KR20030070449A - 세포내 전달을 위한 올리고뉴클레오티드와 친수성고분자로 구성되는 유전자 전달용 접합체, 고분자전해질복합 미셀 및 그의 제조방법 - Google Patents

세포내 전달을 위한 올리고뉴클레오티드와 친수성고분자로 구성되는 유전자 전달용 접합체, 고분자전해질복합 미셀 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 난치성 질환의 치료용으로 사용가능한 유전자 전달용 접합체로서,
세포내로 전달하고자 하는 올리고뉴클레오티드와, 친수성 고분자를 포함하며 상기 올리고뉴클레오티드의 말단기가 친수성 고분자와 공유결합으로 연결된 유전자 전달용 접합체와,
상기 유전자 전달용 접합체와 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 고분자간의 이온 상호작용에 의해 형성되는 고분자 전해질 복합미셀을 개시한다.
상기 구성에 의한 고분자 전해질 복합미셀에 의하면 세포내로 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 전달할 수 있으며, 비교적 낮은 농도에서도 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성을 나타낼 수 있어 생명공학을 위한 기초연구 및 의학분야에서 매우 유용하다.

Description

세포내 전달을 위한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자로 구성되는 유전자 전달용 접합체, 고분자전해질 복합 미셀 및 그의 제조방법{Conjugates Comprising Oligonucleotide And Hydrophilic Polymers for Gene Transfer, Hybrid Polyion Complex Micelles Self-assembled from Said Conjugates and Their Manufacturing Method}
본 발명은 난치성 질환의 치료용으로 사용 가능한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자로 구성되는 접합체와 상기 접합체와, 다가 양이온 고분자 또는 양이온 펩타이드의 이온 결합에 의한 고분자전해질 복합 미셀 입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
유전자치료에 있어서 안전하고 효율적인 유전자전달기술은 오랫동안 연구되어왔으며 다양한 유전자 전달체와 전달기술이 개발되어 왔다. 특히 아데노바이러스, 레트로바이러스 등 바이러스를 이용하는 유전자전달기술과 리포좀과 양이온성 지질, 그리고 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 벡터(nonviral vector)를 이용한 유전자전달기술 들이 개발되어 왔다. 그러나 바이러스를 유전자의 전달체로이용하는 방법의 문제점은 아직까지의 기술로는 전달된 유전자가 숙주의 염색체에 이입되어 숙주의 유전자의 정상기능에 이상을 유도하거나 발암 유전자를 활성화시키지 않고 존재할 수 있다는 확증이 없다는 점이다. 또한 바이러스의 유전자가 적은 양이라도 계속 발현되고 있을 경우 자가면역증을 유발할 수 있거나, 이 바이러스 전달체의 변형된 형태의 바이러스 감염이 유발될 경우 효율적인 방어면역을 일으키지 못할 수 있다는 점이 배제되지 못하고 있다. 따라서 바이러스성 벡터를 사용하는 방법 이외에 리포좀에 유전자를 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법 등이 그들 각각의 단점을 개량하는 방향으로 연구되고 있다. 이들 비바이러스성 벡터들은 바이러스성 벡터보다는 그 효율성에 있어 많이 뒤떨어지지만 생체 내 안전성과 경제성을 고려해 볼 때 부작용이 적고 생산 가격이 저렴해 질 수 있다는 장점을 기반으로 개량기술의 수립이 가능하다.
미셀(micelle) 이란, 친수성과 소수성의 성질을 가진 물질 중 친수성과 소수성이 특정 비율로 결합되었을 때 수용액상에서 열역학적 안정성으로 인해 자연적으로 자기조립 구조가 이루어진 구조체를 의미한다. 수용액상에서 자가조립하여 미셀을 형성할 수 있는 블록 공중합체들의 내부는 소수성의 성질을 가지고 있어 난용성 약물을 손쉽게 포획할 수 있고, 표면은 친수성의 성질을 가지므로 난용성 제제의 가용화, 약물 전달 운반체 등에 사용된다. 이러한 소수성의 내부와 이를 둘러싼 친수성 표면에 의한 수용액 상에서의 미셀의 안정화에 대한 개념은 소수성 상호작용 외에 서로 다른 전하를 띄는 고분자전해질 간의 상호작용까지 넓혀서 적용할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜을 접합시킨 서로 다른 전하를 지닌 고분자전해질들은 서로간의 상호작용으로 인해 자발적으로 형성되는 micelle 구조를 지닌 복합체를 형성하는데, 이를 고분자전해질 복합 미셀(polyion complex micelles) 이라 한다 (Kataoka, K., Togawa, H., Harada, A., Yasugi, K., Matsumoto, T., Katayoshe, S., Macromolecules. 29, 8556-8557, 1996 참조). 이들 고분자전해질 복합 미셀들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템, 즉 마이크로스피어, 나노입자 등에 비해, 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 이루는 구조이므로 제제의 quality control 및 재현성의 확보가 용이하다.
생체내로 약물을 전달하기 위한 전달체에 사용되는 고분자의 요건은 생체적합성의 성질을 가지고 있어야 하며, 이러한 조건을 만족시키는 대표적인 고분자로는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이 있다. 폴리에틸렌글리콜은 미국 식품의약품안전청(FDA)의 승인을 받아 오랫동안 단백질의 특성 개선, 고분자의 표면개질 또는 유전자 전달에 광범위하게 사용되고 있다. 폴리에틸렌글리콜은 친수성이며 자체의 독성이 거의 나타나지 않고, 생체 내에서 면역반응을 거의 일으키지 않는 생체 적합성 폴리머이다. 또한 폴리에틸렌글리콜로 표면의 성질을 개질 함으로써 단백질의 흡착을 크게 줄일 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 동물 및 사람의 질병을 치료하는 데에 있어 치료의 일부분으로 사용되어왔다. 예를 들면, 바이러스성, 균류성, 대사성 질병과 관련된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 안티센스(antisense) 등이 있다. 올리고뉴클레오티드와 그가 혼성화하는 상보적인 표적 핵산간의 관계를 일반적으로 안티센스 (antisense)라 일컫는다. 일단 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적 유전자를 동정하게 되면, 그 표적과 충분히 상보적인 즉, 충분히 특이적으로 혼성화하는 염기서열을 선택하여 바람직한 억제가 이루어지도록 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 치료에 사용하는데 있어서 주된 문제점은 세포로의 전달과정과 세포 내에서의 올리고뉴클레오티드의 안정성과 올리고뉴클레오티드를 세포막을 통해 효율적으로 세포내로 전달하는 데에 있다. 올리고뉴클레오티드의 주 사슬은 에스테르 본드로 이루어져 있기 때문에 대부분의 세포 내에서 빠르게 분해되며 그 반감기가 20여분 정도 되기 때문에 계속적으로 올리고뉴클레오티드가 세포 내로 전달되어 일정 농도에 이르지 않으면, 안티센스 효과는 나타나기 어렵게 된다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 뉴클라아제(nuclease)에 대한 민감성을 개량하기 위해 포스포치오에이트 결합이나 (Milligan, J. F., Mateucci, M. D., Martin, J. C., J. Med. Chem. 36, 1923-1937, 1993 참조) 2-O-allyl기 같은 작용기를 도입하여 (Fisher, T. L., Terhorst, T., Cao, X., Wagner, R. W., Nucleic. Acid Res. 21, 3857-3865, 1993 참조) 안정성을 높인 시도가 행해졌다. 그러나 현재까지 올리고뉴클레오티드가 세포막을 효율적으로 투과할 수 있게 하는 기술은 개발 단계에 있다고 할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 내로의 전달을 위해 마이크로인젝션 또는 양이온성 고분자 또는 지질을 이용하거나 배양액에 올리고뉴클레오티드를 직접 분산시키는 방법을 이용하고 있으나 직접 주입하는 마이크로인젝션을 제외하고는 그다지 높은 효과를 보지 못하고 있다.
본 발명의 목적은 세포내로의 유전자 전달을 위해 말단에 기능기를 도입한 올리고뉴클레오티드와 생체적합성이 우수한 친수성 고분자와의 사이에 분해성 또는 비 분해성 결합으로 제조되는 유전자 전달용 접합체 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달용 접합체와 양이온을 띈 다가 양이온성 고분자 또는 펩타이드와의 상호작용에 의해 자발적으로 생성되는 고분자전해질 복합 미셀을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 고분자 전해질 복합 미셀을 이용하여 유전자 치료용으로 제공되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포내 전달 효율성을 향상시키고자 함에 있다.
도 1은 본 발명의 고분자전해질 복합 미셀의 개념을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 산 분해성 결합을 포함한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자인 폴리에틸렌글리콜간의 접합과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 산 분해성 결합을 포함한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자간의 접합과정에서 단계별 생성물을 역상 HPLC를 사용해 분석한 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 산 분해성 결합을 포함한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자간의 접합체의 산성환경 하에서의 시간에 따른 올리고뉴클레오티드의 분리정도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 산 분해성 결합을 포함한 올리고뉴클레오티드-폴리에틸렌글리콜 접합체와 양이온성 펩타이드인 KALA 사이의 상호작용에 의해 생성된 고분자전해질 복합 미셀의 세포 내 전달현상을 공유초점현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 산 분해성 결합을 포함한 안티센스 c-myc 올리고뉴클레오티드-폴리에틸렌글리콜 접합체와 양이온성 펩타이드인 KALA 사이의 상호작용에 의해 생성된 고분자전해질 복합 미셀의 평활근 세포주의 증식 저해 정도를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 유전자를 목적하는 세포내로 전달하는 유전자가 결합된 접합체로서, 세포내로 전달하고자 하는 올리고뉴클레오티드와, 생분해적인 친수성 고분자를 포함하며 상기 올리고뉴클레오티드의 말단기가 친수성 고분자와 공유결합으로 연결된 유전자 전달용 접합체를 포함한다.
본 발명은 시험연구용으로나 의약산업적으로 매우 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함하는 유전자를 효율적으로 세포내로 전달할 수 있는 미셀형태의 유전자 전달 시스템을 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 유전자 치료 등에 유용한 일체의 유전자를 포함하며 이에는 의학적으로 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩타이드 헥산(PNA) 등이 포함된다. 또한 상기 본 발명에 적용가능한 올리고뉴클레오티드 내의 주사슬의 결합형태는 포스포디에스터 결합, 포스포로티오에이트 결합, 포스포로아미데이트 결합, 또는 아미드 결합 등이 포함된다.
바람직하기로 상기 올리고뉴클레오티드는 세포내의 DNA나 RNA에 특이적으로 결합할 수 있는 분자량인 1,000∼50,000의 범위내의 것으로부터 선택됨이 좋다. 위와 같은 조건을 만족하는 올리고뉴클레오티드의 예를 들면 c-myc, c-myb, c-fos, 또는 c-jun 등의 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 있으며 이들 유전자의 전부 또는 일부 절편이 여기에 포함될 수 있다.
친수성 고분자는 상기 올리고뉴클레오티드와 공유결합을 통해 접합체를 형성한다. 상기와 같이 형성된 접합체는 이후 상반되는 전하 즉 양이온을 띠는 고분자 전해질과의 소수성 및 이온상호작용 등을 통해 자발적으로 형성되는 미셀 구조의 복합체를 형성한다. 상기 친수성 고분자는 세포내로 이행되어질 유전자 전달체를 구성하므로 그 자체 독성이 없어야 하며, 생체내에서 면역반응을 일으키지 않는 생체적합성 고분자 중에서 선택되어야 한다. 바람직하기로 상기 친수성 고분자는 비이온성이고 분자량이 500 이상인 것에서 선택된다. 이들 친수성 고분자의 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등이 있다. 바람직하기로는 상기 친수성 고분자 중에서도 폴리에틸렌글리콜은 안전성은 물론 단백질의 특성개선, 고분자의 표면개질 등에 있어 그 특성이 매우 우수하다.
접합체를 구성하는 상기 친수성 고분자와 올리고뉴클레오티드 사이의 결합은아미드 결합, 카바메이트 결합 등을 포함하는 비분해성 결합과, 하이드라존 결합, 포스포로아미데이트 결합, 아세탈 결합 등을 포함하는 산분해성 결합과, 디설파이드 결합, 에스터 결합, 안하이드라이드 분해성 및 효소 분해성 결합의 군에서 선택되는 1종의 형태일 수 있다.
상기 유전자 전달용 접합체의 합성은 다음과 같은 단계를 포함하여 수행가능하다.
(1) 올리고뉴클레오티드의 말단기(예를 들면 3' 또는 5'말단)를 활성화하는 단계와,
(2) 생분해성인 친수성 고분자를 상기 올리고뉴클레오티드의 말단기에 공유결합시키는 단계.
상기에서 올리고뉴클레오티드의 말단기를 활성화하기 위한 물질은 예를 들면 1-에틸-3,3-디에틸아미노프로필 카보디이미드(EDAC), 이미다졸, N-하이드로식숙신이미드(NHS)와 디클로로헥실카보디이미드(DCC), HOBT, p-나이트로페닐클로로포르메이트, 카보닐디이미다졸, N,N'-디숙신이미딜카보네이트(DSC) 등이 있다.
본 발명은 상기한 유전자 전달용 접합체와 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 고분자간의 이온 상호작용에 의해 형성되는 고분자 전해질 복합미셀을 포함한다. 도 1은 상기 고분자 전해질 복합미셀의 형성과정을 개략적으로 도시한 예로서 산 분해성 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드(ODN)-PEG 접합체와 양이온성 펩타이드(KALA)간의 상호작용에 의해 복합미셀이 형성되는 과정을 보여주고 있다.
상기에서 양이온성 펩타이드에 속하는 물질의 예를 들면 KALA 또는 프로타민 등이 있으며, 양이온성 고분자에 속하는 물질의 예를 들면 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민, 폴리라이신, 디에틸아미노에틸덱스트란, 폴리디메틸아미노에틸메틸아크릴레이트 또는 이들의 유도체 등이 이에 해당된다.
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
<실시예 1> 산 분해성 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체의 합성 (도 2 참조)
본 실시예에서는 올리고뉴클레오티드로서 안티센스c-myb을 사용하였다. 5' 말단에 인산기를 도입한 올리고뉴클레오티드를 1-에틸-3,3-디에틸아미노프로필 카보디이미드(EDAC)와 이미다졸로 활성화하여 올리고뉴클레오티드-포스포이미다졸리드 중간체를 형성하였다. 먼저 40 l의 5 mM 인산완충액(pH 6.8)에 녹인 올리고뉴클레오티드 1 mg (179 nmol)를 40 mg EDAC (209 umol)에 가해 녹인 용액에 100 ㎕의 1 M 이미다졸을 가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 세파덱스 G-50 스펀-칼럼 크로마토그래피를 통해 분리하여 100 ㎕의 칼럼 완충액 (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM 인산완충액, pH 7.5)에 모은다. 상기 합성된 올리고뉴클레오티드-포스포이미다졸리드 중간체에 에틸렌디아민을 최종농도로 250 mM 되게 첨가하고 50 ℃에서 한 시간 동안 반응시켜 포스포로아미데이트 결합을 형성한 후, 세파덱스 G-50 스펀-칼럼 크로마토그래피를 통해 반응물을 분리하였다. 상기의 포스포로아미데이트 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드에 N-하이드록실숙신이미드로 활성화된 메톡시 폴리에틸렌그리콜(Methoxy-PEG-N-hyroxyl succinimide (NHS) derivative, Mw 2,000)을 첨가하여 상온에서 3 시간 반응시켜 산 분해성 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드-PEG를 합성하였다. 올리고뉴클레오티드와 PEG의 반응 몰비는 1:3 이었다. 상기 합성된 올리고뉴클레오티드-PEG는 역상 HPLC (C-4)를 통해 분리하였다. 올리고뉴클레오티드-PEG는 100 mM 암모니움 아세테이트와 50 % 아세토니트릴(acetonitrile in 100 mM ammonium acetate)의 농도구배법을 이용하여 분리하였다. 상기 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자간의 접합과정에서 형성되는 단계별 생성물은 도 3의 크로마토그램으로부터 확인할 수 있다.
도 4는 상기 합성된 산분해성 결합을 포함한 접합체의 산성환경 하에서의 시간에 따른 올리고뉴클레오티드의 분리정도를 보여주고 있다. 산도 7.4 (▼)에서는 올리고뉴클레오티드가 거의 가수분해가 이루어지지 않으나 산도 4.0(●)에서는 매우 빠르게 올리고뉴클레어티드가 분해되어 분리되는 것을 보여준다.
<실시예 2> 비 분해성 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체의 합성
비 분해성 결합을 통한 올리고뉴클레오티드와 폴리에틸렌글리콜의 접합을 위해, 5' 말단에 아민기(-NH2)를 도입한 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 먼저, 5'말단에 아민기(-NH2)를 도입한 올리고뉴클레오티드 1 mg (179 nmol)을 400 ㎕의 5 mM 인산완충액 (pH 7.4)에 녹인 후, 이 용액을 100 ㎕의 N-하이드로실숙신이미드로 활성화되어 있는 메톡시-폴리에틸렌그리콜 (methoxy-PEG-NHS, Mw 2000)이 녹아있는 용액 (5 mM 인산완충액 (pH 7.4))에 천천히 첨가하고 교반하여 3시간 동안 반응시켜 비 분해성결합인 아미드결합으로 연결된 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체를 합성하였다.
<실시예 3> 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀(polyion complex micelles)의 형성과 특성화
상기 실시예 1의 방법으로 합성, 분리한 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체를 세포 전달을 위한 형태인 고분자전해질 복합 미셀을 형성하기 위해, 양이온 펩타이드인 KALA 또는 프로타민, 양이온 고분자인 폴리에틸렌이민 등을 사용하였다. KALA를 이용했을 경우의 예를 들어 자세히 설명하면, 먼저 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체를 2x PBS에 1:1로 희석한 후, 역시 PBS에 녹인 KALA를 첨가하여 수용액 상에서 고분자전해질 복합 미셀을 형성하고 미셀의 안정화를 위해 30 분간 상온에 방치하였다. 이때 KALA 펩타이드의 양전하와 올리고뉴클레오티드의 음전하의 전하 비는 1:1 (+/- = 1/1) 이었다.
상기의 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합체 미셀의 수용액 상의 크기를 측정하기 위해 동적 광 산란법(dynamic light scattering (DLS) method)를 사용하였다. DLS를 통한 측정결과, 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고이온 접합체 미셀은 70 nm 정도의 크기에 매우 좁은 분산도를 지녔음을 알 수 있었다.
<실시예 4> 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀의 세포 내로의 전달효율 검색
안티센스c-myb과 상보적인 염기서열을 지닌 센스c-myb(sensec-myb) 올리고뉴클레오티드를 형광염료와 접합하고 안티센스c-myb을 포함한 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체를 혼성화하였다. 그런 다음 양이온성 펩타이드인 KALA를 첨가하여 고분자전해질 복합 미셀(polyion complex micelles)을 형성하여 세포에 처리하여 세포 내로 미셀이 전달됨을 확인하였다.
5' 말단에 형광염료(fluorescene isothiocyanate, FITC)를 접합시킨 센스 c-myc 올리고뉴클레오티드를 상기 실시예 1에서 제조한 올리고뉴클레오티드-PEG 용액에 첨가하여 섞은 후, 65℃에서 5분간 가열하고 얼음에서 급랭시킴으로써 혼성화 시켰다. 이렇게 혼성화 되어 형광 염색된 접합체를 2xPBS에 1:1로 희석하고 PBS에 녹아있는 KALA 용액과 섞어 고분자전해질 복합 미셀을 형성하였다. 이때 KALA 펩타이드의 양전하와 올리고뉴클레오티드의 음전하의 전하 비는 1:1 (+/- = 1:1) 이었다. 이렇게 형성된 고분자전해질 복합 미셀을 상온에서 30분 방치한 후, 커버글라스 위에서 배양한 A7R5 평활근세포주 (smooth muscle cell line)에 첨가하고 3시간 동안 배양하여 공유초점현미경 (confocal microscope)으로 미셀의 세포 내 전달을 확인하였다(도 5 A: 본 발명, B: 대조군). 이를 자세히 설명하면, 미리 세포를 한well 당 5 x 104개가 되도록 콜라젠이 코팅된 커버글라스가 들어있는 6-well plate에 분주하고 10 % fetral bovine serum (FBS) 가 포함된 DMEM 혈청 배지에서 24 시간 배양하였다. 형광 염색된 미셀을 첨가하기 전에 세포가 자라고 있던 배지를 버리고, 무혈청 DMEM 배지로 교환해준 후, 형광 염색된 미셀을 20 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그런 다음 PBS로 4회 씻어주고 0.2% 글루타르알데히드와 0.5% 포름알데히드를 함유하는 PBS로 15분간 4℃에서 고정시킨 후 PBS로 씻어내고 세포가 있는 커버글라스를 슬라이드글라스에 놓고 공유초점현미경을 이용하여 세포 내로 전달된 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 미셀이 세포내로 전달됨을 확인하였다. 대조군으로는 PEG가 접합되지 않고 형광염료 만이 접합된 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.
<실시예 5> 안티센스c-myb올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀의 평활근세포주의 증식 저해에 대한 관찰.
안티센스c-myb올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀의 평활근 세포에 대한 증식저해 활성도를 알아보기 위해 세포 수 측정법, 티미딘 섭취량 정량법, 그리고 MTT assay를 이용한 세포 수 측정법을 사용하였다. 본 실시 예에서는 세포 수 측정법에 대해 자세히 설명하겠다. 먼저 평활근 세포주인 A7R5 세포를 6-well plate에 한 well 당 1 x 104개가 되도록 분주하고 10% FBS가 포함된 DMEM에서 24 시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 0.25 FBS가 포함된 DMEM에서 다시 48 시간 동안 배양하였다. 48 시간 후 기존의 배지를 제거한 후, 다시 배지를 10% FBS가 포함된 DMEM으로 교환해 주고 적정농도(20 ug/ml)의 안티센스c-myb올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀을 처리하였다(Day 0). 대조군으로는 미스매치(mismatched) 올리고뉴클레오티드가 포함된 고분자전해질 복합 미셀을 처리한 세포와 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 일정 기간마다 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내고 heamocytometer를 이용하여 세포의 수를 측정하였다. 이때 생 세포의 숫자를 측정하기 위해 trypan blue exclusion assay를 사용하였다. 도 6은 상기 실험결과 얻어진 평활근 세포주 증식저해 결과 그래프로서 안티센스 뉴클레오티드를 이용한 고분자 전해질 복합 미셀의 경우, 무처리 세포 대조군이나 미스매치 올리고 뉴클레오티드 복합 미셀에 비하여, 평활근의 세포 성장을 억제하는 것을 보여주고 있다.(▼안티센스c-myb올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀, ○: mismatched 올리고뉴클레오티드가 포함된 고분자전해질 복합 미셀, ●: 무처리 세포).
본 발명에 의한 접합체는 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 고분자와의 상호작용을 통해 고분자 전해질 미셀을 형성하여 미셀의 형태로 세포내로 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 전달할 수 있으며, 비교적 낮은 농도에서도 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성을 나타낼 수 있어 생명공학을 위한 기초연구 및 의학분야에서 매우 유용하다.

Claims (14)

  1. 올리고 뉴클레오티드 유전자를 목적하는 세포내로 전달하는 유전자가 결합된 고분자 접합체에 있어서,
    세포내로 전달하고자 하는 올리고뉴클레오티드와, 친수성 고분자를 포함하며 상기 올리고뉴클레오티드의 말단기가 친수성 고분자와 공유결합으로 연결됨을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 친수성 고분자는 비이온성이고 분자량이 500이상인 것에서 선택됨을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 분자량이 1,000∼50,000의 범위를 만족하는 것에서 선택됨을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린의 군에서 선택된 적어도 1종 이상에서 선택됨을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체
  5. 제 1항에 있어서,
    친수성 고분자와 올리고뉴클레오티드 사이의 결합은 아미드 결합, 카바메이트 결합 등을 포함하는 비분해성 결합과, 하이드라존 결합, 포스포로아미데이트 결합, 아세탈결합 등을 포함하는 산분해성 결합과, 디설파이드 결합, 에스터결합, 안하이드라이드 분해성 및 효소분해성 결합의 군에서 선택된 1종임을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 내의 연결사슬은 포스포디에스터 결합, 포스포로티오에이트 결합, 포스포로아미데이트 결합, 또는 아미드 결합의 군에서 선택된 1종임을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 치료용 또는 연구용의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 펩타이드 헥산임을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체
  8. 제 7항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 c-myc, c-myb, c-fos, 또는 c-jun에서 선택된 것으로 유전자의 일부 또는 전부를 포함함을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체
  9. 유전자 전달용 접합체의 합성방법에 있어서,
    올리고뉴클레오티드의 말단기를 활성화하는 단계와, 생분해성인 친수성 고분자를 상기 올리고뉴클레오티드의 말단기에 공유결합시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체의 합성방법
  10. 제 9항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드의 기능기를 활성화시키는 물질은 1-에틸-3,3-디에틸아미노프로필 카보디이미드(EDAC), 이미다졸, N-하이드로식숙신이미드(NHS)와 디클로로헥실카보디이미드(DCC), HOBT, p-나이트로페닐클로로포르메이트, 카보닐디이미다졸, N,N'-디숙신이미딜카보네이트(DSC) 중에서 선택된 1종임을 특징으로 하는 유전자 전달용 접합체의 합성방법
  11. 제 1항 내지 제 8항에서 선택된 어느 한 항의 유전자 전달용 접합체와 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 고분자간의 이온 상호작용에 의해 형성되는 고분자 전해질 복합미셀
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 양이온성 펩타이드는 KALA 또는 프로타민 임을 특징으로 하는 고분자 전해질 복합미셀
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민, 폴리라이신, 디에틸아미노에틸덱스트란, 폴리디메틸아미노에틸메틸아크릴레이트 또는 이들의 유도체 중에서 선택되는 적어도 1종이상 포함함을 특징으로 하는 고분자 전해질 복합미셀
  14. 제 1항 내지 제 8항에서 선택된 어느 한 항의 유전자 전달용 접합체와 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 고분자간의 이온 상호작용에 의해 형성되는 고분자 전해질 복합미셀의 제조방법
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