky nejsou popsané jako podmínky schopné kondenzovat DNA (Bottger M. a kol., B.B.A 950 (1988), 221-228); Stros M. a kol., N.A.R. 22(1994),10441051). Ve skutečnosti plasmid není nasycen proteinem HMG1 (Kohlstaedt L.A. a kol., Bicchemistry 33 (1994), 12702-12707) Účinek proteinu HMG1 je tudíž vysvětlen jeho schopností vázat se na DNA a být transportován k jádru buňky.

Claims (24)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Farmaceutická kompozice použitelná pro transfekci alespoň jedné nukleové kyseliny, vyznačená tím, že kromě uvedené nukleové kyseliny obsahuje alespoň jednu sloučeninu sdružující schopnost vázat DNA a schopnost jádrové vektcrizace této DNA a alespoň jedno transfekční činidlo zvolené z množiny zahrnující katicntové polymery a lipcfekční činidla.
2 nebo 3, nebo aminovou skupinu -NH- nebo -NR'-, kde R' znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíko vé atomy,
Y a Y' nezávisle jeden na druhém znamenají methylenovou skupinu, karbonylovou skupinu nebo skupinu C=S, • · • · · · • · flfl
R , R a nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku 3 4 5 nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,
R znamená derivát cholesterolu nebo alkylaminovou skupí6 nu -NR]R2, kde R] a R2 nezávisle jeden na druhem znamenají nasycenou nebo nenasycenou, přímou nebo rozvětvenou alifatickou skupinu obsahující 12 až 22 uhlíkových atomů a p znamená číslo od 0 do 5.
2. Farmaceutická kompozice použitelná pro tranfekci alespoň jedné nukleové kyseliny, vyznačená tím, že kromě uvedené nukleové kyseliny obsahuje alespoň jednu sloučeninu náležející ke skupině HMG nebo některý z jejich derivátů a alespoň jedno transfekční činidlo zvolené z množiny zahrnující katicntové polymery a lipcfekční činidla.
3. Farmaceutická kompozice podle nároku 1 nebo 2, v y značená tim, že sloučenina je zvolena z množiny zahrnující proteiny typu HMG 1, 2, I, Y, 14a 17 a jejich deriváty.
4 j ΓΠ Π ve kterém m znamená celé číslo vyšší nebo rovné 2 a n znamená celé číslo vyšší nebo rovné 1, přičemž hodnota m se může měnit v jednotlivých uhlíkatých skupinách nacházejících se mezi 2 aminovými skupinami, kovalentně vázanou s lipofil ní oblastí typu nasyceného nebo nenasyceného uhlovodíkového řetězce cholesterolu, přírodního lipidu nebo syntetického li pidu schopného tvořit lamelární nebo hexagonální fáze.
4. Farmaceutická kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že sloučenina je tvořena celkem nebo částí lidského proteinu HMG1 nebo některého z jeho derivátů nebo homologů.
5. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 4,vyznačená tím, že uvedená sloučenina je navíc polyglykosylovaná, sulfonovaná, fosforylovaná nebo/a roubovaná na komplexní cukry nebo na lipofilní činidlo.
- 25 6. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 5,vyznačená tím, že uvedená sloučenina je navíc sdružená s buněčným nebo jádrovým receptorovým ligandem.
6,vyznačená tím, že transfekčním činidlem je alespoň jedno lipofekční činidlo obsahující alespoň jednu polyaminovou hydrofilní oblast obecného vzorce II
H?N-(-(CH) -NH-) -H (II)
7. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 6,vyznačená tím, že transfekčním činidlem je alespoň jeden kationtový polymer obecného vzorce I Γ N-(CH7)
I á n R (I) ve kterém
R může znamenat atom vodíku nebe skupinu obecného vzorce n znamená celé číslo od 2 do 10 a p a q znamenají celá čísla, přičemž součet p+q má takovou hodnotu, že střední molekulová hmotnost polymeru se pohybuje od 100 do 1θ\
8. Farmaceutická kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že transfekčním činidlem je kationtový polymer zvolený z množiny zahrnující polyethylenimin (PEI) a polypropylenimin (PPI).
9. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačená t i m , že se jedná o polyethylenimin se střední molekulovou hmotností 50 000 (PEI50K) nebo o polyethylenimin se střední molekulovou hmotností 800 000 (PEI800K).
10.
Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až
- 26 «· ti tt φ
11. Farmaceutická kompozice podle nároku 10, v y z n a čená tím, že polyaminová oblast je výhodně tvořena sperminem, therminem nebo jejich analogy, které si zachovaly schopnost vázat nuklecvou kyselinu.
12. Farmaceutická kompozice podle 10 nebo 11, vyznačená tím, že lipofilní oblast má obecný vzorec IV kde
X a X' nezávisle jeden na druhém znamenají atom kyslíku, methylenovou skupinu ve které q je rovno 0, 1,
13. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 6 a 10 až 12, vyznačená tím, že transfekční činidlo je výhodně tvořeno lipcpolyaminem zvoleným z množiny zahrnující dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS), 5-karboxyspermylamid palmitcylfcsfatidylethanolamin (DPPES), 2,5-bis-(3aminopropylaminc)pentyl(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetát nebo 1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl(dioktadecylkarbamcylmethoxy)acetát.
14. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 6a 10 až 13, vyznačená tím, že transfekčním činidlem je dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS).
15. Farmaceutická kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že nukleovou kyselinou je desoxyribonukleová kyselina.
16. Farmaceutická kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že nukleovou kyselinou je kyselina ribonukleová.
17. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, v y z n a čená tím, že nukleová kyselina je chemicky modifikova ná.
18.
Farmaceutická kompozice podle nároku 15, 16 nebo 17, • · · · · · ···· • · · · · · · · · • · · β · « · ···· · • · · · * · · · ·«··· · · ·· ·· c ·
- 28 vyznačená tím, že nukleová kyselina je antimediá torová.
19. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 15 až 18,vyznačená tím, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.
20. Farmaceutická kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že navíc obsahuje jeden nebo několik neutrálních lipidů.
21,vyznačená tím, že jeden nebo několik neutrálních lipidů je zvoleno z množiny zahrnující diolecylfosfatidylethanolamin (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidylethanolamin (POPE) di-stearoyl, -palmitoyl, mirystoylfosfatidylethanolamin a jejich 1- až 3-krát N-methylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrcsidy (jakými jsou zejména galaktocerebrosidy), sfingolipidy (jakými jsou zejména sfingomyeliny) a asialogangliosidy (jakými jsou zejména asialoGMI a GM2) .
21. Farmaceutická kompozice podle nároku 20, vy značená tím, že jeden nebo několik neutrálních lipidů je zvoleno z množiny zahrnující syntetické nebo přírodní lipidy, zwitterioncvé lipidy nebo lipidy zbavené iontového náboje za fyziologických podmínek.
22. Farmaceutická kompozice podle o nároku 20 nebo
23. Použití farmaceutické kompozice podle některého z nároků 1 až 22 pro přenos in vitro, ex vivo nebo/a in vivo nukleových kyselin.
24. Použití sloučeniny definované v nároku 1 nebo 2 vázané s buněčným receptorovým ligandem, protilátkou nebo s derivátem protilátky pro zacílení nukleových kyselin do buněk exprimujících odpovídající receptory nebo antigeny.
CZ98947A 1995-09-28 1996-09-27 Farmaceutická kompozice použitelná pro transfekci nukleových kyselin a její použití CZ94798A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9511411A FR2739292B1 (fr) 1995-09-28 1995-09-28 Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ94798A3 true CZ94798A3 (cs) 1998-07-15

Family

ID=9483020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ98947A CZ94798A3 (cs) 1995-09-28 1996-09-27 Farmaceutická kompozice použitelná pro transfekci nukleových kyselin a její použití

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6153597A (cs)
EP (1) EP0854930A1 (cs)
JP (1) JPH11512704A (cs)
KR (1) KR19990063814A (cs)
AU (1) AU720697B2 (cs)
BR (1) BR9610719A (cs)
CA (1) CA2231064A1 (cs)
CZ (1) CZ94798A3 (cs)
FR (1) FR2739292B1 (cs)
HU (1) HUP9900317A3 (cs)
IL (1) IL123849A0 (cs)
NO (1) NO981322L (cs)
SK (1) SK40098A3 (cs)
WO (1) WO1997012051A1 (cs)
ZA (1) ZA968109B (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2750704B1 (fr) 1996-07-04 1998-09-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de production d'adn therapeutique
US6383811B2 (en) * 1997-12-30 2002-05-07 Mirus Corporation Polyampholytes for delivering polyions to a cell
IT1299583B1 (it) * 1998-05-19 2000-03-16 Vander Way Limited Uso di proteine hmg-i per la preparazione di medicamenti ad attivita' citotossica
DE19925143A1 (de) * 1999-06-02 2000-12-07 Aventis Pharma Gmbh Neue liposomale Vektorkomplexe und deren Verwendung für die Gentherapie
DE19929104A1 (de) * 1999-06-24 2000-12-28 Aventis Pharma Gmbh Neue Vektorkomplexe und deren Verwendung für die Gentherapie
FR2814370B1 (fr) * 2000-09-22 2004-08-20 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei pour le ciblage de cellules souches du cerveau
CA2430653A1 (en) * 2000-11-27 2002-08-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University In Jerusalem Transfection of human embryonic stem cells
ATE388691T1 (de) * 2001-07-10 2008-03-15 Univ North Carolina State Träger zur freisetzung von nanopartikeln
FR2829136B1 (fr) 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
ITMI20011986A1 (it) * 2001-09-25 2003-03-25 San Raffaele Centro Fond Metodo e composizione per l'attivazione di cellule presentanti l'antigene
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
CA2665403C (en) 2006-10-04 2015-06-23 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof
EP3034539A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2646161B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5286634A (en) * 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5631237A (en) * 1992-12-22 1997-05-20 Dzau; Victor J. Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
SG54115A1 (en) * 1993-04-27 1998-11-16 Gerber Scient Products Inc Thermal printing apparatus with improved power supply
FR2722506B1 (fr) * 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
FR2739292A1 (fr) 1997-04-04
US6153597A (en) 2000-11-28
SK40098A3 (en) 1998-09-09
BR9610719A (pt) 1999-07-13
EP0854930A1 (fr) 1998-07-29
WO1997012051A1 (fr) 1997-04-03
NO981322D0 (no) 1998-03-24
FR2739292B1 (fr) 1997-10-31
MX9801920A (es) 1998-08-30
CA2231064A1 (fr) 1997-04-03
JPH11512704A (ja) 1999-11-02
HUP9900317A2 (hu) 1999-05-28
AU7136196A (en) 1997-04-17
IL123849A0 (en) 1998-10-30
HUP9900317A3 (en) 2001-10-29
KR19990063814A (ko) 1999-07-26
ZA968109B (en) 1997-04-21
AU720697B2 (en) 2000-06-08
NO981322L (no) 1998-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6172048B1 (en) Composition containing nucleic acids, preparation and uses
US6200956B1 (en) Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof
ES2290952T3 (es) Composicion que contiene acidos nucleicos y polimeros cationicos, preparacion y utilizacion.
Merwin et al. Targeted delivery of DNA using YEE (GalNAcAH) 3, a synthetic glycopeptide ligand for the asialoglycoprotein receptor
US5990089A (en) Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
MXPA00011312A (es) Un vehiculo de gen polimerico de poli-l.lisina injertada con polietilenglicol con porcion de enfoque hepatocitos.
JP2002536399A (ja) 筋肉内および皮内投与のためのポリヌクレオチド組成物
CZ94798A3 (cs) Farmaceutická kompozice použitelná pro transfekci nukleových kyselin a její použití
WO1998046274A2 (en) Cationic polymers for nucleic acid transfection
US20020031763A1 (en) Cationic polymers, complexes associating said cationic polymers with therapeutically active substances comprising at least one negative charge, in particular nucleic acids, and their use in gene therapy
US5830852A (en) Compositions for insulin-receptor mediated nucleic acid delivery
AU737846B2 (en) Transfectant composition useful in gene therapy associating with a recombinant virus incorporating an exogenous nucleic acid and a non-viral and non-plasmid transfection agent
KR20030070449A (ko) 세포내 전달을 위한 올리고뉴클레오티드와 친수성고분자로 구성되는 유전자 전달용 접합체, 고분자전해질복합 미셀 및 그의 제조방법
MXPA98001920A (en) Pharmaceutical composition useful for the transfection of nucleic acids and its u
AU737314B2 (en) Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same
JP2003529633A (ja) 機能的ポリアルキレンイミンの製造方法、前記化合物を含む組成物及びその使用
MXPA97006016A (en) Composition containing nucleic acids, preparation and use
CZ20002713A3 (cs) Činidlo pro přenos nukleové kyseliny citlivé k redukujícím podmínkám, farmaceutické » přípravky obsahující toto činidlo a použití činidla

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic