BRPI0717800A2

BRPI0717800A2 - COMPOSIÇÃO DE LIPOSSOMAS SENSÍVEIS AO pH

Info

Publication number: BRPI0717800A2
Application number: BRPI0717800-0A
Authority: BR
Inventors: Stavroula Sofou
Original assignee: Politechnic Inst Univ New York
Priority date: 2006-10-06
Filing date: 2007-10-05
Publication date: 2014-09-09
Also published as: CA2664517A1; JP2010505880A; US20110027171A1; AU2007307846A1; WO2008045804A9; WO2008045804A2; EP2084277A2; WO2008045804A3

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção Composição de Lipossomas Sensíveis ao pH

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se ao campo dos sistemas de distribuição terapêutica e composições de lipossomas. Além disso, a presente invenção é direcionada a uma composição de lipídios específicos que formam lipossomas, que podem distribuir um agente biologicamente ativo.

Antecedentes da Invenção

Partículas lipídicas podem ser complexadas com praticamente qualquer material biológico. Esta capacidade permite a essas partículas lipídicas serem utilizadas como sistemas de distribuição para agentes bioativos. Complexos lipídicos foram utilizados para uma infinidade de terapias medicamentosas, e uma área em que estes sistemas de distribuição têm mostrado resultados promissores é em terapias contra câncer. Para uma terapia contra câncer ser bem sucedida e eficiente, o agente bioativo deve ser direcionado ao tumor ou célula cancerosa.

Em alguns casos, somente após os transportadores da droga estarem localizados dentro do interstício tumoral, a segmentação de Iigantes de câncer são necessários para reforçar a ligação dos transportadores às células cancerosas, e para mediar esta interiorização celular que aumenta a biodisponibilidade da droga. Kirpotin, PO, et al. "Antibody Targeting of LongCirculating Lipidic Nanoparticles does not increase Tumor Localization but does increase Internalization in Animal Models", Cancer Res., 66 (13): 6732-6740 (2006). Em outras ocasiões, durante a circulação na corrente sangüínea, a “decoração” da superfície do transportador com Iigantes que se ligam ao tumor podem ativar interações não desejáveis com os hospedeiros dos sistemas imune e reticuloendotelial-(RES), resultando em rápida remoção dos transportadores da corrente sanguínea, em baixas doses absorvidas do tumor, e no acúmulo de transportadores de droga em órgãos saudáveis onde a liberação de conteúdo terapêutico irá matar células saudáveis e aumentar a toxicidade. Allen, TM., “Ligand-Targeted Therapeutics in Anticancer Therapy", Nature Cancer Rev., 2: 750-763 (2002).

Assim, sempre há uma necessidade de uma melhoria nos lipossomas 5 para distribuição de agentes bioativos. Além disso, há sempre uma necessidade de uma melhoria nos lipossomas que podem ser direcionados para tumores e células cancerosas. Além disso, há uma necessidade de uma melhoria nos lipossomas que podem ser minimamente reconhecidos pelos sistemas imune e reticuloendotelial. São a estas necessidades, entre outras, 10 que esta invenção é dirigida.

Sumário da Invenção

Resumidamente, esta invenção diz respeito à lipossomas que são capazes de ser sintonizados para "esconder" (ou "mascarar"), a segmentação de Iigantes durante a circulação e “expor” a segmentação de Iigantes após os lipossomas extravasarem dentro do interstício tumoral (ácido) onde lipossomas estão nas proximidades imediata das células cancerosas. Estes lipossomas podem efetivamente direcionar o tecido de toxicidade de imunorreatividade. A presente invenção inclui tipos de lipossomas que podem circular por períodos mais longos de tempo na corrente sanguínea e podem ser absorvidos por tumores após acumulação dentro do interstício tumoral, para resultar em internalização por células cancerosas de tumor sólido, com menos identificação pelos sistemas imune e RES. Estes lipossomas podem exibir alta acumulação tumoral e de alta biodisponibilidade de droga dentro de células tumorais in vivo. Em uma configuração, os lipossomas podem compreender lipídios

rígidos ionizáveis “formação de domínio” (formação de microdomínio) que são desencadeados para forma de domínios de separação de fase lipídica, em resposta ao meio de pH ácido (por exemplo, 6,7) intersticial do tumor. A membrana Iipossomal pode ser composta de lipídios rígidos e lipídeos PEG 30 (Polietileno glicol), de modo a aumentar o tempo de circulação sanguínea. Além disso, o processo de PEGuilação não pode interferir nas propriedades sensíveis ao pH dos lipossomas desenvolvidos, como a propriedade de formação de domínio de lipídios rígidos (cada um sendo formação lamelar) pode ser utilizado.

Ligantes de segmentação tumoral podem ser conjugados no grupo 5 cabeça de lipídios de formação de microdomínio que preferencialmente distribui em um tipo de domínio após separação de fase lipíca ocorre em pH 6,7. Lipossomas também contêm lipídios PEGuiIados que preferencialmente não separam os domínios acima mencionados depois da sua formação. Por exemplo, em pH fisiológico de cerca de 7,4 (por exemplo, na circulação 10 sanguínea) os lipídios podem ser carregados, os lipídeos que compõem a membrana lipossômica são "mistos" sobre o plano da membrana e são bastante homogêneos, e os lipídios PEGyIated são uniformemente distribuídos ao longo de todo a membrana lipossômica, assim adequadamente “mascarando” (por exemplo, impedindo a combinação espacial de átomos) a 15 superfície de segmentação de Iigantes tumorais conjugados. Como o pH 10 é reduzido, domínios lipídicos separados são formados, em alguns dos quais segmentação de Iigantes tumorais estão agrupadas e a partir dos quais lipídios PEGuiIados são excluídos. Como resultado, Iigantes conjugados de superfície podem ser expostos com seletividade.

Usando lipossomas com segmentação de Iigantes que se tornam

"ocultos" ou "expostos" dependendo do pH do seu ambiente imediato, a fração de lipossomas que é internalizada por células cancerosas in vivo, após o extravasamento de lipossomas dentro do interstício tumoral, pode ser aumentado drasticamente dentro das células cancerosas, que constituem 25 tumores metastáticos vascularizados. Isto pode permitir que menores doses administradas, e doses mais elevadas adsorvidas de tumor, o que pode resultar em menor toxicidade.

Estas características, e outras características e vantagens da presente invenção, será mais visível para um técnico no assunto relevante quando a seguinte descrição detalhada das configurações preferenciais é versado juntamente com os desenhos anexos. Breve Descrição das Figuras

FIG. 1 é uma ilustração esquemática do domínio pH-sintonizável formando lipídios que se agregam como o pH de um meio tornando-se mais ácido.

FIG. 2 é uma ilustração esquemática do domínio pH-sintonizável formando lipídios que "escondem" ou "expõem" a superfície da segmentação de Iigantes conjugados, dependendo do pH do meio.

FIG. 3 é um gráfico que ilustra a extensão da ligação de lipossomas

biotinilados com 0,01% mol de lipídios PEGuiIados a microesferas cobertas de estreptavidina em vários níveis de pH.

FIG. 4 é um gráfico que ilustra a extensão da ligação de lipossomas biotiniladas, com 0,25% mois de lipídios PEGuiIados a microesferas cobertas de estreptavidina em vários níveis de pH.

FIG. 5 é um gráfico que ilustra a extensão da ligação de lipossomas biotiniladas, com 0,5% mois de lipídios PEGuiIados a microesferas cobertas de estreptavidina em vários níveis de pH.

FIG. 6 é um gráfico que ilustra a extensão da ligação de lipossomas biotiniladas com 0,75% mois de lipídios PEGuiIados a microesferas cobertas de estreptavidina em vários níveis de pH.

FIG. 7 é um gráfico que ilustra a extensão da ligação de lipossomas biotiniladas com 1,0% mois de lipídios PEGuiIados a microesferas cobertas de estreptavidina em vários níveis de pH.

FIG. 8 é um gráfico que ilustra a extensão da ligação de lipossomas

biotiniladas com 1,5% mois de lipídios PEGuiIados a microesferas cobertas de estreptavidina em vários níveis de pH.

FIG. 9 é uma ilustração esquemática mostrando que o domínio pHsintonizável formando lipídios que "escondem" ou "expõem" a superfície de segmentação de Iigantes conjugadas dependendo do pH do meio pode não ligar-se especificamente aos alvos quando o “comprimentos eficientes” dos lipídios ligados a PEG são mais longos do que o tamanho da segmentação de ligantes.

FIG. 10 é uma tabela mostrando o aumento fracional calculado na ligação de lipossomas biotiniladas entre pH 7,4 e pH 6,5 para as composições lipídicas variando de 0,1 a 1,5% mois do total de lipídios.

FIG. 11 é um termógrafo preparado de dados de calorimetria de varredura diferencial mostrando o efeito do pH na formação de domínio, devido à protonação dos lipídios DSPS.

FIG. 12 é um gráfico que mostra o percentual de retenção de calceína como uma função de pH por lipossomas compostos de DPPC equimolar e DSPS durante 5 dias.

Descrição Detalhada da Invenção

DEFINIÇÕES

A menos que especificamente indicado othewvise, todas as técnicas e conceitos utilizados scientinc aqui têm o mesmo significado que comumente entendida por aqueles normais de habilidade em a arte à qual pertence esta invenção. Para efeitos da presente invenção, a seguintes termos são dehned.

O termo "câncer", como utilizado neste documento refere-se a uma

doença de células inadequado proliferação e é mais evidente quando tumor tecido grosso compromete a função de órgãos vitais. Conceitos descrevendo tecido normal crescimento são aplicáveis a maligna tecidos, pois os tecidos normais e malignas podem compartilhar um crescimento semelhante características, tanto a nível da célula única, e ao nível do tecido.

O termo "Lipossomas aniônicos", como utilizado neste documento se destina a abarcar todos os Lipossomas conforme definido abaixo que é aniónica. O Lipossomas é determinado como sendo aniónicas quando presentes em pH fisiológico. Convém notar que a própria Lipossomas é a 30 entidade que está a ser determinada como aniónica. A carga e / ou estrutura de um Lipossomas da invenção presente no vivo em um ambiente não tem sido precisamente determinada. No entanto, de acordo com a invenção um aniónica Lipossomas da invenção será produzido utilizando, pelo menos, alguns lipídios que são aniónicas si. O Lipossomas não precisam de ser totalmente composta de aniónica lipídios, mas deve ser composta de um montante de suficiente 5 aniónica lipídico tal que, quando o Lipossomas é formado e colocado dentro de um ambiente in vivo em pH fisiológico da Lipossomas inicialmente tem uma carga negativa.

A "pH-sensíveis", como utilizado aqui lipídico remete para uma lipídicas cuja capacidade de mudança a carga líquida sobre a sua cabeça grupo 10 depende, pelo menos, em parte, o pH da ambiente circundante. "Biologicamente agentes", como utilizado neste documento refere-se a moléculas que afetam uma sistema biológico. Estes incluem moléculas, como proteínas, ácidos nucléicos,agentes terapêuticos, vitaminas e seus derivados, frações virais, lipopolysaccharides, bacteriana fracções, e hormonas. Outros 15 agentes de especial interesse são agentes quimioterápicos, que são utilizados no tratamento e gestão de pacientes com câncer. Essas moléculas são geralmente caracterizadas como antiproliferativas agentes, agentes citotóxicos e agentes imunossupressores e incluem moléculas como o Taxol, doxorrubicina, daunorrubicina, vinca-alcalóides, actinomicina, e etoposide.

"Efectiva montante", como utilizado neste documento refere-se a uma

quantidade necessária ou suficiente indesejáveis para inibir o crescimento celular, por exemplo, impedir o crescimento indesejável célula ou reduzir existentes crescimento celular, como o crescimento de células tumorais. Um efetivo montante pode variar dependendo de factores que se sabe que os 25 normais de habilidade na arte, que incluem a tipo de crescimento celular, o modo e esquema de administração, a dimensão do sujeito, a gravidade do crescimento celular. Uma das ordinárias habilidade na arte seria capaz de considerar tais fatores e fazer a determinação da quantidade efetiva. 15 "LiposOme", como utilizado neste documento refere-se a uma estrutura 30 fechada compreendendo um exterior lipídico bi-ou multi-layer membrana interna aquosa circundante um espaço. Em particular, os lipossomas do presente invenção forma vaso-como estruturas que invaginate seu conteúdo lipídico entre bilayers. Lipossomas pode ser utilizado para embalar qualquer agente biologicamente activas para entrega células.

As seguintes abreviaturas são utilizadas neste documento: PEG: polietileno glicol; MPEG: metoxi-polietileno glicol arquivado; Choi: colesterol; DTPA: diethylenetetramine pentaacetic ácido; DPPC: dipalmitoylphosphatidylcholine; DSPA: distearoylphosphatidic ácido e DSPS: distearoylphosphatidylserine.

Configurações desta invenção incluem lipossomas pH-sensíveis de um 10 determinado composição formando uma estrutura estável que pode desempenhar eficientemente biologicamente ativos agentes. Mais particularmente, a Lipossomas pode conter um ou mais biologicamente ativos agentes, que pode ser administrado em um mamífero hospedeiro para cumprir eficazmente o seu 30 conteúdo de uma célula alvo e alvo ou células tumorais. 15 Os lipossomas podem ser capazes de transportando biologicamente ativos agentes tal que os agentes são seqüestrados em um ambiente e pode ser seletivamente expostas noutro. Especificamente, a utilização de um pH-sintonizada domínio

• formando membrana permite sintonizável rígido · lipossomas que podem eficientemente "expor" o outro "ocultas" tumor

de segmentação por Iigantes após lipossomas extravasamento em tumores.

Um aspecto desta configuração é a utilização pH-sintonizada lipossomas como um mecanismo para expor de forma mais eficiente e seletiva a orientação para o Iigante células cancerosas compondo um tumor ou tumor 25 sólido. Como mostrado na FIG. 1, que é um início e vista lateral do pHsintonizável Iipossomal membranas contendo domínio de formação lipídios, a membrana lipídica-superfície parece homogênea (misto) no fisiológicas pH (à esquerda), quando repulsão eletrostática entre os titulável aniónica grupo cabeças de domínio de formação de lipídeos está dominando (cargas 30 negativas). Em pH ácido (por exemplo, tumor interstício 6.7) (à direita) protonação da carga negativa grupo cabeças permite o atraente Van der Waals forças entre os hidrocarbonetos caudas a dominar e lipídios separação e domínio formação de ocorrer. Em geral, em 'balsa' ou 'domínio' hipótese e, como mostrado na FIG. 1, o longa cadeias de hidrocarbonetos saturados fosfolípidos nas membranas fase separada (agregados em um ordenado fase 5 domínio) no plano da membrana que deverá conter também com lipídios hidrocarbonetos insaturados-correntes.

Lipossomas Composição

Uma configuração desta invenção é uma composição lipossomas pHsensíveis para segmentação por um agente biologicamente ativo para células tumorais, incluindo:

a) pelo menos dois domínios separados fase lipídica formada por

i) uma RHCT lipídico, com uma cabeça e um grupo hidrofóbico cauda que, quando protonados, é substancialmente miscível, onde o primeiro é um lipídio zwitterionic lipídico;

ii) uma segunda lipídico titulável cobrado cabeça com um grupo, e um

hydrophobic cauda que, quando protonados, é substancialmente imiscível com o primeiro lipídico;

b) um Iigante segmentação capazes de se ligar um antígeno ou um marcador e ligado à cabeça do grupo de um terceiro lipídico, com uma cauda

correspondência, pelo menos, uma parte do primeiro lipídica ou a segunda lipídico, onde os lipossomas composição é adaptada para lateralmente separadas, através de lípidos da separação de fases, quando a composição lipossomas está exposta a um determinado ambiente, em que a separação das fases dos lipídios expõe a segmentação ligando para o ambiente mais ácido.

Outra personificação da presente invenção é uma composição

lipossomas contendo um agente biologicamente ativos, incluindo:

a), pelo menos, dois domínios separados fase lipídica formada por

i) um primeiro grupo lipídico com uma cabeça e uma cauda hidrofóbica que, quando protonados, é substancialmente miscível, onde o primeiro é um lipídio zwitterionic lipídico; ii) uma segunda lipídico titulável cobrado cabeça com um grupo, e um hydrophobic cauda que, quando protonados, é substancialmente imiscível com o primeiro lipídico;

b) um terceiro lipídico terem uma cauda correspondência pelo menos uma porção da primeira lipídico ou o segundo lipídicas, onde é o terceiro

lipídico PEG-Iigados e

c) uma segmentação Iigante capazes de se ligar um antígeno ou um marcador e ligado ao grupo cabeça do quarto lipídico ter uma cauda congruência, pelo menos, uma parte do primeiro lipídico orthe segundo lipídico,

mas não correspondência entre o rabo do PEG-Iinked terceiro lipídico, em que os Iipossomas composição é adaptada para lateralmente separadas, através de lípidos da separação de fases, o PEG-Iinked terceiro lipídico da segmentação Iigand quarta-ligado quando a composição lipídica Iipossomas está exposta a um ambiente específico, em que a separação das fases dos 15 lipídios expõe a orientação ligando para o mais ácido ambiente. Em um exemplo, um dos lipídios primeiro é um zwitterionic lipídico com uma tipo de cauda e um do segundo lipídios titulável cabeça é um lipídio com um grupo diferente tipo de cauda. Entende-se que outros lipídios também pode ser incorporado no composição.

Em uma configuração, os Iipossomas podem conter uma segmentação

Iigante anexado ao a superfície do PEG-revestidos lipossomas. A segmentação pode anexar ao Iigante 30 lipossomas por ajuste direto à penhora lipossomas componentes lipídicos superfície ou através de um spacer braço curto ou corrente, dependendo da natureza do agrupamento. Uma variedade de 25 métodos estão disponíveis para unir moléculas, por exemplo, afinidade moléculas, para o superfície de vesículas lipídicas. Em um método, a segmentação Iigante é acoplado à lipídica por engate uma reação descrita abaixo, nos exemplos, para formar uma segmentação ligand-lipídico conjugada, que é conjugado adicionado a uma solução de lipídeos para a 30 formação dos lipossomas. Em outro método ilustrativo, formando uma vesícula-lipídico ativado para covalente penhora de uma segmentação Iigante é incorporado em lipossomas. Os formados lipossomas são expostas ao Iigante segmentação para atingir penhora ot a segmentação ligando para o ativado lipídios. Uma das ordinárias 5 habilidade na arte pode selecionar um método para atribuem um Iigante para a segmentação por lipossomas sem experimentação. Em outra configuração, a composição pode seletivamente expor a segmentação Iigante para células cancerosas (Fig. 2). Por exemplo, a segmentação é Iigante estericamente obstruídas pela vizinha PEG ligado lipídios no interior da composição em um 10 fisiológicos (neutro) pH para que a composição pode circular no sangue vapor 15 (FIG, 2, à esquerda). Como a composição lipossomas encontros proximal para o ambiente as células tumorais, que normalmente tem um pH inferior, a membrana lipídica lipossomas formas lipídico-domínios separados, o vizinho F1EG-Iinked lipídios preferencialmente partição em lipídico domínios que são 15 diferentes dos lípidos domínios em que o Iigante-Iigado lipídios preferencialmente partição, e ligando a segmentação é exposto ao tumor de células (Fig. 2, à direita). A segmentação expostas ligando então pode vincular as células tumorais e entregar o biologicamente ativos agente. Lipossomas adequados para utilização na composição incluir esses compostos 20 principalmente da vesícula formadoras de lipídios. Essa formação de uma vesícula lipídica que é um

(a) pode forma espontânea em bilayer vesículas na água, como exemplitied pela fosfolípides, ou

(b) é estável incorporada bilayers lipídico, com o seu hydrophobic agrupamento em contacto com o interior, hydrophobic região da membrana

bilayer, e sua cabeça agrupamento grupo voltadas para o exterior, polares superfície da membrana.

Muitos lipídios adequados à presente configuração são do tipo com duas hidrocarboneto Correntes, cadeias acil tipicamente, e uma cabeça grupo, polares ou cobrado. Há uma 30 variedade de lipídios sintéticos e naturais que fazem lipídeos, incluindo os fosfolípidos, tais como DPPC e DSPS (e DSPA), onde as duas cadeias de hidrocarbonetos são normalmente pelo menos 16 átomos de carbono de comprimento. O vesicle formadoras de lipídios deste tipo são preferencialmente aqueles com duas cadeias de hidrocarbonetos, normalmente acil correntes, e uma cabeça grupo, polares ou cobrado.

O pH-sensíveis Lipossomas pode ser selecionado para atingir um grau

de specitied fluidez ou rigidez, para controlar a estabilidade dos lipossomas em soro, para controlar o condições efetivas de inserção da segmentação conjugado, para controlar a taxa de Iigand exposição de caráter vinculativo, e para controlar a taxa de liberação da entrapped biologicamente ativos agente 10 no lipossomas. Lipossomas com uma mais rígida lipídico bilayer, ou um gel bilayer fase, são realizados mediante a incorporação de uma relativamente rígida lipídico, por exemplo, um lipídio com uma fase de transição relativamente alta temperatura, por exemplo, acima de aproximadamente 39 0C. Rígida, ou seja, saturados, lipídios contribuir para uma maior rigidez na membrana lipídica 15 bilayer. Outros componentes lipídicos, tais como o colesterol, também são conhecidos por contribuir para rigidez na membrana lipídica bilayer estruturas. Em contraste, lípide fluidez pode ser alcançado 15 mediante a incorporação de um fluido relativamente lipídico, normalmente com um uma fase lipídica com um relativamente baixo para gel líquido cristalina fase de transição 20 temperatura, por exemplo, a uma temperatura igual ou inferior temperatura de trabalho (por exemplo, temperatura corporal). Estes lipossomas podem conter titulável domínio que a fase de formação de lipídios separadas no plano da membrana como uma resposta a uma redução do pH 20, resultando em pHcontrolo | ed exposição dos Iigantes vinculativo para controlado segmentação. 25 Em uma configuração, os lipossomas são compostos por dois tipos de lipídios (ambos Tg> 37 0 C): um tipo é um zwitterionic rígida lipídico (por exemplo, dipalmitoil fosfatidil colina, DPPC, Tg = 41 °C), e o outro componente é um domínio titulável formadoras de rígida lipídico (por exemplo, distearoil fosfatidilserina, DSPS, T9 = 68 ° C), que é desencadeada a fase separada - no 30 plano da membrana como uma resposta a uma redução do pH. Em pH fisiológico (7,4) os lipídios-grupo cabeças do "domínio de formação de« rígida lipídico (DSPS) são cobrados, eletroestáticas repulsa deve prevalecer entre DSPS lipídios, e os membrana Iipossomal parece mais misturada e homogênea, resultando em estérico impedimento para a ligação do IiganteIigados lipídios pelo Ligado a PEG lipídeos, e, estável Retenção de encapsulado conteúdo.

A fase lipídica de separação pode ser sintonizada através da introdução de uma taxa sobre as titulável o grupo cabeças do domínio de formação de lipídeos, o grau de ionização sobre os grupo cabeças do domínio de formação de lipídios pode ser controlado usando o pH para ajustar 10 o equilíbrio entre a repulsão eletrostática entre os grupo cabeças e de van der Waals atração entre as cadeias de hidrocarbonetos. O longo da cadeia de hidrocarbonetos lipídios que poderia fase separada e forma-domínios podem ser selecionados para ter titulável ácidas moléculas na cabeça grupo (por exemplo, fosfatidil serina). Em pH neutro, o grupo cabeças destes lipídios são 15 carregada negativamente opostos aproximação estreita e formação de domínios. Como o pH é diminuído, gradual cabeça grupo protonação 10 minimiza a repulsão eletrostática e domínios lipídicos são formadas. Em uma configuração, um dos lipídeos da lipossomas divulgado aqui pode tem uma carga negativa cabeça grupo, e pode ter PEG-Iinked cadeias. O PEG 20 - ligadas cadeias pode ajudar a reduzir a exposição de segmentação Iigantes para outras células, quando em corrente sanguínea. Nesta configuração, os lipossomas incluem ionizáveis "dominio - que fazem (formação de microdomínios) rígida lipídeos que são acionados para formar domínios como uma resposta a o tumor intersticial pH ácido, Domínio formação (ou então 25 lateral lipídico de separação), a o tumor intersticial pH pode causar a segmentação Iigantes ser "expostos" devido a lateral segregação de PEGIinked lipídios em domínios lipídicos que Iigand-Iinked lípidos não preferencialmente partição. No pH fisiológico (durante a prática) são cobrados os lipídios, a membrana pode ser Lipossomas "misto" de modo a que a 30 segmentação Iigantes estão "escondidos". Em o tumor intersticial pH ácido (6,7-6,5), domínio de formação de lipídios se tornado cada vez mais protonadas (não-iônico) e lipídios domínios de cluster protonadas lipídeos podem formar resultando na exposição de segmentação ligantes. Em uma configuração, os lipídeos podem ter um pK valor entre cerca de 4 e cerca de 7.

Na outra configuração, um dos lipídios dos lipossomas divulgado aqui pode tem uma carga negativa cabeça grupo, e pode ter PEG-Iinked cadeias. O PEG - ligadas cadeias pode ajudar a reduzir a probabilidade da degola Lipossomas a outras células quando na corrente sanguínea. Nesta configuração, os lipossomas incluem ionizáveis "formação de domínios” (formação de microdomínios) rígida lipídeos que são acionados para formar domínios, tal como um resposta ao endosomal / Iisossomal pH ácido, Domínio formação (ou outra lateral lipídico de separação) com o endosomal / Iisossomal pH pode causar a encapsulado conteúdo a ser liberada provavelmente devido a imperfeições no 'lipídico embalagem "em torno do domínio 'aro'. No pH fisiológico (por exemplo, durante a circulação) o conteúdo não pode vazar, como os lipídeos são cobrados e os lipossomas membrana pode ser "misto", no ácidas 5 tarde endosomal / Iisossomal pH (4,5-4,0), domínio de formação de lipídios se tornado cada vez mais protonadas (não-iônico) e lipídios domínios de cluster protonadas lipídeos podem formar resultando na liberação de encapsulados conteúdo. Em uma configuração, os lipídeos podem pK ter um valor entre cerca de 3 e cerca de 5.

Na outra configuração, os lipossomas divulgadas neste documento podem incluir novas 10 estabilizador agentes ou ter uma fase aquosa com um pH elevado. Exemplos de estabilização agentes são uma solução tampão fosfato, um polímero insolúvel em metal vinculativas, resina esferas, 25 metal-binding moléculas, ou moléculas halogénea vinculativa incorporada no fase aquosa, para facilitar ainda mais a retenção de hidrofílicos modalidades terapêuticas. Além disso, lipossomas podem incluir moléculas para facilitar endocitose pela células-alvo.

Lipossomas pode ter uma mais rígida bilayer lipídico, que podem ser alcançados pela incorporação de uma relativamente rígida lipídico. Por exemplo, lipídios, com uma maior fase temperatura de transição tendem a ser mais rígidas. Outras saturados lipídios pode contribuir para uma maior rigidez na membrana lipídica bilayer. Outros componentes lipídicos, tais como colesterol, também são conhecidos por contribuir para a rigidez na membrana lipídica fluido bilayer estruturas.

Em outra configuração, os lipossomas podem incluir rígidas lipídios (por

exemplo, DPPC e DSPS), PEG-Iinked lipídios e de colesterol ou de colesterol / esterol derivado. Ln uma configuração, lipossomas foram desenvolvidos com biotina-relacionados com lipídios dipalmitoyl rabos e PEG-Iinked lipídios com distearcyl caudas que contenham as titulável DSPS domínio de formação de 10 lipídios que pode ser sintonizada a tornar-se activado no ligeiramente condições ácidas, que corresponde ao tumor intersticial pH. Domínio formação potencialmente pode ocorrer quando ambos os constituintes lipídicos (tanto a formação de cristais) têm uma longa hidrocarbonetos saturados rígidacorrentes, mas de comprimentos diferentes. Verificou-se que usando o pH15 sintonizada domínio de formação de membranas é um mecanismo para criar sintonizável rígida-lipossomas, que exponha de forma eficiente o othenivise "ocultas" tumor de segmentação Iigantes após lipossomas extravasamento em tumores.

Em outra configuração, a taxa de DPPC para DSPS pode variar entre 20 cerca de 4:1 para cerca de 1:2, o colesterol pode variar entre cerca de 0 a 5% mole, o DSPE - 5 PEG (2000 MW) pode ser igual ou inferior a cerca de 0.75- 1,00 mole% de lipídios totais e mais de 0,25% mol de lipídios totais, e as biotiniladas lipídicos pode ser igual ou inferior superior a 1-2% mol de lipídios totais. Em um exemplo, rígida lipossomas tendo DPPC (16:0), DSPS (18:0) e 25 5% molar colesterol e 0,1 - 1,5% mol PEG (200MW) foram incubadas em PBS a 37 ° C em diferentes valores de pH.

Segmentação do Ligante

Os lipossomas opcionalmente podem ser preparados para conter superfície grupos, tais como anticorpos ou anticorpos fragmentos, pequenas moléculas efetoras para interagir com células - superfície receptores, antígenos, bem como outros compostos, para a consecução de metas desejadas propriedades Iigantes para específica célula populações. Tais Iigantes podem ser incluídos no lipossomas pelo inclusive no Iipossomal lipídios um lipídio derivado com a segmentação molécula, ou um lipídio polar-cabeça com um grupo químico que pode ser derivado com a segmentação por molécula em pré-formado lipossomas.

Alternativamente, uma segmentação por agrupamento pode ser inserido no preformado lipossomas por incubando o preformado lipossomas com um 20 ligand-polymer · Iipid conjugado. Em uma configuração, a molécula pode ser uma afinidade completa anticorpos, em vez de um fragmento de anticorpo. Embora avanços na anticorpo engenharia podem ser empregadas para diminuir imunogênicos respostas pelo desenvolvimento de anticorpos fragmentos, tumor vinculativo mas, para captação e retenção pequenos fragmentos (Fab ', scFv) pode diminuir em comparação com o total anticorpos. Essas interações podem contribuir para a toxicidade in vivo. Estes lipossomas que são sintonizado para 'esconder' anticorpos durante a circulação e "expor" a segmentação Iigantes apenas na vizinhança imediata das células cancerosas (dentro do tumor ácidas-interstício) pode efectivamente abordar a questão da toxicidade, e podem reduzir a emissão de menor vinculativo avidez de anticorpos fragmentos. Utilizando o anticorpo completa, é possível melhorar a aderência entre as células tumorais e os lipossomas.

Lipids pode ser derivatized com a segmentação por Iigante covalentemente ligados a ligando para o grupo cabeça de um vesicle formadoras de lipídios ou a um curto molécula (spacer braço ou corrente), já anexado ao grupo cabeça de uma vesícula formadoras de lipídios. Há uma 25 ampla variedade de técnicas para anexando um Iigante selecionado para um selecionado lipídico grupo cabeça. Ver, por exemplo, Allen, TM, et al. Biochemicia et Biophysica Acta 1237:99-108 (1995); Zalipsky, S., Bioconjugate Chem., 4 (4) :296-299 (1993); Zalipsky, S., et al., FEBS Lett. 353:71-74 (1994); Zalipsky, S., et al. Bioconjugate Química, 705-708 (1995); Zalipsky, S., em 30 Lipossomas Stealth (D. Lasic e F. Martin, Eds.) Capítulo 9, CRC Press, Boca Raton, Flórida (1995), que são técnicas 10 incorporadas neste documento. Por exemplo, os lipossomas visando conter um ligante, que efetivamente pode vincular RR especificamente e com alta afinidade para um marcador ou alvo. Em um exemplo, a meta pode ser o receptor do fator de crescimento epitelial família (EGFR), o que é comum terapia-alvo para o câncer de tumores 5 sólidos. Além disso, a segmentação pode ser um ligante polipeptídicas polissacárido efectores ou molécula capaz de se ligar um marcador em sólidos células tumorais. Affinity moléculas, adequado com esta invenção, pode ser encontrado em correntes e futuro literatura.

Outros segmentação Iigantes são bem conhecidos os de habilidade na 10 arte, e em outras embodiments, o ligante é obrigatório que tenha uma afinidade para células epiteliais tumorais, e 20, que é, mais preferencialmente, internalizado pelas células. Tais Iigantes frequentemente ligam a um um domínio extracelular do receptor do fator de crescimento. Exemplar receptores (epítopos) sobre Cancer Cell superfícies incluem o receptor do fator de 15 crescimento epidérmico (EGFR), o folato receptor, o receptor transferrina (CD71), ErbB2, eo antígeno carclnoembryonic (CEA). Fransson, etal., Profiling de internalizantes tumor-associated antigens no peito 25 e células de câncer pancreático revertida genómica, Cancer Letters 208, 235-242 (2004).

Agentes Biologicamente Ativos Em uma configuração, o encapsulamento Iipossomal de um agente

biologicamente ativo aumenta a biodisponibilidade das modalidades em células cancerosas. Nesta configuração, o Lipossomas pode ser usado para encapsular um agente biologicamente activas (por exemplo, o cancro modalidades terapêuticas) e solte a modalidade terapêutica eficaz em células 25 cancerosas, permitindo, assim, a toxicidade para ocorrer nas células tumorais. Por exemplo, o uso de pH sensíveis Lipossomas permite mais completa liberação das modalidades terapêuticas mediante endocitose por células do cancro e para a tarde endosomal ou Iisossomal compartimento.

O Lipossomas pode ter um fosfolipídeo-membrana rigidez para melhorar o manutenção do agente no Lipossomas bioactivas durante a circulação sanguínea. A adição de PEG-Iinked lipídios também reduz Lipossomas apuramento, aumentando assim Lipossomas acumulação em tumores. Por exemplo, uma configuração inclui um pH-sensíveis 15 Lipossomas rígida com membranas que combinam longo circulação vezes, com a libertação de conteúdo na tarde endosome ou lysosome. Outros tipos de lipossomas pH5 sensíveis pode incluir cobrado titulável peptídeos na superfície que pode causar fase separação e domínio sobre a formação cobrado membranas.

Esta invenção ainda refere-se a um romance Lipossomas estrutura capaz de transportar bioactivas agentes. Por exemplo, esta invenção fornece uma melhoria Lipossomas formulação e um ácido nucleico, que podem 10 produzir altos níveis de expressão gênica proteína e produção. Além disso, orientada oi-partícula emissores mantenha como uma grande promessa agentes terapêuticos orientados para terapia, e pode ser entregue por lipossomas.

Outros agentes bioactivas adequado com esta invenção são óbvias para aqueles com ordinário habilidade na arte e pode ser pesquisada sem experimentação.

Outros agentes biologicamente ativos adequados com esses lipossomas incluem, mas são não se limitam aos recursos naturais e compostos sintéticos com as seguintes terapêutico atividades: o anti-artrítico, anti-arrítmicos, antibacteriana, anticolinérgicos, anticoagulante, antidiurético, antídoto, antiepiléptica, antifúngicos, anti-inflamatórias, antimetabolic, antimigraine, antineoplásicas, antiparasitários, antipirético, antiseizure, antissoros, antiespasmódico, analgésico, anestésico, beta-bloqueantes, resposta biológica modificando, regulam o metabolismo ósseo, cardiovascular, diurético, enzimáticos fertilidade reforço, promoção de crescimento, hemostático, hormonais, supressão hormonal, alívio hipercalcêmico, atenuação hipocalcêmicos, alívio hipercalcêmico , hiperglicêmicos aliviar, imunossupressivos, reforço imune, relaxante muscular, neurotransmissores, parasympathomimetic, sympathominetric plasma prorroga, expansão plasmática, psicotrópicas, trombolíticos, e vasodilatadora. Em um exemplo ilustrativo, o agente entrapped é uma droga citotóxica, isto é, um fármaco com um efeito deletério ou efeito tóxico sobre as células.

A administração de lipossomas Composição Lipossomas pode ser utilizada como droga para tratamento de portadores de entrega metastático câncer, e outros tipos de doenças inflamatórias, e também como veículos para a entrega vacinas, terapia gênica, etc. A presente invenção prevê ainda um eficaz veículo capaz de vacina eficaz, o reforço da resposta imune antígeno-e diminuição da resposta imune indesejada estranhos, atualmente vivida com adjuvantes. Os lipossomas de acordo com a invenção podem ser formulados para administração, em qualquer forma cômoda. A invenção inclui, portanto, dentro da sua âmbito farmacêutico composições compreendendo pelo menos um composto Iipossomal formulados para uso em medicina humana ou veterinária. Outras vias de administração será conhecido dos normais de habilidade na arte e pode ser facilmente utilizado para administrar os lipossomas do presente invenção.

Outra personificação da presente invenção inclui um método que inclui pré-injeção do indivíduo com lipossomas vazios e saturação do reticuloendotelial órgãos para reduzir a não-tumorais específicas baço e fígado captação dos lipossomas -encapsulada therapeutics mediante administração.

Na utilização e aplicação, os lipossomas podem ser usadas

preferencialmente para entregar um biologicamente ativos agente alvo de uma célula ou células de câncer vascularizado (sólido) tumores. Por exemplo, na entrega à droga desenvolveram tumores metastáticos com vasculatura, o 30 preferencial tumor acumulação e retenção dos lipossomas é essencialmente 25 dependente sobre o seu tamanho (efeito EPR), e pode resultar em doses adequadas tumor adsorvidos que pode ser reforçada por "ligar" a segmentação específica de células cancerosas após lipossomas extravasamento para o interstício tumor.

O Lipossomas da invenção podem ser formulados para administração parenteral por injeção em bolus ou infusão contínua. Formulação injetável pode ser apresentado na unidade dosagem forma em ampolas, multi-dose ou em recipientes com um acrescentado conservante. As composições podem assumir formas tais como suspensões, soluções ou Emulsões aquosas em oleoso ou veículos, e pode conter formulatory agentes, como suspende, estabilizando, e / ou agentes dispersantes, alternativamente, o ingrediente 5 activo pode ser em forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, estéril pirógeno -água livre, antes da utilização.

Uma configuração da invenção inclui um método para administrar uma biologicamente ativos agente compreendendo uma selecção lipossomas compreendendo pelo menos um primeiro lipídico rígida e um segundo rígidas lipídico tendo cada grupo uma cabeça e uma cauda hidrofóbica, onde os lipídios protonadas quando ambos não são particularmente miscível, e um polyethylenegIycol-Iinked lipídico, com uma cadeia lateral correspondência, pelo menos, uma porção do primeira ou a segunda lipídico, em que o primeiro é um lipídio zwitterionic lipídico ea segunda lipídico tem uma cabeça titulável grupo, ea composição é adaptada para "expor" segmentação Iigantes em uma determinada pKa, e para liberar um agente entrapped biologicamente ativo em um 20 certas pKa de menor valor; Lipossomas preparar uma composição com a pelo menos o primeiro rígida lipídico e no segundo rígidas lipídico e do polietilenoglicol-ligado lipídico; preparação uma terapêutica lipossomas, combinando a composição com o biologicamente ativos agente de modo a que o agente é biologicamente ativa dentro da composição que lipossomas a terapêutica Lipossomas é adaptado para liberar o agente entrapped biologicamente ativos em um certo pKa de menor valor; e administrar a terapêutica para uma Lipossomas assunto.

Os lipossomas de acordo com a invenção pode ser formulada para a administração de qualquer forma cômoda. A invenção, portanto, inclui no seu âmbito composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um composto Iipossomal formulados para uso em medicina humana ou veterinária. Essas 30 composições podem ser apresentaram fisiologicamente aceitável para uso com outras companhias aéreas ou excipientes, opcionalmente complementar com medicamentos agentes. Convencionais transportadores também pode ser utilizado com a presente invenção.

Superação da Resposta Imune

Para superar imunogenicidade, em uma configuração da invenção do 5 lipossomas são modificados com PEG-Iigados lipídios para uso específico com o organismo, em outra configuração, um método ainda inclui revestimento da membrana externa superfícies dos lipossomas com moléculas que preferencialmente associado com um determinado célula alvo. Estas moléculas ou segmentação agentes podem ser anticorpos, peptídeos, engenharia de 10 moléculas, ou fragmentos desse fato.

Por exemplo, para alcançar o tumor segmentação de células do ovário e câncer de mama e internalização, lipossomas pode ser revestido (immunolabeled) com Herceptin, uma comercialmente disponíveis anticorpos metas que antígenos que estão sobre-expressos na superfície dessas células 15 cancerosas. Herceptin é escolhido para demonstrar a prova de princípio com a expectativa de que outros anticorpos, segmentação do ovário, mama, fígado, cólon, células de carcinoma da próstata e outros também poderiam ser utilizados. As células alvo pode ser células cancerosas indesejável ou qualquer outra célula. Exemplos de tais células cancerosas são aquelas 20 encontrado no cancro do ovário, câncer de mama metastático ou células mesma. Os ativos 20 segmentação dos lipossomas para determinados órgãos ou tecidos pode ser conseguida por incorporação de lipídeos com fragmentos de anticorpos monoclonais ou anticorpos que são específicos para tumor antígenos associados, lectins, peptídeos ou a elas associadas.

Porque o biologicamente ativo agente é seqüestrado em lipossomas,

segmentada entrega é realizado através da adição de peptídeos Iigantes e outros sem comprometer a capacidade de estes lipossomas para vincular e entregar grandes quantidades do agente, os Iigantes são adicionados à lipossomas em um método simples e inovador. Primeiro, os lipídeos são misturados com o agente biologicamente ativos de interesse. Então quer Iigantes quimicamente tornou conjugados na cabeça de alguns dos grupos lipídios ou ligando -ligada lipídeos são adicionados diretamente ao lipossomas.

Para outros agentes biologicamente ativos que precisam ser carregados activamente em preformado lipossomas, a decoração dos lipossomas com 5 Iigantes segmentação pode ocorrer tanto antes do carregamento do preformado lipossomas com o biologicamente ativos agentes ou depois. 5 Preparar Lipossomas Os lipossomas podem ser preparados por uma variedade de técnicas, tais como as detalhadas no Lasic, DD1 Lipossomas de Física para Applications, Elsevier, Amesterdão (1993), técnicas que são 10 incorporadas neste documento. Exemplos específicos de lipossomas preparados em apoio do presente invenção será descrito a seguir.

Normalmente, os lipossomas podem ser formadas por simples filme lipídico-hidratação técnicas. Em este processo, uma mistura de lipossomas formadoras de lipídios do tipo detalhados acima Dissolvido em um solvente 15 orgânico adequado é evaporado em um navio que se forma um filme fino, que é, então, cobertos por um meio aquoso. O filme lipídico hidratos têm tamanhos entre cerca de 0,1 a 10 microns.

Após formação, os lipossomas são dimensionados. Um método mais eficaz para a calibragem lipossomas extrusão envolve uma suspensão aquosa através de um dos lipossomas série de membranas de policarbonato com um uniforme selecionados poros na gama de 0,03 a 0,2 mícron, tipicamente cerca de 0,05, 0,08, 0,1, ou 0,2 microns. O tamanho dos poros da membrana corresponde aproximadamente ao maior tamanho dos lipossomas produzidos por extrusão através dessa membrana, especialmente quando a preparação é extrudida dois ou mais vezes, através da mesma membrana. Homogeneização métodos também são útil para baixo calibre lipossomas para dimensões de 100 nm ou menos. Em uma configuração de a presente invenção, os lipossomas são extrudados através de filtros com policarbonato poros de 0,1 horas, resultando em lipossomas com diâmetros no intervalo aproximado de cerca de 120 nm, incorporando biologicamente ativas Agente em Lipossomas A escolha do agente biologicamente ativo pode ser incorporado em lipossomas por métodos normalizados, incluindo passiva encarceramento de um composto solúvel em água por hidratante um filme lipídico com uma solução aquosa do agente, passiva encarceramento de um lipofílicos hidratantes compostos por um filme lipídico contendo o agente, e uma carga ionizáveis droga contra um 5 dentro/fora Lipossomas pH gradiente. Outros métodos, tais como inverter evaporação Lipossomas fase preparação, também são adequadas.

Uma outra configuração inclui um método de formulação de uma terapêutica lipossomas composição ter sensibilidade para uma célula-alvo. O método inclui uma seleção Lipossomas formulação composta de pré-formados lipossomas compreendendo pelo menos um tirst lipídios e um segundo lipídico tendo cada uma cabeça e um grupo hidrofóbico cauda, onde o lipídios, quando ambos protonadas não são particularmente miscível, e contendo PEG-Iigados lipídeos de um tipo de cauda, e com uma entrapped biologicamente ativos agente; selecionando a partir de uma pluralidade de segmentação conjuga uma segmentação conjugado composto de uma lipídico ou V, com uma cabeça polar e um grupo hidrofóbico cauda do outro tipo que não o da PEG-Iinked lipid's, e um ligante segmentação anexa à grupo cabeça dos lipídios e combinando os lipossomas formulação ea segmentação conjugate selecionados para formar um terapêuticos, alvo de células sensíveis Lipossomas pH composição.

Kits

A presente invenção inclui kits contendo a actual estrutura Lipossomas capazes de transportar um reagente dentro dela. Um desses kit pode incluir o Lipossomas estruturas prontas para o usuário adicionar o reagente biológico de 25 interesse Um kit maio Lipossomas ainda incluir uma preparação e um ou mais específicas, biologicamente ativas reagentes para além de o Lipossomas estrutura. Outro kit da presente invenção compreende um conjunto de estruturas Lipossomas, cada uma contendo um específico, biologicamente ativos reagente, que quando administrado em conjunto ou em seqüência, são 30 particularmente adequados para o tratamento de uma determinada doença ou condição. EXEMPLOS

Exemplo 1

Biotiniladas lipossomas (1% mol DPPE-biotina) foram desenvolvidos com 5 PEGyIated lipídios que contêm domínio de formação de lipídeos, as 5 quais foram afinados para se tornarem ativado em condições semelhantes às do tumor intersticial pH. Rígidas lipossomas consistindo de DPPC (16:0), DSPS (18:0) (a 1:1 taxa molar), e 5% de colesterol e 0,1 a 1,5% mol-DSPE PEG (2000MW) foram incubadas no PSB, a 37 0C em diferentes valores de pH.

Exemplo 2

Vinculativas de rígida biotiniladas lipossomas (Figs. 3, 4, 5, 6, 7, 8, cheia

símbolos) a streptavidina-coberto - Microesferas magnética foi avaliada em diferentes valores de pH variando de pH 7,4, aproximando o pH do sangue durante a circulação de lipossomas para pH 6,5, que corresponde ao pH do tumor após o interstício extravasamento dos lipossomas para o tumor. A 15 extensão dos lipossomas foi vinculada avaliados para diferentes quantidades de PEG-Iinked lipídios na composição lipossomas variando de 0,1 a 1,5% molar (do total de lípidos) e foi também comparado com idêntico lipossomas sem biotina (plain lipossomas) indicado pelo abertas em símbolos Figs 3,

4, 5, 6, 7 e 8. Em biotinilated lipossomas a quantidade de biotina-ligados lipídios foi retidos constante em 1% mol de lipídios totais (FIG. 3 mostra lipossomas contendo 0,1% molar PEG ligada lipídico, FIG. 4 0,25% mol, FIG. 5 0,5% mol, FIG. 6 0,75% mole, FIG. 7 1,0% mol, e FIG. 8 1.5% mol). A membrana foi Iipossomal marcados com rodamina, lipossomas e foram autorizados a ligar-se aos esferas magnéticas e depois de dez sucessivas separações magnética e lavagem com PBS, a esferas magnéticas foram incubadas em fresco PBS (pH = 7,4) com Triton X-100 para liberar os lipídeos que foram, então, vinculada quantitated medindo sua fluorescência intensidade. Um aumento na intensidade de fluorescência (cps), com uma diminuição do pH do ambiente durante a incubação vinculativo, revelou que o afhnity marcador ou alvo ligante foi exposto no baixo pH ambiente. Para fracções de PEG-Iinked lipídeos variando entre 0,25 e 0,75 mol%, a eficácia vinculativa específica mostra uma nítida transição dentro dos estreitos valores de pH do 7,4 e pH fisiológico o tumor intersticial pH = 6,7 (Figura 4, 5, 6). Tabela 1 ou FIG. 10 mostra o aumento calculado fraccionada em 5 biotiniladas-Lipossomas obrigatório entre pH 7,4 e pH 6,5 para todos os PEGIinked lipídico composições utilizando a seguinte fórmula: (I6_5-I7A) / Iu x100. O aumento máximo no vinculativo entre pH 7,4 e pH 6,5 por lipossomas contendo biotina-linked lipídios como o alvo Iigantes é observado para 0,5% molar Ligado a PEG lipídeos que foi medida a ser 49% (Tabela 1 ou FIG. 10 10).

Dependendo do tamanho molecular (tamanho) da segmentação ligante (definido como 10, a distância que a ligação agrupamento estende-se desde a superfície física do Lipossomas, utilizando o ensaio e erro, a fração de lipídeos PEG-relacionados que têm de ser incluídos na composição lipídica para 15 maximizar o aumento da specitic obrigatório entre pH 7.4 e 6.5. Para otimizar as condições de máxima vinculativo entre diferentes valores de pH, o pKa do ionizado titulável lipídico foi ajustado.

Em especial, a baixa mole frações de lipídios PEGyIated (de 0,25% para 0,75% toupeira especial para o exemplo acima), o PEG-correntes são mais provavelmente no "cogumelo" regime e sua "eficácia" tamanho é comparável ao tamanho da biotina, assim domínio sobre a formação cluster biotina moléculas estão disponíveis para vincular. Em altas toupeira PEGuiIado frações de lipídios (1% e 1,5 mol%, como mostra o referido Exemplo 20), o PEG-correntes tornaram progressivamente alargado com «eficazes comprimentos" que deve ser 'ta er "do que as enxertadas biotina (tal como sugerido na fig. 9), assim mesmo após domínios forma (relativamente pequeno de domínio tamanhos) biotins ainda estão 'dificultado "pela PEG-prorrogado cadeias de vincular ao alvo (FIG. 9) de Gennes, PG conformações de polímeros anexado a uma interface, Macromolecules 13, 1069-1075 (1980). Estes resultados demonstram que em baixas densidades PEG enxerto (0,25,

0,5 e 0,75% mol) Lipossomas vinculativo é pH dependente e que aumenta com a diminuição do pH. O pH determina a separação lateral fase lipídica e formação no domínio Lipossomas membranas (devido a protonação seletiva de aniónica lipídios). Lipid domínios, após a formação, puxe o Ligado a PEG lipídios afastado do Iigand-Iinked lipídios e permitem ligante específico visando 5 se o comprimento eficaz de PEG cadeias acima da física superfície de lipossomas não é significativamente maior que o comprimento de segmentação ligantes. Para nomeadamente a composição lipídica (DPPC equimolar DSPS e lipídios), o mais sensível pH dependentes exibiram comportamento é obrigatório pelos 0,5% mol PEGyIated lipossomas mostra que 49% de aumento 10 na vinculativo entre pH 7,4 e pH 6,5. Por muito baixo PEG enxertia densidades (0,1% mol) lipossomas vincular extensivamente em eveiy pH uma vez que não impedimento estérico adequado é fornecido pela cadeias poliméricas que dificilmente cobrem o lipossomas superfície (FIG. 9), A enxertia PEG densidades mais elevadas (1,0% e 1,5% mol, FIG, 7 e FIG. 8, 15 respectivamente), o pH-dependente vinculativo resposta é perdida devido à prorrogado o comprimento efetivo do PEG cadeias que é solitário do que o tamanho da segmentação ligante utilizado neste exemplo.

Exemplo 3

Differential scanning calorimetry (DSC) foi usado, porque pode fornecer provas diretas da fase de separação lipídico membranas. FIG. 11 mostra a térmica scans da mesma composição Lipossomas (DPPC equimolar e DSPS com 5% Colesterol e 2% mol mol-DSPE PEG), realizado a uma taxa de 60 ° C / h. Como o pH diminuiu de 7,4 para 4,0, foi observada uma melhoria na contribuições de transições térmica em altas temperaturas. Superior térmica transições em menores valores de pH sugerem aumento da formação de lipídios fases que são rico em cluster (protonados) DSPS lipídios (que tem maior Tg) e pobres em fases DSPS lipídios (DPPC ou mais rico em lipídios, figura 11). Estes resultados demonstram que em membranas contendo lipídeos com diferentes comprimentos da cadeia de hidrocarbonetos (com um lipídio Tipo de rolamento grupo cabeças carregada), ou o domínio lipídico mistura é controlada pela formação o pH que afeta o grau de repulsão eletrostática entre os titulável lipídios.

Exemplo 4

A libertação de encapsulados fluorescentes conteúdo, especificamente 5 neste exemplo calceína, de PEGyIated lipossomas, composto equimolar dos rácios de DPPC e DSPS foi investigada por calceína quenching eficiência medições, o filme lipídico foi hidratada em 1 ml de tampão fosfato contendo 55mm calceína (pH 7,4, isosmolarto PBS), O unentrapped calceína foi removido em temperatura ambiente por tamanho exclusão cromatografia 10 (SEC), utilizando uma coluna Sephadex G-50 (de 11 cm de comprimento) e foi eluída com tampão fosfato (EDTA 1mM, pH = 7,4). Para avaliar a liberação de calceína dos lipossomas, a auto-extinção lipossomas contendo concentrações de calceína (55mm) foram incubadas em tampão fosfato em diferentes valores de pH a 37 0C ao longo do tempo. A concentração de lipídeos para incubação 15 foi de 0,20 p moles ml, A libertação de calceína dos lipossomas e sua diluição no entorno solução resultou em um aumento da fluorescência devido ao relevo da auto-extinção calceína libertação foi medido em diferentes momentos, acrescentando quantidades fixas de Lipossomas suspensões em cuvetes (1 cm de trajecto óptico) com tampão fosfato (1mM EDTA, pH 7,4). Calceína 20 fluorescência (ex: 495 nm, in: 515 nm), antes e após a adição de Triton X-100, foi medido utilizando uma Fluoromax -2 spectrofluorometer (Horiba JOBIN Yvon, NJ), e foi utilizado para calcular o quenching eficiência definido como a relação de intensidades de fluorescência após e antes de adição de Triton X100. A percentagem de conteúdo com o tempo foi mantida calculada do 25 seguinte modo: (% Calceína retenção élxlw QM onde, Qt é calceína quenching eficiência no ponto correspondente tempo t, QNX é 20, a máxima eficiência calceína quenching em tampão fosfato (pH 7,4) no quarto temperatura imediatamente após a separação dos lipossomas pela SEC, e Q é o mínimo quenching eficiência igual à unidade.

FIG. 12 mostra o percentual de calceína retenção em função do pH (pH

7,4 (·), pH 5,5 (0), pH 5,0 (V), pH 4,0 (7)) por lipossomas composto por equimolar DPPC e DSPS (com 5% molar colesterol e 2% mol PEGyIated lipídios), incubadas em PBS a 37 ° C. FIG. 5 mostra o conteúdo libertação durante 5 dias. As barras de erro correspondem aos desvios-padrão das medições repetidas de dois Lipossomas preparações, duas amostras por hora 5 preparação por ponto. A queda inicial conteúdo manutenção durante os primeiros 10 minutos de incubação é, provavelmente devido à osmótica e diferenças entre a temperatura e encapsulado em torno de soluções. Depois os primeiros 10 minutos, encapsulados conteúdo estável são retidos por lipossomas, e efetivamente liberado até o pH ácido = 4 que corresponde à 10 tarde endosomal Iisossomal valores, indicando que estes lipossomas podem efetivamente sua libertação terapêuticas específicas carga após vinculativo e endosomal intemalization por células-alvo.

A descrição detalhada do exposto preferido configurações e os anexados dados foram apresentados apenas para fins descritivos e ilustrativos. 15 Eles não têm a intenção de ser exaustiva e não se destinam a limitar o âmbito de aplicação e espírito da invenção. As configurações foram selecionados e descritos para explicar melhor. Os princípios da invenção e suas aplicações práticas. Um perito na matéria será reconhecer que muitas variações podem ser feitas à invenção divulgada nesta especificação sem se afastar do âmbito e 20 do espírito da invenção.

Claims

Composição de Lipossomas Sensíveis ao pH

1. Composição de lipossomas contendo um agente biologicamente ativo, caracterizada por compreender: a) pelo menos, dois domínios separados de fase lipídica formados por i) um primeiro lipídio com uma cabeça e uma cauda hidrofóbica que, quando protonado, é substancialmente miscível, onde o primeiro lipídio é um lipídio zwitteriônico; ii) um segundo lipídio tendo uma cabeça carregada titulável, e uma cauda hidrofóbica que, quando protonado, é substancialmente imiscível com o primeiro lipídio; b) um terceiro lipídio com uma cauda correspondente a pelo menos uma porção do primeiro lipídio ou do segundo lipídio, onde o terceiro lipídio é ligado por PEG e c) um ligante direcionador capaz de se ligar a um antígeno ou um marcador e ligado ao grupo cabeça do quarto lipídio, com uma cauda correspondendo a pelo menos uma porção do primeiro lipídio ou do segundo lipídio, mas não correspondente à cauda do terceiro lipídio ligado a PEG, onde a composição de lipossomas é adaptada para separar lateralmente, através da separação de fase lipídica, o terceiro lipídio ligado a PEG do ligante direcionador ligado ao quarto lipídio quando a composição de lipossomas é exposta a um ambiente específico, onde a separação de fase lipídica expõe o ligante direcionador a um ambiente mais ácido.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo meio específico ser um meio ácido.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela composição de lipossomas ter uma temperatura de transição de fase superior a 37 ° C.

4.Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo agente biologicamente ativo ser selecionado do grupo constituído de quimioterápicos, radionuclídeos, fragmentos de nucleotídeos, e fragmentos de peptídeo.

5.Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo ligante direcionador ser exposto quando a composição estiver em um meio com um pH entre cerca de 6,3 e cerca de 6,7.

6.Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo antígeno ou receptor ser expresso em maior concentração em células cancerígenas do que nas células não cancerígenas.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ligante direcionador ser um anticorpo ou fragmento do mesmo.

8.Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ligante direcionador ser um fragmento de anticorpo em que a separação de fase lipídica remova fisicamente o lipídio ligado a PEG para fora dos lipídios Iigantes ligados na superfície física da membrana lipossômica.

9.Método para o tratamento de um tumor maligno em um mamífero caracterizado por compreender a administração a um mamífero uma quantidade farmaceuticamente eficiente da composição de lipossomas da reivindicação 1.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo mamífero ser humano.

11.Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos lipossomas carregarem uma carga negativa em um pH neutro.

12.Método para aumentar a acumulação de um agente biologicamente ativo proximal em uma célula com um meio ácido, caracterizado por compreender a administração da composição da reivindicação 1, em que a separação de fase lipídica expõe o ligante direcionador para o meio mais ácido, os lipossomas deslocam-se para o meio ácido, expondo o ligante direcionador no meio ácido, especificamente ligando-se a células-alvo, tornando-se endocitada pelas células-alvo, e liberando o agente biologicamente ativo englobado no meio ácido do compartimento endossomal ou Iisossomal desta última.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo primeiro lipídio ser DPPC e o segundo lipídio ser DSPS.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo primeiro lipídio ser DPPC o segundo lipídio ser DSPS, e onde 0 a 5% de colesterol ser incluído na composição.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelos lipossomas serem administrados por via injetável.

16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelos lipossomas serem preparados preferencialmente para se ligar a células tumorais, em um pH de cerca de 6,7 para cerca de 6,5.

17. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelos lipossomas serem preparados para liberar o agente biologicamente ativo em um ambiente com um pH de menos do que cerca de 6.

18. Composição contendo um agente biologicamente ativo, caracterizada por compreender: a) lipossomas aniônicos com domínios de separação de fase líquida em que a separação de fase tem um determinado pH; b) um ligante direcionador capaz de se ligar a um antígeno ou um marcador em uma célula tumoral e ligado ao grupo cabeça de um lipídio, em que a separação de fase do lipídio expõe o ligante direcionador para o meio.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo Iipossoma ter pelo menos um primeiro lipídio e um segundo lipídio, cada um com um grupo cabeça e uma cauda hidrofóbica; pelo menos dois tipos de caudas de lipídios, que, quando ambos protonados, não são substancialmente miscíveis e formam mais de um domínio de separação de fase lipídico;

20. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo Iipossoma ter pelo menos um lipídio ligado ao polietilenoglicol com uma cauda correspondente pelo menos uma porção do primeiro ou segundo lipídio.

21. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela composição ser adaptada para separar lateralmente os lipídios PEG-Iigados do ligante direcionador ligado a lipídeos sobre o plano da membrana após lipossomas serem expostos a um meio com uma diminuição do pH.

22. Composição de lipossomas contendo um agente biologicamente ativo, compreendendo: a) pelo menos dois domínios separados de fase lipídica formada por i) um primeiro grupo lipídio com um grupo cabeça e uma cauda hidrofóbica que, quando protonado, é substancialmente miscível, onde o primeiro lipídio é um lipídio zwitteriônico; ii) um segundo lipídio com um grupo cabeça carregado titulável e uma cauda hidrofóbica que, quando protonado, é substancialmente imiscível com o primeiro lipídio; b) um ligante direcionador capaz de se ligar a um antígeno ou um marcador e ligado ao grupo cabeça de um terceiro lipídio com uma cauda correspondente pelo menos uma porção do primeiro lipídio ou do segundo lipídio, em que a composição de lipossomas é adaptada para separar lateralmente através de separação de fase lipídica, quando a composição de lipossomas é exposta a um meio específico, em que a separação de fases dos lipídios expõe o ligante direcionador a um meio mais ácido.

23. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro lipídio e o segundo lipídio, quando o segundo lipídio está eletrostaticamente carregado, serem menos imiscíveis entre si e formarem menos domínios de separação de fase lipídica.