ES2698565B2 - Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana - Google Patents

Description

D E S C R I P C I Ó N

PROCEDIMIENTO PARA LA ELABORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS, Y NANOPARTÍCULAS LIPÍD1CAS CON LOS MACRÓFAGOS CEREBRALES COMO

CÉLULAS DIANA

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuadra en los sectores de la farmacología y la biotecnología. Más concretamente, en la nanofarmacología y la nanobiotecnología con el desarrollo de nanopartículas lipídicas que contienen material genético cuya utilidad se centra en el tratamiento de patologías del sistema nervioso central.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La barrera hematoencefálica (BHE) es fundamental para aislar y proteger al cerebro de la entrada de sustancias potencialmente indeseables o dañinas a través del sistema de circulación de la sangre. Además de su efecto protector, la BHE también supone un impedimento para la entrada de sustancias terapéuticas en el cerebro, bien porque no la pueden atravesar en cantidad suficiente como para ejercer efectivamente su función, bien porque son rápidamente degradadas, o porque los mecanismos activos de la propia barrera los bombean hacia el exterior.

Por otro lado, son muchas las enfermedades que pueden afectar al cerebro y que preocupan a la sociedad, y son muchos los estudios que se están realizando para desarrollar las terapias adecuadas. Sin embargo, más importante que encontrar principios activos efectivos es desarrollar métodos para que los fármacos administrados lleguen de forma eficiente hasta el cerebro traspasando la BHE. En Chen, Y. et al. (2004). Drug Delivery Across the Blood-Brain Barrier. Curr Drug Deliv 1:361-376 se recopilan distintos métodos para administrar terapias capaces de atravesar la BHE. Existen en la actualidad métodos invasivos basados en cirugía o en la disrupción de la BHE mediante osmosis, citocinas o productos vasoactivos. Los métodos no invasivos cubren diferentes aproximaciones mediante transporte basado en interacciones moleculares (enlaces de hidrógeno, compuestos lipofílicos), transcitosis mediada por portadores y receptores e inhibición del sistema de flujo (sistemas de liberación de productos químicos, liposomas, nanopartículas). A consecuencia del desarrollo de estos métodos se han producido grandes avances en el uso de liposomas para la administración de fármacos. En Arias, J.L. (2013). Liposomes in drug delivery: a patent review (2007 - present). Expert Opin Ther Pat 23:1399-414 encontramos una revisión de las patentes publicadas entre 2007 y 2012 sobre el uso de llposomas como vehículos sistémicos de fármacos, y entre ellas se recogen algunas relacionadas con su uso en cerebro.

Uno de los usos más extendidos de los liposomas es la depleclón de los macrófagos cerebrales residentes. Los macrófagos cerebrales residentes forman parte de la BHE y son esenciales en la regulación de la entrada de moléculas al parénqulma cerebral, además de orquestar una respuesta pro/antilnflamatorla dependiendo del estímulo inflamatorio. Según su localización, se subdividen en macrófagos perivasculares y meníngeos. De este modo, van Rooijen y Sanders (Van Rooijen N, Sanders A (1994). Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J Immunol Methods 174 (1-2):83-93) desarrollaron una técnica de depleción selectiva de macrófagos perivasculares y meníngeos tras la administración intracerebroventricular de la molécula proapoptótica clodronato (diclorometlleno-bisfosfonato) en una suspensión concentrada y heterogénea de liposomas con una distribución amplia de tamaños y formas. El método de elaboración de liposomas descrito por estos autores considera la mezcla de fosfatidilcolina y colesterol en cloroformo, retirando el cloroformo mediante evaporación en vacío para obtener una fina película de fosfolípidos que, posteriormente, se dispersa en una solución acuosa y se mantiene bajo nitrógeno durante 1,5-2 horas. El procedimiento de formación de liposomas se completa con sonicación, lavado con PBS, sedimentación y resuspensión final en PBS.

Posteriormente, dichos liposomas se han modificado para favorecer su unión específicamente a los macrófagos de la BHE. Du, D. et al., en su artículo The role of glucose transporíers in the distribution of p-aminophenyl-alpha-D-mannopyranoside modified liposomes within mice brain de 2014 (J Control Release 182:99-110), describen la funclonalización de liposomas con un derivado de mañosa, p-aminofenil-a-D-manop¡ranósido (MAN), para que estos atraviesen la BHE y se dirijan específicamente a ciertas zonas del cerebro (córtex, cerebelo, tronco encefálico e hipocampo). La incorporación de MAN a la superficie del liposoma se realiza una vez formado el liposoma, según un procedimiento que comprende el uso de glutaraldehído como agente acoplante y la posterior diálisis para eliminar tanto el glutaraldehído como el componente MAN no unidos al liposoma Ese estudio se enfoca en el diseño de vehículos capaces de cruzar la BHE a través de los transportadores de glucosa (GLUT) localizados en las células endoteliales. El estudio considera la unión inespecífica del derivado manosilado a la superficie del liposoma, aunque no garantiza un alto rendimiento de funcionalización ni realiza una optimización de la composición lipídica.

Atendiendo a las moléculas terapéuticas utilizadas en preparados liposomales específicos para atravesar la BHE, se han incluido distintos ácidos nucleicos en liposomas, especialmente oligonucleótidos antisentido con genes diana específicos. El documento Neurons Are Protected from Excitotoxic Death by p53 Antisense Oligonucleotides Delivered in Anionic Liposomes (Lakkaraju, A. et al. (2001) J Biol Chem 276:32000-32007) hace referencia a un estudio comparativo de la eficacia de distintos liposomas aniónicos y catiónicos como vehículos de oligonucleótidos antisentido dirigidos específicamente a inhibir la expresión de p53 en neuronas. Entre los liposomas descritos en la literatura se encuentran aquellos constituidos por la interacción del oligonucleótido con DOPC/DOPG, DOPC/DOPS, DOPC/DOPA o DC-Co!esterol/DOPE (siendo DOPC, dioleoil-glicerofosfocolina; DOPG, dioleoil-glicerofosfoglicerol; DOPS, dioleoil-glicerofosfoserina; DC-Colesterol, dimetilaminoetano-carbamil-colesterol; y DOPE, dioleoil-fosfoetanolamina). En estos estudios, el DC-Colesterol se selecciona como componente lipídico catiónico modelo, ya que es bien tolerado por las neuronas por su baja toxicidad; sin embargo, en estos estudios también se comprueba que las neuronas sobreviven al desafío solo cuando la proporción de lípido catiónico da lugar a un complejo con carga neta superficial negativa. En caso de que la carga sea neutra o positiva, se observa una gran pérdida de neuronas.

La patente ES2638309T3 describe conjugados formados por ácidos nucleicos específicos para una diana de interés y un componente lipídico que permite la distribución de los ácidos nucleicos a células específicas en el sistema nervioso central. Estos conjugados comprenden liposomas con fosfolípidos neutros tales como POPC (palmitoil-oleoil-glicerofosfocolina), DSPE (distearoil-glicerofosfoetanolamina) o colesterol, junto con pequeñas cantidades de lípidos catiónicos.

En el trabajo Mannose receptor-mediated gene transfer into macrophages using novel mannosylated cationic liposomes (Kawakami, S. etal. (2000) Gene Therapy 7:292-299), se hace referencia a complejos ADN-liposoma en los que el liposoma se funcionaliza con un derivado de colesterol manosilado (colesten-5-iloxi-N-(4-((1-imino-2-(3-D-tiomanosil-etil)amino)butil)formann¡da). Este estudio demuestra que estos liposomas funcionalizados permiten obtener una alta transfección en macrófagos peritoneales de ratón. La eficacia en la transfección se basa en el hecho de que los macrófagos expresan grandes cantidades de receptores de mañosa en su superficie, por tanto, los receptores de mañosa reconocen y absorben los complejos de ADN y liposomas manosilados.

El documento Multifunctional Nanoparticles Facilítate Molecular Targeting and miRNA Delivery to Inhibit Atherosclerosis in ApoE(-/-) Mice de Kheirolomoon, A., et al. {(2015) ACS Nano 9:8885-8897) describe unos liposomas del tipo "core-sheir que poseen un núcleo (“core”) constituido por un oligonucleótido (anti-miRNA) estabilizado electrostáticamente con DOTAP (dioleoiloxi-trimetilamonio propano). Además, presentan una cubierta (“shell") lipídica neutra constituida por HSPC (fosfatidilcolina de soja hidrogenada), colesterol y DSPE-PEG2k (distearoil-glicerofosfoetanolamina-N[metoxi(polietilenglicol)-2000]). En este caso, la incorporación de un oligopéptido al componente lipídico pegilado hace que los liposomas obtenidos se dirijan a las células endoteliales diana.

En la búsqueda de una estrategia para la regulación de los macrófagos residentes en el sistema nervioso central y poder solucionar el obstáculo terapéutico que supone la BHE, la utilización de nanoliposomas (también denominadas nanopartículas lipídicas), como vehículos de ácidos nucleicos con efectos potencialmente terapéuticos, es una de las herramientas que actualmente ofrecen mayor promesa. Sin embargo, aún no se ha desarrollado una metodología sencilla y eficiente que permita obtener este tipo de nanovehículos liposomales específicamente dirigidos a los macrófagos perivasculares y meníngeos para modificarlos selectivamente.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener nanopartículas lipídicas de tipo “core-shell”, o núcleo-corona, de estructura multilamelar conteniendo el material genético hibridado con un lípido catiónico biocompatible a alta compactación en las láminas acuosas existentes entre las lámelas de las nanoparticulas llpídlcas. El procedimiento de síntesis de estas estructuras híbridas multilamelares incluye la complejaclón del ácido nucleico en fase acuosa con un lípido catiónico biocompatible en fase orgánica. Dicha reacción de complejación permite la formación de estructuras encapsulantes similares a micelas inversas suspendidas en fase homogénea de marcado carácter orgánico (monofase de Bligh & Dyer, compuesta por cloroformo, metanol y agua). Dichas estructuras son coloides de asociación constituidos por el lípido catiónico biocompatible, con su fracción hidrofóbica expuesta al medio exterior disolvente (hacia la superficie de la micela) y su extremo polar dispuesto hacia el interior de una cavidad hldrofílica (mayoritariamente acuosa en el corazón de la micela). Bajo condiciones de complejación con el ácido nucleico (de carga negativa), este queda residente en el interior de la estructura mlcelar inversa, interactuando con la cabeza polar del lípido catiónico biocompatible, todos los contraiones y el agua intersticial contenida en el Interior de una nanocavidad altamente hldrofílica en el corazón de la micela Inversa. El material genético es un ácido nucleico. En general, puede ser de cualquier tipo (ácido ribonucleico o ácido desoxirrlbonucleico, monocatenario, bicatenario, lineal, circular o combinaciones de ellos) con la limitación de que su tamaño y flexibilidad sean compatibles con su Inserción en una cavidad de dimensiones nanométricas. Por tanto, mediante esta estrategia puede complejarse cualquier tipo de oligonucleótido, enrollado o lineal (microARN, ARNsI, ARNm) e incluso ADN plasmídlco. Asimismo, la secuencia del ácido nucleico puede incluir análogos de nucleótldos o nucleótidos modificados, con la única limitación de contener hidrofilicidad suficiente para mostrar una preferencia por la cavidad acuosa del interior de los complejos. La diferente carga del ácido nucleico se estabiliza variando la cantidad de lípido catiónico de la formulación. Ejemplos no limitativos de lípido catiónico biocompatible son: 1,2-dl-0-octadecen¡l-3-tr¡metilamonio propano (DOTMA), 1,2-dloleiloxi-3-dimetillaminopropano (DODMA), dioleoiloxi-trimetilamonlo propano (DOTAP), bromuro de amonio 1,2-dimirlst¡loxi-propil-3-dimetil-hidroxi etll amonio (DMRIE), cloruro de 1 -[2-(oleoiloxi)etilo]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), dioctadecll-amido-glicllo-espermlna (DOGS), bromuro de 1,2-diolilloxipropil-3-d¡metilhldroxietilamonlo (DORIE), N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropil)am¡no]-4-[d¡(3-aminopropll)amino]butilcarboxam¡do)etil]-3,4-d¡[oleiloxi]-benzam¡da (MVL5), N4-colesterilespermina HCI Sal (GL67), bis-guanidium-tren-colesterol (BGTC), bis-guanidiniumespermidlne-colesterol (BGSC), 3G-[N-(N',N'-dimetilamlnoetano)-carbamoil]colesterol clorhidrato (DC-Chol o DC-colesterol), cloruro de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina y derivados de etilfosfocolina (DOEPC), 2,3-dioleiloxi-N-(2-(esperminecarboxamido) etil)-N,N-dimetil-1-propanaminium trifluoroacetato (DOSPA). Alternativas clásicas de lípido catiónico utilizadas en estudios modelo son: bromuro de diactadecil-dimetilamonio (DODAB), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio propano (DSTAP). Preferentemente, dada su disponibilidad comercial, estabilidad química y coste reducido, se seleccionan derivados catiónicos de colesterol como BGTC, BGSC y, más preferentemente, DC-colesterol, un lípido natural funcionalizado con carga positiva.

En un primer paso del procedimiento se facilita la interacción del ácido nucleico disuelto en agua con el lípido catiónico biocompatible disuelto en cloroformo, en presencia de metanol estabilizando la monofase orgánica (pueden considerarse otras formulaciones similares a las formadoras de monofase en el diagrama de fases de Bligh & Dyer). Preferentemente, se utiliza una formulación con el mínimo de cloroformo: 50% metanol, 30% cloroformo y 20% de agua (porcentajes en masa).

A continuación, se procede a la desestabilización de la monofase de Bligh & Dyer mediante la disminución efectiva del porcentaje de agente compatibilizante (metanol) a través de la adición de cloroformo y agua (preferentemente, hasta alcanzar una composición final: 30% metanol, 40% cloroformo y 30% de agua). Esto causa la separación de fases acuosa y orgánica, con la consiguiente segregación de los complejos híbridos en forma de micelas inversas en la fase orgánica y el posible exceso de ácido nucleico en la fase acuosa. En este segundo paso se concentran las micelas inversas en forma de partículas neutralizadas (ácido nucleico con lipido catiónico biocompatible) separándolas en una fase orgánica que más tarde servirá como medio de mezcla con el resto de lípidos que constituirán las bicapas de las futuras nanopartículas lipídicas multilamelares

Por otro lado, se prepara la mezcla lipídica que constituye la base estructural de la estructura multilamelar basada en bicapas lipídicas. Para ello se crea una mezcla lipídica formadora de bicapas conteniendo entre sus componentes lípidos neutros manosilados que constituyen el elemento funcional que interactuará de forma específica con los macrófagos cerebrales residentes. Dichas bicapas lipídicas constituirán la estructura multilamelar capaz de compactar ácido nucleico a alta densidad. Concretamente, se utiliza una mezcla de fosfolípido ¡nsaturado y colesterol, proporcionando fluidez a las bicapas llpídicas, junto con una pequeña cantidad de lípldo manosilado, el cual proporciona funcionalidad y cuenta con suficiente flexibilidad para interactuar con los receptores de mañosa de la superficie de los macrófagos. Como fosfolípido insaturado, preferentemente se utiliza POPC. Como lípido manosilado se selecciona preferentemente DSPE-PEG(020GS)-MAN y se incluye una cantidad de lípido manosilado comprendida entre el 5 y el 15%, en masa.

Preferentemente, se utiliza un fosfolípido pegilado basado en diesteroilfosfatidiletanolamina (DSPE-PEG) funcionalizado con una mañosa en su extremo. Para ello, se utiliza un lípido fusionado a una cadena de polietllenglicol (PEG) y un grupo reactivo ester succinimldil (NHS) en su extremo (DSPE-PEG-NHS) y se hace reaccionar el grupo -NHS con el grupo -NH² de p-amlnofenil-a-D mannoplranosldo (MAN) mediante una reacción directa que no necesita ningún agente acoplante. Para la formación de la película lipídica que más tarde constituirá la corona de la nanopartícula lipidlca debe retirarse el solvente orgánico que ha servido para su homogenelzación. Para ello puede emplearse cualquier método conocido por el experto en la materia para la evaporación del solvente orgánico como, por ejemplo, rotavapor (vacío), gas inerte

En sustitución del fosfolípido insaturado POPC podrían utilizarse otras fosfocolinas insaturadas de características similares en cuanto a fluidez como, por ejemplo, 1,2-dlmiristoil-sn-gllcero-3-fosfocolina (DMPC), DOPC o L-a-fosfatidilcolina (eggPC).

Asimismo, podrían utilizarse lípidos pegilados y I¡pidos funcionalizados con mañosa basándose en la reacción del grupo reactivo ester succlnimidil (NHS) con p-aminofenlla-D mannopiranosido (MAN). Ejemplos no limitantes pueden ser: DSPE-PEG-NHS, DOPE-PEG-NHS, N-(succinimidiloxi-glutaril)-L-a-fosfatidiletanolamina, 1 -palmitoil-2-oleoil (POPE-PEG-NHS), N-(succinimidiloxi-glutaril)-L-a-fosfatidiletanolamina, dipalmitoil (DPPE-PEG-NHS), N-(succinimidiloxi-glutaril)-L-a-fosfatidiletanolamina,1,2-bis(dimetillfosfino)etano (DMPE-PEG-NHS).

Respecto a la composición del interior multilamelar de la partícula lipídica, la cantidad de lípido catiónico biocompatlble que asegura su estabilidad estructural se determina en función del ácido nucleico que se utiliza. Con el objetivo de maximizar la carga de ácido nucleico, durante el segundo paso del procedimiento, se puede suplementar la cantidad de lípido catiónico biocompatible hasta extraer completamente el ácido nucleico que haya podido quedar atrapado en la fase orgánica de la emulsión de Bligh and Dyer. La relación de los lípidos que conforman el componente funcional también puede modificarse, variando alrededor del contenido fosfolípido-PEG-MAN. El intervalo de colesterol puede abarcar entre el 10 y 40%, correspondiendo el resto al fosfolípido insaturado y al fosfolípido pegilado. La proporción de los lípidos estructurales (formadores de bicapa) y el lipido catiónico biocompatible (DC-colesterol complejante del ácido nucleico) se mantiene mayoritaria, preferentemente en una proporción de 5:1.

La fase orgánica que se obtiene con la desestabilización de la monofase de Bligh & Dyer contiene micelas inversas de lipido catiónico conteniendo el ácido nucleico en su interior. La película lipídica obtenida en el primer paso arriba descrito se disuelve en la fase orgánica de la emulsión Bligh & Dyer, formando una disolución en la que se encuentran las micelas inversas protegiendo los ácidos nucleicos del núcleo y los lípidos disueltos en fase orgánica.

A continuación, se añade una solución acuosa libre de nucleasas a la fase orgánica del paso anterior, de tal manera que el sistema se vuelve heterogéneo en forma de emulsión. Mediante la iniciación del proceso de inversión de fases, la fase orgánica conteniendo la mezcla nucleolipídica compleja queda suspendida en agua. La inversión de fases se completará tras la evaporación posterior del componente orgánico (más volátil que el agua), dando lugar a la suspensión de las nanopartículas lipidicas en fase acuosa.

Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para obtener nanopartículas lipidicas, con los macrófagos cerebrales como células diana, que incluye los siguientes pasos:

la . complejación de un ácido nucleico disuelto en agua con un lipido catiónico biocompatible en cloroformo, para formar micelas inversas mediante formación de una monofase de Bligh & Dyer por la adición de metanol hasta homogeneización;

2a. desestabilización de la monofase de Bligh & Dyer, y concentración de las partículas hidrofóbicas del paso 1a mediante la adición de cloroformo y agua;

lb . preparación de los lípidos formadores de bicapa: fosfolípido insaturado/colesterol/lípido-PEG-MAN que incluye la manosilación del componente lípido-PEG-NHS mediante reacción directa de la cabeza succinimidil éster (NHS) con el grupo -NH² de p-aminofenil-a-D mannopiranosido (MAN);

2b. preparación de una película lipídica con los lípidos del paso 1b;

3. inserción de la película lipídica del paso 2b en la fase orgánica del paso 2a mediante disolución;

4. interacción de las micelas inversas con los lípidos formadores de bicapa, ambos presentes en la disolución del paso 3, inducida por la adición de agua a la fase orgánica;

5. extracción del disolvente orgánico y obtención de las nanopartículas lipídicas multilamelares en solución acuosa.

En este procedimiento, es especialmente interesante la manosilación que se realiza en un único paso y que no requiere la utilización de ningún agente acoplante y, especialmente, no requiere el uso de glutaraldehído.

La limpieza de las nanopartículas lipídicas se puede realizar por sedimentación (centrifugación), eliminando en el sobrenadante las vesículas lipídicas que no contienen ácidos nucleicos y los posibles ácidos nucleicos no encapsulados. Finalmente, las nanopartículas lipídicas son resuspendidas en tampón libre de nucleasas. Mediante esta sucesión de pasos, se evita el procedimiento tradicional de extrusión para homogeneizar el tamaño de las nanopartículas lipídicas, técnica que se utiliza habitualmente en el estado de la técnica, y que conduce a una elevada pérdida de carga nucleotídica en la fase acuosa.

Por otro lado, la metodología utilizada hasta la fecha para funcionalizar lípidos con mañosa emplea una reacción dependiente de activación con glutaraldehído, el cual actúa como agente enlazante. Sin embargo, el glutaraldehído es desnaturalizante y citotóxico. Mediante la reacción directa entre un derivado de ácido activado vía succinimida (lípido-PEG-NHS) y una amina primaria del p-aminofenil-a-D manopiranosido para formar una amida entre ambos reactivos, se evita la utilización de este agente citotóxico. Además, la incorporación de lípido-PEG-MAN en una etapa intermedia de su proceso de formación, permite su concentración en la superficie de la nanopartícula lipídica por exclusión de tamaño en el interior de las lámelas, obteniendo nanopartículas lipídicas núcleo-corona fuertemente funcionalizadas en superficie mediante un método integrativo, a diferencia de los métodos indirectos descritos hasta la fecha en los que la mañosa es coincubada con los liposomas una vez estos han sido formados. Esta funcionalización directa favorece la propia eficacia del proceso (maximizando la carga de MAN en superficie), evitando al tiempo la autoasociación entre las moléculas de MAN (en el interior de la partícula). Asimismo, la adición de lípidos pegilados mejora la farmacocinética, proporciona protección frente al sistema reticuloendotelial y convierte a las nanopartículas llpídlcas en vehículos más específicos hacia las células diana, proporcionando una cubierta de camuflaje, y más grandes en apariencia.

Otro aspecto de la Invención se refiere a la obtención de nanopartículas llpídicas de tipo "core-sheir, o núcleo-corona, obtenidas mediante el procedimiento descrito en esta memoria. Estas nanopartículas llpídicas, al elaborarse sin la utilización de agentes acoplantes, cuyo ejemplo más paradigmático es el glutaraldehído, están, con toda seguridad, libres de este tipo de agentes cltotóxicos y pueden, por lo tanto, utilizarse in vivo o en cultivos de células con mucha más seguridad que las nanopartículas lipídicas en cuya elaboración se utilizan agentes acoplantes.

Estas nanopartículas lipídicas están especialmente preparadas para ¡nteraccionar con macrófagos cerebrales perlvasculares y meníngeos. El "core" o núcleo contiene una carga farmacológicamente activa de un ácido nucleico y una cantidad electroequivalente de lípido catlónico biocompatible. En términos prácticos, la metodología empleada proporciona una eficiencia de encapsulación del ácido nucleico próxima al 100% mediante la formación de estructuras lamelares de tipo "cebolla’' en las que el lípido catiónico biocompatible se encuentra acomplejando el ácido nucleico en el interior de las láminas acuosas formadas entre bicapas lipídicas concéntricas.

El ácido nucleico puede ser en general de cualquier tipo (ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico, monocatenario, bicatenario, lineal, circular, enrollado o lineal, o combinaciones de ellos) con la limitación de que su tamaño y flexibilidad le permitan mantenerse insertado en una cavidad de dimensiones nanométricas. Puede tratarse, por ejemplo, de cualquier tipo de oligonucleótido, (microARN, ARNsi, ARNm, ADN plasmídico). Asimismo, la secuencia del ácido nucleico puede Incluir análogos de nucleótidos o nucleótidos modificados, con la única limitación de contener hidrofilicidad suficiente para mostrar una preferencia por la cavidad acuosa del interior de los complejos.

En cuanto al lípido catiónico biocompatible incluido en el “core” de la nanopartícula lipídlca, ejemplos no limitativos son: DOTMA, DODMA, DOTAP, DMRIE, DOTIM, DOGS, DORIE, MVL5, GL67, BGTC, BGSC, DC-Chol o DC-colesterol, DOEPC y derivados de etilfosfocolina, DOSPA. Alternativas clásicas de lípido catiónico utilizadas en estudios modelo son DODAB, DDAB. Preferentemente, dada su disponibilidad comercial, estabilidad química y coste reducido, se seleccionan derivados catiónicos de colesterol como BGTC, BGSC y, más preferentemente, DC-colesterol, un lípido natural funcionalizado con carga positiva.

El "core” de las nanopartículas lipidicas presenta una estructura multilamelar condensada (se considera que un objeto lipídico es multilamelar si tiene, al menos, 3 bicapas lipidicas, o lámelas). Las nanopartículas de la invención incluyen, al menos, 3 lámelas y, en la mayoría de los casos un número muy superior (ver Figura 3 (A)). La corona de las nanopartículas lipidicas, o ‘'shell’’, segrega la mayoría del lípido pegilado exponiendo este polímero flexible hacia la superficie libre externa, la cual sirve como cubierta de camuflaje y protección ante la degradación, favoreciendo la interacción adhesiva con los macrófagos diana: macrófagos cerebrales perivasculares y meníngeos. La corona de las nanopartículas lipidicas de la invención incluye:

- una fosfocolina que proporcione fluidez y estabilidad a las bicapas lipidicas;

- colesterol neutro proporcionando rigidez y facilitando la interacción con biomembranas lipidicas con alto contenido en fosfatidiletanolamina (PE);

-un lípido pegilado (lípido-PEG-NHS-MAN) proporcionando una gran cabeza polimérica segregable a la superficie libre externa de la partícula y la capacidad funcional del paminofeníl-a-D manopiranosldo (MAN) mediante su unión al brazo flexible macromolecular (PEG) mediante el grupo puente NHS. Se aprovecha la singularidad que tienen los macrófagos diana de reconocer el azúcar mañosa (presente en los carbohidratos de la pared celular de numerosas bacterias) y la capacidad de las nanopartículas lipidicas tapizadas de este fosfolípido pegilado, para favorecer su adhesión con la membrana plásmatica mediante la funcionalización con la mañosa en su superficie.

En una realización preferida, el lípido pegilado está basado en diesteroilfosfatidiletanolamina (DSPE-PEG-NHS-MAN).

Los lípidos pegilados incluidos en la formulación presentan una cabeza polar de tamaño macromolecular. Debido a su exclusión por tamaño en la estructura laminar, la superficie externa de dichas nanopartículas lipidicas compuestas aparece tapizada de grupos mañosa, los cuales permiten la selectividad de la nanoparticula por los macrófagos meníngeos y perivasculares. Esta estructura estratificada, como si se tratase de una cebolla (lámelas interiores y superficie externa funcionalizada), es diferente a los liposomas convencionales descritos hasta la fecha, los cuales son fundamentalmente unilamelares según se obtienen por extrusión.

En una realización preferida de la invención las nanopartículas lipídicas que tienen como célula diana a los macrófagos cerebrales comprenden:

- un núcleo multilamelar formado por oligonucleótidos antisentido y DC-colesterol, - una cubierta lipídica fluida de base estructural compuesta por fosfolípido y colesterol y un componente funcional de base lipídica pegilado y funcionalizado con un derivado de mañosa;

y presentan una configuración multilamelar con alto grado de compactación, entendiendo por multilamelar que tienen, al menos, 3 lámelas y por alto grado de compactación que el lípido catiónico biocompatible está complejando el ácido nucleico en el núcleo en una estructura tipo sándwich.

Preferentemente, los oligonucleótidos antisentido se diseñan como GapmeRs, cuya liberación en macrófagos residentes produce el silenciamiento selectivo de genes de esos macrófagos, y la cubierta lipídica multilamelar incluye POPC/colesterol/DSPE-PEG-MAN.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la depleción de macrófagos cerebrales que incluye nanopartículas lipídicas formadas por un núcleo con oligonucleótidos antisentido y DC-colesterol, y una cubierta lipídica de fosfolípido, colesterol y un componente de base lipídica pegilado y funcionalizado con un derivado de mañosa. Preferentemente, los oligonucleótidos antisentido son GapmeRs, cuya liberación en macrófagos residentes produce el silenciamiento selectivo de genes de esos macrófagos, y la cubierta lipídica multilamelar está constituida por POPC/colesterol/DSPE-PEG-MAN.

Como consecuencia del procedimiento para la elaboración de estos nanoliposomas las nanopartículas lipídicas están estratificadas en una estructura núcleo-corona comprendiendo un núcleo multilamelar muy compacto con alta carga de ácido nucleico y una corona superficial de lípidos neutros y funcionalizados. En la figura 3 puede observarse este tipo de estructura El hecho de que las nanopartículas lipidicas de la invención sean multilamelares les confiere la ventaja de liberar lentamente su contenido una vez se liberan en el tejido in vivo o in vitro.

Estas nanopartículas lipidicas tienen como células diana a los macrófagos perivasculares y meníngeos cerebrales que son macrófagos residentes del cerebro con actividad fagocítica constitutiva, de origen hematopoyético, que ocupan el cerebro a una tasa constante de reposición en el espacio perivascular y meníngeo. Hasta la fecha se ha descrito que tienen un papel fundamentalmente regulador en la activación de respuestas de fase aguda frente a un estímulo inmune, como son la síntesis y liberación de glucocorticoides o la respuesta febril; se han Identificado como centinelas Inmunes, regulando la acumulación y tráfico de macromoléculas (por ejemplo, el péptido pamllolde), virus, bacterias y leucocitos periféricos al parénquima cerebral en distintos modelos animales de neuropatologías; se han propuesto como una importante fuente de estrés oxidativo que puede estar implicado en la disfunción cerebrovascular que tiene lugar en modelos animales de Alzheimer e hipertensión; y se han identificado como principal reservorio del virus VIH en el sistema nervioso central, ocasionando diversas disfunciones neurológicas.

Por lo tanto, la modulación génica de estas células inmunes, que tienen un claro papel regulador de la fisiología del sistema nervioso central, mediante ácidos nucleicos con efectos farmacológicos vehiculados por nanopartículas lipidicas constituye una interesante estrategia terapéutica para el manejo de la respuesta inmune/inflamatoria que forma parte de la etlofisiopatologia de múltiples patologías neurológicas/ neurodegenerativas y psiquiátricas, de manera que se puede elaborar un método para el tratamiento de dichas patologías utilizando las nanopartículas lipidicas de la invención en un paciente aquejado de alguna enfermedad del sistema nervioso central. Otro aspecto de la invención se refiere a las nanopartículas lipidicas que se han descrito en esta memoria para su uso en la elaboración de un medicamento frente a enfermedades neurológicas/ neurodegenerativas y/o psiquiátricas. Asimismo, la invención también se refiere a aquellas composiciones farmacéuticas que incluyen las nanopartículas lipidicas descritas en esta memoria, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción un juego de dibujos en donde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

Figura 1. Esquema ilustrativo de la metodología para la preparación de las nanopartículas lipídicas, los números indican el número de cada ejemplo y los marcos de colores corresponden a los porcentajes de disolvente indicados en cada cuadro de texto específico.

Figura 2. Espectro de resonancia magnética de protón tras la síntesis del lípido manosilado DSPE-PEG-manosilado. En color rojo se han marcado las señales nuevas tras la unión con la mañosa.

Figura 3. Imágenes obtenidas mediante tinción negativa por microscopía electrónica de transmisión (TEM) de nanopartículas lipídicas complejando el ARNm (A-D) y en ausencia de ARNm (E-F).

Figura 4. Imágenes de doble inmunofluorescencia de secciones coronales de tejido cerebral de ratas.

Figura 5. Imágenes de hibridación “in situ” de secciones coronales de tejido cerebral de ratas con la sonda caracterizada por SEQ ID NO:3. Localización del ARNm del enzima L-PGDS-en células de localización perivascular.

Figura 6. Imágenes de hibridación ‘'in situ” de secciones coronales de tejido cerebral de ratas con la sonda caracterizada por SEQ ID NO:3. Localización del ARNm del enzima L-PGDS en las meninges.

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

Ejemplo 1. Elaboración del núcleo multilamelar. Figura 1 (1).

Como herramienta para la inactivación de cualquier ARNm (ARN mensajero) o ARNInc (ARN no codificante de más de 200 nucleótidos) se utilizó un LNA GapmeR diseñado previa petición y comercializado por la empresa Exiqon®. Un GapmeR es una cadena de 14-16 nucleótidos de ADN monocatenario que se diseña con las regiones flanqueantes modificadas con nucleótidos LNA (Locked Nucleic Acid o ácido nucleico bloqueado) para aumentar la afinidad de la cadena de ADN por el ARN diana. Al hibridarse el GapmeR con el ARN diana, se genera una estructura hueca en la región central del ADN-ARN que activa la ARNasa H de la célula y esta enzima se encarga de degradar el ARN diana.

Se seleccionó una secuencia antisentido para la inhibición del enzima L-PGDS, responsable de la síntesis de la prostaglandina antiinflamatoria 15d-Prostaglandina J2. La secuencia, original y diseñada bajo petición por la empresa Exiqon®, fue: 5 '-3 '-TACTCTTGAATGCACT (caracterizada por SEQ ID NO:1), marcada en 5’ con un isómero derivado de la fluoresceína (FAM, carboxifluoresceína) emitiendo a 488mm.

Como control negativo para este experimento también se diseñó y utilizó una sonda original antisentido sin sentido (“no sense”) cuya secuencia fue 5 '-3 '-AACACGTCTATACGC (caracterizada por SEQ ID NO:2), marcada en 5’ con FAM, emitiendo a 488mm.

En un vial de vidrio de 1,5 mL, se disolvieron 0,54 mg de DC-Chol (Avanti® Polar Lipids) en 90 pl de CHCb, se añadieron 300 pl de metanol y 90 pl de H²O libre de ARNasas conteniendo 20 nmoles de GapmeR. El contenido de ese vial se agitó formándose una monofase (corresponde al contenido 20% H20, 50% MeOH, 30% CHCI3en el diagrama Bligh&Dyer) que se dejó incubar durante toda la noche

Ejemplo 2. Desestabilización de la monofase de Bligh&Dyer y concentración de las partículas hidrofóbicas en la fase orgánica. Figura 1 (2).

Se añadieron CHCI³ (120 pL) y H20 libre de nucleasas (120 pL) para reducir el porcentaje de metanol y situarse en una zona del diagrama de Bligh&Dyer (30% H20, 30% MeOH, 40% CHCI³), donde los disolventes se separan en fases. Los lípidos catiónicos biocompatibles, al estar complejando el GapmeR, lo protegen y lo arrastran a la fase orgánica, más densa (inferior dentro del tubo). Estas micelas no se desestabilizaron al quedar agua de hidratación entre la interacción lípido catiónico biocompatible-GapmeR.

Se mezcló en vórtex y se separaron las fases bajo centrifugación suave (800 rpm, 4 minutos), recuperando la fase orgánica que quedó localizada en la parte inferior del tubo después de la centrifugación.

Ejemplo 3. Preparación de una película lipídica con lípidos neutros manosilados: POPC/colesterol/DSPE-PEG-MAN. Figura 1 (3).

Como fosfocolina fluida, se eligió para este ejemplo POPC (1 -palmitoil-2-oleoil-snglicero-3-fosfocolina) que, junto con el colesterol, se adquirió en Avanti® Polar Lipids. Para la manosilación del lipido pegilado funcionallzado con el grupo NHS, a una solución de DSPE-PEG(2000)-NHS (50 mg, 1 equiv.; (NOF Europe GmbH)) en tetrahldrofurano (THF) (6 m!_) se añadió MAN (4,5 mg, 1 equiv.¡ 4-aminofenll a-D-manopiranosido; Slgma-Aldrlch, Merck). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 h y la reacción fue seguida por cromatografía en capa fina. Después, el disolvente se eliminó al vacio y el producto se utilizó sin necesidad de volver a realizar purificación.

En la figura 2, se muestra el espectro de resonancia magnética de protón tras la síntesis del lipido manosilado. En color rojo se han marcado las señales que aparecen tras la unión de la mañosa al lipido pegilado DSPE-PEG. El ensayo se realizó con un espectrómetro Bruker Avance 300 (1H: 300 MHz) a 298 K usando solventes parcialmente deuterados como estándar interno.

Tabla 1. Configuración del ensayo de resonancia magnética de protón realizado según el ejemplo 3.

Se preparó una película lipídica mezclando los lípidos disueltos en cloroformo siguiendo una relación POPC/colesterol/DSPE-PEG-MAN de 52:40:8 mol%, teniendo en cuenta una ratio POPC/DC-Chol de 5,2:1. Después, se eliminó el cloroformo al vacío, quedando los lípidos formando una fina película en el fondo del vial.

Ejemplo 4. Inserción de los lípidos de la corona en la fase orgánica del ejemplo 2. Figura 1 (4).

Se utilizaron 210 pL de la fase orgánica obtenida en el ejemplo 2 para disolver la película lipídica elaborada en el ejemplo 3. Se mezclaron y se incubaron durante 2 horas.

Ejemplo 5. Obtención de las nanoparticulas lipídicas. Figura 1 (5).

Se mezclaron 210pL de H20 libre de nucleasas y los 210pl_ de la fase orgánica obtenida en el ejemplo 4 y se formó una emulsión mezclando con un vórtex.

A continuación, se extrajo de la emulsión la fase orgánica (cloroformo y metanol) con un rotavapor (evaporación rotatoria) obteniendo las nanopartículas lipidicas disueltas en una fase acuosa cuyo volumen se ajustó con tampón PBS libre de nucleasas hasta un volumen final de 250pl.

Ejemplo 6. Limpieza de las nanopartículas lipidicas. Figura 1 (6).

Las nanopartículas lipidicas del ejemplo 5 se centrifugaron a 14000 rpm durante 15 minutos, para sedimentarlas y eliminar las vesículas lipidicas que no contenían GapmeR así como posibles moléculas de GapmeR que no se hubieran encapsulado por rotura de las nanopartículas.

Finalmente, el pellet resultante de la centrifugación se resuspendió en 250 pl de tampón PBS libre de nucleasas.

Ejemplo 7. Caracterización de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica, Potencial Zeta y TEM

Dispersión de luz dinámica (DLS): En el ejemplo 6, después de la sedimentación de las nanopartículas lipidicas por centrifugación, se obtuvieron dos fases, la primera es el sobrenadante, en el cual se localizan los liposomas menos densos porque no contienen el denso y compacto núcleo formado por lípidos catiónicos biocompatibles complejando el ácido nucleico, y la segunda es un pellet, en el cual se encuentran concentradas las nanopartículas lipidicas.

El diámetro medio y la distribución de vesículas se midieron por dispersión de luz dinámica. Para ello, las muestras se diluyeron (1:100) en tampón PBS y se midieron a 25°C, considerando un índice de refracción medio de 1.335, en un Malvern Zetasizer NS instrument. Se considera que un índice de polidispersidad por debajo de 0,1 representa una muestra bastante monodispersa, es decir, homogénea En la tabla 2, se muestran los resultados obtenidos en tres repeticiones para cada fase tras el paso de limpieza del ejemplo 6; entre medida y medida se dejó un tiempo de espera de 30 minutos. Las medidas realizadas a partir del pellet resuspendido en PBS indican que las muestras obtenidas son bastante monodispersas y que el tamaño medio de las nanopartículas lipidicas se encuentra en torno a 170 nm. Las muestras medidas de una fracción del sobrenadante Indican mayor polidispersidad y un mayor tamaño medio, de aproximadamente 193 nm. En ambos casos parecen estables con el tiempo.

Tabla 2. Resultados obtenidos para la medida del diámetro efectivo y el índice de polidispersidad de las fases obtenidas tras la sedimentación de las nanopartículas lipldicas (sobrenadante y pellet) mediante dispersión de luz dinámica.

Potencial Zeta (mV): Se realizó una medición indirecta de la carga superficial neta de las nanopartículas lipldicas midiendo el potencial zeta de sus suspensiones acuosas diluidas, en un Malvern Zetasizer NS instrument (Malvern Instruments Ltd, UK). Para ello, la muestra se colocó en una celda de electroforesls equipada con electrodos de oro, las muestras se diluyeron en una proporción 1:50 y se midieron a 25°C.

En la tabla 3, se muestran los resultados obtenidos en 5 repeticiones de cada fase (sobrenadante y pellet). En la medición de las nanopartículas lipldicas del pellet, se obtuvieron valores tanto positivos como negativos cercanos a la neutralidad, indicando que los lipidos catiónicos biocompatibles que conforman las nanopartículas lipldicas se encuentran complejando (interaccionando) los fragmentos de GapmeR de carga contraria, apareciendo una compensación de cargas que da lugar a un potencial zeta esencialmente nulo En el sobrenadante se localizan las nanopartículas lipldicas menos densas que no contienen GapmeR. En estos objetos, el exceso de lipidos catiónicos produce un exceso de carga positiva. Esto se observó en las medidas de potencial zeta del sobrenadante, las cuales presentan una carga superficial neta altamente catiónica.

Tabla 3. Potencial zeta medido en las fases obtenidas tras la sedimentación de las nanopartículas lipídicas en el ejemplo 6.

Tinción negativa en Microscopía electrónica de transmisión (NS-TEM): Se analizó por TEM la microestructura de las nanopartículas lipídicas con un método de tinción negativa mediante cationes uranilo (UCV), los cuales marcan preferencialmente el componente nucleotídico de carga negativa. Para su examen, se combinaron volúmenes iguales de la muestra diluida en PBS y acetato de uranilo (2%) y se dejaron incubar durante 1 min a temperatura ambiente. Se colocó una gota de esta solución en una rejilla de cobre recubierta de carbono Formvar durante 5 min. Se eliminó el exceso de líquido usando papeles de filtro. Después de secar la rejilla a temperatura ambiente durante 5 minutos, se realizaron micrografías con un microscopio electrónico de transmisión JEOL 1010 operando a 100 kV {resolución = 0.35 nm). Las micrografías se captaron usando una cámara Megaview II.

La microscopía electrónica de transmisión empleando el método de tinción negativa es una técnica muy útil que proporciona información sobre las propiedades químicas y estructurales en muestras de liposomas o cápsulas lipídicas. El acetato de uranilo presenta preferencia por grupos amino y fosfato, por lo que la alta presencia de grupos fosfato y amino en el ARN convierte esta metodología en una técnica muy adecuada para su localización. Asimismo, la presencia de grupos fosfato a nivel de la cabeza en los fosfolípidos, también permite la tinción de membranas, pero con menor intensidad que en el caso de los ácidos nucleicos. Mediante esta técnica, se ha confirmado la multilamelarldad de las nanopartículas lipídicas de la invención y la estratificación tipo “core-shell” de dichas nanopartículas. En la figura 3 se muestran tres imágenes de tinción negativa mediante microscopía electrónica de transmisión (A, C, E). La imagen A corresponde al núcleo de una nanopartícula lipídica. Estas regiones están compuestas por moléculas de DC-Colesterol complejando GapmeR. Debido a la presencia de grupos amino en el DC-Colesterol y de grupos amino y fosfato en GapmeR, estas regiones se convierten en estructuras de mayor contraste debido a la mayor interacción con el acetato de uranilo. En esta imagen, es posible apreciar la presencia de estructuras tipo sándwich. En la gráfica B se muestra el análisis de la escala de gris en función de la distancia en una región de la imagen A (línea roja) utilizando el software libre ImageJ. En rojo se muestra el ajuste a una función sinusoidal con una distancia pico-pico de 9,24 ±0 ,12 nm, lo cual es compatible con una estructura lamelar periódica formada por bicapas lipídicas de entre 4 y 5 nm de espesor, flanqueadas por láminas acuosas interlamelares de entre 5 y 4 nm de espesor donde se aloja el ARN complejado con el DC-colesterol catlónico incluido en la composición de las bicapas lipídicas En la imagen C se muestra el mismo estudio en una nanopartícula lipídica en la que se visualiza con claridad la corona menos electrodensa, y por tanto con una cantidad reducida de ARN Debido a la multilamelaridad de las nanopartículas lipídicas, también es apreciable periodicidad entre las diferentes lámelas que constituyen la corona, aunque se observa una distancia promedio levemente mayor que en la región del núcleo, con distancias de repetición aproximadas de 9,9 ± 0,3 nm (gráfica D), lo cual es esperable debido a la repulsión entre bicapas lipídicas del “shell” con menor compensación de cargas por parte del ARN que la ocurrida en el “core" compacto. También se observa cómo el contraste en estas reglones es más débil que en el “core”, puesto que el acetato de uranilo únicamente está reaccionando con los grupos fosfato de las cabezas de los fosfolípidos, y en mucha menor extensión con el ARN. A modo de control, la imagen E corresponde a un liposoma multilamelar no complejado recogido de la fase sobrenadante obtenida en el ejemplo 6. Debido a la carencia de RNA reteniendo los lípidos catlónicos en el “core", la composición lipídica es más uniforme y la tinción con acetato de uranilo no diferencia una estratificación del tipo “core-sheir (imagen E), presentando una periodicidad de 9,9 ± 0,3 nm (gráfica F) que es muy similar a la observada en la región correspondiente al "sheH” libre de ARN (gráfica D), Ejemplo 8. Silenciamiento del gen del enzima Prostaglandina D sintasa lipocalina (L-PGDS)

Para producir la inhibición de un gen con un alto grado de expresión de forma constitutiva por los macrófagos perivasculares cerebrales y meníngeos, se seleccionó el gen que codifica para el enzima antiinflamatorio Prostaglandina D sintasa lipocalina (L-PGDS).

Teniendo en cuenta el tiempo necesario para que las nanopartículas lipídicas liberen su contenido dentro de los macrófagos diana, se optó por buscar una herramienta génica que presentara un tiempo de inhibición extendido, como es el caso de los GapmeRs. Como ya se ha indicado en el ejemplo 1, los GapmeRs son una nueva herramienta para la inactivación de cualquier ARNm o ARNInc. A diferencia de otros ARN de interferencia (siRNA), los GapmeRs no solo alcanzan dianas citoplasmáticas, sino también nucleares, como ARN de cadena larga no codificante (ARNInc) y todos los ARN de tamaño pequeño (ARNsn). Además, producen menos efectos indeseados, ya que no se unen al complejo RISC (RNA-/'ncfucecf silencing complex), ni lo saturan. Una de sus principales ventajas es su alta estabilidad, debido a que todo su esqueleto es de fosforotioato, disminuyendo los efectos secundarios.

La secuencia antisentido utilizada para la inhibición del enzima L-PGDS, caracterizada por SEQ ID NO:1, se describe en el ejemplo 1 y está marcada en 5’ con un isómero derivado de la fluoresceína (FAM, carboxifluoresceína) emitiendo a 488mm. La adición de este fluoróforo permite estudiar a través de técnicas de inmunofluorescencia (que se detallan a continuación) la localización del GapmeR en el cerebro de rata tras su administración por vía intracerebroventricular (icv) (detallada a continuación) encapsulado en las nanopartículas lipídicas de la invención.

Como control negativo para este ejemplo también se utilizó una sonda antisentido "no sense”, caracterizada por SEQ ID NO:2, también marcada con fluoresceína.

Para la evaluación directa de la inhibición de la expresión génica de L-PGDS con el GapmeR descrito en el ejemplo 1 y encapsulado en nanopartículas lipídicas, se optó por la utilización de la técnica inmunohistoquímica de hibridación "in situ" (ISH), que consiste en marcar una hebra sencilla de ARN, denominada sonda, y permitir que se empareje con su secuencia complementaria en el ARN presente en una muestra de tejido. En nuestro caso la sonda fue encargada a la empresa Mlcrosynth®, y su secuencia es 5'-3': CTC ACC TGT GTT TAC TCT TGA ATG CAC TTA TCC GGT TGG GGC AGG, caracterizada por SEQ ID NO:3, y se marcó en el extremo 3' con 33P-dATP, mediante una enzima deoxinucleotidil transferasa terminal. Por otro lado, el tejido utilizado para la prueba fue cortes de cerebro de rata (como se detalla a continuación).

Inyección intracerebroventricular (ICV): Estos experimentos se realizaron en ratas Wistar. Para la realización de las inyecciones ICV, se utilizaron coordenadas referidas al ventrículo lateral derecho, se anestesió a los animales con una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina (2,5:1, mg/kg, s.c.) y se montaron en el marco estereotáxico. Las nanopartículas lipídicas que contenían, respectivamente, GapmeR, antisentido y su vehículo (H²O libre de nucleasas) se infundieron lentamente en un volumen de 25 pL durante 10 minutos usando una jeringa Hamilton (Bonaduz, AG Switzerland®) y una aguja 26 GA a través de un inyector estereotáxico motorizado (Stoelting 53311®) en el ventrículo lateral derecho.

Inmunofluorescencía: Los anímales (ratas Wistar) fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital. Inmediatamente después el cerebro fue extraído, congelado en hielo seco y almacenado a -80°C. Se cortaron secciones coronales de tejido cerebral de 14 pm de espesor y se colocaron en portaobjetos. Primero fueron objeto de tres lavados con KPBS (tampón fosfato salino con potasio) 0,02M (pH= 7,4), durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para eliminar la autofluorescencia se incubaron con glicina 10mM, durante 20 minutos a temperatura ambiente, recibieron otros tres lavados de KPBS e inmediatamente fueron bloqueados con BSA (albúmina de suero bovino) 10%, disuelta en KPBS con tritón 0,1 %, durante 30 minutos. Los cortes se incubaron con los correspondientes anticuerpos primarios (ab64693) antirreceptor de mañosa (CD206), durante toda una noche, diluidos en la solución de bloqueo; tras 3 lavados con KPBS recibieron los correspondientes anticuerpos secundarios (Alexa Fluor® 555 (A31572)), durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, se realizaron tres lavados con KPBS, y un último lavado con agua desionizada, durante 5 minutos. Después de secarlos, los cortes se montaron en portas con medio de montaje Fluoroshield® (Sigma Aldrich) que incluía 4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI). Las secciones coronales se cubrieron con cubreobjetos y se congelaron a -20°C o se visualizaron inmediatamente en un microscopio de epi-fluorescencia TI-FL Epi-fl lllum inato® de alto rendimiento Nikon Eclipse Ti Series.

Las imágenes de la figura 4, de doble inmunofluorescencia, indican la presencia de los GapmeR (marcados en verde) en los macrófagos perivasculares (A) y meníngeos (B) (marcados en rojo). La tinción DAPI (en azul), que identifica núcleos celulares, permite observar cómo hay presencia de GapmeR a nivel tanto nuclear como citoplasmático. Estos resultados confirman que los GapmeR han sido incorporados por los macrófagos diana.

Hibridación “in situ” (ISH): Los animales (ratas Wistar) fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital. Inmediatamente después el cerebro fue extraído, congelado en hielo seco y almacenado a -80°C. Se corlaron secciones coronales de tejido cerebral de 14 pm de espesor y se colocaron en portaobjetos tratados con 3-aminopropil-trietoxisilano, preservándolas a -40°C. Se fijaron los tejidos con paraformaldehido (PFA) al 4% y se trataron con la proteasa pronasa para facilitar la accesibilidad de la sonda al ARNm de interés. A continuación, se cubrieron los tejidos con el tampón de hibridación que contiene aproximadamente, 1,5 nM de la sonda cuya secuencia está caracterizada por SEQ ID NO:3 y está marcada con P radioactivo y se incubaron a 42°C, durante 24 h. Después, se lavaron las secciones hibridadas y se expusieron a una película fotográfica durante 1-4 semanas. A continuación, se analizaron los autorradiogramas y se obtuvieron las imágenes en un microscopio de epifluorescencia TI-FL Epi-fl llluminator® de alto rendimiento Nikon Eclipse Ti Series.

En las figuras 5 y 6, se muestran imágenes de ISH en las que se aprecia la presencia de ARNm para la L-PGDS (puntos y manchas negras) en células de localización perivascular (figura 5) y en las meninges (figura 6), en los cortes de cerebro de animales tratados con liposomas cargados con solo el vehículo de los GapmeR (control) (A) y animales que han recibido GapmeR antisentido “'no sense" como control negativo (B). En los cortes que corresponden a animales que han recibido nanopartículas lipídicas con el GapmeR descrito en el ejemplo 1 (C), se aprecia una clara ausencia/reducción en la señal para el ARNm de L-PGDS, lo que confirma su inhibición.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas de tipo núcleo/corona que incluye los siguientes pasos:

   la . complejación de un ácido nucleico disuelto en agua con un lípido catiónico biocompatible en cloroformo, para formar micelas inversas mediante formación de una monofase de Bligh & Dyer por la adición de metanol hasta homogeneización;

   2a. desestabilización de la monofase de Bligh & Dyer, y concentración de las partículas hidrofóbicas del paso 1a mediante la adición de cloroformo y agua;

   lb . preparación de los lípidos formadores de bicapa: fosfolípido insaturado/colesterol/lipido-PEG-MAN que incluye la manosilación del componente lípido-PEG-NHS mediante reacción directa de la cabeza succinimidil éster (NHS) con el grupo -NH2 de p-aminofenil-a-D mannopiranosido (MAN);

   2b. preparación de una película lipídica con los lípidos del paso 1b;

   3. inserción de la película lipídica del paso 2b en la fase orgánica del paso 2a mediante disolución;

   4. interacción de las micelas inversas con los lípidos formadores de bicapa, ambos presentes en la disolución del paso 3, inducida por la adición de agua a la fase orgánica;

   5. extracción del disolvente orgánico y obtención de las nanopartículas lipídicas multilamelares en solución acuosa;

   y en el que la manosilación no requiere un agente acoplante.

   2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que no se realiza homogeneización por extrusión del tamaño de las nanopartículas lipídicas obtenidas en el paso 5.

   3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en el que se añaden los siguientes pasos:

   6. Limpieza por sedimentación de las nanopartículas lipídicas y eliminación de las vesículas lipídicas sin ácido nucleico y del ácido nucleico no encapsulado.

   7. Resuspensión del pellet de nanopartículas lipídicas en solución acuosa.

   4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el lípido catiónico biocompatible se selecciona del grupo formado por: 1,2-di-0-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA), 1,2-dioleiloxi-3-dimetíllaminopropano (DODMA), dioleoiloxi-trimetilamonio propano (DOTAP), bromuro de amonio 1,2-dimiristiloxi-propil 3-d¡met¡l-h¡drox¡ etil amonio (DMRIE), cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etiloj-2-oleil-3-{2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), dioctadecil-amido-glicilo-espermina (DOGS), bromuro de 1,2-dioliiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamonio (DORIE), N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropil)amino]-4-[di(3-amino-propil)amino]butilcarboxamido)etil]-3,4-di[oleiloxi]-benzamida (MVL5), N4-colesteril-espermina HCI Sal (GL67), bis-guanidium-trencolesterol (BGTC), bis-guanidinium-espermidine-colesterol (BGSC), 3B-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamo¡l]colesterol clorhidrato (DC-Chol o DC-colesterol), cloruro de 1,2-d¡oleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina y derivados de etilfosfocolina (DOEPC), 2,3-dioleiloxi-N-(2-(esperminecarboxamido)etil)-N;N-dimetil-1-propanaminium trifluoroacetato (DOSPA), bromuro de diactadecil-dimetilamonio (DODAB), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio propano (DSTAP).

   5. Procedimiento según la reivindicación 4 en el que lípido catiónico biocompatible seleccionado es DC-colesterol.

   6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el ácido nucleico es un ácido ribonucleico o un ácido desoxirribonucleico, monocatenario, bicatenario, lineal, circular, enrollado, o combinaciones de los mismos, un oligonucleótido, microRNA, siRNA, mRNA o DNA plasmidico.

   7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el ácido nucleico es un GapmeR.

   8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el fosfolipido insaturado del paso 1b se selecciona entre las fosfocolinas insaturadas dioleoil-glicerofosfocolina (DOPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), L-afosfatidilcolina (eggPC), o palmitoil-oleoil-glicerofosfocolina (POPC).

   9. Procedimiento según la reivindicación 8 en el que el fosfolipido insaturado seleccionado es POPC.

   10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el lípido pegilado del paso 1b se selecciona del grupo formado por DSPE-PEG-NHS, DOPE-PEG-NHS, N-(succinimidiloxi-glutaril)-L-a-fosfatidiletanolamina, 1 -palmitoil-2-oleoil (POPE-PEG-NHS), N-(succinimidiloxi-glutaril)-L-a-fosfatidiletanolamina, dipalmitoil (DPPE-PEG-NHS), N-(succ¡n¡m¡d¡lox¡-glutar¡l)-L-a-fosfat¡d¡letanolam¡na,1,2-b¡s (dimet¡llfosfino)etano (DMPE-PEG-NHS).

   11. Procedimiento según la reivindicación 10 en el que el lípido seleccionado es diesteroilfosfatidiletanolamina (DSPE-PEG(2000)-NHS).

   12. Nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana que contienen:

   - un núcleo formado por:

   - un ácido nucleico, y

   - un lípido catiónico biocompatible,

   - una corona formada por:

   - un fosfolípido insaturado y colesterol, y

   - un componente de base lipídica pegilado y funcionalizado con un derivado de mañosa,

   caracterizadas por ser multilamelares con alto grado de compactación, entendiendo por multilamelares que tienen, al menos, 3 lámelas y por alto grado de compactación que el lípido catiónico está complejando el ácido nucleico en el núcleo en una estructura tipo sándwich.

   13. Nanopartículas lipídicas según reivindicación 12 en las que el lípido catiónico biocompatible se selecciona del grupo formado por: 1,2-di-0-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA), 1,2-dioleiloxi-3-dimetillaminopropano (DODMA), dioleoiloxi-trimetilamonio propano (DOTAP), bromuro de amonio 1,2-dimiristiloxi-propil-3-dimetil-hidroxi etil amonio (DMRIE), cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etilo]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), dioctadecil-amido-glicilo-espermina (DOGS), bromuro de 1,2-dioliiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamonio (DORIE), N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropil)amino]-4-[di(3-am¡no-propil)amino]butilcarboxamido)etil]-3,4-di[oleiloxi]-benzamida (MVL5), N4-colesteril-espermina HCI Sal (GL67), bis-guanidium-trencolesterol (BGTC), bis-guanidinium-espermidine-colesterol (BGSC), 3I3>-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol clorhidrato (DC-Chol o DC-colesterol), cloruro de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocol¡na y derivados de etilfosfocolina (DOEPC), 2,3-dioleiloxi-N-(2-(esperminecarboxamido)etil)-N,N-dimetil-1-propanaminium trifluoroacetato (DOSPA), bromuro de diactadecil-dimetilamonio (DODAB), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio propano (DSTAP).

   14 Nanoparticulas lipídicas según la reivindicación 13 en las que lípido catiónico biocompatible seleccionado es DC-colesterol.

   15. Nanoparticulas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 12-14 en las que el ácido nucleico se selecciona entre un ácido ribonucleico o un ácido desoxirribonucleico, monocatenario, bicatenario, lineal, circular, enrollado, o combinaciones de los mismos, un oligonucleótido, microARN, ARNsi, ARNm, o ADN plasmidico

   16. Nanoparticulas lipídicas según la reivindicación 15 en las que el ácido nucleico es un Gapmer.

   17. Nanoparticulas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 12-16 en las que el fosfolípido insaturado de la corona se selecciona entre las fosfocolinas insaturadas dioleoil-glicerofosfocolina (DOPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), L-afosfatidilcolina (eggPC), o palmitoil-oleoil-glicerofosfocolina (POPC).

   18. Nanoparticulas lipídicas según la reivindicación 17 en las que el fosfolípido insaturado es POPC.

   19. Nanoparticulas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 12-18 en las que el componente de base lipídica pegilado se selecciona del grupo formado por DSPE, DOPE, POPE, DPPE, DMPE.

   20. Nanoparticulas lipídicas según la reivindicación 19 en las que el componente de base lipídica seleccionado es DSPE

   21. Nanoparticulas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 12-20 en las que el derivado de mañosa es p-aminofenil-a-D manopiranosido.

   22. Nanoparticulas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 12-21 en las que la proporción fosfolípido insaturado/colesterol/lípido manosilado es de 45-85/10-40/5-15 por ciento, en masa, respectivamente

   23 Nanopartículas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 12-22 para su uso en la elaboración de un medicamento frente a enfermedades neurológicas/ neurodegenerativas y/o psiquiátricas.

   24. Composición farmacéutica que incluye las nanopartículas lipídicas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 12-22 y un excipiente farmacéuticamente aceptable

   25. Kit para la depleclón de macrófagos cerebrales que incluye las nanopartículas lipídicas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 12-22.

   26. Kit según la reivindicación 25 en el que el ácido nucleico de las nanopartículas lipídicas es un GapmeR