ES2286857T3 - Complejo de plasmido condensado-liposoma para transfeccion. - Google Patents
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Abstract
Composición de complejos de plásmido-liposoma para su utilización en la transfección de una célula huésped con un gen contenido en un plásmido que comprende moléculas de plásmido condensadas, estando dichas moléculas condensadas con un agente de condensación policatiónico y suspendidas en un medio acuoso que contiene un soluto no electrolítico, presentando dicho medio una fuerza iónica inferior a la fuerza iónica de una solución de 10 mM de una sal ionizable monovalente, y liposomas catiónicos que comprenden un lípido formador de vesícula catiónica de cadena de diacilo, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de N-[1-(2, 3-ditetradeciloxi)propil]-N, N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE), bromuro de N-[1-(2, 3-dioleiloxi)propil-N, N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE), o cloruro de N-[1-(2, 3-dioleiloxi)propil]-N, N, N-trimetilamonio (DOTMA), en la que dichos complejos presentan una proporción de lípido de liposoma a plásmido superior a 5 nmoles de lípido de liposoma/µg de plásmido e inferior a 25 nmoles de lípido de liposoma/µg de plásmido y presentan un tamaño homogéneo inferior a 200 nm.
Description
Complejo de plásmido
condensado-liposoma para transfección.
La presente invención se refiere a una mejora en
un procedimiento para la preparación de complejos de
plásmido-liposoma para la transfección in
vivo de un gen y a las composiciones preparadas por el
procedimiento.
Felgner, J., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:7413-7417 (1987).
Felgner, J., et al., J Tiss. Cult.
Meth. 15:63-68 (1993).
Gao, X., and Huang, L.,
Biochemistry 35:1027-1036 (1996).
Guo, L., et al., Journal of Liposome
Research 3(1):51-70 (1993).
Li, S., and Huang, L., Journal
of Liposome Research, 6(3):589-608
(1996).
Mulligan, R.S., Science
260:926-932 (1993).
Morishita, R. , et al., J Clin.
Invest. 91:2580-2585 (1993).
Rose, J.K., patente US nº 5.279.833
(1994).
Trubetskoy, V.S ., et al., Biochimica
et Biophysica Acta 1131:311-313
(1992).
Wagner, E., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88:4255-4259 (1991).
Se ha desarrollado una variedad de
procedimientos para facilitar la transferencia de material genético
a células específicas, por ejemplo, la terapia génica. Estos
procedimientos son útiles para tanto la transferencia de gen in
vivo como ex vivo. En el primero, se introduce
directamente un gen (intravenosamente, intraperitonealmente,
aerosol, etc.) en un sujeto. En la transferencia de gen ex
vivo (o in vitro), el gen se introduce en las células
después de eliminar las células del tejido específico de un
individuo. A continuación las células transfectadas se vuelven a
introducir en el sujeto.
Los sistemas de administración para conseguir la
terapia génica in vivo y ex vivo incluyen vectores
virales, tales como un vector retroviral o vectores adenovirales,
microinyección, electroporación, fusión de protoplasto, fosfato de
calcio y liposomas (Felgner, et al., 1987; Mulligan, 1993;
Morishita, et al., 1993).
La terapia génica mediada por liposomas ha
implicado, por ejemplo, la utilización de liposomas catiónicos
formados a partir de LIPOFECTINA, un reactivo constituido por un
lípido catiónico y un lípido neutro (Felgner et al.,
1989,1993). Se han descrito otros procedimientos de terapia génica
mediados por liposomas (Trubetskoy, et al., 1992; Morishita,
et al., 1993; Rose, 1994), en los que se forman complejos
electrostáticos de liposomas catiónicos y de ADN. Los
planteamientos más recientes para las composiciones de transfección
basadas en liposomas han incluido un policatión tal como la
protamina o la polilisina, para unir el ADN a las partículas de
lípido (Wagner et al., 1991) o para condensar el ADN (Gao y
Huang, 1996; Li y Huang, 1996).
Sin embargo, los procedimientos de terapia
génica mediada por liposomas y las composiciones descritas hasta la
fecha han reconocido limitaciones, incluyendo, por ejemplo, la
toxicidad de la LIPOFECTINA, el gran tamaño de los complejos de
ADN-liposoma, y eficacias de transfección in
vivo bastante pobres.
Sería deseable, por lo tanto, producir un
complejo de plásmido-liposoma de ADN que sea
relativamente no tóxico, esté clasificado por su tamaño para la
administración intravenosa y posea una eficacia de transfección
elevada.
Según la presente invención se proporciona una
composición de complejos de plásmido-liposoma para
su utilización en la transfección de una célula huésped con un gen
contenido en un plásmido, que comprende
moléculas de plásmido condensadas, estando
dichas moléculas condensadas con un agente de condensación
policatiónico y suspendidas en un medio acuoso que contiene un
soluto no electrolítico, poseyendo dicho medio un fuerza iónica
inferior a la fuerza iónica de una solución 10 mM que contiene una
sal ionizable monovalente, y
liposomas catiónicos que comprenden un lípido
formador de una vesícula catiónica de cadena de diacilo, bromuro de
dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de
N-[1-(2,3-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DMRIE), bromuro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DORIE), o cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA), en la que dichos complejos poseen una proporción de lípido
de liposoma a plásmido superior a 5 nmol de lípido de
liposoma/\mug de plásmido e inferior a 25 nmol de lípido de
liposoma/\mug de plásmido y poseen un tamaño homogéneo inferior a
200 nm.
En una forma de realización, las moléculas de
plásmido condensadas son moléculas de plásmido de ADN que contienen
un gen seleccionado de entre el grupo constituido por genes que
codifican el regulador de la conductancia de transmembrana de la
fibrosis quística, el Factor VIII, la interleucina-2
o el p53.
En una forma de realización, el agente de
condensación es un policatión seleccionado de entre histonas,
poli-l-glutamina, protamina,
melitina y polimixina B. En una forma de realización preferida, el
agente de condensación es una histona seleccionada de entre la
histona total, la histona 1 y la histona 4.
En otra forma de realización, la proporción de
lípido de liposoma a plásmido está comprendido entre 8 y 18 nmol de
lípido liposoma/\mug de plásmido.
Preferentemente, el soluto osmótico no
electrolítico es glucosa, sacarosa o dextrán.
Los liposomas catiónicos pueden comprender un
lípido formador de vesícula catiónica seleccionado de entre bromuro
de dimetildioctadecilamonio (DDAB),
1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamino)propano
(DOTAP), bromuro de
N-[1-(2,3-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DMRIE), bromuro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DORIE), cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA).
En otra forma de realización, los liposomas
catiónicos incluyen además un lípido formador de vesícula neutra. En
todavía otra forma de realización, los liposomas catiónicos incluyen
además colesterol.
En todavía otra forma de realización, los
liposomas catiónicos poseen un revestimiento de superficie de
cadenas de polímero hidrofílico mediante la inclusión de un lípido
formador de vesícula derivatizado con tal polímero hidrofílico. En
una forma de realización, por lo menos una porción de las cadenas
del polímero hidrofílico se unen al lípido formador de vesícula
mediante un enlace liberador, por ejemplo, un enlace eficaz para
liberar las cadenas de polímero hidrofílico en respuesta a una
condición fisiológica existente o inducida. Los complejos de
plásmido-liposoma pueden incluir además un ligando
unido a los extremos distales de las cadenas de polímero
hidrofílico para la unión específica de ligante a una molécula de
receptor sobre una superficie de una célula objetivo. Por ejemplo,
y en una forma de realización preferida, el polímero hidrofílico es
polietilenglicol.
La presente invención proporciona asimismo un
procedimiento para la preparación de complejos de
plásmido-liposoma que comprende las etapas
siguientes:
seleccionar como un agente de condensación para
la condensación de las moléculas de plásmido, un policatión
seleccionado de histonas,
poli-l-glutamina, protamina,
melitina o polimixina B;
seleccionar como medio para la suspensión de
dichas moléculas de plásmido condensadas, un medio acuoso que
contiene un soluto no electrolítico, poseyendo dicho medio una
fuerza iónica inferior a la fuerza iónica de una solución de 10 mM
que contiene una sal ionizable monovalente;
seleccionar una proporción de lípido de liposoma
a plásmido superior a 5 nmol de lípido de liposoma/\mug de
plásmido e inferior a 25 nmoles de lípido de liposoma/\mug de
plásmido; en la que los complejos de
plásmido-liposoma poseen un tamaño homogéneo
inferior a 200 nm;
condensar dichas moléculas de plásmido; y
mezclar los plásmidos condensados con una
suspensión de liposomas catiónicos que comprenden un lípido formador
de vesícula catiónica de cadena de diacilo, bromuro de
dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de
N-[1-(2,3-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DMRIE), bromuro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DORIE), o cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) para formar dichos complejos de
plásmido-liposoma.
Los complejos de
plásmido-liposoma de la presente invención se pueden
utilizar para la transfección de una célula huésped con un gen
contenido en un plásmido de ADN, en el que el plásmido de ADN
contiene un gen seleccionado de entre el grupo constituido por genes
que codifican el Factor VIII, la interleucina-2 o el
p53.
En una forma de realización preferida, el
complejo de plásmido-liposoma es para su utilización
en la transfección de una célula huésped en el pulmón de un sujeto
con un plásmido de ADN que contiene un regulador de conductancia de
transmembrana de fibrosis quística, o para carcinomas de pulmón,
citocinas, tales como la interleucina-2, o genes
supresores de tumor, tales como p53.
Éstos y otros objetivos y características de la
presente invención resultarán más evidentes a partir de la
descripción detallada siguiente de la presente invención haciendo
referencia a los dibujos anexos.
La fig.1 es una imagen generada por ordenador de
una micrografía electrónica de un plásmido condensado con el
polímero policatiónico de histona total;
la fig. 2 es una imagen generada por ordenador
de una micrografía electrónica de un
policatión-plásmido condensado complejado con
liposomas catiónicos según la presente invención;
las figs. 3A-3B son imágenes
generadas por ordenador de micrografías electrónicas de transmisión
criogénica (fig. 3A) y de criofractura (fig. 3B) de un
policatión-plásmido condensado complejado con
liposomas catiónicos según la presente invención;
la fig. 4 es un gráfico que muestra el tamaño,
en nm según se ha medido mediante dispersión de luz dinámica, de
complejos de plásmido-liposoma preparados según la
presente invención;
la fig. 5 es un gráfico de diámetro de
partícula, en nm según se ha medido mediante dispersión de luz
dinámica como una función del tiempo de almacenamiento a 4ºC, para
complejos de plásmido-liposoma de la presente
invención;
la fig. 6 es un gráfico de porcentaje de dosis
inyectada como una función del tiempo después de la inyección
intravenosa en ratones de complejos de
plásmido-liposoma marcados de la presente
invención;
las figs. 7A-7E muestran la
expresión de la luciferasa, en unidades de luz relativa (RLU)/10
segundos/mg de proteína, en el pulmón (fig. 7A), hígado (fig. 7B),
corazón (fig. 7C), bazo (fig. 7D) y riñón (fig. 7E) para complejos
de plásmido-liposoma preparados con la histona
total;
las figs. 8A-8E muestran la
expresión de la luciferasa, en unidades de luz relativa (RLU)/10
segundos/mg de proteína, en el pulmón (fig. 8A), hígado (fig. 8B),
corazón (fig. 8C), bazo (fig. 8D) y riñón (fig. 8E) para complejos
de plásmido-liposoma preparados con la histona
H1;
las figs. 9A-9E muestran la
expresión de la luciferasa, en unidades de luz relativa (RLU)/10
segundos/mg de proteína, en el pulmón (fig. 9A), hígado (fig. 9B),
corazón (fig. 9C), bazo (fig. 9D) y riñón (fig. 9E) para complejos
de plásmido-liposoma preparados con la histona
H4;
las figs. 10A-10E muestran la
expresión de la luciferasa, en pg de luciferasa/mg de proteína, en
el pulmón (fig. 10A), hígado (fig. 10B), corazón (fig. 10C), bazo
(fig. 10D) y riñón (fig. 10E) para complejos de
plásmido-liposoma preparados con
poli-l-glutamina, melitina o
polimixina B como agente de condensación catiónico;
las figs. 11A-11B muestran la
expresión de la luciferasa en el pulmón (fig. 11A) y en el hígado
(fig. 11B) como una función del tiempo en días para complejos de
plásmido-liposoma almacenados a 4ºC;
la fig. 12 muestra la luciferasa en tejidos
diversos, en pg/mg de proteína, a las 24 horas después de la
administración intravenosa de complejos de
plásmido-liposoma a ratones, como una función de
microgramos de luciferasa-plásmido portador;
la fig. 13 muestra la actividad de la
luciferasa, en RLU/mg de proteína, en tejidos diversos 24 horas
después de la administración intravenosa de complejos de
plásmido-liposoma;
las figs. 14A-14B muestran el
porcentaje de animales supervivientes como una función de los días
después de la inoculación con metástasis de pulmón de Lewis, para
animales tratados con complejos de plásmido-liposoma
que incluyen los plásmidos pHSVtk (fig. 14A), pCMVp53 (fig. 14B) y
pCMVIL2 (fig. 14C);
la fig. 15 es un gráfico que muestra el peso
corporal, en gramos, de ratones después de la administración de
complejos de plásmido-liposoma preparados con un
plásmido pNSL que codifica la luciferasa como una función del tiempo
en días. Los ratones se trataron en los días 1, 8, 15, 22 y 28,
según se indica por las flechas en el gráfico, con salino (símbolos
más) y complejos de plásmido-liposoma a
dosificaciones de 50 \mug de plásmido (círculos abiertos), 75
\mug de plásmido (triángulos cerrados) y 100 \mug de plásmido
(triángulos invertidos, abiertos); y
la fig. 16 es un gráfico que muestra la
expresión de la luciferasa, en ng/mg de proteína, en tejidos
diversos de ratón 24 horas después de la administración de complejos
de plásmido-liposoma preparados con el plásmido pNSL
que codifica la luciferasa para los ratones que tienen tumor (modelo
de metástasis de tumor de pulmón de Lewis).
La presente invención se dirige a un complejo de
plásmido-liposoma y a una mejora en un procedimiento
para la preparación tal complejo, para su utilización en la
transfección in vivo de una célula huésped. La composición
incluye moléculas de plásmido que se condensan con un agente de
condensación policatiónico y a continuación se suspenden en un
medio de fuerza iónica baja. Las moléculas de plásmido condensadas
se mezclan con partículas de lípidos, tales como liposomas, para
formar complejos de plásmido-liposoma. La mejora en
el procedimiento de preparación, según se describirá, se refiere a
la selección del agente de condensación, selección del medio de
suspensión y selección de la proporción de lípido de liposoma a
plásmido. Antes de la descripción en detalle del procedimiento de
preparación mejorado, se describirán el complejo de
plásmido-liposoma y sus componentes.
Según se ha descrito anteriormente, el complejo
de plásmido-liposoma incluye moléculas de plásmido
condensadas y liposomas. Los liposomas, tal como se utilizan en la
presente memoria, se refieren a vesículas de lípidos que poseen una
corteza lipídica externa, formada típicamente por una o más bicapas
de lípidos, que encapsulan un interior acuoso. En una forma de
realización preferida, los liposomas son liposomas catiónicos
compuestos de entre aproximadamente 20-80 moles por
ciento de un lípido formador de vesícula catiónica, con el resto de
lípidos formadores de vesículas neutras y/u otros componentes. Tal
como se utiliza en la presente memoria, el "lípido formador de
vesícula" se refiere a cualquier lípido anfipático que posee
mitades de grupos de cabeza hidrofóbicos y polares y que por si
mismo puede formar espontáneamente en la bicapa vesículas en agua,
según se ejemplifica mediante fosfolípidos. Un lípido formador de
vesícula preferido es un lípido de cadena de diacilo, tal como un
fosfolípido, cuyas cadenas de acilo tienen una longitud típicamente
de entre aproximadamente 14 a 22 átomos de carbono y posee varios
grados de insaturación.
Un lípido formador de vesícula catiónica es uno
cuyo grupo de cabeza polar presenta una carga positiva neta, a un
pH de operación, por ejemplo, pH 4-9. Los ejemplos
típicos incluyen fosfolípidos, tales como la fosfatidiletanolamina,
cuyos grupos de cabeza polar se derivatizan con una mitad positiva,
por ejemplo, lisina, según se ha ilustrado, por ejemplo, para el
lípido DOPE derivatizado con L-lisina
(LYS-DOPE) (Guo, et al., 1993). Están
incluidos asimismo en esta clase los glucolípidos, tales como los
cerebrósidos y los gangliósidos que poseen un grupo de cabeza polar
catiónico.
Otro lípido formador de vesícula catiónica que
se puede utilizar es la colesterolamina y los esteroles catiónicos
relacionados. Ejemplos de lípidos catiónicos incluyen
1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamino)propano
(DOTAP); bromuro de
N-[1-(2,3-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DMRIE); bromuro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DORIE); cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB).
El resto de los liposomas están formados por
lípidos formadores de vesículas neutras, significando que los
lípidos formadores de vesículas no poseen una carga neta o que
pueden incluir un porcentaje pequeño de lípidos que poseen una
carga negativa en el grupo de cabeza polar. Están incluidos en esta
clase de lípidos los fosfolípidos, tales como la fosfatidilcolina
(PC), la fosfatidiletanolamina (PE), el fosfatidilinositol (PI) y la
esfingomielina (SM) y el colesterol, derivados de colesterol y
otros esteroles sin carga.
Los lípidos descritos anteriormente se pueden
obtener comercialmente, o preparar según los procedimientos
publicados. Otros lípidos que se pueden incluir en la presente
invención son glucolípidos, tales como los cerebrósidos y los
gangliósidos.
En una forma de realización de la presente
invención, el complejo de plásmido-liposoma incluye
liposomas que poseen un revestimiento de superficie de cadenas de
polímero hidrofílicas, eficaces prolongando el tiempo de la
circulación sanguínea de los complejos de
plásmido-liposoma. Los polímeros hidrofílicos
adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), ácido poliláctico, ácido
poliglicólico, polivinilpirrolidona, polimetiloxazolina,
polietiloxazolina, metacrilamida de polihidroxipropilo,
polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, y celulosas
derivatizadas, tales como la hidroximetilcelulosa o la
hidroxietilcelulosa. Una cadena de polímero hidrofílica preferida
es polietilenglicol (PEG), preferentemente como una cadena PEG que
posee un peso molecular entre 500-10.000 dalton,
más preferentemente entre 1.000-5.000 dalton. El
polímero hidrofílico puede poseer la solubilidad en agua y en un
disolvente no acuoso, tal como cloroformo.
El revestimiento se prepara preferentemente
mediante la inclusión en los lípidos formadores de vesícula que
forman los liposomas, entre 1-20 mol por ciento de
un lípido formador de vesícula, preferentemente un fosfolípido u
otro lípido de cadena de diacilo, derivatizado en su grupo de cabeza
con la cadena de polímero. Los procedimientos de ejemplo para la
preparación de tales lípidos, y la formación de liposomas revestidos
de polímero con ésos, se han descrito en las patentes US nº 5.013.
556 y US nº 5.395.619.
Se apreciará que el polímero hidrofílico se
puede acoplar de forma estable al lípido, o acoplarse a través de
una unión no estable que permite suprimir o "liberar" a los
complejos de plásmido-liposoma revestidos de
polímero del revestimiento de polímero hidrofílico durante la
circulación en la corriente sanguínea o después de la localización
en un sitio objetivo. Se ha descrito la unión de los polímeros
hidrofílicos, en particular de polietilenglicol (PEG), a los
lípidos formadores de vesícula a través de un enlace eficaz para
liberar las cadenas de polímero en respuesta a un estímulo, por
ejemplo, en los documentos WO 98/16202 y WO 98/16201 y por Kirpotin,
D. et al., (FEBS Letters, 388:115-118
(1996).
La unión liberadora, en una forma de
realización, es una unión liberadora químicamente que se escinde
mediante la administración de un agente liberador adecuado o se
escinde bajo condiciones fisiológicas selectivas, tales como en
presencia de enzimas o de agentes reductores. Por ejemplo, las
uniones de éster y de péptido se escinden por enzimas de estearasa
o de peptidasa. Las uniones de disulfuro se escinden por la
administración de un agente reductor, tal como la glutationa o el
ascorbato, o mediante un agente reductor presente in vivo,
tal como la cisteína, que está presente en el plasma e
intracelularmente.
Otros enlaces liberadores incluyen enlaces
sensibles al pH y enlaces que se escinden tras la exposición a
glucosa, luz o calor. A título de ejemplo, las cadenas de polímero
hidrofílico se pueden unir al liposoma mediante un enlace sensible
al pH y los complejos de plásmido-liposoma se
dirigen a un sitio que posee un pH eficaz para escindir el enlace y
liberar las cadenas hidrofílicas, tales como una región de tumor.
Los ejemplos de enlaces sensibles al pH incluyen éter de
aciloxialquilo, enlaces de acetal y de cetal. Otro ejemplo es el
que el enlace escindible es un enlace disulfuro, con la amplia
intención de referirse en la presente memoria a enlaces que
contienen sulfuro. Los enlaces que contienen sulfuro se pueden
sintetizar para conseguir un grado de labilidad seleccionado e
incluyen enlaces disulfuro, enlaces sulfuro-sulfona
y enlaces sulfuro-sulfóxido mixtos. De los tres
enlaces, el enlace disulfuro es el menos susceptible a la tiólisis y
el enlace sulfuro-sulfóxido es el más
susceptible.
Tales enlaces liberadores son útiles para
confeccionar la velocidad de liberación del segmento de polímero
hidrofílico de los complejos de plásmido-liposoma.
Por ejemplo, un enlace disulfuro muy lábil se puede utilizar para
dirigirse a las células sanguíneas o las células endoteliales, ya
que estas células son fácilmente accesibles y es suficiente un
tiempo de vida en circulación sanguínea de liposoma más corto. En el
otro extremo, se puede utilizar un enlace disulfuro de larga
duración o fuerte cuando el objetivo es el tejido de tumor o de
otros órganos en los que se necesita por lo general un tiempo de
vida en circulación sanguínea de liposoma más largo para que los
complejos alcancen el objetivo deseado.
El enlace liberador que une las cadenas de
polímero hidrofílico al liposoma se escinde in vivo
típicamente como resultado del cambio de entorno, tal como cuando
los liposomas alcanzan un sitio específico con un pH ligeramente
inferior, tal como una región de tejido de tumor, o un sitio con
condiciones reductoras, tal como un tumor hipóxico. Las condiciones
reductoras in vivo se pueden asimismo producir mediante la
administración de un agente reductor, tal como ascorbato, cisteína
o glutationa. El enlace escindible se puede asimismo romper en
respuesta a un estímulo externo, tal como luz o calor.
En otra forma de realización, los complejos de
plásmido-liposoma incluyen una mitad afín o un
ligando eficaz dirigido a unirse específicamente a las células
objetivo a las que la terapia se dirige. Tales mitades se pueden
unir a la superficie del liposoma o a los extremos distales de las
cadenas de polímero hidrofílicas. Las mitades ejemplares incluyen
anticuerpos, ligandos para la unión específica a los receptores de
superficie de las células objetivo y similares, según se ha
descrito, por ejemplo, en las solicitudes PCT WO US94/03103, WO
98/16202 y WO 98/16201. La mitad puede ser asimismo un segmento
hidrofóbico para facilitar la fusión del complejo con una célula
objetivo.
Esta sección describe la preparación del
plásmido de fase condensada utilizado en el complejo de
plásmido-liposoma de la presente invención.
Los agentes de condensación policatiónicos
utilizados para condensar el plásmido son polímeros catiónicos
cargados múltiplemente, típicamente biopolímeros tales como la
espermidina, espermina, polilisina, protamina, histona total,
fracciones de histona específicas tales como H1, H2, H3, H4 y otros
polipéptidos policatiónicos, pero pueden incluir asimismo polímeros
biocompatibles, tales como la polimixina B. Se apreciará que estos
agentes de condensación policatiónicos se pueden utilizar en forma
de base libre o de sal, por ejemplo, sulfato de protamina e
hidrobromuro de polilisina. En una forma de realización preferida,
el agente de condensación policatiónico es una histona, que, tal
como se refiere en la presente memoria, incluye la histona total o
las fracciones de histona específicas.
Los plásmidos adecuados para su utilización en
el complejo son preferentemente moléculas circulares o de doble
hebra cerradas que poseen tamaños que están preferentemente en el
intervalo de 5-40 Kbp (kilopar de bases). Los
plásmidos se construyen según procedimientos bien conocidos e
incluyen un gen terapéutico, es decir, el gen que se va a expresar
en la terapia génica, bajo el control de elementos de control de
promotor y de terminación adecuados, y de otros elementos
necesarios para la replicación dentro de la célula huésped y/o la
integración en el genoma de la célula huésped. Los procedimientos
para la preparación de plásmidos útiles para la terapia génica en
los genes o en otros mamíferos se conocen y están referenciados
ampliamente.
Los genes que se van a introducir para la
terapia génica por el complejo de la presente invención por lo
general se incluyen en una de las tres categorías siguientes.
En la primera están los genes que se pretende
que superen una deficiencia genética o defecto en el sujeto, es
decir, donde el sujeto falla en la producción de proteínas
endógenas, activas en todos o dentro de los niveles normales, y se
intenta que el gen introducido en el plásmido cubra esta
deficiencia. Ejemplos de esta clase de genes incluyen los genes que
codifican la adenosina deaminasa (ADA), para la expresión génica en
células troncales o linfocitos; los genes que codifican la
deficiencia de la purina nucleósido fosforilasa, la deficiencia en
la prostaglandina G/H sintasa, la terapia del síndrome de
Lesch-Nyhan causado por una deficiencia en la
hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, genes
que codifican una variedad de proteínas circulares, tales como la
\alpha_{1}-antitripsina, factores de coagulación
(por ejemplo, el Factor VIII, el Factor IX) y globinas (por
ejemplo, \beta-globina, hemoglobina), para el
tratamiento de la hemofilia, la anemia drepanocítica y otras
enfermedades relacionadas con la sangre y los genes que codifican
las hormonas y otros reguladores de péptidos.
En la segunda clase están los polipéptidos
diseñados para tratar cualquier patología existente, tal como un
cáncer, o un estado patogénico tal como una infección viral. Los
ejemplos incluyen la terapia génica para suministrar el gen p53
para la terapia de cáncer, el gen para el péptido CD4 para inhibir
la infección de HIV, el gen para el péptido de Pseudomonas
para inhibir la unión de Pseudomonas a las células
epiteliales, y los genes de anticuerpo específico para inhibir un
patógeno objetivo.
La tercera clase incluye los genes destinados a
producir una transcripción de ARNm que puede actuar como una
molécula complementaria para inhibir una expresión de proteína no
deseable, tal como la sobreexpresión de proteínas específicas para
el crecimiento del tumor, o la expresión de proteínas virales.
Según la presente invención, se ha descubierto
que un complejo de plásmido-liposoma formado
mezclando el plásmido de fase condensada y los liposomas
catiónicos, en un medio acuoso que contiene un soluto no
electrolítico, poseyendo dicho medio una fuerza iónica inferior a
la fuerza iónica de una solución de 10 mM que contiene una sal
ionizable monovalente, produce complejos que poseen un tamaño
homogéneo de forma sustancial típicamente inferior a 200 nm y
preferentemente en el intervalo comprendido entre 50 y 200 nm, más
preferentemente entre 100 y 200 y más preferentemente entre 120 y
180 nm. Los complejos se caracterizan además por una retención de
la actividad de la expresión del gen codificado, esto es, los
complejos poseen una estabilidad de transfección. Esto se evidencia
por la capacidad de los complejos después de un almacenamiento de 30
días, y preferentemente 90 días, a 4ºC, para transfectar células y
conseguir la expresión del gen codificado, según se describirá a
continuación.
El plásmido de fase condensada se forma por la
adición al plásmido de un agente de condensación de polímero
policatiónico del tipo identificado anteriormente, en un medio
acuoso que contiene un soluto no electrolítico, poseyendo dicho
medio una fuerza iónica inferior a la fuerza iónica de una solución
de 10 mM que contiene una sal ionizable monovalente. El polímero
catiónico se añade a la solución del plásmido a una concentración
preferida en la que se consigue la carga estequiométrica, es decir,
en la que el número total de cargas en el polímero catiónico (según
se ha determinado a partir de la densidad de carga/peso conocido del
polímero) es por lo menos tan grande como la carga negativa total
del ADN (según se ha determinado a partir de la cantidad en peso de
plásmido y de la densidad de carga de ADN/peso conocidos).
Típicamente, la proporción en peso de plásmido de ADN añadido al
polímero añadido está entre aproximadamente 0,1-5,0,
más preferentemente, entre 0,3-2,0. El agente de
condensación se añade preferentemente de forma lenta a la suspensión
del plásmido con agitación, por ejemplo, durante un periodo de 10
minutos.
El plásmido condensado y los liposomas
catiónicos, ambos contenidos en dicho medio acuoso, se mezclan a
continuación, por ejemplo, mediante la adición lenta de las
moléculas de plásmido condensado a los liposomas. La proporción de
lípidos de liposoma a plásmido es un parámetro importante para
conseguir la transfección máxima. Esta proporción, en nmol de
lípido de liposoma/\mug de plásmido es superior a 5 pero inferior
a 25, preferentemente superior a 8 pero inferior a 18, más
preferentemente superior a 10 pero inferior a 15 y más
preferentemente entre 12 y 14.
Tal como se ha indicado anteriormente, una
característica crítica de la presente invención es la mezcla de
liposomas y de plásmido de fase condensada en dicho medio acuoso. La
concentración final del medio, incluyendo los iones presentes en el
ADN, el agente de condensación, y las especies de lípido de
liposoma, es inferior a la fuerza iónica de una sal ionizable
monovalente 10 mM, tal como NaCl, y preferentemente inferior a
aproximadamente 1 mM. En general, la fuerza iónica baja se obtiene
fácilmente mediante la utilización de la base libre o del plásmido
de ácido libre, policatión, y especies lipídicas, eliminando los
componentes de electrolito, o de forma alternativa, utilizando
concentraciones suficientemente diluidas de los componentes para
mantener una fuerza iónica baja, y/o eliminando electrolitos
generados a partir de componentes mediante diálisis o similar. La
composición se prepara en presencia de un soluto no electrolítico
tal como glucosa para proporcionar un equilibrio osmótico como una
formulación inyectable.
La Fig. 1 es una imagen generada por ordenador
de una micrografía electrónica de transmisión de tinción negativa
del plásmido pNSL que codifica la luciferasa condensado con histona
total, preparado según se ha descrito en el ejemplo 1. Según se
aprecia, el plásmido se condensa en partículas únicas, discretas de
aproximadamente 100 nm de diámetro y menos.
La Fig. 2 es una imagen generada por ordenador
de una micrografía electrónica de transmisión de tinción negativa
de un complejo de plásmido-liposoma condensado con
un policatión según se ha descrito en el ejemplo 1. Comparando las
moléculas de plásmido condensadas, puras de la fig. 1 con el
complejo de la fig. 2 son fácilmente evidentes en la fig. 2 los
plásmidos condensados, opacos. Además resulta visible en la fig. 2
una membrana transparente que rodea cada plásmido condensado. Esta
membrana transparente es la bicapa de lípido de liposoma que recubre
cada plásmido condensado.
Las figs. 3A-3B son imágenes
generadas por ordenador de micrografías electrónicas de transmisión
crioelectrónica y de criofractura del complejo de
plásmido-liposoma preparado según se ha descrito en
el ejemplo 1. La micrografía de la fig. 3A se obtiene mediante la
congelación de una capa fina de la suspensión del complejo de
plásmido-liposoma y observando la capa bajo un
microscopio crioelectrónico. La micrografía muestra complejos de
plásmido-liposoma discretos, únicos, en los que el
ADN condensado se ve como una región central más oscura en muchas de
las partículas. La micrografía de criofractura de la fig. 3B
muestra asimismo complejos de plásmido-liposoma
discretos, sin agregación aparente.
Se utilizó la dispersión de luz dinámica para
determinar el tamaño promedio y la distribución de tamaño del
complejo. Los resultados se muestran en la fig. 4 que muestra que
los complejos preparados según el ejemplo 1 forman una población
homogénea que posee un tamaño promedio de aproximadamente 146 nm
(desviación estándar de 45 nm). Éste y otros estudios llevados a
cabo que respaldan la presente invención indican que la composición
cuando se prepara según el procedimiento descrito consigue complejos
que poseen una población homogénea, según se evidencia por el pico
único indicando una población de complejos que poseen una
distribución de tamaño relativamente estrecha. Los complejos poseen
un tamaño inferior a 200 nm, más preferentemente entre 50 y 200 nm,
más preferentemente entre 100 y 200 nm y todavía más preferentemente
entre 120 y 180 nm.
Según se ha descrito anteriormente de forma
breve, los complejos de plásmido-liposoma son
estables, esto es, los complejos mantienen su tamaño inicial, por
ejemplo, existe una pequeña agregación de los complejos, y los
complejos retienen la actividad terapéutica, durante por lo menos 30
días después del almacenamiento a 4ºC. La fig. 5 proporciona la
evidencia de la estabilidad del tamaño del complejo y muestra el
tamaño del complejo, según se ha medido mediante dispersión de luz
dinámica, como una función del tiempo. Se almacenó a 4ºC una
suspensión de los complejos de plásmido-liposoma en
agua/glucosa y se analizó después de 7, 14, 21, 28, 60 y 90 días de
almacenamiento. Inicialmente después de la formación del complejo,
el tamaño promedio del complejo fue aproximadamente 150 nm y, como
se ve, después de 90 días de almacenamiento, el tamaño del complejo
permaneció aproximadamente en 150 nm. La estabilidad del complejo
con respecto a la retención de la actividad terapéutica se describe
a continuación en las figs. 11A-11B.
Los complejos de
plásmido-liposoma preparados según la presente
invención se administraron a ratones para determinar la eficacia de
la transfección de diversas formulaciones de complejo de
plásmido-liposoma y para determinar la estabilidad
de la transfección, biodistribución del complejo, farmacocinética y
respuesta de dosis. El procedimiento de transfección in vivo
de forma ejemplar se describe en el ejemplo 2.
La farmacocinética de los complejos de
plásmido-liposoma se determinó mediante la inyección
en ratones de complejos que incluían un plásmido de ADN marcado con
S^{35}. La fig. 6 muestra el porcentaje de dosis inyectada como
una función del tiempo después de la inyección intravenosa.
Inmediatamente después de la inyección del complejo de
plásmido-liposoma, aproximadamente el 7% de la dosis
inyectada está en la corriente sanguínea. Otros estudios han
determinado que inmediatamente después de la inyección el porcentaje
restante de los complejos se localiza en el pulmón. Después de un
periodo de tiempo se neutralizan los complejos mediante proteínas
de suero en el pulmón y entran en la corriente sanguínea, según
resulta evidente por el incremento en el porcentaje de dosis
inyectada hasta aproximadamente 22% en el punto de tiempo de 5 horas
(fig. 6). A continuación los complejos se purifican de la corriente
sanguínea, con aproximadamente el 12% de la dosis inyectada presente
a las 24 horas.
Los complejos de
plásmido-liposoma se prepararon para la
administración in vivo con proporciones diversas de lípido
de liposoma a plásmido. Los complejos se prepararon según el
procedimiento general establecido en el ejemplo 1 mediante la
variación de la cantidad de agente de condensación policatiónico y
la cantidad total de lípidos de liposoma. Típicamente, la cantidad
de agente de condensación policatiónico varió entre 100 y 500
\mug y la proporción de lípido de liposoma/plásmido varió entre 8
y 18 nmoles de lípido/\mug de plásmido.
Las figs. 7-9 muestran los
resultados de los complejos de plásmido-liposoma
preparados con la histona total (figs. 7A-7E),
histona H1 (figs. 8A-8E) e histona H4 (figs.
9A-9E) como agentes de condensación policatiónicos.
Después de la administración del complejo, preparado según las
formulaciones indicadas en las tablas a continuación, se midió la
expresión de la luciferasa en el pulmón, hígado, corazón, bazo y
riñón.
La tabla 1 resume las composiciones de los
complejos de plásmido-liposoma preparados utilizando
la histona total como el agente de condensación policatiónico. La
cantidad de histona total se varió entre 100 y 500 \mug para
variar la proporción de plásmido/histona total de 0,2 a 1,0. Se
varió también la proporción de lípidos de liposoma/plásmido y se
ensayaron las proporciones de 8, 14 y 18 nmoles de lípidos de
liposoma/\mug de plásmido.
Los resultados de la administración in
vivo a ratones de las formulaciones resumidas en la tabla 1 se
muestran en las figs. 7A-7E, en las que la expresión
de la luciferasa, en unidades de luz relativa (RLU)/10 segundos/mg
de proteína, se muestra en el pulmón (fig. 7A), hígado (fig. 7B),
corazón (fig. 7C), bazo (fig. 7D) y riñón (fig. 7E). Los números
indican que existe una ventana en la que la transfección es la más
elevada. Específicamente, para la histona total como agente de
condensación, la transfección es la más elevada donde la proporción
de lípido de liposoma/plásmido es superior a 8 nmoles de
lípido/\mug de plásmido e inferior a 18 nmoles de
lípido/\mug.
La tabla 2 resume las composiciones del complejo
de plásmido-liposoma preparadas y ensayadas in
vivo utilizando la histona H1 como agente de condensación
policatiónico. La proporción de plásmido/histona H1 fue 0,3 ó 0,5 y
la proporción de lípido de liposoma/plásmido se varió desde 8, 14 y
18 nmoles de lípido/\mug de plásmido.
Los resultados de la administración in
vivo a ratones de las formulaciones resumidas en la tabla 2 se
muestran en las figs. 8A-8E, en las que la expresión
de la luciferasa, en unidades de luz relativa (RLU)/10 segundos/mg
de proteína, se muestra en el pulmón (fig. 8A), hígado (fig. 8B),
corazón (fig. 8C), bazo (fig. 8D) y riñón (fig. 8E). Los números
indican que la mejor transfección se consigue con unas proporciones
de lípido de liposoma/plásmido de 14 y 18.
Las tablas 3A y 3B resumen las formulaciones de
los complejos de plásmido-liposoma formados
utilizando la histona H4 como el agente de condensación
policatiónico. La proporción de plásmido/histona H4 varió desde
0,2, 0,3 o 0,5 y la proporción de lípido de liposoma/plásmido se
varió desde 8, 14 o 18 nmoles de lípido/\mug de plásmido.
Los resultados de la administración in
vivo en ratones de las formulaciones resumidas en las tablas 3A
y 3B se muestran en las figs. 9A-9E, en las que la
expresión de la luciferasa, en unidades de luz relativa (RLU)/10
segundos/mg de proteína, se muestra en el pulmón (fig. 9A), hígado
(fig. 9B), corazón (fig. 9C), bazo (fig. 9D) y riñón (fig. 9E).
Existe una ventana en la que la transfección es la más elevada de
más de 8 nmoles de lípido de liposoma/\mug de plásmido y menos de
18 nmoles de lípido de liposoma/\mug de plásmido.
En otros experimentos llevados a cabo con el
apoyo de la presente invención, los complejos de
plásmido-liposoma se prepararon utilizando
poli-l-glutamina, melitina (un
péptido de bajo peso molecular que contiene 26 aminoácidos) o
sulfato de polimixina B como agentes de condensación policatiónicos.
Cada uno de éstos está disponible comercialmente en Sigma Chemical
Co. Los complejos se inyectaron en ratones, según se ha descrito en
el ejemplo 2, y se midió la transfección in vivo mediante la
determinación de la expresión de la luciferasa.
La tabla 4 resume las composiciones de complejo
de plásmido-liposoma preparadas utilizando
poli-l-glutamina, melitina o
polimixina B como agentes de condensación policatiónicos. La
cantidad de agente de condensación se varió entre 50 y 200
\mug.
Los resultados de la administración in
vivo en ratones de los complejos de
plásmido-liposoma de la tabla 4 se muestran en las
figs. 10A-10E, en las que la expresión de la
luciferasa, en pg de luciferasa/mg de proteína, se muestra en el
pulmón (fig. 10A), hígado (fig. 10B), corazón (fig. 10C), bazo (fig.
10D) y riñón (fig. 10E). La proporción de lípido/plásmido para cada
una de las formulaciones fue constante a 14 nmoles de lípido/\mug
de plásmido, cayendo aproximadamente a la mitad de camino en el
intervalo preferido entre 5 y 25 nmoles de lípido de liposoma/\mug
de plásmido.
Estos estudios utilizando una variedad de
agentes de condensación policatiónicos, por ejemplo, la histona
total, la histona H1, la histona H4, la
poli-l-glutamina, la melitina y la
polimixina B, indican que la transfección se consigue cuando la
proporción de lípido de liposoma/plásmido (en nmoles de
lípido/\mug de plásmido) es superior a 5 e inferior a
aproximadamente 25. Más preferentemente, la proporción está entre 8
y 18, todavía más preferentemente entre 10 y 15 y más
preferentemente entre 12 y 14 nmoles de lípido de liposoma/\mug de
plásmido.
Según se ha descrito anteriormente, el complejo
de plásmido-liposoma de la presente invención es
estable, según resultó evienete por el pequeño cambio en el tamaño
de partícula (ver fig. 5), durante tanto como 90 días a 4ºC. Se
determinó la estabilidad de la expresión del complejo mediante la
administración a ratones de complejos de
plásmido-liposoma que se habían almacenado a 4ºC.
Específicamente, la suspensión de los complejos de
plásmido-liposoma se administró intravenosamente a
los ratones inmediatamente después de la preparación del complejo
(día 0) y a 7, 14, 21, 28, 30 y 90 días después del almacenamiento a
4ºC. Siguiendo el procedimiento detallado en el ejemplo 2, se
determinó la expresión de la luciferasa en el pulmón y en el hígado,
y los resultados se muestran en las figs.
11A-11B.
Según se aprecia en las figs.
11A-11B, la expresión de la luciferasa en el pulmón
(fig. 11A) y en el hígado (fig. 11B) permanece constante como una
función del tiempo de almacenamiento de los complejos. Está claro
que el complejo retuvo la capacidad de expresar el gen codificado
para el periodo de ensayo de 90 días. En consecuencia, en una forma
de realización de la presente invención el complejo se caracteriza
por la capacidad de retener más del 50% de la actividad de la
expresión medida en el día 0 durante por lo menos 30 días, más
preferentemente durante 90 días.
Se llevó a cabo un estudio de respuesta de dosis
utilizando complejos de plásmido-liposoma preparados
según se ha descrito en el ejemplo 1. El complejo de
plásmido-liposoma se administró intravenosamente en
ratones a cinco niveles de dosificación de plásmido: 25, 50, 200,
250 y 200 \mug. Se midió la expresión de la luciferasa en el
pulmón, corazón, hígado, riñón y bazo veinticuatro horas después de
la administración, y los resultados se muestran en la fig. 12. La
expresión de la luciferasa medida fue proporcional a la dosis
administrada, con la expresión más elevada en el pulmón.
La expresión de la luciferasa sistémica 24 horas
después de la administración del complejo de
plásmido-liposoma en ratones se muestra en la fig.
13. El complejo de plásmido-liposoma se distribuye
ampliamente, según resultó evidente por la expresión de la
luciferasa en la médula ósea, nodos linfáticos y cerebro.
En otro estudio llevado a cabo con el apoyo de
la presente invención, detallado en el ejemplo 3, se trataron los
ratones que contenían tumores de pulmón de Lewis metastásicos con
complejos de plásmido-liposoma. Después de la
inoculación del tumor, los ratones se trataron con uno de los ocho
regímenes de tratamiento establecidos en la tabla 5 del ejemplo 3.
Los tratamientos incluyeron la administración de complejos de
plásmido-liposoma preparados utilizando plásmidos
que portaban genes que codificaban p53 (pCMVp53) e interleucina 2
(pCMVIL2) y un tratamiento de combinación de ganciclovir y de
complejos de plásmido-liposoma preparados con un
plásmido pHSVtk (timidina cinasa del virus del Herpes Simplex). Un
grupo de control de animales recibió salino, y los grupos
comparativos de los animales recibieron los complejos preparados con
el plásmido pNSL que codifica la luciferasa (ejemplo 1) o el
ganciclovir solo.
Las figs. 14A-14C muestran el
porcentaje de animales supervivientes como una función de los días
después de la inoculación de la célula de tumor. En todas las figs.
14A-14C, los animales tratados con salino se
representan con cuadrados cerrados. Según se aprecia, todos los
animales tratados con salino murieron 24 días después de la
inoculación del tumor. En la fig. 14A, se muestran los animales
tratados con complejos que incluyen los 50 \mug (triángulos
invertidos sólidos) y los 75 \mug (cuadrados abiertos) de plásmido
pHSVtk y con ganciclovir. Todos los animales tratados solo con
ganciclovir (círculos abiertos) murieron en el día 37. En
contraste, los animales tratados con la combinación de la terapia de
complejos de plásmido-liposoma y ganciclovir lo
pasaron mejor, sobreviviendo al estudio el 70% de los tratados con
la dosis de plásmido más elevada.
La fig. 14B muestra el porcentaje de
supervivencia de animales tratados con los complejos de
plásmido-liposoma incluyendo pCMVp53 (triángulos
invertidos sólidos) y pNSL (que codifica la luciferasa) (círculos
abiertos). Según se observa, el 20% de los animales tratados con
los complejos que incluyen el plásmido que codifica el gen p53
sobrevivió a la duración del estudio, mientras que murieron los
animales tratados con salino (cuadrados cerrados) y los animales
tratados con el plásmido pNSL que codifica el gen informador de la
luciferasa.
La fig. 14C muestra los resultados de animales
tratados con complejos que incluyen el plásmido pCMVIL2,
administrado a 50 \mug de ADN de plásmido (triángulos sólidos
invertidos) y a 75 \mug de ADN de plásmido (cuadrados abiertos).
Según se aprecia, sobrevivieron entre aproximadamente 15 y 20% de
los animales al final del periodo de tratamiento, mientras que los
que permanecieron sin tratar (control salino, cuadrados sólidos)
murieron en el día 24. De forma similar, los animales tratados con
complejos que incluían el plásmido pNSL que codifica la luciferasa
(círculos abiertos) murieron en el día 31.
La formulación número 34 de la tabla 5 en el
ejemplo 3, esto es el complejo de plásmido-liposoma
con el gen que codifica la luciferasa pNSL, se administró a ratones
en dosis de 50 \mug de plásmido/0,7 \mumol de lípido, 75 \mug
de plásmido/1,05 \mumol de lípido, 100 \mug de plásmido/1,4
\mumol de lípido y se monitorizó el peso corporal de los ratones
como una indicación de la toxicidad de la formulación. Según se
aprecia en la fig. 15, los ratones tratados en los días 1, 8, 15, 22
y 28, según se ha indicado por las flechas en el gráfico, con los
complejos tuvieron una pequeña pérdida de peso después de la primera
dosis, pero recuperaron cualquier pérdida de peso al cabo de unos
pocos días. Los símbolos de la figura son como sigue: ratones
tratados con salino (símbolos más) y ratones tratados con complejos
de plásmido-liposoma a dosificaciones de 50 \mug
de plásmido (círculos abiertos), 75 \mug de plásmido (triángulos
cerrados) y 100 \mug de plásmido (triángulos invertidos,
abiertos).
\newpage
En otro estudio utilizando el modelo de tumor de
pulmón de Lewis, se administró a ratones el complejo de
pNSL-luciferasa-plásmido-liposoma
y se examinó la expresión de la luciferasa 24 horas después de la
administración de los complejos de plásmido-liposoma
en diversos tejidos. Según se aprecia en la fig. 16, la expresión
de luciferasa más elevada se observó en el pulmón y en los
tumores.
De todo lo anterior, se puede apreciar como se
cumplen las características y objetivos diversos de la presente
invención. Los complejos de plásmido-liposoma
preparados según el procedimiento de la presente invención forman
una población homogénea sustancialmente poseyendo tamaños inferiores
a aproximadamente 200 nm, según resultó evidente mediante
dispersión de luz dinámica. Los complejos son estables durante 90
días, sin agregación de los complejos, según se evidencia por la
dispersión de luz dinámica. De forma importante, la actividad de
transfección de los complejos es estable también, en la que los
complejos retienen más del 50% de la eficacia de la transfección
después del almacenamiento durante por lo menos 30 días a 4ºC.
Los ejemplos siguientes ilustran los
procedimientos de preparación, caracterización y utilización de los
complejos de plásmido-liposoma de la presente
invención. Los ejemplos de ninguna manera pretenden limitar el
alcance de la presente invención.
Se compró en Avanti Polar Lipids, Inc.
(Birmingham, AL) el amonio de dimetildioctadecilo (DDAB). El
colesterol, en una pureza superior al 99%, se obtuvo de
Nu-Chek (Elysian, MN).
La histona total, que consiste en una mezcla de
histonas, que incluye H1, H2, H3 y H4, histona H1 e histona H4 se
obtuvo de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). La
poli-l-glutamina, melitina y el
sulfato de polimixina B se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO).
Se obtuvieron las mediciones de la distribución
de tamaño mediante la dispersión de luz dinámica (DLS) utilizando
un instrumento Coulter N4MD, utilizado según las instrucciones del
fabricante. Los resultados se expresaron como el diámetro medio en
nm y la desviación estándar de una distribución gaussiana de
partículas mediante el volumen relativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido pNSL que codifica la
luciferasa a partir de dos plásmidos disponibles comercialmente,
plásmido pGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA) y
pGL3-C (Promega Corporation, Madison, WI).
El pGL3-C se cortó con
XbaI y se ligaron los extremos romos utilizando el fragmento
de Klenow de la ADN polimerasa de E. coli. A continuación se
cortó con HindIII y el fragmento 1689-bp,
portador del gen de la luciferasa, se purificó con gel. El plásmido
pGFP-N1 se cortó con SmaI y HindIII y
el fragmento 4,7 kb, aislado a partir de un gel de agarosa, se ligó
con el fragmento de la luciferasa. Las células de JM109 de E.
coli se transformaron y se seleccionaron 20 colonias;
aproximadamente la mitad de ellas mostraron la presencia de
insertos; se cortaron 8 clones con insertos con NamHI y
XhoI para confirmar además la presencia del gen de la
luciferasa; 7 de ellas fueron positivas.
Los liposomas catiónicos se prepararon según los
procedimientos estándar mediante la disolución de 10 \mumol de
DDAB y 10 \mumol de colesterol en un disolvente orgánico que
contenía principalmente CHCl_{3}. Los lípidos se secaron hasta
una película fina mediante rotación bajo presión reducida. La
película de lípido se hidrató mediante la adición de agua destilada
para formar una suspensión de liposomas a una concentración de 20
\mumol/ml. Los liposomas se clasificaron por el tamaño mediante
sonicación o mediante extrusión secuencial a través de membranas de
policarbonato Nucleopore con tamaños de poro de 0,4 \mum, 0,2
\mum, 0,1 \mum y 0,05 \mum para obtener liposomas de tamaño
inferior a aproximadamente 200 nm (Nucleopore, Pleasanton, CA).
El plásmido pNSL de ADN que codifica la
luciferasa, preparado según se ha descrito anteriormente, se
condensó según el procedimiento siguiente. Se diluyeron 400 \mul
del plásmido (1 mg/ml en agua destilada) en 310 \mul de agua
destilada y se mezclaron a continuación con 90 \mul de glucosa al
50%. Se añadieron a la solución de plásmido lentamente con
agitación 100 \mul de un agente de condensación policatiónico
(histona total, histona H1, histona H4,
poli-l-glutamina, melitina o
polimixina B) de una solución madre de 1 mg/ml en agua destilada. La
mezcla se agitó durante 10 minutos.
Se prepararon los complejos de
plásmido-liposoma que poseen una proporción de
lípido de liposoma/plásmido de 14 nmoles de lípido/\mug de
plásmido mediante la dilución de 280 \mul del liposoma
suspendiéndolos con 350 \mul de agua destilada y a continuación
añadiendo 70 \mul de glucosa al 50%. La suspensión de plásmidos
condensados se añadió lentamente a la suspensión de liposoma
catiónico diluido con agitación continua durante 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La transfección in vivo con los complejos
de plásmido-liposoma se llevó a cabo con ratones
BALB/c obtenidos a partir de Simonsen (Gilroy, CA). Cada
formulación de complejo de plásmido-liposoma se
inyectó vía la vena de la cola en 3 ratones. Los ratones se
sacrificaron 24 horas después de la inyección y se recogieron los
tejidos (pulmón, hígado, bazo, riñón, corazón) después de una
perfusión con PBS heparinizado (4ºC) bajo anestesia.
A una temperatura de entre 0 y 4ºC, se
añadieron a cada tejido 0,75 ml de reactivo de lisis celular
(Promega, Madison, WI), y el tejido se homogeneizó durante 1 minuto
a 20.000 rpm. Se eliminó el sobrenadante en un tubo de
microcentrífuga y se centrifugó a 10.000 g durante 5 minutos. Se
recogió el sobrenadante para los ensayos de la luciferasa y de la
proteína. Se midieron 20 \mul de cada muestra inmediatamente
mediante un luminómetro (regulador de ensayo que contenía 100
\mul de luciferina y ATP, 10 segundos de medición). La unidad de
luz relativa se normalizó mediante la cantidad de proteína de los
extractos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon los complejos de
plásmido-liposoma según el procedimiento del ejemplo
1 utilizando los plásmidos siguientes: pNSL que codifica la
luciferasa, preparado según se ha descrito en el ejemplo 1, y
pCMVp53, pCMVIL2 y pHSVtk (disponibles comercialmente en su
totalidad).
Se obtuvieron ocho ratones macho
B6C3-F1 de Taconic Farms (German Town, NY) y se
dejaron aclimatar durante 3 días antes de la iniciación del
experimento. Los animales se alojaron en jaulas aisladas adecuadas
con alimento de roedores estéril y con agua acidificada ad
lib y en un ciclo 12:12 luz:oscuridad. Los animales se
aleatorizaron en grupos de tratamiento antes de la inoculación de
tumores basándose en el peso corporal. Los animales se
aleatorizaron en los grupos de tratamiento antes de la inoculación
de los tumores.
Se observó diariamente el bienestar general de
todos los animales. Los animales se pesaron antes de la inoculación
de las células de tumor y a continuación dos veces semanalmente. Se
practicó la eutanasia a los animales que se observó que tenían un
15% o más de pérdida de peso a partir de su peso inicial, o a
cualquier animal con sufrimiento, y se examinó la presencia y
tamaño de focos metastásicos en el pulmón, hígado y bazo.
Se inocularon los tumores tomando tumores de
pulmón de Lewis en crecimiento a partir de otros ratones
B6C3-F1 mediante recogida quirúrgica estéril
después de la eutanasia. Los tumores se trituraron mecánicamente de
forma tan fina como fue posible y se digirieron brevemente en una
mezcla enzimática de colagenasa, proteasa y ADNasa a 37ºC. Después
de la digestión y del lavado en un medio (RPMI + 15% de FCS) se
contaron las células con un hemocitómetro. Las células se agitaron
y se resuspendieron en un medio a 10^{6} células por ml (10^{5}
células por 0,1 ml de inyección). Las células resuspendidas se
introdujeron en jeringas individuales (0,1 ml, con agitación
continua) para la inyección intravenosa en la vena de la cola de
cada animal.
\newpage
Los animales se trataron, empezando 3 días
después de la inoculación con células de tumor, con uno de los ocho
regímenes establecidos en la Tabla 5. Los 10 animales de cada grupo
se trataron 5 veces a intervalos de una semana, excepto como se
indicó para el grupo de tratamiento de ganciclovir nº 30 y para los
animales que recibieron el ganciclovir como parte de una terapia de
combinación (grupos nº 32, 33).
\vskip1.000000\baselineskip
Veinticuatro horas después del último
tratamiento, se practicó la eutanasia a los animales supervivientes
para un cultivo y un examen del tejido y del tumor. El porcentaje de
animales supervivientes para cada grupo de tratamiento se muestra
en las figs. 14A-14C. La toxicidad de la formulación
nº 34 se muestra en la fig. 15 y la expresión de la luciferasa de
la formulación nº 34 se muestra en la fig. 16
Claims (18)
1. Composición de complejos de
plásmido-liposoma para su utilización en la
transfección de una célula huésped con un gen contenido en un
plásmido que comprende
moléculas de plásmido condensadas, estando
dichas moléculas condensadas con un agente de condensación
policatiónico y suspendidas en un medio acuoso que contiene un
soluto no electrolítico, presentando dicho medio una fuerza iónica
inferior a la fuerza iónica de una solución de 10 mM de una sal
ionizable monovalente, y
liposomas catiónicos que comprenden un lípido
formador de vesícula catiónica de cadena de diacilo, bromuro de
dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de
N-[1-(2,3-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DMRIE), bromuro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DORIE), o cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA), en la que dichos complejos presentan una proporción de
lípido de liposoma a plásmido superior a 5 nmoles de lípido de
liposoma/\mug de plásmido e inferior a 25 nmoles de lípido de
liposoma/\mug de plásmido y presentan un tamaño homogéneo inferior
a 200 nm.
2. Composición según la reivindicación 1, en la
que las moléculas de plásmido condensadas son moléculas de plásmido
de ADN que contienen un gen seleccionado de entre los genes que
codifican para el regulador de conductancia de transmembrana de
fibrosis quística, Factor VIII, interleucina-2 o
p53.
3. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que el agente de condensación es un
policatión seleccionado de entre histonas,
poli-l-glutamina, protamina,
melitina y polimixina B.
4. Composición según la reivindicación 3, en la
que el agente de condensación es una histona seleccionada de entre
la histona total, la histona 1 y la histona 4.
5. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la proporción de lípido de
liposoma a plásmido es de entre 8 y 18 nmoles de lípido de
liposoma/\mug de plásmido.
6. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho soluto se selecciona de
entre glucosa, sacarosa y dextrán.
7. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el lípido formador de la
vesícula catiónica de cadena de diacilo es
1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamino)propano
(DOTAP).
8. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que los liposomas catiónicos
comprenden además un lípido formador de vesícula neutra.
9. Composición según la reivindicación 8, en la
que los liposomas catiónicos comprenden además colesterol.
10. Composición según la reivindicación 9, en la
que los liposomas catiónicos se preparan a partir de DDAB y de
colesterol.
11. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que los liposomas catiónicos
presentan un revestimiento de superficie de cadenas de polímero
hidrofílico que comprenden un lípido formador de vesícula
derivatizado con tal polímero hidrofílico.
12. Composición según la reivindicación 11, en
la que por lo menos una parte del polímero hidrofílico se une al
lípido formador de vesícula mediante un enlace eficaz para liberar
las cadenas de polímero hidrofílico en respuesta a un estado
fisiológico existente o inducido.
13. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 11 ó 12, en la que los complejos de
plásmido-liposoma comprenden además un ligando unido
a los extremos distales de las cadenas de polímero hidrofílico para
una unión específica de ligando a una molécula de receptor en la
superficie de la célula objetivo.
14. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, en la que el polímero hidrofílico es el
polietilenglicol.
15. Composición de complejos de
plásmido-liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores para su utilización en la transfección
de una célula huésped en el pulmón de un sujeto con un plásmido de
ADN que contiene un gen seleccionado de entre los genes que
codifican para el regulador de conductancia de transmembrana de
fibrosis quística, interleucina-2 y p53.
16. Composición de complejos de
plásmido-liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores para su utilización en la transfección
de una célula huésped en un tumor en un sujeto con un plásmido de
ADN que contiene un gen seleccionado de entre los genes que
codifican para la interleucina-2 y el p53.
17. Procedimiento para la preparación de
complejos de plásmido-liposoma que comprende las
etapas siguientes:
seleccionar como agente de condensación para la
condensación de las moléculas de plásmido, un policatión
seleccionado de entre histonas,
poli-l-glutamina, protamina,
melitina o polimixina B;
seleccionar como medio para la suspensión de
dichas moléculas de plásmido condensadas, un medio acuoso que
contiene un soluto no electrolítico, presentando dicho medio una
fuerza iónica inferior a la fuerza iónica de una solución de 10 mM
de una sal ionizable monovalente;
seleccionar una proporción de lípido de liposoma
a plásmido superior a 5 nmol de lípido de liposoma/\mug de
plásmido e inferior a 25 nmoles de lípido de liposoma/\mug de
plásmido; en la que los complejos de
plásmido-liposoma presentan un tamaño homogéneo
inferior a 200 nm;
condensar dichas moléculas de plásmido; y
mezclar los plásmidos condensados con una
suspensión de liposomas catiónicos que comprenden un lípido formador
de vesícula catiónica de cadena de diacilo, bromuro de
dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de
N-[1-(2,3-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DMRIE), bromuro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio
(DORIE) o cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) para formar dichos complejos de
plásmido-liposoma.
18. Procedimiento según la reivindicación 17
para la preparación de un complejo de
plásmido-liposoma según cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 16.
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