CN117222747A - 用于改善核酸簇克隆性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于在基底的表面上的位点处以簇形式接种和扩增源自样品的靶核酸的方法，该方法包括保留不能接种的无活性形式的这些靶核酸的至少一部分以提供可用于接种的相对低浓度的活性形式的靶核酸。当这些活性形式的靶核酸接种在该基底的该表面上时，它们可以被扩增。因为活性形式的靶核酸的浓度低，所以第二活性形式的靶核酸在第一活性形式的靶核酸已充分扩增以占优势之前将在相同位点处在相同簇内接种的可能性低。因此，相对于采用更高浓度的活性形式的靶核酸的传统接种和扩增方法，该簇将通过过滤器的可能性增加。

Description

用于改善核酸簇克隆性的方法
相关申请
本申请要求2021年3月22日提交的名称为“用于改善核酸簇克隆性的方法”的临时申请号63/164,163的优先权，该临时申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开尤其涉及扩增靶核酸以生成簇；并且更具体涉及增加单克隆的或具有高优势百分比的簇的数目。
背景技术
靶核酸链的测序可以通过多个反应循环发生，其中每个循环一个可检测核苷酸被掺入到拷贝链中。可检测核苷酸通常被封闭以防止每个循环掺入多于一个可检测核苷酸。在孵育时间后，通常进行洗涤步骤以去除任何未掺入的可检测核苷酸。然后可以进行检测步骤，其中确定掺入到拷贝链中的可检测核苷酸的身份。接着，进行解封闭步骤和切割或掩蔽步骤，其中从拷贝链中最后一个掺入的核苷酸去除封闭剂，并且从掺入到拷贝链中的最后一个核苷酸切割可检测部分或在该核苷酸上掩蔽可检测部分。在一些情况下，可检测部分充当封闭剂，并且可检测部分的去除可以去除封闭剂。然后通过在随后的掺入步骤中引入可检测核苷酸来重复循环。
在许多情况下，同时测序具有相同序列的靶核酸链的簇。簇用于扩增由掺入到拷贝链中的可检测核苷酸产生的信号。因为簇含有相同序列的多个模板链，所以在每轮核苷酸添加时掺入到相应拷贝链中的核苷酸应当是相同的，并且来自可检测核苷酸的信号应当与簇中模板链的拷贝数成比例地增强。
靶核酸链的簇可以通过例如在称为接种的步骤中在足以使靶核酸与基底表面上的捕获引物杂交的条件下接触包括多种靶核酸的样品而在诸如固体表面的基底上形成。可以扩增接种的靶核酸以产生簇。捕获引物可以是结合到基底表面以允许桥扩增的一对引物中的一个引物。捕获引物可以限于基底的特定位置(诸如孔、图案化流通池上等)以将扩增的菌落彼此分离。
在一些情况下，簇是多克隆的而不是单克隆的。多克隆簇可以由簇中多于一个靶核酸的扩增产生。如果多克隆簇具有以远远高于其它靶物种的浓度存在的单个靶物种，使得来自优势物种的信号可以从簇中非优势物种的噪声中分辨出来，则可以对优势靶物种进行测序。靶物种可以变成优势的，因为它在一种或多种随后的非优势物种的接种和扩增之前接种和扩增。
含有产生远远高于其它物种背景的信号并且因此可以被测序的优势靶物种的多克隆簇被称为“通过过滤器”或PF。目前采用的用于高通量测序的技术和方法提供60％至80％范围内的PF，这意味着20％至40％的簇是不可测序的。为了增加通量和增加测序效率，希望增加PF簇的百分比。
增加PF的簇的百分比的一种方式是降低与基底接触以生成簇的样品中的靶核酸的浓度。通过降低靶核酸的浓度，减少了多于一个核酸将与表面上的引物附接并被扩增的机会。然而，降低样品中靶核酸的浓度也增加了一些簇位点将不被接种并且将不含有用于测序的扩增核酸的可能性。
可以进行单独的接种和扩增步骤来代替利用具有低浓度靶核酸的样品的单一接种和扩增步骤，以实现更多簇位置被占据的簇的更高优势和PF。在每个步骤中，可以使用低得多的DNA模板浓度，使得仅一部分位置被接种，但是这些位置中的每一个位置扩增为低得多的具有更高优势的多克隆，并且因此更可能PF。通过多轮接种和扩增，基底的更多位置可以被靶核酸的簇占据。
然而，包括多个接种/扩增步骤的方法具有几个缺点。例如，该方法比仅包括单一接种/扩增步骤的过程更复杂，比仅包括单一接种/扩增步骤的过程花费更多的时间，并且可以使用比仅包括单一接种/扩增步骤的过程更多的扩增试剂。
发明内容
本申请尤其描述了用于接种和扩增源自样品的靶核酸以在基底表面上的位点处形成簇的方法。至少一部分靶核酸最初呈不能接种的无活性形式，使可用于接种的活性形式的靶核酸的浓度相对低。当活性形式的靶核酸接种在基底表面上时，它们可以被扩增。因为活性形式的核酸的浓度低，所以第二活性形式的靶核酸在第一活性形式的靶核酸已充分扩增以占优势之前将在相同位点并在相同簇内接种的可能性低。因此，相对于采用更高浓度核酸的传统接种和扩增方法，簇将PF的可能性增加。
尽管能够使用本文所述的最初无活性形式的核酸进行多于一个的接种和扩增步骤，但是单一接种和扩增步骤可以提供多步骤低浓度接种和扩增的一些益处，而没有多步骤的缺点。包含靶核酸的组合物的组合物可以与基底接触足以允许大多数或所有位点被接种和扩增以形成单克隆的或具有高优势百分比的簇的时间。
在多个方面，本公开描述了一种方法，该方法包括提供具有与捕获剂结合的表面的基底和提供组合物，该组合物包含(i)多个不同的靶核酸，每个靶核酸包含通用序列，和(ii)抑制通用序列的至少一部分与捕获剂结合的抑制剂。该方法还包括使基底的表面与组合物接触以使靶核酸中的一个靶核酸与捕获剂结合。该方法还可以包括在组合物与基底表面接触时扩增与捕获剂结合的靶核酸。
与基底表面结合的捕获剂可以包含具有核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，通用序列包含与捕获剂的核酸的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。
抑制剂可以包含具有与捕获剂的核酸的核苷酸序列的至少一部分相同的核苷酸序列的核酸。组合物还包含解封闭剂，该解封闭剂包含具有与抑制剂的核酸的至少一部分互补的核苷酸序列的核酸。组合物中解封闭剂的浓度低于抑制剂的浓度。
在一些实施方案中，抑制剂包封多个不同的靶核酸。例如，抑制剂可以包含包封靶核酸的脂质体或噬菌体。组合物还可以包含解封闭剂，该解封闭剂被配置为释放包封在抑制剂中的多个不同的靶核酸。例如，当抑制剂包含脂质体时，解封闭剂可以包含被配置为破坏脂质体的膜以从脂质体释放靶核酸的分子。例如，解封闭剂可以包含孔蛋白、踝蛋白或细胞骨架膜下蛋白。作为另一个示例，当抑制剂包含噬菌体λ时，解封闭剂可以包括lamB。
在多个方面，本公开描述了一种方法，该方法包括提供具有与捕获剂结合的表面的基底和提供组合物，该组合物包含多个不同的靶核酸，每个靶核酸包含被配置为结合捕获剂的通用序列。多个不同核酸中的至少一些核酸的通用序列被阻止与捕获剂结合。至少一些核酸被阻止与基底表面的结合位点结合。该方法还包括使基底的表面与组合物接触并解封闭多个不同的靶核酸中的至少一些靶核酸的通用序列以允许解封闭的核酸与捕获剂结合。该方法还可以包括在组合物与基底表面接触时扩增与捕获剂结合的核酸。
在一些实施方案中，本文所述方法中的组合物被配置为在组合物与基底表面接触的时间期间提供约5皮摩尔(pM)至约50pM范围内的可用于与捕获剂结合的靶核酸浓度。在一些实施方案中，组合物中核酸(包括可用于结合结合位点的那些和不可用于结合结合位点的那些)的总浓度可以在约50pM至约1nM的范围内。
多个不同的靶核酸可以包含DNA，诸如文库DNA。
捕获剂可以是捕获剂阵列的一部分。
基底可以是测序流通池的一部分。
定义
除非另外指明，否则本文所用的术语应理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
如本文所用，术语“阵列”是指可以根据相对位置彼此区分的一组位点。位于阵列的不同位点处的不同分子可以根据位点在阵列中的位置而彼此区分。阵列的单个位点可以包括一种或多种特定类型的分子。例如，位点可以包含具有特定序列的单个靶核酸分子，或者位点可以包含具有相同序列(和/或其互补序列)的若干核酸分子。阵列位点可以由基底或设备上的特征部限定。示例性特征部包括但不限于孔、小珠(或其他颗粒)、来自表面的凸起、表面上的脊、表面上的图案化涂层或表面中的通道。例如，阵列的每个位点可以由孔限定。
如本文所用，术语“扩增子”当用于提及核酸时，意指复制该核酸的产物，其中该产物具有与该核酸的核苷酸序列的至少拷贝部分相同或互补的核苷酸序列。扩增子可以通过使用核酸(例如靶核酸或其扩增子)作为模板的多种扩增方法中的任一种产生，所述扩增方法包括例如聚合酶延伸、聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、连接延伸或连接酶链反应。扩增子可以是具有特定核苷酸序列的单拷贝(例如，聚合酶延伸产物)或该核苷酸序列的多拷贝(例如，RCA的多联体产物)的核酸分子。靶核酸的第一扩增子通常为互补拷贝。后续的扩增子是在生成第一扩增子后，由靶核酸或由第一扩增子形成的拷贝。后续的扩增子可以具有与靶核酸基本上互补或与靶核酸基本上相同的序列。
如本文所用，术语“容量”当用于提及位点和核酸时，意指可占据该位点的核酸(例如，源自靶核酸的扩增子)的最大量。例如，该术语可以指在特定条件下可以占据该位点的核酸的总数。也可以使用其他度量，包括例如核酸的总质量或在特定条件下可以占据该位点的特定核苷酸序列的拷贝总数。通常，靶核酸的位点的容量将基本上等于靶核酸的扩增子的位点的容量。
如本文所用，术语“扩增位点”是指阵列的可以生成一个或多个扩增子的位点。扩增位点还可以被配置为包含、保持或附接在该位点生成的至少一个扩增子。扩增位点可以包含捕获剂。
如本文所用，术语“捕获剂”是指能够附接或保留靶分子(例如，靶核酸)的材料、化学物种、分子或它们的部分。示例性捕获剂包括但不限于与靶核酸的至少一部分互补(例如，被修饰以包括通用捕获结合序列)的捕获核酸、能够与修饰的靶核酸(或与其附接的连接部分)结合的受体-配体结合对的成员(例如，亲和素、链霉亲和素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)，或能够与修饰的靶核酸(或与其附接的连接部分)形成共价键的化学试剂。在一些实施方案中，捕获剂包含核酸。在一些实施方案中，包含核酸的捕获剂可以用作扩增引物。
为了本说明书的目的，靶核酸与捕获剂的“结合”意指靶核酸以适于对结合的靶核酸进行操作的方式相对于捕获剂附接或保留。例如，结合的靶核酸可以相对于捕获剂充分地附接或保留以进行靶核酸的扩增，同时靶核酸在扩增条件下仍然附接或保留捕获剂。结合可以包括共价结合、杂交等。关于靶核酸和抑制剂等，结合具有类似的含义。为了本说明书的目的，“接种”在基底上的核酸与基底结合；例如经由捕获剂结合。
当涉及核酸捕获剂时，可以使用术语“P5”和“P7”。术语“P5’”(P5上撇号)和“P7’”(P7上撇号)分别指P5和P7的互补序列。应当理解，任何合适的核酸捕获剂都可以用于本文所呈现的方法中，并且P5和P7的使用仅为示例性实施方案。在流通池上使用核酸捕获剂诸如P5和P7是本领域已知的，如WO 2007/010251、WO 2006/064199、WO 2005/065814、WO2015/106941、WO 1998/044151和WO 2000/018957的公开内容所例示。本领域技术人员将认识到核酸捕获剂也可以作为扩增引物起作用。例如，任何合适的核酸捕获剂都可以充当正向扩增引物，无论是固定的还是在溶液中的，并且可以用于本文呈现的用于与序列(例如，通用捕获结合序列)杂交和扩增序列的方法中。类似地，任何合适的核酸捕获剂都可以充当反向扩增引物，无论是固定的还是在溶液中的，并且可以用于本文呈现的用于与序列(例如，通用捕获结合序列)杂交和扩增序列的方法中。鉴于可获得的一般知识和本公开的教导，本领域技术人员将理解如何设计和使用适于捕获和扩增如本文所呈现的靶核酸的序列。
如本文所用，术语“通用序列”是指两个或更多个靶核酸共有的序列区域，其中这些分子也具有彼此不同的序列区域。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可以允许使用通用与通用序列(例如，通用捕获结合序列)的一部分互补的捕获核酸群体捕获多种不同的核酸。通用捕获结合序列的非限制性示例包括与P5和P7引物相同或互补的序列。P5具有以下核苷酸序列：AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA(SEQ ID NO:1)。P7具有以下核酸序列：CAAGCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT(SEQ ID NO:2)。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列的一部分(例如，通用引物结合位点)互补的通用引物的群体来复制或扩增多种不同核酸。如本文所述，靶核酸可以被修饰以例如在不同靶序列的一端或两端附接通用衔接子(本文也称为衔接子)。
如本文所用，术语“衔接子”及其派生词(例如，通用衔接子)通常是指可以连接到靶核酸的任何线性寡核苷酸。在一些实施方案中，衔接子与存在于样品中的任何靶序列的3'端或5'端基本上不互补。在一些实施方案中，合适的衔接子长度在约10至100个核苷酸、约12至60个核苷酸和约15至50个核苷酸的长度范围内。一般来讲，衔接子可以包括核苷酸和/或核酸的任何组合。衔接子可以包括一个或多个位置处的一个或多个可切割基团。衔接子可以包括与引物(例如，包含核酸的捕获剂)的至少一部分基本上相同或基本上互补的序列。衔接子可以包括条形码(也称为索引或标签)以有助于下游纠错、识别或测序。
如本文所定义，“样品”及其衍生物以其最广泛的意义使用，并且包括怀疑包括靶核酸的任何标本、培养物等。在一些实施方案中，样品包括DNA、RNA、PNA、LNA、嵌合或杂交形式的核酸中的一者或多者。样品可以包括含有一种或多种核酸的任何基于生物、临床、外科、农业、大气或水生动植物的标本。该术语还包括任何分离的核酸样品，诸如基因组DNA、新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋的核酸标本。还设想样品的来源可以是：单个个体、来自遗传相关成员的核酸样品的集合、来自遗传不相关成员的核酸样品、来自单个个体的(与之匹配的)核酸样品(诸如肿瘤样品和正常组织样品)，或者来自含有两种不同形式的遗传物种(诸如从母体受试者获得的母体DNA和胎儿DNA)的单个来源的样品，或者在含有植物或动物DNA的样品中存在污染性细菌DNA。在一些实施方案中，核酸材料的来源可以包括从新生儿获得的核酸，例如通常用于新生儿筛检的核酸。
如本文所用，当用于指核酸分子时，术语“双链”意指核酸分子中的核苷酸与互补核苷酸氢键键合。部分双链核酸可以占其与互补核苷酸氢键键合的核苷酸的至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
如本文所用，术语“每个”当用于提及项目的集合时，旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目，除非上下文中另外明确指出。
如本文所用，术语“排除体积”是指由特定分子占据以排除其它此类分子的空间体积。
如本文所用，术语“间隙区域”是指基底中或表面上与基底或表面的其它区域分开的区域。例如，间隙区域可以将阵列的一个位点与阵列的另一个位点分开。彼此分开的两个位点可以为离散的，彼此缺乏接触。在另一个示例中，间隙区域可以将位点的第一部分与位点的第二部分分开。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域通常具有与表面上位点的表面材料不同的表面材料。例如，阵列位点可以具有量或浓度超过存在于间隙区域处的量或浓度的捕获剂。在一些实施方案中，间隙区域可以不含捕获剂。
如本文所用，术语“聚合酶”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括例如使用核酸作为模板链产生核酸分子的互补复制的酶。通常，DNA聚合酶结合到模板链并且然后沿模板链向下移动，将核苷酸依序添加到生长核酸链的3'端处的游离羟基。DNA聚合酶通常自DNA模板合成互补DNA分子并且RNA聚合酶通常自DNA模板合成RNA分子(转录)。聚合酶可以使用短RNA或DNA链(称为引物)来开始链生长。一些聚合酶可以使它们将碱基添加到链的位点上游的链移位。此类聚合酶称为链置换的，意味着它们具有从由聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链移位活性的示例性聚合酶包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bsu，Bacillus subtilis)聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst，Bacillus stearothermophilus)聚合酶、外-克列诺(exo-Klenow)聚合酶、或测序级T7外-聚合酶的大片段。一些聚合酶使它们前方的链降解，从而有效地用后面生长的链置换前方链(5'核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有使它们后面的链降解的活性(3'核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶通过突变或以其它方式修饰以减少或消除3'和/或5'核酸外切酶活性。
如本文所用，术语“核酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括天然存在的核酸及其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的主链。类似结构可以具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如存在于核糖核酸(RNA)中)。核酸可以含有本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种。核酸可以包括天然的或非天然的碱基。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可以具有选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤的一个或多个碱基，并且核糖核酸可以具有选自尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的一个或多个碱基。可以包括在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。核酸可以包含两个或更多个核苷酸。
除非另有明确说明，否则术语“靶”当用于提及核酸时，旨在作为本文所示的方法或组合物的上下文中核酸的语义标识符并且不一定限制核酸的结构或功能。在每端具有通用序列(例如在每端具有通用衔接子)的靶核酸可以被称为修饰的靶核酸。为了本公开的目的，“靶核酸”和“修饰的靶核酸”可互换使用，并且指具有靶核苷酸序列的任何核酸。
如本文所用，术语“转运”是指分子通过流体移动。该术语可以包括被动转运，例如分子沿其浓度梯度移动(例如，被动扩散)。该术语还可以包括主动转运，分子可以沿其浓度梯度或逆其浓度梯度移动。因此，转运可以包括施加能量以将一个或多个分子沿期望方向或向期望位置(诸如扩增位点)移动。
如本文所用，术语“速率”当用于提及转运、扩增、捕获或其它化学过程时，旨在与其在化学动力学和生物化学动力学中的含义一致。两个过程的速率可以相对于最大速率(例如在饱和时)、预稳态速率(例如在平衡之前)、动力学速率常数或本领域已知的其它量度进行比较。特定过程的速率可以相对于完成该过程的总时间来确定。例如，扩增速率可以相对于扩增完成所花费的时间来确定。然而，特定过程的速率不需要相对于完成该过程的总时间来确定。
术语“和/或”意指所列要素中的一个或全部，或所列要素中的任何两个或更多个的组合。“或”在本文中用于意指“和/或”，除非上下文另有说明。在一些情况下，使用“和/或”并不意味着在其他情况下使用“或”旨在不意指“和/或”。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些益处的本发明的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案是不可用的，并且并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
术语“包含”及其变型在说明书和权利要求书中出现这些术语时不具有限制的含义。
应当理解，在本文以语言“包含”、“包括(include、includes或including)”等描述实施方案的任何地方，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。例如，包括小珠的基底可以是由小珠组成或基本上由小珠组成的基底。
除非另外指明，否则“一个”、“一种”、“该”和“至少一个”可互换使用，表示一个或多于一个。
用于待发生事件(诸如两个核酸序列的杂交)的“适合”的条件或“合适的”条件是不阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有利于事件。
如本文所用，在组合物的上下文中，“提供”物品或核酸意指制备组合物、物品或核酸、购买组合物、物品或核酸或以其他方式获得化合物、组合物、物品或核酸。
同样在本文中，通过端点表述的数值范围包括该范围内所包含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本说明书通篇提及的“一个实施方案”、“实施方案”、“某些实施方案”、“一些实施方案”、“一个方面”、“方面”、“某些方面”或“一些方面”等意指结合该实施方案或方面描述的特定特征、构型、组成或特性包括在本公开的至少一个实施方案或方面中。因此，本说明书通篇的多处出现的此类短语不一定指本公开的相同实施方案。此类短语在本说明书通篇不同位置的出现不一定意味着单独提及的方面或实施方案不相同或不可组合。此外，在一个或多个实施方案或方面中，本文公开的特定特征、构型、组成或特性可以任何合适的方式组合。
对于本文所公开的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以任何可行的顺序进行。并且，视情况而定，两个或更多个步骤的任何组合可同时进行。
本发明的上述发明内容并非旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了例示性实施方案。在本申请全文的若干地方，通过示例的列表提供了指导，这些示例可以各种组合使用。在每种情况下，所引用的列表仅用作代表性的组，并且不应理解为排他性列表。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可最好地理解本公开的例示性实施方案的以下详细描述。
图1是包括阵列的流通池的实施方案的示意性俯视平面图。
图2是阵列位点的一部分的实施方案的示意性侧视平面图，显示了附接于基底表面的捕获剂。
图3是图2的阵列位点的示意性侧视平面图，显示了与捕获剂结合的靶核酸。
图4是用于维持用于在阵列位点表面上接种和扩增的活性形式的靶核酸的低浓度的机制的实施方案的示意图。无活性形式的靶核酸池以维持活性形式的靶核苷酸的低浓度的速率转化成活性形式，以增加仅单一靶核酸物种在位点表面上接种的可能性并增加通过扩增生成单克隆簇的可能性。
图5是用于维持接种组合物中活性形式的靶核酸的低浓度的机制的实施方案的示意图。无活性形式的靶核酸池以维持活性形式的靶核苷酸的低浓度的速率转化成活性形式。无活性形式转化成活性形式的靶核酸的速率主要由解封闭剂与无活性形式组分的相互作用速率决定。
图6是用于以增加仅单以活性形式的靶核酸将接种到在阵列位点处的基底表面的可能性的速率将接种组合物中的无活性形式的靶核酸转化成活性形式的核酸的机制的示例的实施方案的示意图。一部分无活性形式的靶核酸被抑制剂封闭以防止接种。在接种组合物中以维持活性形式的靶核酸的低浓度的合适速率固有地发生向活性形式的转化。
图7是用于将接种组合物中的无活性形式的靶核酸转化成活性形式的核酸的机制的示例的实施方案的示意图。一部分无活性形式的靶核酸被抑制剂封闭以防止接种。解封闭剂与抑制剂相互作用以释放靶核酸的活性形式。靶核酸从无活性形式向活性形式的转化速率主要受解封闭剂与抑制剂的相互作用速率控制。
图8是用于将接种组合物中的无活性形式的靶核酸转化成活性形式的核酸的机制的示例的实施方案的示意图。无活性形式的靶核酸被包封在载体诸如脂质体中。解封闭剂与媒介物相互作用以引起活性形式的靶核酸的释放。靶核酸从无活性形式向活性形式的转化速率主要受解封闭剂与媒介物的相互作用速率控制。
图9是用于将接种组合物中的无活性形式的靶核酸转化成活性形式的核酸的机制的示例的实施方案的示意图。无活性形式的靶核酸被包封在噬菌体中。解封闭剂诸如LamB与噬菌体相互作用以引起活性形式的靶核酸的释放。靶核酸从无活性形式向活性形式的转化速率主要受解封闭剂与噬菌体的相互作用速率控制。
图10是用于以增加仅单以活性形式的靶核酸将接种到在阵列位点处的基底表面的可能性的速率将接种组合物中的无活性形式的靶核酸转化成活性形式的核酸的机制的示例的实施方案的示意图。靶核酸具有形成发夹环并阻止靶核酸与基底上的捕获剂在阵列位点处结合的延伸。在接种组合物中以维持活性形式的靶核酸的低浓度的合适速率固有地发生向活性形式的转化。
图11是用于以增加仅单以活性形式的靶核酸将接种到在阵列位点处的基底表面的可能性的速率将接种组合物中的无活性形式的靶核酸转化成活性形式的核酸的机制的示例的实施方案的示意图。靶核酸具有形成发夹环并阻止靶核酸与基底上的捕获剂在阵列位点处结合的延伸。限制性内切酶可以切割延伸以促进以适当速率转化成活性形式。
图12是550nm间距、360nm直径的纳米孔簇的随机光学重建显微镜(STORM)图像。许多簇发出不同的颜色，表明这些簇是多克隆的。
图13是％PF和％优势的关系图。该图显示当簇的％优势增加时，它们的％PF也增加。每个数据点表示通过STORM成像确定的平均％优势和通过测序确定的几个10s至100s纳米孔群体的平均％PF。
图14A是来自纳米孔的重复接种/扩增实验的一系列STORM图像。在该实验中，从左至右进行5个连续步骤，在前4个步骤(红、绿、白、品红)中，将20pM DNA与扩增混合物一起孵育15分钟，然后用缓冲液冲洗。在最后步骤中，将200pM DNA接种并扩增以填充最后的孔(黄色)。
图14B是显示从图14A中描绘的图像获得的结果的图。通过STORM成像分析重复接种/扩增簇以确定它们的优势，表明该策略可以将优势分布转移到更高的％优势。通过测序证实更高的％PF。
图15A和图15B是说明噬菌体介导的DNA文库分子向溶液中的控制释放、准备用于接种的图像。DNA被牢固地保持在噬菌体衣壳内(15A)，直到添加LamB触发蛋白导致噬菌体衣壳将DNA释放到溶液中(15B)。图15A显示了保持在噬菌体内表面上的一些DNA，并且图15B显示了在LamB使DNA分子从噬菌体释放后一段时间后的相同区域。
示意图未必按比例绘制。附图中使用的类似标号是指类似的部件、步骤等。然而，应当理解，在给定附图中使用数字来指代部件并非旨在限制在另一附图中用相同数字标记的部件。此外，使用不同的数字来指代部件并非旨在指示不同编号的部件不能与其他编号的部件相同或类似。
具体实施方式
本申请尤其涉及用于在基底表面上的位点以簇形式接种或接种和扩增源自样品的靶核酸的方法。至少一部分靶核酸最初呈不能接种的无活性形式，使可用于接种的活性形式的靶核酸的浓度相对低。活性形式的靶核酸可以在它们接种在基底表面上时被扩增。因为活性形式的靶核酸的浓度低，所以第二活性形式的靶核酸在第一活性形式的靶核酸被充分扩增以占优势之前将在相同位点接种的可能性低。通过保持活性形式的靶核酸的低浓度，可以保持核酸在基底表面上的接种速率相对于接种的核酸的扩增速率低，这可以允许第一接种的核酸被扩增至足以在第二核酸在相同位点接种之前占优势的程度。因此，相对于采用更高浓度的活性核酸的传统接种和扩增方法，位点处的簇将PF的可能性增加。
阵列
本文所述的方法可以用于将靶核酸接种在任何合适的基底上。优选地，基底或包括一个或多个基底的设备具有捕获剂阵列。阵列的捕获剂优选充当扩增位点的至少一部分。
基底可以包括任何合适的材料，该材料可以包括或可以被改性以包括捕集剂。合适材料的示例包括玻璃、改性玻璃、功能化玻璃、无机玻璃、微球(例如惰性和/或磁性颗粒)、塑料、多糖、尼龙、硝化纤维、陶瓷、树脂、二氧化硅、基于二氧化硅的材料、碳、金属、光纤或光纤束、聚合物和多孔板(例如微量滴定板)。示例性的塑料包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯和TeflonTM。示例性的基于二氧化硅的材料包括硅和各种形式的改性硅。
在一些实施方案中，基底在更大的设备(诸如孔、管、通道、比色皿、陪替氏培养皿、瓶等)内或为该设备的一部分。优选地，流通池包括基底。合适的流通池的示例包括在cBot测序工作站(Illumina,Inc.,San Diego,CA)中使用的八通道流通池和在例如美国专利号8,241,573、WO 2007/123,744或Bentley等人，Nature，第456卷第53-59页(2008年)中描述的那些。示例性的流通池包括可从Illumina,Inc.(San Diego,Calif.)商购获得的那些。任选地，流通池是图案化流通池。合适的图案化流通池包括但不限于WO 2008/157640中描述的流通池。在一些实施方案中，微孔板或微量滴定板包括基底。
捕获剂可以位于基底或包括一个或多个基底的设备上的阵列的任何合适位点。
在一些实施方案中，阵列位点可以被配置为基底表面上的特征部。特征部可以以各种期望的形式中的任一种存在。例如，位点可以包括孔、凹坑、通道、脊、凸起区域、钉、柱等。位点可以包含小珠或颗粒。在一些实施方案中，位点不包含小珠或颗粒。示例性位点包括存在于包括用于由454LifeSciences(Roche的子公司，Basel Switzerland)或IonTorrent(Life Technologies的子公司，Carlsbad CA)销售的商业测序平台的基底的设备中的孔。其它包括孔的设备包括例如蚀刻的光纤和在美国专利号6,266,459；美国专利号6,355,431；美国专利号6,770,441；美国专利号6,859,570；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568；美国专利号6,274,320；美国专利号8,262,900；美国专利号7,948,015；美国专利公开号2010/0137143；美国专利号8,349,167或PCT公开号WO 00/63437中描述的其它基底。在一些情况下，在这些参考文献中举例说明了用于在孔中使用小珠作为基底的应用的基底。在本公开的方法或组合物中，含孔基底可以与或不与小珠一起使用。在一些实施方案中，基底的孔可以包括凝胶材料(具有或不具有小珠)，如美国专利号9,512,422中所述。
阵列位点可以包含非金属表面上的金属特征部，诸如玻璃、塑料或其它上述材料。金属层可以使用本领域已知的方法沉积在表面上，诸如湿法等离子体蚀刻、干法等离子体蚀刻、原子层沉积、离子束蚀刻、化学气相沉积、真空溅射等。可以适当地使用多种商业仪器中的任一者，包括例如Ionfab/>或Optofab/>systems(Oxford Instruments,UK)。金属层也可以通过电子束蒸发或溅射来沉积，如Thornton,Ann.Rev.Mater.Sci.第7卷：第239-260页(1977年)所示。金属层沉积技术(诸如上文所例示的那些)可以与光刻技术组合以在表面上产生金属区域或贴片。美国专利号8,778,848和美国专利号8,895,249中提供了用于组合金属层沉积技术和光刻技术的示例性方法。
可以限定阵列位点的特征部阵列可以表现为斑点或贴片的网格。特征部可以以重复图案或以不规则的非重复图案定位。特别有用的图案是六边形图案、直线图案、网格图案、具有反射对称性的图案、具有旋转对称性的图案等。不对称的图案也可以是有用的。不同的最近相邻特征部对之间的间距可以相同，或者不同的最近相邻特征部对之间的间距可以不同。在具体实施方案中，阵列的特征部可以各自具有大于约100nm2、250nm2、500nm2、1μm2、2.5μm2、5μm2、10μm2、100μm2或500μm2的面积。另选地或除此之外，阵列的特征部可以各自具有小于约1mm2、500μm2、100μm2、25μm2、10μm2、5μm2、1μm2、500nm2或100nm2的面积。实际上，区域可以具有在选自上文所例示的那些上限和下限之间的范围内的大小。
对于包括限定表面上的位点的特征部的阵列的实施方案，特征部可以是离散的，由间隙区域分开。特征部的大小和/或位点之间的间隔可以不同，使得阵列可以是高密度、中密度或低密度。高密度阵列可以具有间隔小于约15μm的区域。中密度阵列具有间隔约15至30μm的区域，而低密度阵列具有间隔大于30μm的区域。可用于本文所述方法和设备的阵列可以具有低密度阵列、中密度阵列或高密度阵列。在一些实施方案中，具有如本文所述的阵列的设备具有间隔小于100μm、50μm、10μm、5μm、1μm或0.5μm的区域。
在一些实施方案中，阵列可以包括小珠或其它颗粒的集合。颗粒可以悬浮在溶液中，或者它们可以位于基底的表面上。溶液中小珠阵列的示例是由Luminex(Austin,Tex.)商业化的那些。具有位于表面上的小珠的阵列的示例包括其中小珠位于孔中的那些阵列，诸如BeadChip阵列(Illumina Inc.,San Diego Calif.)或用于来自454LifeSciences(Roche的子公司，Basel Switzerland)或Ion Torrent(Life Technologies的子公司，Carlsbad CA)的测序平台的基底。在美国专利号6,266,459；美国专利号6,355,431；美国专利号6,770,441；美国专利号6,859,570；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568；美国专利号6,274,320；US 2009/0026082A1；US2009/0127589 A1；US2010/0137143 A1；US2010/0282617A1或PCT公开号WO 00/63437中描述了具有位于表面上的小珠的其他阵列。上述几篇参考文献描述了用于在将小珠加载到阵列基底中或上之前将靶核酸附接到小珠的方法。应当理解，可以使小珠包括捕获剂，并且然后可以使用小珠加载阵列，从而形成用于本文所述方法的扩增位点。如前所述，可以在没有小珠的情况下使用基底。例如，捕获剂可以直接附接于孔或孔中的凝胶材料。因此，参考文献是可被修饰以用于本文所述方法和组合物的材料、组合物或设备的示例。
阵列的扩增位点可以包括多种能够结合靶核酸的捕获剂。在一些实施方案中，捕获剂包括捕获核酸。捕获核酸的核苷酸序列可以与一个或多个靶核酸的序列(诸如通用衔接子的区域的序列)互补。在一些实施方案中，捕获核酸可以作为扩增靶核酸的引物起作用。在一些实施方案中，一个捕获核酸群体包括P5引物或其互补物，并且第二个捕获核酸群体包括P7引物或其互补物。
捕获剂(诸如捕获核酸)可以附接于扩增位点。例如，捕获剂可以附接于限定阵列位点的特征部的表面。附接可以经由中间结构，诸如小珠、颗粒或凝胶。经由凝胶将捕获核酸附接于阵列的示例描述于美国专利号8,895,249中，且进一步由可从Illumina Inc.(SanDiego,Calif.)商购获得的流通池例示或描述于WO 2008/093098中。可以用于本文所述的方法和设备中的示例性凝胶包括但不限于具有胶体结构的那些凝胶，诸如琼脂糖；具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或交联的聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺、SFA(参见例如美国专利申请公开号2011/0059865A1)或PAZAM(参见例如美国临时专利申请序列号61/753,833和美国专利号9,012,022)。经由小珠的附接可以如本说明书中和本文先前所述的引用参考文献中举例说明的来实现。
在一些实施方案中，限定阵列表面上的位点的特征部是非邻接的，被表面的间隙区域分开。与阵列的特征部相比，具有基本上更低量或浓度的捕获剂的间隙区域是有利的。缺乏捕获剂的间隙区域是特别有利的。例如，在间隙区域相对少量存在或不存在捕获部分有利于靶核酸和随后产生的簇定位到期望的特征部。在一些实施方案中，特征部可以是表面中的凹形特征部(例如，孔)，并且该特征部可以包含凝胶材料。含凝胶的特征部可以通过表面上的间隙区域彼此分隔，其中该凝胶基本上不存在，或者如果存在，该凝胶基本上不能支持核酸的定位。用于制备和使用具有含凝胶特征部(诸如孔)的基底的方法和组合物描述于美国专利号9,512,422中。
具有包括多个位点110的阵列的流通池100的示例在图1中示意性地示出。在所描绘的实施方案中，位点110包括可以含有捕获剂的孔。例如，图2和图3示出了阵列位点110的一部分，其可以是图1中所描绘的孔。图2显示了没有杂交的靶核酸的位点110，并且图3显示了具有杂交的靶核酸200的位点110。位点110包括基底表面120和在表面120上的多个捕获剂130。捕获剂130包含与靶核酸200的一部分235互补的核苷酸序列135。例如，捕获剂130可以包含P5或P7引物序列，并且靶核酸200可以包含通用衔接子序列，该通用衔接子序列在其3'端包含与P5或P7引物序列的至少一部分互补的核苷酸序列(例如，核苷酸序列135)。当流通池100在位点110与包含靶核酸文库的组合物接触时，靶核酸200的部分235可以与捕获剂130的核苷酸135的互补序列杂交。捕获剂130可以充当扩增引物以复制靶核酸200。例如，捕获剂130可以包含游离3'端，可以使用靶核酸200作为模板从该游离3'端进行延伸。因此，位点110可以是可以在其上形成簇的扩增位点。
虽然未显示，但应理解第二捕获剂可以在位点的表面上以允许桥扩增。在此类情况下，靶核酸的5'端可以包括具有与第二捕获剂的核苷酸序列相同的序列的通用衔接子。因此，当使用第一捕获剂130作为引物复制靶核酸时，所得的复制核酸将具有可以在桥扩增期间与第二捕获剂杂交的互补序列。
接种组合物
可以通过使阵列位点与包含靶核酸的组合物接触来完成接种。组合物优选在用于接种的温度下是液体组合物。组合物可以是溶液、悬浮液、分散体等。优选地，核酸完全溶解在组合物中。
接种组合物可以包括一种或多种用于扩增接种的靶核酸的组分。例如，合适的核苷酸、缓冲液、酶、辅因子、引物等可以包括在接种组合物中。
接种组合物可以包含任何合适浓度的总靶核酸。例如，接种组合物可以包含约50pM至约1nM的总靶核酸，诸如约100pM至约700pM、约200pM至约500pM或约300pM的总靶核酸。优选地，接种组合物由包含许多不同靶核酸的靶核酸文库形成。
接种组合物可以具有任何合适浓度的能够在阵列位点处结合捕获剂的活性形式的靶核酸。例如，活性形式的靶核酸的浓度可以在约5pM至约50pM的范围内，诸如约10pM至约40pM、约15pM至约30pM或约20pM。
如上所述，在接种期间保持活性形式的靶核酸的低浓度降低了多于一个靶核酸将接种在特定位点的可能性，并且因此增加了由该位点处的扩增产生的簇将是单克隆的或将具有比采用更高浓度的活性形式的靶核酸的传统接种和扩增更高的优势百分比的可能性。对于传统的接种和扩增，接种组合物中的所有或基本上所有的靶核酸是活性形式的靶核酸。
可以采用用于从较高浓度总靶核酸池提供低浓度的活性形式的靶核酸的任何合适机制。例如，试剂可以抑制靶核酸的至少一部分与捕获剂结合以及接种在用于簇形成的阵列位点的表面上。抑制剂可以包封一个或多个靶核酸或可以封闭一部分靶核酸以防止在表面上接种。当抑制剂抑制靶核酸与捕获剂结合时，靶核酸是无活性形式。
抑制剂优选与靶核酸(例如靶核酸的通用序列)选择性相互作用，而不是通过非选择性机制(诸如分子拥挤等)抑制结合。
在抑制剂封闭靶核酸(无活性形式)和从抑制剂释放或解封闭靶核酸(活性形式)之间可以存在平衡。优选地，该平衡有利于活性形式的靶核酸的浓度低于无活性形式核酸的浓度。释放的或解封闭的活性形式的靶核酸可以在阵列位点处结合捕获剂(即，在表面上接种)并被扩增以形成簇。无活性形式和活性形式的靶核酸之间的平衡在接种组合物内可以是固有的。
在一些实施方案中，此类平衡可以描绘为如下式I所示：
在一些实施方案中，接种组合物包含解封闭剂，其与抑制剂相互作用以释放或解封闭靶核酸并将靶核酸从无活性形式转化成活性形式。解封闭剂可以刚好在接种组合物与阵列接触之前或接种组合物与阵列接触时掺入到接种组合物中。
在抑制剂与解封闭剂的相互作用之间可以存在平衡，该平衡可以驱动组合物中活性形式的靶核酸的浓度。例如，如果在靶核酸与抑制剂结合时靶核酸呈无活性形式，而在抑制剂与解封闭剂结合时靶核酸呈活性形式，则游离解封闭剂和与抑制剂结合的解封闭剂之间的平衡优选向游离解封闭剂移动。
在一些实施方案中，此类平衡可以描述为如下式II所示：
在一些实施方案中，靶核酸从无活性形式向活性形式的转化在接种组合物中是有效不可逆的或基本上不可逆的。在此类实施方案中，从无活性形式到活性形式的转化速率优选比扩增速率慢。无活性形式的靶核酸向活性形式的靶核酸的转化速率可以在很大程度上控制接种速率。从无活性形式向活性形式的转化可以是固有的(例如，类似于式I，但在一个方向上)或者可以由解封闭剂驱动(例如，类似于式II，但在一个方向上)。
图4和图5示意性地显示了用于提供具有相对高浓度的无活性形式的靶核酸200'的核酸池20以实现相对低浓度的活性形式的靶核酸200的机制。无活性形式的靶核酸200'不接种在阵列位点的表面上，而活性形式的靶核酸200可以(例如，经由与捕获剂的相互作用)接种在阵列位点110的表面上。可以扩增接种的靶核酸200以形成簇(例如，如图4的最右侧所示)。从无活性形式到活性形式的转化可以是固有的(例如，如图4中所示)或可以由解封闭剂300驱动(例如，如图5中所示)。
任何合适的抑制剂200可以用于抑制靶核酸的至少一部分与捕获剂结合。抑制剂可以是靶核酸的延伸或可以与靶核苷酸分开。抑制剂可以包封一个或多个靶核酸。当未封闭时，抑制剂可以封闭靶核酸的与捕获剂结合的部分。
与靶核酸分离的抑制剂
A.封闭
可以使用阻止靶核酸在阵列位点与捕获剂结合的任何合适的抑制剂。封闭核酸(无活性形式)的至少一部分可以转化成活性形式。这可以固有地发生在接种组合物中或可以由解封闭剂驱动。
抑制剂可以包含与靶核酸的被配置为结合捕获剂并因此抑制靶核苷酸与捕获剂结合的部分杂交的核酸。抑制剂可以是任何长度的核酸。例如，抑制剂可以具有约10个核苷酸或更多的长度，诸如100个核苷酸或更多，或1000个核苷酸或更多。抑制剂可以是长度大于靶核酸的核酸。优选地，抑制剂的长度小于靶核酸的长度。例如，抑制剂可以具有约10至约100个核苷酸、约12至约60个核苷酸、或约15至约50个核苷酸的长度。
核酸抑制剂的至少一部分可以与靶核酸的被配置为结合捕获剂的部分杂交。在一些实施方案中，抑制剂包含与被配置为结合捕获剂的靶核酸的整个部分完全互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，抑制剂包含与被配置为结合捕获剂的靶核酸的整个部分不完全互补的核苷酸序列。抑制剂可以包含与靶核酸的被配置为结合捕获剂的部分的5'或3'的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
可以调节抑制剂与靶核酸的互补性百分比、互补性长度或互补性区域以调整捕获剂和抑制剂对靶核酸的相对亲和力，这可以调整可用于经由与捕获剂结合而接种的无活性形式的靶核酸和活性形式的靶核酸的相对浓度。另外，互补部分可以包括非天然核苷酸，诸如锁核苷酸，其可以增强或降低抑制剂与靶核酸之间的碱基对结合稳定性以改变捕获剂和抑制剂对靶核酸的相对亲和力。
可以调节接种组合物中核酸抑制剂的浓度以通过移动平衡实现具有杂交抑制剂的无活性靶核酸和不与抑制剂杂交的活性形式核酸的期望比例。实现活性形式的靶核酸的期望浓度的核酸抑制剂的浓度可以取决于总靶核酸的浓度；抑制剂与靶核酸的互补性百分比、互补性长度或互补性区域；互补性区域的序列；以及抑制剂或靶核酸是否包括增强或降低相对于天然核苷酸对应物的碱基对结合稳定性的任何非天然核苷酸。
核酸抑制剂的浓度可以大于、等于或小于靶核酸的总浓度。优选地，核酸抑制剂的浓度大于接种组合物中总靶核酸的浓度。例如，核酸抑制剂的浓度可以是总靶核酸浓度的约1.5倍或更多、总靶核酸浓度的2倍或更多、或总靶核酸浓度的约2.5倍或更多。
图6示意性地显示了与核酸抑制剂220络合210的无活性形式的靶核酸200'向可以接种在阵列位点110表面上的活性形式的靶核酸200的转化(例如，经由与捕获剂杂交)。转化在接种溶液中固有地发生以维持活性形式的靶核酸200的低浓度，从而降低多于一个靶核酸200接种在阵列位点110上的可能性，使得在扩增时所得簇是单克隆的或具有高优势百分比。
在一些实施方案中，接种组合物包含核酸抑制剂和核酸解封闭剂。核酸抑制剂可以是如上所述的。核苷酸解封闭剂可以具有与靶核酸竞争结合抑制剂的核酸序列。当解封闭剂与抑制剂杂交时，靶核酸被释放并处于活性形式。
核酸解封闭剂的至少一部分可以与核酸抑制剂杂交。在一些实施方案中，解封闭剂包含与整个抑制剂完全互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，解封闭剂包含与整个抑制剂不完全互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，解封闭剂具有与捕获剂的可以与靶核酸杂交的部分相同的序列。
优选地，抑制剂与靶核酸部分互补，并且解封闭剂与抑制剂的互补程度高于抑制剂与靶核酸的互补程度。在一些实施方案中，抑制剂与靶核酸部分互补，并且解封闭剂与抑制剂完全互补。
可以调节抑制剂与靶核酸的互补性百分比、互补性长度或互补性区域以及解封闭剂与抑制剂的互补性百分比、互补性长度或互补性区域以调整捕获剂和抑制剂对靶核酸的相对亲和力以及解封闭剂对抑制剂的相对亲和力，这可以调整可用于经由与捕获剂结合而接种的无活性形式的靶核酸和活性形式的靶核酸的相对浓度。另外，互补部分可以包括非天然核苷酸，诸如锁核苷酸，其可以增强或降低抑制剂与靶核酸以及解封闭剂与抑制剂之间的碱基对结合稳定性，以改变捕获剂和抑制剂对靶核酸以及解封闭剂对抑制剂的相对亲和力。
可以调节接种组合物中核酸抑制剂和核酸解封闭剂的浓度以实现无活性靶核酸和活性形式核酸的期望比例。实现活性形式的靶核酸的期望浓度的抑制剂和解封闭剂的浓度可以取决于总靶核酸的浓度；抑制剂与靶核酸的互补性百分比、互补性长度或互补性区域；解封闭剂与抑制剂的互补性百分比、互补性长度或互补性区域；抑制剂与靶核酸之间的互补性区域的序列以及解封闭剂与抑制剂之间的互补性区域的序列；以及抑制剂、解封闭剂或靶核酸是否包括增强或降低相对于天然核苷酸对应物的碱基对结合稳定性的任何非天然核苷酸。
优选地，核酸抑制剂的浓度大于接种组合物中总靶核酸的浓度，并且核酸解封闭剂的浓度小于接种组合物中总靶核酸的浓度。在一些实施方案中，抑制剂的浓度是解封闭剂的浓度的两倍或更多。例如，抑制剂的浓度可以是解封闭剂的浓度的5倍或更多，或者可以是解封闭剂的浓度的10倍或更多。在一些实施方案中，抑制剂的浓度是解封闭剂的浓度的约5倍至约10倍。
图7示意性地显示了与核酸抑制剂220络合210的无活性形式的靶核酸200'向可以接种在阵列位点表面上的活性形式的靶核酸200的转化(例如，经由与捕获剂杂交)。该转化由与靶核酸200竞争结合抑制剂220的解封闭剂介导。当解封闭剂300和抑制剂220杂交时，它们形成络合物310。可以调整条件以提供相对高浓度的无活性形式的靶核酸200'和抑制剂220的络合物210和相对低浓度的活性形式的靶核酸200，以降低多于一个靶核酸200接种在阵列位点110上的可能性，使得在扩增时所得簇是单克隆的或具有高优势百分比。
B.包封
在一些实施方案中，接种组合物包含包封在媒介物中的无活性靶核酸池。靶核酸是无活性的，因为它们被包封并且不能在阵列位点处结合捕获剂。靶核酸可以以合适的速率从媒介物中释放以提供用于接种的活性形式的(释放的)靶核酸的合适浓度。靶核酸可以以任何合适的方式包封在媒介物中。靶核酸被包封和释放的方式可以取决于所使用的媒介物。靶核酸从媒介物中的释放可以固有地发生在接种组合物中，或可以由解封闭剂介导。采用的解封闭剂可以取决于用于包封靶核酸的媒介物。
可以使用任何合适的媒介物来包封靶核酸。例如，靶核酸可以被包封在胶束、脂质体、噬菌体等中。
在一些实施方案中，接种组合物包含包封在脂质体中的靶核酸。靶核酸可以以任何合适的方式包封在任何合适的脂质体中。例如，通过主动包封的被动包埋将靶核酸包封在脂质体中。被动包埋可以在脂质体形成期间采用诸如反相蒸发、脱水/再水合、去污剂透析、经由二价阳离子螯合的融合、溶解于有机溶剂(诸如乙醇)中的脂质体与溶解于水性溶剂中的靶核酸的混合等的技术进行。主动包封可以通过将靶核酸加载到预形成的脂质体中来进行。在美国专利号5,227,170中描述了主动包封的一个示例。
可以使用的其它脂质体包封方法描述于以下文献中：美国专利号9,278,067；美国专利申请公开号2009/0068256、PCT专利申请公开号WO 00/03683；美国专利号7,790,696；美国专利申请公开号2006/0058249；Jeffs等人，(2005年3月)，A Scalable,Extrusion-Free Method for Efficient Liposomal Encapsulation of Plasmid DNA，Pharmaceutical Research，第22卷第3期：第362-372页；Gjetting等人，(2011年5月)，Asimple protocol for preparation of a liposomal vesicle with encapsulatedplasmid DNA that mediate high accumulation and reporter gene activity intumor tissue，Results Pharma Sci.，第1卷第1期：第49-56页；Lo等人，(2011年11月)，Encapsulation of DNA in negatively charged liposomes and inhibition ofbacterial gene expression with fluid liposome-encapsulated antisenseoligonucleotides，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)–Biomembranes，第1515卷第1期：第44-54页。
可以使用任何合适的脂质来形成脂质体。例如，可以采用上述出版物中公开的脂质和其它分子。在一些实施方案中，脂质体包含磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油和胆固醇中的一种或多种。
接种溶液可以包含引起靶核酸从脂质体释放的解封闭剂。可以使用任何合适的解封闭剂。例如，解封闭剂可以包含破坏脂质体以释放靶核酸的分子。破坏脂质体的合适分子的示例包括生物孔蛋白分子、细胞骨架膜下蛋白和踝蛋白。可以调整解封闭剂在接种组合物中的浓度以实现活性形式的(释放的)靶核酸在接种溶液中的期望浓度。
可以在时间上接近接种组合物与阵列接触的时间或在接种组合物与阵列接触的同时将解封闭分子添加到接种组合物中。
图8示意性地显示了包封在充当抑制剂220的脂质体400中的无活性形式的靶核酸200'向活性形式的靶核酸200的转化。解封闭剂300(诸如生物孔蛋白、细胞骨架膜下蛋白或踝蛋白)破坏脂质体400'，从而引起靶核酸(活性形式)200的释放。可以调整解封闭剂300的浓度，使得脂质体400被破坏的速率足够慢以维持活性形式的靶核酸200的适当低浓度，从而使多于一个靶核酸200接种在阵列位点110上的可能性保持低，使得在扩增时所得簇是单克隆的或具有高优势百分比。
在一些实施方案中，接种组合物包含包封在病毒载体(诸如噬菌体)中的靶核酸。靶核苷酸可以在任何合适的病毒载体中以任何合适的方式包封。例如，靶核酸可以通过将靶核酸易位到预先形成的蛋白质壳(诸如前头)而包装到噬菌体中。包装可以由包装酶或末端酶介导。
可以使用任何合适的病毒或噬菌体来包封靶核酸。例如，腺病毒、T4噬菌体、丝状噬菌体、噬菌体λ等可以用于包封靶核酸。
接种溶液可以包含引起靶核酸从病毒或噬菌体释放的解封闭剂。可以使用任何合适的解封闭剂。例如，如果噬菌体λ用于包封靶核酸，则lamB可以用于引起靶核酸从噬菌体释放。可以调整解封闭剂在接种组合物中的浓度以实现活性形式的(释放的)靶核酸在接种溶液中的期望浓度。
可以在时间上接近接种组合物与阵列接触的时间或在接种组合物与阵列接触的同时将解封闭分子添加到接种组合物中。
使用噬菌体释放DNA的一个示例描述于Grayson等人，(2007年9月)“Real-timeobservations of single bacteriophageλDNA ejections in vitro”，Proc.Ntl.Acad.Sci.USA，第104卷第37期：第14652-14657页，其教导可被采用或根据需要修改以用于本文所述的接种。
图9示意性地显示了包封在充当抑制剂220的噬菌体500中的无活性形式的靶核酸200'向活性形式的靶核酸200的转化。解封闭剂300(诸如lamB)与噬菌体500相互作用以引起靶核酸(活性形式)200的释放。可以调整解封闭剂300的浓度，使得噬菌体500释放靶核酸200的速率足够慢以维持活性形式的靶核酸200的适当低浓度，从而使多于一个靶核酸200接种在阵列位点110上的可能性低，使得在扩增时所得簇是单克隆的或具有高优势百分比。
作为靶核酸延伸的抑制剂
当抑制剂是靶核酸的延伸时，抑制剂可以与靶核酸的被配置为结合捕获剂的部分杂交，并因此抑制靶核苷酸与捕获剂结合。例如，抑制剂可以从靶核酸的一端延伸以形成发夹环或茎环，该发夹环或茎环具有与靶核酸的被配置为结合捕获剂的部分杂交的部分。优选地，抑制剂从靶核苷酸的3'端延伸。抑制剂可以具有约10至约100个核苷酸、约12至约60个核苷酸、或约15至约50个核苷酸的长度。抑制剂的至少一部分可以与靶核酸的被配置为结合捕获剂的部分杂交。在一些实施方案中，抑制剂包含与被配置为结合捕获剂的靶核酸的整个部分完全互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，抑制剂包含与被配置为结合捕获剂的靶核酸的整个部分不完全互补的核苷酸序列。抑制剂可以包含与靶核酸的被配置为结合捕获剂的部分的5'或3'的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
可以调节抑制剂与靶核酸的互补性百分比、互补性长度或互补性区域以调整捕获剂和抑制剂对靶核酸的相对亲和力，这可以调整可用于经由与捕获剂结合而接种的无活性形式的靶核酸和活性形式的靶核酸的相对浓度。另外，互补部分可以被修饰以包括非天然核苷酸，诸如锁核苷酸，其可以增强或降低抑制剂与靶核酸之间的碱基对结合稳定性以改变捕获剂和抑制剂对靶核酸的相对亲和力。
如果抑制剂与靶核酸的被配置为结合捕获剂的整个部分完全互补，则靶核酸的被配置为结合捕获剂的部分与抑制剂的杂交(分子内结合)相对于与捕获剂的杂交(分子间结合)在热力学上可能是有利的。
图10示意性地显示了在接种溶液中失活形式的靶核酸200'向活性形式的靶核酸200的转化。靶核酸包括3'延伸至被配置为在阵列位点110处结合基底的表面120上的捕获剂130的部分的部分220。在无活性形式200'中，3'延伸部分220与靶核苷酸的被配置为结合捕获剂130的部分的至少一部分杂交，并因此阻止靶核酸与捕获剂130结合。在活性形式220中，3'延伸不与靶核苷酸的被配置为结合捕获剂130的部分的一部分杂交。与捕获剂130结合的活性形式的靶核酸200可以被扩增以产生靶核酸200的一部分的拷贝700。从无活性形式向活性形式的转化可以在接种组合物中以提供适当浓度的活性形式的靶核酸200的速率固有地发生。
在一些实施方案中，抑制剂是靶核酸的延伸并且接种组合物包含解封闭剂，该解封闭剂切割靶核酸的延伸以促进靶核酸从无活性形式转化成活性形式。延伸可以被任何合适的试剂切割。例如，延伸可以被限制性内切酶切割。可以控制限制性内切酶或其它合适的切割剂的浓度以调节靶核酸从无活性形式向活性形式转化的速率。
图11示意性地显示了在接种溶液中无活性形式的靶核酸200向活性形式的靶核酸200的转化。靶核酸包括3'延伸至被配置为在阵列位点110处结合基底的表面120上的捕获剂130的部分的部分220。在无活性形式200'中，3'延伸部分220与靶核苷酸的被配置为结合捕获剂130的部分的至少一部分杂交，并因此阻止靶核酸与捕获剂130结合。在活性形式220中，3'延伸不与靶核苷酸的被配置为结合捕获剂130的部分的一部分杂交。与捕获剂130结合的活性形式的靶核酸200可以被扩增以产生靶核酸200的一部分的拷贝700。通过经由限制性内切酶(解封闭剂)300切割延伸促进从无活性形式向活性形式的转化。
尽管未显示，但应理解，核酸解封闭剂(例如，如关于图7所描绘和描述的)可以用于关于图10和图11所描绘和描述的方法中。
应当理解，上面提出的机制不是穷尽的，并且可以采用用于以维持相对低浓度的用于接种的活性核苷酸的速率将无活性形式的靶核苷酸池转化为活性形式的靶核苷酸的其他合适机制。
靶核酸文库
接种组合物可以包含任何合适的靶核酸。优选地，接种组合物包含源自样品的不同靶核酸的文库。
一旦从样品中获得靶核酸，就可以使用多种可用的和已知的标准技术制备用于本文所述方法的靶核酸。核酸制备的示例性方法包括但不限于在Bentley等人，Nature，第456卷第49-51页(2008年)；美国专利号7,115,400；和美国专利申请公开号2007/0128624；2009/0226975；2005/0100900；2005/0059048；2007/0110638；和2007/0128624中所描述的。
接种组合物中的靶核酸可以是单链的或双链的。优选地，靶核酸是双链的。可以将通用衔接子连接至源自样品的双链靶核酸的两端。通用衔接子可以包括双链核酸区域和单链非互补核酸链区域。单链非互补核酸链的区域可以包括在3'端的第一通用捕获结合序列。第一通用捕获结合序列可以与具有与第一通用捕获结合序列互补的核苷酸序列的第一捕获剂的至少一部分结合。第一捕获剂可以在阵列位点处。
单链非互补核酸链的区域可以任选地包括在5'端的第二通用捕获结合序列。第二通用捕获结合序列可以与具有与第二通用捕获结合序列互补的核苷酸序列的第二捕获剂的至少一部分结合。第二捕获剂可以在阵列位点处以允许靶核酸的桥扩增。
通用衔接子可以使用任何合适的方法(诸如本领域已知的连接方法)连接至双链靶核酸。此类方法利用连接酶(诸如DNA连接酶)来实现或催化两条核酸链(在这种情况下，为通用衔接子和双链靶核酸的两条核酸链)的末端的连接，使得形成共价键。通用衔接子可以含有5'-磷酸部分以促进与靶片段上存在的3'-OH的连接。双链靶核酸含有5'-磷酸部分，该部分是剪切过程的残留物，或是使用酶处理步骤添加的，并且已进行末端修复，任选地通过一个或多个悬垂碱基延伸，从而得到适合连接的3'-OH。在该语境中，连接意指先前未共价连接的核酸链的共价连接。在本公开的一些方面，此类连接通过在两条核酸链之间形成磷酸二酯键而发生，但是也可以使用其他共价连接方式(例如，非磷酸二酯主链键)。
用于连接的通用衔接子可以包括一个或多个通用捕获结合序列和其它通用序列，诸如通用引物结合位点和索引序列。靶核酸可以用于接种和扩增，并且随后用于如本文所述的测序。
还可以使用标准的已知方法修饰靶核酸以包括任何合适的核苷酸序列。此类序列可以包括例如限制性内切酶位点或索引标签以允许鉴定给定核酸序列的扩增产物。
扩增/簇形成
一旦靶核酸被接种在阵列位点处的基底上，靶核酸就可以被扩增以在该位点处产生簇。适于扩增靶核酸的试剂优选包括在接种组合物中。
本公开的方法可以包括扩增靶核酸以产生扩增位点，该扩增位点包括来自单独靶核酸的扩增子的单克隆群体，该单克隆群体已接种于该位点或包括单独靶核酸在该位点处的高优势百分比。通过保持活性形式的靶核酸的低浓度(例如如上所述保持活性形式的靶核酸的低浓度)保持低的靶核酸接种速率。
由于相对慢的靶核酸接种速率与相对快的进行扩增以使位点填充有接种的核酸拷贝的速率相对，因此发生排他性扩增。一旦第一靶核酸开始扩增，位点就将快速充满或接近充满其拷贝，从而抑制第二靶核酸在该位点处的接种。
即使扩增位点在该位点处接种和扩增第二靶核酸之前未被充满，第一核酸的量也可以超出第二核酸的量，使得当测序发生时，来自第一核酸的信号可以与来自第二核酸的信号区分或超出来自第二核酸的信号，并且可以确定来自第一核酸的序列。例如，当在直径小于500nm的圆形位点上进行14个循环的指数桥扩增时，来自第二靶核酸的接种和扩增的污染将产生数量不足的污染扩增子，从而不利地影响Illumina测序平台上的边合成边测序分析。
优选地，阵列中的扩增位点是单克隆的或包含具有足够低水平的来自第二靶核酸的污染扩增子的优势靶核酸扩增子，使得污染水平对阵列的后续使用不具有不可接受的影响。例如，当阵列将用于检测应用时，可接受的污染水平将是不会以不可接受的方式影响检测技术的信噪比或分辨率的水平。对于特定应用，在单个扩增位点处可以是可接受的示例性污染水平包括但不限于至多0.1％、0.5％、1％、5％、10％或25％的污染扩增子。阵列可以包括具有这些示例性水平的污染扩增子的一个或多个扩增位点。例如，阵列中高达5％、10％、25％、50％、75％或甚至100％的扩增位点可具有一些污染扩增子。
本文所述的方法可以在扩增发生时在靶核酸被转运(例如，经由扩散)至扩增位点的条件下进行。因此，由于可以接种的活性形式的靶核酸的相对低浓度，排他性扩增可以利用相对慢的转运速率。因此，可以进行本文所述的扩增反应，使得靶核酸从溶液转运至扩增位点，同时(i)产生第一扩增子，和(ii)在阵列的其它位点处产生后续的扩增子。在扩增位点生成扩增子的平均速率(即，扩增速率)可以超过靶核酸从溶液转运至扩增位点的平均速率(即，接种速率)。在一些情况下，可以在单独的扩增位点处从单一靶核酸生成足够数目的扩增子以装满相应扩增位点。生成扩增子以装满相应扩增位点的速率可以例如超过单独靶核酸从溶液转运至扩增位点的速率。
在本文所述方法中使用的扩增组合物优选能够在扩增位点处快速制备靶核酸的拷贝。典型地，在本公开的方法中使用的扩增组合物将包括聚合酶和核苷酸三磷酸(NTP)。可以使用本领域已知的多种聚合酶中的任一种，但在一些实施方案中，可以优选使用核酸外切酶阴性的聚合酶。对于制备DNA拷贝的实施方案，NTP可以是脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。通常，四种天然物种dATP、dTTP、dGTP和dCTP将存在于DNA扩增试剂中；然而，如果需要，可以使用类似物。对于制备RNA拷贝的实施方案，NTP可以是核糖核苷三磷酸(rNTP)。通常，四种天然物种raTP、rUTP、rGTP和rCTP将存在于RNA扩增试剂中；然而，如果需要，可以使用类似物。
可以为接种组合物的扩增组合物还可以包括促进扩增子形成并且在一些情况下提高扩增子形成速率的组分。示例是重组酶装载蛋白。重组酶可以通过允许反复侵入/延伸来促进扩增子形成。更具体地，重组酶可以促进通过聚合酶进行靶核酸的侵入以及通过该聚合酶进行的引物的延伸，该聚合酶使用靶核酸作为扩增子形成的模板。该过程可以被重复作为链式反应，其中由每轮侵入/延伸产生的扩增子用作后续轮中的模板。由于不需要变性循环(例如，经由加热或化学变性)，因此该过程可以比标准PCR更快速地发生。因此，重组酶促进的扩增可以等温地进行。通常期望在重组酶促进的扩增组合物中包括ATP或其他核苷酸(或在一些情况下其非可水解的类似物)以促进扩增。重组酶、单链结合(SSB)蛋白和辅助蛋白的混合物是特别有用的。用于重组酶促进的扩增的示例性制剂包括由TwistDx(Cambridge,UK)以TwistAmp试剂盒商业销售的那些。重组酶促进的扩增组合物的有用组分和反应条件描述于美国专利号5,223,414和美国专利号7,399,590中。
可以包括在扩增组合物中以促进扩增子形成并且在一些情况下提高扩增子形成速率的组分的另一个示例是解旋酶。解旋酶可以通过允许扩增子形成的链式反应来促进扩增子形成。由于不需要变性循环(例如，经由加热或化学变性)，因此该过程可以比标准PCR更快速地发生。因此，解旋酶促进的扩增可等温地进行。解旋酶和单链结合(SSB)蛋白的混合物是特别有用的，因为SSB可以进一步促进扩增。用于解旋酶促进的扩增的示例性制剂包括来自Biohelle(Beverly,Mass.)以IsoAmp试剂盒商业销售的那些制剂。此外，包括解旋酶蛋白的可用制剂的示例在美国专利号7,399,590和美国专利号7,829,284中有所描述。
可以包括在扩增组合物中以有利于扩增子形成并且在一些情况下提高扩增子形成速率的组分的另一个示例是起点结合蛋白。
扩增组合物中分子拥挤试剂的存在可以用于帮助排他性扩增。可用的分子拥挤试剂的示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、葡聚糖或聚乙烯醇。示例性分子拥挤试剂和制剂在美国专利号7,399,590中有所描述。
扩增反应发生的速率可以通过增加扩增反应的一种或多种活性组分的浓度或量来增加。例如，可以增加聚合酶、核苷酸三磷酸、引物、重组酶、解旋酶或SSB的量或浓度来增加扩增速率。在一些情况下，扩增反应的量或浓度增加(或以其它方式在本文所述的方法中操作)的一种或多种活性组分是扩增反应的非核酸组分。
也可以通过调整温度来增加扩增速率。例如，在一个或多个扩增位点处的扩增速率可以通过将该位点处的温度增加至反应速率由于变性或其他不利事件而下降的最大温度来增加。对于给定的扩增反应混合物，最佳的或期望的温度可以从所使用的扩增组分的已知性质或凭经验来确定。此类调整可以基于引物熔解温度(Tm)的先验预测或凭经验进行。
扩增反应发生的速率可以通过增加一种或多种扩增试剂的活性来增加。例如，可以将增加聚合酶延伸速率的辅因子添加到使用聚合酶的反应中。在一些实施方案中，可以将金属辅因子(诸如镁、锌或锰)添加到聚合酶反应中或可以添加甜菜碱。
在一些实施方案中，使用双链的靶核酸群体。已经观察到在排他性扩增条件下在位点阵列处的扩增子形成对于双链靶核酸是有效的。例如，在重组酶和单链结合蛋白的存在下，可以从双链靶核酸更有效地产生具有扩增子群体的多个扩增位点(与相同浓度的单链靶核酸相比)。然而，应理解，单链靶核酸可以用于本文所述方法的一些实施方案中。
本文所述方法可以使用多种扩增技术中的任一种扩增技术。可以使用的示例性技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多取代扩增(MDA)或随机引物扩增(RPA)。在一些实施方案中，例如，当扩增位点能够在具有期望容量的体积中含有扩增子时，扩增可以在溶液中进行。优选地，在本公开的方法中在排他性扩增条件下使用的扩增技术将在固相上进行。例如，用于扩增的一个或多个引物可以附接于扩增位点处的固相。如上所讨论的，用于接种的捕获剂可以包含一个或多个引物。在PCR实施方案中，用于扩增的引物中的一个或两个可以附接于固相。利用附接于表面的两个引物物种的形式通常被称为桥扩增，因为双链扩增子在两个表面附接的侧接已被复制的模板序列的引物之间形成桥样结构。可以用于桥扩增的示例性试剂和条件描述于例如美国专利号5,641,658；美国专利公开号2002/0055100；美国专利号7,115,400；美国专利公开号2004/0096853；美国专利公开号2004/0002090；美国专利公开号2007/0128624；和美国专利公开号2008/0009420中。固相PCR扩增也可以用附接于固体支持物的扩增引物中的一个扩增引物和溶液中的第二引物进行。使用表面附接引物和可溶性引物的组合的示例性形式是乳液PCR，如例如在Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第100卷：第8817-8822页(2003年)，WO 05/010145或美国专利公开号2005/0130173或2005/0064460中所述的。乳液PCR是该形式的示例，并且应当理解，为了本文所述方法的目的，乳液的使用是任选的，并且实际上几个实施方案不使用乳液。所述PCR技术可以被修改以用于使用在本文其他地方举例说明的用于促进或增加扩增速率的组分的非循环扩增(例如等温扩增)。因此，所述PCR技术可以在排他性扩增条件下使用。
RCA技术可以被修改以用于本公开的方法。可以用于RCA反应的示例性组分和RCA产生扩增子的原理描述于例如Lizardi等人，Nat.Genet.第19卷，第225-232页(1998年)，以及US2007/0099208 A1。用于RCA的引物可以在溶液中或附接于扩增位点处的固体支持物表面。上述参考文献中举例说明的RCA技术可以根据本文的教导进行修改，例如，以增加扩增速率，从而适合特定应用。因此，RCA技术可以在排他性扩增条件下使用。
MDA技术可以被修改以用于本公开的方法。MDA的一些基本原理和有用条件描述于例如Dean等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA，第99卷：第5261-5266页(2002年)；Lage等人，Genome Research，第13卷：第294-307页(2003年)；Walker等人，Molecular Methods forVirus Detection，Academic Press,Inc.，1995；Walker等人，Nucl.Acids Res，第20卷：第1691-1696页(1992年)；美国专利号5,455,166；美国专利号5,130,238；和美国专利号6,214,587。用于MDA的引物可以在溶液中或附接于扩增位点处的固体支持物表面。上述参考文献中举例说明的MDA技术可以根据本文的教导进行修改，例如，以增加扩增速率，从而适合特定应用。因此，MDA技术可以在排他性扩增条件下使用。
所述扩增技术的组合可以用于在排他性扩增条件下制备阵列。例如，RCA和MDA可以组合使用，其中RCA用于在溶液中生成多联体扩增子(例如使用溶液相引物)。然后扩增子可以使用在扩增位点处附接于固体支持物表面的引物来用作MDA的模板。在该示例中，在组合的RCA和MDA步骤后产生的扩增子将附接于扩增位点的表面。
如关于以上几个实施方案举例说明的，本公开的方法不需要使用循环扩增技术。例如，靶核酸的扩增可以在没有变性循环的情况下在扩增位点处进行。示例性的变性循环包括将化学变性剂引入扩增反应和/或增加扩增反应的温度。因此，靶核酸的扩增不需要包括用使靶核酸和扩增子变性的化学试剂替换扩增溶液的步骤。类似地，靶核酸的扩增不需要包括将溶液加热至使靶核酸和扩增子变性的温度。因此，在扩增位点处靶核酸的扩增可以在本文所述方法的持续时间内等温进行。实际上，本文所述的扩增方法可以在没有一个或多个循环操作的情况下进行，该循环操作是在标准条件下针对一些扩增技术而进行的。此外，在一些标准固相扩增技术中，在靶核酸被加载到基底上之后且在开始扩增之前进行洗涤。然而，在本方法的实施方案中，在将靶核酸转运至反应位点和在扩增位点处扩增靶核酸之间不需要进行洗涤步骤。相反，允许转运(例如经由扩散)和扩增同时发生以提供排他性扩增。
在一些实施方案中，可能期望重复在排他性扩增条件下发生的扩增循环。因此，尽管可以在没有循环操作的情况下在单独扩增位点处制备靶核酸的拷贝，但是可以循环处理扩增位点阵列以增加每个循环后含有扩增子的位点的数目。在特定的实施方案中，扩增条件可以从一个循环到下一个循环时改进。例如，可以在循环之间调节上述用于改变转运速率或改变扩增速率的一个或多个条件。因此，转运速率可以在循环之间增加，转运速率可以在循环之间降低，扩增速率可以在循环之间增加，或者扩增速率可以在循环之间降低。
测序中的用途/测序方法
例如，已经通过本文所述的接种和扩增方法产生以在扩增位点处产生扩增的靶核酸的本公开的阵列可以用于多种应用中的任一种应用。特别有用的应用是核酸测序。一个示例是边合成边测序(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板(例如，靶核酸或其扩增子)的延伸，以确定模板中核苷酸的序列。基础化学过程可以是聚合(例如，由聚合酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中，以模板依赖性方式将荧光标记的核苷酸添加到引物(从而使引物延伸)，使得对添加到引物中的核苷酸的顺序和类型的检测可以用于确定模板的序列。在针对不同模板发生的事件可以因其在阵列中的位置而被区分的条件下，可以对本文所述阵列的不同位点处的多个不同模板进行SBS技术。
流通池提供用于容纳阵列的方便形式，该阵列通过本公开的方法产生并且经受涉及循环中重复递送试剂的SBS或其他检测技术。例如，为了启动第一SBS循环，一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等可以流入/通过容纳核酸模版的阵列的流通池。可以检测其中引物延伸引起标记核苷酸掺入的那些阵列位点。任选地，核苷酸还可以包括一旦将核苷酸添加到引物就终止进一步的引物延伸的可逆终止属性。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到引物，使得后续的延伸直到递送解封闭剂以去除该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将解封闭试剂递送到流通池(在检测发生之前或之后)。洗涤可以在各个递送步骤之间进行。然后可以重复该循环n次以使引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可以容易地适于与通过本公开的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台在例如以下文献中描述：Bentley等人，Nature，第456卷第53-59页(2008年)、WO 04/018497；美国专利号7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；美国专利号7,329,492；美国专利号7,211,414；美国专利号7,315,019；美国专利号7,405,281和美国专利号8,343,746。
可以使用利用循环反应的其他测序程序，诸如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测当特定核苷酸掺入新生核酸链中时无机焦磷酸盐(PPi)的释放(Ronaghi等人，AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.第11卷第1期，第3-11页(2001年)；Ronaghi等人，Science，第281卷第5375期，第363页(1998年)；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320)。在焦磷酸测序中，所释放的PPi可以通过ATP硫酸化酶立即转化成三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且所产生ATP的水平可以经由荧光素酶产生的光子来检测。因此，可以经由发光检测系统来监测测序反应。用于基于荧光的检测系统的激发辐射源不是焦磷酸测序程序所必需的。可以用于对本公开的阵列应用焦磷酸测序的可用流体系统、检测器和程序在例如WIPO公开专利申请2012/058096、US2005/0191698A1、美国专利号7,595,883和美国专利号7,244,559中描述。
边连接边测序反应也是有用的，包括例如Shendure等人，Science，第309卷：第1728-1732页(2005年)；美国专利号5,599,675和美国专利号5,750,341所述的那些。一些实施方案可以包括边杂交边测序程序，如例如描述于Bains等人，Journal of TheoreticalBiology，第135卷第3期，第303-307页(1988年)；Drmanac等人，Nature Biotechnology，第16卷，第54-58页(1998年)；Fodor等人，Science，第251卷第4995期，第767-773页(1995年)；和WO 1989/10977中。在边连接边测序和边杂交边测序程序中，存在于阵列位点处的靶核酸(例如，靶核酸或其扩增子)经受寡核苷酸递送和检测的重复循环。如本文或本文引用的参考文献中所述的用于SBS方法的流体系统可以容易地适于递送用于边连接边测序或边杂交边测序程序的试剂。通常，寡核苷酸被荧光标记，并且可以使用类似于关于本文或本文引用的参考文献中的SBS程序所描述的那些荧光检测器来检测。
一些实施方案可以使用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如，可以通过带有荧光团的聚合酶与γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用或者利用零模式波导(ZMW)来检测核苷酸掺入。用于基于FRET的测序的技术和试剂在例如以下文献中描述：Levene等人，Science 299,682-686(2003)；Lundquist等人，Opt.Lett.第33卷，第1026-1028页(2008年)；Korlach等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第105卷，第1176-1181页(2008年)。
一些SBS实施方案包括检测在核苷酸掺入延伸产物时释放的质子。例如，基于释放质子的检测的测序可以使用可从Ion Torrent公司(Guilford,Conn.，Life Technologies子公司)商购获得的电检测器和相关技术或在US 2009/0026082A1、US2009/0127589 A1、US2010/0137143 A1或US 2010/0282617A1中所述的测序方法和系统。本文所述的用于接种和扩增靶核酸的方法可以容易地应用于用于检测质子的基底。更具体地，本文所述的方法可以用于产生用于检测质子的在阵列位点处的扩增子克隆群体。
例如，已经通过本文所述的方法产生的本公开的阵列的有用应用是基因表达分析。基因表达可以使用RNA测序技术来检测或定量，例如那些被称为数字RNA测序的技术。RNA测序技术可以使用本领域已知的测序方法(诸如上述的那些)进行。基因表达也可以使用杂交技术检测或定量，该杂交技术通过与阵列直接杂交或使用多重测定进行，该多重测定的产物在阵列上检测。例如已经通过本文所述的方法产生的本公开的阵列也可以用于确定来自一个或多个个体的基因组DNA样品的基因型。可以在本公开的阵列上进行的基于阵列的表达和基因分型分析的示例性方法描述于以下文献中：美国专利号7,582,420、6,890,741、6,913,884或6,355,431或者美国专利公布号2005/0053980A1、2009/0186349A1或US2005/0181440A1。
已通过本文所述方法产生的阵列的另一有用应用是单细胞测序。当与索引方法组合时，单细胞测序可以用于染色质可接近性测定以在数千单细胞中产生活性调节元件概况，并且可以产生单细胞全基因组文库。可以在本公开的阵列上进行的单细胞测序的示例描述于美国公开专利申请2018/0023119A1、美国临时申请序列号62/673,023和62/680,259中。
本文所述的方法的优点是它们提供了从多个核酸文库中的任一个核酸文库快速且有效地创建阵列。因此，本公开提供了能够使用本文所述的一种或多种方法制备阵列并且还能够使用本领域已知的技术(例如上文举例说明的那些技术)检测阵列上的核酸的整合系统。因此，本公开的整合系统可以包括能够将扩增试剂递送至扩增位点阵列的流体部件，诸如泵、阀、贮存器、流体管线等。特别有用的流体部件是流通池。可以在整合系统中配置和/或使用流通池以创建本公开的阵列并检测该阵列。示例性流通池描述于例如US2010/0111768 A1和美国专利号8,951,781中。如针对流通池所例示的，整合系统的一个或多个流体部件可以用于扩增方法和检测方法。以核酸测序实施方案为例，整合系统的一个或多个流体部件可以用于本文所述的扩增方法以及用于在测序方法(诸如上文例示的那些)中递送测序试剂。另选地，整合系统可以包括单独的流体系统以执行扩增方法并执行检测方法。能够创建核酸阵列并且还能够确定核酸序列的整合测序系统的示例包括但不限于MiSeqTM和HiSeqTM平台(Illumina,Inc.,San Diego,Calif.)和在美国专利号8,951,781中描述的装置。根据本文所述的指导，可以改进此类装置以使用排他性扩增制备阵列。
能够进行本文所述方法的系统不需要与检测装置整合。相反，独立系统或与其他装置整合的系统也是可能的。类似于上文在整合系统的上下文中举例说明的那些的流体部件可以用于此类实施方案中。
无论是否与检测能力整合，能够进行本文所述方法的系统都可以包括能够执行一组指令以进行本文所述方法、技术或过程的一个或多个步骤的系统控制器。例如，指令可以指导用于在排他性扩增条件下创建阵列的步骤的执行。任选地，说明可进一步指导使用本文前述方法检测核酸的步骤的执行。有用的系统控制器可包括任何基于处理器或基于微处理器的系统，包括使用微控制器、精简指令集计算机(RISC)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、逻辑电路以及能够执行本文所述功能的任何其他电路或处理器。用于系统控制器的一组指令可以是软件程序的形式。如本文所用，术语“软件”和“固件”是可互换的，并且包括存储在存储器中以供计算机执行的任何计算机程序，包括RAM存储器、ROM存储器、EPROM存储器、EEPROM存储器和非易失性RAM(NVRAM)存储器。软件可为各种形式，诸如系统软件或应用软件。此外，软件可以是独立程序的集合的形式，或者是较大程序内的程序模块或程序模块的一部分的形式。软件还可包括面向对象编程形式的模块化编程。
实施例
通过以下非限制性实施例说明本发明。应当理解，应当根据如本文所述的本发明的范围和实质广义地解释特定实施例、材料、量和程序。
实施例1
为了说明通过目前使用的技术获得的簇的多克隆性，使用Illumina'sSBS技术生长图案化的簇。
图12是550nm间距、360nm直径的纳米孔簇的随机光学重建显微镜(STORM)图像。许多簇发出不同的颜色，表明这些簇是多克隆的。
许多多克隆簇是可测序的，因为即使存在几个读段(靶核酸)，也有一个倾向于“占优势”。此类簇可以被称为具有高“优势”。能够被测序的簇被称为“通过过滤器”或PF。我们已经发现簇的％优势与那些PF的簇的百分比之间的强相关性。如图13所示，当簇的％优势增加时，它们的％PF也增加。图13中的每个数据点表示通过STORM成像确定的平均％优势和通过测序确定的几个10s至100s纳米孔群体的平均％PF。
在测序运行期间，期望具有最高可能百分比的PF簇，使得运行的通量最大化并且是最有效的。在目前的测序仪中，使用图案化的流通池，％PF通常在60％至80％范围内，并且因此20％至40％的簇不可用于测序。如果簇的生长使得更多簇具有最高优势(理想地为100％优势)，则将实现增加的％PF，这将在没有额外的流通池、试剂或运行时间的情况下增加通量。
实施例2
一种提高单克隆性或提高％优势的方式是降低用于接种和扩增的样品中靶核酸的浓度并进行重复的接种/扩增步骤。当多个靶核酸一次落在纳米孔中并被扩增时，多克隆性在图案化的纳米孔流通池中发生。这种情况发生的概率非常依赖于靶核酸浓度。在低浓度下，可以实现其中纳米孔是高度单克隆的或具有高％优势的情况。然而，当采用低靶核酸浓度时，在单轮接种扩增期间，仅一部分纳米孔可以生长簇，这导致流通池的低总通量。
为了提高簇在其中生长的纳米孔的数目，可以进行重复或连续的接种和扩增步骤。对于其中簇已经在前一轮接种和扩增中生长的那些孔，在随后的轮中通过另外的靶核酸进行的进一步接种不成问题，因为第一接种的核酸将是占优势的或者将有非常少的结合位点可用于与另外的靶核酸结合，这将降低在具有先前接种和扩增的靶核酸的簇中结合的可能性。
在该实施例中，进行五个连续的接种和扩增步骤。第一步采用20pM靶DNA来产生红色簇，第二步采用20pM靶DNA来产生绿色簇，第三步采用20pM靶DNA来产生白色簇，第四步采用20pM靶DNA来产生品红色簇，并且第五步采用200pM靶DNA来产生黄色簇。在每个步骤期间，将扩增混合物孵育15分钟，并且然后用缓冲液冲洗。
结果显示在图14A中，其中从左到右显示在五个连续步骤的每一个步骤之后的STORM图像。如所示的，利用高百分比的含有簇的纳米孔产生了高度占优势的或单克隆的簇。
进行STORM图像的分析以确定簇的优势。结果显示在图14B中，其证明重复的低浓度接种和扩增策略产生高％优势。进行测序。我们还通过测序确认这导致更高的总体％PF。
标准(单步骤)接种(300pm)和扩增后的％PF为51.0％。四轮连续低浓度(20pM)接种和扩增后的％PF为61.3％。八轮连续低浓度(20pM)接种和扩增后的％PF为80.4％。
这些结果清楚地表明，重复的低浓度接种和扩增策略确实实现了期望的效果。然而，该过程具有几个缺点。例如，它需要重复的步骤，花费更多的时间，并且使用实质上更多的扩增试剂。
实施例3
在该预示性实施例中，描述了本文中称为模板控制释放和接种-TECRAS的过程。TECRAS可以解决与上面讨论的重复低浓度接种和扩增相关的缺点。例如，TECRAS可以仅涉及单一接种和扩增步骤以实现更高％优势和更高％PF的类似目标。
在该方法中，DNA靶文库以高浓度(例如300pM)存在于扩增混合物中。然而，它以不能接种的初始无活性形式存在。然后发生缓慢过程，该过程将这些DNA分子从无活性形式转化成可以接种并开始扩增的活性形式。调整该过程的速率，使得在任何给定时刻，活性DNA的浓度是低的(例如20pM)。这具有与重复接种和扩增相同的效果，但是具有以下益处：这是单一孵育步骤。
为了说明使用噬菌体保持无活性形式的靶核酸池并释放活性形式的靶核酸以用于接种的概念，将DNA掺入λ噬菌体中并通过添加LamB实现控制释放。结果示于图15A-图15B中。DNA被牢固地保持在噬菌体衣壳内(15A)，直到添加LamB触发蛋白导致噬菌体衣壳将DNA释放到溶液中(15B)。图15A显示了保持在噬菌体内表面上的一些DNA，并且图15B显示了在LamB使DNA分子从噬菌体释放后一段时间后的相同区域。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物的完整公开内容，以及以电子方式获得的材料(包括，例如，在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)全文以引用方式并入。出版物中引用的补充材料(诸如补充表、补充图、补充材料和方法和/或补充实验数据)同样全文以引用方式并入。在本申请的公开内容与以引用方式并入本文的任何文献的公开内容之间存在任何不一致性的情况下，应以本申请的公开内容为准。上述详细描述和实施例仅为了清楚地理解本发明而给出。不应将其理解为不必要的限制。本发明不限于所示和所述的确切细节，因为对本领域技术人员显而易见的变型将包括在由权利要求所限定的发明内。
除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所用的表示组分的量、分子量等的所有数字在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本发明寻求获得的期望性质而变化。至少，并非试图将等同原则限制在权利要求的范围之内，每个数值参数应至少根据所报告的有效数位的数目并通过应用惯常的四舍五入法来解释。
尽管阐述本发明的广义范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中所列出的数值被尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地包含一个范围，该范围必然是由存在于其相应测试测量中的标准偏差引起。
除非另外指明，否则所有标题都是为了方便读者，而不应用于限制该标题后面的文本的含义。

Claims (17)

1.一种方法，所述方法包括：
提供具有与捕获剂结合的表面的基底；
提供组合物，所述组合物包含(i)多个不同的靶核酸，每个靶核酸包含通用序列，和(ii)抑制所述通用序列的至少一部分与所述捕获剂结合的抑制剂；
使所述基底的所述表面与所述组合物接触以使所述靶核酸中的一个靶核酸与所述捕获剂结合；以及
在所述组合物与所述基底的所述表面接触时扩增与所述捕获剂结合的所述靶核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获剂包含具有核苷酸序列的核酸，并且其中所述通用序列包含与所述捕获剂的所述核酸的所述核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抑制剂包含具有与所述捕获剂的所述核酸的所述核苷酸序列的所述至少一部分相同的核苷酸序列的核酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述组合物还包含解封闭剂，所述解封闭剂包含具有与所述抑制剂的所述核酸的至少一部分互补的核苷酸序列的核酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述组合物中的所述解封闭剂的浓度低于所述抑制剂的浓度。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述抑制剂包封所述多个不同的靶核酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抑制剂包含脂质体。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述抑制剂包含噬菌体。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含解封闭剂，所述解封闭剂被配置为释放包封在所述抑制剂中的所述多个不同的靶核酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抑制剂包含脂质体，并且所述解封闭剂包含被配置为破坏所述脂质体的膜以从所述脂质体释放所述多个不同的靶核酸的分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述解封闭剂包含孔蛋白、踝蛋白或细胞骨架膜下蛋白。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述抑制剂包含噬菌体λ，并且其中所述解封闭剂包括lamB。
13.一种方法，所述方法包括：
提供具有与捕获剂结合的表面的基底；
提供组合物，所述组合物包含多个不同的靶核酸，每个靶核酸包含被配置为结合所述捕获剂的通用序列；其中所述多个不同的核酸中的至少一些核酸的所述通用序列被阻止与所述捕获剂结合；
使所述基底的所述表面与所述组合物接触；
解封闭所述多个不同的核酸中的至少一些核酸的所述通用序列以允许所解封闭的核酸与所述捕获剂结合；
在所述组合物与所述基底的所述表面接触时，扩增与所述捕获剂结合的所述核酸。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物被配置为在所述组合物与所述基底的所述表面接触的时间期间提供约5皮摩尔(pM)至约50pM范围内的可用于与所述捕获剂结合的靶核酸浓度。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个不同的靶核酸包含DNA。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获剂是捕获剂阵列的一部分。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基底是测序流通池的一部分。
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