CZ20013103A3 - Způsob zapouzdřování bioaktivních komplexů do liposomů - Google Patents
Způsob zapouzdřování bioaktivních komplexů do liposomů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20013103A3 CZ20013103A3 CZ20013103A CZ20013103A CZ20013103A3 CZ 20013103 A3 CZ20013103 A3 CZ 20013103A3 CZ 20013103 A CZ20013103 A CZ 20013103A CZ 20013103 A CZ20013103 A CZ 20013103A CZ 20013103 A3 CZ20013103 A3 CZ 20013103A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- liposomes
- dna
- lipid
- bioactive
- cells
- Prior art date
Links
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims abstract description 245
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 claims abstract description 73
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 72
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 136
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 37
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 claims description 36
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 34
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 34
- 239000000693 micelle Substances 0.000 abstract description 15
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 abstract description 13
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 177
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 72
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 51
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 33
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 26
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 18
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 17
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 16
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 16
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 14
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 14
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 13
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 12
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 11
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 10
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 10
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 7
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 7
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 7
- RJPSHDMGSVVHFA-UHFFFAOYSA-N 2-[carboxymethyl-[(7-hydroxy-4-methyl-2-oxochromen-8-yl)methyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C RJPSHDMGSVVHFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 6
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 6
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 5
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 5
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000028937 DNA protection Effects 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GPXQYXMZUPIJMH-XWGUCVLRSA-N N-lauroyl-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)NCCOP(O)(=O)OC[C@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC GPXQYXMZUPIJMH-XWGUCVLRSA-N 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate;hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N 0.000 description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 3
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 3
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 3
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-M 9-cis,12-cis-Octadecadienoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC([O-])=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-M 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 2
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000145525 Spinach latent virus Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003817 anthracycline antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 229940124630 bronchodilator Drugs 0.000 description 2
- 239000000168 bronchodilator agent Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000010408 film Substances 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940049918 linoleate Drugs 0.000 description 2
- 229940040452 linolenate Drugs 0.000 description 2
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-M linolenate Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC([O-])=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-M 0.000 description 2
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 2
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000002911 mydriatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002459 polyene antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L sodium dithionite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])=O JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229960002555 zidovudine Drugs 0.000 description 2
- HFVMEOPYDLEHBR-UHFFFAOYSA-N (2-fluorophenyl)-phenylmethanol Chemical compound C=1C=CC=C(F)C=1C(O)C1=CC=CC=C1 HFVMEOPYDLEHBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- AFSHUZFNMVJNKX-LLWMBOQKSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycerol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC AFSHUZFNMVJNKX-LLWMBOQKSA-N 0.000 description 1
- ZQXCQTAELHSNAT-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-3-nitro-5-(trifluoromethyl)benzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(Cl)=CC(C(F)(F)F)=C1 ZQXCQTAELHSNAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXLHNFOLHRXMAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-benzylphenoxy)-n,n-diethylethanamine;hydron;chloride Chemical compound Cl.C1=CC(OCCN(CC)CC)=CC=C1CC1=CC=CC=C1 TXLHNFOLHRXMAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-M Arachidonate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC([O-])=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 238000001919 Rayleigh scattering spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 108010087049 alanyl-alanyl-prolyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 229940114078 arachidonate Drugs 0.000 description 1
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical group CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229940116224 behenate Drugs 0.000 description 1
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-M behenate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N carbonic acid monoamide Natural products NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000604 cryogenic transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004576 lipid-binding Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 description 1
- ZUHZZVMEUAUWHY-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CCCN(C)C ZUHZZVMEUAUWHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- 229940067626 phosphatidylinositols Drugs 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008106 phosphatidylserines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-Q spermidine(3+) Chemical compound [NH3+]CCCC[NH2+]CCC[NH3+] ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-Q 0.000 description 1
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-R spermine(4+) Chemical compound [NH3+]CCC[NH2+]CCCC[NH2+]CCC[NH3+] PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-R 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 229940114926 stearate Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- QZZGJDVWLFXDLK-UHFFFAOYSA-M tetracosanoate Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O QZZGJDVWLFXDLK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- KJAMZCVTJDTESW-UHFFFAOYSA-N tiracizine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2N(C(=O)CN(C)C)C2=CC(NC(=O)OCC)=CC=C21 KJAMZCVTJDTESW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Description
Oblast techniky
Tento vynález je směřován k metodě zapouzdřování komplexů, jako třeba polykationtově kondensovaných nukleových kyselin, do liposomů, při použití emulze stabilizované amfipatickými lipidy, jako prostředí, v kterém se komplex tvoří. Metoda podle vynálezu je použitelná pro získání liposomů obsahujících různé sloučeniny, které dosud bylo obtížné vložit do liposomů při vysokých poměrech sloučeniny k lipidu.
Dosavadní stav techniky
Aby mohla bioaktivní látka být použita jako farmaceutický preparát, musí být schopna dosáhnout terapeutického místa v přiměřeně terapeuticky účinném množství. Zatímco mnohé bioaktivní látky jsou stabilní in vivo, jiné jsou naopak často degradovány. Dojde-li k takové degradaci dříve, než léčivo nebo bioaktivní látka dosáhnout cílového místa, bude cílové místo dosaženo ne-terapeutickým množstvím léčiva. Jiná léčiva nebo bioaktivní látky jsou přijaty jinými než cílovými systémy, výsledkem čehož je opět nedostatek terapeutického množství léčiva nebo bioaktivní látky, které dosahují cílové místo v terapeutickém množství. Určitá polární léčiva nemohou vstoupit do buněk v důsledku jejich neschopnosti proniknout membránou cílového místa. Jedinou cestou, jak tato polární léčiva mohou vstoupit do buněk, je příjem procesem endocytosy, který je vystavuje účinkům degradativních lysosomálních enzymů buňky. Ještě jiným problémem v léčebném podání léčiva nebo bioaktivní látky je neschopnost podat léčivo nebo bioaktivní látku v tak vysoké koncentraci, aby byla léčivá, s čímž bývá často spojena potřeba odstranění toxicity. Tyto problémy se řeší různými metodami. Pokud léčivo nebo bioaktivní látka není spojeno s toxicitou, může být podáno v dávkách dostatečně vysokých ktomu, aby bylo možno kompenzovat degradaci, odstranění necílovými místy a nedostatek zasažení míst, kde je léčivo nebo bioaktivní látka potřebná. Mnohá léčiva nebo bioaktivní látky jsou však buď příliš drahá, aby bylo možné takové plýtvání nebo jejich toxicita zabraňuje podání tak vysokých dávek. Byly použity četné metody k překonání některých z problémů spojených s podáváním terapeutických množství léčiv nebo bioaktivních látek.
Jednou z takových metod je zapouzdření léčiv nebo bioaktivních látek do liposomů. I když některá léčiva nebo bioaktivní látky mohou být zapouzdřeny do liposomů ••:pcws)o/$95 ·· · · ··· v terapeuticky účinných dávkách pasivním vložením nebo gradientovým vkladem, jsou tyto metody omezeny buď na léčiva nebo bioaktivní látky se specifickými chemickými vlastnostmi nebo na léčiva nebo bioaktivní látky, které mohou být podány v relativně malých koncentracích. Některé bioaktivní sloučeniny, jako slabé báze nebo slabé kyseliny, mohou být vloženy vzdáleně do upravených liposomů za tvorby vysoce koncentrovaných komplexů. Tento typ vkládání, popisovaný jako vzdálené nebo gradientově vkládání, vyžaduje, aby léčivo nebo bioaktivní látka byla dočasně schopná proniknout lipidickou dvoj vrstvou liposomů. Toto však neplatí pro všechny bioaktivní molekuly, mnohé z nich nemohou procházet liposomální dvojvrstvou.
Jednou z oblastí, ve kterých byly pokusy podávat terapeutické hladiny léčiv nebo bioaktivních látek pouze částečně úspěšné, je oblast genové terapie. Genová terapie zahrnuje introdukci exogenního genu do buněk příslušného typu, jež je následována umožněním exprese těchto genů v buňce v terapeuticky významné hladině. Tato terapie v relativně krátkém časovém úseku pokročila od základního výzkumu k introdukci různých genů do buněk, včetně genů užitečných pro léčbu zhoubných nádorů (Duque et al., Histol Histopathol,\3'. 231-242 (1998); Runnebaum et al., Nnticancer Res., 17:2887-2890 (1997). Zatímco prostá DNA byla v některých případech přijata buňkami (Wolff et al., Science, 247:1465-1468 (1990), nemůže tomu tak v důsledku její velké velikosti a vysokému stupni negativního náboje být obecně. Prostou DNA nelze navíc upravit tak, aby mohla být cílena na specifické buňky. Podle toho je úspěšná genová terapie obecně závislá na dostupnosti „vektorů“ pro introdukci DNA a jiných nukleových kyselin do buněk.
V současnosti jsou dvě hlavní skupiny systémů pro introdukci DNA, virový a nevirový. Virové vektory, včetně virů neschopných replikace, jako retroviry, adenoviry a adenoasociované viry jsou potud nej častěji popisované genové přenašeče (Robbins et al., Trends in Biotech., 16:35-40 (1998)). Jejich použití však překáží imunogenicita jejich virových složek, možné riziko reverze do stavu způsobilosti replikace, možná introdukce mutací vyvolávajících tumory, nedostatek cílících mechanismů, omezení v kapacitě pro DNA, obtíže při výrobě ve velkém měřítku a jiné faktory (viz např.: Lee and Huang, JBiol Chem, 271: 8481-8487(1996)).
• · · · ·· ·♦ ·· · • · ♦· · · ·♦· . : : *··řCWsbo/5S95 ·· · · ·· ·· ···
Jako alternativa k virovým vektorům byly vyvinuty dva hlavní typy nevirových transportních prostředků. Kationtové komplexy DNA sliposomem (neboli „lipoplexy“, Felgner et al., Proč Nati Acad Sci USA, 84: 7413-7417 (1987)), sestávající z kationtového lipidu a DNA, jsou potud nejpodrobněji popsanou alternativou k virovým vektorům přenosu genů. Takovéto lipoplexy však mají při použití v genové terapii několik hlavních nevýhod včetně nízké stability, vysoké toxicity, biologické neodbouratelnosti, nepatrné kondensace a ochrany DNA, sérové citlivosti, velké velikosti a nedostatku tkáňové specifity. Nadto, vzhledem k jejich pozitivnímu náboji, obecně nespecificky reagují s negativně nabitým povrchem většiny buněk. Ve shodě s tím je obecně nemožné zacílit in vivo takové lipoplexy na specifická místa.
Druhou kombinaci lipoplexu a DNA představuje DNA kondenzovaná s polylysinem, vázaná na anionický liposom (Lee and Huang, J Biol Chem, 271:8481-8487 (1996)). Toto vyžaduje určité anionické lipidy, aby byla vytvořena aktivní struktura. Vzniklé lipoplexy buď zcela nezapouzdřují DNA nebo musí tvořit dvě nebo více dvojvrstev kolem kondensované DNA. V posledním případě přenosu do cytoplasmy by DNA potřebovala proniknout při nejmenším třemi membránami. Lze očekávat inhibici účinnosti transfekce. V dříve jmenovaném případě může být stabilita vyrovnána expozicí DNA ve fyziologických solných roztocích.
Liposomy jsou dalším typem nevirového vektoru a nabízejí některé výhody pro takové použití ve srovnání s lipoplexy. Například, liposomové dvojvrstvy tvoří okolí zapouzdřených nukleových kyselin, čímž chrání nukleové kyseliny před degradací okolními nukleázami; lipoplexy naopak nezapouzdřují nukleové kyseliny a tudíž je nemohou zcela oddělit od okolních nukleáz. Navíc, liposomy mohou zapouzdřovat ve svých vodných kompartmentech kromě nukleových kyselin současně i jiné bioaktivní látky; lipoplexy nikoliv, protože nezapouzdřují vodné objemy. Liposomy mohou být navíc připraveny jako neutrálně nabité nebo aniontové oproti lipoplexům, oproti striktní iontové povaze shora zmíněných lipoplexů. Liposomy lze tedy upravit tak, aby byla odstraněna cytotoxicita indukovaná přenosovým aparátem a zvýšena jejich akumulace na specifických, zvolených místech.
. : : ‘••:pc,]ýuw5C95 «· «· ·· · · ···
I když koncept zapouzdřování bioaktivních látek není nový, mnoho látek je obtížné zapouzdřit do liposomů při jakýchkoliv hladinách a u jiných bylo prokázáno obtížné zapouzdření při hladinách, které by byly terapeuticky účinné. Mnoho malých molekul lze zapouzdřit do liposomů. ale opět unikají. Je také obtížné zapouzdřit některé bioaktivní látky a udržet je vliposomech při terapeuticky účinné dávce po terapeuticky účinnou dobu. Je obtížné, například, zapouzdřovat jednotlivé velké molekuly do komplexu v liposomů. Obtížné je rovněž používat mnohé ve vodě rozpustné molekuly jako terapeutika, protože nejsou schopné proniknout buněčnou membránou. Když zapouzdřujeme do liposomů, které se mohou spojovat s buněčnou membránou, je možné přenést tato léčiva v terapeuticky účinných dávkách do cílových buněk. Metoda tohoto vynálezu umožňuje tvorbu liposomů obsahujících taková léčiva nebo bioaktivní látky v terapeuticky použitelné formě.
Bylo učiněno několik pokusů o zapouzdření nukleové kyseliny do liposomů, přičemž bylo použito reverzní fázové evaporace (Fraley et al., J Biol Chem,255: 1043110435 (1980)), dehydratace a opětné rehydratace (Alizo et al., J Microencap, 7: 497-503 (1990)), zmrazování a rozmrazování (Monnard et al., Biochem Biophys Acta, 1329: 39-50 (1997)) v metodách tvorby liposomů. Každá z těchto metod má však svá omezení, včetně potřeby nízké počáteční koncentrace nukleové kyseliny, jejímž výsledkem je významné procento prázdných vesikulů ve výtěžku liposomů, neschopnost reprodukovatelně zapouzdřovat do liposomů množství DNA, dostatečná pro terapeutický účinek na požadovaných cílových místech a obtíže při optimalizaci přenašečů vzhledem k ochraně jejich zapouzdřených nukleových kyselin před degradací způsobenou nukleasami.
Byly také učiněny pokusy komplexovat DNA s komplexotvornými činidly a následně zapouzdřit tuto komplexovanou DNA do liposomů. Komplexotvorná činidla jsou činidla, která reagují s jinými molekulami a způsobují precipitaci nebo kondensaci těchto molekul. Komplexotvorná činidla použitelná v praxi tohoto vynálezu jsou vybrána ze skupiny sestávající z nabitých molekul, které mají opačný náboj, než je náboj bioaktivní látky. Toto komplexotvorné činidlo může být vybráno ze skupiny nabitých molekul sestávající ze sperminu, spermidinu, hexamokomplexů kobaltu, iontů vápníku, iontů hořčíku, polylysinů, polyhistidinů, protaminů, polyaniontů, jako jsou heparin a dextran sulfát a citrátové nebo síranové ionty. S nábojem +3 a vyšším jsou známy např. polyaminy, polylysiny a hexamokoplexy trojmocného kobaltu (viz Chattoraj et al., J Biol Chem, 121:
A, »······»···· • · · · · · · · * · · '••íčtÍusÓo/s^s ··· «Μ *· ·· ·» ···
327-337 (19789); Gosule LC and Schellman JA. Nátuře,259: 333-335 (1976); Vitello et al., Gene Therapy,3: 396-404 (1996); Widom et al., J. Mol. Biol., 144: 431-453 (1980); Ascott et al., Biopofymers, 30: 619-630 (1990); Wilson et al., Biochem, 18: 2192-2196 (1979)), schopné kondenzovat molekuly DNA interakcí s násobnými negativními náboji DNA. Polyaminy, např. spermidin (3+) a spermin (4+), se na rozdíl od jiných typů polykationtů vyskytují přirozeně ve všech živých buňkách (viz např. Ames and Dubin, J Biol Chem, 253: 769-775 (1960); Tábor and Tábor, Annu Rev Biochem,53: 749-790 (1984)). Vysoké hladiny polyaminů existují v aktivně proliferujících živočišných buňkách a jsou pokládány za nezbytné pro udržování normálního buněčného růstu (Ames and Dubin, J Biol Chem,253: 769-775 (1960); Tábor and Tábor, Annu Rev Biochem,53: 749-790 (1984); Hafner et al., J Biol Chem, 254: 12419-12462 (1979); Pegg, Biochem J,234: 249-262 (1986)).
Liposomové zapouzdření lineární DNA kondenzované sperminem vliposomech byla vyzkoušena Tichoněnkem et al., Gene,63: 321-330 (1988). Počáteční koncentrace DNA byla však nízká, důsledkem čehož měly výsledné liposomy nízký poměr zapouzdřené DNA k liposomálnímu lipidu (0,02 až 0,2 mikrogramů DNA na mikromol lipidu). Takováto kondenzace lineárních molekul DNA v nepřítomnosti intermolekulámích agregátů DNA vyžadovala kontrolu koncentrace sperminu v nepraktickém stupni přesnosti. Baeza et al., Ori Life Evol Biosphere,2\: 225-252 (1992) a Ibanez et al., Biochem Cell Biol,14: 633-643 (1996) popisují nezávisle zapouzdření 1 až 4 mikrogramů SV40 plazmidu DNA kondenzovaného sperminem vliposomech. Žádný z jejich preparátů nebyl však po tvorbě liposomů dialyzován proti pufrům s vysokou koncentrací solí, takže popsané množství zapouzdřené DNA může obsahovat významné procento nezapouzdřené DNA. Protože tyto liposomové formulace nebyly vystaveny degradaci DNAázou pro určení procenta DNA skutečně oddělené v liposomů, popsané množství pravděpodobně neodpovídá skutečně zapouzdřené DNA.
Účinná příprava a použití liposomálních zapouzdřených nukleových kyselin vyžaduje použití vysoce koncentrovaných suspenzí nukleových kyselin, s cílem minimalizovat procento prázdných liposomů na konci procesu a maximalizovat poměr DNA k liposomálnímu lipidu. Výsledkem kondenzace DNA při vysokých koncentracích v průběhu známých metod tvorby liposomů je obecně intermolekulární agregace vedoucí k tvorbě na nukleových kyselinách založených struktur, které jsou nevhodné pro přenos genu. Velké • · · ·
• · · · ♦ ♦ · · : · *··ρστζυ80ο/5395 ·· ·· ·· ··· agregáty vzniklé přímou kondenzací DNA s komplexotvorným činidlem nemohou být snadno zapouzdřeny v liposomech a tak velké agregátní struktury (řádově ve velikosti buněk) nemohou účinně přenášet materiály do cílových buněk.. Jsou-li agregáty například větší než 500 nm, jsou po intravenózní aplikaci rychle vylučovány z oběhu v důsledku jejich velikosti. Na druhé straně, větší agregáty mohou být podány buňkám in vitro. Mnohdy jsou však agregáty příliš velké i pro jejich příjem buňkami.
Aby bylo tudíž možno přenést různé léky v terapeuticky účinných množstvích do cílových buněk, bylo nezbytné získat metodu přípravy liposomů, které obsahují bioaktivní látky komplexované tak, aby byla snížena jejich permeabilita lipidickou dvojvrstvou, přičemž tato metoda také omezuje velikost komplexu, který má být zapouzdřen v liposomů, tak, aby výsledný terapeutický produkt byl v terapeutickém rozsahu velikosti.
Podstata vynálezu
Podaný vynález poskytuje metodu zapouzdřování bioaktivní látky do liposomů, která zahrnuje tyto kroky:
(a) rozpuštění nejméně jednoho amfipatického lipidu v jednom nebo více organických rozpouštědlech (b) spojení nejméně jedné vodné suspenze zahrnující roztok obsahující první molekulu vybranou ze skupiny sestávající z bioaktivní látky a komplexotvorného činidla s organickým roztokem obsahujícím lipid z kroku (a) tak, aby vznikla emulze ve formě reverzní micely zahrnující první molekulu a lipid;
(c) přidání druhé vodné suspenze zahrnující druhou molekulu vybranou ze skupiny tvořené bioaktivní látkou a komplexotvorným činidlem, přičemž jestliže první molekula je bioaktivní látkou, je druhá molekula komplexotvorným činidlem a naopak, k emulzi z kroku (b), (d) inkubování emulze z kroku (c) umožňující komplexotvornému činidlu kontakt s bioaktivní látkou, čímž vznikne komplex bioaktivní látky s komplexotvorným činidlem ve vodné kapce stabilizované lipidem, přičemž průměr jmenovaného komplexu není větší než průměr vodné kapky a • · · ·
• · · · φ · * • · « φ ♦ ♦ φ · : : ***?>CTjUSD0/5295 • · ·« · · · · · (e) odstranění organického rozpouštědla ze suspenze z kroku (d) tak, aby vznikl liposom obsahující komplexovanou bioaktivní látku a lipid.
Metoda podle vynálezu je použitelná pro přípravu terapeuticky použitelných liposomů obsahujících velký rozsah bioaktivních molekul komplexovaných komplexotvorným činidlem v liposomů. Výhodnými liposomy jsou fúsogenní liposomy, které metodou podle vynálezu mohou zapouzdřovat různé molekuly. Tyto fusogenní liposomy jsou schopné spojení s buněčnými membránami a umožňují předání bioaktivních látek do buněk a orgánů v terapeuticky účinném množství. Metoda podle vynálezu umožňuje navíc zapouzdřit do liposomů více než jednu bioaktivní látku. Jednu nebo více bioaktivních látek lze zapouzdřit do toho samého liposomů metodou podle vynálezu současně. Je-li metodou podle vynálezu zapouzdřena do liposomů jedna nebo více bioaktivních látek, není nutné, aby všechny tyto bioaktivní látky byly ve formě komplexů.
Některé bioaktivní látky procházejí snadno lipidickou dvojvrstvou a tudíž nejsou stabilně odděleny v liposomů. V důsledku tvorby komplexů bioaktivních látek s komplexotvorným činidlem zůstávají bioaktivní látky v liposomech. Hlavní překážkou byl problém zapouzdření komplexovaných bioaktivních látek do liposomů. Jsou-li bioaktivní látka a komplexotvorné činidlo smíseny v roztoku před zapouzdřením do liposomů, potom při koncentracích nutných pro účinné naplnění liposomů vznikají nekontrolovatelně velké komplexy. Termín bioaktivní komplex je jakákoliv bioaktivní látka navázaná na komplexotvorné činidlo tak, že vzniklý komplex má změněné fyzikální vlastnosti jako zmenšení velikosti bioaktivní molekuly, snížení rozpustnosti bioaktivní látky, precipitaci bioaktivních látek, kondensaci bioaktivní látky nebo zvýšení velikosti komplexu.Jednou z předností tohoto vynálezu je, že tvorbou komplexu bioaktivní látky v reverzní micele je zabráněno vzniku nevhodně velkých komplexů neschopných zapouzdření do terapeuticky použitelných liposomů.
Vznik komplexů obsahujících bioaktivní sloučeninu v liposomech má tu výhodu, že takové komplexy jsou málo náchylné k úniku z liposomů před tím, než jsou předány do požadované cílové buňky. Tvorba komplexu může nadto koncentrovat v liposomů velké množství bioaktivní látky, takže poměr bioaktivní látky k lipidu je vysoký a předání je účinné. Předkládaná metoda poskytuje možnost pro spojení bioaktivních materiálů ···«· · · · · ·· * • · φ · « φ · · ♦ · · : *pcTÍJsao/5Í95 ·φ« «· φ· *· ·· ·*· komplexotvorným činidlem v emulzi následované zapouzdřením v liposomu způsobem, který zabraňuje vzniku extrémně velkých, škodlivých agregátů, větších než několik mikronů z bioaktivní látky a komplexotvorného činidla.
V jednom provedení poskytla metoda podle vynálezu metodu zapouzdření komplexů nukleových kyselin. Například nukleové kyseliny, jako taková DNA, jsou spojeny s komplexotvorným činidlem v reversní (invertované) micele, při následné tvorbě liposomů z micel. I když, jak je popsáno shora, byly učiněny předchozí pokusy zapouzdřovat DNA do liposomů, žádná z jmenovaných metod nebyla úspěšná při účinné přípravě terapeuticky použitelné liposomální DNA.
Tento vynález poskytuje metodu pro přípravu liposomů obsahujících nukleovou kyselinu v množstvích nejméně okolo 0,5 mikrogramu nukleové kyseliny na mikromol liposomálního lipidu.
Lipidová složka liposomu obsahuje derivát fosfolipidu a doplňkový lipid. Obecné proporce jsou asi 20 až 80 mol. % derivátu fosfolipidu a asi 80 až 20 mol. % doplňkového lipidu. Navržené deriváty fosfolipidu zahrnují: konjugáty fosfatidyletanolaminu (PE) sbiotinem; N-acylované fosfatidyletanolaminy (NAPEs), jako N-C12 DOPE; a konjugáty fosfatidyletanolaminu s peptidem, tak jako Ala-Ala-Pro-Val DOPE. Doplňkovým lipidem může být množství lipidů obvykle zabudovaných vliposomech. Tam, kde však derivátem fosfolipidu je NAPĚ, je doplňkovým lipidem přednostně fosfatidylcholin (např. DOPC). Jako nukleová kyselina je přednostně DNA.
Tímto je tedy zde poskytnuta metoda jak připravit farmaceutickou kompozici obsahující liposom a farmaceuticky přijatelný nosič. Jmenovaná kompozice může být užita pro přenos nukleové kyseliny do buněk živočicha.
Jiné a další cíle, charakteristiky a výhody budou zřejmé z následujících popisů vybraných ukázek vynálezu, uvedených pro objasnění ve spojení s následujícími obrázky.
Přehled zkratek a jim odpovídajících termínů používaných v této přihlášce: PE, fosfatidyletanolamin; PC, fosfatidylcholin; EPC, vaječný fosfatidylcholin; DO-, dioleoyl-;
• 9 9 • •99
<·· · · **· • : ’*4cws(jo/5::95 ·· ·· · · 9 9 ·
DOPC, dioleoylfosfatidylcholin; DOPE, dioleoylfosfatidyletanolamin; NAPĚ, N-acylovaný fosfatidyletanolamin; N-C12 DOPE, N-dodekanoyldioleoylfosfatidyletanolamin; AAPVDOPE, Ala-Ala-Pro-Val-dioleoylfosfátidyletanolamin; CBAM, acetoxymetylester calceinové modři; PBS, fyziologický fosfátový pufr; LBS, pufr s malou koncentrací solí; HBSS, Hanksův balancovaný solný roztok; EGFP, protein se zvýšenou zelenou fluorescencí; SPLV, stabilní plurilamelární liposomy; ML V, multilamelární liposomy; ULV, unilamelární liposomy; LUV, velké unilamelární liposomy; SUV, malé unilamelární liposomy;ds DNA dvojřetězcová DNA; TEM, transmisní elektronová mikroskopie.
Předkládaný vynález poskytuje metodu zapouzdření bioaktivního komplexu v liposomu, která obsahuje tyto kroky:
(a) rozpuštění nejméně jednoho amfipatického lipidu v jednom nebo více organických rozpouštědlech (b) spojení nejméně jedné vodné suspenze zahrnující roztok obsahující první molekulu vybranou ze skupiny sestávající z bioaktivní látky a komplexotvorného činidla, s organickým roztokem obsahujícím lipid z kroku (a) tak, aby vznikla emulze ve formě reverzní micely zahrnující první molekulu a lipid;
(c) přidání druhé vodné suspenze zahrnující druhou molekulu vybranou ze skupiny sestávající z bioaktivní látky a komplexotvorného činidla, přičemž, jestliže první molekulou je bioaktivní látka, druhou molekulou je komplexotvorné činidlo a obráceně, k emulzi z kroku (b) (d) inkubací emulze z kroku (c) nechat komplexotvorné činidlo v kontaktu s bioaktivní molekulou, čímž vznikne komplex bioaktivní látky s komplexotvorným činidlem uvnitř vodní kapky stabilizované lipidem; přičemž jmenovaný komplex nemá větší průměr než je průměr vodní kapky a (e) odstranění organického rozpouštědla ze suspenze z kroku (d), tak aby vznikly liposomy obsahující komplexní bioaktivní látku a lipid.
Metoda podle vynálezu je použitelná pro přípravu terapeuticky použitelných liposomů obsahujících široké spektrum bioaktivních molekul, které jsou komplexovány komplexotvorným činidlem, v liposomu. Je výhodné, jestliže že liposomy, které metodou podle vynálezu mohou zapouzdřovat různé molekuly, jsou fusogenní liposomy. Tyto
• · · φ · φ
•. .Ucavtrsot)/53l>5 · · Φ • 4 * · · · · fusogenní liposomy jsou schopné se spojovat s buněčnými membránami a umožňovat předání bioaktivních látek v terapeuticky účinném množství do buněk a orgánů. Nadto metoda podle vynálezu umožňuje zapouzdření více než jedné bioaktivní látky do liposomu. Jedna nebo více bioaktivních látek může být zapouzdřena metodou podle vynálezu vtom samém liposomu a v tom samém čase. Je-li v liposomu zapouzdřena metodou podle vynálezu více než jedna bioaktivní látka, není nutné, aby každá z bioaktivních látek byla ve formě komplexu.
Termín „bioaktivní látka“ značí libovolnou sloučeninu nebo látkovou směs, kterou lze podat živočichům, přednostně člověku, z terapeutických nebo diagnostických důvodů. Metoda podle vynálezu je použitelná pro zapouzdřování bioaktivních látek včetně, ale ne jenom, ve vodě rozpustných membránou nepropustných látek, jako nukleové kyseliny, analoga nukleotidů nebo nukleosidů jako cytosin β-D-arabinofuranosid 5'-trifosfát (araCPT), proteiny jako cytochrom c, polární protirakovinné látky jako cis platina, N-fosfono -acetyl-L-asparagová kyselina nebo 5-fluororotová kyselina, polární nebo nabité deriváty protirakovinných látek, polární peptidy, histonové inhibitory deacetylas jako butyrát atd. Bioaktivní látky také zahrnují, ale ne jenom, látky vybrané ze skupiny sestávající z nukleových kyselin, jako DNA a RNA, antivirové látky jako acyclovir, zidovudin a inerferony; antibakteriální látky jako aminoglykosidy, kefalosporiny a tetracykliny; protiplísňové látky jako polyenová antibiotika, imidazoly a triazoly; antimetabolické látky jako kyselina listová a purinová a pyrimidinová analoga; antineoplastické látky jako antracyklinová antibiotika a rostlinné alkaloidy; sacharidy, např. cukry a škroby; aminokyseliny, peptidy, proteiny jako buněčné proteinové receptory, imunoglobuliny, enzymy, hormony, neurotransmitery a glykoproteiny; barviva; radioisotopy a sloučeniny značené radioisotopy; mydriatické sloučeniny; fluorescenční sloučeniny; bronchodilatační látky; lokální anestetika; a jim podobná.
Termín bioaktivní komplex je jakákoliv bioaktivní látka vázaná ke komplexotvomému činidlu tak, že tímto vzniklý komplex má výsledně změněné fyzikální vlastnosti jako velikost bioaktivní molekuly, snížení rozpustnosti bioaktivní látky, precipitace bioaktivních látek, kondenzace bioaktivní látky nebo zvýšení velikosti komplexu.
• · φ · · · · 4 · 4 ···· 4 Τ 44 : : : ‘••icT/cisfeh • 4 ·· · · 4 4 ·
Emulze typu voda v oleji obsahující reverzní micely byly dříve použity ke studiu enzymové kinetiky (např. Bru et al., Biochem J, 310: 721-739 (1995)) a ke vzniku liposomů (např. Szoka et al., Proč Nati Acad Sci USA, 75: 4194-4198 (1978); Gruner et al., Biochem ,
24: 2833-2842 /1984)), ale použití takových emulzí pro modulaci komplexace dvou sloučenin za účelem vložení do liposomů nebylo dříve popsáno.
Emulze lze tvořit různými metodikami, bez problémů v mezích schopností běžně kvalifikovaných pracovníků.. Sonifikací, mixováním, mechanickým mícháním, statickým mícháním, homogenizací, ínjektováním, mikrofluidizací, koloidním mletím, tlakovými emulsifikátory a/nebo na Kady mlýncích, lze připravit emulze různých typů včetně různých pořadí přidání materiálů. Emulze v předkládaném vynálezu jsou tvořeny ve dvou krocích, takže minimálně jedna složka, bioaktivní látka nebo komplexotvomé činidlo, je oddělena ve vodní kapce emulze stabilizované lipidem ještě před přidáním vodné disperze druhé látky.
Při odstraňování rozpouštědla z emulze stabilizované lipidem vznikají „liposomy“. Rozpouštědlo lze odstranit jakýmkoliv počtem metod, včetně, ale ne jenom, rotačním odpařováním a proháněním proudem dusíku.
„Liposomy“ jsou samoshlukující se struktury obsahující jednu nebo více lipidických dvojvrstev, z nichž každá obsahuje dvě monovrstvy amfipatických lipidických molekul, vzájemně opačně orientovaných. Amfipatické lipidy obsahují polární (hydrofilní) oblast hlavní skupiny kovalentně vázanou k jednomu nebo dvěma nepolárním (hydrofobním) acylovým řetězcům. Energeticky nevýhodný kontakt mezi hydrofobními acylovými řetězci a je obklopujícím vodným prostředím nutí amfipatické molekuly, aby se vzájemně nastavily tak, že jejich polární hlavní skupiny jsou orientovány k povrchu dvojvrstvy, zatímco acylové řetězce se přeorientují směrem dovnitř dvojvrstvy. Tak je utvořena energeticky stabilní struktura, v níž jsou acylové řetězce účinně stíněny před kontaktem s vodným prostředím.
Liposomy (viz např. Cullis et al., Biochim Biophys Acta, 559: 399-420 (1987); New, 1995) mohou mít jednoduchou lipidickou dvojvrstvu (unilamelární liposomy, „ULV“), nebo násobnou lipidickou dvojvrstvu (multilamelární liposomy, „MLV“ nebo SPLV“). Každá dvojvrstva obklopuje nebo zapouzdřuje nějaký vodný kompartment. Je-li toto zapouzdření vodného objemu v ochranné atmosféře molekul lipidu, jsou potom liposomy ···· 99 ·· ···
9 · ··»♦ * ♦· · ’Wť/©soS/5355 ··« 99 ·· 99 ♦ ···· schopny isolovat zapouzdřené molekuly, např. nukleové kyseliny, od degradativních vlivů některých faktorů, např. enzymů nukleáz, které jsou přítomny ve vnějším prostředí . Taková ochrana zapouzdřených molekul je, například v případě nukleových kyselin, demonstrována analýzou na agarovém gelu v příkladu 9, jehož výsledky jsou prezentovány na obrázku 4.
Liposomy mohou mít různou velikost, např. průměrný průměr tak malý jako 25 nm nebo tak velký jako 10 000 nm nebo více. Velikost je ovlivňována mnoha faktory, např. složením lipidu a metodou přípravy, což je rovněž v rámci schopností běžně kvalifikovaných pracovníků to stanovit a zodpovídat za to a stanovuje se různými technikami, jako např. kvazi-elastickým rozptylem, což rovněž je v možnostech odborníků.
Různé metodologie, také bez problémů v rámci schopností běžně kvalifikovaných pracovníků, jako je sonifikace, homogenizace, aplikace francouzského lisu a mletí, lze užít k přípravě liposomů menší velikosti z velkých liposomů. Extruze (viz např. U.S. patent č. 5 008 050) může být použita k velikostní redukci liposomů, což je produkce liposomů o předurčené průměrné velikosti protlačováním liposomů pod tlakem póry filtru o definované určené velikosti. Odstředivá průtoková filtrace (WO89/008846) může být také použita k řízení velikosti liposomů, což představuje produkovat populaci liposomů, které mají menší heterogenitu a více homogenní, definované rozdělení velikosti. Obsah těchto dokumentů je včleněn na tomto místě referencí.
Liposomy tohoto vynálezu mohou být unilamelární nebo oligolamelární a mohou mít stejnou velikost jako liposomy produkované jakoukoliv z metod uvedených dále. V preferovaném uspořádání tohoto vynálezu jsou liposomy unilamelární o průměrné velikosti asi 50 až 300 nm.
Liposomy jsou složeny z různých lipidů, amfipatických i neamfipatických, získaných z různých zdrojů, přírodních i syntetických. Vhodné liposomální lipidy zahrnují, bez omezení, fosfolipidy jako fosfatidylcholiny („PC), fosfatidyletanolaminy („PE“), fosfatidylseriny („PS“), fosfatidylglyceroly („PG“), fosfatidylinositoly („Pl“) a kyseliny fosfatidové („PA“). Takové fosfolipidy mohou mít obecně dva acylové řetězce, které jsou buď oba nasycené nebo oba nenasycené nebo jeden nasycený a druhý nenasycený. Tyto
• Φ ·· φ φ φ φ * ‘‘ÍcŤ/íjSÓb/53^5 řetězce zahrnují, bez omezení: myristátové, palmitátové, stearátové, oleátové, linoleátové, linolenátové, arachidátové, arachidonátové, behenátové a lignocerátové řetězce.
Fosfolipidy lze substituovat připojením knim vhodné reaktivní skupiny. Takovou skupinou je obecně aminoskupina a takto substituované fosfolipidy jsou fosfatidyletanolaminy. Různé částice vhodné k připojení na PE jsou, bez omezení: acylové řetězce (WO98/16199), užitečné pro zvýšení schopnosti liposomů připojovat se k biologickým membránám; peptidy (WO98/16240), užitečné pro destabilizaci liposomů v blízkosti cílových buněk; biotinové a maleinimidové zbytky (U.S. patent č. 5 059 421, resp. 5 399 331), užitečné pro vazbu „zaměřovačích“ částic, jako protilátek kliposomům; a různých molekul, jako jsou gangliosidy, polyalkylétery, polyetylenglykoly a organické dikarboxylové kyseliny (viz například U.S. patenty č. 5 013 556, 4 920 016 a 4 837 028). Obsahy shora citovaných dokumentů jsou zde včleněny referencí. .
V souhlase s tím ve většině doporučovaných uspořádání podle tohoto vynálezu, obsahují liposomy připravené metodou podle tohoto vynálezu substituovaný fosfolipid, upravený tak, aby zvyšoval předání jejich obsahu. Liposomy mohou také, ale není to nezbytné, obsahovat doplňkový lipidy. Uvedené doplňkové lipidy jsou inkorporovány do liposomů z mnoha důvodů zřejmých pracovníkům běžně školeným na poli liposomologie. Tyto důvody zahrnují, bez omezení, stabilizování nebo zacilování liposomů, rovněž jako další změny farmakokinetického chování. Vhodné doplňkové lipidy zahrnují kterékoliv z oněch lipidů, které jsou obecně vhodné pro inkorporaci do liposomů, včetně, bez omezení, fosfolipidů, glykolipidů a sterolů.
Liposomy tohoto vynálezu mají přednostně lipidickou složku, která sestává ze substituovaného fosfolipidů a doplňkového lipidu. Substituované fosfolipidy mají tento vzorec:
CHa-R1 □
CH-R2 □
CH2 -O-P(O)2 -o-ch2ch2nh-z, kde Z je vybráno ze skupiny sestávající zbiotinu a maleinimidového zbytku, skupiny označené R3 a skupiny mající obecný vzorec X-Y, kde X je můstek vybraný ze skupiny • · ·· · *44 · * 44
’ .,PCT/řJSÍ)t)/5595 sestávající z jednoduché vazby a skupiny R4; a Y je enzymaticky uvolnitelný peptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je substrátem peptidázy vylučované buňkami. Každá ze skupin R1, R2, R3 a R4 je skupina obecného vzorce
OC(O)(CH2)nl(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH)n7(CH=CH)n8(CH)n9CH3, kde nl je nula nebo celé číslo od 1 do 22; n3 je nula nebo celé číslo od 1 do 19; n5 je nula nebo celé číslo 1 až 16; n7 je nula nebo celé číslo od 1 do 13; n9 je nula nebo celé číslo od 1 do 10; a n2, n4, n6 a n8 jsou buď nula nebo 1. Každé z nl, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 a n9 je při každém výskytu stejné nebo různé.
Pro R1 a R2 součet nl + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 je nezávisle celé číslo od 12 do 22, zatímco pro R3 a R4 je součet nl + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 nezávisle celým číslem od 2 do 22. Uvedené susbstituované fosfolipidy přednostně představují asi 20 až 80 molárních % liposomálního lipidu.
Když R3 je -OC(O)(CH2)nl(CH-CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH)n7(CH=CH)n8(CH)n9. CH3, je substituovaným fosfolipidem N-acylovaný fosfatidyletanolamin („NAPĚ“, viz WO98/16199). Výhodně pak R3 je-OC(O)(CH2)„iCH3 nebo -OC(O)(CH2)i0CH3.
Substituovaným fosfolipidem je přednostně N-acylovaný PE. Takovéto NAPĚ jsou použitelné pro přípravu fusogenních liposomů a je jim dávána přednost pro přípravu liposomů obsahujících komplexy léčiv nebo bioaktivních látek podle vynálezu.
Destabilizace dvojvrstev indukovaná NAPĚ způsobuje jejich spojení s biologickými membránami v jejich blízkosti a tak zvyšuje fosogenicitu dvojvrstev (Shangguan et al., Biochim Biophys Acta,]368'. 171-183 (1998)). Zvýšená fusogenicita, naopak, může být použita k přenosu zapouzdřených bioaktivních látek jako nukleových kyselin nebo jiných látek, které nemohou proniknout buněčnou membránou, do buněk, spojením buněk s liposomy za podmínek, jako např., v přítomnosti vhodných koncentrací například Ca2+ nebo Mg2+. Výsledkem kontaktu buněk s liposomy je uvolnění bioaktivní látky zapouzdřené v liposomů u buňky a nebo přímo do buněčné cytoplasmy v důsledku spojení liposomů a buněčných membrán. Takový přenos je buď in vivo nebo in vitro.
• « 0 0 0 0 * • · 0 ♦ 0 0 ·
0 0 0 0 0
• ♦ 0 0 • 0 0 00
J :^W®/53.Í5
Když R3 je acylový řetězec nebo peptid a tudíž když substituovaný fosfolipid je
NAPĚ nebo konjugát lipidu s peptidem, pak přinejmenším jeden z R1 a R2 je přednostně nenasycený acylový řetězec, t j., přinejmenším jeden z n2, n4, n6 a n8 v něm je roven jedné. Nenasycené acylové řetězce obsahují, bez omezení, palmitooleátové, oleátové, linoleátové, linolenátové a arachidonátové řetězce. Jako nenasycený acylový řetězec je přednostně oleátový řetězec (,,-OC(O)(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3“). Ještě výhodnější je, když oba acylové řetězce jsou oleátové řetězce, t.j., substituovaný fosfolipid je potom:
CH2-OC(O)(CH2)7(CH=CH)(CH2)7 ch3 □
CH-OC(O)(CH2)7(CH=CH)(CH2)7 ch3 □
CH2-O-P(O)2-O-CH2CH2NH-Z, kde Z je R3 nebo X-Y. Nejvýhodnější substituovaný fosfolipid je potom
CH2- OC(O)(CH2)7(CH=CH)(CH2)7CH3 □
CH- OC(O)(CH2)7(CH=CH)(CH2)7CH3 □
CH2 -O-P(O)2 -0-CH2CH2NH-OC(0)(CH2)ioCH3;
t.j., „N-C12 DOPE“.
Když je substituovaným fosfolipidem N-C12 DOPE, liposomální lipid obsahuje také přednostně fosfatidylcholin, přednostně PC s jedním nenasyceným acylovým řetězcem, největší přednost je dávána dioleoyl fosfatidylcholinu. Nejvýhodnější složení liposomálního lipidu je asi 70 mol. % N-C12 DOPE a asi 30 mol. % DOPC (t.j. „70:30“ složení N-C12 DOPE a DOPC, čímž jsou koncentrace liposomálního lipidu na tomto místě popsány poměrem a čímž jsou takové poměry ukazatelem relativních procentických zastoupení jednotlivých popisovaných lipidů v liposomálním lipidu).
Liposomální lipid může také obsahovat lipid s modifikovanou hlavní skupinou, t.j. lipid, který má polární skupinu substituovanou připojením kní části, která je schopná inhibovat připojení sérových proteinů k liposomu obsahujícímu tento lipid. Začlenění lipidu s modifikovanou hlavní skupinou do liposomů tedy mění jejich farmakokinetické chování, takže liposomy zůstávají v oběhu živočicha po delší časovou • »» « «
periodu, než jak tomu bylo jinak (viz např. Blume et al., Biochim Biophys Acta, 1149: 180 (1993); Gabizon et al., Pharm. Res., 10(5): 703 (1993); Park et al., Biochim Biophys
Acta,257\ 1108(1992); Woodle et al., U.S. Patent No. 5,013,556; Allen et al., U.S. Patent
Nos. 4,837,028 a 4,920016; obsahy těchto dokumentů jsou na tomto místě začleněny referencí).
Typickými lipidy s modifikovanou hlavní skupinou jsou fosfatidyletanolaminy (PE), např. dipalmitoyl fosfatidyletanolamin („DPPE“), palmitoyloleoyl fosfatidyletanolamin („POPE“) a dioleoyl fosfatidyletanolamin („DOPE“), mezi jinými. Tyto lipidy mají hlavní skupiny obecně substituovány polyetylenglykolem nebo organickou dikarboxylovou kyselinou, tak jako kyselinou jantarovou nebo glutarovou („GA“) nebo jejich odpovídajícími anhydridy. Množství těchto lipidů s modifikovanou hlavní skupinou inkorporovaných do lipidového nosiče obecně závisí na mnoha faktorech dobře známých běžně školenému pracovníkovi a je v rámci jeho schopností je určit bez nepatřičných experimentů.Tyto faktory zahrnují, ale ne jenom, typ lipidu a typ modifikace hlavní skupiny; typ a velikost nosiče; a zamýšlené teraupeutické použití této sestavy. V typickém uspořádání je v nosiči obsahujícím lipidy s modifikovanou hlavní skupinou od asi 5 mol. % do asi 20 mol. % lipidů s modifikovanou hlavní skupinou.
Komplexotvorná činidla zahrnují, ale ne jenom, k bioaktivním látkám opačně nabitou skupinu zahrnující spermin, spermidin, hexamokomplex kobaltu, ionty vápníku, ionty hořčíku, polylysiny, polyhistidiny, protaminy, polyanionty jako heparin a sulfát dextranu, citrátové ionty a síranové ionty. Jednou z dovedností je také umění najít jiná použitelná komplexotvorná činidla použitelná v metodě podle vynálezu.
Kondenzované nukleové kyseliny zapouzdřené v liposomu jsou DNA včetně genomové DNA plazmidové DNA a cDNA nebo RNA; zapouzdřenou nukleovou kyselinou je přednostně DNA nebo ještě lépe, uzavřená (cirkulámí) DNA. Kondenzované nukleové kyseliny jsou zapouzdřeny vliposomech při hladině nejméně asi 0,5 mikrogramu na mikromol liposomálního lipidu, nebo nejméně asi 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75 nebo 2 mikrogramy na mikromol. Výhodnější je, když liposomy obsahují asi 2 mikrogramy nukleové kyseliny na mikrogram lipidu až asi 20 mikrogramů na mikromol. Termín „kondensovaný“, jenž je na tomto místě používán ve spojení s nukleovými kyselinami, se
444 *» •
• 4 4 4 λ»· · · · *»44 : : ’‘írr/iis(W53S5
4* 44 ··4*4 vztahuje knukleovým kyselinám, které jsou spojeny s jedním nebo více polykationty, takže vlákna nukleových kyselin jsou více těsněji uspořádána, než by tomu bylo v případě nepřítomnosti polykationtů. Takové stlačení dovoluje nukleovým kyselinám být zapouzdřen do liposomů, ale přesto zachovává tyto nukleové kyseliny v přenositelné, transkripce schopné konformaci.
V souhlase s tím, v doporučeném provedení tohoto vynálezu, metoda poskytuje liposomy obsahující kondensovanou DNA a liposomální lipidy, které obsahují asi 70 molárních % N-C12 DOPE a asi 30 molárních % DOPC. Takové liposomy obsahují nejméně 0,5 mikrogramu kondenzované DNA na mikromol lipidu.
Liposomy získané metodou podle vynálezu mohou obsahovat jednu nebo více bioaktivních látek jako přídavek ke komplexované bioaktivní látce. Bioaktivní látky, které se mohou asociovat s liposomy, zahrnují, ale ne jenom: antivirální látky tak jako acyklovir, zidovudin a interferony; antibakteriální látky tak jako aminoglykosidy, kefalosporiny a tetracykliny; antifungální látky tak jako polyenová antibiotika, imidazoly a triazoly; antimetabolity tak jako kyselina listová, a purinová a pyrmidinová analoga; antineoplastické látky tak jako antracyklinová antibiotika a rostlinné alkaloidy; steroly tak jako cholesterol; sacharidy, např. cukry a škroby; aminokyseliny, peptidy, proteiny tak jako proteinové buněčné receptory, imunoglobuliny, enzymy, hormony, neurotransmitéry a glykoproteiny; barviva; fluorescentní sloučeniny; mydriatické sloučeniny; bronchodilatační látky; lokální anestetika; a podobné.
Sestavy liposomálních bioaktivních látek mohou zvýšit terapeutický index bioaktivní látky, například tlumením látkové toxicity. Liposomy mohou také snižovat rychlost, s jakou jsou bioaktivní látky vylučovány z oběhu živočichů. V souhlase stím mohou sestavy liposomů bioaktivních látek snížit množství látky, jaké musí být podáno, aby bylo dosaženo žádoucího účinku.
Liposomy tohoto vynálezu mohou být dehydratovány, uchovávány a potom rekonstituovány, takže podstatná část jejich vnitřního obsahu je zadržena. Dehydratace liposomů vyžaduje obecně použití hydrofilních sušících ochranných prostředků, tak jako disacharidického cukru jak na vnitřním tak na vnějším povrchu liposomové dvojvrstvy (viz ♦
• Hl
Φ· *· ·· · • · · * * · ·· ·*.? ;íct/iw5%
U.S. patent č. 4 880 635, jehož obsah je zde připojen referencí). Tato hydrofilní sloučenina je považována za zabraňující přestavění lipidů v liposomu, takže jejich velikosti a obsahy jsou udržovány během sušícího procesu a při následné rehydrataci. Látky použitelné jako ochrany při sušení musí být silnými akceptory vodíkových vazeb, a mít stereochemické uspořádání, které chrání a udržuje prostorové uspořádání složek liposomové dvojvrstvy. Je možné sušící ochrany vypustit, pokud liposomový preparát není před dehydratací mražen a v preparátu zůstává dostatek vody do následné dehydratace.
Podle vynálezu je také poskytnuta farmaceutická kompozice obsahující farmaceuticky přijatelný nosič a liposom tohoto vynálezu. Jmenovaná kompozice je použitelná například v přenosu nukleových kyselin do buněk živočicha. Termín „Farmaceuticky přijatelné nosiče“ jak je zde používán, jsou media obecně přijatelná ve spojení s podáváním lipidů a liposomů, včetně formulací liposomových bioaktivních látek, živočichům, včetně člověka. Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou obecně formulovány v souhlase s mnoha faktory, které jsou v rozsahu znalostí běžně školeného pracovníka je určit a odpovídat za ně, včetně, bez omezení: jednotlivá použitá liposomální bioaktivní látka, její koncentrace, stabilita a zamýšleného biologického použití; choroba, porucha nebo stav, který má být ovlivněn liposomální kompozicí; subjekt; jeho věk, velikost a všeobecný stav; a tímto stavem podmíněný způsob podání, t.j., nasální, orální, oftalmický, topický, transdermální, vaginální, subkutánní, intramammární, intraperitoneální, intravenosní, nebo intramuskulární (viz např., Nairn (1985), jejichž obsah je začleněn na tomto místě referenci). Typické farmaceuticky přijatelné nosiče používané při parenterálním podání bioaktivní látky zahrnují, například, D5W, vodný roztok obsahující 5 % (váha na objem) dextrosy ve fyziologickém roztoku. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou obsahovat doplňkové ingredience, například ty, které zvyšují stabilitu obsažené aktivní ingredience, tak jako ochranné prostředky a antioxidanty.
Podle vynálezu je dále poskytnuta metoda zapouzdřování nukleové kyseliny,
t.j., DNA, do liposomu, která obsahuje kroky: (a) spojení vodné suspenze nukleové kyseliny s organickým roztokem obsahujícím lipid, t.j. substituovaný fosfolipid a doplňkový lipid, tak aby vznikla suspenze reverzních (invertovaných) micel, které obsahují tuto nukleovou kyselinu a tento lipid; (b)přidáním polykationtu k této micelární suspenzi, aby byla kondenzována ona nukleová kyselina v reverzních micelách; (c) odstranění organického ·« 99 · • · · · ·· • · ♦ · · •f>fcŤA$S0&53&
·· Λ· ·»·
• 4··· | ·· | |
·· · | • | • |
• * | • | • |
0 · · | • | • |
• · · | e | R |
··· ·* | • λ |
rozpouštědla ze suspenze z bodu (b), tak aby vznikly liposomy obsahující onu nukleovou kyselinu a onen lipid z oněch reverzních micel. Poměr nukleové kyseliny k liposomálnímu lipidu dosažený metodou zapouzdřování je nejméně asi 0,5 mikrogramu nukleové kyseliny na mikromol lipidu.
Lipidy použitelné při provádění tohoto vynálezu jsou, jak je popsáno výše, ony lipidy, které byly zjištěny jako vhodné pro zabudování do liposomů, buď jako takové nebo ve spojení s dodatkovými lipidy; tyto zahrnují fosfolipidy, glykolipidy, steroly a jejich deriváty. Organická rozpouštědla použitá v této metodě jsou kterákoliv z množství rozpouštědel použitelných pro rozpouštění lipidů během přípravy liposomů; tyto zahrnují, bez omezení, metanol, etanol, dimetylsulfoxid, chloroform, a jejich směsi. Přednostním organickým rozpouštědlem je chloroform.
Polykationty použité v metodě podle vynálezu pro kondenzaci nukleových kyselin jsou jakékoliv chemické sloučeniny, které mají tři nebo více ionizovatelných skupin, které mohou být použity pro kondenzaci nukleových kyselin, jiných bioaktivních látek nebo léčiv; tyto obsahují, bez omezení, polylysin, polyaminy (např., spermin a spermidin), hexamokomplexy trojmocného kobaltu, polyhistidin, polyetyleniminy a podobné. Přednostně je polykationtem spermin. Nukleové kyseliny použitelné v praxi tohoto vynálezu zahrnují DNA, např. genomovou DNA, cDNA a plazmidovou DNA, lineární nebo uzavřenou, tak jako i RNA. Nukleové kyseliny jsou suspendovány ve vodných roztocích pomocí obecně známých a běžně používaných metod pro suspendování makromolekul, jako např. vortexování. Vhodná vodná media jsou vodné roztoky různých přísad, jako složek pufrů, a jsou vysoce čisté na určité příměsi, jako jsou soli a nukleázové enzymy; taková media obsahují, bez omezení, pufry s nízkou iontovou silou (nízký obsah solí).(„LSB“, viz Příklad 3 výše).
Emulze olej ve vodě stabilizované fosfolipidy obsahují reverzní micely. Reverzní micely (viz Bru et al., Biochem .7,310: 721-739 (1995)), jsou amfipatické struktury založené na lipidech v nichž jsou lipidické hydrofilní domény odděleny na vnitřním micelárním povrchu, zatímco lipidické hydrofobní domény jsou orientovány zvenku povrchu.
Vznikem emulze s reverzními micelami, jak je popsáno výše a na obr. 2 výše, je zabráněno bioaktivním látkám, včetně nukleových kyselin, které jsou v nich odděleny, intermolekulárnímu kontaktu, který by mohl vést v přítomnosti komplexotvorných činidel ke vzniku agregátů, které jsou nevhodné pro inkorporaci do liposomů. Jmenovaný proces je proveden tak, aby bylo dosaženo maximálního výtěžku výsledných liposomů obsahujících žádaný komplex.
V emulzi vznikají komplexy výměnou přidaných komplexotvorných činidel, jako polykationtů nebo bioaktivních látek mezi vodným kompartmentem micel v emulzi (viz např., Bru et al., FEBS, 282: 170-174(1991); Fletcher et al., JChem SocFaraday TransI, 83: 985-1006 (1987). V případě zapouzdřování komplexů DNA jsou vhodnými polykationty kterékoliv z těch, jež jsou použitelné pro kondenzaci nukleových kyselin. Byly použity např. spermin a spermidin (viz např., Chattoraj et al., JMol Biol, 121: 327-337 (1978) a Gosule et al., Nátuře, 259: 333-335 (1976), jejichž obsah je zde uveden referencí, in vitro pro kondenzaci jednotlivých plazmidů, ale jenom při nízkých koncentracích DNA, aby bylo zabráněno agregaci kondenzovaných plazmidů. Tyto koncentrace byly dost malé, takže při jejich použití pro zapouzdřování kondenzovaných nukleových kyselin vznikal významný počet prázdných, t.j., nukleovou kyselinu neobsahujících liposomů. Polylysin a hexamokomplexy trojmocného kobaltu jsou také vhodné pro kondenzaci nukleových kyselin.
Koncentrace polykationtů vhodné pro kondenzaci nukleových kyselin jsou ty koncentrace, které stačí neutralizovat dostatečný počet negativních nábojů nukleové kyseliny, např., asi 90 % nebo více negativních nábojů v případě nukleové kyseliny (Wilson et al., Biochem,V0>·. 2192-2196 (1979)). Běžně školení pracovníci jsou schopni určit vhodnou nebo optimální koncentraci polykationtů pro kondenzaci dané nukleové kyseliny, použitý polykation, koncentraci nukleové kyseliny a mocenství polykationtů.
V takových případech může v souhlase s tím být nezbytné přidat množství polykationtů větší než je množství potřebné pro kondenzaci nukleové kyseliny. Toto dostatečné množství lze určit pomocí několika postupů, zahrnujících např. typ rozdělovačích experimentů popsaných dále v příkladu 4. Takové experimenty poskytují data (viz obr. 3) ukazující koncentraci přidaného polykationtů potřebnou pro kondenzaci plazmidů. Například při koncentraci nukleové kyseliny a lipidu použitých v Příkladu 3, bylo 0,6 mM sperminu • · · · · · • · · · · · ♦ · . : rcŤ/wsíio/$95 ··· · · · · · ♦ · dostatečných pro kondenzaci DNA plazmidu, ale toto množství se zvýšilo na 0,8 mM v přítomnosti NAPĚ N-C12 DOPE, v koncentraci uvedené dále. Koncentrace polykationtu vyšší než tyto, t.j., vyšší než nezbytně nutná, může být také použita, jak zjistíme, např. podle podmínek popsaných v například v příkladu 3, kdy byla jako optimální pro neutralizaci náboje nukleové kyseliny a lipidu ve výši 8 až 20 mM v emulzi.
Běžně vyškolení pracovníci jsou bez problémů schopni určit koncentrace nukleové kyseliny a lipidu vhodné pro použití v praxi tohoto vynálezu. Například (viz Příklad 3, níže), pro zapouzdření kondenzované DNA ve 200 mikrometrových sférických liposomech bylo 200 mikrogranů pZeoLacZ plazmidu DNA v 125 mikrolitrech LSB smíseno s 30 mikromoly směsi N-C12 DOPE a DOPC v molárním poměru 70:30.
V souhlase s tím doporučené uspořádání tohoto vynálezu je prováděno s kondenzovanou nukleovou kyselinou, jíž je plazmidová DNA, lipidem obsahujícím substituovaný fosfolipid, např., N-C12 DOPE, chloroformem a sperminem, např., při koncentraci asi 1 mM nebo vyšší.
Dále je podle vynálezu poskytnuta metoda transfekce živočišných buněk bioaktivní látkou jako je nukleová kyselina. Jmenovaná metoda zahrnuje stadium, kdy jsou buňky v kontaktu sliposomy podle vynálezu obsahujícími komplexní nukleovou kyselinu. Tento kontakt je buď in vitro, kdy směs obsahující liposom je přidána do pěstebního media, které obklopuje tyto buňky, nebo in vivo, kdy je liposom podán ve farmaceutické směsi také obsahující farmaceuticky přijatelný nosič a je podána živočichovi jakoukoliv standardní metodou podávání takových směsí živočichům.
Kontakt in vivo, zvláště je-li požadována specifita nebo cílení, je podporován zabudováním prostředku do liposomů, který buď směřuje liposom ke specifickému místu, např., konjugací protilátky k liposomů pomocí streptavidinu, čímž je způsobeno přednostní uvolnění obsahu liposomů u určitého místa, např., inkorporací NAPĚ nebo konjugátů peptidu s lipidy do liposomů, případně zabudováním lipidu s modifikovanou hlavní skupinou pro akumulaci liposomů na místech, např. tumorech.
• · · · . ·./ * Pí?r/UŠQQ/539Š.
Účinnost transfekce, což je účinnost skutečné introdukce v liposomech zapouzdřené molekuly nukleové kyseliny do buněk, je podporována, jak in vitro tak in vivo, zabudováním do liposomů takových prostředků, které podporují fúzi liposomálních dvojvrstev k buněčným membránám. Takové prostředky zahrnují, bez omezení, začlenění NAPĚ, konjugátů peptidů s lipidy a s ionizovatelnými lipidy (viz WO 87/07530 a WO 95/27478, jejichž obsah je zde začleněn referencí).
Transfekce, in vivo nebo in vitro, má za cíl introdukovat nukleové kyseliny do buněk tak, aby v nich docházelo k jejich transkripci a translaci. Taková exprese proteinu, pomocí introdukce exogenní nukleové kyseliny, může být použita na adresu mnoha defektů v buňce, zapříčiněných nedostatečnou nebo nadbytečnou expresí buněčných genů nebo na druhé straně, pro modifikaci buněčných proteinů a jejich expresi. Transfekce buněk se zapouzdřenými nukleovými kyselinami podle vynálezu je tedy použitelná pro léčbu živočichů trpících nemocemi nebo poruchami charakteristickými abnormálními, neexistujícími, abnormálně nízkými, abnormálně vysokými nebo nepatřičnými expresemi proteinu. Takové nemoci a poruchy, například a bez omezení, zahrnují různé typy rakoviny a poruchy způsobené genovými defekty. Terapeuticky relevantní transfekce může vést také k expresi proteinu, který předtím nebyl v cílových buňkách exprimován.
/
Úspěch transfekce a exprese přenesené nukleové kyseliny v buňce mohou být detekovány mnoha způsoby, které obecně závisejí buď na fyzické přítomnosti nukleové kyseliny v buňce, např. inkorporací radionukleotidu do nukleové kyseliny nebo detekcí exprese proteinu kódovaného nukleovou kyselinou. Toho může být dosaženo mnoha způsoby, zahrnujícími, bez omezení, je-li protein detekovatelný, např. fluorescencí, markérem, nebo je-li protein selektovatelný, např. markér rezistencí vůči cytotoxickým látkám
Například plazmid pEGFP-1 obsahuje sekvenci DNA, která kóduje zvýšenou zelenou fluorescenci proteinu, jehož přítomnost je detekována fluorescenční mikroskopií. V souhlase s tím je úspěšná transfekce buněk plazmidem (viz příklady 10 až 12) jasně určena změřením množství fluorescence vykazované buňkami. Výsledky těchto experimentů (viz obr. 8 až 12) ukazují, jak úspěšnou transfekci OVCAR-3 buněk plazmidem pEGFP-1, tak i vysokou hladinu exprese přeneseného plazmidu ve významném výtěžku transfektovaných buněk.
Takto úspěšná transfekce byla pozorována jen, když přenášená DNA byla polykationtově kondenzována; sperminem neovlivněné vzorky nevykazovaly žádnou nebo jen nepatrnou fluorescenci (obr. 8). Měření fluorescence proteinové exprese (obr. 9) předvedlo, že transfekce polykationtově kondenzovanou DNA rezultuje ve významné hladině exprese, zatímco transfekce vzorků neovlivněných sperminem nemá za výsledek měřitelnou fluorescenci. Nadto, transfekce svolnou, t.j. nezapouzdřenou, DNA má za výsledek také nepozorovatelnou nebo neměřitelnou fluorescenci (obr. 8c a 9c).
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1. Mikrofotografie agregace DNA prostřednictví sperminu (200 mikrogramů plazmidové DNA v 125 mikrolitrech LSB bylo opatrně smíseno se 7 mM sperminu ve 125 mikrolitrech LSB). (A) Pozorování světelným mikroskopem po 15 minutové inkubaci při laboratorní teplotě (měřítko představuje 10 mikronů). (B) Pozorování mrazové TEM (měřítko představuje 100 nm).
Obrázek 2. Schematické znázornění metody zapouzdření DNA. Kondensovaná DNA (I) ve vodné kapce stabilizované fosfolipidem, jež se utvořila okolo DNA v prostředí organického rozpouštědla. Jiné kapky obsahující spermin (II) přenášejí spermin do kapek obsahujících DNA přechodným dotykem a výměnou. Po kondenzaci v emulzi (IV) vznikají měchýřky odpařením rozpouštědla a další extruzí na menší velikosti (V).
Obrázek 3. Vliv liposomální N-C12 DOPE na agregaci plazmidové DNA zprostředkované sperminem. Rovnovážná dialýza byla provedena v tříkomorovém dialyzačním zařízení (viz příklad 4). Křivka nalevo je z dialýzy bez liposomů, zatímco křivka posunutá doprava je z dialýzy, která obsahovala komoru s liposomy. Osa X: koncentrace sperminu (mM); osa y: turbidita (O.D. 400 nm).
Obrázek 4. Analýza plazmidové DNA chráněné vN-C12 DOPE/DOPC (70:30) v agarosovém gelu. Alikvot každého preparátu byl po extruzi a dialýze rozdělen a jedna část štěpena DNázou I (viz Příklad 9). Dráha 1. Preparát bez sperminu. Dráha 2. Jako dráha 1, ale štěpeno DNázou I. Dráha 3. Preparát se sperminem. Dráha 4. Jako dráha 3, ale štěpeno DNázou I.
• · · • · · • · ·· · • · ·· • · · · · ··
PCT/UŠeO/53<jé·
Obrázek 5.,Světelná mikrofotografie částic v N-C12 DOPE/DOPC (70:30) ve vzorku připraveném jak je popsáno v Příkladu 3 spZeoLacZ plazmidem a sperminem (A) vesrovnání s polystyrénovými perlami s průměrným průměrem 269 ± 7 nm (B) (měřítko představuje 10 nm).
Obrázek 6. Mikrofotografie mrazového lomu TEM (viz příklad 7) N-C12 DOPE/DOPC) (70:30) vzorků připravených zplazmidu a sperminu jak je popsáno v příkladu 3. Šipky jdou k částicím se zřejmě zapouzdřeným materiálem (měřítka reprezentují 400 nm).
Obrázek 7. Mikrofotografie kryo transmisní elektronové mikroskopie (viz příklad 8) liposomů sN-C12 DOPE/DOPC a pZeoLacZ plazmidem bez sperminu (a) nebo se sperminem (b). Jmenované liposomy byly připraveny podle příkladu 3. V (a) jsou zřejmé vláknité struktury mimo (hvězdička) a zřejmě i uvnitř (šipka) liposomů. U (b) šipka označuje kružnici, která se podobá polykationtově kondenzované DNA. Měřítka v (a) a (b) představují 10 nm. Mikrofotografie (c) znázorňuje EPC vzorek připravený se sperminem. Kružnice (šipka) a kyjovitý útvar (hvězdička) jsou srovnány s multilamelárními liposomy (označení pro libru šterlinků) [přepážka představuje 50 nm].
Obrázek 8. Fluorescenční mikrofotografie slévajících se OVCAR3 buněk po transfekci (viz přiklad 11) s preparáty N-C12 DOPE/DOPC (70:30). Vzorky liposomů byly připraveny (viz příklad 3) sEGFP-Cl plazmidem DNA (a) se sperminem nebo (b) bez sperminu; vzorek (c) prázdných N-C12 DOPE/DOPC (70:30) liposomů bez sperminu plus volný pEGFP-Cl plazmid DNA přidaný mimo přeformovaných liposomů byl také testován. Množství plazmidové DNA přidané do prázdných liposomů ve vzorku c bylo stejné jako celkové množství v každém z ostatních preparátů. Ve všech experimentech byly použity stejné koncentrace liposomů.
Obrázek 9. Kvantifikace exprese EFGP v buňkách OVCAR 3 po transfekci spEGFP-Cl měřením úrovně fluorescence EGFP. Experimenty s transfekci (a, b, a c, viz příklad 11) byly stejné jako v legendě předchozího obrázku. Navíc byly testovány: d) vaječný PC liposom připravený se sperminem a plazmidem pEGFP -Cl (viz Příklad 3); a e) žádný přídavek. Buňky byly promyty a označeny s CBAM a poté rozpuštěny v detergentu, aby byla změřena fluorescence EGFP a calceinové modři (viz příklad 10; měřítka chyby stanovení jsou ± standardní odchylka).
Obrázek 10. Asociace transfekční aktivity slipidickým peletem N-C12
DOPE/DOPC (70:30) připraveným se sperminem a plazmidem DNA pEGFP-Cl (viz příklad • · · · • · · ·44 • · · 4444444 ’peř/uá)o/4395
44444 44 44 4 ·4
3); původní roztoky plazmidové DNA a sperminu obsahovaly 200 mM sacharozy. Po extruzi a dialýze byla polovina vzorku použita pro transfekci bez dalšího postupu (a) a lipidové partikly ze zbytku vzorku byly peletovány centrifugací a promyty jednou HBSS před použitím pro transfekci (b). Byl také připraven vzorek N-C12 DOPE/DOPC (70:30) s pouze 200 mM sacharozy. Plazmidová DNA a spermin byly k němu přidány těsně před dialýzou v množství stejném jako bylo použito u ostatních vzorků. Pelet tohoto prázdného vzorku (c) byl připraven stejným způsobem. Stejné množství lipidu každého ze vzorků bylo potom použito pro transfekci za stejných podmínek jako je popsáno v legendách ostatních obrázků. Po inkubaci přes noc byly buňky označeny s CBAM a byla změřena fluorescence EGFP a calceinové modři (měřítka chyby jsou ± standardní odchylka).
Obrázek 11. Transfekce N-C-12 DOPE/DOPC liposomy v ascitickém moku myší ve srovnání spufry. Otoky byly získány z myší majících SCID tumor jak je popsáno v příkladu 13. Buňky byly inkubovány s liposomy obsahujícími plazmidovou DNA (nikoliv pelet) při ve výsledné koncentraci 10 mM celkového lipidu v HBSS nebo HBSS při výsledné koncentraci proteinu přibližně 3.5 mg/ml (viz příklad 11). Po tříhodinové inkubaci byl transfekční roztok nahrazen mediem obsahujícím sérum a butyrát po dobu přibližně 20 hodin. Exprese EGFP byla měřena prostřednictvím její fluorescence (chybové měřítko je ± standardní odchylka).
Obrázek 12. Fluorescenční mikrofotografie OVCAR - 3 buněk po transfekci (viz příklad 11) sN-C12 DOPE/DOPC (70:30) liposomy vpufru nebo myší ascitické tekutině. Buňky byly zpracovány jak je popsáno v legendě k obrázku 12 a fotografovány. Fotografie A představuje transfekci bez peritoneální ascitické tekutiny a fotografie B s peritoneální ascitickou tekutinou; buňky v těchto pohledech splývají.
Obrázek 13. Fluorescenční stanovení lamelarity líposomů pomocí sondy.
Obrázek 14. Fluorescenční mikrofotografie tumoru OVCAR-3 přeneseného in vivo
N-C12 DOPE/DOPC (70:30) liposomem obsahujícím pEGFP-Cl. Panel A zobrazuje expresi
EGFP. Panel B zobrazuje červenou fluorescenci rhodaminem značených líposomů.
Obrázek 15. Fluorescenční mikrofotografie tumoru OVCAR-3 odebraného z odlišných míst než obrázek 14 přenesených in vivo. liposomy N-C12 DOPE/DOPC (70:30) obsahujícími pEGFP - Cl. Panel A zobrazuje expresi EGFP. Panel B zobrazuje červenou fluorescenci líposomů značených rhodaminem.
* · ·· · ·· tt ♦ · · «· · ·«·· ♦ · 4 · ‘ptír/uSoo/%39^ ··· · · · ♦ · · ··· · · ·· · * · · · · ·
Obrázek 16. Fluorescenční mikrofotografie kontrolní tumorové tkáně. Panel A zobrazuje difusní zelenou fluorescenci. Panel B zobrazuje chybějící červenou fluorescenci liposomů značených rhodaminem.
Obrázek 17. Graf zobrazuje expresi β-galaktosidázové aktivity ve svalové tkáni po transfekci in vivo.
Příklady provedení vynálezu
Tomuto vynálezu bude lépe porozuměno z následujících příkladů, které jsou pouhými příklady tohoto vynálezu, jak je popsán v patentových nárocích následujících dále.
Příklad 1 - materiály
N-(lissamin rhodamin B sulfonyl)-fosfatidyletanolamin (přeesterífikován z vajec PC), DOPC, EPC a N-C-12D0PE byly zakoupeny od Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). OVCAR 3 buňky karcinomu ovarií byly zakoupeny od NCI-Frederick Cancer Research Laboratory (Frederick,MD). pEGFP-Cl plazmid a E. coli DH5 kompetentní buňky byly zakoupeny od Clontech Laboratories (Palo Alto, CA). pZeoLacZ plazmid, kompetentní buňky a Hanahanův S.O.C. byly zakoupeny od Invitrogen (San Diego, CA). Hanksův balancovaný solný roztok (HBSS), RPMI 640 a teplotně inaktivované fetální hovězí sérum a Lipotectin byly zakoupeny od Gibco/BRL (Grand Islad, NY). DNáza prostá RNázy a RNáza prostá DNázy I byly zakoupeny od Boehringer Mannheim (GmbH, Germany). Agaróza byla zakoupena od FMC Bioproducts (Rockland, ME). Baktoagar, baktotrypton a kvasničný extrakt byly zakoupeny od DIFCO Laboratories (Detroit, MI). Barviva, metylester kalceinové modři (CBAM), PicoGreen a SybrGreen I byly od Molecular Probes /Eugene, OR).
Příklad 2 - purifikace plazmidu
V této studii byly použity dva plazmidy: plazmid pZeoSVLacZ, který má velikost 6,5 kb a exprimuje gen lacZ pro β-galaktosidázu v savčích buňkách z časného enhanceru-promotoru SV40, což umožňuje selekci v savčích buňkách a E.coli pomocí antibiotika zeocinu, a plazmid pEGFP-Cl, který má velikost 4,7 kb a exprimuje protein se * ···· ·· · · · · ♦ *« ♦ · ♦ · · · · · · *p<ft7ušoo^39.4
9 · · · · » · · ··· 99 99 99 99 999 zvýšenou zelenou fluorescencí (EGFP) z bezprostředního časného promotoru lidského cytomegaloviru, což umožňuje selekci v E. coli pomocí kanamycinu a v savčích buňkách pomocí G418. Plazmidy byly čištěny zE. coli (Baumann a Bloomfield, Biotechniques, 19:884-890 (1995)) - konečný poměr O.D. při 260 nm k O.D. při 280 nm byl pro všechny preparáty vyšší než 1,9; elektroforéza na agarosovém gelu ukázala DNA v očekávaném rozmezí velikostí.
Příklad 3 - Liposomální formulace DNA
Vzorky byly připraveny rozpuštěním 200 pg DNA v 125 μΐ LSB. Výsledná emulze byla spojena s 1 ml CHCI3 obsahujícím 30 pmol směsi N-C-12 DOPE a DOPC v poměru 70:30 ve zkumavce Pyrex vortexováním. Vzorek byl bezprostředně sonifikován po 12 sekund v ponorném sonifikátoru (Laboratory Supplies Co. Hicksville, NY) maximálním výkonem, aby nejprve vznikla emulze plazmidu DNA. Následně byl do této emulze přidán 125 μΐ alikvot LSB obsahující různé koncentrace sperminu (16 až 40 milimolární) a vše bylo vortexováno a sonifikováno. Vzorky bez sperminu byly připraveny stejným způsobem, s výjimkou nepřítomnosti sperminu ve druhém 125 μΐ alikvotu. Příprava vzorků sEPC byla stejná, s výjimkou použití 7 mM použitého sperminu.
Výsledné emulze byly převedeny během několika minut do baňky rotační odparky Rotovap (Bůchi Laboratoriums-Technik AG, Switzerland). Organické rozpouštědlo bylo odpařeno rotací baňky při maximální rychlosti. Počáteční vakuum asi 600 až 650 mm bylo postupně zvyšováno, tak rychle, aby nedocházelo k nadměrnému pěnění, až bylo dosaženo maximálního vakua (asi 730 mm); baňka byla poté evakuována po dalších 25 minut. Film zbylý na stěnách baňky byl resuspendován v 1 ml 300 mM sacharózy vLBS a vzorek byl extrudován pětkrát 0 až 4 pm polykarbonátovými filtry (Poretics, Livermore, CA). Vzorek byl poté dialyzován proti Hanksovu balancovanému solnému pufru (HBSS) bez Ca2+ /Mg2+, při 40 Ctpřes noc.
Byly použity jiné lipidové kompozice pro zapouzdřování kondenzované DNA podle vynálezu. Plazmidy byly kondenzovány a zapouzdřovány do liposomů jak je popsáno ve shora uvedeném příkladu a sedimentovány jako v příkladu 12. Lipidické složení liposomů bylo cholesterol semisukcinát cholesterol : l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3♦» 9··· ·»εί/υδ)ο/5395
9 9 9 9 · 99 •9999 99 9 9 ·9· fosfoetanolamin : l,2-dioleoyl-sn-glycerol.3-fosfoetanolamin : dioleoyl dimetylamonium propan : oleoylacetát v poměru 12,5:2,5:50:12:10,5:10,5. Po peletování a promytí byl pro tento liposom stanoven poměr DNA/lipid podle příkladu 10. Typické DNA/lipid poměry byly 1,4 až 2,1 pg DNA na mikromol lipidu.
Příklad 4 - rozdělení sperminu
N-C12-DOPE nese čistý negativní náboj, který by mohl potenciálně reagovat s pozitivně nabitým sperminem a ovlivňovat kondenzační proces. Bylo tudíž nutné testovat rozdělení sperminu mezi DNA a liposomy tohoto složení v dialyzačních experimentech spufry o nízké iontové síle. Experimenty určené pro měření rozdělení sperminu mezi negativně nabité fosfolipidy a DNA byly provedeny v tříkomorovém dialyzačním zařízení (Sialomed, MD) - každá komora obsahovala 250 μΐ tekutiny. Nutné množství sperminu bylo rozpuštěno vLSB a přeneseno do centrální komory, která byla na obou bocích opatřena dialyzační membránou o limitu průniku 100,000 molární hmotnosti. Komora na jedné straně komory se sperminem obsahovala 400 pg pZeoLacZ plazmidové DNA v celkovém objemu 250 pl LSB. Komora na druhé straně obsahovala buď 250 pl LBS samotné nebo prázdné NC-12 DOPE/DOPC (70:30) liposomy, připravené podle příkladu 3 při celkové koncentraci lipidu 30 mM ve 250 pl LSB - v tomto uspořádání měl jenom spermin přístup do všech třech komor. Protože je známo, že neutralizace plazmidové DNA sperminem vede k agregaci (obr. 1), byla turbidita roztoku v komorách obsahujících DNA vzata jako míra pro měření rozdělení sperminu. Jestliže liposomy kompletně oddělí spermin od DNA, nebude DNA agregovat. Množství dostupného negativně nabitého lipidu bylo přibližně dvojnásobkem množství negativního náboje DNA v těchto experimentech. Každý dialyzační přístroj rotoval na 12 palcovém motorem poháněném kruhu přes noc (asi 20 hodin). Komory obsahující DNA byly potom vyprázdněny po předchozím promíchání jejich obsahu opakovaným pipetováním a obsah byl převeden do 250 μΐ. Pro změření turbidity byla měřena absorbance při 400 nm proti pufrovému blanku.
Byly sestrojeny sperminové titrační křivky turbidity DNA pro dialýzu s nebo bez liposomů (obr. 3). Přibližný posun křivky v důsledku přítomnosti liposomů byl použit pro výpočet relativních vazebných konstant pro lipidy a DNA za předpokladu, že každá molekula sperminu se váže ke čtyřem nukleotidovým fosfátovým skupinám nebo ♦ · 9 9 • · ·· ·♦ ·· · · čtyřem fosfolipidům, v jednoduché rovnováze s asociačními konstantami KDna , případně Kjipid. Při nízké iontové síle jsou disociační konstatnty pro spermin od DNA v mikromolárním rozsahu (Wilson et al., Biochem, 18: 2192-2196 /1979); Gosule et al., JMol Biol, 121: 327337(1978)). Volná koncentrace sperminu byla tedy považována při milimolámích koncentracích sperminu nutných pro agregaci DNA v těchto experimentech za zanedbatelnou.
Frakční neutralizace DNA fosfátových skupin sperminem, potřebná pro agregaci DNA, „y“, byla vzata za 0,9 na základě dat získaných při nepřítomnosti liposomů. Toto je stejná hodnota jako bylo popsáno pro kondenzaci DNA, v souhlase s předchozím pozorováním, že při vysokých koncentracích doprovází agregace kondenzaci (Wilson et al., Biochem, 18: 2192-2196(1979); Gosule et al., J Mol Biol , 121: 327-337 (1978)). Za předpokladu, že [ DNA - spm ] = y [DNA]totai Q& bodě agregace a [lipid-spm] = posun křivky, můžeme použít rovnici
KoNA/Kiipid = [y/ (1 - y )] x [(lipidtotai - posun)/(posun)J
Vezmeme-li lipidtotai jako celkovou koncentraci negativně nabitých lipidů na vnějšku liposomů dělenou čtyřmi, poměr zdánlivých rovnovážných konstant je 178, t.j., vazba sperminu k DNA je mnohem silnější než vazba k lipidům. Poměr vazebných konstant a prvního činitele na pravé straně je konstantní. Poslední činitel na pravé straně může být tedy použit pro výpočet posunu ve sperminové titrační křivce pro kondenzaci DNA pro jakoukoliv koncentraci celkového lipidu, včetně vyšších účinných koncentrací použitých v emulzích.
Výsledky prezentované v obr. 3 ukazují, že přítomnost liposomů jenom slabě posunuje křivku DNA agregace. Přibližně 0,6 mM sperminu v počátečních 250 μΐ emulze bylo tedy dostatečné ke kondenzaci plazmidové DNA, zatímco celkem 0,85 mM by bylo dostatečné pro kondenzaci DNA v přítomnosti použitého množství N-C-12-DOPE. Můžeme tudíž očekávat, že plazmidová DNA bude v těchto preparátech skutečně kondenzována, bez komplikací s neutralizací negativně nabitých lipidů, což by mohlo destabilizovat liposomy.
··· · ·· ·· · • · · · * · · · ’κπτυέοο^ί ··· ·· e· ·· ·· ··♦
Příklad 5 - světelná mikroskopie liposomových vzorků
Předem kondenzovaná DNA byla také zkoušena pro zapouzdření. Podle velké turbidity roztoku bylo možno soudit na masivní agregaci. Toto nebylo neočekáváno, protože podobné případy jsou popsány. Světelná mikroskopie plazmidových agregátů (Obr. 1) byla provedena za použití 200 pg pZeoLacZ plazmidu v 125 μΐ LSB, opatrně smíchaných s 7 mM sperminu v 125 μΐ LSB a a inkubovaných po 15 minut při teplotě místnosti.
Mikroskopické pozorování dokázalo, že agregáty jsou obecně mnohem větší než 1 pm a často větší než 5 až 10 pm. Taková velikost těchto agregátů byla potvrzena kryoelektronovou mikroskopií (obr. 1B). Zvláštního významu jsou při tomto zvětšení pravidelná uspořádání vláken, snad jako výsledek sperminem indukované kondenzace do částečně uspořádané struktury. Tyto zakřivené tyčovité útvary naznačují počátek kruhovitého uspořádání do toroidální struktury, ale ne do kompletních toroidů. Touto cestou vzniklé agregáty jsou příliš velké pro použití přenosovém systému.
Pro určení velikosti N-C-12-DOPE/DOPC (70:30) liposomů obsahujících DNA (obr. 5), byla polystyrénová zrnka o průměrném průměru 269 ± 7 nm (Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA) zředěna H2O do koncentrace vhodné pro mikroskopii a vzorky N-C12-DOPE/DOPC (70:30) liposomů obsahujících DNA byly použity po extruzi a dialýze bez dalšího ředění (přibližně 20mM lipidu). Vzorky byly vyzkoušeny na fluorescenčním mikroskopu Olympus BH-2 (Olympus, Lake Success, NY) při 1 000 násobném zvětšení.
v
Výsledky jsou prezentovány na obr. 5. Částice obsahující DNA se zdají být poměrně uniformní ve velikosti a tvaru při tomto zvětšení a přibližná velikost částic se zdá být velmi podobná velikosti získané při studiích dynamického rozptylu světla. Srovnání těchto částic liposomů obsahujících DNA se sperminem agregovanou DNA na obr. 1 dokazuje přednostní kondenzaci DNA v reverzních micelách podle vynálezu vůči kondenzaci před tvorbou liposomů. Není žádný důkaz svědčící, že by emulzní kondenzační metoda mohla významně inhibovat tvorbu velmi velkých agregátů pozorovaných, když spermin interagoval přímo s DNA ve vodných roztocích.
• φφ φ
ΦΦ • φ φ φ • Φ φφ · φφφ φφφφ
Σ Κ5γΛ1Ζ00/$395
ΦΦ φ · φφφ
Příklad 6 - analýza částic rozptylem světla
Fusogenní preparáty N-C-12DOPE/DOPC se zapouzdřenou DNA byly dále charakterizovány kvazi-elastickým rozptylem světla. Velikost částic byla stanovena na Nicomp 370 analyzéru velikosti částic (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA). Vzorky byly zředěny pro analýzu přibližně desetinásobně. Gaussova analýza byla provedena měřením vesikulů a byl zaznamenán počet vážených průměrů. Data pro plazmid DNA pZeoLacZ, kondenzovaný sperminem a připravený podle příkladu 3, by vyhovovala Gaussovu rozdělení velikostí při průměru velikosti částic 222,6 nm.
Přiklad 7 - mrazový lom TEM
Fusogenní preparáty N-C-12 DOPE/DOPC se zapouzdřenou DNA byly dále charakterizovány pomocí metody mrazového lomu TEM. Asi 2 μΐ vzorku byly uloženy mezi dva dvojité Balzerovy měděné replikační držáky a zmrazený tekutým propanem. Vzorky byly lámány při -100 °C, tlaku 10'6 až 10‘7 barrů a stínění platinou (pod 45 °C) a uhlíkem vBalzerově BAF 400 zařízení pro mrazový lom. Repliky byly digerovány s 5% bělidlem přes noc, promyty destilovanou vodou a namontovány na 300 mesh síťku. Obraz byl získán na Philips 300 TEM.
Výsledky jsou prezentovány na obr 6. Většina částic byla malých (menší než 400 nm), v souhlase výsledkem NICOMP. Přestože pozorování vnitřního obsahu je touto technikou velmi vzácné, zdálo se u některých částic, že mají určité zapouzdřené struktury, které by mohly představovat kondenzovanou DNA.
Příklad 8 mrazová transmisní elektronová mikroskopie
Kryo-EM byla použita pro potvrzení liposomální povahy preparátů a pokud možno vizualizování veškerého zapouzdřeného materiálu. Pro EPC vzorky a DNA agregovanou sperminem byly použity měděné síťky potažené karbonovou podložkou bez dalších úprav. Pro vzorky liposomů obsahujících N-C-12 DOPE/DOPC /70:30) DNA byly EM síťky s karbonovým filmem pozitivně nabity umístěním kapky 0,1 mM roztoku polylysinu na povrch sítka a ponecháním po 1 minutu. Polylysin byl blotován a sítko opláchnuto několika kapkami destilované vody následované několika kapkami vzorkového φφφφ φφ ·· ·· φ φφ · φφφφ φφφφ :*··:: ·ρ€$Γ/υδοοβ39$ φφφ φφ φ φφφ ··· φφ φφ φφ φφ φφφ pufru. 5 μΐ alikvot vzorku byl poté umístěn na sítku, roztažen do tenkého filmu a bezprostředně ponořen do kapalného etanu. Sítka byla do použití uchována pod tekutým dusíkem. Byl použit Philips CM12 transmisní elektronový mikroskop (Mahwah, NJ), pracující při urychlujícím napětí 120 kV. Kryoholder 626 (Warrendale, PA) byl použit pro udržování teploty vzorků mezi -177 °C a -175 °C během zobrazování. Elektronové mikrofotografie byly zaznamenány při nízkých elektronových dávkách. Byla použita zvětšení 35.000x nebo 60,000x a ohniskové hodnoty 1,8 až 2,5 pm..
Výsledky jsou prezentovány na obr. 7. Když byl z procedury N-C-12 DOPE/DOPC liposomů vynechán spermin, byly pozorovány primárně jednolamelární, relativně malé, ale strukturně heterogenní liposomy (obr. 7a), souhlasné s analýzou Nicomp. Některé liposomy vypadaly tubulární, pravděpodobně jako důsledek osmotického gradientu vzniklého během přípravy. Některé liposomy vykazovaly vnitřní vláknité struktury, možná reprezentativní pro nekondenzovanou DNA (šipka vlevo). Bylo také možno vidět nezapouzdřená volná vlákna (šipka vpravo).
Vzorky N-C-12 DOPE/DOPC liposomů připravené se sperminem (obr. 7b, c) byly také heterogenní ve velikosti, tvaru a lamelaritě. Některé částice byly liposomy normálního vzhledu s neviditelným zapouzdřeným materiálem. Jiné však obsahovaly elektronicky husté, dobře definované toroidální struktury (obr. 7b, šipky), které nebyly zjevné ve vzorcích bez sperminu. Takové struktury nebyly ve vztahu k jednotlivým použitým lipidům, protože toroidální (obr. 7c, šipky vpravo) a ohnuté tyčovité struktury (obr. 7c, šipky vlevo) byly také pozorovány v preparátech vaječného PC, které měly tendenci být stabilnější při podmínkách přípravy vzorků pro kryo - EM. Prostory mezi jemnými liniemi mezi tyčemi a toroidy byly uniformní a průkazně menší než prostory mezi dvěma membránami v multilamelárních liposomech (hvězdička). Tyto toroidální struktury jsou velmi podobné toroidům a tyčkám pozorovaným, když je volná DNA kondenzována sperminem (Chattoraj et al., J Mol Biol, 121: 327-337(1978)) nebo jinými kondenzačními činidly (Arscott et al., Biopolymers, 30: 619-630 (1990); Gosule a Schellman, J Mol Biol, 121: 327-337 (1978)) ve zředěných roztocích. Paralelní a koncentrické jemné linie viditelné v tyčkách a v toroidech jsou také podobné liniím viditelným v agregátech plazmidů (obr. lb).
* ♦··· ·· ♦♦ ·♦ · ·· fl · · · · ···♦ ’pdrAJSooÍ39S • •9 ·· ·· ·· ·· ···
Membrány jsou jasně pozorovatelné okolo některých toroidálních struktur (obr.
7b). Zdá se, že všechny tyto pozorované toroidy jsou zapouzdřeny v bariérách neprůchodných pro ionty, protože kondenzovaná DNA nemůže existovat v pufrech s vysokou iontovou silou, v nichž jsou liposomy nakonec suspendovány. Je tudíž zřejmé, že větší část těchto preparátů sestává z liposomální zapouzdřené plazmidové DNA.
Příklad 9 - Analýza v agarosovém gelu
Ochrana plazmidové DNA před štěpením DNázou byla vyhodnocena elektroforézou v agarozovém gelu zapouzdřených plazmidových DNA připravených sperminem a kontrolního vzorku připraveného bez sperminu. Alikvot 50 μΐ požadovaného preparátu byl zředěn do 145 μΐ HBSS bez Ca2+/Mg2+, a 1 μΐ 0,2 M MgCL plus 2 μΐ DNázy I (20 jednotek) byly přidána a smíseny. Po 6 hodinách inkubace při teplotě místnosti byly přidány 2 μΐ 0 až 5 M EDTA pro zastavení reakce. U neštěpovaných kontrol byl 50 μΐ alikvot od každého vzorku smísen se 150 μΐ HBSS (bez Ca2+/Mg2+). Vzorky byly poté extrahovány směsí fenol/CHCL/izoamylalkohol a precipitovány etanolem, jak je popsáno (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2. vydání, ed. Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, pp B4-B5 (1989)). Pelet byl rozpuštěn ve 20 μΐ TE (pH 8,0), 5 μΐ vzorku bylo naneseno na 0,8% agarozový gel. Gely byly obarveny v 1 : 10,000 ředěném zásobním roztoku SYBR Green I na barvení gelů nukleových kyselin (Molecular Probes) po 30 minut a detekovány na FotoSpectrum UV prosvětlovači (světelný box). Fotografie byly provedeny na světelném boxu kamerou Polaroid MP 4+ systém. Tyto fotografie byly poté skenovány na ScanJet IIC (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) a digitalizovány pomocí Aldus Photostyler (U-Lead Systems, Torrance, CA).
Výsledky prezentované na obr. 4 demonstrují, že oba preparáty poskytují průkaznou ochranu DNA nebo patrné zapouzdření.
Příklad 10 - kvantitativní analýza
Abychom kvantifikovali ochranu DNA, byla DNA extrahována z každého alikvotu a měřena metodou fluorescence. PicoGreen fluorescenční metoda (Haugland,
Handbook of fluorescent probes aned research chemicals, 6. vydání, Molecular Probes, lne., • · ♦ 9 · · • ♦ · ♦
: J ’νέτλ^ρ.»53^
161-162 (1996)) byla použita pro kvantifikaci DNA, která byla extrahována fenol/chloroformovou procedurou popsanou dále v příkladu 9. Pracovní roztok byl připraven přidáním 100 μΐ zásobního roztoku PicoGreen Molecular Probes) do 20 ml TE (pH 7,5). Extrahovaný vzorek byl nejprve ÍOOx ředěn s TE (pH 7,5). Potom byl 14 μΐ alikvot ředěného vzorku smísen s 986 μΐ TE (pH 7,5) a 1 ml PicoGreen pracovního roztoku. Směs byla inkubována ve tmě při teplotě laboratoře po 4 minuty. PicoGreen fluorescence byla měřena při laboratorní teplotě na PTI Alphascan fluorometru (South Brunswick, NY), při excitační vlnové délce 480 nm a emisní vlnové délce 520 nm, s 500 nm vysoceprůchodným filtrem (Schott Glass Technologies, Duryea, PA). Fluorescence směsi 1 ml TE (pH 7,5) a 1 ml PicoGreen pracovního roztoku byla použita jako blank. Procento DNA chráněné před štěpením DNázou I bylo vypočteno odečtením blanku a vzetím nedigerovaného vzorku za 100 %. Za našich experimentálních podmínek nebyl signál štěpené DNA průkazný.
Vzorek se sperminem vykazoval 10,1 ± 5,6 procent ochrany plazmidu, zatímco 19,0 ± 4,5 bylo chráněno ve vzorku bez sperminu.
Příklad 11 - metoda transfekce
Byla testována transfekční aktivita liposomálních preparátů zapouzdřujících pEGFP-Cl plazmid DNA. Buňky OVCAR3 byly při koncentraci 1 x 105 buněk na ml v 24 jamkových deskách nebo 2 x 105 buněk na ml v 96 jamkových deskách po 1 ml alikvotech, případně 0,1 ml, v případě RPMI 1640 s 10% tepelně inaktivovaným fetálním hovězím šerem. Buňky byly nechány růst po dva dny (přibližně 40 až 48 hodin) před transfekcí; v této době byly buňky ve shluku. Transfekční roztoky byly připraveny ředěním vhodných liposomů nebo vzorků DNA mediem neobsahujícím sérum. Desky byly odsáty, medium odstraněno a desky dvakrát promyty Dulbecovým fosfátovým fyziologickým pufrem s následným odsátím.
Transfekční roztoky (0,5 ml na jamku u 24 jamkové desky a 0,1 ml na jamku u jamkové desky) byly připraveny 10 násobným ředěním mediem neobsahujícím sérum dialyzovaných vzorků obsahujících plazmid pEGFP-Cl (přibližně 2 mM celkového lipidu, pokud není udáno jinak) a byly poté přidány do jamek a inkubovány při 37 0 C po 3 hodiny.
Jamky byly odsáty a medium obsahující 10 % tepelně inaktivovaného hovězího sera bylo φφφφ »· ·« Φ· φ φφ φ φφφφ · φ φφ : *Pť*r/u^oo/539^
ΦΦ* φφ ·· Φ· φφ φφφ přidáno do každé jamky. Vzhledem k dříve popsané existenci mlčících transgenů za přítomnosti CMV promotoru (Tang etal., Human Gene Therapy, 8: 2117-2124(1997); Dion et al., Virology, 231: 201-209 (1997) bylo do každé jamky přidáno 5 μΜ inhibitoru histonové deacetylázy, trichostatinu A, aby byla zvýšena exprese. V experimentech prezentovaných v posledních 2 obrázcích byl místo toho použit jiný inhibitor histonové deacetylázy, 5 mM butyrát sodný.
Po inkubaci při 37 °C v inkubátoru buněčných kultur po 18 až 22 hodin, bylo medium odsáto a jamky promyty 0,5 ml alikvoty Dulbecova fosfátového fyziologického pufru PBS. Fotomikrografie vzorků na deskách byly provedeny invertovaným mikroskopem Olympus IMT-2 s lOx objektivem. PBS bylo odsáto a do každé jamky bylo přidáno 0,5 ml (0,1 ml na 96 jamkovou desku) acetoxymetylesteru Calcein Blue (CBAM) a desky byly inkubovány 40 minut při teplotě laboratoře. Buňky byly opět promyty s PBS, odsáty a do každé jamky bylo přidáno 0,5 ml (v případě 96 jamkové desky 0,1 ml) 1% C12 Eg TE pufru (pH 8,0). Vzorky byly poté rozpuštěny v detergentu a měřené hodnoty byly použity pro korigovanou fluorescenci celkového EGFP, vztaženo na celkový počet živých buněk.. Fluorescence desek byla měřena na fluorescenčním odečítači desek Cytofluor II (PerSeptive Biosystems, Framingam, MA). Hodnoty pro Calcein Blue v živých buňkách byly měřeny při excitaci 360 nm a emisi 460 nm při zisku 80. Tyto hodnoty byly ověřeny na linearitu na počtu buněk od počáteční koncentrace až po hladinu, kdy byly pozorovány shluky. Pro data uvedená na obr. 10 byl použit liposomální pelet separovaný od externí DNA (příklad 12). Protože hladiny Ca a Mg vRPMI 1640 jsou významně nižší než v seru, byla data v obrázku 11 a 12 získána po doplnění media neobsahujícího sérum s Ca2+ a Mg 2+, aby bylo dosaženo jejich koncentrace 1,2 mM, resp. 0,8 mM, během transfekce.
Přibližnou konverzi fluorescence EGFP na jednotku buněčného proteinu lze stanovit změřením průměrných koncentrací proteinu 48 hodinových kultur OVCAR-3 buněk ve 24 nebo 96 jamkových deskách extrahovaných smáčedlem 1% Tritonem -100. Pro toto stanovení byla použita metoda používající bicinchoninovou kyselinu (PierceChemical, Rockwell, IL), s hovězím serumalbuminem jako standardem. Na obr. 9, měřítko „a“ bylo celkovým průměrným odečtem fluorescence na jamku po odečtení blankových hodnot 670 jednotek. Pro jednotlivé jamky byl průměrný celkový protein na jamku v době transfekce (48 hodin) přibližně 88,4 pg na jamku, což dává 7,6 jednotek fluorescence na pg celkového ♦ · ♦ 9
9 * 99 •9 9« ··9
9 9 9 9 ··· : : *·Ρ€Τ7ϋ500Ζ5395 99 99 ··999 buněčného proteinu v objemu 0,5 ml pro experimenty s 24 jamkovými deskami. Na oObr. 10 představuje měřítko „a“ (96 jamkový experiment) průměrnou EGFP fluorescenci korigovanou na blank o hodnotě 420 jednotek na jamku při průměrné koncentraci celkového proteinu 27 pg na jamku, což dává 15,5 jednotek fluorescence na pg celkového buněčného proteinu v celkovém objemu 0,1 ml. Na obr. 11 (96 jamkový experiment) byla hodnota flurorescence měřítka „a“ 103 fluorescenčních jednotek na pg buněčného proteinu.
V modelu intraperitoneálního přenosu (data na obr. 11 a 12) byla transfekce provedena nejprve přidáním 50 pl koncentrované bezbuněčné tekutiny z peritoneální dutiny myší nesoucích tumor SCID do každé odsáté jamky na 96 jamkové desce s OVCAR-3, buňkami pěstovanými, jak je uvedeno shora. Do každé jamky bylo přidáno 50 pl směsi NC-12 DOPE/DOPC liposom-DNA, připravené jak je popsáno v příkladu 3. Výsledná koncentrace lipidů byla přibližně 10 mM a zapouzdřené DNA přibližně 7 až 14 pg/ml (celkové DNA 67 pg/ml). Inkubace byla provedena, jak je uvedeno výše. V tomto případě byla peritoneální tekutina nastavena na hladinu Ca2+ a Mg2+ 1,2, resp. 0,8 mM přidáním koncentrovaného zásobního roztoku. Roztok liposomální DNA byl také nastaven na tu samou hladinu Ca2+ a Mg2+ přidáním zásobního koncentrovaného roztoku těsně před přidáním liposomů k buňkám.
Data na obr. 8 a 9 demonstrují, že směs N-C-12 DOPE/DOPC (70:30) liposomů obsahujících zapouzdřenou sperminem kondenzovanou plazmidovou DNA byla aktivní při transfekci OVCAR-3 buněk. Data ukazují, že aktivita byla závislá na přítomnosti kondenzačního činidla sperminu a na zapouzdření plazmidové DNA do liposomů. Data na obr. 10 opět demonstrují, že transfekční aktivita je spojena s lipidickou zapouzdřenou DNA a nikoliv s volnou externí DNA. Data na obr. 11 a 12 ukazují, že transfekce může také probíhat v přítomnosti potenciálně interferujících látek (např., sérové proteiny) nalezených v intraperitoneu OVCAR-3 tumorů.
Příklad 12 - Sedimentace plazmidové DNA a lipidových částic
Aby mohla být určena transfekční aktivita zapouzdřené plazmidové DNA, bylo nutné separovat volnou plazmidovou DNA od DNA zapouzdřené vliposomech. Byla použita následující preparační metoda.Byly použité liposomy, připravené sedimentací, aby byly zbaveny externí DNA; výsledky jsou uvedeny v obr. 10. Pro sedimentační experimenty byly
♦ *a ** *· · • · · « φ φ ·· : ί W1M00J539Í ·* φ* »♦ *<
vzorky liposomů N-C12 DOE/DOPC (70:30) připraveny metodou podle příkladu 3 sperminem, s výjimkou 200 mM sacharozy obsažené vLSB. Jako sonda byl přidán také fosfatidyletanolamin,jehož hlavní skupina byla značena lissamin rhodaminem B v množství 10 pg/ml. 500 pl alikvoty tohoto preparátu byly poté centrifugovány při 16 000 x g po 3 hodiny. Po odstranění supernatantu byl pelet resuspendován vHBSS neobsahujícím Ca2+/Mg2+. Suspenze byla centrifugována při 16 000 x g po 3 hodiny. Pelet byl resuspendován v HBSS neobsahujícím Ca2+/Mg2+. 50 pl alikvoty od každé frakce byly odebrány pro štěpení DNázou I (Příklad 9). Po extrakci fenol/CHCI3 a precipitaci etanolem, byla plazmidová DNA stanovena v každém alikvotu metodou PicoGreen (příklad 10) a použita pro výpočet procenta chráněného plazmidu a procenta celkového plazmidu v každé frakci.
Pro změření distribuce lipidů, byly 40 pl alikvoty z každé frakce rozpuštěny v 0,2% C12E8 v celkovém objemu 2 ml a florescence byla monitorována při excitační vlnové délce 560 nms550±20nm průchozím filtrem (Melles Briot, Irvine, CA) a emisní vlnové délce 590 nm. Jako kontrola byly připraveny, jak je uvedeno výše, prázdné N-C-12 DOPE/DOPC (70:30) liposomy. Po dialýze bylo přidáno 100 mikrogramů EGFP plazmidu k 500 mikrolitrům vzorku. Vzorek byl poté centrifugován a byly stanoveny lipidy a plazmidová DNA.
Příklad 13 - peritoneální tekutina:
Aby byl otestován vilv peritoneálních proteinů na transfekční aktivitu zde popsaných preparátů, byl připravena peritoneální mok, jak je popsáno níže. Bylo odebráno 6 ml bezbuněčné HBSS moku z SCID myší 7 týdnů po injekci OVCAR-3 buněk a bylo zkoncentrováno na 1 ml na odstředivém koncentrátoru s limitem propustnosti při molekulové hmotnosti 10 000. Výtěžnost proteinu byla asi 60 %. Tekutina obsahující asi 10 mg/ml proteinu vHBSS byla doplněna s Ca2+ a Mg2+ do rozsahu koncentrace normálního sera, přidána ke kultuře OVCAR-3 buněk a opatrně smísena se stejným objemem liposomů vHBSS při stejné hladině Ca/Mg tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace lipidu 10 mM.
<4« ·· «« · «» Φ Φ · · Φ · · ΦΦ φ φ » · Φ · · * ♦ φ ΦΦΦ» »·· Φ » · · \»· 3CT/IW539J., ··»·
Výsledky těchto transfekčních experimentů jsou uvedeny v obr. 11 a 12. Nehledě na známý inhibiční efekt sérových proteinů na účinnost transfekce, je při těchto podmínkách zachována podstatná aktivita při použití směsí připravených metodou podle vynálezu.
Příklad 14 - Účinnost naplňování liposomů
Účinnost plnění liposomů metodou užívající předkondenzovanou DNA byla porovnána se zde popsanou metodou. Liposomy byly připraveny jak popisuje Ibanez et al., Biochem Cell Biol, Ί4\ 633-643 (1996). pEGFP plazmid DNA byl rozpuštěn v koncentraci 66 pg/ml v TS pufru (10 mM Tris, 1 mM NaCl, PH 7.0). 2 ml tohoto roztoku byly smíseny s 2 ml 23 mM roztoku spermidinu v TS pufru pro prekondenzaci DNA poskytující velmi kalný roztok. Toto bylo uchováváno přes noc při 4 °C. Následující den bylo celkem 9 pmol lipidu rozpuštěno vl ml dietyléteru. Ktomu bylo přidáno 330 μΐ roztoku DNA a spermidinu s následujícím vortexování. Tato směs byla bezprostředně sonifikována třikrát, vždy po 5 sekundách (Laboratory Supply sonicator &G112SO1). Dietyléter byl odstraněn na rotační odparce při 37 °C, aby vznikly liposomy. Pro každé složení lipidů byly připraveny čtyři takové vzorky. Liposomy byly peletovány při 200 000 x g po 30 minut. Supernatant byl odstraněn, bylo přidáno znovu 500 μΐ TS pufru a centrifugace byla opakována. Po třech úplných cyklech byly liposomy extrudovány přes MF membrány s póry 0,45 pm. Liposomy v tomto stadiu byly použity ke stanovení zapouzdření, případně byla část z nich dialyzována proti Hanksovu balancovanému solnému roztoku neobsahujícímu Ca2+ nebo Mg2+. Pro srovnání byly liposomy rovněž připraveny, jak je popsáno v příkladu 3. Zapouzdření DNA bylo stanoveno jak je popsáno v příkladech 9 a 10. Všechny digesce trvaly 6 hodin. Koncentrace lipidu byla stanovena pomocí HPLC. Všechny komponenty s výjimkou cholesterolu byly kvantitativně stanoveny při použití kolonyWaters Sherisorb silica column (3 pm) s acetonitrikmetanokHíSCL v poměru 100:3:0,05 jako mobilní fází, při detekci, absorbance vUV Cholesterol byl stanoven na Phenomenex Luna Cl8 column (5 pm) s metanofvoda v poměru 96:4 jako mobilní fází a detekován detektorem elastického rozptylu světla. Složení testovaných lipidů je udáno v tabulce níže.
• φ φ φ
φ φ φ φ φ φ φ φ φ
\.£cartjsod7«& ·ί·
Tabulka 1
Poměr DNA/lípid (gg DNA/gmol celkového lipidu)* Složení před po
digescí | digesci | |
Literární hodnoty:* ** | ||
EPCCHOL (1:1) | 1,00 | |
EPC:mozek PS:CHOL(4:1:5) | 2,87 | |
EPC:EPA:CHOL (4:1:5) | 2,64 | |
EPC:kardiolipin:CHOL (4:1:5) | 2,53 | |
Nízký obsah solí (10 mM Tris): | ||
EPCCHOL: (1:1) | 0,52 | 0,07 |
EPC: mozek PS:CHOL (4:1:5) | 0,70 | 0,01 |
EPC:EPA:CHOL (4:1:5) | 0,48 | 0,04 |
EPC:kardiolÍpin:CHOL (4:1:5) | 0,78 | 0,09 |
Izotonické soli po přípravě: | ||
EPCCHOL/1:1 | 0,42 | 0,10 |
EPCmozek PS.CHOL (4:1:5) | 0,78 | 0,08 |
EPC:EPA:CHOL (4:1:5) | 1,63 | 0,16 |
EPC:kardiolipin:CHOL (4:1:5) | 0,65 | 0,20 |
TLC 70:30 složení | 8,53 | 0,59 |
*Nález lipidu určený HPLC. Množství DNA stanoveno extrakci a pomocí PicoGreen.
**Ibanez, M., Gariglio, P., Chavez, P., Santioago, C.W. a Baeza, 1.(1996)“ Spermidine -condensed DNA and cone shaped lipids improve delivery and expression of exogenous DNA transfer by liposomes,“ Biochem Cell ΒίοΙ,Ί4·. 633-643 (1996).
Liposomy připravené kondenzací DNA v emulzi jak je zde popsáno mají mnohem větší poměr DNA:lipid než liposomy připravené s předkondenzovanou DNA.
Příklad 15 - Stanovení lamelarity liposomů
Liposomy složené z 70:30 N-C-12 DOPE/DOPC a zapouzdřené DNA byly připraveny jak je popsáno v příkladu 3 a sedimentovány a promyty dle příkladu 12. Tyto liposomy také obsahovaly NBD sondu v množství 0,5 mol. % celkového lipidu. Liposomy byly rozpuštěny ve fosfátovém fyziologickém roztoku na koncentraci 80 μΜ celkového lipidu v míchané fluorometrické kyvetě. NBD fluorescence byla měřena při excitaci při 450 nm a emisi při 530 nm. Do kyvety byl injektován dithioničitan sodný do výsledné koncentrace 20 mM pro redukci exponované NBD sondy. Obrázek 13 demonstruje, že přibližně 50 až 55% NBD signálu zmizelo, což značí, že liposomy v tomto preparátu byly
Φ Φ Φ Φ Φ ·· φ φ ·· φ φ φ φ φφφφ φφφφ φ φ φφφφ φφφ φ φφφ φφφφφφ φ φ
•..řcr^soo^ většinou unilamelární, t.j. asi polovina lipidických sond byla vystavena dithioničitanu sodnému, činidlu snižujícímu impermeabilitu membrán.
Příklad 16 - Transfekce podkožního humánního tumoru v SCDI myších intratumorální injekcí.
Humánní OVCAR-3 buňky (2 x 106) byly injektovány podkožně SCDI myším a nechány růst po několik týdnů až bylo dosaženo průměrného průměru asi 4 až 7 mm.
Liposomy obsahující spermin, pEGFP-Cl plazmid, 70 mol. % N-C-12-DOPE a 30 mol. % DOPC byly připraveny podle příkladu 3. Liposomální membrány rovněž obsahovaly 0,5 mol. % Rhodamine-PE jako flurescentního liposomálního markéru.
0,11 ml roztoku liposomů vHanksově balancovaném solném roztoku neobsahujícím vápník a hořčík (HBSS) a při celkové koncentraci lipidu asi 40 mM bylo injektováno přímo do centra tumorů po doplnění koncentrace Ca2+ a Mg2+ na 1,2, resp. 0,8 mM. O jeden den později bylo do stejných míst injektováno 0,11 ml 20 mM butyrátu sodného v HBSS. Po 24 hodinách byly tumory vyjmuty a zmrazený. Později byly získány 14 až 30 pm silné řezy na kryotomu při -20 °C a zamontovány mrazené na skleněné krycí sklíčko chráněné krycím kroužkem. Mrazené vzorky tumoru byly zamontovány do O.C.T. vkládacího media.
Transgenní exprese plazmidu pEGFP-Cl byla vyhodnocena konfokální mikroskopií na 20 pm řezech fixované mrazené tkáně. Mrazené řezy byly vyhodnoceny pomocí Olympus BX50/Biorad MRC 1000 konfokálního mikroskopu s argonkryptonovým laserem. (Ex 488nm, Em 515 nm pro EGFP; Ex 568, Em 585 pro rhodamin). Povrchy tkáňových řezů byly zobrazeny při 20 x zvětšení. Nebylo použito zesílení obrazu, ale pro přípravu obrázků bylo použito barevného měřítka. Obrázek 14 ukazuje dvojici fluorescenčních zobrazení tkáňových řezů odebraných z tumoru léčeného pEGFP-Cl plazmidem. Dolní panel ukazuje červenou fluorescenci rhodaminem značených liposomů. Velmi vysoký lipidický signál (žlutý) naznačuje, že tento řez byl blízko umístění liposomální injekce. Horní panel ukazuje zelenou fluorescenci v důsledku exprese transgenu. Signál exprimovaného plazmidu je blízko, ale ne vkoincidenci slipidickým signálem a zřejmě ···· · · ·· · · • · · · · ··· * :..Pcj2wsb(ý^5.
představuje skutečnou expresi plazmidu v tumoru. Obrázek 15 ukazuje jinou dvojici fluorescenčních zobrazení z jiného tumorového řezu s exprimováným EGFP. Dvojice fluorescentních zobrazení mrazených řezů kontrolní tumorové tkáně je zřejmá na obr. 16. Slabá, difusní zelená fluorescence, vlastní tkáni je viditelná na horním panelu, ale v žádném kontrolním tkáňovém řezu nebyla nalezena oblast intenzivní fluorescence. V žádném kontrolním tumorovém řezu nebyla červená fluorescence.
Příklad 17 Transfekce myšího svalu in vivo
Transfekční aktivita N-C-12DOPE/DOPC (70:30) liposomů zapouzdřujících plazmid pZeoLacZ byla testována in vivo v myším nožním svalu. Liposomy byly připraveny, jak je popsáno v příkladu 3. Pro tento experiment byly použity samičky DB A myší pěstovaných za standardních podmínek. 50 μΐ liposomů obsahujících pZeoLacZ plazmid bylo injikováno přímo do jedné zadní nohy ve dni jedna. Injekční místo bylo blízko přední části stehna nohy. Do protější nohy bylo injikováno buď 50 μΐ liposomů spEGFP-Cl plazmidem nebo nebyla léčena. V den 2, bylo do liposomem léčené nohy injektováno 50 μΐ 20mM butyrátu sodného vHBSS. Myš byla utracena v den 3 a sval nohy byl rozřezán do čtyř sekcí: přední noha, zadní noha, přední stehno a zadní stehno. Polovina tkáně z každé sekce byla bezprostředně zmrazená v kapalném propanu, zatímco druhá polovina byla fixována ve 4% formalinu, ochráněna proti mrazu 30% sacharozou a potom bleskově zmrazená v propanu.
Exprese transgenu pZeoLacZ plazmidu přeneseného pomocí liposomů N-C-12DOPE/DOPC (70:30) byla sledována pomocí Clontech luminescent β-gal kitu. Nefixovaný sval byl rozmražen, rozkrájen na kousky a následovně homogenizován. Na každý 1 mg vlhké tkáně bylo přidáno 15 ml extrakčního pufru (9,15 ml K2HPO4, 0,85 ml KH2PO4, 20 μΐ Tritonu XI00, 10 μΐ DTT) a suspenze ručně homogenizována po 5 minut a potom inkubována při teplotě laboratoře po 20 minut. Vzorky byly poté centrifugovány po 2 minuty při 14 000 ot/min, aby sedimentovaly zbytky tkáně. Alikvoty supernatantu byly testovány na B-galaktozidázovou aktivitu jak uvádí Clontech. Po 60 minutách bylo světlo měřeno na Bertholdově deskovém luminometru. Odečty byly průměrovány pro různé svalové sekce stejného typu. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 17. Významný přírůstek β-galaktozidázové aktivity vůči kontrole byl nalezen ve svalové sekci předního stehna. Malé zvýšení bylo také zjištěno ve tkáni zadní nohy a zadního stehna.
• · · · · • · · · · pcť$sóo^5 • · · ·
Tyto výsledky demonstrují transfekci in vivo a expresi transgenů plazmidu pZeoLacZ přeneseného do myšího svalu použitím N12-DOPE/DOPC (70:30) liposomového vektoru.
Příklad 18 - Porovnání transfekce s liposomálně kondenzovanou DNA a s kationtovym lipoplexem
Příprava kationtového lipoplexu:
Komplexy kationtových lipidů a pomocných lipidů splazmidovou DNA byly připraveny krátce před použitím. Lipofectin byl zakoupen od Ginco BRL (Grand Island, N.Y.). V případě Lipofectinu byl samotný lipid inkubován v mediu neobsahujícím sérum po přibližně 45 minut před komplexací sDNA, jak je doporučeno výrobcem (Invitrogen). Stejné objemy 4 pg/ml DNA a 40 pg/ml lipidu nebo stejné objemy 20 pg/ml DNA a 200 pg/ml lipidu, vše rozpuštěné v mediu RPMI 1640 neobsahujícím sérum, byly smíseny a inkubovány přibližně 10 a 15 minut před přidáním do jamek na deskách pro tkáňové kultury. Koncentrace Ca2+ a Mg2+ byly nastaveny na 1,2 mM, resp. 0,8 mM přidáním koncentrovaných zásobních roztoků těsně před přidáním lipoplexů k buňkám. Poměr lipid/DNA použitý pro Lipofectin byl optimalizován porovnáním několika poměrů.
Komplexy DC-Cholesterol/DOPE (4/6) byly původně vytvořeny jak bylo dříve popsáno (Muldoon et al., Biotechniques 2T. 162-167 (1997) a použity během 15 minut. Ve všech experimentech byly použity optimalizované poměry DNA/lipid, t.j., 4 pg/ml DNA byly smíseny se stejným objemem 20 pg/ml lipidu anebo 20 pg DNA bylo smíseno se stejným objemem 100 pg/ml lipidu.
Všechny ostatní komplexy byly vytvořeny použitím setu kationtových lipidů nebo lipidových směsí od jediného výrobce (Invitrogen). Byly připraveny dle návodu výrobce v 1 x koncentraci a při uvedených poměrech lipid/DNA.
Transfekční postup byl proveden jak je popsáno v Příkladu 11.
• · • · • · · ·«·« · · · · * :..pcjz?jso^5 .:.
Srovnání s kationtovými lipoplexy:
Peletované liposomy neobsahující externí DNA byly použity pro přímé porovnání transfekce s kationtovými lipoplexy při stejné koncentraci DNA. Tato data jsou prezentována v tabulce 2 vzhledem k liposomálnímu ovlivnění (všechna data po inkubaci s butyrátem sodným, netoxickým aktivátorem transgenní exprese (Tang et al., Human Gene Therapy^·. 2117-2124 (1997); Wheeler et al., Biochim Biophys Acta, 1280 (1996); Gruner et al., Biochem 24: 2833-2842 (1984)) a při fyziologické koncentraci Ca2+ a Mg2+; všechna data jsou vyjádřena vzhledem k celkové esterázové aktivitě). V tabulce 2 je životaschopnost buněk a transfekce za rovnou 1 pro N-C-12 DOPE/DOPC (70:30) liposomy, t.j., číslo větší než 1,0 představuje faktor, kolikrát je některý z těchto parametrů v testovaném systému větší. Transfekční aktivita liposomů N-C12-DOPE/DOPC (70:30) byla obecně v rozsahu nalezeném pro kationtové lipoplexy za těchto podmínek. Některé lipoplexy měly význačně nižší a některé význačně vyšší aktivitu. Lipoplexy obsahující 3P[N-(dimetylaminometan-)karbamoyl)] cholesterol a dioleoylfosfatidyletanolamin (DC-chol/DOPE) byly mimořádně aktivní. Podobně jako všechny kationtové lipoplexy byly však značně více toxické vůči některým buňkám použitým v těchto experimentech než liposomy, obzvláště ve vysokých koncentracích. Toto bylo možno pozorovat v nižší fluorescenci kalceinové modři po účinku lipoplexů (data v Tabulce 2), rovněž jako při mikroskopickém pozorování okrouhlých a prasklých buněk po ovlivnění (data nejsou uvedena). V některých případech transfekční účinnost kationtových lipoplexů vzhledem k liposomům při vyšších koncentracích skutečně poklesla, pravděpodobně jako důsledek jejich toxicity. U liposomálně zapouzdřené DNA nebyla pozorovna žádná toxicita. Je zajímavé, že účinek liposomů obyčejně způsobil zvýšení výsledné fluorescence kalceinové modři o 10 až 30 %, možná v důsledku ochrany před vlivy inkubace v mediu neobsahující sérum.
Význam relativně nízké toxicity tohoto systému přenosu liposomální plazmidové DNA není v systémech tkáňových kultur zcela zřejmý, protože transfekční aktivita dosahuje nasycení při relativné nízkých hladinách DNA použitých ve shora uvedených experimentech. Očekává se však, že situace in vivo bude velmi odlišná. Velký rozsah nespecifických vazebných míst in vivo může vyvolat nezbytnost použití vysokých hladin DNA nebo případně násobné injekce pro účinnou expresi v cílových buňkách. To může být pro použití kationtových lipoplexů v této situaci limitující v důsledku jejich toxicity.
• · · ·
OVCAR-3 buňky byly inkubovány spromytými liposomálními pelety (jako na Obr. 10) nebo lipidovými komplexy se stejným množstvím pEGFP-Cl plazmidu DNA po 3 hodiny v mediu neobsahujícím protein. Všechny transfekční procedury byly jak je popsáno v příkladu 11 a zahrnují nastavení koncentrace Ca2+ a Mg2+ na 1,2, resp. 0,8 mM.
Tabulka 2
Lipid/ | relativní | relativní | relativní | relativní | ||||
směsa | přežití | transfekce | přežití | transfekce | ||||
buněk | 2 pg/ml | buněk | 10 pg/ml | |||||
2 pg/ml | DNA | 10 pg/ml | DNA’C | |||||
DNAb | s.d. | s.d. | s.d. | s.d. | ||||
1 | 0,631 | 0,078 | 0,619 | 0,203 | 0,313 | 0,011 | 0,942 | 0,222 |
2 | 0,651 | 0,084 | 0,987 | 0,216 | 0,401 | 0,009 | 0,794 | 0,207 |
3 | 0,639 | 0,059 | 0,833 | 0,272 | 0,352 | 0,006 | 1,186 | 0,267 |
4 | 0,739 | 0,078 | 1,655 | 0,382 | 0,297 | 0,017 | 1.327 | 0,395 |
5 | 0,618 | 0,070 | 0,096 | 0,064 | 0,460 | 0,011 | 0,091 | 0,024 |
6 | 0,704 | 0,077 | 1,050 | 0,224 | 0,366 | 0,008 | 1,182 | 0,266 |
7 | 0,660 | 0,069 | 0,096 | 0,030 | 0,431 | 0,008 | 0.802 | 0,231 |
8 | 0,708 | 0,089 | 1,651 | 0,381 | 0,139 | 0,014 | 0,325 | 0,077 |
(lipofectin) | ||||||||
9 | 1,095 | 0,101 | 4,930 | 0,991 | 0,383 | 0,032 | 2,451 | 0,627 |
(DC-chol/
DOPE) * Komplexy kationtových lipidů byly připraveny s následujícími lipidy:# 1-1:1 směs Tris-((2-glutaroyl-4amino-N-dioktadecyl amin)-4‘-(2,5-diaminopentanoyl-(2“,5“-diaminopropyletyl)) amin trifluoroacetátu a 2amino-(2‘,2‘-dimetyl)etyl-metylfosfonová kyselina-Ó-oktadecyl-(r-heptadecyl)ester trifluoroacetátu (Pfx-1); #2 - 2,5-diaminopentanoyl-glycyl-glycyl-N-oktadecyl-(r-heptadecyl)amid, trifluoroacetát; #3-1:1 směs 2,5diaminopentanoyl-(2‘,3 ‘ -di-3 -aminopropyl)-2-aminoacetyl-2-aminoacetyl-N-oktadecyl-(l ‘-heptadecyl)amid trifluoracetátu a DOPE (Pfy-3); #4 - 1:1 směs 2-amino-(2‘,2‘-dimetyl)etyl-metylfosfonová kyselina-Ooktadecyl-(l‘-heptadecyl)ester trifluoroacetátu a 2,5-diaminopentanoyl-2-aminoacetyl-an-dioktadecyl amid trifluoridu /pfx-4);#5 - 1:1 směs 2,5,-diaminopentanoyl-(2,5-di-3-aminopropyl)-glutaroyl-N-oktadecyl-(rheptadecyl) amid trifluoracetátu a 2,5-diaminopentanoyl-(2,2,5,5,-tetra-3-aminopropyl)glycyl-N-dioktadecyl amin trifluoracetátu (Píx-5); #6- 1:1 směs 2.5.-diaminopentanoyl-(2,5-di-3-aminopropyl)-l,2-diaminoetyl-0oktadecyl-(l'‘heptadecyl) karbamová kyselina trifluoridu a DOPE (Pfx-7); #7 - bis-(2,5-diamino-(2,5-di-3aminopropyl)-cystyl-N-dioktadecyl amin)) disulfid trifluoroacetátu (Pfx-8);# 8 - lipofectin; #9 - DCcholesterol/DOPE 4/6.
b Data jsou vztažena na liposomy obsahující N-acyl-PE , které jsou vzaty rovné jedné., t.j., čísla představují faktory, kolikrát je ten který lipoplex více nebo méně toxický nebo aktivní. Data z více než jedné serie experimentů byla vztažena na lipid #2 jako standard.
c Transfekční účinnost byla měřena fluorescencí EGFP jako na Obrázku 11a opravena na celkovou buněčnou esterázovou aktivitu což odpovídá celkové fluorescenci kalceinové modři (viz příklad 11).
Osoba obeznámená snadno uzná, že předkládaný vynález je dobře přizpůsoben k uskutečnění účelů a získání zmíněných cílů a výhod, rovněž jako oněch v nich obsažených.
:..PCŤ^JSÓO^,95
Sloučeniny, složeniny, metody, postupy a techniky na tomto místě popsané jsou uvedeny jako typické z navržených uspořádání nebo jsou zamýšleny jako příklady a nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu podle vynálezu. Osobám obeznámeným a věci znalým bude zřejmé, že změny v těchto a jiných použitích jsou obsaženy v duchu připojených patentových nároků.
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob zapouzdřování bioaktivních komplexů do liposomů, vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:(a) rozpuštění nejméně jednoho amfipatického lipidu v jednom nebo více organických rozpouštědlech (b) spojení nejméně jedné vodné suspenze zahrnující bioaktivní látku s organickým roztokem obsahujícím lipid z kroku (a) tak, aby vznikla emulze zahrnující bioaktivní látku a lipid;(c) přidání druhé vodné suspenze zahrnující komplexotvorné činidlo k emulzi z kroku (b), (d) inkubování emulze z kroku (c) umožňující komplexotvornému činidlu kontakt s bioaktivní látkou, čímž vznikne komplex bioaktivní látky s komplexotvorným činidlem ve vodné kapce stabilizované lipidem, přičemž průměr jmenovaného komplexu není větší než průměr kapky a (e) odstranění organického rozpouštědla ze suspenze z kroku (d) tak, aby vznikl liposom obsahující komplexovanou bioaktivní látku a lipid.
- 2. Způsob zapouzdřování bioaktivních komplexů do liposomů, vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:(c) rozpuštění nejméně jednoho amfipatického lipidu v jednom nebo více organických rozpouštědlech (d) spojení nejméně jedné vodné suspenze zahrnující komplexotvorné činidlo s organickým roztokem obsahujícím lipid z kroku (a) tak, aby vznikla emulze zahrnující komplexotvorné činidlo a lipid;(c) přidání druhé vodné suspenze zahrnující bioaktivní látku k emulzi z kroku (b), (d) inkubování emulze z kroku (c) umožňující komplexotvornému činidlu kontakt s bioaktivní látkou, čímž vznikne komplex bioaktivní látky s komplexotvorným činidlem ve vodné kapce stabilizované • · ♦ 9 « · · · · · ♦ · 9 9 : . : ?čtajsoo^3^99 9 99 99 9 9 ·· t lipidem, přičemž průměr jmenovaného komplexu není větší než průměr kapky a (f) odstranění organického rozpouštědla ze suspenze z kroku (d) tak, aby vznikl liposom obsahující komplexovanou bioaktivní látku a lipid.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že bioaktivní klátkou je nukleová kyselina.
- 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nukleovou kyselinou je DNA.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12236599P | 1999-03-02 | 1999-03-02 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20013103A3 true CZ20013103A3 (cs) | 2002-01-16 |
Family
ID=22402271
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20013103A CZ20013103A3 (cs) | 1999-03-02 | 2000-03-01 | Způsob zapouzdřování bioaktivních komplexů do liposomů |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7491409B1 (cs) |
EP (1) | EP1156783B1 (cs) |
JP (1) | JP2002538096A (cs) |
KR (1) | KR20010112301A (cs) |
CN (1) | CN1349402A (cs) |
AT (1) | ATE376413T1 (cs) |
AU (1) | AU3715900A (cs) |
BR (1) | BR0008711A (cs) |
CA (1) | CA2362485A1 (cs) |
CZ (1) | CZ20013103A3 (cs) |
DE (1) | DE60036861T2 (cs) |
EA (1) | EA200100856A1 (cs) |
ES (1) | ES2295018T3 (cs) |
HU (1) | HUP0200114A2 (cs) |
IL (1) | IL145117A0 (cs) |
NO (1) | NO20014231L (cs) |
NZ (1) | NZ513829A (cs) |
PL (1) | PL351487A1 (cs) |
WO (1) | WO2000051565A1 (cs) |
ZA (1) | ZA200107205B (cs) |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL145117A0 (en) * | 1999-03-02 | 2002-06-30 | Liposome Co Inc | Encapsulation of bioactive complexes in liposomes |
KR100822684B1 (ko) | 2000-10-04 | 2008-04-17 | 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 | 지질막에 의한 미립자의 피복방법 |
US7713942B2 (en) | 2001-04-04 | 2010-05-11 | Nordic Vaccine Technology A/S | Cage-like microparticle complexes comprising sterols and saponins for delivery of polynucleotides |
JP2004528321A (ja) * | 2001-04-04 | 2004-09-16 | ノルディック ワクチン テクノロジー アクティーゼルスカブ | ステロールおよびサポニンを含むポリヌクレオチド結合複合体 |
JP4370451B2 (ja) * | 2001-09-28 | 2009-11-25 | 大塚製薬株式会社 | 医薬組成物 |
WO2003059279A2 (en) * | 2002-01-09 | 2003-07-24 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Efficient liposomal encapsulation under mild conditions |
AU2003205049B2 (en) * | 2002-01-09 | 2009-05-28 | Transave, Inc. | Efficient nucleic acid encapsulation into medium sized liposomes |
WO2003075856A2 (en) | 2002-03-07 | 2003-09-18 | University Of Delaware | Methods, compositions, and kits for enhancing oligonucleotide-mediated nucleic acid sequence alteration using compositions comprising a histone deacetylase inhibitor, lambda phage beta protein, or hydroxyurea |
WO2003106636A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Mirus Corporation | Novel methods for the delivery of polynucleotides to cells |
AU2006209711A1 (en) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Process for producing coated fine particle |
JPWO2006101201A1 (ja) * | 2005-03-24 | 2008-09-04 | 国立大学法人 北海道大学 | 目的物質を効率的に核内に送達可能なリポソーム |
DE602006021587D1 (de) * | 2005-09-30 | 2011-06-09 | Univ Hokkaido Nat Univ Corp | Vektor zur zuführung einer zielsubstanz in den zellkern oder die zelle |
WO2008150832A1 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Sanofi-Aventis | Assay methods for identifying agents that modify the activity of nape-pld or abh4 |
US8784659B2 (en) | 2007-08-08 | 2014-07-22 | General Electric Company | Method for controlling microbial biofilm in aqueous systems |
PT2279254T (pt) | 2008-04-15 | 2017-09-04 | Protiva Biotherapeutics Inc | Novas formulações lipídicas para entrega de ácido nucleico |
NO2355851T3 (cs) | 2008-11-10 | 2018-09-01 | ||
CA2767127A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors |
US20110177147A1 (en) * | 2010-01-21 | 2011-07-21 | General Electric Company | Stable biocidal delivery systems |
KR101102834B1 (ko) * | 2010-02-24 | 2012-01-05 | 충남대학교산학협력단 | 신규한 리포좀 제조 방법 및 장치 |
KR101198715B1 (ko) * | 2010-05-14 | 2012-11-13 | 한국생명공학연구원 | 핵산 및 친수성 음이온 화합물의 고효율 포획을 위한 비대칭 리포솜 및 이의 제조방법 |
WO2012000104A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Non-liposomal systems for nucleic acid delivery |
FR2964569B1 (fr) * | 2010-09-10 | 2012-10-19 | Ct De Cooperation Internationale En Rech Agronomique Pour Le Dev Cirad | Nouveaux liposomes de vaccination genique |
US20120231069A1 (en) * | 2011-03-08 | 2012-09-13 | Access Pharmaceuticals, Inc. | Targeted Nanocarrier Systems for Delivery of Actives Across Biological Membranes |
US9758395B2 (en) | 2011-04-28 | 2017-09-12 | Aquero Company, Llc | Lysine-based polymer coagulants for use in clarification of process waters |
KR102246242B1 (ko) | 2013-05-17 | 2021-04-28 | 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 | 중합체 복합 입자로부터의 생물 활성제의 방출 |
CN105228820B (zh) | 2013-05-17 | 2017-08-29 | 3M创新有限公司 | 反应混合物、多孔粒子以及制备方法 |
EP3823634A4 (en) * | 2018-07-21 | 2022-08-03 | University of Tennessee Research Foundation | NEUTRAL LIPOSOMES CONTAINING BIOLOGICAL ACTIVE INGREDIENTS |
JP2022527638A (ja) * | 2019-03-29 | 2022-06-02 | グライコミン, インコーポレイテッド | リポソーム製剤、ならびにリポソーム製剤を使用および調製する方法 |
EP3739321B1 (de) * | 2019-05-17 | 2023-03-08 | Xtal Concepts GmbH | Qualifizierungsverfahren für kryoelektronenmikroskopie-proben sowie dazugehöriger probenhalter |
WO2022045009A1 (ja) * | 2020-08-24 | 2022-03-03 | 国立大学法人山口大学 | 流体を追跡するための組成物及び流体の追跡方法 |
CN117222747A (zh) | 2021-03-22 | 2023-12-12 | 伊鲁米纳剑桥有限公司 | 用于改善核酸簇克隆性的方法 |
CN113785975B (zh) * | 2021-09-09 | 2023-08-29 | 天津医科大学 | 精胺、亚精胺脂质体在抗氧化、抗衰老中的应用 |
DE102022134188B3 (de) | 2022-12-20 | 2024-03-28 | Universität Augsburg - Körperschaft des öffentlichen Rechts | Verfahren zur in-situ Erfassung von Änderungen eines Lipidsystems bei dessen Lagerung bei einer Lagertemperatur unterhalb von -60 °C |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5723147A (en) * | 1987-02-23 | 1998-03-03 | Depotech Corporation | Multivesicular liposomes having a biologically active substance encapsulated therein in the presence of a hydrochloride |
US5286634A (en) * | 1989-09-28 | 1994-02-15 | Stadler Joan K | Synergistic method for host cell transformation |
DK0695169T3 (da) * | 1993-04-22 | 2003-03-17 | Skyepharma Inc | Multivesikulære liposomer med indkapslet cyclodextrin og farmakologisk aktive forbindelser samt fremgangsmåder til anvendelse af disse |
US5795587A (en) * | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
US6071533A (en) * | 1996-11-12 | 2000-06-06 | The Regents Of The University Of California | Preparation of stable formulations of lipid-nucleic acid complexes for efficient in vivo delivery |
IL145117A0 (en) * | 1999-03-02 | 2002-06-30 | Liposome Co Inc | Encapsulation of bioactive complexes in liposomes |
-
2000
- 2000-03-01 IL IL14511700A patent/IL145117A0/xx unknown
- 2000-03-01 NZ NZ513829A patent/NZ513829A/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-03-01 WO PCT/US2000/005395 patent/WO2000051565A1/en active IP Right Grant
- 2000-03-01 CA CA002362485A patent/CA2362485A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-01 AT AT00915983T patent/ATE376413T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-01 JP JP2000602035A patent/JP2002538096A/ja not_active Withdrawn
- 2000-03-01 BR BR0008711-4A patent/BR0008711A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-03-01 EA EA200100856A patent/EA200100856A1/ru unknown
- 2000-03-01 AU AU37159/00A patent/AU3715900A/en not_active Abandoned
- 2000-03-01 HU HU0200114A patent/HUP0200114A2/hu unknown
- 2000-03-01 DE DE60036861T patent/DE60036861T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-01 KR KR1020017011174A patent/KR20010112301A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-03-01 US US09/914,615 patent/US7491409B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-01 CZ CZ20013103A patent/CZ20013103A3/cs unknown
- 2000-03-01 EP EP00915983A patent/EP1156783B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-01 CN CN00807027A patent/CN1349402A/zh active Pending
- 2000-03-01 PL PL00351487A patent/PL351487A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-03-01 ES ES00915983T patent/ES2295018T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-08-30 ZA ZA200107205A patent/ZA200107205B/en unknown
- 2001-08-31 NO NO20014231A patent/NO20014231L/no not_active Application Discontinuation
-
2008
- 2008-08-25 US US12/197,794 patent/US20090068256A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2000051565A1 (en) | 2000-09-08 |
WO2000051565A9 (en) | 2002-02-14 |
ATE376413T1 (de) | 2007-11-15 |
BR0008711A (pt) | 2002-10-01 |
PL351487A1 (en) | 2003-04-22 |
ES2295018T3 (es) | 2008-04-16 |
DE60036861D1 (de) | 2007-12-06 |
IL145117A0 (en) | 2002-06-30 |
ZA200107205B (en) | 2002-12-02 |
EP1156783A1 (en) | 2001-11-28 |
NZ513829A (en) | 2001-09-28 |
AU3715900A (en) | 2000-09-21 |
EP1156783B1 (en) | 2007-10-24 |
EA200100856A1 (ru) | 2002-02-28 |
EP1156783A4 (en) | 2003-05-21 |
NO20014231L (no) | 2001-10-03 |
US7491409B1 (en) | 2009-02-17 |
CN1349402A (zh) | 2002-05-15 |
HUP0200114A2 (hu) | 2002-05-29 |
US20090068256A1 (en) | 2009-03-12 |
KR20010112301A (ko) | 2001-12-20 |
DE60036861T2 (de) | 2008-07-24 |
NO20014231D0 (no) | 2001-08-31 |
JP2002538096A (ja) | 2002-11-12 |
CA2362485A1 (en) | 2000-09-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ20013103A3 (cs) | Způsob zapouzdřování bioaktivních komplexů do liposomů | |
US7060291B1 (en) | Modular targeted liposomal delivery system | |
US7108863B2 (en) | Liposome composition for improved intracellular delivery of a therapeutic agent | |
EP1001750B1 (en) | Stable particulate complexes with neutral or negative globale charge of lamellar structure | |
JPH09500136A (ja) | 樹枝状体ポリ陽イオンを含む自己集合性ポリヌクレオチド配送系 | |
PL199201B1 (pl) | Pęcherzyk lipidowy, sposób wytwarzania pęcherzyka lipidowego oraz zastosowanie pęcherzyka lipidowego | |
Koynova et al. | Recent patents in cationic lipid carriers for delivery of nucleic acids | |
JPWO2006101201A1 (ja) | 目的物質を効率的に核内に送達可能なリポソーム | |
WO1999030686A1 (en) | Cationic drugs encapsulated in anionic liposomes | |
EP1231895B1 (en) | Modular targeted liposomal delivery system | |
Brown et al. | Mechanisms of delivery of liposome-encapsulated cytosine arabinoside to CV-1 cells in vitro. Fluorescence-microscopic and cytotoxicity studies | |
KR101647178B1 (ko) | 효소 절단성 링커 또는 올리고 라이신을 포함하는 폴리에틸렌글리콜-리피드를 이용한 안정화된 플라스미드-지질 입자 | |
MXPA01008802A (en) | Heat-curable, thermally expandable moulded part | |
MXPA01008804A (en) | Encapsulation of bioactive complexes in liposomes | |
Joris et al. | Exploring the broader applicability of a low molecular weight adjuvant approach to improve nucleic acid delivery to the cytosol. | |
Simoesa et al. | On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times | |
SK4782002A3 (en) | Lipidic vesicles, a method for the manufacture thereof pharmaceutical composition containing the same and use thereof | |
WO2011052804A1 (en) | Method of delivering agent into target cell |