ES2212305T3 - Polinucleotidos encapsulados en liposomas, composicion y procedimiento. - Google Patents

Abstract

Una composición de liposomas adecuada para la administración in vivo de un polinucleótido, que comprende una suspensión acuosa de liposomas compuesta predominantemente por liposomas con un membrana lipídica en bicapa, conteniendo: (i) lípidos formadores de vesículas catiónicos que se disponen fundamentalmente en la región interna de la bicapa y rodean el polinucleótido, y (ii) lípidos formadores de vesículas neutros que se disponen fundamentalmente en la región externa de la bicapa y forman un recubrimiento alrededor de las partículas catiónicas- polinucleótido, pudiéndose obtener dichos liposomas mediante evaporación de un disolvente orgánico en una emulsión compuesta por partículas de polinucleótido-lípido catiónico, y lípidos formadores de vesículas neutros en un disolvente acuoso no iónico, y el disolvente orgánico.

Description

Polinucleótidos encapsulados en liposomas, composición y procedimiento.

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional del documento U.S.nº 60/050.490, presentada el 23 de Junio de 1997.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición de liposomas que contienen un polinucleótido encapsulado en su interior, y al procedimiento de preparación de la composición de liposomas.

Antecedentes de la invención

En los últimos años los polinucleótidos se han estudiado como posibles agentes terapéuticos debido a su capacidad de alterar la expresión de genes específicos. La terapia génica para añadir una función génica perdida o ausente, y para inhibir la expresión de un gen se encuentra bajo investigación. En concreto, se está estudiando ampliamente la terapia génica con oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos se componen de una cadena de nucleótidos complementarios al ARN mensajero del gen diana, para hibridar mediante apareamiento de bases Watson-Crick. De este modo, se consigue la inhibición de la traducción, a menudo por mecanismos tales como la activación de la RNAsa H o mediante la prevención del ensamblamiento o el progreso de la maquinaria de traducción (Branch, A.D., Hepatology 24(6):1517-1529 (1996)).

Un problema del uso de polinucleótidos, ADN, ARN y oligonucleótidos, como agentes terapéuticos es su relativa escasa capacidad de atravesar la membrana celular con el fin de alcanzar su sitio de acción en el citoplasma. Los polinucleótidos llevan una carga negativa y, por lo tanto, no atraviesan la membrana con facilidad en forma libre.

Otro problema es que los polinucleótidos pueden interaccionar con una diversidad de moléculas extracelulares, lo que puede alterar la biodisponibilidad del polinucleótido. Además, los polinucleótidos son susceptibles de degradación en fluidos biológicos y presentan farmacocinéticas que pueden no ser favorables para algunas aplicaciones terapéuticas.

Una técnica para vencer estos problemas es administrar el polinucleótido en presencia de una vesícula lipídica, tal como un liposoma, y se han propuesto varias composiciones basadas en liposomas (Zelphati, O., y Szoka, F.C. J. Control. Res. 41:99-119 (1996)). Por ejemplo, una composición propuesta consiste en un polinucleótido mezclado con liposomas catiónicos preformados. Dichos liposomas se preparan generalmente a partir de un lípido catiónico mezclado con una concentración aproximadamente equimolar de un lípido desestabilizador de la membrana y/o un lípido neutro, tal como la dioleil-fosfatidil-etanolamina (DOPE). El polinucleótido se mezcla con los liposomas catiónicos preformados para formar los complejos polinucleótido-liposoma a través de interacciones de carga electrostática. Dichos complejos presentan cierta capacidad para mediar in vitro la captura celular de polinucleótidos, sin embargo, el tamaño relativamente grande (200-2000 nm) y su baja estabilidad los hacen inadecuados para las aplicaciones in vivo, en particular para la distribución a otros órganos distintos al hígado y los pulmones (Bennet, C.F., et al., J. Control. Rel. 41:121-130 (1996); Litzinger, D.C. et al., Biochim. Biophys. Acta 1281: 139-149 (1996)).

Otra composición de polinucleótido-liposoma incluye un polinucleótido encapsulado en el interior acuoso de liposomas neutros formado a partir de lípidos formadores de vesículas neutros. Estos liposomas se preparan típicamente bien por hidratación de una película lipídica seca con una solución muy concentrada de polinucleótido (Juliano, R.L., y Akhtar, S., Antisense Res. Dev. 2: 165-176 (1992)) o por el procedimiento de evaporación inversa (REV) (Ropert, C., et al., Pharm. Res. 10(10): 1427-1433 (1993); Szoka, F.C., y Papahadjopoulos, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75(9):4194-4198 (1978)). Un problema de las composiciones polinucleótido-liposoma preparadas por estos procedimientos es la baja eficiencia de encapsulamiento de polinucleótidos, en concreto en las vesículas unilamelares pequeñas ( < 100 nm), en las que se ha mostrado una eficiencia de encapsulamiento del orden de 2-4% (Zelphati, O., et al., Antiviral Res. 25:13-25(1994)). Dado que los polinucleótidos son caros, estas bajas eficiencias de encapsulamiento son inaceptables. El problema se basa en que la recuperación del polinucleótido no encapsulado puede ser costosa y/o llevar mucho tiempo.

El documento WO 96/40964 describe complejos de partículas de lípidos-ácidos nucleicos, que se forman usando bien procedimientos de diálisis de detergente o por procedimientos que utilizan disolventes orgánicos. Sin embargo, los procedimientos descritos en el documento WO 96/40964 reportan una población mixta de partículas lipídicas ya que hay bajo control sobre la disposición de los componentes lipídicos de cada partícula lipídica.

Sumario de la invención

Por consiguiente, un objeto de la invención es proporcionar una composición para la administración in vivo de un polinucleótido, donde el polinucleótido está encapsulado en el núcleo central de un liposoma.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para preparar una composición tal, que se consiga una elevada eficiencia de encapsulamiento del polinucleótido en el liposoma.

Otro objetivo de la invención es proporcionar una composición de liposomas que sea estable in vivo, como se pone en evidencia por la ausencia de agregación de los liposomas en los ensayos in vitro.

Otro objetivo de la invención es proporcionar una composición de liposomas que tenga un tiempo de vida largo en la circulación sanguínea y con un polinucleótido encapsulado.

En un aspecto, la invención incluye una composición de liposomas adecuada para la administración in vivo de un polinucleótido. La composición incluye una suspensión acuosa de liposomas compuesta en su mayoría por liposomas que tienen una membrana de bicapa lipídica comprendida por lípidos que forman vesículas catiónicos, los cuales se disponen primordialmente en la región interna de la bicapa y rodean el polinucleótido, y unos lípidos formadores de vesículas neutros que se disponen predominantemente en la región externa de la bicapa y forman un recubrimiento alrededor de las partículas catiónicas del polinucleótido. Los liposomas tienen un núcleo central con una superficie interna, y el polinucleótido está encapsulado en el núcleo y localizado predominantemente en la superficie
interna.

En otra realización, el polinucleótido es ADN, ARN, o un fragmento o análogo de éste.

En otra realización, el polinucleótido es un oligonucleótido antisentido.

El lípido catiónico es, por ejemplo, el 1,2-dioleil-oxi-3-(trimetilamino)propano (DOTAP); el bromuro de N-[1-(2,3-ditetradecil-oxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE); el bromuro de N-[1-(2,3-dioleil-oxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE); el cloruro de N-[1-(2,3-dioleil-oxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); el 3\beta[N-(N', N'-dimetilaminoetano) carbamoil] colesterol (DC-Col); o el dimetildioctadecilamonio (DDAB).

En una realización, el lípido formador de vesículas neutro es un fosfolípido. En otra realización, el lípido neutro se derivatiza con un polímero hidrófilo, tal como el polietilenglicol.

Típicamente, los liposomas tienen tamaños menores de 300 nm, preferiblemente entre aproximadamente 50-300 nm.

En otra realización, los liposomas incluyen además un ligando para dirigirlos a un sitio seleccionado del cuerpo, tal como una región particular del tejido o la célula.

En otro aspecto, la invención incluye un procedimiento de encapsulamiento de un polinucleótido en liposomas. El procedimiento incluye la formación de partículas de polinucleótido-lípidos catiónicos en un disolvente lipídico apropiado para la solubilización de los lípidos catiónicos (i) disolviendo el polinucleótido en un disolvente no iónico inmiscible con el disolvente lipídico, (ii) poniendo en contacto el polinucleótido con una cantidad neutralizante de carga de lípido catiónico solubilizado en el disolvente lipídico en presencia de un tercer disolvente efectivo para formar un sistema disolvente monofásico, (iii) añadiendo un disolvente adicional no iónico o un disolvente lipídico al sistema monofásico bajo condiciones efectivas para formar un sistema bifásico y (iv) eliminando la fase del disolvente no iónico. Los lípidos formadores de vesículas neutros y un disolvente acuoso no iónico se añaden al disolvente lipídico que contiene las partículas para formar una emulsión, y se evapora el disolvente lipídico para formar los liposomas con el polinucleótido encapsulado en su interior.

En otra realización, las partículas polinucleótido-lípido catiónico se forman disolviendo el polinucleótido en un disolvente no iónico inmiscible con el disolvente lipídico. El polinucleótido disuelto está en contacto con un cantidad neutralizante de carga de lípido catiónico solubilizado en un disolvente lipídico en presencia de un tercer disolvente efectivo para formar un sistema de disolvente monofásico, por ejemplo, una monofase. Se añade al sistema monofásico un disolvente no iónico adicional o disolvente lipídico en condiciones efectivas para formar un sistema bifásico, y se elimina la fase del disolvente no iónico.

En una realización, el polinucleótido se disuelve en agua y se pone en contacto con lípidos catiónicos solubilizados en cloroformo en presencia de metanol.

En una realización, la evaporación del disolvente lipídico incluye la hidratación con un medio acuoso.

En otro aspecto, la invención incluye el uso de una suspensión de liposomas como la descrita anteriormente para la preparación de un medicamento.

Éstos y otros objetivos y aspectos de la invención se apreciarán más íntegramente al leer la siguiente descripción detallada de la invención junto con las ilustraciones que la acompañan.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una ilustración esquemática que muestra la formación de liposomas, conforme a la invención, mediante un procedimiento de extracción y evaporación;

La Figura 2 es una gráfica que muestra la cantidad de oligonucleótido recuperado, en \mug, mediante la extracción en una fase orgánica que contiene diversas cantidades del lípido catiónico 1,2-dioleil-oxi-3-(trimetilamino)propano (DOTAP), donde la línea continua (símbolos +) indica la cantidad de oligonucleótido en la fase acuosa y la línea de trazos (triángulos abiertos) muestra la cantidad de oligonucleótido en la fase orgánica;

La Figura 3 es un perfil de gradiente de densidad para lípidos catiónicos marcados (línea continua) y para polinucleótidos (línea discontinua), mostrada como porcentaje de recuento total respecto del número de fracción;

Las Figuras 4A-4B son perfiles de fraccionamiento obtenidos siguiendo la separación en una columna de Sepharosa de una composición de liposoma con un polinucleótido encapsulado, conforme a la invención (Fig. 4A) y una composición de liposoma comparativa formada de lípidos formadores de vesículas neutros (Fig. 4B);

La Figura 5 es una gráfica que muestra el porcentaje de dosis inyectada en sangre en función del tiempo tras la inyección intravenosa en ratones del oligonucleótido libre (círculos vacíos), del oligonucleótido encapsulado en liposomas neutros (triángulos rellenos) y de liposomas catiónicos preparados según la invención (símbolos +);

Las Figuras 6A-6C son esquemas que muestran la biodistribución de un oligonucleótido tras la administración intravenosa a ratones de la forma libre (Fig. 6A), la encapsulada en liposomas neutros (Fig. 6B) y la encapsulada en liposomas obtenidos conforme a la invención (Fig. 6C); y

La Figura 7 es una gráfica que muestra la captura del sistema retículo-endotelial de diferentes cantidades de un oligonucleótido encapsulado en liposomas, conforme a la invención, tras la administración intravenosa en ratones.

Descripción detallada de la invención I. Preparación del liposoma y caracterización in vitro

La composición del liposoma de la invención se compone de liposomas, típicamente en forma de suspensión, que tienen un polinucleótido encapsulado en el núcleo central. Como se describirá a continuación y se apreciará en el procedimiento de preparación, los liposomas tienen una bicapa lipídica compuesta de un lípido formador de vesículas catiónico y un lípido formador de vesículas neutro. El polinucleótido encapsulado se asocia con el lípido formador de vesículas catiónico y se localiza predominantemente en la superficie interna del compartimento nucleico central de cada liposoma.

Respecto a la figura 1, se describe un procedimiento para preparar la composición de liposoma de la invención. En el procedimiento, se forma una partícula polinucleótido-lípido catiónico extrayendo el polinucleótido a través de una monofase Bligh y Dyer (Bligh, E.G., y Dyer. W.J., Can. J. Biochem. Physiol. 37(8):911-917 (1959)). El polinucleótido se disuelve en un primer disolvente, típicamente un disolvente no iónico, a una concentración seleccionada. Entre los ejemplos de los primeros disolventes se incluyen el agua desionizada y los disolventes hidrófilos no acuosos. Los disolventes no iónicos pueden contener un soluto no electrolito, tal como la sacarosa, la glucosa, el dextrano y similares.

Un lípido catiónico de preferencia se disuelve en un segundo disolvente apropiado, también denominado aquí como disolvente de lípidos, el cual es inmiscible con el primer disolvente en el que se disuelve el polinucleótido. Por ejemplo, el disolvente de lípidos puede ser cloroformo, tetraclorometano, tricloroetileno, tricloroetano, benceno, hexano, pentano, tolueno y similares.

El polinucleótido disuelto y el lípido catiónico se ponen en contacto en presencia de un tercer disolvente efectivo para formar una monofase, por ejemplo, un sistema de disolvente monofásico (tubo nº2 en la Figura 1). Este tercer disolvente puede ser un alcohol, tales como el metanol o el etanol, una cetona, tal como la acetona, o un éter. Se pueden determinar, mediante experimentos de solubilidad fácilmente realizables por los expertos en la materia, los disolventes apropiados como tercer disolvente, por ejemplo, un disolvente efectivo para formar una monofase en presencia de un primer disolvente y un segundo disolvente de lípidos.

Continuando con la referencia a la figura 1, la monofase se incuba y se añade una cantidad del primer disolvente y/o el disolvente de lípidos para separar la monofase en un sistema de disolvente bifásico (tubo nº3 en la Figura 1). El disolvente menos denso se elimina del sistema por aspiración o decantación. Se apreciará, que en este punto, se puede analizar el contenido de polinucleótido en cada fase para determinar la eficiencia de extracción, que indica la eficiencia de carga del liposoma.

En este punto del procedimiento de preparación, se forma una partícula denominada aquí como partícula de lípido catiónico-polinucleótido. Se apreciará que se pueden seleccionar las cantidades de polinucleótido y de lípido catiónico para conseguir una partícula polinucleótido-lípido catiónico con carga neutralizada o una partícula cargada. Como se discutirá a continuación, los estudios que apoyan la invención muestran que el grado de interacción de carga entre el lípido catiónico y el polinucleótido aniónico afecta a la captura de liposomas por el sistema retículo-endotelial.

Como se ilustra en el tubo nº4 de la Figura 1, los lípidos formadores de vesículas neutros se añaden a la fase orgánica que contiene las partículas de polinucleótido-lípido catiónico. Se añade una cantidad de disolvente no iónico, y se mezcla brevemente la preparación mediante agitación y/o sonicación. Entonces se evapora la fase orgánica en un rotavapor para formar una fase gel (tubo nº5 en la Figura 1). Después de una evaporación suficiente de la fase orgánica, el sistema revierte a fase acuosa para formar liposomas que tienen una membrana lipídica en bicapa de los lípidos formadores de las vesículas neutros, y los lípidos catiónicos con el polinucleótido encapsulado en el núcleo central del liposoma. Los lípidos formadores de vesículas neutros se encuentran predominantemente en las bicapas lipídicas externas, con los lípidos catiónicos en la bicapa lipídica interna cerca del núcleo central de los liposomas. El polinucleótido, que se asocia con los lípidos catiónicos, se encuentra predominantemente en las regiones de la superficie interna del compartimiento nucleico central.

En los estudios realizados que apoyan la invención, se preparó un complejo polinucleótido-lípido catiónico, usando oligonucleótidos antisentido que tenían 18 y 21 restos. El ejemplo 1 describe la preparación de partículas de polinucleótido-lípido catiónico, compuesto de un oligonucleótido de 18 restos, y el lípido catiónico dioleil trimetilamonio propano (DOTAP). En este estudio, se determina la cantidad de DOTAP requerida para estabilizar la carga del oligonucleótido de 18 restos. Como se describe en el ejemplo 1, se disolvió una cantidad fija del oligonucleótido, incluyendo una traza de ^{125}I-oligonucleótido, en un disolvente no iónico (agua desionizada) y se mezcló con cantidades diversas de DOTAP disuelto en cloroformo. Se añadió una cantidad de metanol suficiente para formar una monofase. Después de una incubación, la mezcla monofásica se desestabilizó para formar un sistema de disolvente bifásico añadiendo agua y cloroformo.

La fase acuosa y la fase orgánica se analizaron para oligonucleótidos marcados y los resultados se presentan en la Figura 2, que muestra la cantidad del ^{125}I-oligonucleótido en la fase orgánica (triángulos vacíos/línea discontinua) y en la fase acuosa (símbolos +/ línea continua) en función de los nmoles de lípido catiónico, DOTAP. Como se observa, a bajas concentraciones de lípido catiónico, la mayor parte del oligonucleótido permanece en la fase acuosa, no iónica. Según aumenta la concentración de lípido catiónico, se recupera más oligonucleótido en la fase orgánica lipídica y con aproximadamente 80 nmoles de DOTAP, se extrae casi todo el oligonucleótido en el disolvente lipídico orgánico. En este punto, la relación molar de oligonucleótido con el lípido catiónico es de aproximadamente 1:50 y la relación de carga +/- es 3:1.

Se realizaron otros estudios realizados en apoyo de la invención para demostrar el efecto de los disolventes en el proceso de extracción para la formación de las partículas de polinucleótido-lípido catiónico. En estos estudios, se realizó el proceso descrito en el ejemplo 1, usando un disolvente acuoso iónico, tampón Hepes (Hepes 25mM, NaCl 140mM, pH 7,4). En presencia de un tampón iónico, el oligonucleótido no se extrae en fase orgánica, probablemente debido a la interacción de apantallamiento de carga. En otros estudios, se emplea para la extracción una solución acuosa al 10% de sacarosa, con resultados similares a los descritos en la figura 2. Se apreciará que el procedimiento descrito anteriormente para los oligodesoxinucleótidos de 18 restos y el lípido catiónico DOTAP, puede usarse para cualquier combinación de polinucleótido y lípido catiónico seleccionada. Entre los ejemplos de polinucleótidos se incluyen el ADN, el ARN y los fragmentos y análogos de éstos; oligonucleótidos hasta aproximadamente 100 nucleótidos, que incluyen oligonucleótidos con enlaces químicos resistentes a nucleasas, tales como el fosforotioato y el metilfosfonato.

Se apreciará que en las realizaciones en las que el polinucleótido es, por ejemplo, ADN, el polinucleótido se puede condensar usando un agente condensante policatiónico además de o en lugar de lípido catiónico. Por ejemplo, la espermina, la espermidina, las histonas, la polilisina y el sulfato de protamina son agentes policatiónicos adecuados para condensar un polinucleótido grande y facilitar su encapsulamiento en los liposomas de la invención.

El lípido catiónico, como se usa aquí, alude a un lípido formador de vesículas que tiene una carga neta positiva. El lípido catiónico puede ser un monocatión o un policatión. Según se define aquí el "lípido formador de vesículas", puede ser cualquier lípido anfipático que presente una parte hidrofóbica y una cabeza polar, y que por sí mismo pueda formar espontáneamente en agua vesículas con bicapa, como por ejemplo los fosfolípidos. Típicamente, dichos lípidos formadores de vesículas son lípidos de cadena de diacilo, tales como un fosfolípido, cuyas cadenas acilo tienen típicamente aproximadamente entre 14-22 átomos de carbono de longitud, y tiene diversos grados de insaturación.

Entre los ejemplos de lípidos formadores de vesículas catiónicos se encuentran los fosfolípidos, tales como la fosfatidiletanolamina, cuyos grupos de la cabeza polar se derivatizan con un resto positivo, por ejemplo, la lisina, como se ilustra, por ejemplo, para el lípido DOPE derivatizado con la L-lisina (LYS-DOPE) (Guo. L., et al., Journal of Liposome Research 3(1):51-70 (1993)). También se incluyen en esta clase los glucolípidos que tienen un grupo catiónico en la cabeza polar. Otros lípidos formadores de vesículas catiónicos que pueden emplearse son la colesterol amina y los esteroles catiónicos relacionados.

Otros ejemplos incluyen el 1,2-dioleil-oxi-3-(trimetilamino)propano (DOTAP); elbromuro de N-[1-(2,3-ditetradecil-oxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE); el bromuro de N-[1-(2,3-dioleil-oxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE); el cloruro de N-[1-(2,3-dioleil-oxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); el 3\beta-[N-(N', N'-dimetilaminoetano) carbamoil] colesterol (DC-Col); o el dimetildioctadecilamonio (DDAB).

Los lípidos descritos arriba se pueden obtener comercialmente, o prepararse conforme a los procedimientos publicados.

Una variedad de lípidos neutros son apropiados para su uso en la presente invención. Los lípidos formadores de vesículas neutros, lo que significa lípidos formadores de vesículas que no tienen carga neta, incluyen fosfolípidos, tales como la fosfatidilcolina, la fosfatidil etanolamina, el fosfatidilinositol, y la esfingomielina. También se contempla el uso de lípidos cargados negativamente solos o en combinación con un lípido neutro. Entre los lípidos formadores de vesículas negativos se incluyen la fosfatidilserina, el fosfatidilglicerol y el ácido fosfatídico. Se puede apreciar que se pueden añadir otros lípidos, tales como el colesterol u otros esteroles no cargados, a los lípidos formadores de vesículas neutros o cargados negativamente y que varias combinaciones son apropiadas para su uso.

El ejemplo 2 describe la formación de liposomas tras la formación de las partículas de oligonucleótido-lípido catiónico mediante el procedimiento de extracción planteado arriba, en el ejemplo 1. Las partículas de lípido catiónico-oligonucleótido se prepararon, usando el lípido catiónico DOTAP y un oligonucleótido de 21 restos, disolviendo 50 \mug del oligonucleótido en una fase acuosa no iónica y 0,5 \mumoles de DOTAP en una fase orgánica lipídica. El oligonucleótido se extrae de la fase acuosa para formar las partículas de oligonucleótido-lípido catiónico.

Se añadió una cantidad seleccionada de fosfatidilcolina (yodo número 40) y de colesterol a las partículas de oligonucleótido-lípido catiónico, en una relación 2:1 (PC:Col). Se añadió una pequeña cantidad de agua desionizada, se sonicó la mezcla brevemente para emulsionar las fases, y se evaporó la fase orgánica. Los liposomas se formaron una vez que el sistema revirtió a fase acuosa. Como se describe anteriormente, los oligonucleótidos encapsulados se asocian predominantemente a la superficie interna de la región nuclear central debido a la interacción de cargas entre el lípido catiónico y los oligonucleótidos. Los lípidos neutros cubren las partículas, para formar una bicapa liposómica compuesta de ambos, los lípidos catiónicos, que se disponen primordialmente en la región interior de la bicapa de los liposomas, y los lípidos neutros, que se disponen en las regiones externas de la bicapa de los liposomas y forman un recubrimiento alrededor de las partículas catiónicas de polinucleótido.

Los liposomas que tienen encapsulados los oligonucleótidos, preparados como se describe en el ejemplo 2, se caracterizaron mediante dispersión dinámica de luz y se determinó su eficiencia de encapsulación en una columna de gradiente de densidad de metrizamida. Como se describe en el ejemplo 3, la suspensión de liposomas se deposita en una columna de gradiente de metrizamida para separar los liposomas que contienen el oligonucleótido encapsulado del oligonucleótido no encapsulado. El oligonucleótido no encapsulado se equilibra en una fracción de la columna más baja y más densa, por ejemplo, una fracción de 20% de metrizamida mientras los liposomas se equilibran en una fracción menos densa. Después de que la muestra de liposomas se deposite en la columna, se centrifuga la columna de gradientes. Tras la centrifugación, la fracción de liposoma de la muestra se ha equilibrado en una interfase de 10% metrizamida/agua, con una tenue banda del lípido visible en la interfase de 20%/10% de metrizamida. El lípido se recoge de la interfase de 10% metrizamida/agua para contarlo en un contador gamma y para analizar el contenido en fosfato.

TABLA 1

Fosfatidilcolina (\mumoles)	Tamaño* (nm)	Eficacia de	Relación polinucleótidos/
		encapsulación* (%)	fosfolípido (nmol/\mumol)
0,5	360 \pm 60	72 \pm 10	7,9 \pm 2,1
1,0	530 \pm 170	74 \pm 4	5,4 \pm 0,4
2,0	510 \pm 200	73 \pm 10	3,4 \pm 0,5
* valor \pm desviación típica de n=3

La tabla 1 muestra los resultados de tres composiciones liposómicas que contienen diferentes cantidades de fosfatidilcolina. La eficiencia de encapsulación, tomada como recuento en la fracción de oligonucleótido asociado a liposoma entre el número total de recuento medido en la columna, es de aproximadamente 73%, una mejora significativa sobre la conseguida mediante encapsulamiento pasivo.

También se muestran en la tabla 1 las medidas del tamaño de partícula liposomal, determinado mediante dispersión dinámica de luz. Los liposomas presentaban un diámetro entre 360-530 nm, un poco mayor del deseado para la administración in vivo, donde se prefieren los liposomas con tamaños menores de aproximadamente 300 nm. La reducción del tamaño de los liposomas hasta el tamaño deseado se realizó mediante la extrusión a través de filtros de 100 nm o filtros de 200 nm apilados. Estas extrusiones demostraron que el tamaño de los liposomas se puede reducir con éxito reteniendo el oligonucleótido encapsulado. Los experimentos de extrusión demostraron también que el lípido neutro estabiliza los liposomas, por el hecho de que los liposomas con aproximadamente 2 \mumoles de lípido neutro sean más estables durante la extrusión.

En otra realización de la invención, los liposomas incluyen un recubrimiento de superficie de cadenas de polímero hidrófilo, efectivo para extender el tiempo de circulación en sangre de los liposomas. Entre los polímeros hidrófilos apropiados se incluyen el polietilenglicol (PEG), el ácido poliláctico, el ácido poliglicólico, la polivinil-pirrolidona, la polimetiloxazolina, la polietiloxazolina, la polihidroxipropil metacrilamida, la polimetacrilamida, la polidimetilacrilamida, y las celulosas derivatizadas, tales como la hidroximetilcelulosa y la hidroxietilcelulosa. Una cadena de polímero hidrófilo preferida es el polietilenglicol (PEG), preferiblemente como una cadena PEG que tenga un peso molecular entre 500-10.000 Dalton, más preferiblemente entre 1.000-5000 Dalton.

El recubrimiento se prepara preferiblemente incluyendo en los lípidos formadores de vesículas neutros, entre 1-20% molar de un lípido formador de vesícula, preferiblemente un fosfolípido u otro lípido de cadena diacilo, derivatizado en su grupo de cabeza con la cadena del polímero. Entre los ejemplos de procedimientos para preparar estos lípidos, y con ello formar liposomas recubiertos de polímero se han descrito en las patentes en copropiedad con la presente US. nºs. 5.013.556, 5.631.018 y 5.395.619. El polímero puede ser acoplado de forma estable al lípido, o acoplado a través de una unión inestable que permite a las partículas revestidas verter su recubrimiento al circular en la corriente sanguínea.

Los liposomas que tienen esa superficie de recubrimiento y que incluyen un polinucleótido encapsulado se preparan usando metoxipolietilenglicol (mPEG) derivatizado a diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE). Como se describe en el ejemplo 3, se formaron las partículas de oligonucleótido-lípido catiónico y se prepararon los liposomas añadiendo a las partículas lípidos neutros, compuestos de una relación molar 2:1:0,1 de fosfatidilcolina, colesterol y mPEG_{2000}, covalentemente unido al grupo de la cabeza polar de DSPE, mPEG-DSPE. La suspensión de liposomas resultante se formó por extrusión a través de filtros de policarbonato hasta diámetros menores de 200 nm.

La eficiencia de encapsulación de oligonucleótidos en los liposomas recubiertos de PEG se determinó separando los liposomas del oligonucleótido no encapsulado en un gradiente de metrizamida, como se describe en el ejemplo 3. El perfil de separación de la suspensión de liposoma se muestra en la figura 3, en la que se presenta el porcentaje total de recuento de la columna de gradiente en función de un número de fracción. Como se observa en la figura, casi todo el lípido migró a la interfase de 10% metrizamida/agua desionizada, y excepto por una pequeña cantidad en las dos primeras fracciones, todo el oligonucleótido migró al lípido. La tabla 2 resume los resultados de dos experimentos por separado.

TABLA 2

Lípido neutro añadido	Tamaño (nm)	Eficiencia de	Relación oligonucleótidos/
(\mumoles)		encapsulación (%)	fosfolípido (nmol\mumol)
3	174	86	2,1
3	176	91	2,2
*Calculado basándose en la relación inicial de oligonucleótido:fosfolípido, y corrigiendo después por el %
de oligonucleótido no asociado con el lípido.

Los datos de la tabla 2 muestran que para un liposoma que tiene un tamaño de aproximadamente 175 nm, tamaño aceptable para la administración in vivo, la eficiencia de encapsulación fue de aproximadamente del 90%, una mejora considerable sobre la eficiencia del 10% reseñada en la bibliografía para liposomas preparados mediante otros procedimientos (Ropert, et al., 1993). La relación oligonucleótido-fosfolípido es de aproximadamente 2 nmol/\mumol.

En otra realización de la invención, los liposomas incluyen un ligando o un resto de afinidad efectivo para unirse específicamente a un región de tejido deseada de la célula diana. Tales restos pueden fijarse a la superficie del liposoma o al extremo distal de las cadenas de polímeros hidrofílicas. Entre los ejemplos de restos se incluyen los anticuerpos, los ligandos para la unión específica a los receptores de superficie de la célula diana y similares, como se describe, por ejemplo, en la solicitud PTC en copropiedad con la presente nº WO US94/03103.

A. Estabilidad del liposoma

Se determinó la estabilidad de los liposomas en 25% de suero bovino fetal, preparando los liposomas con un oligonucleótido encapsulado y midiendo el tamaño del liposoma en función del tiempo después de ponerlos en el suero.

En este estudio, los liposomas se prepararon según el procedimiento de la invención y se componían de un oligodesoxinucleótido de 21 restos, el lípido catiónico DOTAP, y lípidos neutros consistentes en 5% mol de mPEG-DSPE, 2 \mumoles de fosfatidilcolina y 1,25 \mumoles de colesterol (relación molar PC:Col:mPEG-DSPE de 2:1:0,1).

Usando estos componentes se prepararon dos suspensiones de liposomas. En la primera suspensión de liposoma, se usó agua desionizada para la formación de las partículas de lípido catiónico-oligonucleótido, y como medio de hidratación para la formación de liposomas durante la evaporación del disolvente. En la segunda suspensión, se usó una solución acuosa al 5% de sacarosa en vez de agua.

El tamaño de los liposomas después de la extrusión fue de 174 nm, para los liposomas preparados en agua desionizada, y de 172 nm, para los liposomas preparados en un 5% de sacarosa, como se observa en la tabla 3.

Una muestra de cada suspensión de liposomas se colocó en tampón (25 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,4) y se midió de nuevo el tamaño de partícula, como se observa en la Tabla 3. Se redujo el tamaño de los liposomas de ambas suspensiones, hasta aproximadamente 156 nm y 157 nm para las suspensiones asentadas en agua y al 5% de sacarosa, respectivamente.

Una muestra de cada suspensión de liposomas se colocó en una solución al 25% de suero de ternera fetal en tampón y se midió inmediatamente el tamaño de partícula del liposoma en intervalos de 24 h tras de su almacenamiento a 37ºC. Como se observa en la Tabla 3, los liposomas de cada suspensión experimentan algún cambio en el tamaño de partícula según se equilibra las partículas para estabilizar las fuerzas osmóticas internas y externas. Es importante reseñar que no se observó agregación de los liposomas, indicando que los liposomas deben ser estables tras la administración in vivo.

TABLA 3

Tubo nº	Lípido neutro	Fase acuosa	Tamaño tras	Tamaño en	Tamaño en 25% SBF
	(\mumoles)		extrusión (nm)	Hepes 7,4 (nm)	(nm)
					0 h	24 h	48 h
1	2	H_{2}O desionizada	174	156	171	160	165
2	2	5% sacarosa	172	157	226	166	198

II. Caracterización in vivo de los liposomas

Los liposomas se prepararon de acuerdo con la invención para incluir un oligonucleótido fosforotioato de 18 restos complementario al gen MDRI. Los liposomas usados en los estudios in vivo presentaban un recubrimiento de superficie de cadenas de polímeros hidrófilos de polietilenglicol (PEG), incluyendo en la composición de liposomas neutros diesteroilfosfatidiletanolamina derivatizado con PEG (mPEG_{2000}-DSPE), como se describe en el ejemplo 5B. Por contraposición, los liposomas neutros se prepararon mediante una hidratación convencional de una película de lípidos en presencia del oligonucleótido (ejemplo 5A).

Las figuras 4A-4B son perfiles de fraccionamiento de los liposomas catiónicos (figura 4A) y los liposomas neutros (figura 4B) preparados para los estudios animales. Los perfiles se obtuvieron probando las fracciones durante la separación del oligonucleótido libre del oligonucleótido asociado a lípidos mediante filtración en una columna de sefarosa CL-4B (ejemplo 5B). Como se observa en la figura 4A, prácticamente el 100% de los oligonucleótidos se asoció a la fracción lipídica, como se pone en evidencia por un único pico de elución entre las fracciones 5-12. Por el contrario, como se observa en la figura 4B, solo un 20% del oligonucleótido se asoció a los liposomas neutros.

Se midió el tamaño de los liposomas mediante dispersión dinámica de luz y los liposomas convencionales tenían un diámetro medio de 197 \pm 2 nm (polidispersidad 0,032 \pm 0,012) mientras que los liposomas catiónicos de la invención tenían un diámetro medio de 188 \pm 1 nm (polidispersidad 0,138 \pm 0,018).

Se administraron ambas composiciones de liposomas a ratones según el procedimiento del ejemplo 6. También se administró oligonucleótido libre a un grupo de animales experimentales. Las composiciones se administraron por vía intravenosa en una sola inyección en bolo por la vena de la cola con una dosis de lípido (fosfatidilcolina) de 0,5 \mumoles. A tiempos concretos, se sacrificaron tres ratones de cada grupo experimental y se analizó la presencia de oligonucleótido en los órganos y muestras sanguíneas.

La figura 5 muestra el tiempo de vida en la circulación sanguínea del oligonucleótido libre (círculos vacíos) y del oligonucleótido encapsulado en liposomas, en la que los liposomas de la invención se representan con símbolos + y los liposomas neutros comparativos con triángulos rellenos. Como se observa en la figura, el oligonucleótido libre marcado con ^{125}I tiene una inicial y rápida fase de distribución y aproximadamente el 50% de la dosis inyectada se ha eliminado del cuerpo 2 horas después de la administración.

Por el contrario, el oligonucleótido marcado con ^{125}I encapsulado dentro de liposomas muestra un perfil farmacocinético en sangre muy diferente. Encapsulado dentro de los liposomas neutros (triángulos rellenos), el oligonucleótido tiene una fase inicial corta de eliminación inmediatamente después de la inyección que da cuenta de aproximadamente el 10% de la dosis inyectada. El 90% restante de la dosis tiene una velocidad de eliminación mucho más lenta, de manera que 24 horas después de la inyección, aproximadamente el 20% de la dosis inyectada permanece en sangre.

El oligonucleótido marcado con ^{125}I encapsulado dentro de los liposomas catiónicos de la invención muestran un perfil similar, sin embargo, la fase inicial de eliminación da cuenta de aproximadamente el 30% de la dosis inyectada. Veinticuatro horas después de la inyección, más del 10% de la dosis inyectada permanece en sangre.

La tabla 4 proporciona los parámetros farmacocinéticos calculados para cada tratamiento. El tiempo de residencia corresponde al tiempo requerido para que el 66% de la dosis administrada se elimine de la sangre, y las formulaciones de liposomas dan como resultado una mejora significativa del tiempo de residencia. Los valores del área bajo la curva (ABC) para las formulaciones de liposomas también son significativamente superiores que las del oligonucleótido libre. El ABC del oligonucleótido encapsulado dentro de los liposomas de la invención es mayor que para los liposomas neutros debido a la mayor dosis administrada (52,4 \mug versus 6,5 \mug). Como se discutió anteriormente, la dosis administrada se basa en la cantidad de lípido más que en la cantidad del oligonucleótido, ya que la dosis de lípido puede tener un efecto significativo en la farmacocinética liposómica (Allen, T.M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133-141 (1991)) cuando el agente encapsulado tiene una velocidad baja de goteo de los liposomas. La cantidad de oligonucleótido asociado a los liposomas catiónicos es significativamente mayor que a los liposomas neutros, como se demuestra mediante la eficiencia de encapsulamiento (figuras 4A, 4B), y por lo tanto la cantidad de oligonucleótido inyectado por \mumol de fosfolípido es mucho mayor para los liposomas catiónicos, conduciendo a una mayor ABC. Cuando las dosis se normalizan a 30 \mug de oligonucleótido/ratón (asumiendo una farmacocinética lineal), la ABC para los liposomas neutros (199,9) es mayor que para los liposomas catiónicos (128,1) o el oligonucleótido libre (10,4). Se apreciará que la mejora en la eficiencia de carga del oligonucleótido en los liposomas catiónicos de la invención, comparado con los liposomas neutros convencionales, permite la administración de una dosis de lípido menor para lograr una dosis dada del oligonucleótido.

Continuando las referencias a la tabla 4, el rápido aclaramiento del oligonucleótido libre de la sangre también se refleja en la constante de tasa de eliminación (k) que es más de 10 veces mayor que para ambos tratamientos liposómicos. El volumen de distribución (V_{D}) en los tratamientos liposómicos es próximo al volumen de la sangre de los animales usados, sin embargo, el volumen de distribución para el oligonucleótido libre era aproximadamente 5 veces mayor, indicando que se distribuía ampliamente entre los tejidos.

La semivida (T_{1/2}) en la circulación sanguínea para la fase inicial de eliminación (T_{1/2}\alpha) y para la eliminación de la dosis restante (T_{1/2}\beta) también se muestran en la tabla 4.

TABLA 4 Parámetros farmacocinéticas calculados para oligonucleótidos en diferentes formulaciones

Grupo	Tiempo de	ABC	V_{d} (ml)	k(h^{-1})	t_{1/2}\alpha (h)	t_{1/2}\beta (h)
	residencia (h)	(\mug \cdoth/ml)
Liposomas neutros	17,6	43,4	1,96	0,08	0,39	12,4
( 6,5 \mug)
Liposomas catiónicos	15,0	226,9	2,39	0,10	0,26	10,6
(52,4 \mug)
Oligonucleótido	4,7	5,7	13,77	0,38	0,26	3,5
libre (30 \mug)

Las figuras 6A-6C son esquemas que muestran la biodistribución del oligonucleótido en los animales, en la que la figura 6A corresponde a la distribución después de la administración del oligonucleótido en forma libre. La figura 6B corresponde al oligonucleótido encapsulado en liposomas neutros y la figura 6C corresponde al oligonucleótido encapsulado en liposomas catiónicos conforme a la invención.

La figura 6A muestra que en cualquier tiempo superior a 15 minutos muy poco oligonucleótido libre permanece en sangre. La mayor proporción de la dosis se distribuye en el resto del cuerpo lo que incluye todos los tejidos restantes sin disecar. El hígado y el riñón también contienen cantidades significativas de recuentos radiactivos.

La figura 6B muestra que en todos los tiempos, la mayor proporción de oligonucleótido se da en la sangre cuando se administra en forma de liposomas neutros. Los niveles en sangre dan cuenta de casi toda la dosis, particularmente en los tiempos anteriores. Existe una cantidad relativamente constante en el hígado y el bazo en todos los tiempos, sin embargo, las concentraciones parecen aumentar en el resto del animal en tiempos posteriores y esto concuerda con la distribución y eliminación del oligonucleótido libre tras la liberación de los liposomas, o la posible acumulación del oligonucleótido liposomal dentro de los tejidos.

La figura 6C muestra que el oligonucleótido administrado, encapsulado en liposomas catiónicos, permanece principalmente en la sangre. Hay un aumento en las concentraciones del resto del animal a lo largo del tiempo, que coincide con la eliminación de oligonucleótido libre o con la acumulación de oligonucleótido liposomal en tejidos.

En otro estudio, se analizó el efecto de la relación de oligonucleótido:lípido catiónico en la captura de los liposomas por el sistema reticuloendotelial. Los liposomas se prepararon mediante el procedimiento de la invención (ejemplo 5B) con relaciones de oligonucleótido: lípido catiónico (DOTAP) de 0 ( sin oligonucleótido en la formulación), 44,4 \mug/\mumol (relación +/- de 2,6:1) y 104,8 \mug/\mumol (relación +/-1,1:1). En la formulación en la que los liposomas no contenían oligonucleótido, se hidrataron los liposomas en presencia de tiraminilinulina marcada con ^{125}I, preparada como se describe en Sommerman (Sommermann E.F., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 122:319-324 (1984)). La formulación de liposoma se inyectó en los ratones por vía intravenosa y se analizaron el hígado y el bazo 15 minutos después de la administración de tiraminilinulina marcada con ^{125}I y oligonucleótido marcado con ^{125}I.

Los resultados se muestran en la figura 7, donde se muestra el porcentaje de la dosis remanente en el sistema retículo endotelial en función de la relación oligonucleótido/lípido catiónico. Para la dosis sin oligonucleótido, casi el 50% de la dosis se distribuyó en el hígado y el bazo 15 minutos después de la inyección. Cuando la relación oligonucleótido/lípido catiónico era de 44,4 \mug/\mumol, aproximadamente el 40% de la dosis se distribuyó en hígado y bazo. Cuando la relación era de 44,4 \mug/\mumol (relación +/-1,1:1), aproximadamente el 30% de la dosis se distribuyó en el hígado y el bazo 15 minutos después de la inyección. La captura de 104,8 \mug/\mumol era significativamente diferente a la captura de 44,4 \mug/\mumol y 0 \mug/\mumol (p<0,05).

III. Procedimiento de administración

El polinucleótido que está encapsulado en liposomas catiónicos según se describe anteriormente puede administrarse a un sujeto que necesita tratamiento.

El polinucleótido encapsulado en los liposomas puede seleccionarse de una variedad de polinucleótidos basados en ADN y ARN, incluidos fragmentos y análogos de éstos. En una realización, el polinucleótido es un oligonucleótido de ADN antisentido compuesto de secuencias complementarias a su diana, comúnmente un ARN mensajero (ARNm) o un precursor de ARNm. El ARNm contiene información genética en la orientación funcional, o sentido, y la unión del oligonucleótido antisentido inactiva el ARNm deseado y previene su traducción a proteína. Estas moléculas antisentido se definen basándose en experimentos bioquímicos que muestran que las proteínas se traducen a partir de ARNs específicos y que una vez que se conoce la secuencia del ARN, puede diseñarse una molécula antisentido que se unirá a él a través de los pares de bases complementarios Watson-Crick. Estas moléculas antisentido contienen tipicamente entre 10-30 pares de bases, más preferiblemente entre 10-25, y lo más preferiblemente entre 15-20.

En una realización de la invención, el oligonucleótido antisentido se modifica para mejorar la resistencia a la hidrólisis por nucleasa. Estos análogos entre los que se incluyen el fosforotioato, el metilfosfonato, el fosfodiester y los p-etoxi oligonucleótidos (documento WO 97/ 07784, publicado en el 6 de marzo de 1997).

La composición de la invención se pretende usar en una variedad de terapias, que incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento de las enfermedades víricas, malignas e inflamatorias y trastornos tales como, la fibrosis quística, la deficiencia de adenosindesaminasa y el SIDA. Se contempla el tratamiento de canceres mediante la administración de genes supresores del tumor, tales como APC, DPC4,NF-1,NF-2, MTS1, RB, p53, WT1,BRCA1, BRCA2,VHL, o la administración de oncogenes, tales como el PDGF, erb-B, erb-B2, RET, ras (incluyendo Ki-ras, N-ras), c-myc, N-myc, L-myc, Bcl-1, Bcl-2 y MDM2.

También se contempla la administración de los siguientes ácidos nucleicos para el tratamiento de los trastornos indicados: HLA-B7, tumores, carcinoma colorrectal, melanoma; IL-2, cánceres, especialmente el cáncer de pecho, el cáncer de pulmón y los tumores; IL-4, cáncer; TNF, cáncer; IGF-1antisentido, tumores cerebrales; IFN, neuroblastoma; GM-CSF, carcinoma de células renales; MDR-1, cáncer, especialmente cáncer avanzado, cánceres de pecho y de ovarios; y HSV timidina quinasa, tumores de cerebro, tumores de cabeza y cuello, mesotelioma, y cáncer de ovarios.

Se apreciará que la composición de la invención también tiene utilidad en procedimientos ex vivo.

Los liposomas se encuentran típicamente en forma de suspensión, para una administración parenteral, preferiblemente administración intravenosa. Son aptas otras rutas de administración, incluyendo la subcutánea, la intramuscular, la administración interlesional (en tumores), la intertraqueal por inhalación, la tópica, la internasal, la intraocular, mediante inyección directa en órganos y la intravenosa.

De lo anterior, puede apreciarse cuántos aspectos y propósitos de la invención se han encontrado. La presente invención proporciona una composición de liposomas que tiene una polinucleótido encapsulado en el núcleo central, donde, en virtud del procedimiento de preparación, el polinucleótido se asocia primordialmente a la superficie interna de los lípidos catiónicos, formando el núcleo central. Un recubrimiento de lípidos neutros rodea el núcleo de lípidos catiónicos, sirviendo estos lípidos neutros para estabilizar las vesículas.

En la realización en que los liposomas incluyen un recubrimiento superficial de cadenas de polímero hidrófilos, los liposomas consiguen una larga duración de vida en la circulación sanguínea, con una escasa captura por el SRE.

Además, el procedimiento para preparar los liposomas da como resultado una alta eficiencia de encapsulación del polinucleótido, en el que se encapsula en los liposomas al menos aproximadamente 80% del polinucleótido. En los estudios descritos anteriormente, a una relación de carga 1:1 del oligonucleótido:lípido catiónico, se extrajo aproximadamente el 95% del oligonucleótido desde la fase acuosa a la fase orgánica. Después de la adición del lípido neutro y la formación del liposoma todo el polinucleótido permanece asociado al lípido (como se pone en evidencia en la figura 4A).

Si es necesario, el tamaño de los liposomas se puede ajustar mediante extrusión, para llevar el tamaño del liposoma a un intervalo apropiado para su administración in vivo, típicamente, menor de aproximadamente 300 nm, más preferiblemente entre 50-300 nm, lo más preferiblemente entre 100-200 nm. Los liposomas son estables, como se evidencia porque no hay agregación o cambio apreciable de tamaño cuando se colocan en suero de ternera fetal y por su baja captura in vivo por el pulmón y el SRE.

IV. Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la composición de liposomas y el procedimiento de preparación de la presente invención

Ejemplo 1 Formación de partículas de polinucleótido-lípido catiónico A. Preparación del oligonucleótido marcado con ^{125}I

El oligonucleótido marcado con ^{125}I se preparó del siguiente modo: Se recubrió un vial de reacción cónico de 1ml con aproximadamente 200 \mug de Iodogen (Pierce, Rockford, IL) y después se añadieron 500 \mug del oligonucleótido junto con 2.400 pmoles de ^{125}I (185 Mbq) y 300 \mug de oligonucleótido se añadieron junto con 2.400 pmoles de ^{125}I (185 Mbq) y 300 \mul de acetato sódico 0,35 M, pH 4,0 en un volumen total de 400 \mul (Piatyszek, M.A., Ana. Biochem. 172:356-359 (1988)). Se incubó la mezcla durante una hora a 40ºC con agitación frecuente. Después de la incubación, se extrajo la mezcla del vial de reacción y se eliminó el ^{125}I libre mediante separación en una columna de Sefadex G-25. Con el fin de eliminar los residuos de ^{125}I, se precipitó la muestra en acetato sódico 0,3 M y 2,5 volúmenes de etanol al 95%. El yodo libre se desechó en el sobrenadante mientras que el oligonucleótido marcado se rehidrató del precipitado y se desaló en una columna de Sefadex G-25 (Pharmacia, Suecia) equilibrada en H_{2}O bidestilada. Esto ocasionó menos del 5% del ^{125}I libre, como se determinó por cromatografía de capa fina en PEI-celulosa (J. T. Baker. Inc., Phillipsburg, NJ)

B. Procedimiento de extracción de las partículas preparadas

Se prepararon siete viales que contenían 10 \mug de un oligonucleótido de 18 restos con una traza de ^{125}I-oligonucleótido en 0,25 ml de agua destilada desionizada.

El lípido catiónico 1,2-dioleil-oxi-3-(trimetilamino)propano (DOTAP) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) se disolvió en cloroformo en el intervalo de concentraciones aproximadamente 1,8 a 1880 nmoles/ml.

Se añadió a cada vial de oligonucleótido 0,25 ml de cada solución de lípido catiónico en cloroformo y 0,51 ml de metanol, y se agitó cada vial para formar una monofase.

Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 0,25 ml de H_{2}O destilada desionizada y 0,25 ml de CHCl_{3} a cada vial para desestabilizar la monofase, formando en cada vial un sistema bifásico. Los viales se mezclaron y se centrifugaron durante 7 minutos a 800 x g. La fase acuosa-metanol se aspiró de cada vial y se guardó en un tubo separado, y luego se midió la cantidad de oligonucleótido en ambas fases mediante recuento en un contador gamma. Los resultados se muestran en la figura 1.

Ejemplo 2 Preparación de liposomas

Las partículas de lípido catiónico-oligonucleótido se prepararon usando el procedimiento del ejemplo 1 mediante disolución de 50 \mug de un oligonucleótido de 21 restos en agua destilada desionizada. Se disolvieron 0,5 \mumoles de DOTAP en cloroformo, y se extrajo el oligonucleótido en cloroformo de acuerdo con el ejemplo 1.

Después de la extracción, se añadieron fosfatidilcolina (PC, yodo número 40) y colesterol en una relación 2:1 (PC:Col), a la fase orgánica de cloroformo que contenía las partículas de oligonucleótido-lípido catiónico. Típicamente, la cantidad de PC añadida fue de 0,5 \mumoles, 1,0 \mumoles o 2 \mumoles. Tras la adición de los lípidos neutros, se añadió 0,2 mL de H_{2}O desionizada destilada y la mezcla se sonicó brevemente para emulsionar la mezcla. Se evaporó la fase orgánica en un rota-vapor bajo un vacío de 66,7 a 93,3 kPa.

Los liposomas se formaron una vez que el sistema volvió a la fase acuosa. Los liposomas tenían típicamente entre 200 y 400 nm de diámetro.

Ejemplo 3 Eficiencia de encapsulación del polinucleótido

Se preparó una suspensión de liposomas de acuerdo con el ejemplo 2, con la adición de una pequeña cantidad de oligonucleótido marcado con ^{125}I (preparado en el ejemplo 1). La eficiencia de encapsulación y la relación oligonucleótido:fosfolípido se determinó como se describe a continuación.

La eficiencia de encapsulación se determinó mediante la separación en un gradiente de metrizamida de un oligonucleótido de 21 residuos no encapsulado del oligonucleótido asociado al liposoma, y midiendo por recuento gamma la cantidad de oligonucleótido en cada fracción. Se tomó la eficiencia de encapsulación como el recuento de la fracción de oligonucleótido asociado al liposoma respecto al número total de recuentos medidos.

El gradiente de metrizamida se realizó como se describe a continuación. Un gradiente de 20% de metrizamida/10% metrizamida/agua deionizada se colocó en tubos de centrífuga de 12 ml mediante estratificación secuencial por capas de 1,5 ml de 20% metrizamida, 8 ml de 10% metrizamida y 2ml de H_{2}O desionizada. Un experimento control con oligonucleótido libre verificó que el 100% del oligonucleótido libre, no asociado a lípido permanecía en la fracción de 20% de metrazimida.

Las muestras de liposomas se colocaron en una columna de gradiente y a continuación se centrifugaron los gradientes a 240.000 x g durante 4 horas a 4ºC. Tras la centrifugación, se vio una banda lipídica en la interfase de 10% metrizamida/ H_{2}O desionizada. El lípido se recogió de la interfase de 10% metrizamida/ H_{2}O desionizada mediante aspiración con una pipeta, se contó en un contador gamma y luego se analizó el contenido de fosfato. La tabla 1 muestra los resultados de tres formulaciones de liposomas que contenían 0,5, 1 ó 2 \mumoles de fosfatidilcolina.

Ejemplo 4 Liposomas con un recubrimiento de superficie de polietilenglicol

Los liposomas que tienen un recubrimiento de superficie de polietilenglicol (PEG) se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 2, mediante la extracción de 50 \mug de oligonucleótido con una traza de ^{125}I-oligonucleótido en agua desionizada con 0,5 \mumoles de DOTAP en cloroformo. Después, se añadieron 3 \mumoles de fosfatidilcolina (PC40), 1,75 \mumoles de colesterol y 0,175 \mumoles de diestearoil fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (mPEG _{2000}- DSPE) (relación molar PC:Col: mPEG de 2:1:0,1) a la fase lipídica orgánica que contenía 0,5 \mumoles de DOTAP y el oligonucleótido extraído. También se añadió una traza de ^{3}H- Col a la fase orgánica.

Los liposomas de esta mezcla se prepararon mediante evaporación del cloroformo y se añadieron 200 \mul de agua desionizada para aumentar el volumen de extrusión. La suspensión de liposomas se extruyó a través de filtros de policarbonato de 400 nm y 200 nm hasta diámetros por debajo de 200 nm.

La suspensión de liposomas se caracterizó por la separación del oligonucleótido no encapsulado del oligonucleótido asociado al lípido en un gradiente de metrizamida como se describe en el ejemplo 3, excepto por un tiempo de centrifugación de 12 horas. Tras la centrifugación, los gradientes se fraccionaron cuidadosamente haciendo un pequeño agujero en el fondo del tubo de centrifugación, y recogiendo con las mismas gotas las fases en fracciones en viales de centelleo. Se miden tanto el recuento \gamma (del ^{125}I-oligonucleótido), como el \beta (del ^{3}H-Col), luego el recuento \beta de cada fracción se corrige con la señal \gamma. La figura 3 muestra un perfil de gradiente representativo y los resultados se resumen en la tabla 2.

Ejemplo 5 Preparación de liposomas para estudios in vivo A. Preparación de liposomas neutros comparativos

Se prepararon los liposomas neutros que encapsulaban un oligodeoxinucleótido antisentido de 18 restos mediante la hidratación de una película lipídica en una solución concentrada del oligonucleótido. Se mezclaron fosfatidilcolina (PC40) de soja parcialmente hidratada, colesterol y politetilenglicol diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG_{2000}-DSPE) en cloroformo en una relación molar de 2:1:0,1. La mezcla se secó hasta formar una fina película mediante evaporación rotatoria y después se eliminaron en vacío la trazas de cloroformo durante toda la noche. Se añadió una solución de oligonucleótido 1,7 mM a la película lipídica para dar una concentración de fosfolípido de aproximadamente 300 mM; la película se hidrató durante seis horas a temperatura ambiente. Después se añadió un volumen igual de la solución de oligonucleótido y se agitó el tubo durante aproximadamente un minuto. A continuación, se diluyó la mezcla hasta 75 mM de fosfolípido con tampón Hepes (25 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,4) y se sonicó durante 2 minutos. A continuación los liposomas se extruyeron bajo presión de N_{2} a través de un filtro de policarbonato Nuclepore de 200 nm en tampón Hepes de acuerdo con Olson et al ( Olson. F., Biochim. Biophys. Acta 557: 9-23 (1979)). Los liposomas se midieron mediante dispersión dinámica de luz usando un dispositivo para la determinación de tamaños de partículas Brookhave B190 (Brookhaven Instrument, Holtsville, NY). El oligonucleótido libre se separó del oligonucleótido asociado a lípidos mediante filtración en una columna de Sepharosa CL-4B (Pharmacia, Suecia) equilibrada con tampón Hepes.

B. Preparación de liposomas catiónicos con un recubrimiento de superficie de PEG 1. Preparación de oligonucleótido marcado con ^{32}P

Se sintetizó un oligonucleótido de fosforotioato de 18 restos complementario al gen de MDRI por el laboratorio de Servicios de DNA nucleico de la Universidad de Calgary (Calgary, AB). El oligonucleótido marcado con ^{32}P se preparó siguiendo el procedimiento general de Sambrook et al (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

Brevemente, se mezclaron 100 ng de oligonucleótido con 50 \muCi de ^{32}P-\gamma-ATP- (ICN Pharmaceuticals, Inc., Irving, CA), tampón de reacción hasta una concentración de 5x y 10 unidades de T4 quinasa (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) en un volumen total de 20 \mul. La mezcla se incubó a 37ºC en un baño de agua durante 45 minutos. Después de la incubación, se añadieron 80 \mul de tampón (10 mM Tris, 1 mM EDTA) y a continuación se extrajo el oligonucleótido usando fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) (FisherBiotech, Fair Lawn, NJ). El ^{32}P\gamma-ATP- libre se eliminó mediante separación en una columna de Sefadex G-50 para centrífuga (Pharmacia, Suecia).

2. Preparación del liposoma

El lípido catiónico 1,2.dioleil-3-trimetil amonio-propano (DOTAP) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) se usó para extraer el oligonucleótido fosforotioato de 18 restos a través de una monofase de Bligh y Dyer. Hasta 700 \mug (aproximadamente 0,118 \mumoles) del oligonucleótido de 18 restos se diluyeron en 250 \mul de H_{2}O bidestilada más una traza del oligonucleótido marcado con ^{125}I ó ^{32}P. En un tubo separado, hasta dos \mumoles de DOTAP se diluyeron en 250 \mul de CHCl_{3} y se añadieron 510 \mul de MeOH. El oligonucleótido en H_{2}O didestilada se añadió a la mezcla de CHCl_{3}/MeOH que contenía DOTAP y la muestra se mezcló para formar una monofase. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 250 \mul de CHCl_{3}, seguido de 250 \mul de H_{2}O bidestilada. El tubo se agitó brevemente y luego se centrifugó a 900 x g durante 7 minutos. El sistema entonces era bifásico y la fase acuosa superior se extrajo y se determinó la cantidad de oligonucleótido bien por recuento radiactivo o midiendo la absobancia a 260 nm. El procedimiento dio como resultado \sim 95% del oligonucleótido extraído en la fase orgánica cuando se usó una relación de carga 1:1 (+/-) (DOTAP:oligonucleótido).

A continuación, la fosfatidilcolina de soja parcialmente hidrogenada (PC4O), el colesterol y el mPEG-DSPE (todo en CHCl_{3}) se añadieron a la fase orgánica para llegar a una relación molar PC40:Col:DOTAP:mPEG-DSPE de 3:2:1:0,2. Después de transferirla a un tubo de ensayo de vidrio se añadió suficiente H_{2}O bidestilada como para que la concentración del fosfolípido fuera de 20-30 mM en H_{2}O y la emulsión se agitó y después se sonicó durante aproximadamente un minuto. Luego, se evaporó la fase orgánica en un rotavapor a aproximadamente 53,3 kPa. El sistema formó una fase en gel tras la evaporación de la mayoría de la fase orgánica y tras una evaporización adicional (algunas veces con ligera agitación), el sistema revirtió a la fase acuosa, la cual se agitó brevemente y a continuación se evaporó más. Las vesículas formadas mediante este procedimiento tenían un diámetro en el intervalo de 600 a 800 nm, y posteriormente se sometieron a extrusión a través de filtros de policarbonato de 400 y luego de 200 nm.

Se midió el tamaño de los liposomas mediante dispersión dinámica de luz usando un dispositivo para la determinación de tamaños de partículas Brookhaven B190 (Brookhaven Instrument, Holtsville, NY). Los liposomas neutros tenían un diámetro medio de 197 \pm 2 nm (polidispersidad 0,032 \pm0,012) mientras que los liposomas catiónicos DOTAP tenían un diámetro medio de 188 \pm 1 nm (polidispersidad 0,138 \pm 0,018). El tamaño fue estable en tampón a 4ºC así como en 25% de SBF a 37ºC durante al menos tres días (datos no mostrados).

El oligonucleótido libre se separó del oligonucleótido asociado a lípidos mediante filtración por una columna de Sefarosa CL-4 (Pharmacia, Suecia) equilibrada con tampón Hepes. Los perfiles de fraccionamiento de los liposomas catiónicos y los liposomas neutros se muestran en las figuras 4A y 4B, respectivamente.

Ejemplo 6 Administración de liposomas in vivo

Ratones ICR cruzados hembra (6-8 semanas de edad) se adquirieron de la compañía Charles River y se usaron dentro de las 5 semanas tras el envío, tiempo en que su peso se encontraba en un intervalo de 24 a 30 gramos. Los animales recibieron una sola inyección en bolo, a través de la vena de la cola, de 0,2 ml de liposomas con una dosis lipídica de 0,5 \mumoles de fosfolípido por ratón. El recuento radioactivo de cada inyección se extiende en un intervalo de 0,4 a 2 x 10^{5} cpm. A unos tiempos específicos (0,25; 0,5; 1; 4; 12; 24 horas) se sacrificaron los ratones (tres por grupo), y los órganos se disecaron, pesaron y se determinó el recuento radiactivo en un contador Beckman gamma 8000. El hígado, bazo, pulmón, corazón y riñón, 100 \mul de sangre, y el tiroides se disecaron y contaron, y el resto del animal (resto del animal) también se contó. El recuento radiactivo de cada tejido y del resto del animal se corrigieron usando factores de corrección de la sangre que se habían determinado previamente (Allen, T.M., U.C.L.A. Symposium on Molecular and Cellular Biology, in Lopez-Berestein, G. and Fidler, I., eds. 89:405-415, Alan R. Liss, New York). El recuento en sangre se extrapoló al volumen de sangre total del ratón.

Los resultados de la administración in vivo se muestran en las figuras 5, 6 y 7.

Claims (19)

1. Una composición de liposomas adecuada para la administración in vivo de un polinucleótido, que comprende una suspensión acuosa de liposomas compuesta predominantemente por liposomas con un membrana lipídica en bicapa, conteniendo (i) lípidos formadores de vesículas catiónicos que se disponen fundamentalmente en la región interna de la bicapa y rodean el polinucleótido, y (ii) lípidos formadores de vesículas neutros que se disponen fundamentalmente en la región externa de la bicapa y forman un recubrimiento alrededor de las partículas catiónicas-polinucleótido, pudiéndose obtener dichos liposomas mediante evaporación de un disolvente orgánico en una emulsión compuesta por partículas de polinucleótido-lípido catiónico, y lípidos formadores de vesículas neutros en un disolvente acuoso no iónico, y el disolvente orgánico.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho polinucleótido se selecciona de un grupo consistente en ADN, ARN, y fragmentos y análogos de estos.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho polinucleótido es un oligonucleótido antisentido.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho lípido catiónico se selecciona de un grupo consistente en el 1,2-dioleil-oxi-3-(trimetilamino)propano (DOTAP); bromuro de N-[1-(2,3-ditetradecil-oxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE); bromuro de N-[1-(2,3,-dioleil-oxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE); cloruro de N-[1-(2,3-dioleil-oxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); el 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano) carbamoil] colesterol (DC-Col); y dimetildioctadecilamonio (DDAB).

5. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho lípido formador de vesículas neutro es un fosfolípido.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos liposomas incluyen además un lípido neutro derivatizado con un polímero hidrófilo para formar un recubrimiento de superficie de cadenas de polímeros hidrófilos.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho polímero hidrófilo es polietilenglicol.

8. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos liposomas tienen un tamaño de entre aproximadamente 50-300 nm.

9. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos liposomas incluyen además un ligando para dirigirlo a un sitio seleccionado.

10. Una composición de liposomas apropiada para la administración in vivo de un polinucleótido, que comprende una suspensión acuosa de liposomas que pueden obtenerse (a) preparando partículas de polinucleótido-lípido catiónico en un disolvente orgánico, (b) mezclando las partículas con un lípido formador de vesículas neutro en presencia de un disolvente acuoso no iónico para formar una emulsión, y (c) evaporando el disolvente orgánico de la emulsión para formar liposomas que tienen (i) una membrana lipídica en bicapa que comprende lípidos formadores de vesículas catiónicos dispuestos fundamentalmente en la región interna de la bicapa y lípidos formadores de vesículas neutros dispuestos fundamentalmente en la región externa de la bicapa, (ii) un núcleo central con una superficie interna, y (iii) el polinucleótido encapsulado en el núcleo central y localizado fundamentalmente en la superficie
interna.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que dicho polinucleótido se selecciona de un grupo consistente en ADN, ARN, y fragmentos de éstos.

12. La composición de la reivindicación 10, en la que dicho polinucleótido es un oligonucleótido antisentido.

13. La composición de la reivindicación 10, en la que dichos liposomas incluyen además un lípido neutro derivatizado con un polímero hidrófilo para formar un recubrimiento de superficie de cadenas de polímero hidrófilo.

14. La composición de la reivindicación 13, en la que dicho polímero hidrófilo es el polietilenglicol.

15. La composición de la reivindicación 10, en la que dichos liposomas tienen un tamaño de entre aproximadamente 50-300 nm.

16. La composición de la reivindicación 10, en la que dichos liposomas incluyen además un ligando para dirigirse a un sitio seleccionado.

17. Un procedimiento de encapsulamiento de un polinucleótido en liposomas, que comprende

la formación de partículas de polinucleótido-lípido catiónico en un disolvente lipídico apropiado para la solubilización del lípido catiónico por (i) disolución del polinucleótido en un disolvente no iónico inmiscible con el disolvente lipídico, (ii) poniendo en contacto el polinucleótido con una cantidad neutralizante de carga de lípido catiónico, solubilizado en el disolvente lipídico en presencia de un tercer disolvente eficaz para formar un sistema de disolvente de una sola fase, (iii) añadiendo un disolvente no iónico adicional o un disolvente lipídico al sistema monofásico en condiciones eficaces para formar un sistema bifásico, y (iv) eliminando la fase de disolvente no iónico,

añadir al disolvente lipídico que contiene dichas partículas, lípidos formadores de vesículas neutros y un disolvente acuoso no iónico, para formar una emulsión, y

evaporar el disolvente lipídico para formar liposomas que tienen el polinucleótido encapsulado en su interior.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en la que dicha disolución incluye la disolución de un polinucleótido en agua, y en la que poner en contacto incluye un contacto con lípidos catiónicos solubilizados en cloroformo en presencia de metanol.

19. El uso de la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de un medicamento.