ES2295018T3

ES2295018T3 - Encapsulacion de complejos bioactivos en liposomas.

Info

Publication number: ES2295018T3
Application number: ES00915983T
Authority: ES
Inventors: Paul Meers; Tong Shangguan; Donna Cabral-Lilly; Andrew Janoff; Patrick Ahl
Original assignee: Transave LLC
Current assignee: Transave LLC
Priority date: 1999-03-02
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2020-03-01
Also published as: AU3715900A; KR20010112301A; IL145117A0; WO2000051565A1; EP1156783A1; EA200100856A1; CZ20013103A3; ZA200107205B; DE60036861T2; US20090068256A1; PL351487A1; JP2002538096A; BR0008711A; ATE376413T1; DE60036861D1; EP1156783B1; WO2000051565A9; CN1349402A; CA2362485A1; NO20014231D0

Abstract

Procedimiento de encapsulación de un complejo bioactivo en un liposoma, que comprende las etapas siguientes: (a) disolver por lo menos un lípido anfifático en uno o más disolventes orgánicos; (b) combinar una primera suspensión acuosa que comprende un ácido nucleico con la disolución orgánica que contiene el lípido de la etapa (a) de modo que se forme una emulsión que comprende el ácido nucleico en el lípido; (c) añadir a la emulsión de la etapa (b) una segunda suspensión acuosa que comprende un policatión; (d) incubar la emulsión de la etapa (c) con el fin de permitir que el policatión haga contacto con el ácido nucleico formando así un complejo del ácido nucleico con el policatión dentro de las gotas de agua estabilizadas por el lípido; en el que dicho compuesto no es de diámetro mayor que el diámetro de las gotas; y (e) eliminar el disolvente orgánico de la suspensión de la etapa (d), de modo que se formen liposomas que comprenden el ácido nucleico acomplejado y el lípido.

Description

Encapsulación de complejos bioactivos en liposomas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de encapsulación de complejos, tales como ácidos nucleicos condensados con policationes, en liposomas, utilizando una emulsión estabilizada mediante lípidos anfifáticos como intermediarios en los que se forma el complejo. La presente invención se refiere asimismo al complejo encapsulado en liposomas así formado. El procedimiento de la presente invención se puede aplicar con el fin de proporcionar liposomas cargados con una variedad de compuestos que hasta ahora han sido difíciles de cargar en liposomas en una proporción elevada entre carga y lípido.

Antecedentes de la invención

Para que sean de utilidad como preparaciones farmacéuticas, los agentes bioactivos deberán ser capaces de alcanzar las dianas terapéuticas en una cantidad adecuada y terapéuticamente efectiva. Mientras muchos agentes bioactivos y fármacos son estables in vivo, otros se degradan rápidamente. Cuando dicha degradación tiene lugar antes de que el fármaco o agente bioactivo alcance su diana, llegará a la diana una cantidad no terapéutica del fármaco. Otros fármacos o agentes bioactivos son absorbidos por sistemas diferentes de las dianas, resultando otra vez en una disminución de la cantidad del fármaco o agente bioactivo que alcanza las dianas en cantidades farmacéuticamente efectivas. Ciertos fármacos polares no pueden penetrar en las células en absoluto debido a su incapacidad para cruzar las membrana celular de las dianas. La única forma en que dichos fármacos polares pueden penetrar en una célula es mediante internalización mediante endocitosis, que los expone a los enzimas degradadores liposomales en la célula. Otro problema adicional en la administración terapéutica de fármacos o agentes bioactivos es la incapacidad de administrar una concentración de fármaco o agente bioactivo suficientemente grande para ser terapéutica, evitando a la vez las toxicidades frecuentemente asociadas con algunos fármacos o agentes bioactivos. Estos problemas se han abordado mediante diferentes procedimientos. Cuando un fármaco o agente bioactivo no presenta toxicidad asociada al mismo, se puede administrar en dosis suficientemente elevadas para contrarrestar la degradación, la eliminación por los órganos no diana y la falta de dirección a los lugares en los que el fármaco o agente bioactivo es necesario. Sin embargo, muchos fármacos o agentes bioactivos son demasiado caros para permitir dicha pérdida o tienen toxicidades que impiden la administración de dosis tan altas. Se han utilizado varios procedimientos con el fin de superar algunos de los problemas que se encuentran en la administración de cantidades terapéuticas de fármacos o agentes bioactivos.

Uno de dichos procedimientos consiste en la encapsulación de los fármacos o agentes bioactivos en liposomas. Mientras que algunos fármacos o agentes bioactivos se pueden encapsular en liposomas en dosis terapéuticamente efectivas mediante la carga pasiva o mediante carga por gradiente, dichos procedimientos están limitados a fármacos o agentes bioactivos provistos de propiedades químicas específicas o a fármacos o agentes bioactivos que se pueden administrar en concentraciones relativamente bajas. Algunos compuestos bioactivos tales como las bases débiles o los ácidos débiles se pueden cargar remotamente en liposomas preformados con el fin de producir complejos muy concentrados. Este tipo de carga, que se refiere como carga remota o mediante gradiente, necesita que el fármaco o agente bioactivo sea transitoriamente capaz de pasar a través la bicapa lipídica del liposoma. Sin embargo, éste no es el caso para todas las moléculas bioactivas, muchas de las cuales no pueden pasar a través de la bicapa lipídica liposómica.

Un ámbito en el que los intentos de administrar niveles terapéuticos de fármacos o agentes bioactivos han tenido sólo un éxito parcial es el ámbito de de la terapia génica. La terapia génica implica la introducción de un gen exógeno en un tipo celular adecuado, seguido de la habilitación de la expresión del gen dentro de la célula a niveles terapéuticamente relevantes. Dicha terapia ha progresado, en un período relativamente corto de tiempo, desde la investigación básica a la introducción en las células de una pluralidad de genes, que comprende los de utilidad en el tratamiento de los cánceres (Duque et al., Histol. Histopathol.,13:231-242 (1998); Runnebaum et al., Anticancer Res., 17:2887-2890 (1997)). Mientras que el ADN desnudo, en algunos casos ha sido internalizado en las células (Wolff et al., Science, 247:1465-1468 (1990), generalmente no lo puede ser, debido a su gran tamaño y a su elevada carga negativa; además, el ADN desnudo no se puede diseñar con el fin de dirigirlo a células específicas. En consecuencia, el éxito de la terapia génica depende de la disponibilidad de "vectores" destinados a introducir el ADN y otros ácidos nucleicos en las células.

En la actualidad, existen dos grupos principales de sistemas de administración de ADN, víricos y no víricos. Los vectores víricos, incluyendo los virus deficientes en la replicación, tales como los retrovirus, adenovirus y los virus adeno-asociados, han sido hasta ahora los vehículos de administración de genes más ampliamente descritos (Robbins et al., Trends in Biotech., 16:35-40 (1998). Sin embargo, su utilización ha sido entorpecida por la inmunogenicidad de los componentes víricos, el riesgo potencial de reversión a un estado competente en la replicación, el potencial de introducir mutaciones tumorigénicas, la falta de mecanismos de dirección, las limitaciones en la capacidad del ADN, la dificultad de la producción a gran escala y otros factores [ver, por ejemplo, Lee y Huang, J. Bio. Chem., 271:8481-8487 (1996)].

Se han desarrollado dos tipos principales de vehículos no víricos como alternativas a los vectores víricos. Los complejos de liposomas catiónicos-ADN o "lipoplexes", [Felgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)], que comprenden lípidos catiónicos y ADN han sido hasta ahora las alternativas más ampliamente descritas a los vectores víricos para la administración de genes. Sin embargo, dichos lipoplexes tiene varias desventajas cuando se utilizan en la terapia génica, que comprenden una baja estabilidad, elevada citotoxicidad, no biodegradabilidad, pobre condensación y protección del ADN, sensibilidad al suero, tamaño grande y falta de especificidad tisular. Además, debido a que los lipoplexes están cargados positivamente, generalmente interaccionan de modo no específico con las superficies cargadas negativamente de la mayoría de las células; en consecuencia, generalmente no es posible dirigir los lipoplexes a lugares específicos in vivo.

Otra variante de los lipoplexes y el ADN implica ADN condensado con polilisina unido a liposomas aniónicos [Lee y Huang, J. Biol. Chem. 271:8481-8487 (1996)]. Ello necesita ciertos aniones lipídicos para generar la estructura activa. Los lipoplexes generados o no encapsulan el ADN por completo o deben formar dos o más capas de bicapas alrededor del ADN condensado. En el último caso la administración al citoplasma necesitaría que el ADN atravesase por lo menos tres membranas. Se esperaría que esto inhibiese la eficacia de transfección. En el primer caso, la exposición del ADN a las disoluciones salinas fisiológicas puede comprometer su estabilidad.

Los liposomas son un tipo adicional alternativo de vector no vírico y ofrecen varias ventajas para esta utilización en comparación con los lipoplexes. Por ejemplo, las bicapas liposomales se forman alrededor de los ácidos nucleicos encapsulados, protegiendo de este modo los ácidos nucleicos contra la degradación por las nucleasas del ambiente; los lipoplexes, por el contrario, no encapsulan el ácido nucleico, y en consecuencia, no los pueden secuestrar por completo de las nucleasas ambientales. Además, los liposomas pueden encapsular, en su compartimento acuoso, otros agentes bioactivos además de los ácidos nucleicos; los lipoplexes, por el contrario, no pueden debido a que no encapsulan un volumen acuoso. Además, se pueden generar liposomas con carga neutra o aniónica, contrariamente a la restringida naturaleza catiónica de los lipoplexes mencionados anteriormente. Así pues, los liposomas se pueden diseñar con el fin de evitar la citotoxicidad inducida por el vehículo de administración propiamente e incrementar su acumulación en lugares específicos de interés.

Aunque el concepto de encapsular agentes bioactivos en liposomas no es nuevo, muchos agentes han sido difíciles de encapsular en liposomas a un nivel cualquiera y otros han demostrado ser difíciles de encapsular en liposomas a los niveles que serían terapéuticamente efectivos. Se pueden encapsular muchas moléculas pequeñas en liposomas, pero se permeabilizan. Así, también ha sido difícil retener algunos agentes bioactivos encapsulados en liposomas en dosis, y durante tiempos, terapéuticamente efectivos. Por ejemplo, ha sido difícil encapsular moléculas particularmente grandes en un complejo dentro de un liposoma. También ha sido difícil utilizar muchas moléculas solubles en agua como agentes terapéuticos debido a que son incapaces de penetrar a través de la membrana celular. Cuando se encuentran establemente encapsulados en liposomas que se pueden fusionar con las membranas, es posible administrar dichos en fármacos en las células a las dosis terapéuticamente efectivas. El procedimiento de la presente invención permite formar liposomas que comprenden dichos fármacos o agentes bioactivos en formas terapéuticamente útiles.

Se han realizado varios intentos de encapsular ácidos nucleicos en liposomas. Éstos comprenden la utilización de procedimientos de formación de liposomas por evaporación en fase invertida [Fraley et al., J. Biol. Chem. 255:10431-10435 (1980)], deshidratación-rehidratación [Alizo et al., J. Micro. encap. 7:497-503 (1990)] y congelación-descongelación [Monnard et al., Biochem. Biophys. Acta, 1329:39-50 (1997)]. Sin embargo, cada uno de estos procedimientos adolece de varias limitaciones, que comprenden la necesidad de concentraciones iniciales bajas de ácidos nucleicos, lo que produce porcentajes significativos de vesículas vacías en los liposomas producidos, incapacidad de encapsular en liposomas de un modo reproducible cantidades de ADN suficientes para ser terapéuticamente efectivas en la diana y dificultades en la optimización de vehículos destinados a proteger los ácidos nucleicos encapsulados de la degradación por nucleasas.

Se han realizado intentos de producir complejos de ADN con agentes acomplejantes y a continuación encapsular el ADN acomplejado en liposomas. Los agentes acomplejantes son agentes que reaccionan con otras moléculas causando la precipitación o condensación de las moléculas. Los agentes acomplejantes de utilidad en la puesta en práctica de la presente invención se seleccionan de entre el grupo que comprende moléculas con cargas opuestas a las del agente bioactivo. El agente acomplejante se puede seleccionar de entre el grupo de moléculas cargadas que comprende espermina, espermidina, hexaminocobalto, iones de calcio, iones de magnesio, polilisinas, polihistidinas, protaminas, polianiones tales como heparina y sulfato de dextrano, iones de citrato, iones de sulfato. Por ejemplo, se conocen que los policationes de carga +3 o superior, por ejemplo poliaminas, polilisina y hexamino cobalto (III) [véase Chattoraj et al., J. Mol. Biol., 121:327-337 (1978); Gosule LC and Schellman JA. Nature 259:333-335 (1976); Vitello et al., Gene Therapy, 3:396-404 (1996); Widom et al., J. Mol. Biol., 144:431-453 (1980); Arscott et al., Biopolymers 30:619-630 (1990); Wilson et al., Biochem. 18:2192-2196 (1979)] son capaces de condensar moléculas de ADN, mediante interacciones con la pluralidad de cargas negativas en el ADN. Las poliaminas, por ejemplo espermidina (3+) y espermina (4+), se encuentran, contrariamente a otros tipos de policationes, naturalmente en las células vivas [véase, por ejemplo Ames and Dubin, J. Biol. Chem. 253:769-775 (1960); Tabor y Tabor, Annu. Rev. Biochem. 53:749-790 (1984). Es conocido que los niveles elevados de poliaminas existen en las células animales que proliferan activamente y se cree que son esenciales en éstas para el mantenimiento del crecimiento celular (Ames y Dubin, J. Biol. Chem., 253:769-775 (1960); Tabor and Tabor, Annu. Rev. Biochem. 53:749-790 (1984); Hafner et al., J. Bio. Chem. 254:12419-12426 (1979); Pegg. Biochem. J. 234:249-262 (1986)].

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La encapsulación en liposomas de ADN lineal condensado con espermina ya se intentó por Tikchonenko et al., Gene 63:321-330 (1988)]. Sin embargo, la concentración inicial de ADN fue baja, lo que resultó en una baja proporción entre ADN encapsulado y lípido liposómico (0,02-0,2 microgramos ADN por micromol de lípido). Además, dicha condensación de moléculas de ADN lineal en ausencia de agregación intermolecular de ADN necesitó del control de la concentración de espermina con un grado de precisión impracticable. Además, Baeza et al., [Ori. Life. Evol. Biosphere 21:225-252 (1992)] e [Ibañez et al., Biochem. Cell. Biol. 74:633-643 (1996)] reportaron la encapsulación en liposomas de entre 1 y 4 microgramos por micromol de ADN plásmido de SV40 condensado con espermina. Sin embargo, no se dializó contra tampones salinos ninguna de las dos preparaciones después de la producción de los liposomas, las cantidades de ADN encapsulado reportadas pueden realmente comprender un porcentaje significativo de ADN no encapsulado. Debido a que dichas formulaciones de liposomas no fueron expuestas a degradación mediante ADNasa con el fin de determinar el porcentaje de ADN realmente secuestrado en los liposomas, las elevadas cantidades reportadas probablemente no reflejan ADN realmente encapsulado.

La preparación y utilización eficaz de ácidos nucleicos encapsulados en liposomas necesita la utilización de suspensiones de ácidos nucleicos a concentraciones elevadas, con el fin de minimizar el porcentaje de liposomas vacío resultantes del procedimiento y maximizar la proporción de ADN:lípido. Sin embargo, la condensación del ADN a una concentración elevada mediante los procedimientos conocidos de producción de liposomas produce generalmente agregación intermolecular, lo que conduce a la formación de estructuras a base de ácidos nucleicos inadecuadas para la administración de genes. Los agregados grandes que se forman mediante la condensación del ADN directamente con un agente acomplejante no se pueden encapsular en liposomas con facilidad y las estructuras tan grandes (del orden del tamaño de las células) no pueden administrar materiales a las células diana. Por ejemplo, si los agregados son mayores de 500 nm, después de su administración intravenosa son eliminados rápidamente de la circulación debido a su tamaño. Por otra parte, los agregados mayores se pueden administrar a las células in vitro. Sin embargo, a veces los agregados son demasiado grandes como para ser internalizados por las células.

Por consiguiente, con el fin de administrar una pluralidad de fármacos en cantidades terapéuticamente efectivas a células diana, fue necesario proporcionar un procedimiento de producción de liposomas que contenga los agentes bioactivos acomplejados de tal modo que disminuya su permeabilidad a través de la membrana lipídica, proporcionando a su vez un procedimiento que limite el tamaño del complejo que se debe encapsular en los liposomas de tal modo que el producto terapéutico resultante se encuentre comprendido en el intervalo de tamaños terapéuticos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento de encapsulación de un complejo bioactivo en un liposoma, que comprende las etapas siguientes:

(a): disolver por lo menos un lípido anfifático en uno o más disolventes orgánicos;

(b): combinar por lo menos una suspensión acuosa que comprende una disolución que comprende una primera molécula seleccionada de entre el grupo que comprende un agente bioactivo y un agente acomplejante con la disolución orgánica que contiene el lípido de la etapa (a) de tal modo que se forme una emulsión en forma de micelas invertidas que comprenden la primera molécula y el lípido;

(c): añadir a la emulsión de la etapa (b) una segunda suspensión acuosa que comprende una segunda molécula seleccionada de entre el grupo que comprende un agente bioactivo y un agente acomplejante en el que la primera molécula es un agente bioactivo, la segunda molécula es un agente acomplejante y viceversa;

(d): incubar la emulsión de la etapa (c) con el fin de permitir que el agente acomplejante se ponga en contacto con el agente bioactivo formando de ese modo un complejo del agente bioactivo con el agente acomplejante dentro de las gotas de agua estabilizadas mediante el lípido; en las que dicho complejo no es superior en diámetro al diámetro de las gotas y,

(e): eliminar el disolvente orgánico de la suspensión de la etapa (d), con el fin de que se formen liposomas que comprenden el agente bioactivo acomplejado y el lípido.

El procedimiento de la presente invención es de utilidad en la preparación de liposomas de utilización terapéutica que comprenden una pluralidad de moléculas bioactivas acomplejadas con un agente acomplejante dentro del liposoma. Preferentemente, los liposomas son liposomas fusogénicos que mediante el procedimiento de la presente invención pueden encapsular en una pluralidad de moléculas. Estos liposomas fusogénicos son capaces de fusionarse con la membrana celular y permitir la administración de agentes bioactivos en cantidades terapéuticamente efectivas a las células y órganos. Además, el procedimiento de la presente invención también permite encapsular en los liposomas más de un agente bioactivo. Mediante el procedimiento de la presente invención se puede encapsular uno o más agentes bioactivos en el mismo liposoma a la vez. Si se encapsula más de un agente bioactivo en un liposoma mediante el procedimiento
de la presente invención, no es necesario que los dos agentes bioactivos se encuentren en forma de complejos.

Algunos agentes bioactivos pasan fácilmente a través de una bicapa lipídica y por consiguiente no son secuestrados de modo estable en los liposomas. Mediante la generación de complejos de los agentes bioactivos con un agente acomplejante, el agente bioactivo permanece en los liposomas. Un obstáculo importante ha sido el problema de encapsular agentes bioactivos complejos en los liposomas. Cuando se mezclan el agente bioactivo y el agente acomplejante en una disolución antes de la encapsulación en liposomas, a las concentraciones necesarias para una carga eficaz en los liposomas se forman muchos complejos que son incontroladamente grandes. El término complejo bioactivo se refiere a cualquier agente bioactivo unido a un agente acomplejante de tal modo que se produce un cambio en las propiedades físicas del complejo así formado, tal como la disminución del tamaño de la molécula bioactiva, disminución de la solubilidad del agente bioactivo, precipitación del agente bioactivo, condensación del agente bioactivo o el incremento del tamaño del complejo. Los liposomas que se fusionan con la membrana celular son capaces de administrar una gran cantidad de moléculas dentro de las células. Una ventaja de la presente invención es que, mediante la formación del complejo de agente bioactivo en micelas invertidas, se evita la formación de complejos inadecuadamente grandes que no se pueden encapsular en los liposomas de utilización terapéutica.

La formación de complejos que comprenden un compuesto bioactivo dentro de los liposomas tiene la ventaja de que es menos probable que dichos complejos se escapen del liposoma antes de la administración a la célula diana deseada. Además, la formación de un complejo puede concentrar una gran cantidad de agente bioactivo dentro del liposoma de tal modo que la proporción entre agente bioactivo y lípido es superior y la administración es eficaz. El procedimiento dado a conocer proporciona el acomplejamiento de materiales bioactivos con agentes acomplejantes en una emulsión seguido de la encapsulación en un liposoma de modo que se evita la formación de agregados demasiado grandes perjudiciales superiores a algunas micras del agente bioactivo y el agente acomplejante.

En una forma de realización, el procedimiento de la presente invención ha proporcionado un procedimiento destinado a encapsular complejos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, los ácidos nucleicos tales como el ADN, se acomplejan con un agente condensador en micelas al revés (invertidas), seguido de la formación de liposomas a partir de las micelas. Mientras que, tal como se ha descrito anteriormente, se realizaron intentos para encapsular ADN en liposomas, ninguno de dichos procedimientos tuvo éxito en preparar eficazmente ADN liposomal de utilización terapéutica.

La presente invención proporciona un procedimiento destinado a la preparación de un liposoma que comprende un ácido nucleico condensado, en cantidades de por lo menos 0,5 microgramos de ácido nucleico por micromol de lípido liposómico.

El componente lipídico de los liposomas comprende preferentemente un fosfolípido derivatizado y un lípido adicional, generalmente en una proporción que comprende entre aproximadamente 20 y 80 en moles % de fosfolípido derivatizado y entre aproximadamente 80 y 20 en moles % de lípido adicional. Los fosfolípidos derivatizados preferidos comprenden: conjugados de fosfatidiletanolamina (PE)-biotina; fosfatidiletanolaminas (NAPE) N-aciladas, tales como N-C12 DOPE; y conjugados de péptido-fosfatidiletanolamina, tales como Ala-Ala-Pro-Val DOPE. El lípido adicional puede ser uno cualquiera de entre la pluralidad de lípidos que comúnmente se incorporan en los liposomas; sin embargo, cuando el fosfolípido derivatizado es NAPE, el lípido adicional es preferentemente una fosfatidilcolina (por ejemplo DOPC). Preferentemente el ácido nucleico es ADN.

En la presente memoria se proporciona asimismo un procedimiento de preparación de una composición farmacéutica que comprende el liposoma y un vehículo farmacéuticamente aceptable; dicha composición se puede utilizar con el fin de administrar el ácido nucleico a las células de un animal.

Otros objetivos, características y ventajas se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la siguiente descripción de las formas de realización preferidas de la presente invención que se proporciona con el fin de darlas a conocer junto con los siguientes dibujos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Microfotografía de agregados de ADN de plásmido producidos con espermina (se mezclaron suavemente 200 microgramos de ADN de plásmido en 125 microlitros LSB con 7 mM de espermina en 125 microlitros LSB). (A) Observación mediante un microscopio de luz 15 minutos después de la incubación a temperatura ambiente (la barra representa 10 micras). (B) Observación Cryo-TEM (la barra representa 100 nm).

Figura 2. Representación esquemática del procedimiento de encapsulación de ADN. La condensación del ADN tiene lugar (I) en las gotas de agua estabilizadas con fosfolípidos que se han formado alrededor del ADN en el disolvente orgánico en bulto. Gotas separadas que contienen espermina transfieren (II) espermina a las gotas que contienen ADN mediante un contacto transitorio (III) e intercambio. Después de la condensación en la emulsión (IV), se forman vesículas mediante la evaporación del disolvente y se extruyen todavía más a un tamaño inferior (V).

Figura 3. Efecto del N-C12 DOPE liposomal sobre la agregación de ADN de plásmido mediada por espermina. Se realizó una diálisis a equilibrio en un dispositivo de diálisis de tres cámaras (véase el Ejemplo 4). La curva a la izquierda es de la diálisis sin liposomas, mientras que la curva desplazada a la derecha es de una diálisis que comprende una cámara con liposomas. Eje X: concentración de espermina (mM); Eje Y: turbidez (O.D. 400 nm).

Figura 4. Análisis mediante gel de agarosa de la protección del ADN de plásmido en formulaciones de NC-C12 DOPE/DOPC (70:30)-una alícuota de cada preparación después de la extrusión y diálisis se dividió y una parte se digirió con ADNasa I (véase el Ejemplo 9). Carril 1. Preparación sin espermina. Carril 2. Como el carril 1 pero digerido con ADNasa I. Carril 3. Preparación con espermina. Carril 4. Como el carril 3, pero digerido con ADNasa I.

Figura 5. Microfotografía con luz de las partículas en muestras de N-C12 DOPE/DOPC (70:30) preparadas tal como se describe en el Ejemplo 3 con el plásmido pZeoLacZ y espermina (A) en comparación con cuentas de poliestireno de un diámetro medio de 269 \pm 7 nm (B) (las barras representan 10 nm).

Figura 6. Microfotografías de TEM de congelación-fractura (véase el Ejemplo 7) de muestras de N-C12 DOPE/DOPC (70:30) preparadas tal como se describe en el Ejemplo 3. Las flechas apuntan a la partícula con material aparentemente encapsulado (la barra representa 400 nm).

Figura 7. Microfotografías de crio-TEM (véase el Ejemplo 8) de liposomas con N-C12 DOPE/DOPC y el plásmido pZeoLacZ sin espermina (a), o con espermina (b), dichos liposomas se prepararon tal como se describe en el Ejemplo 3. En (a) se observan estructuras similares a fibras fuera (estrella) y aparentemente dentro (flecha) de los liposomas. En (b), la flecha apunta hacia un toroide que parece plásmido de ADN condensado con policationes (las barras en (a) y (b) representan 100 nm). La microfotografía (c) representa una muestra de EPC producida con espermina. Las estructuras de toroide (flecha) y de barra doblada (estrella) se comparan con liposomas multilamelares (signo de libra) [la barra representa 50 nm].

Figura 8. Microfotografía de fluorescencia de células OVCAR3 confluentes después de una transfección (véase el Ejemplo 11) con las preparaciones de N-C12 DOPE/DOPC (70:30). Los ejemplos de liposomas se prepararon (véase el Ejemplo 3) con el ADN de plásmido pEGFP-C1 (a) con espermina o (b) sin espermina; también se ensayó una muestra (c) de liposomas N-C12 DOPE/DOPC (70:30) vacíos sin espermina más ADN del plásmido pEGFP-C1 añadido por fuera de los liposomas prefabricados. La cantidad de ADN de plásmido que se añadió a los liposomas vacíos en la muestra c fue igual a la masa total en cada una de las demás preparaciones. En el experimento se utilizaron cantidades iguales de liposomas.

Figura 9. Cuantificación de la expresión de EGFP en células OVCAR 3 transfectadas con pEGFP-C1, medida mediante el nivel de fluorescencia de EGFP. Los experimentos de transfección (a, b y c, véase el Ejemplo 11) fueron los mismos que en la leyenda de la figura anterior. Además, las formulaciones que se ensayaron fueron: d) liposomas de PC de huevo preparados con espermina y el plásmido pEGFP-C1 (véase el Ejemplo 3); y e) sin adiciones. Las células se lavaron y se marcaron con CBAM y a continuación se disolvieron en detergente con el fin de medir la fluorescencia de la EGFP y el azul de calceína (véase el Ejemplo 10; las barras de error son \pm s.d.).

Figura 10. Asociación de la actividad de transfección con el precipitado de lípido de N-C12-DOPE/DOPC (70:30) preparado con espermina y ADN del plásmido pEGFP-C1 (véase el Ejemplo 3); las disoluciones iniciales de ADN de plásmido y espermina contenían sacarosa 200 mM. Una vez extruídas y dializada, la mitad de la muestra se utilizó para la transfección sin manipulaciones adicionales (a), y las partículas de lípido del resto de la muestras se precipitaron por centrifugación y se lavaron una vez con HBSS antes de ser utilizadas para transfectar (b). También se preparó una muestra de N-C12-DOPE/DOPC (70:30) con solamente 200 mM sacarosa a la que se añadió externamente ADN de plásmido y espermina justo antes de la diálisis, en una cantidad igual a la utilizada en las otras muestras. El precipitado de esta muestra vacía (c) se preparó de la misma forma, a continuación, se utilizó la misma cantidad de lípido de cada una de las muestras para transfectar en las condiciones descritas en las leyendas de las figuras anteriores. Después de incubar durante la noche, las células se marcaron con CBAM y se midió la fluorescencia de EGFP y azul de calceina (las barras de error son \pm s.d.).

Figura 11. Transfección a través de liposomas N-C12 DOPE/DOPC (70:30) en fluido ascítico de ratón en comparación con el tampón. El líquido ascítico se obtuvo mediante el lavado de un ratón SCID portador de tumor tal como se describe en el ejemplo 13. Las células se incubaron con liposomas que contienen ADN plásmido (no un precipitado) a una concentración final de 10 mM de lípido total en HBSS o HBSS con fluido ascítico, a una concentración final de proteína de aproximadamente 3,5 mg/ml (véase el ejemplo 11). Después de 3 horas de incubación, la disolución de transfección se sustituyó con un medio que contenía suero y butirato durante aproximadamente 20 horas. La expresión de EGFP se midió a través de su fluorescencia (las barras de error son \pm s.d.).

Figura 12. Microfotografías de fluorescencia de células OVCAR-3 transfectadas (véase el Ejemplo 11) con liposomas N-C12 DOPE/DOPC (70:30) en tampón o en fluido ascítico de ratón. Se fotografiaron las células, tratadas tal como se describe en la leyenda de la Figura 12. La fotografía A representa una transfección sin fluido ascítico peritoneal y la fotografía B con fluido ascítico peritoneal; en estas imágenes las células son confluyentes.

Figura 13. Determinación mediante sonda fluorescente de la lamelaridad de los liposomas.

Figura 14. Fotografías de fluorescencia de tumores OVCAR-3 transfectados in vivo con liposomas N-C-12 DOPE/DOPC (70:30) que comprendían pEGFP-C1. El panel A muestra la expresión de EGFP. El panel B muestra la fluorescencia roja de los liposomas marcados con rodamina.

Figura 15. Microfotografías de fluorescencia de un tumor OVCAR-3, extraído de un lugar diferente al de la Figura 14, transfectado in vivo mediante liposomas N-C12 DOPE/DOPC (70:30) que contenían pEGFP-C1. El panel A muestra la expresión de EGFP. El panel B muestra la fluorescencia roja de los liposomas marcados con rodamina.

Figura 16. Microfotografías de fluorescencia de tejido tumoral control. El panel A muestra florescencia verde difusa. El panel B muestra la falta de fluorescencia roja de los liposomas marcados con rodamina.

Figura 17. La gráfica muestra la expresión de actividad \beta-galactosidasa en tejido muscular después de una transfección in vivo.

Descripción detallada de la invención

A continuación se indican las abreviaciones y los términos correspondientes, utilizados a lo largo de la presente memoria: PE, fosfatidil-dietanolamina; PC, fosfatidilcolina; EPC, fosfatidilcolina de huevo; DO-, dioleoil-; DOPC, dioleoil fosfatidilcolina; DOPE, dioleoil fosfatidiletanolamina; NAPE, fosfatidiletanolamina N-acilada; N-C12 DOPE, N-dodecanoil dioleoil fosfatidiletanolamina; AAPV-DOPE, Ala-Ala-Pro-Val-dioleoil fosfatidiletanolamina; CBAM acetoxi metil éster de azul de calceína; PBS, disolución salina tamponada con fosfato; LSB, tampón bajo en sal; HBSS, disolución salina equilibrada de Hank; EGFP, proteína verde fluorescente amplificada; SPLV, liposomas plurilamelares estables; MLV, liposomas multilamelares; ULV, liposomas unilamelares; LUV, liposomas unilamelares grandes; SUV, liposomas unilamelares pequeños; ADN ds, ADN de doble cadena; TEM, microscopía electrónica de transmisión.

La presente invención proporciona un procedimiento destinado a encapsular un complejo bioactivo en un liposoma que comprende las etapas siguientes:

(b): combinar por lo menos una suspensión acuosa que comprende una disolución que comprende una primera molécula seleccionada de entre el grupo que comprende un agente bioactivo y un agente acomplejante con la disolución orgánica de la etapa (a) que comprende lípido de tal modo que se forme una emulsión en forma de micelas invertidas que comprenden la primera molécula y el lípido;

(c): añadir a la emulsión de la etapa (b) una segunda suspensión acuosa que comprende una segunda molécula seleccionada de entre el grupo que comprende un agente bioactivo y un agente acomplejante en la que si la primera molécula es un agente bioactivo, la segunda molécula es un agente acomplejante o viceversa,

(d): incubar la emulsión de la etapa (c) con el fin de permitir que el agente acomplejando se ponga en contacto con el agente bioactivo formando así un complejo del agente bioactivo con el agente acomplejante dentro de las gotas de agua estabilizadas por el lípido; en el que dicho complejo no es de un diámetro superior al diámetro de las gotas y,

(e): eliminar el disolvente orgánico de la suspensión de la etapa (d), de modo que se formen liposomas que comprenden los complejos de agente bioactivo y lípido.

El procedimiento de la presente invención es de utilidad en la preparación de liposomas de utilización terapéutica que comprenden una amplia gama de moléculas bioactivas acomplejadas con un agente acomplejante dentro del liposoma. Preferentemente, los liposomas son liposomas fusogénicos que mediante el procedimiento de la presente invención pueden encapsular una pluralidad de moléculas. Estos liposomas fusogénicos son capaces de fusionarse con las membranas celulares y permitir la administración de agentes bioactivos en cantidades terapéuticamente efectivas a las células y órganos. Además, el procedimiento de la presente invención también permite encapsular más de un agente bioactivo en un liposoma. Uno o más agentes bioactivos se pueden encapsular a la vez en los mismos liposomas mediante el procedimiento de la presente invención. Si mediante el procedimiento de la presente invención se encapsula en los liposomas uno o más agentes bioactivos, no es necesario que cada uno de los agentes bioactivos se encuentre en forma de complejos.

El término "agentes bioactivos" se refiere a un compuesto o composición de materia que se puede administrar a animales, preferentemente humanos, con fines terapéuticos y diagnósticos. El procedimiento de la presente invención es de utilidad en la encapsulación de agentes bioactivos que comprenden, pero sin estar limitado por ello, agentes solubles en agua impermeables por las membranas tales como los ácidos nucleicos, nucleótidos o análogos de los nucleósidos tales como el 5' trifosfato de citosin-\beta-D-arabinofuranósido (araCTP), proteínas tales como el citocromo c, agentes anticancerosos polares tales como el cisplatino, ácido N-fosfono-acetil-L-aspártico o el ácido 5-fluoroorótico, derivados polares o cargados de los agentes anticancerosos, péptidos polares, inhibidores de las histonas desacetilasas tales como el butirato, etc. Los agentes bioactivos también comprenden, pero sin estar limitado por ello, los agentes seleccionados de entre el grupo que comprende ácidos nucleicos tales como ADN y ARN, agentes antivíricos tales como el acyclovir, zidovudine y los interferones; agentes antibacterianos tales como los aminoglicósidos, cefalosporinas y tetraciclinas; agentes antifúngicos tales como los antibióticos polieno, imidazoles y triazoles; agentes antimetabólicos tales como el ácido fólico y análogos de las purinas y pirimidinas; agentes antineoplásicos tales como los antibióticos de antraciclina y los alcaloides vegetales; carbohidratos, por ejemplo azúcares y almidones; aminoácidos, péptidos proteínas tales como las proteínas receptores celulares, inmunoglobulinas, enzimas, hormonas, neurotrasmisores y glicopropteínas; colorantes; radiomarcadores tales como los radioisótopos y compuestos marcados con radioisótopos; compuestos
radioopacos; compuestos fluorescentes; compuestos midriáticos; broncodilatadores; anestésicos locales y similares.

El término complejo bioactivo se refiere a cualquier agente bioactivo unido a un agente acomplejante de tal modo que el complejo así formado resulta en un cambio en propiedades físicas tales como la disminución del tamaño de la molécula bioactiva, disminución en la solubilidad del agente bioactivo, la precipitación del agente bioactivo, la condensación del agente bioactivo o el incremento en el tamaño del complejo.

Las emulsiones de agua en aceite que comprenden las micelas invertidas han sido utilizadas con anterioridad con el fin de estudiar la cinética enzimática [p. eje. Bru et al., Biochem. J. 310:721-739 (1995)] y con el fin de producir liposomas [por ejemplo Szoka et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA, 75:4194-4198 (1978); Gruner et al., Biochem. 24:2833-2842 (1984)], sin embargo, la utilización de dichas emulsiones con el fin de modular el acomplejamiento de dos compuestos con el fin de cargar liposomas no ha sido publicada con anterioridad.

Las emulsiones se pueden producir mediante varios procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Se puede utilizar sonificación, agitación en vortex, agitación mecánica, mezclado estático, homogeneización, inyección, microfluidificación, molinos de coloidales, emulsionantes a presión y/o molinos Kady con el fin de preparar emulsiones de varios tipos que comprenden una pluralidad de órdenes de adición de los materiales. Las emulsiones de la presente invención se forman en dos etapas de modo que por lo menos uno de los componentes, el agente bioactivo o el agente acomplejante se pre-secuestra en las gotas de agua de la emulsión estabilizada por el lípido antes de la adición de la dispersión acuosa del otro agente.

Con la eliminación del disolvente de la emulsión estabilizada por el lípido, se forman los "liposomas". El disolvente se puede eliminar mediante una pluralidad de procedimientos que comprenden, sin estar limitado por ello, evaporación rotativa y corriente de nitrógeno.

Los "liposomas" son estructuras autoensambladas que comprenden una o más bicapas de lípido, cada una de las cuales comprende dos monocapas que comprenden moléculas de lípido anfifático en orientación opuesta. Los lípidos anfifáticos comprenden una región de cabeza polar (hidrófila) covalentemente unida a una o más cadenas acílicas no polares (hidrófobas). Los contactos no energéticamente favorables entre las cadenas acílicas hidrófobas y el medio acuoso circundante induce la reorganización de las moléculas lipídicas anfifáticas de tal modo que sus cabezas polares se orienten hacia las superficies de la bicapa, mientras que las cadenas acílicas se protegen efectivamente del contacto con el ambiente acuoso.

Los liposomas [ver, por ejemplo Cullis et al., Biochem. Biophys. Acta, 559:399-420 (1987); nuevo 1995] pueden tener una sola bicapa lipídica (liposomas unilamelares, "ULV"), o varias bicapas lipídicas (liposomas multilamelares, "MLV" o "SPLV"). Cada bicapa lipídica rodea, o encapsula, un compartimento acuoso. Dada esta encapsulación de un volumen acuoso dentro de una barrera protectora de moléculas de lípido, los liposomas son capaces de secuestrar las moléculas encapsuladas, por ejemplo ácidos nucleicos, de los efectos degradantes de factores, por ejemplo enzimas nucleasas, presentes en el ambiente exterior. dicha protección del contenido encapsulado se demuestra, en el caso de las moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante el tipo de análisis mediante geles de agarosa mostrado en el Ejemplo 9, el resultado de los cuales se muestra en la Figura 4.

Los liposomas pueden presentar una pluralidad de tamaños, por ejemplo un diámetro medio tan pequeño como 25 nm o tan elevado como 10.000 nm o más. El tamaño está afectado por una pluralidad de factores, por ejemplo la composición del lípido y el procedimiento de preparación, conocidos por los expertos en la materia, y se determina mediante varios procedimientos, tales como la dispersión casi-elástica de luz, también conocida por los expertos en la materia.

Se puede aplicar una pluralidad de procedimientos, también conocidos por los expertos en la materia, tales como sonificación, homogeneización, aplicación de una prensa French y molido con el fin de preparar liposomas del tamaño menor a partir de liposomas mayores. También se puede utilizar extrusión [ver, por ejemplo la patente US nº 5.008.050] con el fin de reducir el tamaño de los liposomas, esto consiste en producir liposomas de un tamaño medio predeterminado forzando los liposomas, a presión, a través de los poros de un filtro con tamaños seleccionados definidos. También se puede utilizar filtración de flujo tangencial (WO89/008846) con el fin de regularizar el tamaño de los liposomas, es decir, producir una población de liposomas con menor heterogeneidad de tamaños y una distribución de tamaños más homogénea. El contenido de estos documentos se incorpora en la presente memoria a título de referencia.

Los liposomas de la presente invención pueden ser unilamelares, u oligolamelares, y pueden tener tamaños iguales a los de los liposomas producidos mediante uno cualquiera de los procedimientos dados a conocer anteriormente en la presente memoria. Sin embargo, en una forma de realización preferida de la presente invención, los liposomas son liposomas unilamenlares con números de tamaños medios comprendido entre 50 y 300 nm.

Los liposomas se componen de una pluralidad de lípidos, tanto anfifáticos como noanfifáticos, obtenidos a partir de varias fuentes, tanto naturales como sintéticas. Los lípidos liposomales adecuados comprenden, sin estar limitado por ello, fosfolípidos tales como la fosfatidilcolinas ("PC"), fosfatidiletanolaminas ("PE"), fosfatidilserinas ("PS"), fosfatidilglicerles ("PG"), fosfatidilinositol ("PI") y ácidos fosfatídicos ("PA"). Dichos fosfolípidos generalmente tienen dos cadenas acílicas, siendo las dos saturadas, las dos insaturadas o una saturada y la otra insaturada; dichas cadenas comprenden, sin que ello sea limitativo, cadenas de: miristato, palmitato, estearato, oleato, linoleato, linolenato, araquidato, araquidonato, behenato y lignocerato.

Los fosfolípidos también pueden estar derivatizados, mediante la unión a éstos de un grupo reactivo adecuado. Dicho grupo es generalmente un grupo amino, y en consecuencia, los fosfolípidos derivatizados son típicamente fosfatidiletanolaminas. Las diferentes partes adecuadas para la unión a PE comprenden, sin que ello sea limitativo: cadenas acílicas (WO98/16199), de utilidad para incrementar la fusionabilidad de los liposomas a las membranas biológicas, péptidos (WO98/16240), de utilidad para desestabilizar los liposomas en la proximidad de las células diana; partes de biotina y maleimido (patentes US nº 5.059.421 y nº 5.399.331, respectivamente), de utilidad en la unión a los liposomas de partes directoras tales como anticuerpos y, varias moléculas tales como gangliósidos, polialquiléteres, polietilenglicoles y ácidos dicarboxílicos orgánicos (véase por ejemplo las patentes US nº 5.013.556, nº 4.920.016 y nº 4.837.028). El contenido de los documentos anteriormente citados se incorpora a la presente memoria a título de referencia.

En consecuencia, en las formas de realización más preferidas de la presente invención, los liposomas preparados mediante el procedimiento de la presente invención comprenden un fosfolípido derivatizado, adaptado con el fin de amplificar la administración de su contenido. Los liposomas pueden, aunque no es necesario, comprender también lípidos adicionales, incorporando dichos lípidos adicionales en los liposomas por varias razones evidentes para los expertos en liposomología. Dichas razones comprenden, sin que ello sea limitativo, estabilizar o dirigir los liposomas, así como alterar todavía más el comportamiento fármacocinético de los liposomas. Los lípidos adicionales adecuados comprenden cualquiera de los lípidos comúnmente reconocidos como adecuados para la incorporación en liposomas, comprendiendo, sin que ello sea limitativo, fosfolípidos, glicolípidos y esteroles.

Preferentemente, los liposomas de la presente invención comprenden un componente lípido que comprende un fosfolípido derivatizado y un lípido adicional. El fosfolípido derivatizado es de fórmula:

1

en la que: Z se selecciona de entre el grupo que comprende biotina, una parte maleimídica, un grupo designado R^{3} y un grupo de fórmula X-Y; X es un conector seleccionado de entre el grupo que comprende un enlace simple y el grupo R^{4} ; e Y es un péptido escindible mediante un enzima y comprende una secuencia de aminoácidos que es el sustrato de una proteasa secretada por las células. Cada uno de entre R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} es un grupo de fórmula

-OC(O)(CH_{2})_{n1}(CH=CH)_{n2}(CH_{2})_{n3}(CH=CH)_{n4}(CH_{2})_{n5}(CH=CH)_{n6}(CH_{2})_{n7}(CH=CH)_{n8}(CH_{2})_{n9}CH_{3}

en la que: n1 es cero o un entero entre 1 y 22; n3 es cero o un entero entre 1 y 19; n5 es cero o un entero entre 1 y 16; n7 es cero o un entero entre 1 y 13; n9 es cero o un entero entre 1 y 10 y cada uno de n2, n4, n6 y n8 son cero o 1. Cada uno de n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 y n9 son el mismo o diferentes en cada ocurrencia.

Para R^{1} y R^{2}, la suma de n1 + 2n2+ n3 + 2n4+ n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 es independientemente un entero entre 12 y 22, en el que para R^{3} y R^{4}, la suma de n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 es independientemente un entero entre 2 y 22. Dichos fosfolípidos derivatizados comprenden preferentemente entre aproximadamente 20 y 80 por ciento en moles de lípido liposomal.

Cuando R^{3} es -C(O)(CH_{2})_{n1}(CH=CH)_{n2}(CH_{2})_{n3}(CH=CH)_{n4}(CH_{2})_{n5}(CH=CH)_{n6}(CH_{2})_{n7} (CH=CH)_{n8}(CH_{2})_{n9}CH_{3}, el fosfolípido derivatizado es una fosfatidiletanolamina N-acilada ("NAPE", véase WO98/16199). Preferentemente, R^{3} es entonces -OC(O)(CH_{2})_{n1}CH_{3}, más preferentemente -OC(O)(CH_{2})_{10}CH_{3}.

Preferentemente, el fosfolípido derivatizado es una PE N-acilada. Dichas NAPE son de utilidad en la preparación de liposomas fusogénicos y son preferidas en la preparación de liposomas que comprenden el fármaco o agente bioactivo acomplejado de la presente invención.

La desestabilización de la bicapa inducida por NAPE induce la fusión de la bicapa a las membranas biológicas en la proximidad y por consiguiente, incrementa la fusogenicidad de las bicapas [Shangguan et al., Biochem. Biophys. Acta, 1368:171-183 (1998)]. La fusogenicidad incrementada, a su vez, se puede utilizar con el fin de administrar agentes bioactivos encapsulados, tales como ácidos nucleicos u otros agentes que no pueden cruzar la membrana celular, a las células, mediante la combinación de las células con liposomas bajo condiciones, por ejemplo la presencia de concentraciones adecuadas de Ca^{2+} y Mg^{2+} . El contacto entre liposomas y células resulta en la liberación de los agentes bioactivos encapsulados en los liposomas próximos a las células y/o directamente en el citoplasma de las células como resultado de la fusión entre el liposoma y la membrana celular. Dicha administración se produce in vivo o in vitro.

Cuando R^{3} es una cadena acílica o el péptido, y por consiguiente, cuando el fosfolípido derivatizado es un NAPE o conjugado de péptido y lípido, por lo menos uno de entre R^{1} y R^{2} es preferentemente una cadena acílica insaturada, es decir, por lo menos uno de n2, n4, n6 y n8 en ésta es igual a 1. Las cadenas acílicas insaturadas comprenden, sin limitaciones, cadenas de palmitoleato, oleato, linoleato, linolenato y araquidonato. Preferentemente, la cadena acílica insaturada es una cadena de oleato ("-OC(O)(CH_{2})_{7}CH= CH(CH_{2})_{7}CH_{3}"). Más preferentemente, tanto R^{1} como R^{2} son cadenas de oleato, es decir, el fosfolípido derivatizado es:

2

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en la que Z es R^{3} o X-Y. Más preferentemente, el fosfolípido derivatizado es entonces:

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3

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es decir, "N-C12 DOPE".

Cuando el fosfolípido derivatizado es N-C12 DOPE, el lípido liposomal preferentemente también comprende una fosfatidilcolina, preferentemente una PC con por lo menos una cadena acílica insaturada y más preferentemente dioleoil fosfatidilcolina. Preferentemente, el lípido liposomal comprende aproximadamente 70 en moles % de N-C12 DOPE y aproximadamente 30 en moles % DOPC (es decir, es una formulación "70:30" de N-C12 DOPE y DOPC, en la que a las concentraciones de lípidos liposomales se las refiere en la presente memoria como proporciones y en la que dichas proporciones son una indicación del porcentaje relativo de lípido liposomal de los lípidos particulares a los que se hace referencia).

El lípido liposomal también puede comprender un "lípido con el grupo de cabeza modificado", es decir, un lípido con un grupo polar derivatizado mediante la unión a éste de una parte capaz de inhibir la unión de las proteínas del suero a un liposoma que comprende el lípido. La incorporación de lípidos con el grupo de cabeza modificado en los liposomas altera así su comportamiento farmacocinético, de tal modo que los liposomas permanecen en la circulación de un animal durante un período de tiempo más largo del que de otro modo sería el caso (véase, por ejemplo Blume et al., Biochem. Biophys. Acta, 1149:180 (1993); Gabizon et al., Pharm. Res., 10(5):703 (1993); Park et al., Biochim. Biophys. Acta, 257:1108 (1992); Woodle et al., patente US nº 5.013.556; Allen et al., patente US nº 4.837.028 y 4.920.016; el contenido de estos documentos se incorpora a la presente memoria a título de referencia).

Los lípidos con grupos de cabeza modificados son típicamente fosfatidiletanolaminas (PE), por ejemplo dipalmitoil fosfatidiletanolamina ("DPPE"), palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina ("POPE") y dioleoil fosfatidiletanolamina ("DOPE"), entre otros. Dichos lípidos tienen grupos de cabeza generalmente derivatizados con polietilenglicol, o con un ácido orgánico dicarboxílico, tal como ácido succínico o glutámico ("GA"), o sus correspondientes anhídridos. La cantidad de lípido con el grupo de cabeza modificado incorporado en el vehículo de lípido depende del número de factores conocido por los expertos en la materia. Éstos comprenden, pero sin ser limitativo: el tipo de lípido y el tipo de modificación del grupo de cabeza; el tipo y tamaño del vehículo y la utilización terapéutica para la que se pretende utilizar la formulación. Típicamente, entre aproximadamente 5 en moles % y aproximadamente 20 en moles % del lípido en un vehículo lipídico que contienen lípido con el grupo de cabeza modificado es lípido con el grupo de cabeza modificado.

Los agentes acomplejantes comprenden en general, aunque ello no es limitante, un grupo de carga opuesta a la del agente bioactivo que comprende espermina, espermidina, examino cobalto, iones de calcio y magnesio, polilisinas, polihistidinas, protaminas, polianiones tales como heparina y sulfato de dextrano, iones citrato y sulfato. Los expertos en la materia reconocerán otros agentes acomplejantes de utilidad en el procedimiento de la presente invención.

Los ácidos nucleicos condensados encapsulados en los liposomas son ADN, que comprende ADN genómico, ADN de plásmido y ADNc o ARN; preferentemente, el ácido nucleico encapsulado en los liposomas es ADN, más preferentemente es ADN de plásmido cerrado (circular). Los ácidos nucleicos condensados se encapsulan en liposomas a un nivel de por lo menos 0,5 microgramos por micromol de lípido liposomal, o por lo menos aproximadamente 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, ó 2 microgramos por micromol. Más preferentemente, los liposomas comprenden entre aproximadamente 2 microgramos de ácido nucleico por micromol de lípido y aproximadamente 20 microgramos por micromol. Tal como se utiliza en relación con los ácidos nucleicos, "condensado" se refiere a ácidos nucleicos que se han combinado con uno o más policationes de tal modo que las cadenas del ácido nucleico están empaquetadas más apretadamente de lo que lo estarían en el caso de no existir los policationes. dicho empaquetamiento permite que los ácidos nucleicos se encapsulen en los liposomas, pero dejando a los ácidos nucleicos en una conformación transfectable y preparada para la transcripción.

En consecuencia, en una forma de realización preferida de la presente invención, el procedimiento prepara liposomas que comprenden un ADN condensado y lípido liposomal que comprende aproximadamente 70 en moles % de N-C12 DOPE y aproximadamente 30 en moles % de DOPC. Dichos liposomas comprenden por lo menos 0,5 microgramos de ADN condensado por micromol de lípido.

Los liposomas proporcionados por el procedimiento de la presente invención pueden comprender uno o más agentes bioactivos además del agente bioactivo condensado. Los agentes bioactivos que se pueden asociar con los liposomas comprenden, aunque sin quedar limitado a éstos: agentes antivíricos tales como el acyclovir, zidovudine e interferones; agentes antibacterianos tales como aminoglicósidos, cefalosporinas y tetraciclinas; agentes antifúngicos tales como antibióticos de poliene, imidazoles y triazoles; agentes antimetabólicos tales como ácido fólico y análogos de purinas y pirimidinas, agentes antineoplásicos tales como los antibióticos de antraciclina y alcaloides vegetales; esteroles tales como colesterol; carbohidratos, por ejemplo, azúcares y almidones; aminoácidos, péptidos, proteínas tales como receptores celulares proteicos, inmunoglobulinas, enzimas, hormonas, neurotransmisores y glicoproteínas; colorantes; compuestos radiomarcadores tales como radioisótopos y compuesto marcados con radioisótopos; copuestos radioopacos, compuestos fluorescentes; compuestos midriáticos; broncodilatadores; anestésicos locales y similares.

Las formulaciones de agentes liposomales bioactivos pueden amplificar el índice terapéutico del agente bioactivo, por ejemplo, mediante el tamponamiento de la toxicidad del agente. Los liposomas también pueden reducir la velocidad a la que un agente bioactivo se elimina de la circulación de los animales. En consecuencia, la formulación en liposomas de agentes bioactivos puede resultar en que se tenga que administrar una menor cantidad del agente con el fin de lograr el efecto deseado.

Los liposomas de la presente invención se pueden deshidratar, almacenar y a continuación reconstituir de tal modo que se retenga una proporción sustancial de su contenido interno. La deshidratación de los liposomas generalmente necesita la utilización de un protector hidrófilo del secado tal como los azúcares disacáridos tanto dentro como fuera de las superficies de la bicapa de los liposomas (véase la patente US nº 4.880.635, el contenido de la cual se incorpora a la presente memoria a título de referencia). Se cree asimismo que dicho compuesto hidrófilo evita la reorganización de los lípidos de los liposomas, de tal modo que su tamaño y contenido se mantienen durante el proceso de secado y a través de la siguiente rehidratación. Las propiedades adecuadas de dichos protectores del secado son las de ser fuertes aceptores de enlaces de hidrógeno y poseer características estereoquímicas que preserven los espacios intermoleculares de los componentes de la bicapa de los liposomas. Por el contrario, se puede omitir el protector del secado si la preparación de liposomas no se congela antes de su deshidratación y si después de la deshidratación queda suficiente agua en la preparación.

También se proporciona en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y los liposomas de la presente invención. Dicha composición es de utilidad, por ejemplo, con el fin de administrar ácidos nucleicos a las células de un animal. Tal como se utiliza en la presente memoria "vehículos farmacéuticamente aceptables" son aquellos medios generalmente aceptables para su utilización en relación con la administración de lípidos y liposomas, que comprende las formulaciones de agentes liposomales bioactivos, a los animales, incluidos los seres humanos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se formulan generalmente de acuerdo con una pluralidad de factores conocidos por los expertos en la materia y comprenden, sin que sea limitativo: el agente bioactivo liposomal particular utilizado, su concentración, estabilidad y biodisponibilidad pretendida; la enfermedad, trastorno o condición que se debe tratar con la composición de liposomas; el sujeto, su edad, tamaño y condiciones generales y la vía de administración de la composición que se pretende utilizar, por ejemplo, nasal, oral, oftálmica, tópica, transdermal, vaginal, subcutánea, intramamaria, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular (véase, por ejemplo, Nairn (1985), el contenido del cual se incorpora en la presente memoria a título de referencia). Los vehículos farmacéuticamente aceptables típicos utilizados para la administración parenteral de agentes bioactivos comprenden, por ejemplo, D5W y disoluciones acuosas que comprenden 5% en peso por volumen de dextrosa, y disolución salina fisiológica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener ingredientes adicionales, por ejemplo, los que incrementan la estabilidad del ingrediente activo incluido, tales como conservantes y antioxidantes.

Además en la presente memoria se proporciona un procedimiento de encapsulación de ácidos nucleicos, p. eje. ADN, en liposomas que comprende las etapas siguientes: (a) combinar una suspensión acuosa de ácido nucleico con una disolución orgánica que comprende un lípido, por ejemplo un fosfolípido derivatizado y un lípido adicional, con el fin de formar una suspensión de micelas al revés (invertidas) que comprenden el ácido nucleico y el lípido; (b) añadir un policatión a la suspensión micelar, con el fin de condensar el ácido nucleico dentro de las micelas invertidas; y (c) eliminar el disolvente orgánico de la suspensión de la etapa (b), con el fin de generar liposomas que comprenden el ácido nucleico y el lípido de las micelas invertidas. La proporción entre ácido nucleico y lípido liposómico que se logra mediante el procedimiento de encapsulación es de por lo menos 0,5 microgramos de ácido nucleico por micromol de lípido.

Los lípidos de utilidad en la práctica de la presente invención son, tal como se ha descrito anteriormente, los lípidos reconocidos como adecuados para su incorporación en liposomas, de por sí o con otros lípidos adicionales; éstos comprenden: fosfolípidos, glicolípidos, esteroles y sus derivados. Los disolventes orgánicos utilizados en el presente procedimiento son los adecuados para disolver lípidos durante el transcurso de la prelación de liposomas; éstos comprenden, sin ser limitativo, metanol, etanol, dimetilsulfóxido, cloroformo y mezclas de los mismos. Preferentemente, el disolvente orgánico es cloroformo.

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Los policationes de utilidad en el procedimiento de la presente invención con el fin de condensar los ácidos son los compuestos químicos que tienen tres o más grupos ionizables que se pueden utilizar para condensar ácidos nucleicos, otros agentes bioactivos o fármacos; éstos comprenden, sin ser limitativo, polilisina, poliaminas (por ejemplo espermina y espermidina), examino cobalto (III), polihistidina, polietilenimina y similares. Preferentemente, el policatión es espermina. Los ácidos nucleicos de utilidad en la práctica de la presente invención comprenden, ADN, por ejemplo ADN genómico, ADNc y ADN de plásmido, lineal o cerrado, así como también ARN. Los ácidos nucleicos se suspenden en un medio acuoso mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, agitado en vortex de las macromoléculas suspendedoras. Los medios acuosos adecuados son disoluciones acuosas de una pluralidad de aditivos, tales como agentes tamponantes, y se encuentran sustancialmente libres de ciertos ingredientes, tales como sales y enzimas nucleasas. Dichos medios comprenden, sin ser limitativo, tampones de baja salinidad ("LBS", véase el Ejemplo 3 más adelante en la presente memoria).

Las emulsiones de agua en aceite estabilizadas mediante fosfolípidos contienen micelas invertidas. Las micelas invertidas [véase Bru et al., Biochem. J. 310:721-739 (1995)] son estructuras anfifáticas a base de lípidos en las que los dominios hidrófilos de los lípidos se encuentran secuestrados en el interior de la superficie de las micelas, mientras que los dominios hidrófobos de los lípidos se encuentran organizados alrededor del exterior.

Las emulsiones con micelas invertidas se forman, tal como se ha descrito anteriormente y en la Figura 2 más adelante en la presente memoria, y protegen a los agentes bioactivos, que comprenden los ácidos nucleicos secuestrados en ellas de los contactos intermoleculares que de otro modo conducirían a su agregación, en presencia de agentes acomplejantes, e inutilidad para su incorporación en liposomas. Dicho procedimiento se realiza con el fin de maximizar el porcentaje de liposomas que comprenden los complejos deseados.

Dentro de la emulsión, los complejos se forman mediante el intercambio de los agentes acomplejantes que se añaden, tales como policationes, o los agentes bioactivos, entre los compartimentos acuosos de las micelas invertidas en la emulsión [ver, por ejemplo Bru et al., FEBS, 282:170-174 (1991); Fletcher et al., J. Chem. Soc. Faraday Trans. I. 83:985-1006 (1987)]. En el caso de la encapsulación de complejos de ADN, los policationes adecuados son cualquiera de los policationes de utilidad para condensar ácidos nucleicos. Por ejemplo, se han utilizado espermina y espermidina [por ejemplo, Chattoraj et al., J. Mol. Biol. 121:327-337 (1978) y Gosule et al., Nature, 259:333-335 (1976), el contenido de los cuales se incorpra a la presente memoria a título de referencia] in vitro para condensar plásmidos individuales, pero solamente a bajas concentraciones de ADN, con el fin de evitar la agregación de los plásmidos condensados. Dichas concentraciones fueron lo suficientemente mínimas para que, si se hubiese intentado la encapsulación en liposomas de los ácidos nucleicos condensados, se produjese un número significativo de liposomas vacíos (es decir que no contienen ADN). La polilisina y el hexamino cobalto también se encuentran disponibles para la condensación de ácidos nucleicos.

Las concentraciones de policationes adecuadas para condensar los ácidos nucleicos son las concentraciones que producen la neutralización de un número de cargas negativas en los ácidos nucleicos, por ejemplo aproximadamente el 90% o más de la cargas negativas en el caso del ADN [Wilson et al., Biochem, 18:2192-2196 (1979)]. Los expertos en la materia pueden determinar las concentraciones adecuadas u óptimas de policationes para el ácido nucleico que se debe condensar, el policatión utilizado, la concentración de ácido nucleico y la valencia del policatión.

Además, factores adicionales, bien conocidos por los expertos en la materia, pueden afectar a las concentraciones de policationes adecuadas para condensar los agentes bioactivos tales como los ácidos nucleicos. Por ejemplo, los NAPE tales como N-C12 DOPE son portadores de una carga negativa neta, mediante la cadena acílica adicional; en consecuencia dichos lípidos pueden interactuar con las moléculas positivamente cargadas, disminuyendo de este modo el conjunto de policationes disponible para condensar los ácidos nucleicos.

En consecuencia, en dichos casos, puede ser necesario añadir una cantidad de policatión superior a la de otro modo necesaria para la condensación de los ácidos nucleicos. Dichas cantidades adicionales suficientes de policationes se pueden determinar mediante varios procedimientos, que comprenden, por ejemplo, el tipo de experimentos de partición que se dan a conocer en el Ejemplo 4. Dichos experimentos proporcionan datos (véase la Figura 3) que muestran la concentración adicional de policationes necesaria para la condensación del ácido nucleico. Por ejemplo, con las concentraciones de ácidos nucleicos y lípidos utilizadas en el Ejemplo 3, para la condensación de ADN de plásmido fue suficiente 0,6 mM de espermina, pero dicha cantidad se incrementó a 0,85 mM en presencia de NAPE N-C12 DOPE a la concertación publicada. Sin embargo, se pueden utilizar concentraciones de policationes superiores a éstas, es decir, superiores a la mínima necesaria. Por ejemplo, de nuevo contemplando las condiciones del Ejemplo 3 como ejemplificativas, se encontró que una concentración final de espermina comprendida entre 8 y 20 mM en la emulsión fue óptima para la neutralización de la carga de los ácidos nucleicos y lípidos.

Los expertos en la materia pueden determinar las concentraciones de ácidos nucleicos y lípidos adecuadas en la práctica de la presente invención. Por ejemplo (véase el Ejemplo 3, más adelante en la presente memoria), con el fin de encapsular ADN de plásmido condensado en liposomas esféricos de 200 nm se combinaron 200 microgramos de ADN del plásmido pZeoLacZ en 125 microlitros de LSB con 30 micromoles de una combinación de N-C12 DOPE y DOPC en una proporción de 70:30.

En consecuencia, las formas de realización preferidas de la presente invención se practican con un ácido nucleico condensado que es un ADN de plásmidos, un lípido que comprende un fosfolípido derivatizado, por ejemplo N-C12 DOPE, cloroformo y espermina, por ejemplo a una concentración de aproximadamente 1 mM o superior.

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Además, en la presente memoria se proporciona un procedimiento destinado a la transfección de las células de un animal con un agente bioactivo tal como un ácido nucleico, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de poner en contacto las células con un liposoma de la presente invención que comprende el ácido nucleico condensado. Dicho contacto es in vitro, en cuyo caso, se añade al medio de cultivo que rodea las células una composición que comprende el liposoma o in vivo, en cuyo caso el liposoma se administra en una composición farmacéutica que también comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y se administra al animal mediante uno cualquiera de los procedimientos estándar de administración de dichas composiciones a los animales.

El contacto in vivo, especialmente cuando se desea dirigirlo a una diana específica, se auxilia mediante la incorporación en el liposoma de un medio destinado a dirigir el lipoma a un lugar específico, por ejemplo mediante la conjugación de un anticuerpo al liposoma mediante estreptavidina, lo que produce que el contenido del liposoma se libere preferentemente en ciertos lugares, por ejemplo mediante la incorporación de NAPE o conjugados de péptido-lípido en los liposomas, y/o haciendo que los liposomas se acumulen en los lugares, p. eje, tumores, mediante la incorporación en ellos de un lípido con el grupo de cabeza modificado.

La eficacia de transfección, es decir la eficiencia con que realmente se introduce una molécula de ácido nucleico encapsulado en liposomas en una célula, se ayuda, tanto in vitro como in vivo, mediante la incorporación en el liposoma de un mecanismo destinado a inducir que la bicapa del liposoma se funda con la membrana de la célula. Dichos mecanismos comprenden, sin que esto sea limitativo, la incorporación de NAPE, conjugados de péptido- lípido y lípidos ionizables [véase WO 87/07530 y WO 95/27478, el contenido de los cuales se incorpora en la presente memoria a título de referencia].

La transfección tanto in vitro como in vivo está dirigida a introducir ácidos nucleicos en las células de tal modo que se transcriban y traduzcan en éstas. dicha expresión de proteínas mediante la introducción de ácidos nucleicos se puede utilizar con el fin de atacar una pluralidad de defectos de las células provocados por la falta de expresión, o por la sobreexpresión, de un gen en éstas, o de otro modo con el fin de modificar las proteínas celulares y su expresión. La transfección de las células con los ácidos nucleicos encapsulados en liposomas proporcionados en la presente memoria es de utilidad en el tratamiento de los animales afligidos por enfermedades o trastornos que se caracterizan por la anormal, sea no existente, anormalmente baja, anormalmente elevada o inapropiada, expresión de una proteína. Dichas enfermedades y trastornos comprenden, por ejemplo y sin que ello sea limitativo, varios cánceres y trastornos por genes defectuosos. La transfección terapéuticamente relevante también puede producir la expresión de una proteína previamente no expresada en las células diana.

El éxito de la transfección y la expresión del ácido nucleico transfectado en las células, se puede detectar mediante una pluralidad de procedimientos, dependiendo generalmente éstos de la detección de la presencia física del ácido nucleico en las células, por ejemplo mediante la incorporación de radioisótopos en el ácido nucleico, o mediante la detección de la expresión de la proteína codificada por el ácido nucleico. Ello se puede lograr mediante varios procedimientos que comprenden, pero sin que esto sea limitante, la detección de la proteína, por ejemplo un marcador de fluorescencia o que la proteína sea un marcador selectivo, por ejemplo, de resistencia a un agente tóxico.

Por ejemplo, el plásmido pEGFP-1 comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína verde fluorescente amplificada, cuya presencia se detecta mediante microscopía de fluorescencia. En consecuencia, el éxito de la transfección de las células con este plásmido (véanse los Ejemplos 10 a 12) se detecta fácilmente mediante la determinación de la cantidad de fluorescencia exhibida por las células. Los resultados de estos experimentos (véanse las Figuras 8 a 12), tanto la transfección con éxito de las células OVCAR-3 con el plásmido pEGFP-1, como el elevado nivel de expresión del plásmido transfectado en un porcentaje significativo de las células transfectadas.

Se observó el éxito de dicha transfección solamente cuando el ADN transfectado había sido condensado mediante policationes; las muestras no procesadas con espermina no mostraron, o mostraron muy poca, fluorescencia (véase la figura 8). La cuantificación de la expresión de proteína fluorescente (Figura 9) demostró que la transfección con ADN condensado mediante policationes produjo niveles significativos de expresión, mientras que la transfección de las muestras tratadas sin espermina no produjo una fluorescencia cuantificable. Además, la transfección con ADN libre, es decir, no encapsulado, tampoco produjo fluorescencia observable o detectable (Figuras 8c y 9c).

La presente invención se entenderá mejor a partir de los ejemplos siguientes que son únicamente ejemplificativos de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales

N-(lisamina rodamina B sulfonil)-fosfatidiletanolamina (transesterificada de PC de huevo), DOPC, EPC y N-C12-DOPE se adquirió de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Las células OVCAR3 de carcinoma de ovario se adquirieron de NCI-Frederick Cancer Research Laboratory (Frederick, MD). El plásmido pEGFP-C1 y las células competentes de E. coli DH5\alpha se adquirieron de Clontech Laboratories (Palo Alto, CA). El plásmido pZeoSVLacZ, las células competentes y el S.O.C. de Hanahan se adquirieron de Invitrogen (San Diego, CA). La Disolución Salina Equilibrada de Hank (HBSS), RPMI 1640, el suero bovino fetal térmicamente inactivado y Lipofectina se adquirieron de Gibco/BRL (Grand Island, NY). La RNasa libre de ADNasa y la ADNasa I libre de ARNasa se adquirieron de Boehringer Mannheim (GmbH, Germany). La agarosa se adquirió de FMC Bioproducts (Rockland, ME). Bacto agar, Bacto Tryptone y extracto de levadura se adquirieron de DIFCO Laboratories (Detroit, MI). El acetoxi metil éster de azul de calceína (CBAM), los colorantes PicoGreen y SybrGreen se adquirieron de Molecular Probes (Eugene, OR).

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Ejemplo 2 Purificación de plásmido

Se utilizaron dos plásmidos en este estudio: el plásmido pZeoSVLacZ que es de 6,5 lcb y expresa el gen lacZ de la \beta-galactosidasa en células de mamífero a partir el promotor-amplificador temprano del SV40, que permite la selección en células de mamíferos y en E. coli utilizando el antibiótico zeocina; y, el plásmido pEGFP-C1, que es de 4,7 kb y expresa la proteína verde fluorescente (EGFP) amplificada a partir del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano, que permite la selección en E. coli mediante la utilización de kanamicina y en células de mamífero utilizando G418. Los plásmidos se purificaron de E. coli [Baumann and Bloomfield, Biotechniques, 19:884-890 (1995)]-la proporción final de O.D. a 260 nm a O.D. 280 nm fue superior a 1,9 en todas las preparaciones; la electroforesis en geles de agarosa indico ADN en el rango de tamaños esperado.

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Ejemplo 3 Formulaciones de ADN liposomal

Se prepararon muestras mediante la dilución de 200 \mug de ADN en 125 \mul de LSB y a continuación combinando la suspensión resultante con 1 ml de CHCl_{3} que comprendía 30 \mumoles de N-C12 DOPE y DOPC en una proporción molar de 70:30 en un tubo de plástico de 13 x 100 de Pyrex a la vez que se agitaba mediante Vortex. La muestra se sonificó inmediatamente durante 12 segundos en un baño sonificador (Laboratory Supplies Co. Hicksville, NY) a la máxima potencia, con el fin de generar primero una emulsión de ADN de plásmido. A continuación, se añadió a dicha emulsión una alícuota de 125 \mul de LSB con varias concentraciones de espermina (comprendidas entre 16 y 40 milimolar) con agitación en vortex y se sonificó. Las muestras sin espermina se prepararon del mismo modo, excepto que la espermina se omitió de la segunda alícuota de125 \mul. La preparación de las muestras con EPC también fue idéntica, excepto que se utilizó espermina 7 mM.

Las emulsiones resultantes se colocaron, en pocos minutos, en un frasco en un Rotovap (Büchi Laboratoriums-Technick AG, Suiza). El disolvente orgánico se eliminó mientras giraba el frasco a la velocidad máxima, a la vez que se moduló el vacío mediante una válvula de aguja. Inicialmente se estableció un vacío de aproximadamente 600 a 650 mm, que a continuación se incrementó lo más rápidamente posible sin excesivo burbujeo, hasta que se alcanzó el vacío máximo (aproximadamente 730 mm); a continuación se evacuó el frasco durante otros 25 minutos. La película dejada en el frasco se resuspendió en 1 ml de 300 mM sacarosa en LSB y la muestra se extruyó cinco veces a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum (Poretics, Livemore, CA). A continuación la muestra se dializó contra tampón salino equilibrado de Hank (HBSS) sin Ca^{2+}/Mg^{2+}, durante la noche a 4ºC.

Se utilizaron otras composiciones de lípido con el fin de encapsular ADN condensado según la presente invención. Los plásmidos se condensaron y encapsularon en liposomas tal como se describe en el ejemplo anterior y se sedimentaron tal como en el Ejemplo 12. La composición de lípidos de los liposomas fue de hemisuccinato de colesterol:colesterol: 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina:1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina: dioleoil dmetilamonio propano:oleoil acetato en la proporción 12,5:2,5:50:12:10,5:10,5. Después del precipitado y lavado la proporción ADN/lípido de estos liposomas se determinó como en el Ejemplo 10. Las proporciones típicas de ADN/lípido estuvieron comprendidas entre 1,4 y 2,1 \mug ADN por micromol de lípido.

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Ejemplo 4 Partición de la espermina

N-C12-DOPE porta una carga neta negativa que potencialmente podría interaccionar con la espermina cargada positivamente y afectar el procedimiento de condensación. Por consiguiente, fue necesario ensayar la partición de la espermina entre el ADN y los liposomas de esta composición en un experimento de diálisis en un tampón de baja salinidad. Los experimentos diseñados con el fin de medir la partición de la espermina entre los fosfolípidos negativamente cargados y el ADN se realizaron en el instrumento de diálisis de tres cámaras (Sialomed, MD) cada una de las cámaras contenía 250 \mul de líquido. Se diluyó en LSB la cantidad deseada de espermina y se colocó en la cámara central, que estaba flanqueada por dos membranas de diálisis de punto de corte 100.000 m.w. La cámara en uno de los lados de la cámara de espermina contenía 400 \mug de ADN del plásmido pZeoLacZ en un volumen total de 250 \mul LSB. La cámara en el otro lado contenía 250 \mul de LSB solamente o liposomas vacíos de N-C12 DOPE/DOPC (70:30), preparados tal como se describe en el Ejemplo 3 a una concentración total de lípido de 30 mM, en 250 \mul de LSB- in esta disposición, solamente la espermina tiene acceso a las tres cámaras. Debido a que se conoce que la neutralización de ADN de plásmido por la espermina produce agregación (Fig. 1), la turbidez de la disolución en la cámara que contiene el ADN se utilizó como medio para seguir la partición de la espermina. Si los liposomas secuestran por completo la espermina del ADN, el ADN no se agrega. En estos experimentos la cantidad de lípido negativamente cargado disponible fue aproximadamente dos veces la cantidad de carga negativa en el ADN. Cada instrumento de diálisis se hizo rotar en una rueda motorizada de 12 pulgadas durante la noche (aproximadamente 20 horas). Se vació la cámara con el ADN mediante pipeteo repetido con el fin de mezclar la mezcla y se colocó en una cubeta con un volumen de 250 \mul. Se utilizó la absorbancia a 400 nm con el fin de seguir la turbidez sobre el fondo de tampón.

Se construyeron curvas de titulación de turbidez de ADN con espermina para la diálisis con y sin liposomas presentes (Figura 3). El desplazamiento aproximado en la curva debido a la presencia de liposomas se utilizó con el fin de calcular la constante relativa de enlace para los lípidos y el ADN, asumiendo que cada molécula de espermina se une a cuatro grupos fosfato de los nucleótidos o a cuatro fosfolípidos, en un equilibrio simple con constantes de asociación K_{ADN} y K_{lípido}, respectivamente. Es conocido que a una concentración de sal baja, la constante de disociación de la espermina del ADN se encuentra en el rango micromolar [Wilson et al., Biochem. 18:2192-2196 (1979); Gosule et al., J. Mol. Biol, 121:327-337 (1978)]. Por consiguiente, la concentración de espermina libre se consideró despreciable a la concentración milimolar de espermina necesaria para la agregación del ADN en estos experimentos.

La neutralización fraccional de los grupos fosfato del ADN por la espermina necesaria para la agregación del ADN, \gamma, se tomó como 0,9, en base a los datos obtenidos en ausencia de liposomas. Este es el mismo valor que se ha publicado como necesario para la condensación del ADN, de acuerdo con observaciones anteriores de que la agregación acompaña la condensación a concentraciones elevadas de ADN [Wilson et al., Biochem. 18:2192-2196 (1979); Gosule et al., J. Mol. Biol., 121:327-337 (1978)]. Asumiendo que [ADN-spm] = \gamma[ADN]_{total} en el punto de agregación y que [lípido-spm] = desplazamiento en la curva, se puede utilizar la ecuación:

K_{ADN}/K_{lipido} = [\gamma/(1-\gamma)] x [(Lípido_{total}-desplazamiento)/(desplazamiento)]

Cuando el Lípido_{total} se toma como la concentración total de lípido negativamente cargado expuesto en el exterior de los liposomas dividido por cuatro, la proporción de la constante de equilibrio aparente es de 178, es decir, la unión de la espermina al ADN es mucho más ávida que la unión al lípido. La proporción entre las constantes de unión y el primer factor a la derecha son constantes. Por consiguiente, el último factor a la derecha se puede utilizar con el fin de calcular el desplazamiento de la curva de titulación de espermina para la condensación del ADN para cualquier concentración total de lípido, que comprende la concentración efectiva más elevada utilizada en las emulsiones.

Los datos presentados en la Figura 3 demuestran que la presencia de liposomas solamente desplaza ligeramente la curva de agregación del ADN. Por consiguiente, fueron suficientes aproximadamente 0,6 mM de espermina en la emulsión inicial de 250 \mul para condensar el ADN del plásmido, mientras que un total de 0,85 mM sería suficiente para condensar el ADN en presencia de la cantidad de N-C12-DOPE utilizada. Por consiguiente, se esperaría que el ADN de plásmido pueda estar realmente condensado en estas preparaciones sin la complicación de neutralizar los lípidos cargados negativamente lo que podría desestabilizar los liposomas.

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Ejemplo 5 Microscopía óptica de las muestras de liposomas

Se ensayó la precondensación del ADN para su encapsulación potencial en lisposomas. Se produjo una agregación masiva según se determinó mediante un gran cambio de turbidez en la disolución. Ello no fue inesperado ya que se han reportado problemas similares. La microscopía óptica de los agregados de plásmidos (Figura 1) se realizó utilizando 200 \mug de plásmido pZeoLacZ en 125 \mul LSB, mezclados suavemente con 7 mM de espermina en 125 \mul LSB e incubados durante 15 minutos a temperatura ambiente.

La observación al microscopio (Figura 1A) demostró que los agregados fueron generalmente mucho mayores que 1 \mum y frecuentemente mayores que entre 5 y 10 \mum. El gran tamaño de los agregados se confirmó todavía más mediante crio-microscopía electrónica (Fig. 1B). Particularmente notables a esta amplificación fueron las organizaciones regulares de fibras, quizás resultantes de la condensación en una estructura parcialmente ordenada inducida por la espermina. También se observaron algunas barras curvadas sugestivas de los comienzos de estructuras toroidales, pero no de toroides completos. Los agregados formados de este modo fueron demasiado grandes para ser de utilidad en un sistema de administración.

Para estimar el tamaño de los liposomas de N-C12-DOPE/DOPC (70:30) que contienen ADN (Figura 5), se diluyeron en H_{2}O cuentas de poliestireno con un diámetro medio de 269 \pm 7 nm (Duke Scientific Corp., Palo Alto CA) a una concentración adecuada para la microscopía y se utilizaron liposomas de N-C12 DOPE/DOPC (70:30) con ADN después de la extrusión y diálisis sin más dilución (aproximadamente 20 mM lípido). Las muestras se examinaron en un microscopio de fluorescencia Olympus BH-2 (Olympus, Lake Success, NY) a 1000 X.

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Los resultados se presentan en la Figura 5. Las partículas de liposomas que contienen ADN son aparentemente de un tamaño y forma relativamente uniformes y el tamaño aproximado de las partículas de la muestra pareció ser muy similar al obtenido en los estudios de dispersión dinámica de luz. La comparación de estas partículas de liposomas que contienen ADN con el ADN agregado con espermina en la Figura 1 A demuestra el beneficio de condensar el ADN en las micelas invertidas según la presente invención antes de formar los liposomas. No se observó evidencia de agregados muy grandes cuando la espermina interactuó directamente con el ADN en disolución acuosa, lo que indica que el procedimiento de condensación en emulsión puede inhibir considerablemente dicha formación de
agregados.

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Ejemplo 6 Análisis de partículas mediante dispersión de luz

Las preparaciones de N-C12 DOPE/DOPC se caracterizaron mediante dispersión casi-elástica de luz. El análisis del tamaño de partícula se realizó utilizando un analizador de partículas Nicomp 370 (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA). Para el análisis las muestras se diluyeron aproximadamente 10 veces. Se realizó un análisis Gausiano en el modo de vesícula y se reportaron los promedios compensados por número. Los datos para el plásmido de ADN pZeoLacZ condensado con espermina preparado como en el Ejemplo 3 se pueden ajustar a una distribución Gausiana de tamaños con un número medio de tamaño de partícula de 222,6 nm.

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Ejemplo 7 TEM congelación-fractura

Las preparaciones fusogénicas de N-C12 DOPE/DOPC con ADN encapsulado se caracterizaron además mediante TEM de congelación-fractura. Se depositaron aproximadamente 2 \mul de muestra entre dos soportes de cobre doblemente replicantes de Balzer y se congelaron en propano líquido. Las muestras se fracturaron a -100ºC, 10^{-6} a 10^{-7} bar y se sombrearon con platino (< 45ºC) y carbono en un aparato de congelación-fractura Balzer BAF 400. Se digirieron réplicas con 5% de colorante durante la noche, se lavaron con agua destilada y se montaron en rejillas de tamaños 300 mesh. Las imágenes se obtuvieron con un TEM Philips 300.

Los resultados se muestran en la Figura 6. La mayoría de las partículas fueron de un tamaño pequeño (inferior a 400 nm), consistente con los resultados de NICOMP. Debido al plano de fractura predominante a través de la bicapa de lípido, es rara la observación del contenido interno con este procedimiento. Sin embargo, un pequeño número de partículas parece tener algunas estructuras encapsuladas que podría representar ADN condensado.

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Ejemplo 8 Crio microscopía electrónica de transmisión

Se utilizó Crio-EM con el fin de confirmar la naturaleza liposómica de las preparaciones y posiblemente visualizar el material encapsulado. Para las muestras de EPC y el ADN agregado con espermina, se utilizaron mallas de cobre recubiertas con un soporte de carbón perforado sin más tratamiento. Para las muestras de liposomas que contienen ADN N-C12-DOPE/DOPC (70:30), a las mallas de EM con una película de carbono perforado se les proporcionó una carga positiva colocando una gota de 0,1 mM de disolución de polilisina sobre la superficie de la malla y permitiendo que reposase un minuto. Se empañó la polilisina y se limpió la malla con varias gotas de agua destilada, seguido de varias gotas de tampón de muestra. Se colocó encima de la malla una alícuota de 5 \mul de muestra, se enjugó a una película delgada e inmediatamente se sumergió en etano líquido. Las mallas se almacenaron bajo nitrógeno líquido hasta su utilización. Se observaron en un microscopio electrónico de transmisión Philips CM12 (Mahwah, NJ), a un voltaje de aceleración de 120 kV. Se utilizó un criosoporte 626 (Warrendale, PA) con el fin de mantener la temperatura de la muestra entre -177ºC y -175ºC durante la generación de imágenes. Las microfotografías se registraron de las áreas suspendidas sobre los agujeros en condiciones de baja dosis de electrones. Se utilizaron amplificaciones de 35.000 x y 60.000 x y valores de enfoque comprendidos entre 1,8
y 2,5 \mum.

Los resultados se muestran en la Figura 7. Cuando la espermina se omite de los procesos para los liposomas N-C12 DOPE/DOPC, se observan principalmente liposomas unilamelares, relativamente pequeños pero estructuralmente heterogéneos (Figura 7a), consistente con el análisis Nicomp. Varios liposomas tuvieron apariencia tubular, probablemente como resultados del gradiente osmótico generado durante el proceso de fabricación. Algunos liposomas mostraron estructuras interiores con apariencia de fibras, que posiblemente representan ADN no condensado (flecha izquierda). También se pudieron observar fibras libres no encapsuladas (flecha derecha).

Las muestras de liposomas de ADN que contienen N-C12 DOPE/DOPC preparadas con espermina (Fig. 7b,c) también fueron heterogéneas en tamaño, forma y lamelaridad. Algunas partículas eran liposomas de apariencia normal sin material encapsulado visible. Sin embargo, otras contenían estructuras toroideas electrónicamente densas, bien definidas (Fig. 7b, flechas) que no se observaron en ausencia de espermina. Dichas estructuras no estuvieron relacionadas con el lípido particular utilizado, ya que las estructuras toroideas (Fig. 7c, flecha derecha) y las barras dobladas (Fig. 7c, flecha izquierda) se observaron también en las preparaciones de PC de huevo, que tendieron a ser más estables en las condiciones de preparación de las muestras de crio-EM. El espaciado entre las líneas delgadas dentro de las barras y los toroides fue uniforme y significativamente más pequeño que el espacio entre dos membranas en los liposomas multilamelares (estrella). Estas estructuras toroideas tienen gran parecido a los toroides y barras observados cuando se condensa ADN libre con espermina [Chattoraj et al., J. Mol. Biol. 121:327-337 (1978)] u otros agentes condensantes [Arscott et al., Biopolymers, 30:619-630 (1990); Gosule y Schellman, J. Mol. Biol., 121:327-337 (1978)] en disoluciones diluidas. Las líneas delgadas paralelas y concéntricas visibles dentro de las barras y toroides también asemejan las líneas observadas en los agregados de plásmidos (Fig. 1b).

Las membranas se pueden observar fácilmente alrededor de algunas de las estructuras toroideas (por ejemplo Fig. 7b). Es posible que todos los toroides observados estén encapsulados dentro de una membrana impermeable a los iones, ya que los toroides de ADN condensado no pueden existir en los tampones de elevada salinidad en los que finalmente se suspenden los liposomas. Por consiguiente, parecería que una proporción importante de estas preparaciones comprende ADN de plásmido encapsulado en liposomas.

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Ejemplo 9 Análisis por gel de agarosa

La protección del ADN de plásmido de la digestión por ADNasa se valoró mediante electroforesis en geles de agarosa para el ADN de plásmido encapsulado en liposomas preparado con espermina y para una muestra control preparada sin espermina. Se diluyó una alícuota de 50 \mul de la preparación deseada en 145 \mul de HBSS sin Ca^{2+}/Mg^{2+} y se le añadió con mezclado 1 \mul de 0,2 M MgCl_{2} más 2 \mul de ADNasa I (20 unidades). Después de 6 horas de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 2 \mul de 0,5 M EDTA con el fin de parar la reacción. Para los controles no digeridos, se mezcló una alícuota de 50 \mul de muestra con 150 \mul de HBSS (sin Ca^{2+}/Mb^{2+}). A continuación se extrajeron las muestras con fenol/CHCl_{3}/alcoho isoamílico y se precipitaron con etanol tal como se ha descrito [Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY. pp B4-B5 (1989)]. Los precipitados se disolvieron en 20 \mul de TE (pH 8,0), 5 \mul de los cuales se cargaron en un gel de 0,8 % agarosa. Los geles se tiñeron con una disolución stock 1:10.000 de SYBR Green I para tinción de ácidos nucleicos (Molecular Probes) durante 30 minutos, y se visualizaron en un transiluminador ultravioleta FotoSpectrum® (caja de luz). Las fotografías se tomaron en la caja de luz con un sistema de cámara Polaroid MP 4+. Las fotografías se rasterizaron utilizando un ScanJet IIC® (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) y se digitalizaron con Aldus Photostyler® (U-Lead Systems, Torrance, CA).

Los resultados presentados en la Figura 4 demuestran que las dos preparaciones permitieron una protección significativa del ADN o aparente encapsulación.

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Ejemplo 10 Análisis cuantitativo

Con el fin de cuantificar la protección del ADN, se extrajo ADN de cada una de las alícuotas y se midió mediante un ensayo de fluorescencia. Se utilizó el ensayo de fluorescencia PicoGreen [Haugland, Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 6ª ed. Molecular Probes, Inc., pp161-162 (1996)] con el fin de cuantificar el ADN que se extrajo mediante el procedimiento de feno/cloroformo dado a conocer en el Ejemplo 9. Se preparó una disolución de trabajo mediante la adición de 100 \mul de stock PicoGreen (Molecular Probes) a 20 ml de TE (pH 7,5). La muestra extraída primero se diluyó 100 x con TE (pH 7,5). A continuación una alícuota de 14 \mul de la muestra diluida se mezcló con 986 \mul de TE (pH 7,5) y 1 ml de disolución de trabajo PicoGreen. La mezcla se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 4 minutos. La fluorescencia de PicoGreen se registró a temperatura ambiente en un fluorímetro PTI Alphascan (South Brunswick, NJ) con una longitud de onda de excitación de 480 nm y longitud de onda de emisión de 520 nm, con un filtro de paso alto >500 nm (Schott Glass Tehnologies, Duryea, PA). La fluorescencia de 1 ml de TE (pH 7,5) y de 1 ml de mezcla de disolución de trabajo PicoGreen se utilizaron como blancos. El porcentaje de ADN protegido de la digestión por ADNasa I se calculó sustrayendo el blanco, y tomando la muestra no digerida como el 100%. En las condiciones experimentales, la señal de fluorescencia del ADN digerido fue insignificante.

La muestra con espermina mostró 10,1 + 5,6% de protección del plásmido, mientras que se protegió el 19,0 + 4,5 en la muestra sin espermina.

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Ejemplo 11 Ensayos de transfección

A continuación se ensayó la actividad de transfección de las preparaciones liposomales que encapsulan ADN del plásmido pEGFP-C1. Se sembraron células OVCAR3 en placas a una densidad de 1 x 10^{5} células por ml en placas de 24 pocillos, o a 2 x 10^{5} células por ml en placas de 96 pocillos, en 1 ml o 0,1 ml por pocillo, respectivamente, de RPMI 1640 con 10% suero bovino fetal térmicamente inactivado. Las células se dejaron crecer durante 2 días (aproximadamente entre 40 y 48 horas) antes de realizar las transfecciones; en este punto las células eran confluyentes. Las disoluciones de transfección se prepararon mediante la dilución de los liposomas apropiados o las muestras de ADN en medio libre de suero. Las placas se aspiraron para eliminar el medio y se lavaron una vez con disolución salina tamponada de Dulbecco seguido de aspiración.

Las disoluciones de transfección (0,5 ml por pocillo para las placas de 24 pocillos, 0,1 ml por pocillo para las placas de 96 pocillos) se prepararon mediante una dilución de las muestras dializadas que contenían el plásmido pEGFP-C1, de 10 veces en medio libre de suero (aproximadamente 2 mM de lípido total a menos que se indique de otro modo), y a continuación se añadieron a los pocillos y se incubaron a 37ºC durante 3 horas. Los pocillos se aspiraron y se añadió medio con 10% suero bovino fetal térmicamente inactivado a cada pocillo. Debido al silenciamiento, demostrado anteriormente, de los transgenes bajo el promotor CMV [Tang et al., Human Gene Therapy, 8:2117-2124 (1997); Dion et al., Virology, 231:201-209 (1997)] se añadió a cada pocillo 5 \muM de inhibidor de la histona desacetilasa, trichostatina A, con el fin de amplificar la expresión. En los experimentos que se presentan en las 2 últimas figuras, se utilizó otro inhibidor de la histona desacetilasa, 5 mM butirato sódico.

Después de incubar a 37ºC en un incubador de cultivos celulares durante 18 y 22 horas, se aspiró el medio y se lavó con alícuotas de 0,5 ml de PBS de Dulbecco. Se tomaron microfotografías de las muestras cuando todavía estaban en las placas de cultivo de tejidos utilizando un microscopio Olympus IMT-2 con un objetivo 10X. El PBS se aspiró y se añadió a cada pocillo 0,5 ml (0,1 ml para las placas de 96 pocillos) de 5 \muM acetoxi metiléster de azul de calceina (CBAM) en PBS y se incubó durante 40 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron otra vez con PBS, se aspiró y se añadió a cada pocillo 0,5 ml (0,1 ml a las placas de 96 pocillos) de 1% C_{12}E_{8} en tampón TE (pH 8,0). Las muestras se disolvieron a continuación en un detergente y se tomaron lecturas para determinar la fluorescencia total de EGFP corregida en términos del número total de células vivas. La fluorescencia de las placas se midió en un lector de fluorescencia para placas Cytofluor II (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA). Las lecturas del azul de calceína cargado en las células vivas se llevaron a cabo con una excitación de 360 nm y emisión a 460 nm, con una ganancia de 80. Se verificó que las lecturas eran lineales con respecto al número de células originalmente sembrado hasta el nivel en que se observó confluencia. Para los datos mostrados en la Figura 10, se utilizó un precipitado de liposomas separado del ADN externo (Ejemplo 12). Debido a que los niveles de Ca^{2+} y el Mg^{2+} en el RPMI 1640 son significativamente más bajos en el suero, los datos en las Figuras 11 y 12 se obtuvieron después de suplementar el medio libre de suero con Ca^{2+} y Mg^{2+} hasta alcanzar 1,2 y 0,8 mM, respectivamente, durante la transfección.

Se pudo estimar una conversión aproximada a fluorescencia EGFP por unidad de proteína celular mediante la medición de la concentración media en proteína en los cultivos OVCAR-3 de 48 horas en los experimentos de 24 y 96 pocillos extraídos con 1% del detergente Triton-100. Se utilizó un ensayo de ácido bicinconínico (Pierce Chemical, Rockford, IL) con albúmina de suero bovino como estándar. Para la Figura 9, la barra "a", la lectura total de fluorescencia con corrección de fondo por pocillo de 670 unidades. De una placa diferente, el promedio de proteína celular total por pocillo en el momento de la transfección (48 h) fue de aproximadamente 88,4 \mug/pocillo dando 7,6 unidades de fluorescencia por \mug de proteína celular total en un volumen de 0,5 ml para el experimento en las placas de 24 pocillos. En la Figura 10, los datos par la barra "a" (experimento de 96 pocillos), representan una fluorescencia media de EGFP con el fondo corregido de 420 unidades por pocillo con una concentración media de proteína total de 27 \mug por pocillo, lo que da 15,5 unidades de florescencia por \mug de proteína celular total en un volumen de 0,1 ml. En la Figura 11, (experimento de 96 pocillos) la lectura de fluorescencia de la barra "a" fue de 103 unidades por \mug de proteína celular.

Con el fin de modelar la administración intraperitoneal (datos en las Figuras 11 y 12), se realizaron las transfecciones mediante la adición, en primer lugar, de 50 \mul de un fluido de lavado concentrado, libre de células, de la cavidad peritoneal de ratones SCID portadores de tumores (Ejemplo 13), a cada pocillo aspirado de una placa de 96 pocillos de células OVAR-3 cultivadas tal como se ha descrito anteriormente. A cada pocillo se añadió 50 \mul de la formulación de ADN-liposomas NC12-DOPE/DOPC, preparada tal como se describe en el Ejemplo 3, que tiene una concentración final de lípido de aproximadamente 10 mM y una concentración final de ADN encapsulado comprendida entre 7 y 14 \mug/ml (ADN total 67 \mug/ml). Las incubaciones se realizaron tal como se ha descrito anteriormente. En este caso, el fluido de lavado peritoneal se ajustó a los niveles aproximados de Ca^{2+} y Mg ^{2+} en el suero (1,2 mM y 0,8 mM, respectivamente) mediante la adición de un stock concentrado. La disolución de ADN liposomal se ajustó también a los mismos niveles de Ca^{2+} y Mg^{2+} mediante la adición del stock concentrado justo antes de la adición de los liposomas a las células.

Los datos en las Figuras 8 y 9 demuestran que la formulación de liposomas NC12-DOPE/DOPC (70/30) que encapsulan ADN de plásmido condensado con espermina fue activa en la transfección de las células OVCAR-3. Los datos muestran que la actividad fue dependiente de la presencia del agente condensador espermina y de la encapsulación del ADN del plásmido en los liposomas. Los datos en la Figura 10 demuestran otra vez que la actividad de transfección está asociada al ADN encapsulado en lípido y no con ADN libre externo. Los datos en las Figuras 11 y 12 muestran que la transfección también puede tener lugar en presencia de sustancias potencialmente interferentes (por ejemplo proteínas del suero) encontradas en el lugar intraperitoneal del tumor OVCAR-3.

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Ejemplo 12 Sedimentación del ADN de plásmido y de las partículas de lípido

Con el fin de demostrar la actividad de transfección del ADN de plásmido encapsulado, fue necesario separar el ADN de plásmido libre del ADN encapsulado en liposomas. Se utilizó el siguiente procedimiento de preparación. En los experimentos cuyos resultados se muestran en la Figura 10 se utilizaron liposomas preparados mediante sedimentación con el fin de eliminar el ADN externo. Para los experimentos de sedimentación, las muestras de liposomas N-C12-DOPE/DOPC (70:30) se prepararon mediante el procedimiento del Ejemplo 3 con espermina, excepto que se incluyeron 200 mM de sacarosa en el LSB. También se añadieron 10 \mug/ml de grupos de cabeza marcados con rodamina B-fosfatidiletanolamina lisamina (Rh-PE) como sonda de lípido. Se centrifugó una alícuota de 500 \mul de la preparación a 16.000 x g durante 3 horas. Después de extraer el sobrenadante, el precipitado se resuspendió en HBSS sin Ca^{2+}/Mg^{2+}. La suspensión se centrifugó a 16.000 x g durante 3 horas. El precipitado se resuspendió en 500 \mul de HBSS sin Ca^{2+}/Mg^{2+}. Se tomaron alícuotas de 50 \mul de cada una de las fracciones para digerir con ADNasa I (Ejemplo 9). Después de una extracción con fenol/CHCl_{3} y precipitación con etanol, el ADN del plásmido en cada alícuota se midió mediante el ensayo PicoGreen (Ejemplo 10) y se utilizó con el fin de calcular el porcentaje de plásmido protegido y el porcentaje de ADN total de plásmido, en cada fracción.

Con el fin de medir la distribución de lípidos, se disolvió una alícuota de 40 \mul de cada una de las fracciones en 0,2% C_{12}E_{8} en un volumen total 2 ml y se siguió la fluorescencia mediante una longitud de excitación de 560 nm utilizando un filtro de paso de banda de 550 + 20 nm (Melles Griot, Irving, CA) y una emisión de longitud de onda de 590 nm. Como control, se prepararon como anteriormente, liposomas vacíos N-C12-DOPE/DOPC (70:30). Después de la diálisis, se añadieron 100 \mug de plásmido EGFP a 500 \mul de muestra. A continuación se centrifugaron las muestras y se cuantificaron los lípidos y el ADN de plásmido.

Aproximadamente el 80% del lípido precipitó en estas condiciones, mientras que solamente precipitó aproximadamente 14% del ADN total. La actividad de transfección del material precipitado se muestra en la Figura 10. La actividad de transfección se encontró claramente asociada con el precipitado de lípido, es decir, con el ADN encapsulado en liposomas.

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Ejemplo 13 Fluido de lavado

Con el fin de ensayar el efecto de las proteínas intraperitoneales sobre la actividad de transfección de las preparaciones descritas en la presente memoria, se preparó un fluido de lavado tal como se describe a continuación. Se tomó un lavado libre de célula de 6 ml de HBSS de un ratón SCID 7 semanas después de la inyección de células OVCAR-3 y se concentró a 1 ml mediante un concentrador de centrifugado con punto de corte a un p.m. de 10.000. La recuperación de proteína es de aproximadamente el 60%. Este fluido, que comprende aproximadamente 10 mg/ml de proteína en HBSS, se suplementó con Ca^{2+} y Mg^{2+} hasta el rango normal en el suero, se añadió a las células OVCAR-3 y se mezcló suavemente con un volumen igual de liposomas en HBSS, con el mismo nivel de Ca/Mg, resultando en una concentración final de lípido de 10 mM.

Los resultados de estos experimentos de transfección se muestran en las Figuras 11 y 12. A pesar de los efectos inhibidores de las proteínas del suero sobre la eficacia de transfección, permaneció una actividad sustancial en estas condiciones utilizando la formulación preparada mediante el procedimiento de la presente invención.

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Ejemplo 14 Eficiencia del cargado de los liposomas

La eficiencia de carga de los liposomas utilizando un procedimiento de ADN precondensado se comparó con el procedimiento descrito en la presente memoria. Se prepararon liposomas tal como describen Ibañez et al., Biochem. Cell Biol., 74:633-643 (1996). Se disolvió ADN del plásmido pEGFP a 66 \mug/ml en tampón TS (10 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7,0). Se mezclaron 2 ml de esta disolución con 2 ml de 23 mM espermidina en tampón TS con el fin de precondensar el ADN produciendo una disolución muy turbia. Ésta se guardó durante la noche a 4ºC. Al día siguiente, un total de 9 \mumol de lípido se disolvió en 1 ml de éter dietílico. A esto se añadió 330 \mul del ADN y disolución de espermidina con agitación en un vortex. A continuación e inmediatamente la mezcla se sonificó tres veces durante 5 segundos cada vez (sonificador de Laboratory Supply # G112SOI). El éter dietílico se eliminó a continuación utilizando un evaporador giratorio a 37ºC con el fin de producir liposomas. Se prepararon cuatro de dichas muestras para cada composición de lípido. Los liposomas se centrifugaron a 200.000 X g durante 30 minutos. El sobrenadante se eliminó y se añadieron 500 \mul adicionales de tampón TS y se repitió la centrifugación. Después de un total de tres ciclos, se extruyeron los liposomas a través de membranas MF con poros de 0,45 \mum. En este punto se utilizaron los liposomas con el fin de determinar la encapsulación o se dializó una fracción de los mismos contra disolución salina equilibrada de Hank sin Ca^{2+} o Mg^{2+}. Para comparar, se prepararon también liposomas tal como se describe en el Ejemplo 3. La encapsulación de ADN se midió tal como se describe en los Ejemplos 9 y 10. Todas las digestiones fueron de 6 horas. La concentración de lípido se midió mediante HPLC. Todos los componentes excepto el colesterol se cuantificaron utilizando una columna de gel de sílice (3 \mum) Waters Sherisorb con una fase móvil de acetonitrilo:metanol:H_{2}SO_{4}, 100:3:0,05 y se detectó mediante absorbancia UV. El colesterol se midió en una columna (5 \mum) Phenomenex Luna C18 con una fase móvil de 96:4 metanol:agua y se detectó mediante un detector de dispersión elástica de luz. En la siguiente tabla se dan las composiciones de los lípidos ensayados.

TABLA I

4

Los liposomas preparados mediante la condensación de ADN dentro de una emulsión tal como se describe en la presente memoria tuvieron proporciones de ADN:lípido mucho más elevadas que los liposomas preparados con ADN precondensado.

Ejemplo 15 Determinación de la lamelaridad de los liposomas

Se prepararon liposomas compuestos por 70:30 N-C12-DOPE/DOPC y ADN de plásmido encapsulado tal como se describió en el Ejemplos 3 y se sedimentaron y lavaron tal como en el Ejemplo 12. Estos liposomas también contenían una sonda NBD a 0,5 en moles % del lípido total. Los liposomas se diluyeron a una concentración total de lípido 80 \muM en disolución salina tamponada con fosfato en una cubeta de fluorímetro agitada. Se midió la fluorescencia NBD mediante excitación a 450 nm y emisión a 530 nm. Se inyectó una concentración final de ditionato sódico 20 mM en la cubeta con los liposomas con el fin de reducir la sonda de NBD expuesta. La Figura 13 demuestra que desapareció aproximadamente entre el 50 y el 55% de la señal de NBD lo que indica que los liposomas en la preparación eran principalmente unilamelares, es decir, aproximadamente la mitad de las sondas lipídicas estaban expuestas al agente reductor, ditionato sódico, impermeable a través de la membrana.

Ejemplo 16 Transfección de un tumor subcutáneo humano en ratones SCID mediante inyección intratumoral

Se inyectaron células OVCAR-3 humanas (2 x 10^{6}) subcutáneamente en ratones SCID y se las dejó crecer durante varias semanas hasta que se alcanzó un diámetro medio de entre 4 y 7 mm. Se prepararon liposomas que comprendían espermina, el plásmido pEGFP-C1, 70 mol % de N-C12-DOPE y 30 mol % de DOPC, tal como se indica en el Ejemplo 3. Las membranas de los liposomas también comprendieron 0,5 en moles % de rodamina-PE como trazador fluorescente de los liposomas.

0,11 ml de una disolución de liposomas en disolución salina equilibrada de Hank sin calcio o magnesio (HBSS) a una concentración total de aproximadamente 40 mM se inyectó directamente en el centro de los tumores después de ajustar los niveles de Ca^{2+} y Mg^{2+} a 1,2 y 0,8 mM, respectivamente. Un día después, se inyectó en el mismo lugar 0,11 ml de una disolución 20 mM de butirato sódico en HBSS. Después de 24 horas, se escindieron los tumores y se congelaron. Más adelante, se obtuvieron en un criostato a -20ºC secciones de un grosor comprendido entre 14 y 30 \mum, se montaron congeladas en portaobjetos de vidrio y se sujetaron con un cubreobjetos. Las muestras de tumor congeladas se montaron en medio de embeber O.C.T.

La expresión transgénica del plásmidos pEGFP-C1 se ensayó mediante microscopía confocal de las criosecciones de 20 \mum del tejido congelado fijado. Las secciones congeladas se examinaron en un microscopio confocal Olympus BX50/Biorad MRC 1000 provisto de un láser de Argon/Kripton (Ex 488 nm, Em 515 para EGFP; Ex 568, Em 585 para rodamina). Se hicieron imágenes de las zonas de las secciones de tejido a una amplificación 20X. No se utilizaron mejoras a las imágenes, pero se aplicó una escala de colores en la preparación de las figuras. La Figura 14 muestra un par de imágenes fluorescentes de una sección de tejido tomada de un tumor tratado con el plásmido pEGFP-C1. El panel inferior muestra la fluorescencia roja de los liposomas marcados con rodamina. La señal muy elevada de lípido (amarillo) sugiere que esta sección estaba cerca del lugar de inyección de los liposomas. El panel superior muestra fluorescencia verde debida a la expresión del transgen. La señal del plásmido expresado se encuentra cerca pero no coinciden con la señal de lípido y parece ser verdadera expresión del plásmido en el tumor. La Figura 15 muestra otro par de imágenes fluorescentes de una sección de tumor diferente que expresa EGFP. En la Figura 16 se muestra un par de imágenes de fluorescencia de una criosección de tejido de tumor control. En el panel superior se observa una débil fluorescencia difusa inherente al tejido, pero no se encontraron áreas de fluorescencia intensa en ninguna de las secciones del tejido control. No se observó fluorescencia roja en ninguna de las secciones del tumor control.

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Ejemplo 17 Transfección de músculo de ratón in vivo

Se ensayó in vivo en el músculo de la pata de un ratón la actividad de transfección de los liposomas NC12-DOPE/DOPC (70:30) que encapsulan el plásmido pZeoSVLacZ. Los liposomas se prepararon tal como se describe en el Ejemplo 3. En el experimento se utilizaron ratones hembra DBA estabulados en condiciones estándar. El primer día se inyectaron 50 \mul de liposomas que comprendían el plásmido pZeoSVLacZ directamente en uno de los músculos de las patas traseras. El lugar de la inyección fue en la parte delantera del muslo de la pata. La pata opuesta o recibió 50 \mul de liposomas con el plásmido pEGFP-C1 o no recibió tratamiento. El día 2, se inyectó en las patas tratadas con liposomas 50 \mul de butirato sódico 20 mM en HBSS. Los ratones se sacrificaron el día 3 y los músculos de las patas se extrajeron y se cortaron en cuatro secciones: pata delantera, pata trasera, muslo delantero y muslo trasero. La mitad del tejido de cada sección se congeló inmediatamente en propano líquido, mientras que la otra mitad se fijó en 4% paraformaldehido, se crioprotegió con 30% de sacarosa y a continuación se congeló instantáneamente en propano.

La expresión del transgén del plásmido pZeoSVLacZ administrado mediante los liposomas N12-DOPE/DOPC (70:30) se ensayó utilizando el equipo de luminiscencia de \beta-gal de Clontech. El músculo no fijado se descongeló, se cortó en secciones y se homogeneizó tal como sigue. Se añadieron 15 ml de tampón de lisis (9,15 ml K_{2}HPO_{4}, 0,85 ml KH_{2}PO_{4}, 20 \mul Triton X100, 10 \mul DTT) por cada 1 mg de tejido húmedo y se homogeneizó a mano durante 5 minutos y a continuación se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación las muestras se centrifugaron durante 2 minutos a 14.000 rpm con el fin de precipitar los residuos de tejido. Se ensayaron alícuotas de los sobrenadantes para detectar actividad \beta-galactosidasa tal como indica Clontech. Las lecturas de luz se midieron después de 60 minutos utilizando un luminómetro de placas Berthold. Se realizó el promedio de las lecturas para las diferentes secciones del mismo tipo de los músculos. Los resultados se muestran en la Figura 17. Se observó un incremento significativo en la actividad de \beta-galactosidasa sobre el control en las secciones de músculo del muslo delantero. También se encontraron incrementos ligeros en la pata trasera y en el tejido del muslo trasero.

Estos resultados demuestran la transfección in vivo y la expresión del plásmido pZeoSVLacZ cuando se administra al músculo del ratón utilizando el vector de liposomas N12-DOPE/DOPC (70:30).

Ejemplo 18 Comparación de la transfección con ADN condensado liposomal y lipoplexes catiónicos Preparación de lipoplex catiónico

Justo antes de su utilización, se prepararon complejos de lípidos catiónicos y lípidos auxiliares con ADN de plásmido. Se adquirió Lipofectina de Gibco BRL (Grand Island, N.Y.). Para la Lipofectin, se incubó el lípido solamente en medio libre de suero durante aproximadamente 45 minutos antes de la acomplejación con ADN, tal como sugiere el fabricante (Invitrogen). Volúmenes iguales de ADN 4 \mug/ml y lípido 40 \mug/ml o volúmenes iguales de ADN 20 \mug/m y lípido 200 \mug/ml, todas ellas en RPMI 1640 libre de suero, se mezclaron y se incubaron durante aproximadamente 10 y 15 minutos antes de su adición a los pocillos de placas de cultivo de tejidos. Se ajustó el Ca^{2+} y el Mg^{2+} a una concentración final 1,2 y 0,8 mM, respectivamente, mediante la adición de un stock concentrado justo antes de la adición del los lipoplexes a las células. La proporción de lípido/ADN utilizada para Lipofectina se basó en una optimización comparando varias proporciones.

Los complejos de DC-Colesterol/DOPC (4/6) se formaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente [Muldoon et al., Biotechniques 22:162-167 (1997)] y se utilizó en 15 minutos. La proporción de ADN/lípido optimizada se utilizó en todos los experimentos, es decir, se mezclaron 4 \mug/ml ADN con un volumen igual de 20 \mug/ml lípido o 20 \mug/ml ADN se mezclaron con un volumen igual de 100 \mug/ml lípido.

Todos los complejos restantes se formaron utilizando un conjunto de lípidos catiónicos o mezclas de lípidos de un solo fabricante (Invitrogen). Éstos se prepararon tal como sugiere el fabricante a una concentración 1X y a la proporción de lípido/ADN sugerida.

Los ensayos de transfección se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 11.

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Comparación de los lipoplexes catiónicos

Los liposomas precipitados libres de ADN externo se utilizaron en la comparación directa de transfección con lipoplexes catiónicos a concentraciones iguales de ADN. Estos datos se presentan en la Tabla 2 relativa al tratamiento con liposomas (todos los datos después de la incubación con butirato sódico, como activador no tóxico de la expresión de transgenes [Tang et al., Human Gene Therapy, 8:2117-2124 (1997); Weeler et al., Biochem. Biophys. Acta 1280 (1996); Gruner et al., Biochem. 24:2833-2842 (1984)] y a niveles fisiológicos de Ca^{2+} y Mg^{2+}, (todos los datos están normalizados con respecto a la actividad de estarasa intracelular). En la Tabla 2, la viabilidad celular y la transfección se toman como 1,0 para los liposomas N-C12-DOPE/DOPC, es decir, los números superiores a 1,0 representan el factor por el que uno cualquiera de estos dos parámetros es superior en el sistema de ensayo. La actividad de transfección de los liposomas N-C12-DOPE/DOPC (70:30) estuvo generalmente en el rango de la encontrada para los lipoplexes catiónicos en estas condiciones. Algunos de los lipoplexes dieron una actividad considerablemente inferior y algunos una actividad considerablemente superior. Los lipoplexes que comprenden 3\beta[N-(dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol y dioleoilfosfatidiletanolamina (DC-chol/DOPE) fueron particularmente activos. Sin embargo, al igual que los lipoplexes catiónicos, fueron considerablemente más tóxicos que los liposomas para las células particulares que se utilizaron en estos experimentos, especialmente a las concentraciones superiores. Ello se pudo observar como una baja fluorescencia de azul de calceína después del tratamiento con los lipoplexes (Tabla 2), así como también mediante la observación al microscopio de células redondas y rotas después del tratamiento (datos no mostrados). En varios casos, la eficiencia de transfección con lipoplexes catiónicos de hecho se redujo en relación a la de los liposomas a la concentración superior, probablemente como resultado de su toxicidad. No se observó toxicidad con el ADN encapsulado en liposomas. De manera interesante, el tratamiento con los liposomas generalmente produjo un incremento en la fluorescencia final de azul de calceína de entre un 10 y un 30%, posiblemente como resultado de la protección contra los efectos de la incubación en medio libre de suero.

La importancia de la toxicidad relativamente baja del sistema de administración de ADN de plásmido liposomal no es completamente evidente en el sistema de cultivo de tejidos debido a que la eficacia de transfección alcanza la saturación al nivel relativamente bajo del ADN utilizado en los experimentos anteriores. Sin embargo, se espera que la situación in vivo sea muy diferente. El gran exceso de lugares de enlace no específicos in vivo puede necesitar la utilización de niveles elevados de ADN y/o varias inyecciones para una expresión eficiente en las células diana. Esto puede ser un límite para la utilización de los lipoplexes catiónicos en esta situación debido a su toxicidad.

Se incubaron células OVCAR-3 con precipitados lavados de liposomas (tal como en la Figura 10) o con complejos de lípidos con una cantidad igual de ADN de plásmido pEGFP-C1 durante 3 horas en medio libre de suero. Todos las procesos de transfección fueron tal como se describe en el Ejemplo 11 y comprenden el ajuste de los niveles de Ca^{2+} y Mg^{2+} a 1,2 mM y 0,8 mM, respectivamente.

TABLA 2

5

^{a}Los complejos de lípidos catiónicos se prepararon con los siguientes lípidos: #1-mezcla 1:1 de Tris-((2-glutaroil-4-amino-N-dioctadecil amina)-4'-(2,5-diaminopentanoil-(2",5"-diaminopropiletil)) amina, trifluoroacetato y 2-amino-(2',2'-dimeti)etil-metilfosfónico ácido O-octadecil-(1'-heptadecil) éster, trifluoroacetato (Pfx-1); #2-2,5-diaminopentanoil-glicil-glicil-N-octadecil-(1'heptadecil) amida, trifluoroacetato (Pfx-2); #3-mezcla 1:1 de 2,5-diaminopentanoil-(2',3'-di-3-aminopropil)-2-aminoacetil-2-aminoacetil-N-octadecil-(1'-heptadecil) amida, trifluoroacetato y DOPE
(Pfx-3); #4-mezcla 1:1 de 2-amino-(2',2'-dimetil)etil-metilfosfónico ácido O-octadecil-(1'-hetadecil) éster, trifluoroacetato y 2,5-diaminopentanoil-2-aminoacetil-N-dioctadecilamida, trifluoruro (Pfx-4); #5-mezcla 1:1 de 2,5-diamino-
pentanoil-(2,5-di-3-aminopropil-glutaroil-N-octadecil-(1'-heptadecil) amida, trifluoroacetato y 2,5-diaminopetanoil-(2,2,5,5-tetra-3-aminopropil)-glicil-N-dioctadecil amina, trifluoroacetato (Pfx-5); #6-mezcla 1:1 de 2,5-diaminopenta-
noil-(2,5-di-3-aminopropil)-1,2-diaminoetil-O-octadecil-(1'-heptadecil)carbámico ácido, trifluoruro y DOPE (Pfx-7); #7-Bis-(2,5-diaminopentanoil-(2,5-di-3-aminopropil)-cistil-N-dioctadecil amina))disulfuro, trifluoroacetato (Pfx-8); #8-lipofectin; #9 -DC-colesterol/DOPE 4/6.

^{b} Los datos se expresan en relación a los liposomas que comprenden N-acil-PE, tomados como 1,0, es decir, los números representan el factor por el que cada lipoplex es más o menos tóxico o activo. Se comparan los datos de más de una serie de experimentos utilizando el lípido #2 como estándar.

^{c} La eficacia de transfección se midió mediante la fluorescencia de EGFP tal como en la Figura 11 y se corrigió para la actividad total de esterasa celular tal como se refleja en la fluorescencia total de azul de calceína (véase el Experimento 11).

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Los expertos en la materia apreciarán que la presente invención está bien adaptada para cumplir los objetivos y alcanzar los resultados y ventajas mencionados, así como también los inherentes a la misma. Los compuestos, composiciones, procedimientos, procesos y técnicas descritas en la presente memoria se presentan como representativos de las formas de realización preferidas, o se pretende que sean ejemplificativos y no se pretende que sean limitativos del ámbito de la presente invención. Los cambios en ésta y otras utilizaciones evidentes para los expertos en la materia estarán comprendidos en el espíritu de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Procedimiento de encapsulación de un complejo bioactivo en un liposoma, que comprende las etapas siguientes:

(b): combinar una primera suspensión acuosa que comprende un ácido nucleico con la disolución orgánica que contiene el lípido de la etapa (a) de modo que se forme una emulsión que comprende el ácido nucleico en el lípido;

(c): añadir a la emulsión de la etapa (b) una segunda suspensión acuosa que comprende un policatión;

(d): incubar la emulsión de la etapa (c) con el fin de permitir que el policatión haga contacto con el ácido nucleico formando así un complejo del ácido nucleico con el policatión dentro de las gotas de agua estabilizadas por el lípido; en el que dicho compuesto no es de diámetro mayor que el diámetro de las gotas; y

(e): eliminar el disolvente orgánico de la suspensión de la etapa (d), de modo que se formen liposomas que comprenden el ácido nucleico acomplejado y el lípido.

2. Procedimiento de encapsulación de un complejo bioactivo en un liposoma, que comprende las etapas siguientes:

(b): combinar una primera suspensión acuosa que comprende un policatión con disolución orgánica que comprende el lípido de la etapa (a) de modo que se forme una emulsión que comprende el policatión y el lípido;

(c): añadir a la emulsión de la etapa (b) una segunda suspensión acuosa que comprende un ácido nucleico;

(d): incubar la emulsión de la etapa (c) con el fin de permitir que el policatión se ponga en contacto con el ácido nucleico formando así un complejo del ácido nucleico con el policatión dentro de las gotas de agua estabilizadas por el lípido; en la que dicho complejo no es de diámetro mayor que el diámetro de la gota; y

(e): eliminar el disolvente orgánico de la suspensión de la etapa (d), con el fin de formar liposomas que comprenden el ácido nucleico acomplejado y el lípido.

3. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico es ADN.