ES2320193T3 - Sistema de suministro liposomico dirigido modular. - Google Patents
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Abstract
Liposoma que comprende: a) un liposoma fusogénico que comprende una bicapa lipídica que encapsula a un agente bioactivo; y b) un resto de unión electrostáticamente unido a dicha bicapa lipídica de dicho liposoma fusogénico; y c) un resto de direccionamiento covalentemente unido a dicho resto de unión.
Description
Sistema de suministro liposómico dirigido
modular.
La invención se refiere a un liposoma dirigido
que puede suministrar de manera intracelular eficazmente uno o más
agentes bioactivos, a una composición farmacéutica que incluye el
liposoma dirigido y a un método de suministro del contenido de un
liposoma a un sitio diana in vivo o in vitro tal como
una célula tumoral, sitio de inflamación o infección.
La utilidad farmacéutica de agentes bioactivos
depende de la capacidad de colocar cantidades terapéuticamente
eficaces de agente intacto en el sitio diana en el paciente. El
suministro de agentes bioactivos intactos a sitios diana puede ser
difícil: puede producirse degradación in vivo de los agentes
bioactivos, así como absorción/retención del agente por sistemas no
dirigidos. Aunque puedan suministrarse cantidades farmacéuticamente
eficaces de agente intacto en las proximidades del sitio diana,
acceder a la ubicación funcional del sitio por el agente bioactivo
puede ser un reto, particularmente si esa ubicación es intracelular.
Por ejemplo, ciertos compuestos polares y muchas moléculas grandes
no pueden entrar en las células en absoluto debido a su incapacidad
de cruzar las membranas de las células diana. Además, la dilución
del agente bioactivo mediante unión no específica a sitios no diana
reduce la cantidad de agente bioactivo disponible para el sitio
diana.
Aún otro reto en el suministro terapéutico de
fármacos o agentes bioactivos es limitar las toxicidades asociadas
a menudo con concentraciones terapéuticamente eficaces de agentes
bioactivos o fármacos. El suministro a un sitio diana específico
también puede reducir algo de la toxicidad asociada normalmente con
la administración de un fármaco o agente. Incluso cuando un agente
bioactivo o fármaco no tiene toxicidad asociada con el mismo, la
"pérdida" de agente a través de degradación, eliminación por
órganos no diana y otros fallos de suministro pueden aumentar de
manera significativa y prohibitiva el coste del tratamiento o
disminuir la eficacia.
Un método usado para suministrar fármacos o
agentes bioactivos a tejidos y células es encapsular los fármacos o
agentes bioactivos en liposomas. A menudo, una ventaja añadida a
este tipo de formulación es la reducción de la toxicidad asociada
con ciertos agentes bioactivos o fármacos. Las posibilidades de
direccionamiento intracelular que proporcionan los liposomas son
especialmente fascinantes. Aunque se sabe que ciertas células
fagocitan liposomas, el suministro de la mayoría de los liposomas a
un sitio diana no es suficiente para suministrar el contenido
encapsulado al interior de la célula. Se conocen liposomas
fusogénicos que permiten que la bicapa del liposoma se fusione con
la membrana celular y, por tanto, suministran los fármacos o agentes
bioactivos encapsulados a la célula. Sin embargo, a menudo estos
liposomas fusogénicos carecen de estabilidad cuando se incuban en
suero. Además, hasta la fecha, la mayoría de los liposomas
fusogénicos no han podido dirigirse al sitio específico en el que
se requiere el fármaco o agente bioactivo. El suministro liposómico
eficaz a células in vivo requiere direccionamiento
específico y protección sustancial frente al entorno extracelular,
particularmente proteínas séricas. Desafortunadamente, la mayoría de
las estrategias de protección y direccionamiento conocidas generan
también grandes barreras estéricas en la superficie de los liposomas
que limitan o impiden el suministro fusogénico del contenido
liposómico en el interior de la célula. Además, las estrategias de
protección y direccionamiento conocidas unen moléculas de
protección/direccionamiento al liposoma a través de enlaces
hidrófobos con la bicapa lipídica del liposoma. Estos enlaces
hidrófobos inhiben habitualmente la función de las membranas
fusogénicas. Cuando el resto hidrófobo se diseña para permitir su
disociación del resto de protección/direccionamiento, su disociación
no se produce específicamente en el sitio diana.
El documento WO 98/16202 describe una
composición de liposomas fusogénicos químicamente unidos con un
copolímero de dibloque que consiste en un polímero hidrófilo
protector y un polímero hidrófilo para su interacción con las
membranas de las células seleccionadas como diana.
En resumen, la invención es un sistema de
suministro y direccionamiento liposómico modular que comprende un
liposoma fusogénico, un resto de unión y un resto de
direccionamiento. En una realización alternativa, el sistema puede
comprender un resto de estabilización, o bien en lugar de o bien
además del resto de direccionamiento. El liposoma fusogénico
comprende una bicapa lipídica que encapsula a un agente bioactivo
que va a suministrarse a un sitio diana tal como un tumor, un sitio
de inflamación o infección y/o al citoplasma de una célula. Los
liposomas pueden contener uno o más fármacos o agentes bioactivos o
pueden contener una combinación de fármacos y agentes bioactivos.
En una realización, el agente bioactivo es un ácido nucleico,
preferiblemente ADN. El resto de direccionamiento y/o
estabilización está covalentemente unido a uno o más restos de
unión, y el resto de unión se une electrostáticamente a pH neutro a
la bicapa lipídica del liposoma fusogénico. El resto de unión se
selecciona del grupo que consiste en polilisina, protamina,
polietilenimina, poliarginina, poliacrilato, un derivado de
espermina, citocromo c, una anexina, sulfato de heparina, un
aminodextrano, poliaspartato, poliglutamato, un ácido polisiálico
y/o poli(ácido 2-etilacrílico). El resto de
direccionamiento es una molécula que se unirá selectivamente a la
superficie de las células seleccionadas como diana. Por ejemplo, la
molécula de direccionamiento puede ser un ligando que se une al
receptor de la superficie celular encontrado en un tipo celular
particular o expresado a una mayor frecuencia en las células diana
que en otras células. El resto de direccionamiento se selecciona
del grupo que consiste en una vitamina, transferrina, un anticuerpo
o fragmento del mismo, antígeno sialil-Lewis X,
ácido hialurónico, derivados de manosa, derivados de glucosa,
lectinas específicas de células, galaptina, galectina,
lactosilceramida, un derivado esteroideo, una secuencia RGD, EGF,
péptido de unión a EGF, péptido de unión al receptor de urocinasa,
un péptido derivado de trombospondina, un derivado de albúmina y/o
una molécula derivada de química combinatoria. El resto de
direccionamiento potencia la capacidad del liposoma de unirse a una
célula seleccionada como diana y de suministrar el contenido
liposómico al sitio diana. Aunque sin querer restringirse a la
siguiente explicación del mecanismo mediante el cual la presente
invención suministra el contenido liposómico al interior celular, se
ha especulado que tras unirse el liposoma a una célula, puede
provocarse una ruta de endocitosis, en la que el liposoma se
fagocita y secuestra en un compartimento endosómico dentro de la
célula. El bajo pH (en relación con el plasma extracelular) dentro
del compartimento endosómico debilita el enlace electrostático entre
el resto de unión y el liposoma, en el que al menos una parte del
resto de unión (y el resto de direccionamiento covalentemente unido
al mismo) se disocia al menos temporalmente del liposoma para
exponer la bicapa lipídica fusogénica y permitir la fusión de la
membrana liposómica y la membrana endosómica. La liberación del
contenido liposómico en el citoplasma de la célula resulta de la
fusión. Aunque la ruta de endocitosis no se inicie cuando el
liposoma se une a la célula, un bajo pH que rodea inmediatamente a
la célula (en relación con el pH del plasma más allá de la
proximidad inmediata de la célula) podría provocar la disociación al
menos temporal del resto de unión del liposoma tal como se describió
anteriormente, permitiendo de ese modo la liberación del contenido
liposómico en el citoplasma celular.
Preferiblemente, la invención también comprende
un resto de estabilización que está indirectamente unido a la
bicapa lipídica del liposoma fusogénico a través de un resto de
unión. El resto de estabilización está covalentemente unido al
resto de unión, resto de unión que está electrostáticamente unido o
puede unirse electrostáticamente a la bicapa lipídica a pH neutro o
casi neutro, es decir, el pH del suero normal. También puede unirse
covalentemente un resto de direccionamiento al resto de
estabilización. Preferiblemente, el resto de estabilización se
selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol,
polivinilpirrolidona, un dextrano, un poliaminoácido,
metil-polioxazolina, poliglicerol,
poli(acriloil morfolina) y/o poliacrilamida.
En una realización, la invención es una
composición que comprende un liposoma fusogénico que comprende una
bicapa lipídica que encapsula a un agente bioactivo; y un resto de
unión electrostáticamente unido a dicha bicapa lipídica; en el que
un resto de direccionamiento está covalentemente unido a dicho resto
de unión.
La invención también abarca el uso de un agente
bioactivo para la fabricación de un liposoma dirigido adecuado para
introducir un agente bioactivo en una célula, que comprende preparar
un liposoma fusogénico que tiene una bicapa lipídica que encapsula
a un agente bioactivo, unir electrostáticamente un resto de
direccionamiento a dicho liposoma fusogénico para formar un
liposoma dirigido, poner en contacto el liposoma dirigido con una
célula de manera que el resto de direccionamiento se libere de al
menos una parte de la bicapa lipídica del liposoma para exponer una
parte de la bicapa lipídica y fusionar la parte de bicapa lipídica
expuesta con una membrana celular de manera que el agente bioactivo
se libere en la célula. Preferiblemente, el uso también incluye unir
electrostáticamente un agente de estabilización a la bicapa lipídica
del liposoma fusogénico.
La figura 1 representa la transfección de
células de cáncer de ovario mediante liposomas con inversión de
carga y su potenciación mediante el uso de una molécula de
estabilización/direccionamiento.
La figura 2 representa la cuantificación de la
eficacia de transfección potenciada para liposomas con inversión de
carga cuando se dirigen mediante módulos con transferrina o
folato.
La figura 3 demuestra que la eficacia de
transfección potenciada de liposomas de
N-acil-PE fusogénicos mediante un
módulo de direccionamiento de folato depende del folato.
La figura 4 demuestra que los módulos de
direccionamiento de folato electrostáticamente unidos a los
liposomas potencian la transfección más que el folato conjugado a
lípidos.
La figura 5 representa el mantenimiento de la
integridad liposómica cuando un conjugado de anticuerpo se une
electrostáticamente a la superficie del liposoma.
La figura 6 demuestra la captación liposómica
potenciada mediada por un conjugado de anticuerpo
electrostáticamente unido a la superficie del liposoma.
La figura 7 muestra la transfección potenciada
como resultado de cantidades crecientes de un conjugado de
anticuerpo electrostáticamente unido a la superficie de liposomas
que contienen ADN de plásmido.
La figura 8 representa la expresión de proteína
fluorescente verde potenciada como resultado del direccionamiento
con anticuerpos.
La figura 9 representa la unión de liposomas
dirigidos por transferrina de la presente invención a células
OVCAR-3 en presencia y ausencia de suero.
La figura 10 representa el efecto de conjugados
de polilisina-transferrina sobre la transfección y
unión del liposoma.
La figura 11 es una fotomicrografía fluorescente
que representa el efecto de pKT sobre la unión del liposoma a
células y la transfección.
La figura 12 demuestra la inhibición de la
transfección mediada por liposomas dirigidos por pKT mediante
anticuerpos anti-transferrina.
La figura 13 representa la eficacia de
transfección de conjugados en comparación con polilisina libre.
La figura 14 demuestra la unión de liposomas
fluorescentes a células OVCAR-3 derivadas de la
ascitis de un xenoinjerto de ratón con y sin agente de
direccionamiento (pKT).
La figura 15 demuestra el ensayo de
beta-galactosidasa para transfección in
vivo.
La figura 16 demuestra el ensayo de
beta-galactosidasa para transfección in
vivo.
El suministro de ácidos nucleicos o fármacos
encapsulados en liposomas a células específicas mediante fusión de
membranas es un objetivo sumamente deseable debido a la protección
de la carga frente a la degradación, el potencial de
direccionamiento y la disminución de la toxicidad farmacológica.
Además, es ventajoso proteger y/o estabilizar el propio liposoma
hasta que alcanza su sitio de suministro deseado, porque el liposoma
puede degradarse in vivo. Sin embargo, muchas moléculas de
direccionamiento tales como anticuerpos y la mayoría de los restos
de estabilización o protectores tales como polietilenglicol (PEG)
inhiben estéricamente la interacción entre la membrana liposómica y
la membrana celular, aún cuando el liposoma se ha unido a la
superficie celular. Debido a este impedimento estérico,
generalmente no es posible que los liposomas fusogénicos suministren
eficazmente su contenido al citoplasma de la célula. Esta invención
proporciona un liposoma dirigido, o liposoma estabilizado y
dirigido, en el que al menos una parte de los restos de
estabilización/direccionamiento pueden eliminarse al menos
temporalmente en el sitio diana. La invención implica adherencia no
covalente de un resto de direccionamiento, y preferiblemente un
resto de estabilización, a la superficie de un liposoma mediante
interacciones electrostáticas, preferiblemente interacciones
electrostáticas multivalentes. Tales interacciones pueden ser
bastante fuertes si la valencia de la interacción es
suficientemente alta. Sin embargo, el pH reducido (en relación con
el plasma extracelular más allá de la proximidad inmediata de la
célula) en ciertos sitios in vivo tales como el sitio de
infección, inflamación o dentro de ciertos compartimentos u
orgánulos celulares tales como endosomas, relaja o, en ciertos
casos, revierte la interacción entre el resto adherente y el
liposoma. Una vez que un liposoma fusogénico, así modificado, se
une al tipo celular seleccionado como diana y se encuentra con el
entorno de pH reducido, el resto de estabilización/direccionamiento
puede eliminarse parcial o completamente si al menos una de las
especies que interaccionan electrostáticamente, es decir, lípidos de
membrana o agente de estabilización/direccionamiento se neutraliza
al menos parcialmente mediante el entorno de pH bajo en combinación
con otros iones. Además, una parte del agente de
estabilización/direccionamiento electrostáticamente unido puede
intercambiarse sobre la membrana celular tras la unión del liposoma
y su internalización en un endosoma, eliminando también la
interferencia estérica para la fusión. Por ejemplo, puede protegerse
un liposoma aniónico, fusogénico mediante un conjugado de
polilisina con PEG y dirigirse adicionalmente mediante una molécula
unida, tal como folato, transferrina o un anticuerpo. Si el lípido
aniónico está al menos parcialmente neutralizado a pH inferior, el
agente de estabilización/direccionamiento puede disociarse completa
o parcialmente permitiendo la exposición de la membrana liposómica
fusogénica desnuda y la posterior fusión o fusión parcial del
liposoma con la membrana endosómica. Esto libera el contenido
liposómico en el citoplasma. El contenido puede incluir cualquier
molécula terapéuticamente relevante.
Una segunda ventaja de este método de
direccionamiento y estabilización del liposoma es que puede
producirse un único tipo de liposoma al que pueden unirse
posteriormente de manera electrostática cualquier número de agentes
de estabilización/direccionamiento. Esta realización requiere
simplemente mezclar un liposoma fusogénico, que encapsula a un
agente bioactivo o fármaco relevante, con un resto de unión
covalentemente unido a un resto de direccionamiento que se unirá al
sitio seleccionado como diana específico. Por tanto, el sistema es
modular. Pueden prepararse agentes de direccionamiento
seleccionados unidos covalentemente a restos de unión que se unirán
electrostáticamente a la bicapa lipídica. Pueden prepararse
independientemente liposomas fusogénicos que encapsulan a
diferentes agentes bioactivos o fármacos. Entonces, dependiendo del
sitio diana y el/los agente(s) terapéutico(s) que se
desea(n) administrar, puede mezclarse la combinación
apropiada de agente de direccionamiento y liposoma que encapsula a
un fármaco o agente bioactivo para proporcionar un agente
terapéutico específico que se dirige al sitio celular específico.
Esto permitirá un direccionamiento específico de paciente con un
único tipo de preparación liposómica que puede modificarse mediante
una serie de agentes de direccionamiento.
Los elementos básicos de la invención son un
liposoma fusogénico, un resto de unión y un resto de
direccionamiento. El liposoma fusogénico comprende una bicapa
lipídica que encapsula a un agente bioactivo que va a administrarse
al citoplasma de una célula, siendo preferiblemente el agente
bioactivo ADN condensado. El resto de direccionamiento se coloca en
la parte exterior del liposoma, y está covalentemente unido al resto
de unión. El resto de unión está electrostáticamente unido a la
bicapa lipídica del liposoma fusogénico, uniendo así indirectamente
el resto de direccionamiento electrostáticamente a la bicapa
lipídica. Preferiblemente, la invención también comprende un resto
de estabilización que, como el resto de direccionamiento, está
electrostáticamente unido a la bicapa lipídica a través de un resto
de unión. Específicamente, el resto de estabilización está
covalentemente unido al resto de unión, y el resto de unión está
electrostáticamente unido a la bicapa lipídica del lípido
fusogénico. Un resto de direccionamiento puede estar covalentemente
unido al resto de estabilización. Estos elementos individuales de la
invención se describirán ahora en detalle.
"Liposomas" son estructuras que se
autoensamblan que comprenden una o más bicapas lipídicas, cada una
de las cuales comprende dos monocapas que contienen moléculas de
lípidos anfipáticos orientadas de manera opuesta. Los líquidos
anfipáticos comprenden una región de grupo principal polar
(hidrófilo) covalentemente unida a una o dos cadenas de acilo no
polares (hidrófobas). Contactos energéticamente desfavorables entre
las cadenas de acilo hidrófobas y el medio acuoso circundante
inducen que las moléculas de lípidos anfipáticos se dispongan por
sí mismas de manera que sus grupos principales polares se orientan
hacia la superficie de la bicapa, mientras que las cadenas de acilo
se reorientan hacia el interior de la bicapa. Se forma así una
estructura energéticamente estable en la que las cadenas de acilo
están protegidas eficazmente del contacto con el entorno acuoso. Un
liposoma "fusogénico" tal como se define en el presente
documento es un liposoma que puede interaccionar con una membrana
celular de forma que permite que el contenido del liposoma entre en
el citoplasma de la célula. Sin limitación, esta interacción puede
tomar la forma de fusión completa o parcial de las membranas, o
roturas localizadas simultáneas, adyacentes de las membranas celular
y liposómica que permiten el paso del contenido del liposoma al
citoplasma de la célula.
Los liposomas (véase, por ejemplo, Cullis et
al., 1987; New, 1995) pueden tener una única bicapa lipídica
(liposomas unilamelares, "ULV"), o múltiples bicapas lipídicas
(liposomas multilamelares, "MLV" o "SPLV"). Cada bicapa
rodea, o encapsula, un compartimento acuoso. Dada esta encapsulación
de volumen acuoso dentro de una barrera protectora de moléculas
lipídicas, los liposomas pueden secuestrar moléculas encapsuladas,
por ejemplo, ácidos nucleicos, lejos de los efectos de degradación
de factores, por ejemplo, enzimas nucleasas, presentes en el entorno
externo.
Los liposomas pueden tener una variedad de
tamaños, por ejemplo, un diámetro promedio de tan solo 25 nm o de
hasta 10.000 nm o más. El tamaño se ve afectado por varios factores,
por ejemplo, la composición de lípidos y el método de preparación,
estando bastante dentro del ámbito de expertos habituales
determinarlos y explicarlos, y se determina mediante varias
técnicas, tales como dispersión de luz quasielástica, también dentro
del ámbito de los expertos.
Pueden usarse diversas metodologías, también
dentro del ámbito de expertos habituales, tales como sonicación,
homogeneización, aplicación de prensa francesa y molienda, para
preparar liposomas de un tamaño más pequeño a partir de liposomas
más grandes. Puede usarse extrusión (véase, por ejemplo, la patente
estadounidense número 5.008.050) para reducir el tamaño de
liposomas, es decir, para producir liposomas que tienen un tamaño
medio predeterminado forzando los liposomas, a presión, a través de
poros de filtro de un tamaño seleccionado, definido. También puede
usarse filtración de flujo tangencial (documento WO89/008846), para
regularizar el tamaño de los liposomas, es decir, para producir una
población de liposomas que tienen menos heterogeneidad de tamaño, y
una distribución de tamaño definida, más homogénea. El contenido de
estos documentos se incorpora al presente documento como
referencia.
Los liposomas de esta invención pueden ser
unilamelares, u oligolamelares, y pueden tener un tamaño igual al de
los liposomas producidos mediante cualquiera de los métodos
expuestos anteriormente en el presente documento. Sin embargo, en
realizaciones preferidas de esta invención, los liposomas son
liposomas unilamelares que tienen tamaños promedio en número de
aproximadamente 50-500 nm.
Los liposomas están compuestos por una variedad
de lípidos, tanto anfipáticos como no anfipáticos, obtenidos a
partir de una variedad de fuentes, tanto naturales como sintéticas.
Los lípidos liposómicos adecuados incluyen, sin limitación,
fosfolípidos tales como fosfatidilcolinas ("PC"),
fosfatidiletanolaminas ("PE"), fosfatidilserinas ("PS"),
fosfatidilgliceroles ("PG"), fosfatidilinositoles ("PI") y
ácidos fosfatídicos ("PA"). Tales fosfolípidos tienen
generalmente dos cadenas de acilo, estando éstas o bien ambas
saturadas, ambas insaturadas o bien una saturada y otra insaturada;
dichas cadenas incluyen, sin limitación, cadenas de miristato,
palmitato, estearato, oleato, linoleato, linolenato, araquidato,
araquidonato, behenato y lingocerato.
Los fosfolípidos también pueden derivatizarse,
mediante la unión a los mismos de un grupo reactivo adecuado. Un
grupo de este tipo es generalmente un grupo amino y, por tanto, los
fosfolípidos derivatizados son normalmente fosfatidiletanolaminas.
Los diferentes restos adecuados para unirse a PE incluyen, sin
limitación: cadenas de acilo (documento WO98/16199), útiles para
potenciar la capacidad de fusión de los liposomas a membranas
biológicas; péptidos (documento WO98/16240), útiles para
desestabilizar los liposomas en las proximidades de las células
diana; restos biotina y maleimido (patentes estadounidenses números
5.059.421 y 5.399.331, respectivamente), útiles para unir restos de
direccionamiento tales como anticuerpos a liposomas; y diversas
moléculas tales como gangliósidos, polialquiléteres,
polietilenglicoles y ácidos dicarboxílicos orgánicos (véanse, por
ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.013.556, 4.920.016 y
4.837.028). El contenido de los documentos citados anteriormente se
incorpora al presente documento como referencia.
Por consiguiente, en las realizaciones más
preferidas de esta invención, los liposomas comprenden un
fosfolípido derivatizado, adaptado de manera que potencia el
suministro de su contenido. Los liposomas también pueden
comprender, aunque no se requiere, líquidos adicionales también,
incorporándose dichos lípidos adicionales en los liposomas por
varias razones evidentes para los expertos habituales en el campo
del estudio de los liposomas. Tales razones incluyen, sin
limitación, estabilizar o dirigir los liposomas, así como alterar
adicionalmente el comportamiento farmacocinético de los liposomas.
Los lípidos adicionales adecuados incluyen cualquiera de los lípidos
comúnmente reconocidos como adecuados para su incorporación en
liposomas, incluyendo, sin limitación, fosfolípidos, glicolípidos y
esteroles.
Preferiblemente, los liposomas de esta invención
tienen un componente lipídico que comprende un fosfolípido
derivatizado y un lípido adicional. Se describen liposomas adecuados
y los métodos de preparación de los mismos en la solicitud de
patente estadounidense con número de serie 08/951.056, incorporada
al presente documento en su totalidad como referencia.
Preferiblemente, el fosfolípido derivatizado es
una PE N-acilada. Tales NAPE son útiles para
preparar liposomas fusogénicos y se prefieren para preparar
liposomas que comprenden los complejos de agente bioactivo o fármaco
de la presente invención.
La desestabilización de la bicapa inducida por
NAPE induce que las bicapas se fusionen a membranas biológicas en
las proximidades, y por tanto potencia la capacidad fusogénica de
las bicapas (Shangguan et al., 1998). A su vez, puede usarse
la capacidad fusogénica potenciada para suministrar agentes
bioactivos encapsulados, tales como ácidos nucleicos u otros
agentes que no pueden cruzar la membrana celular, a células,
combinando las células con los liposomas en condiciones, por
ejemplo, la presencia de concentraciones apropiadas tales como
Ca^{2+} y Mg^{2+}. El contacto liposoma-célula
da como resultado la liberación de los agentes bioactivos
encapsulados en el liposoma de manera local a las células, y/o
directamente en el citoplasma de las células como resultado de la
fusión entre las membranas del liposoma y de la célula. Tal
suministro es o bien in vivo o bien in vitro.
Se hace referencia a continuación (ejemplo 1) a
una formulación preferible alternativa de liposomas para
direccionamiento modular como liposomas "con inversión de
carga". La composición de tales liposomas también permite unir
electrostáticamente grupos de estabilización/direccionamiento. Tales
liposomas invierten su carga a pH bajo, disociando los conjugados de
estabilización/direccionamiento y logrando una carga positiva para
potenciar la interacción con la membrana celular.
El lípido liposómico también puede comprender un
"lípido con grupo principal modificado", es decir, un lípido
que tiene un grupo polar derivatizado mediante la unión al mismo de
un resto que puede inhibir la unión de proteínas séricas a un
liposoma que incorpora el lípido. La incorporación de lípidos con
grupo principal modificado en liposomas altera por tanto su
comportamiento farmacocinético, de manera que los liposomas
permanecen en la circulación de un animal durante un periodo de
tiempo más largo que el que se produciría de otra manera (véanse,
por ejemplo, Blume et al., 1993; Gabizon et al., 1993;
Park et al., 1992; Woodle et al., patente
estadounidense número 5.013.556; Allen et al., patentes
estadounidenses números 4.837.028 y 4.920.016; incorporándose el
contenido de estos documentos al presente documento como
referencia).
Ácidos nucleicos que pueden encapsularse en el
liposoma son ADN, incluyendo ADN genómico, ADN de plásmido y ADNc, o
ARN; preferiblemente, el ácido nucleico encapsulado es ADN, más
preferiblemente, ADN de plásmido cerrado (circular).
"Encapsulado" o "que contiene" tal como se usan en el
presente documento con respecto al contenido del liposoma describen
materiales que están dentro del volumen acuoso interior del
liposoma, intercalados en la bicapa lipídica del liposoma o
parcialmente intercalados en la bicapa lipídica del liposoma.
Los liposomas de la invención contienen uno o
más agentes bioactivos. Los agentes bioactivos que pueden asociarse
con liposomas incluyen, pero no se limitan a: agentes antivirales
tales como aciclovir, zidovudina y los interferones; agentes
antibacterianos tales como aminoglicósidos, cefalosporinas y
tetraciclinas; agentes antifúngicos tales como antibióticos
polienos, imidazoles y triazoles; agentes antimetabólicos tales como
ácido fólico y análogos de pirimidina y purina; agentes
antineoplásicos tales como los antibióticos de antraciclina y
alcaloides vegetales; esteroles tales como colesterol; hidratos de
carbono, por ejemplo, azúcares y almidones; aminoácidos, péptidos,
proteínas tales como proteínas receptoras celulares,
inmunoglobulinas, enzimas, hormonas, neurotransmisores y
glicoproteínas; colorantes; radiomarcadores tales como radioisótopos
y compuestos marcados con radioisótopos; compuestos radioopacos;
compuestos fluorescentes; compuestos midriáticos; broncodilatadores;
anestésicos locales; y similares.
Las formulaciones de agentes bioactivos
liposómicos pueden potenciar el índice terapéutico del agente
bioactivo, por ejemplo tamponando la toxicidad del agente. Los
liposomas también pueden reducir la tasa a la que se aclara el
agente bioactivo de la circulación de animales. Por consiguiente, la
formulación liposómica de agentes bioactivos puede significar que se
necesite administrar menos agente para conseguir el efecto
deseado.
El liposoma de esta invención puede
deshidratarse, almacenarse y reconstituirse luego de manera que se
conserva una parte sustancial de su contenido interno. La
deshidratación liposómica requiere generalmente el uso de un
protector de secado hidrófilo, tal como un azúcar de disacárido
tanto en la superficie interior como exterior de las bicapas de los
liposomas (véase la patente estadounidense número 4.880.635, cuyo
contenido se incorpora al presente documento como referencia). Se
cree generalmente que el compuesto hidrófilo impide la redisposición
de los lípidos en liposomas, de modo que su tamaño y contenido se
mantienen durante el procedimiento de secado, y durante la
rehidratación posterior. Cualidades apropiadas para tales
protectores de secado son que son fuertes aceptores de puentes de
hidrógeno, y presentan características estereoquímicas que conservan
la separación intermolecular de los componentes de la bicapa del
liposoma. Alternativamente, el protector de secado puede omitirse si
la preparación de liposomas no se congela antes de la
deshidratación, y permanece suficiente agua en la preparación tras
la deshidratación.
También se proporciona en el presente documento
una composición farmacéutica que comprende un vehículo
farmacéuticamente aceptable y el liposoma de esta invención. Dicha
composición es útil, por ejemplo, en el suministro de ácidos
nucleicos a las células de un animal. "Vehículos farmacéuticamente
aceptables" tal como se usa en el presente documento son
aquellos medios generalmente aceptables para su uso junto con la
administración de lípidos y liposomas, incluyendo formulaciones de
agentes bioactivos liposómicos, a animales, incluyendo seres
humanos. Se formulan generalmente vehículos farmacéuticamente
aceptables según varios factores, estando bastante dentro del
ámbito del experto determinarlos y explicarlos, incluyendo sin
limitación: el agente bioactivo liposómico particular usado, su
concentración, la biodisponibilidad pretendida y estabilidad; la
enfermedad, el trastorno o el estado que están tratándose con la
composición liposómica; el sujeto, su edad, tamaño y estado general;
y la vía de administración pretendida de la composición, por
ejemplo, nasal, oral, oftálmica, tópica, transdérmica, vaginal,
subcutánea, intramamaria, intraperitoneal, intravenosa o
intramuscular (véase, por ejemplo, Nairn (1985), cuyo contenido se
incorpora al presente documento como referencia). Los vehículos
farmacéuticamente aceptables típicos usados en la administración
parenteral de agentes bioactivos incluyen, por ejemplo, D5W, una
disolución acuosa que contiene el 5% en peso por volumen de
dextrosa, y solución salina fisiológica. Los vehículos
farmacéuticamente aceptables pueden contener componentes
adicionales, por ejemplo aquéllos que potencian la estabilidad de
los principios activos incluidos, tales como conservantes y
antioxidantes.
Lípidos útiles en la práctica de esta invención
son, tal como se describió anteriormente en el presente documento,
aquellos lípidos reconocidos como adecuados para su incorporación en
liposomas, o bien solos o bien junto con lípidos adicionales; éstos
incluyen, fosfolípidos, glicolípidos, esteroles y sus derivados.
Disolventes orgánicos usados en este método son cualquiera de una
variedad de disolventes útiles para disolver lípidos durante el
transcurso de la preparación de liposomas; estos incluyen, sin
limitación, metanol, etanol, dimetilsulfóxido, cloroformo y mezclas
de los mismos. Preferiblemente, el disolvente orgánico es cloroformo
o cloruro de metileno.
Todavía se proporciona adicionalmente en el
presente documento un método de transfección de células de un
animal con un liposoma fusogénico dirigido que comprende uno o más
agentes bioactivos tales como, pero sin limitarse a, un ácido
nucleico. El método comprende las etapas de preparar un liposoma
fusogénico que encapsula a un agente bioactivo; preparar un resto
de direccionamiento covalentemente unido a un agente de unión,
pudiéndose unir electrostáticamente dicho agente de unión a dicho
liposoma fusogénico a pH fisiológico normal, mezclar el liposoma
fusogénico cargado con el conjugado de direccionamiento y poner en
contacto las células con la composición compuesta por el liposoma
fusogénico cargado electrostáticamente unido al agente de
direccionamiento. Tal contacto es o bien in vitro, en cuyo
caso se añade una composición que comprende el liposoma al medio de
cultivo que rodea a las células, o bien in vivo, en cuyo caso
se administra el liposoma en una composición farmacéutica que
comprende también un vehículo farmacéuticamente aceptable, y se
administra al animal mediante cualquiera de los medios
convencionales de administración de tales composiciones a
animales.
El resto de direccionamiento de la invención
puede ser cualquier composición química que favorezca el
posicionamiento de un liposoma en un sitio o sitios específicos.
Puede utilizarse más de un resto de direccionamiento en un único
liposoma. Preferiblemente, el resto de direccionamiento se
selecciona del grupo que consiste en una vitamina tal como folato;
transferrina; un anticuerpo tal como OVB-3,
anti-CA125, anti-CEA, y otros;
antígeno sialil-Lewis X, ácido hialurónico,
derivados de manosa, derivados de glucosa, lectinas específicas de
células, galaptina, galectina, lactosilceramida, un derivado
esteroideo, una secuencia RGD, un ligando para un receptor de la
superficie celular tal como factor de crecimiento epidérmico (EGF),
péptido de unión a EGF, péptido de unión al receptor de urocinasa,
un péptido derivado de trombospondina, un derivado de albúmina y/o
una molécula combinatoria dirigida contra diversas células.
El resto de unión puede ser cualquier
composición química que pueda unirse simultáneamente a la bicapa
lipídica de un liposoma de manera electrostática y unirse a un
resto de estabilización o direccionamiento de manera covalente, de
manera que el enlace electrostático pueda debilitarse así en entorno
con pH reducido (en relación con el plasma extracelular no en las
proximidades inmediatas de la célula) de modo que al menos algo del
resto de unión se disocia al menos temporalmente del liposoma,
exponiendo de ese modo al menos una parte de la bicapa lipídica
externa durante al menos algún periodo de tiempo. El resto de unión
es preferiblemente una molécula pequeña y no dificulta la
interacción entre el resto de direccionamiento y la célula
seleccionada como diana. Pueden usarse más de un resto de unión en
un único liposoma, y los restos de unión usados para unir los restos
de estabilización y direccionamiento pueden ser iguales o
diferentes. Preferiblemente, el resto de unión se selecciona del
grupo que consiste en polilisina, protamina, polietilenimina,
poliarginina, poliacrilato, un derivado de espermina, citocromo c,
una anexina, sulfato de heparina, un aminodextrano, poliaspartato,
poliglutamato, un ácido polisiálico y/o poli(ácido
2-etilacrílico).
El resto de estabilización de la invención es
cualquier composición química que inhibe o impide que un liposoma se
fusione con otros liposomas o células no diana, y/o protege a la
bicapa lipídica del liposoma frente a la acción de rotura, de
degradación o de interferencia de compuestos perjudiciales (por
ejemplo, proteínas séricas). Puede usarse más de un resto de
estabilización en un único liposoma. Preferiblemente, el resto de
estabilización se selecciona del grupo que consiste en
polietilenglicol, polivinilpirrolidona, un dextrano, un
poliaminoácido, metil-polioxazolina, poliglicerol,
poli(acriloil morfolina) y/o poliacrilamida.
Ahora se describirán realizaciones preferidas de
la invención en los ejemplos a continuación. Se pretende que los
ejemplos sean ilustrativos de la invención.
Preferiblemente, para el suministro de ácidos
nucleicos a células, se preparan liposomas según el método descrito
en la solicitud provisional estadounidense con número de serie
60/122.365 titulada "Encapsulation of Bioactive Complexes in
Liposomes", presentada el 2 de marzo de 1999. A continuación se
describe una realización.
Purificación de plásmidos: Se usaron dos
plásmidos en este estudio: el plásmido pZeoSVLacZ que tiene 6,5 kb,
y expresa el gen lacZ para \beta-galactosidasa en
células de mamífero a partir del
potenciador-promotor temprano de SV40, que permite
la selección en células de mamífero y E. coli usando
el antibiótico zeocina; y, el plásmido pEGFP-C1, que
tiene 4,7 kb y expresa proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) a
partir de un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano,
que permite la selección en E. coli usando kanamicina, y en
células de mamífero usando G418. Se purificaron los plásmidos a
partir de E. Coli (Baumann y Bloomfield, 1995; o mediante un
kit Qiagen según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia,
CA)), la razón final de D.O. a 260 nm con respecto a D.O. a 280 nm
fue superior a 1,9 para todas las preparaciones; la electroforesis
en gel de agarosa indicó ADN en el intervalo de tamaño esperado.
Preparación de formulaciones de ADN
liposómicas (liposomas de N-acil-PE
fusogénicos; método de emulsión de dos etapas): Se prepararon
muestras diluyendo 200 \mug de ADN en 125 \mul de tampón de baja
concentración de sal (LSB; TrisHCl 10 mM, NaCl 1 mM, pH 7,0, todo
el LSB usado en estas preparaciones también contenía sacarosa 200
mM), y entonces combinando la suspensión resultante con 1 ml de
CHCl_{3} que contenía 30 \mumoles de razón molar 70:30 de
N-C12 DOPE y DOPC, en un tubo de Pirex de 13 x 100
mientras que se agitaba con vórtex. Se sonicó inmediatamente la
muestra durante 12 segundos en un sonicador de baño (Laboratory
Supplies Co. Hicksville, NY) a máxima potencia, para formar una
emulsión con ADN de plásmido en primer lugar. Posteriormente, se
añadió una alícuota de 125 \mul de LSB que contenía espermina
(preferiblemente de 16 a 40 milimolar) a esta emulsión con agitación
con vórtex y sonicación.
Se colocaron las emulsiones resultantes, en el
plazo de algunos minutos, en un matraz sobre un aparato Rotovap
(Büchi Laboratoriums-Technik AG, Suiza). Se eliminó
el disolvente orgánico mientras que hacía girar el matraz a su
máxima velocidad, mientras que se modulaba el vacío con una válvula
de aguja. Inicialmente se estableció un vacío de aproximadamente
600-650 mm, aumentándose éste posteriormente, tan
rápido como fuera posible sin burbujeo excesivo, hasta que se
alcanzó el vacío máximo (aproximadamente 730 mm); entonces se siguió
haciendo vacío en el matraz durante otros 25 minutos. Se resuspendió
la película que quedó en el matraz en 1 ml de sacarosa 300 mM en
LSB, y se extruyó la muestra cinco veces a través de filtros de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum (Poretics, Livemore, CA).
Entonces se dializó la muestra frente a tampón salino equilibrado de
Hank (HBSS) sin Ca^{2+}/Mg^{2+}, durante la noche a 4ºC.
Tras la preparación de los liposomas que
contenían ácido nucleico descritos anteriormente, se separó el ADN
de plásmido libre del ADN encapsulado en liposoma mediante
centrifugación. Se sedimentaron los liposomas y se lavaron antes de
formar el complejo de direccionamiento. Pueden aumentarse las
preparaciones para producir cantidades mayores de producto mediante
métodos conocidos en la técnica.
En otra realización, se prepararon liposomas,
hasta el momento en el presente documento denominados liposomas con
inversión de carga, en primer lugar mezclando los lípidos en
cloroformo (DOPC:POPE:colesterol:hemisuccinato de
colesterilo:DOPAP:acetato de oleílo, 12:50:2,5: 12,5:10,5:10,5). A
continuación, se condensaron los plásmidos con espermina usando el
protocolo de emulsión de lípidos de dos etapas descrito
anteriormente en la realización anterior. Una diferencia es que la
concentración final de sacarosa en la disolución de ADN que iba a
encapsularse era de 300 mM. Se eliminó el disolvente o bien
mediante evaporación rotatoria o bien mediante burbujeo con
nitrógeno. Se suspendieron los liposomas de la pasta resultante en
sacarosa 300 mM, se extruyeron a través de filtros de 0,4 \mum,
entonces se dializaron frente a PBS o solución salina equilibrada de
Hank (HBSS). Se eliminó el plásmido no encapsulado centrifugando la
muestra a 10.000 g. Se lavó el sedimento de liposoma/plásmido, se
volvió a centrifugar y se resuspendió en PBS o HBSS. Se determinó la
distribución de tamaño de los liposomas mediante dispersión luminosa
usando un aparato para determinar el tamaño de partículas
submicrométricas NICOMP modelo 370 (NICOMP, Santa Bárbara, CA). Se
cuantificó la cantidad de plásmido presente en el sedimento
liposómico usando un ensayo fluorescente PicoGreen (Molecular
Probes, Inc., Eugene, OR) tal como se describe en el ejemplo 3
"Ensayos".
Se caracterizaron los liposomas de esta
composición mediante microscopía electrónica de transmisión de una
preparación de liposoma/plásmido con ligando de
polilisina-anti-OVB3 unido. Se
colocó la muestra en una rejilla de ME recubierta de carbón y se
tiñó negativamente con acetato de uranilo al 1%. Se observaron
liposomas de un tamaño heterogéneo con cantidades variables de
penetración de la tinción. Las preparaciones finales de
liposoma/plásmido dieron una distribución de tamaño gausiana
mediante análisis de dispersión luminosa. El diámetro medio
ponderado en número de 7 preparaciones diferentes fue de 140 nm
\pm 20 nm (la desviación estándar de la media para cualquier
preparación individual oscilaba entre el 40-55%). El
contenido en plásmido en las muestras de liposoma/plásmido lavadas
oscilaba desde 1,25-2,45 \mug de ADN/\mumol de
lípido, con una media de 1,6 \mug de ADN/\mumol de lípido. Se
protegió esta fracción de plásmido de la digestión con ADNasa I
sugiriendo o bien encapsulación o bien una asociación muy estrecha
con los liposomas.
Se sintetizaron módulos de
direccionamiento/estabilización para usar con liposomas preparados
tal como en el ejemplo 1. Pueden acoplarse covalentemente restos de
direccionamiento/estabilización a un ligador para interacción
electrostática, tal como polilisina (pK), mediante cualquier método
conocido en la técnica. En el presente documento se proporcionan
ejemplos de procedimientos para el acoplamiento de polilisina a
agentes de direccionamiento tales como ácido fólico, transferrina y
anticuerpos, solamente para fines de mostrar a modo de ejemplo.
También se proporcionan en el presente documento métodos para
acoplar un agente de unión tal como polilisina a un agente de
estabilización tal como PEG o a un agente de estabilización y un
resto de direccionamiento.
Se disolvió ácido fólico (50 mg, 0,11 mmoles) en
6 ml de DMF:PY (5:1; v/v). A esta disolución se le añadió
diciclohexilcarbodiimida (DCC, 140 mg, 0,68 mmoles) y se agitó la
mezcla de reacción a temperatura ambiente durante
2-3 h. El precipitado de diciclohexilurea (DCU) se
desarrolló con el tiempo.
Se disolvió
BocNH-PEG-CO_{2}NHS (3400 p.m.,
Shearwater Polimers, Huntsville, AL) en 5 ml de disolución de
CH_{2}Cl_{2}:TFA (4:1, v/v). Se agitó esta mezcla a temperatura
ambiente durante 2 horas. El análisis de CCF reveló que se había
completado la reacción. El producto dio una prueba de la ninhidrina
positiva. Se eliminaron los disolventes a presión reducida y se secó
la muestra a alto vacío.
A la mezcla de reacción de FAA, se le añadió
H_{2}N-PEG-CO_{2}NHS (186 mg,
0,057 mmoles) en 2,5 ml de DMF:
trietilamina (100:1 v/v) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. El análisis de CCF mostró que la reacción se había completado. El producto fue positvo para UV y ninhidrina. Se eliminaron los disolventes de la mezcla de reacción a presión reducida y se secó la muestra a alto vacío.
trietilamina (100:1 v/v) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. El análisis de CCF mostró que la reacción se había completado. El producto fue positvo para UV y ninhidrina. Se eliminaron los disolventes de la mezcla de reacción a presión reducida y se secó la muestra a alto vacío.
A una disolución de
FA-NH-PEG-CO_{2}NHS
(100 mg, 0,027 mmoles) en 5 ml de DMF:Py (4:1 v/v), se le añadieron
PLL (62,15 mg, 0,0224 mmoles) y Et_{3}N (3,4 mg, 4,7 \mul,
0,0336 mmoles). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura
ambiente durante la noche. En este punto de tiempo el análisis de
CCF reveló que se formó una nueva mancha polar que fue positiva para
UV y dio una prueba de la ninhidrina positiva. Se eliminaron los
disolventes de la mezcla de reacción a presión reducida y se secó la
muestra a alto vacío. Se suspendió el material residual en
CHCl_{3} y se centrifugó a 4000 rpm durante 30 min. Se separó el
material sólido del sobrenadante y se lavó con CHCl_{3}. Peso de
la muestra pura 55,4 mg (rendimiento del 37,5%).
También pueden prepararse conjugados de folato o
PEG ligados directamente a polilisina u otras moléculas cargadas
mediante procedimientos similares.
Se disolvió ácido fólico (50 mg, 0,11 mmoles) en
6 ml de N,N-dimetilformamida:piridina (DMF:PY) (4:1
v/v). A esta disolución se el añadió diciclohexocarbodiimida (DCC)
(140 mg, 0,68 mmoles) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura
ambiente durante \sim 3 h. Con el tiempo se observó precipitado de
diciclohexilurea (DCU) en la mezcla de reacción.
A la mezcla de reacción de FAA preparada
anteriormente, se le añadió
H_{2}N-PEG-NHBoc (3400 p.m.,
Shearwater Polymers, Huntsville, AL) (192 mg, 0,057 mmoles) en 1 ml
de N,N-dimetilformamida. Se agitó esta mezcla de
reacción a temperatura ambiente durante la noche. En este punto el
análisis de CCF reveló que la reacción se había completado. El
producto formado fue positivo para UV positivo y dio una prueba de
la ninhidrina negativa. Se eliminaron los disolventes a presión
reducida.
Se disolvió el material residual en 5 ml de
CH_{2}Cl_{2}:TFA (4:1 v/v) y se agitó la mezcla de reacción a
temperatura ambiente durante 2-3 h. En este punto de
tiempo, el análisis de CCF reveló que la reacción se había
completado. El producto fue positivo para UV y dio prueba de la
ninhidrina positiva. Se eliminaron los disolventes a presión
reducida y se secó el material residual a alto vacío.
Se disolvió el material residual en 5 ml de
DMF:Py (4:1 v/v). A esta disolución se le añadieron Et_{3}N (15,7
\mul, 11,41 mg, 0,113 mmoles) y anhídrido glutárico (9,7 mg; 0,085
mmoles) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente
durante la noche. El análisis de CCF mostró que la reacción se había
completado. Se realizó el análisis de CCF en
CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O (65:30:5; v/v/v). El producto dio una
prueba de la ninhidrina negativa. El peso residual de la muestra fue
649 mg.
Se añadió DCC (44 mg, 0,21 mmoles) a una
disolución de
FA-NH-PEG-NH-CO(CH_{2})_{3}COOH
(material residual) (162 mg, 0,043 mmoles) en 4 ml de DMSO:Py (4:1
v/v). Se agitó esta mezcla a temperatura ambiente durante
2-3 h. Con el tiempo se desarrolló el precipitado de
DCU. En este punto se añadió polilisina HBr (32 mg, 0,011 mmoles) a
la mezcla de reacción en 1,4 ml de disolución de DMSO:Py:Et_{3}N
(1000:200:200 \mul). Se agitó esta mezcla de reacción a
temperatura ambiente durante la noche. En este punto de tiempo el
análisis de CCF en CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O (60:35:5 v/v/v)
reveló que la reacción se había completado. El análisis de CCF dio
pruebas de la ninhidrina y UV positivas. Se eliminaron los
disolventes a presión reducida. Se disolvió el material residual en
CHCl_{3} y se separó el precipitado mediante centrifugación a
3000-4000 rpm durante 30 minutos. Se separó la
mezcla sólida y se lavó con CHCl_{3}. La muestra pura pesó 19,1 mg
(rendimiento del 27%).
Se preparó
FA-PEG-GA tal como se describió en
el apartado b en el esquema de la síntesis de
folato-PEG-polilisina.
Se añadió DCC (8,03 mg, 0,039 mmoles) a una
disolución de
FA-NH-PEG-NH-CO(CH_{2})_{3}COOH
(material residual) (50 mg, 0,013 mmoles) en 3,0 ml de CHCl_{3}.
Se agitó esta mezcla a temperatura ambiente durante
2-3 h. En este punto se añadió base libre de
protamina (13,3 mg, 0,0033 mmoles) a la mezcla de reacción en 1,5 ml
de 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol. Se agitó esta
mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. En este
punto de tiempo el análisis de CCF en CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O
(60:35:5 v/v/v) reveló que la reacción se había completado. El
análisis de CCF dio pruebas de la ninhidrina y UV positivas. Se
eliminaron los disolventes a presión reducida. Se disolvió el
material residual en CHCl_{3} y se separó el precipitado mediante
centrifugación a 3000-4000 rpm durante 30 minutos.
Se separó la mezcla sólida y se lavó con CHCl_{3}. La muestra pura
pesó 5,5 mg (rendimiento del 22%).
También pueden prepararse conjugados de folato
solos o PEG solo ligados directamente a polilisina u otras moléculas
cargadas mediante modificaciones menores de este método.
Se prepararon varias variaciones de los
conjugados de PEG como controles para comparar con los conjugados
anteriores. A estos les faltaba uno o más componentes del conjugado
activo. Se preparó el conjugado
Ac-PEG-GA-Pro, o
AcPGPr, sustituyendo un grupo acetilo por folato en el conjugado.
Por tanto no estaba dirigido a un receptor celular.
Además de los experimentos control, puede ser
deseable usar una molécula protectora no dirigida de este tipo para
modular la superficie liposómica para un direccionamiento óptimo
in vivo. Por ejemplo, puede usarse un conjugado no dirigido
además de un conjugado de direccionamiento en la superficie
liposómica.
A una disolución de
H_{2}N-PEG-NHBOC (100 mg, 0,0294
mmoles) en 3,0 ml de CHCl_{3} se le añadieron anhídrido acético
(9,0 mg, 7,85 \mul, 0,088 mmoles) y una cantidad en exceso de TEA.
Se selló esta mezcla de reacción bajo nitrógeno y se agitó a
temperatura ambiente durante 3-4 h. En este punto de
tiempo el análisis de CCF en CHCl_{3}:CH_{3}OH (9:1 v/v) reveló
que la reacción se había completado. El análisis de CCF dio prueba
de la ninhidrina negativa. Se eliminaron los disolventes a presión
reducida y se usó el material residual en la etapa siguiente sin
purificación.
A una disolución de
Ac-NH-PEG-NHBOC en
2,2 ml de CH_{2}Cl_{2} se le añadieron 0,25 ml de TFA. Se agitó
esta mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 h. En este
punto de tiempo el análisis de CCF en CHCl_{3}:CH_{3}OH (9:1
v/v) reveló que la reacción se había completado. El análisis de CCF
dio prueba de la ninhidrina positiva. Se eliminaron los disolventes
a presión reducida y se usó el material residual en la etapa
siguiente sin purificación.
Se disolvió el material residual en 3,0 ml de
CHCl_{3}. A esta disolución se le añadieron una cantidad en exceso
de Et_{3}N y anhídrido glutárico (5 mg; 0,044 mmoles) y se agitó
la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. El
análisis de CCF mostró que la reacción se había completado. Se
realizó el análisis de CCF en CHCl_{3}:CH_{3}OH (9:1 v/v). El
producto dio una prueba de la ninhidrina negativa. Se usó el
meterial residual en la etapa siguiente sin purificación
adicional.
A una disolución de
Ac-NH-PEG-NH-CO-(CH_{2})_{3}-COOH
en 2,0 ml de CHCl_{3} se le añadió DCC (18,2 mg, 0,088 mmoles) y
se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante
2-3 h. En este punto de tiempo se desarrolló un
precipitado blanco. Se añadió protamina (30,0 mg, 0,0074 mmoles) en
1,6 ml de alcohol 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropílico
a la mezcla de reacción y se agitó la mezcla de reacción a
temperatura ambiente durante la noche. En este punto de tiempo, el
análisis de CCF dio una mancha positiva polar. Se eliminaron los
disolventes a presión reducida y se suspendió material residual en
CHCl_{3}. Se centrifugó la suspensión a 3500 rpm durante 15 min.
Se separó el material sólido de la disolución transparente dando 23
mg, rendimiento del 35%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se caracterizó la razón de protamina o
polilisina con respecto a la masa molecular restante en los
productos finales mediante derivatización fluorescente de los
grupos amino libres con fluorescamina, un reactivo que se vuelve
fluorescente tras la reacción con aminas. Como calibración de
respuesta de fluorescencia, se hicieron reaccionar cantidades
pesadas de polilisina o protamina libre con fluorescamina dando un
producto fluorescente. Se prepararon curvas patrón para o bien
protamina o bien la molécula de polilisina de 3.000 de peso
molecular usada para formación de conjugado. Entonces se determinó
la concentración de aminas en los conjugados mediante reacción con
fluorescamina. Se realizó el ensayo en un lector de placas de
fluorescencia Cytofluor 4000 de 96 pocillos (PerSeptive Biosystems,
Cambridge, MA). Tras la dilución de la muestra en 50 \mul de
volumen total de agua, se añadieron 200 \mul de tampón
NaBH_{2}O_{3} 130 mM a pH 9,5 y 50 \mul de fluorescamina 0,2
mg/ml que se disolvió en acetona. Se incubaron las muestras a
temperatura ambiente durante 20 minutos tras lo cual se midió la
fluorescencia a 490 \pm 20 nm con 395 \pm 12 nm de excitación.
Se compararon las lecturas de fluorescencia con las curvas patrón
para determinar la cantidad de protamina o polilisina en un peso
dado de conjugado y se calculó la razón de esta cantidad con
respecto a la masa total. Para los conjugados de protamina con PEG
y o bien folato o bien un grupo acetilo la razón esperada de un
conjugado 1:1 es 0,52 y 0,54, respectivamente, mientras que las
razones determinadas fueron 0,50 \pm 0,05 y 0,56 \pm 0,05,
respectivamente. Para los conjugados de polilisina de FPK y FPGK,
las razones calculadas son 0,45 y 0,44, respectivamente, mientras
que las razones determinadas fueron 0,64 \pm 0,17 y 0,35 \pm
0,05, respectivamente. Debido a la polidispersividad de la
polilisina usada para este fin, estas razones son solamente
directrices aproximadas para los complejos 1:1.
Los conjugados de protamina contenían claramente
una única protamina por grupo PEG, mientras que los conjugados de
polilisina estaban próximos a las razones deseadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un conjugado de fosfolípido de folato
y PEG para comparar con los conjugados de folato preparados
anteriormente. El conjugado de fosfolípido se insertaría de manera
hidrófoba en la membrana liposómica, mientras que los otros
conjugados interaccionarían con la membrana liposómica por medio de
una atracción electrostática. Los resultados se discuten
adicionalmente en el ejemplo 8.
A una disolución de DOPE (20 mg, 0,026 mmoles)
en 3,0 ml de CHCl_{3} se le añadieron
t-BocNH-PEG-CO_{2}NHS
(91,5 mg, 0,026 mmoles) y TEA (2,7 mg, 0,026 mmoles). Se selló esta
mezcla de reacción bajo nitrógeno y se agitó a temperatura ambiente
durante la noche. En este punto de tiempo el análisis de CCF en
CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O (65:25:4 v/v) reveló que la reacción
se había completado. Se eliminaron los disolventes a presión
reducida y se purificó el material residual en cromatografía en
columna dando 168 mg (53%). Algunas de las señales de ^{1}H RMN
(CDCl_{3}) características son: \delta 0,86 (t, 6H, J = 6,35 Hz,
CH_{3}), 1,25-1,27 (a, (CH_{2})_{n}
para DOPE), 1,43 (s, t-BOC), 3,63 (a, los CH_{2} para PEG)
y 5,32 (señal ancha para protones olefínicos).
A una disolución de conjugado de
t-BOCNH-PEG-NH-DOPE
en 4,0 ml de CH_{2}Cl_{2} se le añadió 1,0 ml de TFA. Se agitó
esta mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 h. En este
punto de tiempo el análisis de CCF en CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O
(65:25:4 v/v) reveló que la reacción se había completado. Se
eliminaron los disolventes a presión reducida y se purificó el
material residual en cromatografía en columna dando 44 mg. Algunas
de las señales de ^{1}H RMN (CDCl_{3}) características son:
\delta 0,86 (t, 6H, J = 6,11 Hz, CH_{3}),
1,25-1,27 (a, (CH_{2})_{n} para DOPE),
3,63 (a, los CH_{2} para PEG) y 5,32 (señal ancha para protones
olefínicos).
A una disolución de FA (10,58, 0,026 mmoles) en
3,0 ml de DMSO:Py (2:1 v/v) se le añadieron DCC (14,8 mg, 0,072
mmoles) y NH_{2}-PEG-DOPE (45 mg,
0,012 mmoles). Se selló esta mezcla de reacción bajo nitrógeno y se
agitó a temperatura ambiente durante la noche. En este punto de
tiempo el análisis de CCF en CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O (75:35:6
v/v) reveló que la reacción se había completado. El análisis de CCF
dio pruebas de ninhidrina, molibdato y UV positivas. Se eliminaron
los disolventes a presión reducida y se purificó el material
residual en cromatografía en columna dando 21,5 mg (43%). Algunas de
las señales de ^{1}H RMN (CDCl_{3}:CD_{3}OD 8:1 v/v)
características son: \delta 0,79 (t, 6H, J = 6,62 Hz, CH_{3}),
1,18-1,21 (a, (CH_{2})_{n} para DOPE),
3,56 (a, los CH_{2} para PEG), 5,25 (señal ancha para protones
olefínicos) y 6,60-8,6 (3 señales para FA).
\vskip1.000000\baselineskip
También se preparó un conjugado de anticuerpo
para la unión electrostática a liposomas para dirigir tales
liposomas a las células apropiadas.
OVB-3 es una IgG monoclonal
(AcM) que se une específicamente a células de carcinoma de ovario
humanas. Se obtuvo la línea celular de hibridoma de la ATCC
(HB-9147). Se inyectaron las células de hibridoma en
ratones Balb/c y se recogió la ascitis dos semanas más tarde. Se
aisló el AcM de la ascitis usando una columna de proteína A y se
almacenó en un tampón fosfato (NaCl 150 mM, NaP_{i} 20 mM, pH
7,5).
Se introdujeron grupos sulfhidrilo libres en los
polímeros de polilisina modificando la aminas con
2-iminotiolano (reactivo de Traut). Se obtuvo
polilisina bromhidrato en el intervalo de 1.000 a 4.000 de peso
molecular de SIGMA. Se disolvió la polilisina (45 mg) en 1,0 ml de
tampón de borato (NaBH_{2}O_{3} 100 mM pH 8,0). A esta
disolución, se le añadió 1 ml de 2-iminotiolano 95,9
mg/ml disuelto en agua. Se incubó la mezcla durante 1 hora en la
oscuridad con agitación suave. Tras la incubación, se transfirió la
muestra a un tubo de centrífuga de vidrio de 30 ml y se añadieron 18
ml de isopropanol. Se centrifugó la muestra durante 20 minutos a 9K
RPM. Se eliminó el sobrenadante y se secó el sedimento con una
corriente suave de N_{2}. Se redisolvió el sedimento en 2 ml del
tampón de borato pH 8,0.
Con el fin de proporcionar una medida
cuantitativa del alcance del acoplamiento del AcM a polilisina, se
marcó la polilisina tiolada con la sonda fluorescente de éster
succimidílico del ácido carboxílico Alexa 350 que se obtuvo de
Molecular Probes. Se preparó una disolución madre de DMSO y Alexa
350 10 mg/ml. Se añadieron setenta y cinco \mul de disolución
madre de Alexa 350 a 2 ml de muestra de polilisina tiolada preparada
anteriormente. Se incubó la muestra en la oscuridad a temperatura
ambiente durante 1 hora con agitación suave. Tras la incubación, se
transfirió la muestra a un tubo de centrífuga de vidrio de 30 ml y
se añadieron 18 ml de isopropanol. Se centrifugó la muestra durante
20 minutos a 9K RPM. Se eliminó el sobrenadante y se secó el
sedimento con una corriente suave de N_{2}. Se redisolvió la
muestra en de 100 a 200 \mul de agua. Se liofilizó la muestra con
el fin de obtener el peso de la muestra. Después de la determinación
del peso de la muestra, se disolvió la muestra en tampón NaP_{i}
(100 mM NaP_{i}, pH 7,0) a una concentración de 20 mg/ml.
Se realizó el acoplamiento de polilisina a
OVB-3 en la región de hidrato de carbono del AcM. Se
añadieron doscientos \mul de NaIO_{4} 300 mM en agua a 2 ml de
OVB-3 5 mg/ml en NaCl 150 mM, NaP_{i} 20 mM pH
7,5. Se incubó la muestra durante 1 hora a temperatura ambiente en
la oscuridad. Se añadió glicerol (200 \mul) para detener la
reacción de oxidación. Entonces de sometió la muestra a una columna
de desalación PD-10 de Sephadex G-25
que se equilibró con un tampón de acetato pH 5,0 (acetato de Na 100
mM, pH 5,0). Se reconcentró de nuevo la muestra hasta 2 ml usando
una celda de ultrafiltración con agitación de Amicon con filtro MWCO
30K.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se unió la polilisina tiolada al
OVB-3 oxidado con hidrato de carbono usando el
reticulador heterobifuncional MPBH (hidrazida del ácido
4-(4-N-maleimidofenil)butírico)
que se obtuvo de Pierce. Se añadieron cien \mul de una disolución
madre de MPBH y DMSO 80 mM a 2 ml de disolución
OVB-3 oxidado preparado anteriormente (acetato de
Na 100 mM, pH 5,0). La concentración de MPBH final fue 4 mM. Se
incubó la muestra durante 2 horas a temperatura ambiente en la
oscuridad con agitación suave. Entonces se hizo pasar la muestra por
una columna de desalación PD-10 de Sephadex
G-25 que se equilibró con un tampón P_{i} pH 7,0
(NaP_{i} 100 mM, pH 7,0). Se agruparon las fracciones de
OVB-3 de la columna y se añadieron 15 mg de
polilisina tiolada preparada anteriormente (NaP_{i} 100 mM, pH
7,0). Se incubó la muestra a temperatura ambiente durante al menos 3
horas. Se separó la polilisina tiolada sin reaccionar del conjugado
de polilisina y OVB-3 mediante filtración en gel
(Sephacryl-200 H) o una columna de proteína A
(columna de proteína A HiTrap de Pharmacia Biotech) usando un tampón
de TES pH 7,4 (NaCl 150 mM, TES 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4). Se
agrupó el conjugado de polilisina y OVB-3, se
reconcentró mediante ultrafiltración con agitación hasta una
concentración de disolución madre de aproximadamente 1 mg/ml, y se
almacenó en la nevera.
Se sembraron en placa células
OVCAR-3 a 2 x 10^{5} células por ml en placas de
96 pocillos en 0,1 ml por pocillo de RPMI 1640 con suero bovino
fetal inactivado por calor al 10%. Se dejaron crecer las células
durante dos días (aproximadamente 40-48 horas) antes
que se realizasen las transfecciones; en este punto las células
estaban en confluencia. En el caso de los liposomas dependientes del
pH descritos a continuación, se dejaron crecer las células durante
solamente un día antes de la transfección.
Se determinó el número de células en cuanto a la
actividad estearasa intracelular total lavando las células con
solución salina tamponada con fosfato (PBS), tiñendo con éster
acetoximetílico de azul de calceína (CBAM - 5 \muM en PBS durante
aproximadamente 30-45 minutos a temperatura
ambiente), y entonces aclarando las placas con PBS). Se añadieron
100 \mul/pocillo de disolución de detergente (C_{12}E_{8} al
1%, TE, pH 8) a cada pocillo. Se determinó el número de células en
un instrumento Cytofluor 2 determinando la fluorescencia de azul de
calceína (excitación a 360 nm, emisión a 460 nm, ganancia
normalmente a 80). Se lavaron de nuevo las placas 2 veces con
disolución de detergente y se leyeron de nuevo en la misma
disolución de detergente para la corrección del fondo. También se
leyeron una serie de pocillos control no marcados como blanco
interno. Se corrigieron todas las lecturas de fluorescencia de
transfección (EGFP) y unión a liposoma (rodamina) dividiendo entre
las lecturas de CBAM.
Se incubaron liposomas que comprendían de
aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 1% en moles de
N-(lisamina-rodamina
B-sulfonil)-fosfatidiletanolamina
con las células y se observó visualmente la fluorescencia de
ro-
damina y mediante la medición en un lector de placas Cytofluor II usando excitación de 560 nm y emisión
damina y mediante la medición en un lector de placas Cytofluor II usando excitación de 560 nm y emisión
\hbox{de 620 nm.}
El éxito de la transfección y la expresión del
ácido nucleico transfectado en una célula puede detectarse de
varias maneras, dependiendo esto generalmente de o bien la detección
de la presencia física del ácido nucleico en la célula, por
ejemplo, mediante incorporación de radionucleótidos en el ácido
nucleico, o bien detectando la expresión de la proteína codificada
por el ácido nucleico. Esto puede lograrse de varias maneras,
incluyendo, sin limitación, cuando la proteína es un marcador
detectable, por ejemplo, fluorescente, o cuando la proteína es un
marcador seleccionable, por ejemplo, de resistencia a agente
citotóxico.
Por ejemplo, el plásmido pEGFP-1
contiene una secuencia de ADN que codifica para la proteína verde
fluorescente mejorada, cuya presencia se detecta mediante
microscopía de fluorescencia o lector de placas de fluorescencia.
Por consiguiente, la transfección satisfactoria de células con este
plásmido se determina fácilmente evaluando la cantidad de
fluorescencia mostrada por las células. Se sometió a prueba la
actividad de transfección de las preparaciones liposómicas que
encapsulan a ADN del plásmido pEGFP-C1 tal como
sigue. Se prepararon disoluciones de transfección mediante dilución
de las muestras de ADN o liposoma apropiadas en el tampón o medio
deseado. Se aspiraron las placas paras eliminar el medio.
Se prepararon disoluciones de transfección (0,1
ml por pocillo para placas de 96 pocillos) mediante dilución de
muestras dializadas que contenían el plásmido
pEGFP-C1 en medio o tampón (aproximadamente 2 mM de
lípido total, a menos que se indique lo contrario) que contenía
suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (a menos que se
designe lo contrario), y entonces se añadieron a los pocillos y se
incubaron a 37 grados C durante 3 horas. Se aspiraron los pocillos,
y se añadió medio que contenía suero bovino fetal inactivado por
calor al 10% a cada pocillo. Debido al silenciamiento de transgenes
demostrado anteriormente con el promotor de CMV (Tang et al.,
1997; Dion et al., 1997) se incluyó un inhibidor de histona
desacetilasa, butirato de sodio 5 mM, en el medio para potenciar la
expresión.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Tras la incubación a 37 grados C en un incubador
de cultivo celular durante 18-22 horas, se aspiró el
medio y se añadió un lavado de 0,5 ml de PBS de Dulbecco. En este
punto o justo antes del lavado, se tomaron fotomicrografías de las
muestras todavía en las placas de cultivo tisular con un microscopio
invertido Olympus IMT-2 usando un objetivo de 10x.
Entonces se disolvieron las muestras en detergente y se tomaron
lecturas para fluorescencia de EGFP total corregida, en cuanto al
número total de células vivas, usando el ensayo AM de azul de
calceína que se describió anteriormente.
Se someten a ensayo las células para determinar
la actividad \beta-galactosidasa usando el kit de
detección de \beta-galactosidasa
quimioluminescente de Clontech según las instrucciones del
fabricante. En resumen, se centrifugan 200 \mul de células IP
lavadas a 1200 rpm durante dos minutos. Se elimina el sobrenadante
y se lisa el sedimento celular en 300 \mul de tampón de lisis
(fosfato de potasio 100 mM, pH 7,8 con Trition
X-100 al 0,2%, preparado tal como se describe por
Clontech) agitando con vórtex durante -30 segundos y agitando
suavemente durante 15 min. Entonces se elimina el residuo celular
mediante centrifugación a 14000 rpm durante 2 min. Se añaden 200
\mul de tampón de reacción a 45 \mul de lisado celular en placas
de 96 pocillos, se mezclan y se incuban durante 60 min. a
temperatura ambiente. Se lee la luminiscencia en un luminómetro de
microplacas (EG&G Berthold), registrando las señales luminosas a
intervalos de 5 segundos.
Se adquirieron
N-(lisamina-rodamina
B-sulfonil)-fosfatidiletanolamina
(transesterificado de PC de huevo), DOPC, EPC y
N-C12-DOPE de Avanti Polar Lipids
(Alabaster, AL). Se adquirieron células de carcinoma de ovario
OVCAR3 de NCI-Frederick Cancer Research Laboratory
(Frederick, MD). Se adquirieron el plásmido
pEGFP-C1, y células competentes DH5\alpha de
E. coli de Clontech Laboratories (Palo Alto, CA). Se
adquirieron plásmido pZeoSVLacZ, células competentes y S.O.C. de
Hanahan de Invitrogen (San Diego, CA). Se adquirieron solución
salina equilibrada de Hank (HBSS), RPMI 1640 y suero bovino fetal
inactivado por calor de Gibco/BRL (Grand Island, NY). Se
adquirieron ARNasa sin ADNasa y ADNasa I sin ARNasa de Boehringer
Mannheim (GmbH, Alemania). Se adquirió agarosa de FMC Bioproducts
(Rockland, ME). Se adquirieron Bacto agar, Bacto triptona y extracto
de levadura de DIFCO Laboratories (Detroit, MI). Los colorantes
éster acetoximetílico de azul de calceína (CBAM), PicoGreen y
SybrGreen I provenían de Molecular Probes (Eugene, OR). Se
obtuvieron una polilisina-transferrina (pKT) y
polilisinas libres de Sigma (St. Louis, MO). pKT consiste en una
poli-L-lisina de
30-70 kDa acoplada a holotransferrina humana de modo
que hay aproximadamente 3 moléculas de transferrina por polilisina.
También hay un grupo isotiocianato de fluoresceína (FITC) en cada
conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización de la invención de suministro
modular, se diseñaron liposomas para invertir la carga en un cambio
desde pH 7 hasta un pH inferior encontrado en orgánulos celulares
tales como endosomas. Para determinar si los conjugados de
direccionamiento/protección se unirían establemente a liposomas en
condiciones de pH fisiológico y se liberarían de tales liposomas en
condiciones tales como pH inferior, se llevó a cabo el siguiente
experimento. Se preparó el liposoma en primer lugar mezclando POPE:
DOPC:DODAP:colesterol:hemisuccinato de colesterilo:acetato de
oleoílo (51:12,2:10,7:10,7:2,6:12,8:10,7) en cloroformo. Se
encapsuló plásmido EGFP, condensado con espermina, durante la
preparación de liposomas según el método de emulsión de dos etapas
(ejemplo 1). Se usó sacarosa 300 mM como tampón de dilución de
plásmido y espermina. Se usó sacarosa 300 mM en el tampón de
hidratación inicial para facilitar la separación de los liposomas
del grueso del tampón mediante centrifugación. Se dializó la
preparación de liposomas final frente a PBS antes de su uso. La
concentración de lípido final fue -20 mM.
Se unieron los complejos de proteína de
direccionamiento a células a la superficie externa de los liposomas
que contienen plásmido a través de interacciones no covalentes. A pH
7,4, los liposomas tienen una carga negativa neta que proporciona
una superficie de unión para proteínas cargadas positivamente o
restos unidos a polipéptidos cargados positivamente (pKT,
pK-OVB3-Ac). Se estimó el número de
liposomas en una alícuota de 200 \mul suponiendo una
concentración de lípido total de 20 mM y un diámetro de liposoma de
150 nm. Se comprobaron razones de 1-5 complejos de
proteína por liposoma. Se prepararon disoluciones madre de proteína
(pKT marcada con FITC, pK-OVB3) a una concentración
de 0,5 mg/ml en PBS, pH 7,4. Entonces se diluyó una alícuota que
contenía la cantidad de proteína deseada en 200 \mul de PBS. Para
un ensayo de unión a proteína convencional, se añadió gota a gota
la disolución de proteína a la disolución de liposoma con agitación
continua. Se mezclaron volúmenes iguales de disolución de proteína
con los liposomas a razones en moles de modo que la carga global del
conjunto de liposoma-proteína permaneció negativa.
Se incubó la mezcla de proteína/liposoma a temperatura ambiente
durante 15-30 min. y entonces se separó en dos
alícuotas de igual volumen. Se disminuyó el pH de una alícuota
hasta pH 5 mediante adición de HCl, seguido por incubación a
temperatura ambiente durante 15 min. adicionales. Se separaron
liposomas y proteína unida de la proteína libre mediante
centrifugación a 14.000g durante 30 min. Se resupendieron los
sedimentos de liposomas en PBS y el pH de todos los sobrenadantes
volvió a pH 7,4 con adición de NaOH antes del análisis. Se midieron
los niveles de proteína en el sobrenadante usando el ensayo de
proteína Coomassie de Biorad para
pK-OBV3-Ac. Para el pKT marcada con
FITC, se midió la fluorescencia para cada fracción (Ex: 485, Em:
530). Se usaron como controles liposomas sin ligando añadido y
disoluciones de proteína sin liposomas añadidos.
La tabla 1 muestra los resultados de la unión
dependiente del pH de pKT a dos concentraciones, 2 ó 5 complejos de
pKT por liposoma. (Nota: la mitad de la neutralización de la carga
negativa liposómica se produciría con \sim3 pKT unidas). A pH 7,4
prácticamente toda la proteína sedimentó con la fracción de liposoma
durante la centrifugación a ambas concentraciones de pKT. Cuando se
disminuyó el pH hasta 5, se encontró una diferencia entre las
muestras. A una razón molar de pKT/liposoma de 2, todo el pKT
permanecía asociado con el liposoma incluso a pH bajo. A la mayor
razón de pKT/liposoma, una fracción del pKT se disoció completamente
del liposoma a pH 5 y permaneció en el sobrenadante tras la
centrifugación. Estos resultados sugieren que pueden existir dos
tipos de sitios de unión para pKT en el liposoma: un sitio de
afinidad superior que no es dependiente de pH y se une a hasta dos
complejos de ligando por liposoma y un sitio de afinidad inferior en
el que el complejo de proteína puede engancharse o desengancharse de
la superficie del liposoma mediante un cambio en el pH.
La mayoría de la pKT (\sim80%) permanece unida
a estos liposomas en el 20% de suero, y una cantidad significativa
permanece unida hasta el 40% de suero. Esta cantidad de ligando de
direccionamiento es suficiente para proporcionar una unión celular
específica a través de un receptor de transferrina.
La tabla 1 muestra también la unión dependiente
del pH de 3K-polilisina conjugada a un anticuerpo al
antígeno de OVB3, que se encuentra en células de cáncer de ovario
(pK-OVB3). De manera análoga al estudio de pKT, se
unieron 2 ó 5 complejos de
pK-OVB3-Ac a través de interacciones
electrostáticas por liposoma cargado negativamente. Se separaron los
liposomas y el ligando de direccionamiento unido de la proteína
soluble no unida mediante centrifugación. La cantidad de
pK-OVB3-Ac no unido en los
sobrenadantes aumentó significativamente cuando se disminuyó el pH
desde 7,4 hasta 5 (\sim30% de aumento a una razón en moles de
pK-OVB3-Ac/liposoma de 2, y
\sim50% de aumento a una razón en moles de 5).
Tomados juntos, estos resultados demuestran que
estos liposomas se unen a una variedad de ligandos de
direccionamiento por medio de un ligador catiónico a pH neutro. A pH
bajo, la afinidad del complejo de ligando puede variar con la
polivalencia del catión, y al menos algo del complejo de
direccionamiento debe disociarse del liposoma a pH bajo. A pH 5, tal
como en el compartimiento endosómico o liposómico, la carga en el
hemisuccinato de colesterol debe cambiar de negativa a neutra, y
DODAP debería volverse totalmente cargado, dando como resultado una
superficie de membrana con carga neta positiva. Esta superficie
tendría menor afinidad a la polilisina cargada positivamente.
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\vskip1.000000\baselineskip
Existen muchos factores que influyen en el
tiempo de vida en circulación de los liposomas in vivo. Un
aspecto crítico es la unión/activación del factor C3 del complemento
mediante los liposomas (véanse Semple, et al. (1998) Advanced
Drug Delivery Reviews 32:3-17 y Devine y Bradley
(1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:19-29 para
revisiones); la activación de C3 aumentó enormemente el aclaramiento
de liposomas de la sangre. Se sometió a prueba el efecto de los
complejos de direccionamiento modular en la activación de C3
mediante liposomas usando la formulación sensible al pH.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió a prueba la capacidad de los
liposomas para unirse al componente C3 del complemento mediante una
modificación del ensayo de hemólisis in vitro de Devine et
al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1191:43-51 y
Ahl et al. (1997) Biochim. Biophys. Acta
1329:370-382. En resumen, se lavaron eritrocitos de
oveja sensibilizados con anticuerpos (todos los reactivos provenían
de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, a menos que se indique) y se
resuspendieron tal como se indica por el fabricante. Se hidrató
complemento de sueros de rata en agua, entonces se diluyó 2 veces
con tampón GVB^{2+}. Se mezclaron 200 \mul de liposomas, con o
sin ligando de direccionamiento unido
(polilisina-transferrina,
polilisina-anti-OVB3-IgG
o polilisina-PEG-folato) con 100 ml
de sueros de rata diluidos y se incubaron a 37ºC durante 30 min. con
agitación continua. Se añadieron 300 \mul de tampón GVB^{2+} y
se sedimentó cualquier agregado de liposomas mediante
centrifugación. Entonces se hicieron ocho diluciones de 2 veces
sucesivas, en tampón GVB^{2+}, para cada muestra. Se añadieron 100
\mul de los eritrocitos de oveja hasta un volumen igual de cada
dilución de liposoma/sueros y se incubaron durante 30 min. a 37ºC
con agitación. Se detuvo la hemólisis adicional añadiendo tampón de
GVB-EDTA. Entonces se sedimentaron los glóbulos
rojos intactos y fragmentos de membrana, y se midió la absorbancia
del sobrenadante a 415 nm. El tampón de GVB^{2+} sirvió como
control negativo para la unión a C3, y se consideró que la
absorbancia de un volumen igual de glóbulos rojos lisados de manera
osmótica era el 100% de la hemólisis.
Se generaron las curvas de hemólisis mediada por
C3 para los liposomas con inversión de carga con y sin ligando de
direccionamiento unido. Los liposomas con inversión de carga solos
dieron un perfil de hemólisis muy similar al del control de tampón,
sugiriendo poco o nada de activación de C3 por estos liposomas.
Cuando se añadió el complejo de direccionamiento, el perfil de
hemólisis fue similar al de la curva de solamente liposoma para los
tres módulos de direccionamiento sometidos a prueba. Se determinó la
disminución de CH50 con respecto al tampón a partir de los ajustes
lineales de la parte central de las curvas de hemólisis mediante el
método descrito por Ahl et al. Estos resultados se muestran
en la tabla 2. Se encontraron disminuciones mucho menores
(3,3-7%) en los valores de CH50 para los liposomas
sensibles a pH con y sin ligando de direccionamiento unido. Estos
valores son significativamente inferiores a los observados por Ahl,
et al. (1997) para liposomas que se aclararon rápidamente de
la circulación de las ratas. También son inferiores a los valores
encontrados por los investigadores para liposomas no aclarados
completamente de la circulación en la primera hora.
Estos resultados sugieren que la presencia de
moléculas de direccionamiento unidas no aumenta significativamente
la cantidad de activación de C3 mediada por liposoma. Esta ausencia
de activación de C3 puede dar como resultado un aumento del tiempo
en circulación para estos vectores de liposoma.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se hicieron crecer células
OVCAR-3 de NIH tal como en el ejemplo 3 durante -24
h antes de que se realizasen los ensayos de transfección. Se
mezclaron alícuotas de liposomas sensibles a pH que contenían
plásmido pEGFP-C1 con una cantidad deseada de
ligando de direccionamiento en PBS y se incubaron a temperatura
ambiente durante 15 min. Se diluyó la muestra 5 veces en RPMI con o
sin SBF inactivado por calor y se añadieron 5 \mul de una
disolución de CaCl_{2} 50 mM/MgCl_{2} 20 mM por 0,5 ml de
liposomas y se mezcló. Se añadieron 90 \mul de disolución de
liposomas a células lavadas con PBS en cada pocillo y se incubó
durante -5 h a 37ºC. Se eliminó la disolución de transfección, se
lavaron las células con PBS, entonces se dejó incubar durante
24-36 h en RPMI complementado con SBF inactivado por
calor al 10% y butirato de sodio 5 mM.
Se determinó cualitativamente la expresión de
transgén de EGFP viendo las células todavía en la placa de cultivo
mediante microscopía de epifluorescencia y cuantitativamente leyendo
la intensidad de fluorescencia de cada pocillo tras el lisado de
las células en detergente C12E8 al 1% usando un lector de placas
Cytofluor-4000 de PE Biosystems (Ex: 485, Em: 530)
tal como en el ejemplo 3. Se midió la viabilidad celular mediante un
ensayo de fluorescencia enzimático. Antes de la lisis, se incubaron
las células durante 40 min. en AM azul de calceína 25 \muM
(Molecular Probes). Se midieron las intensidades de fluorescencia
del producto de hidrólisis de azul de calceína (Ex: 360, Em: 460)
durante la misma serie que las lecturas de EGFP. Para la comparación
entre condiciones, se corrigió la expresión de transgén para el
número de células dividiendo la lectura de EGFP entre la lectura de
azul de calceína para cada pocillo.
Se sometió a prueba la capacidad de los
liposomas que se pueden activar con el pH de transfectar células
in vitro en células Ovcar3. Se sometieron a prueba tres
ligandos de direccionamiento (pKT, pK-OVB3 y FPK) a
1, 3 ó 5 complejos de proteína por liposoma. La formulación de
liposoma, sola o en combinación con los ligandos de
direccionamiento, mostraron una pequeña cantidad de toxicidad
celular. Los niveles de azul de calceína fueron aproximadamente el
20% inferiores para los pocillos incubados con los liposomas que
contenían plásmido que para las células no tratadas o células
incubadas durante la noche en medios con butirato de sodio pero sin
liposomas. La cantidad o el tipo de resto de direccionamiento no
alteraron significativamente el nivel de azul de calceína
medido.
En primer lugar se evaluó cualitativamente la
expresión de transgén mediante microscopía de epifluorescencia. La
figura 1 muestra fotomicrografías representativas de células Ovcar3
transfectadas con los liposomas sensibles a pH con inversión de
carga con plásmido pEGFP-C1 encapsulado. Sin ligando
de direccionamiento unido, se observaron pocas células, pero
claramente visibles cargadas con EGFP (figura 1a). Con la adición de
pKT, el número de células que mostraba fluorescencia verde aumentó
(figura 1b). El número absoluto de células transfectadas varió algo
de un experimento de transfección a otro. Sin embargo, la cantidad
relativa de transfección, cuando se compraran diferentes restos de
direccionamiento, concordaba entre experimentos. Se obtuvieron
resultados similares con ligandos pK-OVB3 y FPK.
Se determinaron cuantitativamente los efectos de
cantidades crecientes de resto de direccionamiento celular para
ligandos pKT o FPK. Los resultados se muestran en la figura 2. Se
corrigió la cantidad de expresión de transgén para el número de
células dividiendo la lectura de fluorescencia de EGFP entre la
lectura de azul de calceína para cada pocillo tras restar el fondo.
Entonces se multiplicó este valor por 1000 para la representación.
Se encontró un aumento en la expresión de transgén con concentración
de ligando creciente para los tres agentes de direccionamiento de
unión. Una expresión de transgén más alta para la serie de pKT,
puede simplemente reflejar el aumento del número de ligandos de
direccionamiento por complejo de proteína. pKT tiene 3 transferrinas
por cadena de polilisina en la que
polilisina-PEG-folato tiene 1
ligando por cadena de polilisina. Se detuvo la titulación del
complejo de direccionamiento a una razón en moles de
proteína:liposoma de 5:1 para mantener la carga global de los
liposomas con pKT y pK-folato negativa a pH 7,4.
Como control, se usó polilisina 30K pura como ligando de
direccionamiento a una razón de proteína:liposoma de 3:1. La
cantidad de transfección fue similar a la de sin ligando.
Los liposomas de
N-acil-PE fusogénicos están cargados
negativamente a pH neutro como lo están los liposomas con
neutralización de carga. La densidad de carga de los liposomas de
N-acil-PE disminuye a pH inferior, pero no se
invierte completamente. Sin embargo, la neutralización parcial
también puede permitir algo de relajación o intercambio de
conjugados electrostáticamente unidos a pH bajo. En el ejemplo 8 se
proporcionan resultados y discusión adicional.
Se prepararon liposomas compuestos por un 70% de
NC12DOPE y un 30% de DOPC que encapsulaban espermina y el plásmido
pEGFP-C1 como en el ejemplo usando el método de
emulsión de dos etapas seguido de sedimentación y lavado de los
liposomas para eliminar el ADN externo. Se mezcló una disolución
madre de liposomas 20 mM en concentración de lípido total con la
cantidad apropiada de una disolución madre 340 \muM de conjugado
de
folato-PEG-glutaril-protamina
(FPGPr) o un derivado control en el que el grupo folato se sustituyó
por un grupo acetilo (AcPGPr). Se diluyó la mezcla con solución
salina tamponada de Hank (HBSS) sin Ca^{2+} o Mg^{2+} hasta
alcanzar una concentración de lípido total de 4 mM y se añadió suero
bovino fetal inactivado por calor hasta una concentración final del
10% (v/v). Para ajustar las concentraciones de Ca^{2+} y Mg^{2+}
hasta cerca de los niveles fisiológicos esperados, se añadió una
disolución madre de CaCl_{2} 60 mM y MgCl_{2} 40 mM a 20 \mul
por ml de disolución de liposomas justo antes de colocar los
liposomas en los pocillos vacíos de las placas de cultivo tisular de
96 pocillos. Se prepararon placas y se llevaron a cabo análisis de
transfección tal como en el ejemplo 3.
Los datos se muestran en la figura 3. Los
conjugados de folato potenciaron en gran medida la eficacia de
transfección de los liposomas, mientras que un conjugado control que
llevaba sólo un grupo acetilo no lo hizo. Estos datos demuestran que
la transfección mediante estos liposomas se potencia mediante
conjugados de estabilización/direccionamiento electrostáticamente
unidos y que el efecto depende de la presencia de folato en el
conjugado. Esto sugiere que se utiliza un receptor de folato.
Se prepararon liposomas tal como se describieron
en el ejemplo 7 para su asociación con varios conjugados que
contienen folato, PEG y un grupo cargado positivamente para su
interacción con la membrana. Estos conjugados eran
folato-PEG-protamina con un ligador
de glutarilo (FPGPr),
folato-PEG-polilisina con un ligador
de glutarilo (FPGK) y
folato-PEG-polilisina (FPK)
sintetizado tal como se describió en la sección ensayos y métodos.
También se sintetizó un derivado de
folato-PEG-fosfatidiletanolamina
(FPPE) para su comparación con los conjugados que interaccionan
mediante interacción electrostática. El derivado de FPPE se inserta
en la membrana liposómica y se mantiene allí mediante interacciones
hidrófobas fuertes. Los otros derivados se unen a los liposomas
mediante una interacción electrostática y pueden disociarse
potencialmente en el endosoma de modo que puede exponerse la
membrana fusogénica. El FPPE no puede disociarse tan fácilmente. La
disociación es importante para eliminar el gran resto de
direccionamiento que contiene PEG para que pueda producirse la
fusión de membranas.
Se prepararon liposomas tal como se describió en
el ejemplo 3, que contenían sacarosa 200 mM con espermina y ADN.
Tras sedimentar y lavar para eliminar ADN externo, se asociaron los
diversos conjugados con los liposomas. Para los liposomas que
contenían FPPE, se incorporó FPPE en los liposomas al 2,5% en moles
del fosfolípido total. Se añadieron los conjugados FPGK, FPK y
FPGPr a la lámina externa de los liposomas a una concentración que
también era del 2,5% en moles del fosfolípido externo. Se añadieron
tampón, suero y cationes divalentes a las muestras tal como se
describió en el ejemplo 7 antes de la adición a células
OVCAR-3 en placas de 96 pocillos. La concentración
de lípido total final fue de 4 nM. Tras incubaciones tal como se
describieron en el ejemplo 7, se determinó la fluorescencia verde
debida a la expresión de EGFP tal como se describió en el ejemplo
3.
La figura 4 muestra la comparación entre los
diversos conjugados en la que los conjugados electrostáticamente
unidos eran mucho más activos que el conjugado FPPE covalentemente
unido. Se obtuvieron resultados similares en los que se compararon
tres preparaciones separadas de los liposomas que contenían FPPE con
el conjugado FPGPr. También se comparó el conjugado FPGPr con el
conjugado FPPE a un porcentaje en moles inferior en la membrana
(0,4% en moles). En este caso, se obtuvo un resultado similar, es
decir, que el conjugado de FPPE no mostró actividad de transfección,
mientras que el conjugado electrostático mostró actividad
sustancial. El conjugado de FPPE no era totalmente inactivo ya que
mostró algo de potenciación de la actividad de transfección con el
sistema liposómico con inversión de carga (ejemplos
4-6) a un porcentaje en moles muy bajo (inferior al
0,1% en moles).
Otra realización del concepto de
estabilización/direccionamiento modular implica un anticuerpo frente
a células de cáncer de ovario denominado OVB-3
acoplado a ligadores como en el ejemplo 2.
Se encontró que el conjugado
pK-OVB-3 se unía a liposomas
aniónicos, pero no a liposomas zwitteriónicos, indicando la
naturaleza electrostática de la unión. Esto se demostró con más de
un tipo de liposoma aniónico (datos no mostrados).
Se examinó el efecto de la unión del módulo de
direccionamiento pK-OVB-3 sobre la
integridad de los liposomas mediante
NBD-fosfolípidos fluorescentes. Se obtuvo
fosfatidiletanolamina marcada con NBD (marcador de grupo principal,
transesterificada a partir de PC de huevo) de Avanti Polar Lipids
(Alabaster, AL) y se incorporó en liposomas de
N-acil-PE (ejemplo 1) al 0,5% en moles de
lípido total. Se ha mostrado que el ión ditionito que no puede
pasar a través de la membrana reduce rápidamente el
NBD-fosfolípido en la monocapa lipídica externa
para dar una forma no fluorescente. El
NBD-fosfolípido restante en un liposoma sellado sólo
puede reducirse tras la adición de un detergente. La adición de
ditionito de sodio 20 nM a liposomas de
N-C12-DOPE/DOPC (7:3) marcados con
NBD-fosfolípido que contenían ADN encapsulado
(preparados como en el ejemplo 1) disminuyó rápidamente el nivel de
fluorescencia de NBD a partir de la monocapa externa tal como se
muestra en la figura 5. Una reducción aproximada del 50% indica que
se encuentra una única membrana de bicapa en la mayoría de los
liposomas. La adición de detergente redujo el
NBD-fosfolípido restante en la monocapa interna de
los liposomas disolviendo los liposomas. La unión del conjugado
pK-OVB3 a estos liposomas no tuvo efecto
significativo sobre la magnitud o el transcurso de tiempo de la
reducción del NBD-fosfolípido por ditionito de
sodio. Esto indica que la unión del conjugado a la superficie de los
liposomas no desestabilizó ni alteró significativamente la
estructura básica de estos liposomas fusogénicos.
Se prepararon liposomas con módulos de
direccionamiento pK-OVB-3 incubando
liposomas cargados negativamente con el conjugado
pK-OVB-3 durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Durante esta incubación, esencialmente todos
los módulos de direccionamiento
pK-OVB-3 se unen electrostáticamente
a la superficie de los liposomas aniónicos. Se prepararon liposomas
con módulos de direccionamiento
pK-OVB-3 a razones de conjugado con
respecto a lípido que oscilaban desde 0 hasta 100 \mug de
proteína por \mumol de lípido. Entonces se incubaron
inmediatamente estos liposomas recubiertos con
pK-OVB-3 con células
OVCAR-3 a una concentración de lípidos de 1 mM
durante 1,5 horas a 37ºC en presencia de suero de ternero fetal
inactivado por calor al 10%. Se hicieron crecer las células
OVCAR-3 en placas de 96 pocillos Costar durante
aproximadamente 24 horas comenzando a una concentración de células
de 2X10^{4} células por pocillo. Tras esta incubación, se lavaron
exhaustivamente las células OVCAR-3 mediante
aspiración para eliminar liposomas no asociados. Se marcaron los
liposomas con el 0,2 por ciento en moles del lípido fluorescente
rodamina-DOPE para seguir la captación de liposomas
en un lector de placas fluorescentes (560 \pm 10 nm de excitación,
520 \pm 20 nm de emisión). La figura 6 muestra que el aumento de
la cantidad de módulo de direccionamiento
pK-OVB-3 unido a la superficie de
liposomas de N-C12-DOPE/DOPC (razón molar de
7:3) aumenta significativamente el nivel de captación por células
OVCAR-3 de estos liposomas en presencia de suero al
10%.
Se realizó una serie de experimentos de
transfección para someter a prueba el efecto de los conjugados de
anticuerpos. Se prepararon los conjugados
pK-OVB-3 tal como se describió
anteriormente. Se preparó tal como se describió anteriormente una
disolución madre de conjugado de
polilisina-anticuerpo OVB-3 (conc.
de 0,5 mg/ml), un conjugado de una polilisina 3K con el anticuerpo
OVB-3.
Se prepararon liposomas de
N-C12-DOPE/DOPC (70/30) para encapsular el
plásmido pEGFP-C1, espermina y sacarosa tal como se
describió en el ejemplo 1 y se sedimentaron y lavaron tal como se
describió en el ejemplo 1. Se hicieron crecer células
OVCAR-3 en placas de 96 pocillos tal como se
describió en el ejemplo 3.
Todos los experimentos de transfección fueron
con células OVCAR-3 en cultivo tisular, tal como se
describió anteriormente. Se añadieron directamente cantidades
variables del conjugado de OVB-3 a una disolución
madre de liposomas 40 mM y se diluyó sin calcio o magnesio. La
concentración de lípido total final fue de 4 mM para todas las
muestras. Se añadió suero bovino fetal inactivado por calor al 10% a
cada muestra. Se añadieron 20 \mul de una disolución madre de
Ca/Mg 60/40 mM a cada ml de la disolución de liposomas justo antes
de su adición a las placas de cultivo tisular. Se realizaron los
experimentos por cuadriplicado.
Se incubaron liposomas para la transfección de
células OVCAR-3 tal como se describió anteriormente.
Se sometieron a ensayo el número de células total y la actividad de
transfección mediante mediciones de fluorescencia tal como se
describió anteriormente.
Los resultados se muestran en la figura 7. En la
figura 7, se representó gráficamente la fluorescencia de EGFP
corregida para el número de células total mediante la lectura de
azul de calceína frente a la concentración del conjugado de
OVB-3-polilisina. Se muestran en la
figura 8 las fotomicrografías de fluorescencia correspondientes. Tal
como puede observarse en las figuras, el conjugado de
anticuerpo-polilisina potencia en gran medida la
eficacia de transfección en suero al 10%.
El anticuerpo monoclonal OVB-3
tenía un nivel relativamente alto de unión a células
OVCAR-3, mientras que la unión de IgG de suero de
ratón no específica a células OVCAR-3 era
relativamente insignificante. Se prepararon liposomas de
N-C12-DOPE/DOPC (razón molar de 7:3) que
encapsulaban plásmidos con módulos de direccionamiento de
pK-IgG de suero de ratón o pK-OVB3
tal como se describió anteriormente. No hubo diferencia
significativa en el nivel de incorporación de polilisina para los
dos conjugados de anticuerpos. La razón de conjugado con respecto a
lípido para ambas preparaciones de liposomas era de 12,5 \mug de
proteína por \mumol de lípido. Entonces se incubaron los
liposomas fusogénicos con células OVCAR-3 durante 3
horas a 37ºC a 4 mM de lípido en suero inactivado por calor al 10%.
Se sustituyó este medio por medio de crecimiento y se permitió que
las células crecieran durante la noche. Se determinó la expresión
transgénica de GFP mediante fluorescencia de GFP (485 \pm 10 nm
de excitación, 530 \pm 12 nm de emisión) y normalizó para el
número total de células vivas usando un ensayo de fluorescencia AM
de azul de calceína. El módulo de direccionamiento preparado con
anticuerpo monoclonal OVB-3 específico para
OVCAR-3 aumentó significativamente la expresión
transgénica de GFP de liposomas de
N-C12-DOPE/DOPC (razón molar de 7:3) en
relación con liposomas no dirigidos control, mientras que el
conjugado de IgG de ratón no específica-pK no
produjo ningún aumento significativo en la expresión transgénica.
Las cantidades relativas de expresión transgénica (normalizada hasta
100 para los resultados de OVB-3) fueron de 100
\pm 21 para el sistema dirigido por OVB-3 frente a
23 \pm 5 para el sistema sin direccionamiento y 20 \pm 15 para
los liposomas dirigidos por IgG no específica. Esto demuestra las
características específicas de diana del módulo de direccionamiento
OVB-3-pK.
Se prepararon liposomas con aproximadamente un
1% en moles de
lisamina-rodamina-fosfatidiletanolamina
como sonda de membrana fluorescente.
Se incubaron liposomas preparados tal como se
describió en el ejemplo 1 (NC12-DOPE/DOPC 70/30) con
concentraciones variables de polilisina transferrina (pKT). Se
preparó la pKT como una disolución de 1 mg/ml en solución salina
tamponada de Hank (HBSS) sin Ca o Mg. Dado que la agregación de los
liposomas se produjo a una razón de aproximadamente 0,3 g de
conjugado (pKT)/mmol de fosfolípido total (el intervalo esperado
para la neutralización de cargas en la superficie externa del
liposoma para los liposomas de esta composición), las razones de
pKT/liposoma se mantuvieron por debajo de este intervalo para las
investigaciones.
Con el fin de determinar si el conjugado de pKT
afectaba a la unión de liposomas a células tumorales de cáncer de
ovario OVCAR-3, se incubaron células hechas crecer
en placas de 96 pocillos con liposomas con y sin el conjugado de
pKT unido electrostáticamente al liposoma. Se usó en todas las
muestras una razón de aproximadamente 0,2 g de pKT/mmol de lípido.
Se incubaron las células con liposomas a 0,1 mM, 1,0 mM, 5 mM y 15
mM de lípido total en presencia y ausencia de suero (FBS inactivado
por calor al 10%) para determinar el efecto del suero sobre la
unión de los liposomas a las células. Se prepararon las disoluciones
de unión añadiendo los materiales en el siguiente orden: liposomas,
pKT, tampón, suero, en el que el tampón es HBSS sin Ca^{2+} o
Mg^{2+}. Justo antes de la adición de las disoluciones a las
células, se añadieron Ca^{2+} y Mg^{2+} para ajustar las
concentraciones globales hasta 1,2 y 0,8 mM respectivamente. A la
terminación del periodo de incubación, se aspiraron los pocillos,
se aclararon para eliminar liposomas no unidos y se determinó la
unión mediante la cantidad de fluorescencia de rodamina unida a las
células. Los resultados se muestran en la figura 9. Los liposomas
que no tenían polilisina transferrina unida a su bicapa mostraron
una unión limitada a la superficie celular cuando se incubaron en
presencia de suero. Sin embargo, cuando los liposomas tenían
polilisina transferrina unida a su superficie, la unión a las
células aumentó significativamente. En ausencia de suero, el
conjugado de polilisina transferrina tenía poco efecto sobre la
unión de liposomas a células OVCAR-3. Las proteínas
séricas inhiben significativamente la unión de liposomas a las
células. El conjugado de transferrina
pK unido a los liposomas redujo o eliminó la inhibición inducida por el suero de la unión de liposomas a las células.
pK unido a los liposomas redujo o eliminó la inhibición inducida por el suero de la unión de liposomas a las células.
Queda claro a partir de los resultados que la
adición de pKT potencia en gran medida la unión de liposomas a estas
células. Además, la pKT parece reducir o eliminar la inhibición por
el suero de la unión de liposomas.
Se prepararon liposomas de
N-C12-DOPE/DOPC que contenían liposomas - ADN
de plásmido de pEGFP condensado con espermina y se marcaron mediante
el 0,5% en moles de
lisamina-rodamina-fosfatidiletanolamina.
En un experimento, se prepararon liposomas cargados de sacarosa
mediante inclusión de sacarosa 200 mM en el tampón con ADN y el
tampón con espermina. Tras la eliminación del disolvente orgánico y
la formación de liposomas y la dilución en tampón de sacarosa 300
mM, se extruyeron los liposomas y se dializaron en solución salina
tamponada de Hank sin Ca^{2+} ni Mg^{2+} (HBSS). Entonces se
sedimentaron los liposomas, se lavaron y se resuspendieron a dos
veces la concentración normal en HBSS, es decir, hasta una
concentración de lípidos final de aproximadamente 40 mM. Se diluyó
esta disolución madre hasta 20 mM y se usó para experimentos en
placas de 96 pocillos.
Tal como se describió en el ejemplo 3, se
sembraron placas de 96 pocillos con células OVCAR-3
a 2x10^{5} células/ml de medio (RPMI 1640 con suero bovino fetal
al 10%) dos días antes de los experimentos de transfección. Se
realizaron transfecciones, tal como se describió en el ejemplo 3,
evacuando los pocillos y añadiendo 100 \mul/pocillo de las
disoluciones de transfección premezcladas deseadas e incubando a
37ºC durante 3 horas. En este punto, se eliminaron las disoluciones
de transfección y se añadieron 100 \mul/pocillo de medio RPMI 1640
con FBS al 10% y butirato de sodio 5 mM. Tras la incubación durante
la noche a 37ºC, se trataron las placas para el ensayo fluorescente
de transfección tal como se describió en el ejemplo 1. Se lavaron
las placas 2x con la misma disolución de detergente y se leyeron de
nuevo en la misma disolución de detergente. Se corrigieron todas las
lecturas de EGFP dividiendo las lecturas de CBAM entre la actividad
esterasa celular total.
En paralelo, se realizó un conjunto de
experimentos usando liposomas vacíos marcados con un derivado de
lisamina-rodamina-PE (ex. a 560 nm,
em. a 620 nm). Éstos eran los mismos liposomas descritos en el
ejemplo 1. Los liposomas sirvieron como indicadores de unión
liposómica en diversas condiciones y como controles, especialmente
en los casos en los que se usó pKT. En el último caso, el marcaje
con fluoresceína de la pKT es una posible interferencia en las
lecturas de EGFP para la transfección, y se hicieron correcciones
apropiadas en algunos casos. En comparación con los liposomas que
contenían plásmido de EGFP, el nivel de marcaje con rodamina fue
superior y el diámetro fue ligeramente más pequeño para estos
liposomas.
Todos los experimentos, incluidos experimentos
de unión, se realizaron de la manera de un experimento de
transfección, es decir, una incubación de 3 horas con liposomas,
seguido por incubación durante la noche con medio que contiene
butirato y suero.
Se realizaron comparaciones a una única
concentración de liposomas y en FBS al 10%, mientras que se variaban
otros componentes. El orden de adición de los materiales fue tal
como se indica a continuación. El "tampón" añadido fue HBSS sin
Ca/Mg en todos los casos. Se añadieron Ca^{2+} y Mg^{2+} al
final tal como se describió anteriormente. Las disoluciones madre de
liposomas eran de aproximadamente 20 mM de lípido total.
Los resultados se muestran en la figura 10. La
figura 10 demuestra que pKT potencia la unión de liposomas a células
y la transfección de una manera dependiente de la dosis. En la
figura 11, fotografías de los mismos experimentos también demuestran
el efecto de pKT, en las que la fluorescencia roja indica lípidos
liposómicos y la fluorescencia verde la expresión del gen
suministrado.
Se investigó adicionalmente en este ejemplo el
efecto de un anticuerpo anti-transferrina. Se
prepararon liposomas y ensayos tal como se describió en los ejemplos
1 y 3. Se realizaron comparaciones a 1 mM de lípido total, pkT 0,2
mg/ml y en FBS al 10% (siempre inactivado por calor como en todos
los ejemplos previos). Las muestras también contenían o bien
anticuerpo anti-transferrina 1,4 mg/ml (Sigma, St.
Louis) o bien IgG bovina no específica 1,4 mg/ml (Sigma, St. Louis).
Se añadieron los materiales en el orden descrito en el ejemplo 7
para preparar disoluciones madre para su adición a pocillos de
cultivo tisular. Se añadieron Ca^{2+} y Mg^{2+} al final como en
el ejemplo 7.
Se tomaron fotografías el día después de la
incubación de transfección y los resultados se muestran en la figura
12.
La figura 12 muestra claramente que el
anticuerpo anti-transferrina inhibió la transfección
mediante los liposomas. Por tanto, parece que este anticuerpo inhibe
la transfección mediada por el conjugado de
polilisina-transferrina, aunque la unión del
liposoma a las células no se inhibe fuertemente.
De manera notable, la polilisina sola a una
concentración aproximadamente igual a la concentración de pKT no
medió ni la unión ni la transfección de liposomas (véase el ejemplo
13). Por tanto, parece que la molécula de transferrina desempeña
algún papel en la unión de los liposomas a las células, e
indudablemente desempeña un papel en la potenciación de la
transfección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon los conjugados de
OVB-3-polilisina tal como se
describió anteriormente. Se añadió el
pK-OVB-3 como una disolución madre
de 0,5 mg/ml a una disolución de liposomas de lípidos 40 mM y
entonces se diluyó con HBSS sin Ca/Mg de manera que la concentración
de lípido total final era de 4 mM y la concentración de
pK-OVB-3 de 0,1 mg/ml. Se estimó que
el tanto por ciento en peso de polilisina (pK) en los conjugados era
del 3%. Basándose en esta estimación, se usó una disolución madre de
pK de 3 kDa a aproximadamente 0,015 mg/ml a un volumen igual que las
disoluciones de pK-OVB-3 para
preparar conjugados de liposomas, es decir, la concentración de pK
final era del 3% de pK-OVB-3 o 0,003
mg/ml.
Se obtuvo la muestra de pKT de Sigma (St. Louis)
y se describió anteriormente. Contiene grupo polilisina de
30-70 kDa. Para su comparación con este conjugado,
se obtuvo una polilisina de 30-70 kDa (no conjugada)
de Sigma (St. Louis). Basándose en la determinación del fabricante
de aproximadamente 0,3 unidades de polilisina (pK) por transferrina
en los conjugados, se añadió la cantidad apropiada de pK libre a los
liposomas en los experimentos de comparación. En los experimentos
con pKT, la concentración de liposomas era a 2 mM de lípido total y
la concentración de pKT de 0,1 mg/ml. Se prepararon los complejos de
liposoma-pKT añadiendo la cantidad apropiada de la
disolución madre de pKT 1 mg/ml a una disolución de liposomas
concentrada (20 mM de lípido total) y diluyendo luego con la
cantidad apropiada de HBSS sin calcio o magnesio.
Para los experimentos con el conjugado de FPK,
se añadieron 40 \mul de una disolución madre de 340 \mug/ml de
FPK a 40 \mul de liposomas 40 mM y luego se diluyó dando una
concentración de lípidos final de 4 mM y una concentración de FPK
final de 34 \mug/ml.
Para experimentos con el conjugado de FPGK, se
añadieron 80 \mul de una disolución madre de 340 mg/ml de FPGK a
40 \mul de liposomas 40 mM y luego se diluyó dando una
concentración de lípidos final de 4 mM y una concentración de FPK
final de 68 \mug/ml.
Los conjugados de FPK y FPGK contienen también
unidades de polilisina (pK) de 3 kDa. Para la comparación de pK con
los conjugados de FPK y FPGK, se usó una disolución madre de pK de 3
kDa equivalente a las disoluciones de FPK y FPGK. Dado que la pK
está aproximadamente al 40% en peso en estos conjugados, se usó una
disolución madre de 136 \mug/ml. La concentración de lípidos final
en los experimentos de transfección fue de 4 mM y las
concentraciones de FPK y FPGK finales fueron de 34 y 68 \mug/ml
respectivamente, mientras que la concentración de pK libre final
para la comparación fue de 27 \mug/ml.
Se prepararon liposomas de
N-C12-DOPE/DOPC (70/30) para encapsular el
plásmido pEGFP-C1, espermina y sacarosa tal como se
describió anteriormente y se sedimentaron y lavaron tal como se
describió anteriormente. Se hicieron crecer células
OVCAR-3 en placas de 96 pocillos tal como se
describió anteriormente.
Todos los experimentos de transfección fueron
con células OVCAR-3 en cultivo tisular, tal como se
describió anteriormente. Se añadió directamente el conjugado de
OVB-3 a una disolución madre de liposomas 40 mM y se
diluyó en HBSS sin calcio o magnesio. La concentración de lípido
total final fue de 4 mM para todas las muestras. Se añadió a cada
muestra suero bovino fetal inactivado por calor al 10%. Se añadieron
20 \mul de disolución madre de Ca/Mg 60/40 mM a cada ml de
disolución de liposomas justo antes de su adición a las placas de
cultivo tisular. Se realizaron los experimentos por
cuadriplicado.
Se incubaron liposomas para la transfección de
células OVCAR-3 tal como se describió anteriormente.
Se sometieron a ensayo el número de células total y la actividad de
transfección mediante mediciones de fluorescencia tal como se
describió anteriormente.
Los resultados se muestran en la figura 13. Se
representó gráficamente la fluorescencia de EGFP corregida para el
número de células total mediante lectura con azul de calceína frente
a diversas condiciones para la transfección. La figura 13 muestra
que los conjugados son siempre mucho más activos que las polilisinas
libres correspondientes en cuanto a la transfección, lo que sugiere
que la actividad no está mediada por la parte de polilisina de los
conjugados solos. Los datos también muestran que los conjugados de
folato potencian la transfección.
Como primera etapa para someter a prueba la
transfección in vivo, se examinó la unión de liposomas a
células de ascitis OVCAR-3 humanas extraídas de un
xenoinjerto de ratón. Se prepararon los liposomas tal como se
describió en el ejemplo 1. Tal como en el ejemplo 1, se marcaron
tanto liposomas que contenían ADN como vacíos con un fluoróforo de
rodamina-PE.
Se realizó una serie de experimentos usando
células OVCAR-3 recogidas del fluido de ascitis de
ratones SCID. Se logró el lavado mediante inyección de 6 ml de PBS
en la cavidad peritoneal de un ratón al que se le habían inyectado
1 x 10^{7} células 40 días antes. Se sedimentaron la células
recogidas y se lavaron con PBS y se resuspendieron a una densidad
estimada de aproximadamente 1-2 x 10^{6}/ml (de
hemacitómetro) en HBSS sin Ca ni Mg. Se colocaron alícuotas de 10,
20 ó 50 \mul en los pocillos de fondo redondo de una placa de 96
pocillos de polipropileno. Se añadió HBSS para ajustar el volumen
total de cada pocillo hasta 100 \mul. En este punto se centrifugó
la placa en una centrífuga, entonces se usó un aspirador de aguja
fina para recoger el fluido. Tras un lavado en HBSS, se añadieron 50
\mul de un fluido intraperitoneal libre de células concentrado
(aproximadamente 10x) recogido de ratones SCID que llevaban
OVCAR-3 y ajustado con 20 \mul/ml de una
disolución madre de Ca^{2+}/Mg^{2+} 60/40 mM a cada pocillo.
Entonces se añadieron 50 \mul de cada muestra de liposomas con
Ca^{2+}/Mg^{2+} añadido a cada pocillo, y se incubaron los
pocillos a 37ºC durante 3 horas. Tras la incubación, se lavaron los
pocillos (mediante centrifugación) 3 veces con HBSS (sin Ca ni Mg) y
se resuspendieron en RPMI 1640 con suero bovino fetal inactivado por
calor al 10% y butirato de sodio 5 mM. Se monitorizaron las células
mediante microscopía de fluorescencia.
Los resultados se muestran en la figura 14. La
figura 14 revela que pKT potenció sustancialmente la unión de los
liposomas a las células OVCAR3. También puede haber algo de
transfección. Se esperaría que la unión drásticamente potenciada
vista observada aquí ex vivo potencie mucho en última
instancia la transfección in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se trató un ratón que llevaba un
tumor OVCAR3 de una manera similar al modelo presentado en Son,
Cancer Gene Therapy 4, 391; 1997, que se incorpora al presente
documento como referencia. El tratamiento implicó inyectar un número
de células tumorales muy alto en el ratón y tratar previamente con
cisplatino antes de la transfección.
Se establecieron dos ratones SCID con alto
número de células OVCAR-3 tal como en el ejemplo 6
en el día 1. En el día 42, se inyectaron i.p. 0,2 ml de cisplatino
0,5 mg/ml. En el día 46, cada ratón recibió una inyección i.p. de
una preparación de liposoma tal como sigue: se inyectaron i.p. 0,5
ml de liposomas que contenían pEGFP-C1
(NC12-DOPE/DOPC, 70/30) (un ratón recibió liposomas
con el plásmido pZeoLacZ encapsulado en lugar de de plásmido
pEGFP-C1). La disolución madre de liposoma era
lípido total 40 mM, se diluyó 1:1 con pKT 1 mg/ml y se constituyó
en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin Ca^{2+} o
Mg^{2+}. Justo antes de la inyección, se añadieron 20 \mul/ml
de una disolución madre de Ca^{+2} y Mg^{2+} 60 mM y 40 mM,
respectivamente, lo que llevó Ca^{2+} y Mg^{2+} a 1,2 y 0,8 mM
respectivamente. Las mismas inyecciones de liposoma siguieron en los
días 49 y 52. En el día 53, se inyectaron i.p. 0,5 ml de la misma
disolución de butirato 20 mM en HBSS sin Ca/Mg. En el día 54, se
sacrificaron ambos ratones y se realizó un lavado peritoneal con 6
ml de PBS en cada ratón para obtener células de ascitis. Se obtuvo
un número bastante bajo de células, probablemente como resultado
del tratamiento de platino. También se disecaron parte de la pared
peritoneal y el tejido mesentérico y se congelaron para un análisis
futuro. Se sedimentaron las células de ascitis y se lavaron 2 veces
con PBS, se recogieron en 0,5 ml y se diluyeron 10x para observación
y fotografías. Se resupendieron las células tratadas con pZeoLacZ en
5 ml de PBS frío y se resupendieron las células tratadas con pEGFP
en 10 ml de PBS frío. Se diluyó una alícuota de 0,3 ml de cada uno
hasta 1 ml en una cubeta de plástico que contenía PBS y se leyó la
D.O. a 650 nm frente a blanco de tampón. Las lecturas fueron
pZeoLacZ - 0,836; pEGFP- 0,618. Una estimación aproximada de la
muestra de pEGFP fue que contenía 1-2e6 células/ml.
Se diluyó la muestra de pZeoLacZ añadiendo 1,76 ml de PBS para
aproximarse a la concentración de células de la otra muestra. Se
tomaron alícuotas de las mismas para ensayos de
\beta-galactosidasa quimiolunimescente y los
resultados se muestran en la figura 15. La muestra de EGFP sirve
como control para el pZeoLacZ.
La figura 15 muestra que se produjo actividad
\beta-galactosidasa significativa en las células
transfectadas con pZeoLacZ, pero solamente a nivel de fondo en el
control de pEGFP. Los datos confirman que se produjo transfección
in vivo.
Los ejemplos anteriores proporcionaron pruebas
para la transfección in vivo mediada por pKT usando un
sistema i.p. de alto número de células OVCAR-3 en
los ratones SCID. También se utilizó un modelo con un número de
células menor en el que podían tratarse más ratones.
En el día 1 se les inyectaron a 11 ratones SCID
(hembras CB17 de Taconic) 1 x 10^{7} células
OVCAR-3 a partir de cultivo tisular. Se dejaron
crecer las células hasta el día 73. En el día 73 se inyectaron
intraperitonealmente (i.p.) a los ratones 0,2 ml de cisplatino 0,5
mg/ml en PBS. En el día 77, 80 y 83, los ratones recibieron
inyecciones i.p. de liposomas o complejos de lípido. Se inyectaron
cuatro tipos de sistemas que contenían ADN (véase a continuación).
En el día 84, se inyectaron i.p. 0,5 ml de butirato de sodio 20 mM
en HBSS sin Ca/Mg. En el día 85, se realizó un lavado peritoneal
tal como en el ejemplo 4. Se recogieron células de muestras de
lavado para su análisis tal como se describió anteriormente. Se
realizaron ensayos para \beta-galactosidasa con un
sustrato quimioluminescente tal como en el ejemplo 3.
- Grupo 1:
- se mezclaron liposomas que encapsulaban plásmido pCMV\beta (para determinar la expresión de \beta-galactosidasa) a una concentración de lípido total de 40 mM en un volumen igual con una disolución madre de conjugado de polilisina-transferrina (pKT) 2 mg/ml. La mezcla de liposoma recibió 12 \mul por ml de una disolución madre de Ca^{2+} 60 mM y Mg^{2+} 40 mM justo antes de la inyección de 0,8 ml de esta mezcla en la cavidad peritoneal de cada uno de 4 ratones.
- Grupo 2:
- exactamente el mismo protocolo excepto porque se usaron liposomas que contenían el plásmido pEGFP-C1.
- Grupo 3:
- se complejaron liposomas de DC-colesterol/DOPE (2/3) con ADN de plásmido de pCMV\beta. Una disolución madre 4 mM de los liposomas anteriores (preparados mediante sonicación en un sonicador de baño a partir de una película rehidratada) en HEPES 20 mM, pH 7,0, se diluyó 1:1 en agua desionizada destilada dando una disolución madre 2 mM. Se diluyó una disolución madre de ADN de plásmido pCMV\beta en agua hasta 1 mg/ml. Se mezclaron volúmenes iguales de las disoluciones madre aproximadamente 15 minutos antes de la inyección intraperitoneal tal como se describió en los ejemplos anteriores. Se inyectaron i.p. 0,3 ml en cada uno de 2 ratones.
- Grupo 4:
- exactamente lo mismo que los complejos de DC-colesterol anteriores, excepto porque se usó ADN de plásmido pEGFP-C1. Se inyectaron i.p. 0,3 ml en 1 ratón.
Los liposomas comprendían
N-C12-DOPE/DOPC (70/30) preparados estériles
y tal como en la sección de ensayos y métodos, incluyendo
sedimentado y lavado. El conjugado pKT es el mismo tal como se trató
anteriormente. Los datos se muestran en la figura 8.
La figura 16 revela que la transfección
liposómica mediada por pKT del gen lacZ funcionó claramente in
vivo en este sistema i.p.
Claims (12)
1. Liposoma que comprende:
- a)
- un liposoma fusogénico que comprende una bicapa lipídica que encapsula a un agente bioactivo; y
- b)
- un resto de unión electrostáticamente unido a dicha bicapa lipídica de dicho liposoma fusogénico; y
- c)
- un resto de direccionamiento covalentemente unido a dicho resto de unión.
2. Liposoma según la reivindicación 9, que
comprende además un resto de estabilización interpuesto entre dicho
resto de unión y dicho resto de direccionamiento, estando dicho
resto de estabilización covalentemente unido a dicho resto de unión
y dicho resto de direccionamiento.
3. Liposoma que comprende:
- a)
- un liposoma fusogénico que comprende una bicapa lipídica que encapsula a un agente bioactivo; y
- b)
- al menos un resto de unión electrostáticamente unido a dicha bicapa lipídica de dicho liposoma fusogénico;
- c)
- un resto de direccionamiento covalentemente unido a dicho al menos un resto de unión; y
- d)
- un resto de estabilización covalentemente unido a dicho al menos un resto de unión.
4. Liposoma según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que dicho resto de unión es al menos un resto seleccionado del
grupo que consiste en polilisina, protamina, polietilenimina,
poliarginina, poliacrilato, un derivado de espermina, citocromo c,
una anexina, sulfato de heparina, un aminodextrano, poliaspartato,
poliglutamato, un ácido polisiálico y poli(ácido
2-etilacrílico).
5. Liposoma según la reivindicación 3, en el que
dicho al menos un resto de unión es al menos un resto seleccionado
del grupo que consiste en polilisina, protamina, polietilenimina,
poliarginina, poliacrilato, un derivado de espermina, citocromo c,
una anexina, sulfato de heparina, un aminodextrano, poliaspartato,
poliglutamato, un ácido polisiálico y poli(ácido
2-etilacrílico).
6. Liposoma según las reivindicaciones 1, 2 ó 3,
en el que dicho resto de direccionamiento es al menos un resto
seleccionado del grupo que consiste en una vitamina, transferrina,
un anticuerpo, antígeno sialil-Lewis X, ácido
hialurónico, derivados de manosa, derivados de glucosa, lectinas
específicas de células, galaptina, galectina, lactosilceramida, un
derivado esteroideo, una secuencia RGD, EGF, péptido de unión a EGF,
péptido de unión al receptor de urocinasa, un péptido derivado de
trombospondina, un derivado de albúmina y una molécula
combinatoria.
7. Liposoma según las reivindicaciones 1, 2 ó 3,
en el que dicho agente bioactivo encapsulado en dicho liposoma
fusogénico comprende al menos un agente bioactivo seleccionado del
grupo que consiste en un ácido nucleico, un agente antiviral, un
agente antibacteriano, un agente antifúngico, un agente
antimetabólico, un agente antineoplásico, un esterol, un hidrato de
carbono, un aminoácido, un péptido, una proteína, un colorante, un
radiomarcador, un compuesto radioopaco, un compuesto fluorescente,
un compuesto midriático, un broncodilatador y un anestésico
local.
8. Liposoma según la reivindicación 7, en el que
dicho agente bioactivo es un ácido nucleico condensado.
9. Liposoma según las reivindicaciones 2 ó 3, en
el que dicho resto de estabilización es al menos un resto
seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol,
polivinilpirrolidona, un dextrano, un poliaminoácido,
metil-polioxazolina, poliglicerol,
poli(acriloil morfolina) y poliacrilamida.
10. Uso de un agente bioactivo para la
fabricación de un liposoma dirigido adecuado para introducir un
agente bioactivo en el citoplasma de una célula, comprendiendo dicho
uso:
- a)
- preparar un liposoma fusogénico, comprendiendo dicho liposoma fusogénico una bicapa lipídica que encapsula a un agente bioactivo:
- b)
- unir electrostáticamente un resto de direccionamiento a dicho liposoma fusogénico para formar un liposoma dirigido;
- c)
- poner en contacto dicho liposoma dirigido con una célula;
en el que la disociación de dicho
resto de direccionamiento de al menos una parte de la bicapa
lipídica de dicho liposoma dirigido forma una parte de bicapa
lipídica expuesta que puede interaccionar con la membrana de un
endosoma de dicha
célula.
11. Uso según la reivindicación 10, que
comprende además las etapas de unir electrostáticamente un resto de
estabilización a dicho liposoma fusogénico y disociar dicho resto de
estabilización de dicha al menos una parte de la bicapa lipídica
simultáneamente con dicha disociación de dicho resto de
direccionamiento.
12. Composición farmacéutica que comprende un
vehículo farmacéuticamente aceptable y el liposoma según las
reivindicaciones 1, 2 ó 3.
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