ES2215073T3 - Virosomas de dosper cationicos. - Google Patents
Virosomas de dosper cationicos.Info
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Abstract
Una vesícula de lípidos con una membrana de bicapa que tiene una carga neta positiva a pH fisiológico y en la que la vesícula comprende adicionalmente por lo menos un péptido fusogénico activo que es una hemaglutinina viral no de Sendai que hace que las vesículas sean internalizadas por células diana por medio de fagocitosis o endocitosis mediada por receptor, caracterizada porque la membrana de la vesícula comprende 5 a 30% en peso, basado en los lípidos de la membrana totales, de 1, 3- dioleoiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida (DOSPER), y un total de 95 a 70% en peso de otros lípidos que comprenden fosfatidilcolina (PC) o un derivado de ésta y opcionalmente fosfatidiletanolamina (PE) y/o lípidos catiónicos diferentes a DOSPER.
Description
Virosomas de DOSPER catiónicos.
La presente invención es en los campos de la
bioquímica, biotecnología génica y terapia génica y se refiere a
nuevos virosomas, es decir, vesículas liposomales cargadas
positivamente que contienen glicoproteínas vírales en la membrana,
para la transferencia altamente eficaz del material deseado,
particularmente material genético, a sitios diana, y aplicaciones
útiles de los mismos. Los virosomas catiónicos presentes son
particularmente adecuados para la descarga no infecciosa,
específica o inespecífica de compuestos cargados negativamente,
preferentemente genes, en células diana in vitro e in
vivo.
El documento WO 92/13525 informa de que los
virosomas hechos de membranas de bicapa fosfolipídica que se
dirigen a diana con proteínas de espícula vírales del virus
influenza y con marcadores específicos de célula como por ejemplo
anticuerpos monoclonales, se fusionan muy eficazmente con membranas
modelo y células animales debido a un mecanismo de penetración de
tipo virus por medio de endocitosis mediada por receptor. Mientras
que estos virosomas se aplican con éxito para descargar sustancias
químicas y fármacos deseados en sitios diana, tienen algunas
desventajas con respecto a la incorporación y transferencia estable
de moléculas cargadas como por ejemplo, ácidos nucleicos cargados
negativamente.
El documento WO97/41834, informa virosomas
catiónicos que se usan para la descarga eficaz de material genético
específica de célula en células diana in vitro e in
vivo. Adicionalmente informa un modo de fabricación de dichos
virosomas así como procedimientos para la aplicación de estos
virosomas.
La presente invención es una revelación adicional
de la invención informada en el documento WO97/41834 y se refiere a
un virosoma catiónico nuevo que debido a su composición de membrana
específica puede cargarse muy eficazmente con cualquier material
cargado negativamente deseado, preferentemente con material
genético que comprende ADN o ARN de cadena larga y corta,
oligodesoxinucleótidos, ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos
(PNA), ribozimas (moléculas de ARN con actividades enzimáticas),
genes, plásmidos y vectores. Inesperadamente, se ha encontrado que
cuando se usa DOSPER como lípido catiónico en combinación con otros
lípidos, se pueden producir virosomas de alto rendimiento que
incluso superan hasta diez veces la ya elevada eficacia de
transfección de los virosomas de DOTAP del documento WO97/41834.
Este sorprendente efecto solo se consigue, sin embargo, cuando se
usa DOSPER como lípido catiónico y cuando DOSPER se combina con
otros lípidos en una proporción que es diferente de la proporción
conocida de los lípidos catiónicos (DOTAP) a los otros lípidos
revelados explícitamente y reivindicados en el documento
WO97/41834.
Fig.1: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular 293T de riñón embrionaria
primaria transformada humana en 0,5 ml de medio se transfectaron
con virosomas de DOSPER y liposomas de DOSPER que contenían
plásmido pGreen Lantern marcado con ^{3}H.
Fig.2: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular COS-1 de
fibroblasto de mono se transfectaron con virosomas de DOSPER y
liposomas de DOSPER que contenían plásmido pGreen Lantern marcado
con ^{3}H.
Fig. 3: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular HeLa de carcinoma de cuello
de útero epitelioide humano en 0,5 ml de medio se transfectaron con
virosomas de DOSPER y liposomas de DOSPER que contenían plásmido
pGreen Lantern marcado con ^{3}H.
Fig. 4: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular NIH3T3 de fibroblasto de
ratón se transfectaron con virosomas de DOSPER y liposomas de
DOSPER que contenían plásmido pGreen Lantern marcado con
^{3}H.
Fig. 5: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular K562 de leucemia mielaginosa
crónica humana se transfectaron con virosomas de DOSPER y
liposomas de DOSPER que contenían plásmido pGreen Lantern marcado
con ^{3}H.
Fig. 6: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular P3 de mieloma de ratón se
transfectaron con virosomas de DOSPER y liposomas de DOSPER que
contenían plásmido pGreen Lantern marcado con ^{3}H.
Fig. 7: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de las líneas celulares COS-1,
293T, K562 y P3X63Ag8 se transfectaron con virosomas de DOSPER que
contenían plásmido pcDNA3.1/His B/lacZ marcado con ^{3}H.
Fig. 8: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular 293T de riñón embrionaria
primaria transformada humana en 0,5 ml de medio se transfectaron
con virosomas de DOSPER y virosomas de DOTAP que contenían plásmido
pcDNA3. 1/His B/lacZ his marcado con ^{3}H (0,4 \mug ADN; 24000
dpm= 100%).
Fig. 9: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular K562 de leucemia mielaginosa
crónica humana en 0,5 ml de medio se transfectaron con virosomas
de DOSPER y virosomas de DOTAP que contenían plásmido pcDNA3.
1/His B/lacZ his marcado con ^{3}H (0,4 \mug ADN; 24000 dpm=
100%).
Fig. 10: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular Sp2 de ratón, híbrida no
secretora en 0,5 ml de medio se transfectaron con virosomas de
DOSPER y virosomas de DOTAP que contenían plásmido pcDNA3. 1/His
B/lacZ his marcado con ^{3}H (0,4 \mug ADN; 24000 dpm=
100%).
Fig. 11: Influencia de la duración del tiempo de
transfección sobre la cantidad de plásmido de ADN incorporado.
5x10^{5} células de la línea celular HeLa de carcinoma
epitelioide humano se transfectaron con virosomas de DOSPER y
virosomas de DOTAP que contenían plásmido pGreen Lantern marcado con
^{3}H.
Fig. 12: Expresión de la
\beta-galactosidasa en células NIH3T3 que se han
transfectado con virosomas de DOSPER o liposomas de DOSPER,
respectivamente; valores medios de los tres experimentos A, B y
C.
Fig. 13: Expresión de la
\beta-galactosidasa en células NIH3T3 y 293T que
se han transfectado con virosomas de DOSPER (experimento A) usando
plásmido pcDNA3.1/His B/lacZ en diferentes concentraciones y
suministrado por medio de diferentes virosomas; valores en ng/mg
de proteína después de 4 días.
Los virosomas de la presente invención son
vesículas de lípido que típicamente comprenden una membrana de
vesícula que tiene una carga neta positiva debido a la presencia de
lípidos catiónicos. Comprenden adicionalmente péptidos fusogénicos
de origen viral, predominantemente glicopéptidos de envolturas
virales como la hemaglutinina del virus influenza, péptidos que
hacen que los virosomas sean incorporados por las células diana por
medio de un mecanismo de penetración mediado por receptor. Pueden
estar equipados opcionalmente además con marcadores específicos de
célula para una unión preferida a las células diana deseadas in
vivo.
La presencia de fosfatidiletanolamina (PE) en la
membrana se prefiere para anclar dicho marcador específico de célula
al virosoma por medio de un entrecruzante bifuncional. Cuando no se
requiere la dirección a diana específica de célula de los virosomas
(por ejemplo, para la aplicación en cultivos celulares definidos
in vitro) o cuando el marcador específico de célula está
unido a la membrana de forma diferente a la unión por medio de un
entrecruzante bifuncional, el PE puede estar opcionalmente ausente
de la membrana del virosoma.
En otra forma de realización que se prefiere para
aplicaciones in vivo de los virosomas, la presente invención
también se refiere a la unión covalente irreversible de los
marcadores específicos de célula a los virosomas catiónicos
incluyendo pero no limitándose a anticuerpos monoclonales,
fragmentos de anticuerpos como fragmentos de F(ab')2 y Fab',
citoquinas, y/o factores de crecimiento, útiles para una detección
y unión selectiva de las células diana. Están unidos a la membrana
de la vesícula de tal forma que se extienden hacia exterior y
ejercen esencialmente actividad funcional completa con respecto a la
detección y unión del receptor. Un procedimiento preferido para
crear virosomas que comprende el entrecruzamiento orientado al
sitio de un marcador específico de célula se revela en el Ejemplo 1
del documento WO97/41834 para virosomas de DOTAP. Según este
procedimiento, los marcadores específicos de célula se acoplan a
moléculas entrecruzantes de fosfatidiletanolamina preformadas como
por ejemplo,
N-[4-(p-maleimido-fenilbutiril]-fosfatidiletanolamina
(MPB.PE) en presencia de un detergente.
Para conseguir los mejores resultados posibles es
ventajoso aislar y purificar cuidadosamente las glicoproteínas
virales antes de la reconstitución para evitar la inactivación o
por digestión proteolítica o por reducción de enlaces
S-S intramoleculares. En consecuencia, se prefiere
que los marcadores conjugados, por ejemplo,
marcador-MPB.PE, se separen de las moléculas de
entrecruzamiento de fosfatidiletanolamina no conjugadas (por ejemplo
MPB.PE) por cromatografía de afinidad con una matriz de agarosa
activada, preferentemente con Tiopropil Sefarosa 6B reducida. Se
añaden entonces alícuotas de los complejos de entrecruzante de
fosfatidiletanolamina-molécula marcadora conjugados
purificados a la solución de detergente que contiene la mezcla de
lípidos de membrana disueltos, péptidos de fusión y otros
ingredientes deseados, antes de que se formen los virosomas
catiónicos a partir de éstos.
Es ventajoso llevar a cabo el procedimiento de
acoplamiento del entrecruzante bifuncional con el fosfolípido y el
marcador específico de célula en un procedimiento aparte antes de
la preparación de los virosomas. Este procedimiento permite
controlar mejor y optimizar la densidad de la superficie de las
membranas del virosoma, particularmente con respecto al número de
marcadores específicos de célula unidos a él. El aumento del control
de la concentración de moléculas de proteína incrustadas o unidas a
la membrana es importante en tanto que una proporción no
equilibrada de proteínas de fusión (por ejemplo hemaglutinina) y
marcadores específicos de célula (por ejemplo fragmentos de
anticuerpo Fab') sobre la membrana del virosoma puede reducir o
incluso destruir sus propiedades selectivas y, en el extremo, puede
dar como resultado la coagulación y precipitación de las
vesículas.
La ventaja de usar fragmentos de anticuerpo
F(ab')2 y Fab' en lugar de moléculas de anticuerpo completas
como marcadores específicos de célula se ha discutido extensamente
en el documento WO 97/41834. Los virosomas específicos de célula
presentes, ejercen una selectividad por diferentes tipos celulares
debida a sus marcadores específicos de célula en la membrana, y
simultáneamente, una elevada capacidad para la penetración celular
por endocitosis debida al péptido fusogénico viral, por ejemplo,
hemaglutinina. Los virosomas con fragmentos de Fab' que reconocen
antígenos asociados a tumores como TAG72, CEA,
17-1A, CA 19-9 o antígenos
asociados a leucemia como CD10 (CALLA = Antígeno de Leucemia
Linfocítica Aguda Común) y CD20 se unen selectivamente, es decir,
más preferentemente a células de leucemia o de tumor que portan los
antígenos mencionados en su superficie celular.
Las nuevas vesículas o virosomas son
particularmente útiles para transferir cualquier material cargado
negativamente deseado, preferentemente material genético, a sitios
diana, en particular a células y tejidos animales y humanos in
vitro e in vivo. Se destaca que los nuevos virosomas, no
son solo capaces de penetrar en células proliferativas, es decir
replicativas, sino también en células no proliferativas, es decir,
en reposo, característica que les hace extensamente aplicables en
los campos de la biociencia, farmacología y medicina, tanto como
herramienta de investigación y/o de diagnóstico y como medicamento.
El uso de los presentes virosomas como lanzaderas para la descarga
de agentes citotóxicos o material de ácido nucleico los hace
adecuados para aplicaciones en diferentes dolencias patológicas
como por ejemplo, infecciones virales, cánceres, tumores, leucemias,
u otras enfermedades que incluyen enfermedades que se deben a
defectos genéticos y que pueden ser susceptibles a procedimientos
de terapia génica que usan los presentes virosomas.
Los virosomas de la presente invención se pueden
aplicar in vitro o in vivo. Por ejemplo, la purga de
la médula ósea se usa como componente en el tratamiento de
neoplasmas graves, que incluyen leucemias agudas y crónicas. En la
actualidad, la médula se limpia de células leucémicas por medio de
una variedad de agentes como reactivos inmunológicos y fármacos
quimioterapéuticos. Se demostrará que el
virosoma-ODN encapsulado dirigido contra un oncogen
que confiere una ventaja de crecimiento a las células leucémicas,
es útil terapéuticamente y, lo que es más importante, que es más
selectivo que los agentes quimioterapéuticos convencionales al
eliminar células leucémicas mientras evita las células progenitoras
normales.
Para el uso como medicamento, los presentes
virosomas pueden formar parte de una composición farmacéutica que
comprende adicionalmente aditivos usuales y vehículos adecuados
farmacéuticamente. Se prefiere que la composición farmacéutica se
prepare como solución para inyección, pero pueden ser ventajosas
para algunas aplicaciones otras formas de aplicación, por ejemplo,
emulsiones, cremas, geles, pomadas, para administración tópica o
sistémi-
ca.
ca.
Por lo tanto, también es un objetivo de la
presente invención, usar los presentes virosomas para la
fabricación de una composición farmacéutica adecuada para el
tratamiento profiláctico y/o terapéutico de individuos animales o
humanos que se puedan beneficiar de dicho tratamiento. Es otro
objetivo de la presente invención, usar los presentes virosomas
para la fabricación de un kit de diagnóstico para aplicaciones
in vitro e in vivo.
Las presentes vesículas se obtienen
preferentemente por medio de un procedimiento análogo a cualquiera
de los procedimientos para crear virosomas DOTAP revelados en los
Ejemplos 1 a 3 y 6 del documento WO97/41834, exceptuando que el
DOTAP se sustituye por DOSPER y que la concentración de DOSPER en la
membrana de virosoma final se ajusta adecuadamente como se define a
continuación en la presente memoria descriptiva y en particular, no
supera el 30% en peso del contenido de lípidos total del virosoma.
Básicamente, el procedimiento de preparación de los presentes
virosomas comprende las siguientes etapas:
- a)
- preparar una solución tampón que comprende un detergente no iónico y que comprende adicionalmente DOSPER y otros lípidos y por lo menos un péptido fusogénico activo que es una hemaglutinina viral no de Sendai que hace que las vesículas sean internalizadas por células diana por medio de fagocitosis o endocitosis mediada por receptor;
- b)
- ajustar las concentraciones de lípidos hasta, basado en los lípidos de membrana totales, 5 a 30% en peso de DOSPER y hasta un total de 95 a 70% en peso de dichos otros lípidos que comprenden fosfatidilcolina (PC) o un derivado de la misma y opcionalmente fosfatidiletanolamina (PE) y/o lípidos catiónicos distintos de DOSPER; y
- (c)
- eliminar el detergente mediante diálisis o tratando la solución con gotas de microvehículos, lo que da como resultado la formación de dichas vesículas de bicapa lipídica cargadas positivamente; y preferentemente
- (d)
- incorporar en las vesículas una cantidad de un fármaco o sustancia deseados para descargar en las células diana, estando dicho fármaco o sustancia deseados preferentemente cargados negativamente y siendo seleccionados particularmente del grupo formado por un tinte, una sustancia trazadora, un agente cosmético, una sustancia activa farmacéutica o biológicamente, y un material de ácido nucleico.
En otra forma de realización de la invención
preferida para aplicaciones in vivo de los virosomas, se
aplica un entrecruzante bifuncional adecuado para unir un marcador
específico de célula irreversiblemente a la membrana de la
vesícula. El marcador específico de célula, que está dirigido a un
receptor de célula responsable de la unión selectiva del virosoma a
la célula, se une al entrecruzante de tal forma que es todavía
completamente biológicamente activo. Se prefiere que el
entrecruzante se emplee en forma de complejo de moléculas
preformado en el que el entrecruzante se una covalentemente a la
fosfatidiletanolamina y a un marcador específico de célula, como se
define en las reivindicaciones.
El término "péptido fusogénico" se refiere a
péptidos o proteínas capaces de inducir y/o promover una reacción
de fusión entre la membrana del virosoma y una membrana de lípidos
de la célula diana. En la mayoría de las formas de realización, se
refiere a glicoproteínas de espícula virales que contienen el
péptido de fusión, particularmente al trímero de hemaglutinina
completo de espículas de superficie viral, un monómero del mismo, o
una o ambas subunidades partidas, los glicopéptidos HA1 y HA2, que
contienen el péptido de fusión funcional. En otra forma de
realización de la presente invención el término se refiere al
péptido de fusión puro, o bien aislado a partir de fuentes naturales
o producido sintéticamente. En una forma de realización
particularmente preferida de la presente invención, estos
polipéptidos que contienen el péptido de fusión, se refieren a las
hemaglutininas del virus influenza, por ejemplo, la del subtipo
A-H1N1.
En lugar de o además de la hemaglutinina del
virus influenza, se pueden usar también adecuadamente las
hemaglutininas de otros virus como péptidos de fusión (proteínas)
para los virosomas de la presente invención, siempre que ejerzan
sustancialmente el mismo mecanismo de penetración celular mediado
por el pH que la hemaglutinina de influenza. Las hemaglutininas
candidatas incluyen, por ejemplo, las de rhabdovirus, virus de
parainfluenza tipo III, virus Semliki Forest y togavirus, como se
revela en el documento WO97/41834.
El término "entrecruzante" se refiere a una
molécula heterobifuncional orgánica capaz de unirse a la superficie
de las vesículas preparadas según esta invención y capaz de unir
polipéptidos. En una forma de realización preferida de la presente
invención, esta molécula contiene un grupo
N-hidroxisuccinimida para acoplarse al grupo amino
de la fosfatidiletanolamina y un grupo maleimida para la
conjugación de un marcador específico de célula como por ejemplo un
fragmento de anticuerpo monoclonal. Los entrecruzantes adecuados
comprenden
4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato
de succinimidilo, éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida,
éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida,
4(p-maleimidofenil)-butirato
de succinimidilo,
4(p-maleimidofenil)butirato de
sulfosuccinimidilo; alternativamente, el entrecruzante puede ser
una molécula que contenga un grupo
N-hidroxisuccinimida y un grupo azido fotoreactivo
para acoplarse a marcadores, por ejemplo, citoquinas, como
N-hidroxisuccinimidilsuberato
(NHS-SA),
N-hidroxisuccinimidil-4-azidobenzoato
(HASAB),
N-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)
hexanoato (SANPAH),
N-sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2-nitrofenilamino)hexanoato.
Se prefiere que el entrecruzante se use en forma de un complejo de
moléculas preformado de lípidos más entrecruzante más marcador
específico de célula.
El término "proteína específica de célula" o
"marcador específico de célula" se refiere a una proteína
capaz de unirse al entrecruzante o al complejo
entrecruzante-lípido, respectivamente, y que es
capaz adicionalmente de unirse al receptor de las células diana. En
una forma de realización preferida de la presente invención, esta
molécula se refiere a un anticuerpo monoclonal, un fragmento de
anticuerpo, una citoquina o un factor de crecimiento. El marcador
específico de célula proporciona la detección selectiva y la unión
de células diana y así mejora la acción del péptido fusogénico
concomitantemente presente en la membrana virosomal. Los fragmentos
de anticuerpos preferidos comprenden los fragmentos de
F(ab')2 y Fab', mientras que los marcadores específicos de
célula comprenden adicionalmente interleuquinas y otras citoquinas,
particularmente las mencionadas en la Tabla 1 a continua-
ción.
ción.
| BDNF | IFN\alpha | MIP-1\alpha | PDGF |
| CNTF | IFN\beta | MIP-1\beta | PF-4 |
| EGF | IFN\gamma | MIP-2 | RANTES |
| Epo | IL-1 a IL-15 | NGF | SCF |
| FGF | LIF | NT-3 | TGF\alpha |
| G-CSF | LT(TNF\beta) | NT-4 | TGF\beta |
| GM-CSF | MCP-1 a MCP-3 | OSM | TNF\alpha |
| 1-309/TCA-3 | M-CSF | PBP | Tpo |
| \gammaIP-10 | MIF | PBSF | jVEGF |
El término "lípido catiónico" como se usa en
la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula orgánica
que contiene un componente catiónico y una cola no polar, un
denominado anfífilo de cabeza a cola, como cloruro de
N-[(1,2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) (Felgner y col; Proc Natl Acad USA
84:7413-7417, 1987),
N-[1,2,3-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamoniometilsulfato
(DOTAP); o
N-t-butil-N'-tetradecil-3-tetradecilaminopropionamidina
(Ruysschaert y col.; Biochem. Biophys. Res. Commun.
203:1622-1628, 1994). Salvo que se mencione
explícitamente de otra manera, el término también incluye los
lípidos policatiónicos definidos a continuación.
El término "lípido policatiónico" se refiere
a una molécula orgánica que contiene un componente policatiónico y
una cola no polar como la lipospermina:
1,3-dipalmitoil-2-fosfatidiletanolamido-espermina
(DPPES) y dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) (Behr y col.;
Proc. Natl. Acad. USA 86:6982-6986, 1989);
trifluoroacetato de
2,3-dioleoiloxi-N-[2(espermincarboxamido)
etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio
(DOSPA);
1,3-dioleiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida
(DOSPER); yoduro de
N,N,N',N'-tetrametil(-N,N'-bis(2-hidroxietil)-2,3-dioleoiloxi-1,4-butanodiamonio
(THDOB).
Es esencial que los virosomas de la presente
invención contengan DOSPER y uno o más de otros lípidos naturales o
sintéticos que están cargados positivamente o neutros. Por
"positivamente cargados" se entiende que los lípidos tienen
una carga neta positiva a pH fisiológico. Así, los lípidos,
membranas o virosomas "positivamente cargados" serán lípidos,
membranas o virosomas que tienen una carga neta positiva a pH
fisiológico. Los "lípidos neutros" no presentan ninguna carga
neta a pH fisiológico y comprenden lípidos como colesterol o
derivados de éste, y/o fosfolípidos de tipo bipolar, que tienen
áreas cargadas positivamente y negativamente dentro de la molécula
que estequiométricamente compensan cada una de las otras
cargas.
El término "material cargado negativamente"
como se usa en la presente memoria descriptiva comprende cualquier
fármaco o sustancia deseados que porten una carga neta negativa a
pH fisiológico.
El término "fármaco o sustancia deseados"
como se usa en la presente memoria descriptiva se entiende que
comprende cualquier sustancia química, compuesto o mezcla de
compuestos que sea aplicable para fines cosméticos, diagnósticos,
farmacéuticos, médicos o para cualquier otro fin científico. Dichas
sustancias comprenden compuestos que se pueden controlar
analíticamente in vitro o in vivo como tintes, tintes
fluorescentes, compuestos marcados radiactivamente o de otra forma,
sustancias trazadoras o marcadoras; también comprenden, no
obstante, fármacos de proteína o no proteicos, o cualquier otra
sustancia activa farmacéutica o biológicamente, particularmente
agentes anti-virales o anti-cáncer
convencionales, pero también compuestos de ácidos nucleicos como se
definen en la presente memoria descriptiva. Dado que los virosomas
presentes están cargados positivamente a pH fisiológico, se
prefiere que se carguen con fármacos o sustancias deseados o bien
neutros o cargados negativamente, ya que permiten la incorporación
más eficaz y estable en los virosomas.
Los términos "ácido nucleico" o "material
genético" como se usan en la presente memoria descriptiva,
comprenden ADN o ARN de cadena corta, desoxirribonucleótidos,
oligodesoxirribonucleótidos, selenoatos de
oligodesoxirribonucleótidos, fosforotioatos de
oligodesoxirribonucleótidos (OPT), fosforamidatos de
oligodesoxirribonucleótidos, metilfosfonatos de
oligodesoxirribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA),
ribonucleótidos, oligoribonucleótidos, fosforotioatos de
oligoribonucleótidos, fosfatos de
2'-OMe-oligoribonucleótido,
fosforotioatos de
2'-OMe-oligoribonucleótidos,
ribozimas (moléculas de ARN con actividades enzimáticas), genes,
plásmidos y vectores (vehículos de clonación).
El término "virosomas" como se usa en la
presente memoria descriptiva se refiere, en su forma más simple, a
vesículas liposomales con una membrana de bicapa que comprende
lípidos catiónicos y un espacio interno, preferentemente acuoso, en
el que la membrana contiene adicionalmente proteínas virales, en
particular, glicoproteínas virales. En la forma de realización
preferida, las proteínas virales comprenden por lo menos un péptido
fusogénico o proteína con actividad de fusión biológica completa,
particularmente la glicoproteína de espícula hemaglutinina y/o
neuraminidasa del virus influenza A (por ejemplo A/Singapur). Se
entenderá que las proteínas virales también abarcan secuencias de
aminoácidos producidas sintéticamente que corresponden o son iguales
al péptido de fusión del virus influenza como se describe en la
presente memoria descriptiva. Los lípidos de membrana comprenden los
lípidos catiónicos definidos anteriormente pero pueden comprender
adicionalmente otros lípidos naturales y/o sintéticos,
preferentemente fosfolípidos como fosfatidilcolina (PC) y
fosfatidiletanolamina (PE).
A pesar de que los virosomas catiónicos de la
presente invención puedan en muchos casos, especialmente para
experimentos de cultivos celulares in vitro, aplicarse con
éxito sin marcadores específicos de célula en la membrana, se
prefiere particularmente para las aplicaciones in vivo que
comprendan adicionalmente por lo menos un marcador específico de
célula en la membrana como se define anteriormente en la presente
memoria descriptiva. El diámetro medio de las vesículas está en el
intervalo de 120-180 nm, como determina la
microscopía electrónica y la dispersión de luz dinámica.
Usando los virosomas catiónicos de la presente
invención como vehículos para medicamentos o sustancias deseados
que incluyen material genético, se pueden evitar o por lo menos
disminuir considerablemente los efectos secundarios no deseados
debidos a la toxicidad. Este efecto beneficioso se consigue gracias
a que los virosomas catiónicos presentes tienen, en comparación con
los liposomas o virosomas conocidos hasta ahora, una actividad y
eficacia mucho mayor para la transferencia de material encapsulado,
particularmente material cargado negativamente como nucleótidos
antisentido, a las células diana, e incluso más importante, para la
expresión por la célula diana del material de ácido nucleico
transfectado. En consecuencia, es un objeto de la presente
invención, proporcionar los virosomas de DOSPER definidos en la
reivindicación 1 y variaciones de los mismos definidos como formas
de realización adicionales en las reivindicaciones subsiguientes 2
a 11. También es un objeto de la presente invención proporcionar
una composición que contenga los nuevos virosomas junto con un
vehículo adecuado para diferentes aplicaciones como se define por
ejemplo en la reivindicación 12.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un proceso de creación de los nuevos virosomas como se
define en la reivindicación 13 con las variaciones definidas en las
reivindicaciones 14 a 24.
Es un objeto más de la presente invención,
enseñar y reivindicar procedimientos más específicos de uso de los
presentes virosomas, como se define en las reivindicaciones 25 a
29.
Para que la invención descrita en la presente
memoria descriptiva se pueda entender de manera más completa, se
establecen los siguientes ejemplos. Los ejemplos tienen fines
ilustrativos solo y no se debe considerar que limitan esta
invención en ningún aspecto.
Se aisló la hemaglutinina (HA) de la cepa
A/Singapur/6/86 del virus influenza como describen Skehel y Schild
(1971), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:968-972. En
pocas palabras, se creció el virus en la cavidad alantoica de
huevos de gallina, y se purificó dos veces por ultracentrifugación
en gradiente de sacarosa. El virus purificado se estabilizó en un
tampón que contenía 7,9 mg/ml de NaCl, 4,4 mg/ml de citrato de
trisodio-2H_{2}O, 2,1 mg/ml de ácido sulfónico de
2-morfolinoetano, y 1,2 mg/ml de ácido sulfónico de
N-hidroxietil
-piperazin-N'-2-etano
pH 7,3. Se sedimentaron por ultracentrifugación a 100000 x g
durante 10 minutos 53 ml de la suspensión del virus que contenía 345
\mug de HA por ml. Se añadieron al sedimento del virus influenza,
7,7 ml de una solución de detergente tamponada que contenía NaCl
145 mM, HEPES 2,5 mM y 54 mg/ml del detergente no iónico
octaetilenglicol monododeciléter (OEG=C12E8), pH 7,4. El sedimento
se disolvió completamente usando ultrasonidos durante 2 minutos a
temperatura ambiente. La solución se sometió a ultracentrifugación a
100000 x g durante 1 hora. El sobrenadante obtenido contenía el
trímero de HA solubilizado (1,635 mg HA/ml) y cantidades traza de
neuraminidasa. Se añadieron 0,5-2 mg de DOSPER y
5,5-4 mg (completando el total de 6 mg de lípido
total) de dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) a 3,7 ml del sobrenadante
(g mg HA) y se disolvieron. La solución se esterilizó pasándola por
un filtro de 0,2 \mum y después se transfirió a un contenedor de
cristal que contenía 1,15 g de gotas de microvehículo estéril,
preferentemente Biobeads SM-2. El contenedor se
agitó durante 1 hora usando un agitador REAX2 de Heidolph (Kelheim,
Alemania). Cuando fue necesario, este procedimiento se repitió
hasta tres veces con 0,58 mg de Biobeads. Después de estos
procedimientos, se obtuvo una solución ligeramente transparente de
virosomas de DOSPER.
Se obtuvieron los mejores resultados con
preparaciones de virosomas que contenían una proporción de lípidos
de 1,5 mg de DOSPER (25% en peso de los lípidos totales) por 4,5 mg
de DOPC. Concentraciones más elevadas de DOSPER, por ejemplo, por
encima de 30-35% en peso, no dieron como resultado
la formación adecuada de los virosomas tras la eliminación del
detergente.
La sustitución parcial de DOPC por PE (fosfatidil
etanolamina) y/o otros lípidos catiónicos como DOTAP o DOSPA es
posible sin una pérdida significativa de la actividad de
transfección.
Incorporación de oligodesoxirribonucleótidos de
fosforotioato en virosomas de DOSPER:
Los oligodesoxirribonucleótido fosforotioatos
(OPT) antisentido y sentido del gen L-myc se usaron
como ejemplo para la demostración de la elevada eficacia de los
virosomas catiónicos en la transfección. Se sintetizaron
5'-FITC-OPT por medio de la química
de la fosforamidita (Microsynth GMBH, Balgach, Suiza). El
pentadecámero
(5'-FITC-GTAGTC-CATGTCCGC-3')
y el pentadecámero (5'-FITC
-GCGGACATGGACTAC-3') se usaron como OPT antisentido
y OPT sentido, respectivamente. Se sintetizó un OPT secuencia
mezcla control (msc) que consistía en la misma longitud de
nucleótidos que los OPT antisentido y sentido.
Se añadió 1 ml de virosomas de DOSPER a cada uno
de
a) 2 mg de FITC-OPT antisentido
(1,3 \mumol)
b) 3,4 mg de FITC-OPT sentido
(1,3 \mumol) y
c) 3,1 mg de FITC-OPT msc (1,3
\mumol)
Se disolvieron los FITC-OPT y las
soluciones se trataron después por sonicación durante 2 minutos a
26ºC. Se separaron los FITC-OPT no encapsulados de
los virosomas por filtración en gel en una columna de Alta Carga
Superdex 200 (Pharmacia, Suecia). La columna se equilibró con PBS
estéril. Las fracciones de volumen nulo que contenían los virosomas
de DOSPER con FITC-OPT encapsulado se eluyeron con
PBS y se recogieron. Las concentraciones de FITC-OPT
encapsulado en el virosoma se determinaron flurométricamente
después de que los virosomas se disolvieran completamente en NaOH
0,1 M que contenía Triton X-100 0,1% (v/v). Para la
calibración de la escala de fluorescencia se fijó a cero la
fluorescencia de virosomas de DOSPER vacíos que estaban disueltos en
la solución de detergente anterior.
Acoplamiento de los fragmentos Fab' a los
virosomas por medio de complejos de moléculas
fosfatidiletanolamina-entrecruzante bifuncional
preformados: se añadieron 3 mg de Fab' recién reducido de
anticuerpo anti-CD10-(AntiCALLA) monoclonal murino,
disuelto en 2,8 ml de solución tampón de ácido cítrico (NaCL 100
mM, ácido cítrico 40 MM, Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O 35 mM, EDTA 2
mM, pH 5,5) a una solución de 0,524 mg de
N-[4-(p-maleimido-fenil)butiril]
fosfatidiletanolamina (MBP.PE) en 215 \mul de tampón de ácido
cítrico que contenía 0,5% de
n-octil-oligo-oxietileno.
La mezcla se incubó después bajo nitrógeno durante 16 h a 4ºC con
agitación suave. Después de la incubación, el MBP.PE no acoplado
fue eliminado por un lote de 400 \mul de Tiopropil Sefarosa 6B
húmeda recién reducida (Pharmacia, Suecia). La mezcla se incubó
durante 4 h a temperatura ambiente. La Tiopropil Sefarosa 6B se
eliminó por centrifugación y la solución resultante se neutralizó
hasta pH 7,0. La solución neutralizada se complementó con OEG (54
mg/ml).
Las soluciones preparadas como se describe
anteriormente se añadieron a las soluciones para la preparación de
los virosomas de DOSPER. Las moléculas de
Fab'-MPB.PE se insertan en la bicapa lipídica
durante la formación de los virosomas.
Las micrográficas de los virosomas de DOSPER
confirman la estructura unilamelar preferida de las vesículas con un
diámetro medio de aproximadamente 120 a 180 nm como determina la
dispersión de luz láser. Las espículas de la proteína HA del virus
influenza son claramente visibles.
La actividad fusogénica total de los virosomas de
DOSPER presentes se confirmó por el ensayo cuantitativo basado en la
desinactivación de fluorescencia descrito por Hoekstra y col.
(1984), Biochemistry 23:5675-5681 y L. Lüscher y
col. (1993), Arch. Virol. 130:317-326. La sonda
fluorescente de cloruro de octadecil rodamina B (R18) (obtenida de
Molecular Probes Inc., Eugene, USA) se insertó a densidades
elevadas en la membrana de los virosomas de DOSPER añadiendo a una
película seca fina de la sonda fluorescente, la solución de OEG
tamponada (C_{12}E_{8}) que contenía DOSPER y HA, seguido por la
agitación durante 5 a 10 minutos para disolver la sonda,
continuando después como se describe anteriormente en
"Preparación de virosomas de DOSPER...". La dilución de la
rodamina inactivada se observó por medio de la incubación de
virosomas de DOSPER marcados con rodamina con liposomas modelo
(proporción de DOSPER/DOPC: fosfolípido liposomal= 1:20). La
fluorescencia se midió con un espectrofluorímetro
Perkin-Elmer 100 a 560 y 590 nm de longitud de onda
de excitación y emisión, respectivamente.
Incorporación de plásmidos marcados con ^{3}H
en virosomas de DOSPER
Básicamente, la incorporación de compuestos de
ácidos nucleicos en virosomas se llevaba a cabo por medio de los
siguientes tres procedimientos:
- 1.
- Diálisis. Los compuestos de ácido nucleico se encapsulaban durante la formación de los virosomas, en la que el detergente Octal-POE (de Alexis Corp., Laeufelfingen, Suiza) se eliminaba mediante diálisis.
- 2.
- Biobeads: Los compuestos de ácido nucleico se encapsulaban durante la formación de los virosomas, en la que el detergente OEG era eliminado por microvehículos, por ejemplo, Biobeads SM2.
- 3.
- Ultrasonicación: Los compuestos de ácido nucleico eran encapsulados por lípidos catiónicos, preferentemente DOSPER, y los liposomas o complejos de lípidos cargados de ácido nucleico obtenidos, preferentemente liposomas o complejos de lípidos de DOSPER, se fusionaban con virosomas de DOSPER por ultrasonicación.
Dado que las mejores tasas de incorporación se
obtenían por medio del tercer procedimiento, la mayoría de los
experimentos se hicieron usando el procedimiento de fusión para la
incorporación de material de ácido nucleico en los virosomas.
El plásmido pGEEN LANTERN™-I
(GIBCO-BRL) se produjo en E.Coli en presencia
de ^{3}H-metiltimidina para obtener plásmidos
marcados radiactivamente para la cuantificación exacta de la
eficacia de transfección. La actividad específica del plásmido fue
6,625 x 10^{10} dpm/g (=29,84 mCi/g).
Se disolvieron 11,6 \mug de plásmido marcado
con ^{3}H (17,5 \mul) en 480 \mul de tampón
HEPES-NaCl. Después de la adición de 116 \mug de
DOSPER (1 \mug/ml) la mezcla resultante se trató por
ultrasonicación durante 30 segundos y a partir de ahí se dejó
reposar durante 15 min. Por medio de este tratamiento se forman
complejos de lípidos hechos de DOSPER y plásmido. Alternativamente,
en lugar de los complejos de lípidos, se pueden producir los
liposomas de DOSPER por procedimientos convencionales, por ejemplo,
a partir de una solución tamponada de OEG que contiene DOSPER y el
plásmido, y la posterior eliminación del detergente usando diálisis
o microvehículos absorbentes de detergente, opcionalmente seguido
por ultrasonicación, lo que da como resultado liposomas de DOSPER
cargados con los plásmidos.
A la solución que contiene los complejos de
lípidos o liposomas cargados con el plásmido se añaden 93 \mul de
los virosomas de DOSPER vacíos pre-elaborados (por
ejemplo, según el Ejemplo 1). La mezcla se ultrasonica durante 1
min para fusionar los virosomas de DOSPER con los liposomas o
complejos de lípidos para incorporar los plásmidos en los virosomas.
Este procedimiento de incorporación del material deseado en los
virosomas puede también ser aplicable para la incorporación de
fármacos o sustancias que no sean material de ácido nucleico,
preferentemente para sustancias cargadas negativamente.
Comparación de la eficacia de transfección del
plásmido marcado con ^{3}H por virosomas de DOSPER y liposomas de
DOSPER: se encapsularon 33 \mug del plásmido de ADN marcado en
virosomas de DOSPER y 11,7 \mug en liposomas de DOSPER
preelaborados. Se transfectaron con virosomas de DOSPER y liposomas
de DOSPER cuatro líneas celulares adherentes diferentes, es decir,
HeLa, 293T, COS-1 y NIH3T3 y adicionalmente, las
líneas celulares K562 y
P3/NSI/1-Ag4-1 que crecen en
cultivo en suspensión.
Se incubaron 5x10^{5} células de cada tipo
celular en 500 \mul (=0,5 ml) de medio con 25 \mul de solución
de o bien virosomas de DOSPER que contienen plásmido o liposomas de
DOSPER que contienen plásmido durante 2, 4, 6 y
24 h a 37ºC. Las alícuotas añadidas de virosomas de DOSPER y liposomas de DOSPER contenían 400 ng de plásmido marcado que correspondían a una radiactividad de 26,500 dpm (=100%). Después de la incubación, las células se lavaron, se lisaron y la radiactividad incorporada se midió con un contador beta.
24 h a 37ºC. Las alícuotas añadidas de virosomas de DOSPER y liposomas de DOSPER contenían 400 ng de plásmido marcado que correspondían a una radiactividad de 26,500 dpm (=100%). Después de la incubación, las células se lavaron, se lisaron y la radiactividad incorporada se midió con un contador beta.
Se evaluó la influencia de la duración del tiempo
de transfección (periodo de incubación) en la cantidad de plásmido
de ADN incorporado, y los resultados se representan en las Figuras
1 a 6. La Breve Descripción de las Figuras anterior resume las
líneas celulares en cada una de las Figuras. Las Figuras
1-6 muestran claramente que los virosomas de DOSPER
son superiores en la transfección a los liposomas de DOSPER para
todos los tipos celulares y para todos los tiempos de incubación.
Los tiempos de incubación mayores de 6 y 24 horas con liposomas de
DOSPER solo dieron como resultado aumentos muy pequeños de
incorporación de ADN, mientras que tiempos de incubación más largos
con virosomas de DOSPER, condujeron a una incorporación de ADN
considerablemente superior. Este resultado sugiere que la
incorporación mediada por HA de los virosomas es mucho más eficaz
que la incorporación inducida por los liposomas de DOSPER sin la
ayuda de ningún ligando de unión viral a los receptores celulares.
Es interesante que en el caso de los virosomas de DOSPER, los
tiempos de incubación de 6-24 h no condujeron a una
saturación de la incorporación de ADN sino a un aumento adicional
de la incorporación de ADN, un efecto que puede deberse a la rápida
sustitución de los receptores de la membrana después de su
eliminación por medio de la endocitosis mediada por receptor de los
virosomas en la superficie celular. En general, se encontró que las
líneas celulares adherentes (que crecen en monocapas) se
transfectaban más eficazmente que las líneas celulares que crecían
en cultivos en suspensión.
El Ejemplo 2 se repitió con otro plásmido marcado
con ^{3}H, es decir pcDNA3.1/His B/lacZ (Suministrador:
Invitrogen, Groningen. Países Bajos). Las líneas celulares
COS-1, K562, 293T y P3X63Ag8 se transfectaron con
virosomas de DOSPER cargados con este plásmido y se incubaron
durante un periodo de 2, 4, y 72 horas. No se realizó una
comparación con los liposomas de DOSPER en este experimento.
Los resultados se representan en la Fig. 7. Se
puede observar a partir de los mismos que una prolongación del
tiempo de incubación bien puede dar como resultado un aumento
adicional en la captación celular del plásmido marcado cuando se
usan los presentes virosomas. De hecho, usando los virosomas de
DOSPER presentes como sistema de transferencia de alta resolución
para material de ácido nucleico, es posible descargar el
60-80% de la cantidad total del ácido nucleico
cargado (por ejemplo, plásmido) en las células diana deseadas. Todas
las líneas celulares probadas, eran comparablemente susceptibles a
la captación del virosoma por lo tanto del plásmido.
Los virosomas penetran en las células de
mamíferos por medio del mecanismo mediado por receptor dirigido a HA
conocido del virus influenza A. No se esperaba que la naturaleza
química de la bicapa lipídica de la membrana del virosoma pudiera
jugar un papel importante siempre que el estado nativo y la
actividad fusogénica de la HA se mantuviera adecuadamente. Se cree
por lo tanto que los virosomas de DOSPER y los virosomas de DOTAP
tenían aproximadamente la misma eficacia de transfección para el
material de ácido nucleico en células de mamífero.
Sorprendentemente, sin embargo, los experimentos
diseñados para comparar las eficacias de transfección de los
virosomas de DOSPER y DOTAP dieron un resultado diferente, es decir,
que se desviaba extraordinariamente de lo esperado. Los experimentos
se hicieron según los Ejemplos 1 y 2 mientras que usaron el
plásmido pcDNA3.1/His B/lacZ marcado con tritio para la
encapsulación y la transfección. Los virosomas de DOTAP se
prepararon según el Ejemplo 1 del documento WO97/41834 y la
incorporación del plásmido se hizo como se describe anteriormente
en la presente memoria descriptiva usando el mismo procedimiento
que para los virosomas de DOSPER. La misma cantidad de plásmido
marcado con ^{3}H que se describe en el Ejemplo 2 para los
virosomas de DOSPER se encapsuló en virosomas de DOTAP. Las líneas
celulares 293T, K562, Sp2 y HeLa se incubaron con virosomas de
DOSPER y DOTAP bajo las mismas condiciones que se describen
anteriormente en el Ejemplo 2.
Los resultados se representan en las Figuras
8-11. Muestran claramente que la eficacia de
transfección de los virosomas de DOSPER es por lo menos el doble de
la de los virosomas de DOTAP y puede ser incluso hasta diez veces
superior. Particularmente, con las líneas celulares creciendo en
cultivos en suspensión como la línea celular Sp2 (Fig.10) la
diferencia en la eficacia de transfección es visible mucho más
claramente. La razón para ello no se entiende del todo todavía pero
puede ser parcialmente debido a la diferente naturaleza química de
los dos lípidos, en los que la cabeza polar de la molécula de DOSPER
contiene cuatro grupos amino libres mientras que la cabeza polar de
la molécula de DOTAP contiene únicamente un grupo amino libre. Se
supone, sin ligarse a la teoría, que la encapsulación de material
cargado negativamente, como los plásmidos, en virosomas que
contienen DOSPER, puede conducir a cantidades mayores de virosomas
útiles. Por contraste, la encapsulación del plásmido en virosomas de
DOTAP puede dar como resultado un elevado número de vesículas
defectuosas con potencial de transfección bajo. Una segunda
hipótesis implicaría un efecto potenciador del DOSPER durante la
unión de los virosomas a la membrana celular de las células diana,
un punto de vista que no se puede excluir.
Los resultados demuestran así que el uso del
lípido policatiónico DOSPER presenta sorprendentemente eficacia de
transfección superior en comparación con el lípido catiónico DOTAP
usado más frecuentemente.
La determinación cuantitativa usando un kit ELISA
de \beta-Gal (suministrador: Boehringer Manheim)
de la expresión de \beta-galactosidasa realizada
por las células diana en los experimentos del Ejemplo 3 que
recibieron el plásmido pcDNA3.1/His B/lacZ por medio de
transfección virosomal confirmó adicionalmente que no solo era
superior la tasa de transfección del plásmido liberado por el
virosoma a la del plásmido liberado por el liposoma sino también la
expresión del mismo en las células diana. Los experimentos dieron
una expresión de veinte veces a cuarenta veces mayor de la
\beta-galactosidasa cuando se usan los virosomas
de DOSPER en lugar de los liposomas de DOSPER para la transfección
del plásmido en las células diana (Fig.12).
Se observó también, sin embargo, que había una
fuerte dependencia del nivel de expresión de la
\beta-galactosidasa de la concentración del
plásmido dentro de los virosomas.
Los virosomas de la preparación 2 contienen solo
la mitad del plásmido de los virosomas de la preparación 1,
mientras que el número de virosomas es el mismo en ambas
preparaciones.
La preparación 1 corresponde a la preparación de
virosomas preferida que se ha usado para la mayoría de los
experimentos descritos en la presente memoria descriptiva.
La preparación 3 contiene la misma cantidad de
plásmido, distribuida sin embargo en un número doble de
virosomas.
La preparación 4 contiene una cantidad todavía
menor de plásmido encapsulado en el mismo número de virosomas que
en las preparaciones 1 y 2.
La preparación 5 contiene la misma cantidad de
plásmido que las preparaciones 1 y 3, encapsulado sin embargo
dentro de un número de virosomas que es tres veces mayor que en la
preparación 1.
Los resultados representados en la Figura 13
testifican que la formulación derivada empíricamente de virosomas
DOSPER preferida era más óptima, y adicionalmente que la
disminución de la concentración de plásmido en las preparaciones 2,
3 y 4 no dio como resultado un aumento en el nivel de expresión. La
hipótesis de que una sobrecarga de las células diana por medio de
la transfección con preparaciones de virosomas similar a la
Preparación 1 anterior podría haber inhibido la expresión
posiblemente ya no era por lo tanto sostenible.
| 2'-Ome | 2'-O Metilo |
| CALLA | antígeno de leucemia linfoblástica aguda común |
| CAT | cloranfenicol acetiltransferasa |
| dpm | desintegraciones por minuto |
| DOSPER | 1,3-dioleoiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida |
| DOTAP | N-[(1,2,3-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamoniometil sulfato |
| FITC- | fosforotioato de oligodesoxirribonucleótido |
| OPT | marcado con isotiocianato de fluoresceína |
| G418 | Geneticin® disulfato (antibiótico G418) |
| HA | hemaglutinina |
| MPB.PE | N-[4-(p-maleimido)-fenilbutiril]fosfatidiletanolamina (=un complejo de entrecruzante-fosfolípido) |
| msc | Secuencia mezcla control |
| NA | neuraminidasa |
| Octil- | n-octil-oligo-oxietileno |
| POE | |
| ODN | Oligodesoxinucleótidos |
| OEG | Octaetilenglicol monododeciléter (C12E8) |
| OPT | fosforotioato(s) de oligodesoxirribonucleótido |
| PC | Fosfatidilcolina |
| PE | Fosfatidiletanolamina |
| PNA | ácido nucleico peptídico |
| SCLC | cáncer de pulmón de célula pequeña |
| SV40 | virus 40 de simio |
Claims (29)
1. Una vesícula de lípidos con una membrana de
bicapa que tiene una carga neta positiva a pH fisiológico y en la
que la vesícula comprende adicionalmente por lo menos un péptido
fusogénico activo que es una hemaglutinina viral no de Sendai que
hace que las vesículas sean internalizadas por células diana por
medio de fagocitosis o endocitosis mediada por receptor,
caracterizada porque la membrana de la vesícula comprende 5
a 30% en peso, basado en los lípidos de la membrana totales, de
1,3-dioleoiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida
(DOSPER), y un total de 95 a 70% en peso de otros lípidos que
comprenden fosfatidilcolina (PC) o un derivado de ésta y
opcionalmente fosfatidiletanolamina (PE) y/o lípidos catiónicos
diferentes a DOSPER.
2. La vesícula según la reivindicación 1,
caracterizada porque contiene adicionalmente un fármaco o
sustancia deseados para descargar en las células diana, estando
dicho fármaco o sustancia preferentemente cargados negativamente y
siendo seleccionados particularmente del grupo formado por un tinte,
una sustancia trazadora, un agente cosmético, una sustancia activa
farmacéutica o biológicamente, y un material de ácido nucleico.
3. La vesícula según la reivindicación 2,
caracterizada porque el fármaco o sustancia deseados son un
material de ácido nucleico seleccionado del grupo formado por un
ADN o ARN de cadena corta, desoxirribonucleótidos,
oligodesoxirribonucleótidos, selenoatos de
oligodesoxirribonucleótidos, fosforotioatos de
oligodesoxirribonucleótidos, fosforamidatos de
oligodesoxirribonucleótidos, metilfosfonatos de
oligodesoxirribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos,
ribonucleótidos, oligoribonucleótidos, fosforotioatos de
oligoribonucleótidos, fosfatos de
2'-OMe-oligoribonucleótidos,
fosforotioatos de
2'-OMe-oligoribonucleótidos,
ribozimas, genes, plásmidos y vectores.
4. La vesícula según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el fármaco o
sustancia deseados son un material de ácido nucleico y la vesícula
comprende dicho material de ácido nucleico en una cantidad que
varía desde 0,03 a 0,1, preferentemente 0,045 a 0,065 \mug de
material de ácido nucleico por 1 \mug de DOSPER.
5. La vesícula según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el diámetro
medio de vesícula está en un intervalo de 120-180
nm.
6. La vesícula según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende
adicionalmente al menos un marcador específico de célula unido a la
membrana de la vesícula.
7. La vesícula según la reivindicación 6,
caracterizada porque la membrana de la vesícula comprende
adicionalmente fosfatidiletanolamina (PE) y un entrecruzante
bifuncional que se une a través de uno de sus sitios de unión a un
grupo amino libre de la PE y a través de su otro sitio de unión, al
marcador específico de célula.
8. La vesícula según la reivindicación 6 ó 7,
caracterizada porque el marcador específico de célula es una
proteína activa biológicamente para la unión a un receptor de las
células diana seleccionado del grupo formado por un anticuerpo, un
fragmento de anticuerpo, una citoquina y un factor de
crecimiento.
9. La vesícula según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la
hemaglutinina se deriva de un virus seleccionado del grupo formado
por rhabdovirus, virus de parainfluenza tipo III, virus Semliki
Forest y togavirus.
10. La vesícula según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la membrana de
la vesícula comprende DOSPER en una concentración de 10 a 30%,
preferentemente 20 a 25% en peso, basado en los lípidos de la
membrana totales.
11. La vesícula según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la membrana de
la vesícula comprende, basado en los lípidos de la membrana
totales, 25% en peso de DOSPER y 75% en peso de PC, preferentemente
dioleoilfosfatidilcolina (DOPC).
12. Una composición que comprende una pluralidad
de vesículas definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11 en combinación con un vehículo adecuado, para uso en
aplicaciones cosméticas, farmacéuticas o diagnósticas.
13. Un procedimiento para la elaboración de una
vesícula de lípidos según la reivindicación 1, caracterizada
porque comprende las etapas de
(a) preparar una solución tampón que comprende un
detergente no iónico y que adicionalmente comprende
DOSPER y otros lípidos y al menos un péptido fusogénico activo que es una hemaglutinina viral no de Sendai que hace que las vesículas sean internalizadas por las células diana a través de fagocitosis o endocitosis mediada por receptor;
DOSPER y otros lípidos y al menos un péptido fusogénico activo que es una hemaglutinina viral no de Sendai que hace que las vesículas sean internalizadas por las células diana a través de fagocitosis o endocitosis mediada por receptor;
(b) ajustar las concentraciones de lípidos a,
basado en los lípidos de membrana totales, 5 a 30% en peso de
DOSPER y hasta un total de 95 a 70% en peso de dichos otros lípidos
que comprenden fosfatidilcolina (PC) o un derivado de ésta y
opcionalmente fosfatidiletanolamina (PE) y/o lípidos catiónicos
diferentes a DOSPER; y
(c) eliminar el detergente mediante diálisis o
tratando la solución con gotas de microvehículo, dando como
resultado la formación de dichas vesículas de bicapa lipídica
cargadas positivamente.
14. El procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque comprende adicionalmente una etapa de
incorporación en las vesículas de una cantidad de un fármaco o
sustancia deseados para descargar en las células diana, estando
dicho fármaco o sustancia deseados preferentemente cargados
negativamente y siendo particularmente seleccionados del grupo
formado por un tinte, una sustancia trazadora, un agente cosmético,
una sustancia activa farmacéutica o biológicamente, y un material
de ácido nucleico.
15. El procedimiento según la reivindicación 13 ó
14, caracterizado porque comprende adicionalmente una etapa
de preparación de complejos de moléculas conjugados formados por
fosfatidiletanolamina (PE), un entrecruzante bifuncional, y un
marcador específico de célula de una forma tal que el entrecruzante
bifuncional se una al grupo amino de la PE a través de uno de sus
sitios de unión y a través de otro a un grupo tiol del marcador
específico de célula, eliminando el material no conjugado y
añadiendo los complejos de moléculas a la solución en la etapa
a).
16. El procedimiento según la reivindicación 14 ó
15, caracterizado porque la incorporación del fármaco o
sustancia deseados se lleva a cabo por la adición a la solución en
la etapa (a) del fármaco o sustancia deseados, después de que en la
etapa (c) se formen las vesículas que contienen dicho fármaco o
sustancia.
17. El procedimiento según la reivindicación 14 ó
15, caracterizado porque la incorporación del fármaco o
sustancia deseados a la vesícula se lleva a cabo por la adición a
las vesículas que se dan como resultado de la etapa (c) del fármaco
o sustancia deseados, sonicando la mezcla para integrar el fármaco o
sustancia en las vesículas, y eliminando el material no integrado,
preferentemente por filtración en gel.
18. El procedimiento según la reivindicación 14 ó
15, caracterizado porque la incorporación del fármaco o
sustancia deseados a las vesículas se lleva a cabo por la adición a
las vesículas que se dan como resultado de la etapa (c) de
complejos de lípidos o liposomas cargados positivamente que incluyen
el fármaco o sustancia deseados y por la sonicación de la mezcla
resultante para fusionar los complejos de lípidos o liposomas con
dichas vesículas para integrar el fármaco o sustancia en dichas
vesículas.
19. El procedimiento según la reivindicación 18,
caracterizado porque los complejos de lípidos o liposomas
cargados positivamente comprenden 50 a 100% en peso, basado en los
contenidos de lípidos totales, de lípido DOSPER.
20. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, en el que el marcador específico de
célula se selecciona del grupo formado por un anticuerpo, un
fragmento de anticuerpo, una citoquina y un factor de
crecimiento.
21. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 20, caracterizado porque el fármaco o
sustancia deseados son un material de ácido nucleico seleccionado
del grupo formado por ADN o ARN de cadena corta,
desoxirribonucleótidos, oligodesoxirribonucleótidos, selenoatos de
oligodesoxirribonucleótidos, fosforotioatos de
oligodesoxirribonucleótidos, fosforamidatos de
oligodesoxirribonucleótidos, metilfosfonatos de
oligodesoxirribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos,
ribonucleótidos, oligoribonucleótidos, fosforotioatos de
oligoribonucleótidos, fosfatos de
2'-OMe-oligoribonucleótidos,
fosforotioatos de
2'-OMe-oligoribonucleótidos,
ribozimas, genes, plásmidos y vectores.
22. El procedimiento según la reivindicación 21,
caracterizado porque el material de ácido nucleico se
incorpora en los virosomas a una concentración de 0,03 a 0,1,
preferentemente 0,045 a 0,065 \mug de material de ácido nucleico
por 1 \mug de lípido DOSPER.
23. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 22, caracterizado porque el detergente
no iónico es octaetilenglicol monododeciléter (C_{12}E_{8})( )
o n-octil-oligooxietileno.
24. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 23, caracterizado porque el agente
entrecruzante es una molécula orgánica heterobifuncional que tiene
al menos un grupo maleimido y al menos un grupo carboxilo, y
preferentemente se selecciona del grupo formado por derivados de
bis-N-succinimidilo y derivados de
succinimidilo fotoactivable.
25. Uso de una vesícula según la reivindicación 1
para la fabricación de una composición para aplicaciones cosméticas,
diagnósticas o médicas, particularmente para descargar un fármaco
o sustancia deseados en células diana en reposo o
proliferación.
26. Uso según la reivindicación 25,
caracterizado porque dichas células diana se incuban in
vitro en presencia de dichas vesículas y porque dichas células
diana incubadas son transferibles opcionalmente a un organismo in
vivo.
27. Uso según la reivindicación 25 ó 26,
caracterizado porque las células diana se seleccionan del
grupo formado por células cancerosas, células leucémicas y células
infectadas viralmente.
28. Uso según la reivindicación 27,
caracterizado porque la actividad metabólica o proliferativa
de dichas células diana se reduce bajo incubación en presencia de
dichas vesículas.
29. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 28, caracterizado porque dicho fármaco
o sustancia deseados son un material de ácido nucleico que
comprende al menos un oligonucleótido antisentido, preferentemente
un oligonucleótido antisentido que se dirige a ARNm codificado por
protooncogen u oncogen.
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