SK4782002A3 - Lipidic vesicles, a method for the manufacture thereof pharmaceutical composition containing the same and use thereof - Google Patents
Lipidic vesicles, a method for the manufacture thereof pharmaceutical composition containing the same and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- SK4782002A3 SK4782002A3 SK478-2002A SK4782002A SK4782002A3 SK 4782002 A3 SK4782002 A3 SK 4782002A3 SK 4782002 A SK4782002 A SK 4782002A SK 4782002 A3 SK4782002 A3 SK 4782002A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- dosper
- substance
- vesicle
- virosomes
- vesicles
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 5
- 239000000277 virosome Substances 0.000 claims abstract description 151
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 51
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 33
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 20
- -1 nucleic acid compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108010093857 Viral Hemagglutinins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 66
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 32
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 28
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 19
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 claims description 19
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 17
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 17
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 17
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 9
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 8
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 claims description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 5
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 claims description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 4
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 claims description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 2
- YYELLDKEOUKVIQ-UHFFFAOYSA-N octaethyleneglycol monododecyl ether Chemical group CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO YYELLDKEOUKVIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims 2
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 claims 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 claims 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims 1
- 239000002801 charged material Substances 0.000 abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 90
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 125000004035 thiopropyl group Chemical group [H]SC([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- NGXDNMNOQDVTRL-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-(4-azido-2-nitroanilino)hexanoate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O NGXDNMNOQDVTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 2
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical group ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 2
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LWAVGNJLLQSNNN-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-azidobenzoate Chemical compound C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LWAVGNJLLQSNNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHYRLCJMMJQUBY-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCC1=CC=C(N2C(C=CC2=O)=O)C=C1 VHYRLCJMMJQUBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- LAGUSEHJTGJJRJ-UHFFFAOYSA-N 2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)-2-oxoethyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(C(=O)CNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC LAGUSEHJTGJJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710155834 C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 1
- 241000189662 Calla Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710151803 Mitochondrial intermediate peptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000713102 Mus musculus C-C motif chemokine 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- NFGODEMQGQNUKK-UHFFFAOYSA-M [6-(diethylamino)-9-(2-octadecoxycarbonylphenyl)xanthen-3-ylidene]-diethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C21 NFGODEMQGQNUKK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ITFGZZGYXVHOOU-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylmethanamine;methyl hydrogen sulfate Chemical compound C[NH+](C)C.COS([O-])(=O)=O ITFGZZGYXVHOOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSONUCOCPOCMJG-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-tetradecyl-3-(tetradecylamino)propanimidamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCNCCC(=N)N(C(C)(C)C)CCCCCCCCCCCCCC CSONUCOCPOCMJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- LUYQYZLEHLTPBH-UHFFFAOYSA-N perfluorobutanesulfonyl fluoride Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)S(F)(=O)=O LUYQYZLEHLTPBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000008299 viral mechanism Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Predložený vynález je z oblasti biochémie, génovej biotechnológie a génovej terapie a týka sa nových virozómov, tzn. pozitívne nabitých lipozómových vezikúl obsahujúcich v membráne vírusové glykoproteíny, na vysoko účinný prenos požadovaného materiálu, najmä genetického materiálu, do cieľových lokalít, a ich užitočných aplikácií. Predložené katiónové virozómy sú výnimočne vhodné na špecifické a nešpecifické, neinfekčné dodávanie negatívne nabitých zlúčenín, výhodne génov, do cieľových buniek in vitro a in vivo.
Doterajší stav techniky
WO 92/13525, ktorého celý obsah je tu začlenený jeho citáciou, uvádza, že virozómy vyrobené z fosfolipidových dvojvrstvových membrán, ktoré sú prestúpené vírusovými ihlicovými proteínmi z influenza vírusu a bunkovo špecifickými markermi, ako napríklad monoklonálnymi protilátkami, veľmi účinne fúzujú s modelovými membránami a živočíšnymi bunkami vďaka penetračnému mechanizmu podobnému s vírusovým mechanizmom prostredníctvom receptorom sprostredkovanej endocytózy. Hoci sú tieto virozómy úspešne aplikované na dodávanie chemických látok a požadovaných liečiv do cieľových lokalít, trpia určitými nevýhodami čo sa týka stabilného začlenenia a prenosu nabitých molekúl, ako napríklad negatívne nabitých nukleových kyselín.
WO 97/41834, ktorého celý obsah je tu začlenený jeho citáciou, opisuje katiónové virozómy na bunkovo špecifické dodávanie genetického materiálu do cieľových buniek in vitro a in vivo. Ďalej uvádza spôsob výroby takýchto virozómov, ako aj spôsoby aplikácie týchto virozómov.
-2Podstata vynálezu
Predložený vynález je podrobnejším rozvinutím vynálezu zverejneného pod číslom WO 97/41834 a týka sa nových katiónových virozómov, do ktorých sa vďaka ich špecifickému zloženiu membrány môže veľmi účinne naložiť akýkoľvek negatívne nabitý materiál, výhodne genetický materiál zahŕňajúci DNA alebo RNA s dlhým aj krátkym reťazcom, oligodeoxynukleotidy, ribonukleotidy, peptidové nukleové kyseliny (PNA), ribozýmy (RNA molekuly s enzymatickými aktivitami), gény, plazmidy a vektory. Neočakávane sa zistilo, že keď sa použije DOSPER ako katiónový lipid, v kombinácii s inými lipidmi, je možné vyrobiť vysoko účinné virozómy, ktoré až desaťkrát prekračujú už aj tak vysokú transfekčnú účinnosť DOTAP virozómov podľa WO 97/41834. Avšak tento prekvapujúci účinok sa dosiahne len keď sa ako katiónový lipid použije DOSPER, a keď sa DOSPER kombinuje s inými lipidmi v pomere, ktorý sa líši od známeho pomeru katiónových lipidov (DOTAP) voči iným lipidom, ktoré sú explicitne vymenované a nárokované voWO 97/41834.
Podstatou vynálezu sú lipidové vezikuly, ktoré typicky obsahujú vezikulovú membránu majúcu pozitívny sieťový náboj vďaka prítomnosti katiónových lipidov. Okrem toho obsahujú fuzogénne peptidy vírusového pôvodu, predominantne glykopeptidy vírusových obalov, ako napríklad hemaglutinín influenza vírusu, ktoré spôsobujú začleňovanie virozómov cieľovými bunkami prostredníctvom receptorom sprostredkovaného penetračného mechanizmu. Voliteľne môžu byť vybavené aj bunkovo špecifickými markerami na prednostné pripojenie na požadované cieľové bunky in vivo.
V jednom uskutočnení, ktoré je výhodné pre in vivo aplikácie virozómov, sa predložený vynález týka aj ireverzibilného kovalentného naviazania bunkovo špecifických markerov na katiónové virozómy zahŕňajúc, ale bez obmedzenia, monoklonálne protilátky, protilátkové fragmenty, ako napríklad F(ab’)2 a Fab fragmenty, cytokíny a/alebo rastové faktory, ktoré sú užitočné na selektívnu detekciu a viazanie cieľových buniek. Na vezikulovú membránu sú naviazané tak, aby vyčnievali do exteriéru a vykazovali v podstate úplnú funkčnú aktivitu čo sa týka detekcie a väzby receptora. Výhodný spôsob výroby virozómov obsahujúcich
-3miestne orientovaný sieťovo naviazaný bunkovo špecifický marker je opísaný v príklade 1 vo WO97/41834 pre DOTAP virozómy. Podľa tohto spôsobu sa bunkovo špecifické markery pripoja na vopred vytvorené fosfatidyletanolamínové molekuly na vytváranie priečnych väzieb, ako napríklad A/-[4-(p-maleimido-fenylbutyryl]fosfatidyletanolamín (MPB.PE) v prítomnosti detergentu.
Na dosiahnutie najlepších možných výsledkov je výhodné opatrne izolovať a purifikovať vírusové glykoproteíny pred rekonštituovaním, aby sa zabránilo inaktivácii buď proteolytickým štiepením, alebo redukciou vnútromolekulových S-S väzieb. V súlade s tým je výhodné, aby sa konjugované markery, napríklad markerMPB.PE, oddelili od nekonjugovaných fosfatidyletanolamínových molekúl na vytváranie priečnych väzieb (napríklad MPB.PE) afinitnou chromatografiou s aktivovanou agarózovou matricou, výhodne s redukovanou tiopropylovou Sepharose 6B. Alikvóty konjugovaných komplexov fosfatidyletanolamínových molekúl na vytváranie priečnych väzieb a markerových molekúl sa potom pridajú do detergentného roztoku obsahujúceho zmes rozpustených membránových lipidov, fúzovaných peptidov a iných želateľných zložiek pred tým, ako sa z nich vytvoria katiónové virozómy.
Je výhodné uskutočňovať párovací postup bifunkčného činidla na vytváranie priečnych väzieb s fosfolipidom a bunkovo špecifickým markerom ako oddelené procesy pred prípravou virozómov. Tento postup umožňuje lepšie kontrolovať a optimalizovať povrchovú hustotu virozómových membrán, najmä s ohľadom na počet bunkovo špecifických markerov, ktoré sú na nich naviazané. Zlepšená kontrola koncentrácie proteínových molekúl začlenených do alebo naviazaných na membránu je dôležitá do tej miery, do akej môže nevyvážený pomer fúzovaných peptidov (napríklad hemaglutinínu) a bunkovo špecifických markerov (napríklad protilátkových Fab’ fragmentov) na virozómovej membráne redukovať alebo aj zničiť ich selektívne vlastnosti a - v extrémnom prípade - môže viesť k zhlukovaniu a precipitácii vezikúl.
Výhodnosť použitia protilátkových fragmentov F(ab’)2 a Fab’ namiesto celých protilátkových molekúl ako bunkovo špecifických markerov bola podrobne diskutovaná vo WO 97/41834. Predložené bunkovo špecifické virozómy vykazujú selektivitu voči rôznym bunkovým typom vďaka ich bunkovo špecifickým markerom
-4na membráne a zároveň majú vysokú schopnosť penetrovať do bunky endocytózou vďaka vírusovému fuzogénnemu peptidu, napr. hemaglutinínu. Virozómy s Fab’ fragmentárni, ktoré rozoznávajú antigény asociované s tumorom, ako napríklad TAG72, CEA, 17-1 A, CA 19-9 alebo antigény asociované s leukémiou, ako napríklad CD 10 (CALLA = bežný antigén akútnej lymfocytovej leukémie) a CD20, sa selektívne, tzn. prednostnejšie, viažu na nádorové alebo leukemické bunky nesúce spomenuté antigény na ich bunkovom povrchu.
Nové vezikuly alebo virozómy sú užitočné najmä na prenos akéhokoľvek požadovaného negatívne nabitého materiálu, výhodne genetického materiálu, do cieľových lokalít, najmä do živočíšnych a ľudských buniek a tkanív, in vitro a in vivo. Je treba zdôrazniť, že nové virozómy sú schopné penetrovať nie len do proliferujúcich, tzn. replikujúcich sa, buniek, ale aj do neproliferujúcich, tzn. buniek v pokojovom štádiu, čo je znak, ktorý ich robí široko aplikovateľnými v oblasti biologických vied, farmakológie a medicíny tak vo forme výskumných a/alebo diagnostických nástrojov, ako aj vo forme liečiva. Použitie predložených virozómov ako prepravcov na dodávanie cytotoxických činidiel alebo nukleokyselinového materiálu ich robí vhodnými na aplikácie pri rôznych patologických stavoch, ako napríklad pri vírusových infekciách, rakovinách, nádoroch, leukémiách alebo iných ochoreniach vrátane ochorení, ktoré sú spôsobené genetickými defektmi a môžu byť vhodné pre metódy génovej terapie použitím predložených virozómov.
Virozómy podľa predloženého vynálezu môžu byť aplikované in vitro alebo in vivo. Napríklad, čistenie kostnej drene sa používa ako časť liečby niekoľkých neoplázii vrátane akútnej a chronickej leukémie. V súčasnosti sa dreň čistí od leukemických buniek rôznymi činidlami, ako napríklad imunologickými reakčnými činidlami a chemoterapeutickými liekmi. Potvrdilo sa, že ODN obalený vo virozóme a namierený proti onkogénu, ktorý poskytuje leukemickým bunkám rastovú výhodu, je terapeuticky užitočný, a čo je dôležitejšie, selektívnejší ako bežné chemoterapeutické činidlá pri eliminácii leukemických buniek, pričom šetrí normálne originálne bunky.
Na použitie ako liečivo môžu byť predložené virozómy časťou farmaceutického prostriedku, ktorý okrem toho obsahuje zvyčajné aditíva a farmaceutický prijateľné nosiče. Výhodné je, aby bol farmaceutický prostriedok
-5pripravený ako injekčný roztok, ale na niektoré aplikácie môžu byť výhodné aj iné formy prípravku, napr. emulzie, krémy, gély, masti na topické alebo systémové podávanie.
Takže predmetom predloženého vynálezu je aj použitie predložených virozómov na výrobu farmaceutického prostriedku vhodného na profylaktické a/alebo terapeutické ošetrenie zvieraťa alebo človeka, pre ktorých môže byť takéto ošetrenie užitočné. Ďalším predmetom predloženého vynálezu je použitie predložených virozómov na výrobu diagnostického kitu na in vitro a in vivo aplikácie.
Predložené vezikuly sa výhodne získavajú spôsobom, ktorý je analogický s akýmkoľvek zo spôsobov na výrobu DOTAP virozómov, ktoré sú opísané v príkladoch 1 až 3 a 6 vo WO 97/41834, s tou výnimkou, že DOTAP je nahradený DOSPERom, a že DOSPER koncentrácia v konečnej virozómovej membráne je správne nastavená v súlade s definíciou uvedenou tu nižšie a najmä, že táto koncentrácia nepresahuje 30 % hmotnosti celkového lipidového obsahu virozómu. V podstate zahŕňa spôsob prípravy predložených virozómov nasledujúce kroky:
a) prípravu tlmivého roztoku, ktorý obsahuje neiónový detergent, a ktorý okrem toho obsahuje DOSPER a iné lipidy a aspoň jeden aktívny fuzogénny peptid, ktorým je vírusový hemaglutinín iný ako Sendai, ktorý spôsobuje internalizáciu vezikúl cieľovými bunkami prostredníctvom receptorom sprostredkovanej fagocytózy alebo endocytózy;
b) nastavenie lipidových koncentrácií (vztiahnuté na celkové membránové lipidy) na 5 až 30 % hmotn. DOSPER a vyváženie 95 až 70 % hmotn. inými lipidmi zahŕňajúcimi fosfatidylcholín (PC) alebo jeho deriváty a voliteľne fosfatidyletanolamín (PE) a/alebo katiónové lipidy iné ako DOSPER; a
c) odstránenie detergentu dialýzou alebo ošetrením roztoku s mikronosičovými guľôčkami, čo vedie k vytvoreniu pozitívne nabitých lipidových dvojvrstvových vezikúl; a výhodne
d) zavedenie určitého množstva požadovaného lieku alebo látky do vezikúl na dodanie do cieľových buniek, pričom požadovaný liek alebo látka je výhodne negatívne nabitá a najmä vybraná zo skupiny obsahujúcej farbičku, stopovaciu látku, kozmetické činidlo, farmaceutický alebo biologicky aktívnu látku a nukleokyselinový materiál.
-6V inom uskutočnení vynálezu výhodnom na in vivo aplikácie virozómov sa aplikuje vhodné bifunkčné činidlo na vytváranie priečnych väzieb na ireverzibilné naviazanie bunkovo špecifického markera na vezikulovú membránu. Bunkovo špecifický marker, ktorý je namierený proti bunkovému receptoru zodpovednému za selektívne naviazanie virozómu na bunky, sa viaže na činidlo na vytváranie priečnych väzieb takým spôsobom, že je stále plne biologicky aktívny. Je výhodne, aby sa činidlo na vytváranie priečnych väzieb použilo vo forme vopred vytvoreného molekulového komplexu, v ktorom je činidlo na vytváranie priečnych väzieb kovalentne naviazané na fosfatidyletanolamín a bunkovo špecifický marker, ako je definované v nárokoch.
Výraz fuzogénny peptid označuje peptidy alebo proteíny, ktoré sú schopné indukovať a/alebo napomáhať fúzovacej reakcii medzi virozómovou membránou a lipidovou membránou cieľovej bunky. Vo väčšine uskutočnení označuje vírusové ihlicové glykoproteíny obsahujúce fúzovací peptid, najmä kompletný hemaglutínový spúšťač vírusových povrchových ihlíc, jeho monomér alebo jednu alebo obe štiepne podjednotky, glykopeptidy HA1 a HA2 obsahujúce funkčný fúzovací peptid. V inom uskutočnení predloženého vynálezu výraz označuje samotný čistý fúzovací peptid, buď izolovaný z prirodzených zdrojov, alebo produkovaný synteticky. Vo výnimočne výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu označujú tieto polypeptidy obsahujúce fúzovací peptid hemaglutinínu influenza vírusu, napríklad hemaglutinín A-H1N1 subtyp.
Namiesto, alebo okrem influenza vírusového hemaglutinínu môžu byť na použitie ako fúzované peptidy (proteíny) pre predložené virozómy vhodné aj hemaglutiníny z iných vírusov pokiaľ vykazujú v podstate rovnaký pHsprostredkovaný bunkový penetračný mechanizmus ako influenza hemaglutinín. Kandidátske hemaglutiníny zahŕňajú napríklad rhabdovírus, parainfluenza vírus typ III, Semliki Forest vírus a togavírus, ako je opísané vo WO97/41834.
Výraz činidlo na vytváranie priečnych väzieb označuje organickú heterobifunkčnú molekulu schopnú naviazať sa na povrch vezikúl pripravených podľa tohto vynálezu a schopnú viazať polypeptidy. Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu táto molekula obsahuje /V-hydroxysukcínimidovú skupinu na párovanie s aminoskupinou fosfatidyletanolamínu a maleimidovú skupinu na
-Ί konjugáciu s bunkovo špecifickými markerom, ako napríklad fragmentom monoklonálnej protilátky. Vhodné činidlá na vytváranie priečnych väzieb zahŕňajú sukcínimidyl 4-(/V-maleimidometyl)-cyklohexán-1 -karboxylát, m-maleimidobenzoyl/V-hydroxysukcínimidester, m-maleimidobenzoyl-/V-hydroxysulfosukcínimidester, sukcínimidyl 4-(p-maleimidofenyl)-butyrát, sulfosukcínimidyl 4-(p-maleimidofenyl)butyrát. Alternatívne môže byť činidlom na vytváranie priečnych väzieb molekula, ktorá obsahuje /V-hydroxysukcínimidovú skupinu a fotoreaktívnu azido skupinu na pripojenie markerov, napríklad cytokínov, ako napríklad /V-hydroxysukcínimidylsuberát (NHS-SA), /V-hydroxysukcínimidyl-4-azidobenzoát (HASAB), /V-sukcínimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrofenylamino)hexanoát (SANPAH), /V-sulfosukcínimidyl-6-(4'-azido-2-nitrofenylamino)hexanoát. Je výhodné, aby bolo činidlo na vytváranie priečnych väzieb použité vo forme vopred vytvoreného molekulového komplexu lipid plus činidlo na vytváranie priečnych väzieb plus bunkovo špecifický marker.
Výraz bunkovo špecifický proteín alebo bunkovo špecifický markeľ označuje proteín, ktorý je schopný naviazať sa na činidlo na vytváranie priečnych väzieb respektívne na komplex činidla na vytváranie priečnych väzieb a lipidu, a okrem toho je schopné viazať sa na receptor cieľových buniek. Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu táto molekula označuje monoklonálnu protilátku, protilátkový fragment, cytokín alebo rastový faktor. Bunkovo špecifický marker poskytuje selektívnu detekciu a viazanie sa na cieľové bunky a tak zlepšuje účinok fuzogénneho peptidu, ktorý sa spolu s ním nachádza vo virozómovej membráne. Výhodné protilátkové fragmenty zahŕňajú F(ab’)2 a Fab’ fragmenty, zatiaľ čo bunkovo špecifické markery ďalej zahŕňajú interleukíny a iné cytokíny, najmä tie, ktoré sú uvedené nižšie v tabuľke 1.
Tabuľka 1
| Cytokíny (medzinárodné skratky) | |||
| BDNF | IFNa | MIP-1a | PDGF |
| CNTF | IFNp | ΜΙΡ-1β | PF-4 |
| EGF | IFNy | MIP-2 | RANTES |
| E po | IL-1 až il-15 | NGF | SCG |
| GFG | LIF | NT-3 | TGFa |
| G-CSF | LT (TNFp) | NT-4 | TGFp |
| GM-CSF | MCP-1 až MCP-3 | OSM | TNFa |
| 1-309/TCA-3 | M-CSF | PBP | Tpo |
| γΙΡ-10 | MIF | PBSF | jVEGF |
Výraz katiónový lipid, tak ako je používaný tu, označuje organickú molekulu, ktorá obsahuje katiónovú zložku a nepolárny chvost, takzvaný „head-totaiľ amfifil, ako napríklad Λ/-[(1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-/V,/V,/\/-trimetylamóniumchlorid (DOTMA) (Felgner a ďalší, Proc. Natl. Acad. USA 84: 7413-7417, 1987), Λ/-[(1,2,3-dioleoyloxy)-propyl]-/V,/\/,/\/-trimetylamóniummetylsulfát (DOTAP) alebo A/-ŕerc-butyl-/V-tetradecyl-3-tetradecylaminopropiónamidín (Ruysschaert a ďalší, Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 1622-1628, 1994). Ak nie je explicitne uvedené inak, výraz zahŕňa aj nižšie definované polykatiónové lipidy.
Výraz polykatiónový lipid označuje organickú molekulu, ktorá obsahuje polykatiónovú zložku a nepolárny chvost, ako napríklad lipospermín: 1,3-dipalmitoyl2-fosfatidyletanolamido-spermín (DPPES) a dioktadecylamidoglycyl-spermín (DOGS) (Behr a ďalší, Proc. Natl. Acad. USA 86: 6982-6986, 1989), 2,3-dioleoyloxy-/V-[2-(spermínkarboxamido)etyl]-/V,/V-dimetyl-1-propánamínium-trifluóracetát (DOSPA), 1,3-dioleoyloxy-2-(6-karboxy-spermyl)-propylamid (DOSPER), Ν,Ν,Ν’,Ν'tetrametyl-/V,/\f-bis(2-hydroxyetyl)-2,3-dioleoyloxy-1,4-butándiamónium-jodid (THDOB).
Podstatné je, aby všetky virozómy podľa predloženého vynálezu obsahovali DOSPER a jeden alebo viacero iných prirodzených alebo syntetických lipidov, ktoré sú pozitívne nabité alebo neutrálne. Termínom pozitívne nabitý sa myslí, že lipidy majú pozitívny sieťový náboj pri fyziologickom pH. Takže výraz pozitívne nabité lipidy, membrány alebo virozómy má označovať lipidy, membrány alebo virozómy, ktoré majú pozitívny sieťový náboj pri fyziologickom pH. Neutrálne lipidy nevykazujú žiadny sieťový náboj pri fyziologickom pH a zahŕňajú lipidy ako napríklad cholesterol alebo jeho deriváty a/alebo fosfolipidy obojakého iónového
-9typu, ktoré majú pozitívne a negatívne nabité oblasti vo vnútri molekuly, ktoré si vzájomne stechiometricky kompenzujú náboje.
Výraz negatívne nabitý materiál, tak ako je používaný tu, zahŕňa akékoľvek požadované liečivo alebo látku, ktoré nesú negatívny sieťový náboj pri fyziologickom pH.
Výraz požadované liečivo alebo látka, tak ako je používaný tu, zahŕňa akúkoľvek chemickú látku, zlúčeninu alebo zmes zlúčenín, ktoré sú aplikovateľné na kozmetické, diagnostické, farmaceutické, medicínske alebo akékoľvek iné vedecké účely. Takéto látky zahŕňajú zlúčeniny, ktoré je možné analyticky monitorovať in vitro alebo in vivo, ako napríklad farbičku, fluorescenčné farbičky, rádioaktívne alebo inak značené zlúčeniny, stopovacie alebo markerové látky; zahŕňajú však aj proteínové alebo neproteínové liečivá alebo akékoľvek iné farmaceutický alebo biologicky aktívne látky, najmä bežné protivírusové alebo protirakovinové činidlá, ale aj nukleokyselinové zlúčeniny, ako sú tu definované. Keďže predložené virozómy sú pri fyziologickom pH pozitívne nabité, je výhodné, aby boli naplnené buď neutrálnymi, alebo negatívne nabitými požadovanými liečivami alebo látkami, pretože je tak umožnené najúčinnejšie a najstabilnejšie začlenenie do virozómov.
Výrazy nukleová kyselina alebo genetický materiál, tak ako sú používané tu, zahŕňajú DNA alebo RNA s krátkymi reťazcami, deoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidové selenoáty, oligodeoxyribonukleotidové fosforotioáty (OPTs), oligodeoxyribonukleotidové fosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidové metylfosfonáty, peptidové nukleové kyseliny (PNAs), ribonukleotidy, oligoribonukleotidy, oligoribonukleotidové fosforotioáty, 2'-0meoligoribonukleotidové fosfáty, 2'-Ome-oligoribonukleotidové fosforotioáty, ribozýmy (RNA molekuly s enzymatickými aktivitami), gény, plazmidy a vektory (klonovacie vehikula).
Výraz virozómy, tak ako je používaný tu, označuje, v jeho najjednoduchšej forme, lipozomálne vezikuly s dvojvrstvovou membránou obsahujúcou katiónové lipidy a vnútorným, výhodne vodným, priestorom, pričom membrána okrem toho obsahuje vírusové proteíny, konkrétne vírusové glykoproteíny. Vo výhodnom uskutočnení vírusové proteíny zahŕňajú aspoň jeden fuzogénny peptid alebo proteín
- 10s úplnou biologickou fúzovacou aktivitou, konkrétne ihlicový glykoproteínový hemaglutinín a/alebo neuramidázu influenza A (napr. A/Singapore) vírusu. Treba chápať, že vírusové proteíny zahŕňajú aj synteticky produkované aminokyselinové sekvencie zodpovedajúce alebo rovnaké ako tu opísaný fúzovací peptid influenza vírusu. Membránové lipidy zahŕňajú vyššie definované katiónové lipidy, ale voliteľne môžu zahŕňať aj iné prirodzené a/alebo syntetické lipidy, výhodne fosfolipidy, ako napríklad fosfatidylcholín (PC) a fosfatidyletanolamín (PE).
Hoci katiónové virozómy podľa predloženého vynálezu môžu byť v mnohých prípadoch, najmä na in vitro bunkové kultivačné experimenty, úspešne aplikované bez bunkovo špecifických markerov na membráne, na in vivo aplikácie je výnimočne výhodné, aby obsahovali aj aspoň jeden bunkovo špecifický marker, ako je definovaný vyššie, na membráne. Priemerný priemer vezikúl je v rozsahu 120 až 180 nm, čo sa stanovuje elektrónovou mikroskopiou a dynamickým svetelným rozptylom.
Použitím katiónových virozómov podľa predloženého vynálezu ako nosičov pre požadované liečivá alebo látky vrátane genetického materiálu, je možné predchádzať alebo aspoň značne znížiť nežiadúce vedľajšie účinky spôsobené toxicitou. Tento užitočný účinok sa dosahuje vďaka tomu, že predložené katiónové virozómy majú, v porovnaní s doteraz známymi lipozómami alebo virozómami, oveľa vyššiu aktivitu a účinnosť prenosu zachyteného materiálu, najmä negatívne nabitého materiálu, ako napríklad antisense oligonukleotidov, do cieľových buniek a, čo je ešte dôležitejšie, oveľa vyššiu aktivitu a účinnosť expresie transfekovaného nukleokyselinového materiálu cieľovou bunkou.
Z toho vyplýva, že predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť DOSPER virozómy definované v nároku 1 a ich variácie definované ako ďalšie uskutočnenia v nasledujúcich nárokoch 2 až 11. Predmetom vynálezu je aj poskytnutie prostriedkov obsahujúcich nové virozómy spolu s vhodným nosičom na rôzne aplikácie, ako je určené napríklad v nároku 12.
Ďalej vynález poskytuje spôsobu výroby nových virozómov, ako je určený v nároku 13, s variáciami definovanými v nárokoch 14 až 24.
-11 Ešte ďalším predmetom predloženého vynálezu je vysvetlenie a nárokovanie špecifickejších spôsobov používajúcich predložené virozómy, ako sú definované v nárokoch 25 až 29.
Na to, aby mohol byť tu opísaný vynález hlbšie pochopený uvádzame nasledujúce príklady. Príklady sú len na ilustratívne účely a nie sú v žiadnom ohľade mienené ako obmedzujúce tento vynález.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek ľudskej transformovanej primárnej embryonálnej obličkovej bunkovej línie 293 T v 0,5 ml média sa transfekovalo DOSPER-virozómami a DOSPER-lipozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
Obrázok 2: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek opičej fibroblastovej bunkovej línie COS-1 sa transfekovalo DOSPER-virozómami a DOSPER-lipozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
Obrázok 3: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek bunkovej línie HeLa z ľudského epitelioidného karcinómu krčku maternice v 0,5 ml média sa transfekovalo DOSPER-virozómami a DOSPERlipozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
Obrázok 4: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek myšacej fibroblastovej bunkovej línie NIH3T3 sa transfekovalo DOSPER-virozómami a DOSPER-lipozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
Obrázok 5: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek ľudskej chronickej myelogénnej leukemickej bunkovej línie K562 sa transfekovalo DOSPER-virozómami a DOSPER-lipozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
Obrázok 6: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek myšacej myelómovej bunkovej línie P3 sa transfekovalo
- 12DOSPER-virozómami a DOSPER-lipozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
Obrázok 7: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek bunkových línií COS-1, 293T, K562 a P3X63Ag8 sa transfekovalo DOSPER-virozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pcDNA3.1/His B/lacZ.
Obrázok 8: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek ľudskej transformovanej primárnej embryonálnej obličkovej bunkovej línie 293 T v 0,5 ml média sa transfekovalo DOSPER-virozómami a DOTAP-virozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pcDNA3.1/His B/lacZ his (0,4 pg DNA; 24000 dpm = 100 %).
Obrázok 9: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek ľudskej chronickej myelogénnej leukemickej bunkovej línie K562 v 0,5 ml média sa transfekovalo DOSPER-virozómami a DOTAP-virozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pcDNA3.1/His B/lacZ his (0,4 pg DNA; 24000 dpm = 100 %).
Obrázok 10: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek hybridnej nesekretujúcej myšacej bunkovej línie Sp2 v 0,5 ml média sa transfekovalo DOSPER-virozómami a DOTAP-virozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pcDNA3.1/His B/lacZ his (0,4 pg DNA; 24000 dpm = 100%).
Obrázok 11: Vplyv dĺžky času transfekcie na množstvo prijatého DNAplazmidu. 5x105 buniek ľudskej epiteloidnej karcinómovej bunkovej línie HeLa sa transfekovalo DOSPER-virozómami obsahujúcimi 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
Obrázok 12: Expresia β-galaktozidázy v NIH3T3 bunkách, ktoré boli transfekované s DOSPER virozómami, respektíve DOSPER lipozómami; priemerné hodnoty troch experimentov A, B a C.
Obrázok 13: Expresia β-galaktozidázy v NIH3T3 a 293T bunkách, ktoré boli transfekované s DOSPER virozómami (experiment A) použitím plazmidu pcDNA3.1/His B/lacZ v rozličných koncentráciách, ktorý bol poskytnutý v rozličných počtoch virozómov; hodnoty v ng/mg proteínu po 4 dňoch.
-13Prikladv uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava DOSPER virozómov s kompletne aktívnymi fúzovacími vírusovými hemaglutinínovými spúšťačmi z influenza vírusu
Hemaglutinín (HA) z A/Singapore/6/86 kmeňa influenza vírusu sa izoloval ako je opísané v Skehel a Schild (1971), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 968-972. V krátkosti, vírus sa pestoval v alantoickej dutine slepačích vajec a dvakrát sa purifikoval centrifugáciou v sacharózovom gradiente. Purifikovaný vírus sa stabilizoval v tlmivom roztoku obsahujúcom 7,9 mg/ml NaCl, 4,4 mg/ml citrátu sodného - 2H2O, 2,1 mg/ml kyseliny 2-morfolinoetánsulfónovej a 1,2 mg/ml kyseliny A/-hydroxyetylpiperazín-/\/'-2-etánsulfónovej, pH 7,3. 53 ml vírusovej suspenzie obsahujúcej 345 pg HA na ml sa peletovalo ultracentrifugáciou pri 100000 ot./min. 10 minút. K influenza vírusovému peletu sa pridalo 7,7 ml tlmeného detergentného roztoku obsahujúceho 145 mM NaCl, 2,5 mM HEPES a 54 mg/ml neiónového detergentného oktaetylénglykolmonododecyléteru (OEG = C12E18), pH 7,4. Pelet sa úplne rozpustil použitím ultrasonifikácie počas 2 minút pri laboratórnej teplote. Roztok sa ultracentrifugoval pri 100000 ot./min. 1 hodinu. Získaný supernatant obsahoval rozpustený HA spúšťač (1,635 mg HA/ml) a stopové množstvá neuraminidázy. K 3,7 ml supernatantu (6 mg HA) sa pridalo 0,5 až 2 mg DOSPER a
5.5 až 4 mg (dováženie na 6 mg celkového obsahu lipidov) dioleoylfosfatidylcholínu (DOPC). Roztok sa sterilizoval pasážovaním cez 0,2pm filter a potom sa preniesol do sklenenej nádoby obsahujúcej 1,15 g sterilných mikronosičových guľôčok, výhodne Biobeads SM-2. Nádoba sa trepala 1 hodinu použitím trepačky REAX2 od Heidolph (Kelheim, Nemecko). Keď to bolo nevyhnutné, tento postup sa opakoval až trikrát s 0,58 mg Biobeads. Po týchto procedúrach sa získal mierne priehľadný roztok DOSPER virozómov.
Najlepšie výsledky sa dosiahli s prípravkami, ktoré obsahovali lipidový pomer
1.5 mg DOSPER (25 % hmotn. celkových lipidov) na 4,5 mg DOPC. Vyššie DOSPER koncentrácie, napríklad viac ako 30 až 35 % hmotn., neviedli k formovaniu správnych virozómov po odstránení detergentu.
-14Možné je čiastočné nahradenie DOPC s PE (fosfatidyletanolamínom) a/alebo inými katiónovými lipidmi, ako napríklad DOTAP alebo DOSPA, bez významnej straty transfekčnej aktivity.
Začlenenie fosforotioátových oligodeoxyribonukleotidov do DOSPER virozómov:
Antisense a sense oligodeoxyribonukleotidové fosforotioáty (OPTs) L-myc génu sa použili ako príklad na demonštrovanie vysokej účinnosti katiónových virozómov pri transfekcii. Prostredníctvom fosforamiditového chemického postupu sa syntetizovali 5'-FITC-OPTs. Pentadekamér (5'-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3') sa použil ako antisense OPT a pentadekamér (5'-FITC-GCGGACATGGACTAC-3') sa použil ako sense OPT. Syntetizoval sa kontrolný OPT so zmiešanou sekvenciou (msc) majúci rovnaký počet nukleotidov ako antisense a sense OPTs.
ml DOSPER virozómov sa pridal ku každému z:
a) 2 mg antisense FITC-OPT (1,3 μητιοΙ)
b) 3,4 mg sense FITC-OPT (1,3 μηηοΙ) a
c) 3,1 mg msc FITC-OPT (1,3 μιτιοΙ).
FITC-OPTs sa rozpustili a roztoky sa potom sonifikovali 2 minúty pri 26 °C. Neobalené FITC-OPTs sa oddelili od virozómov gólovou filtráciou na High Load Superdex 200 kolóne (Pharmacia, Švédsko). Kolóna sa ekvilibrovala so sterilným PBS. Prázdne objemové frakcie obsahujúce DOSPER virozómy s enkapsulovaným FITC-OPT sa eluovali s PBS a odobrali sa. Koncentrácie FITC-OPT zachyteného virozómami sa stanovovali fluorometricky potom ako sa virozómy úplne rozpustili v 0,1M NaOH obsahujúcom 0,1% (v/v) Triton X-100. Na kalibráciu fluorescenčnej stupnice sa stanovila fluorescencia prázdnych DOSPER-virozómov, ktoré sa rozpustili vo vyššie uvedenom detergentom roztoku, ako nula.
Pri pripájaní Fab’ fragmentov na virozómy prostredníctvom vopred vytvorených komplexov fosfatidyletanolamínu a bifunkčnej molekuly na vytváranie priečnych väzieb sa 3 mg čerstvo redukovaného Fab’ z hlodavčej monoklonálnej anti-CDIO-(AntiCALLA) protilátky, rozpustené v 2,8 ml tlmivého roztoku z kyseliny citrónovej (100 mM NaCl, 40 mM kyselina citrónová, 35 mM Na2HPO4.2H2O, 2 mM EDTA, pH 5,5) pridali do roztoku 0,524 mg A/-[4-(p-maleimido-fenyl)butyryl]fosfatidyletanolamínu (MPB.PE) v 215 μΙ tlmivého roztoku z kyseliny citrónovej
-15obsahujúcom 0,5 % n-oktyl-oligo-etylénu. Zmes sa potom inkubovala v dusíku 16 hodín pri 4 °C pričom sa mierne miešala. Po inkubovaní sa odstránil nenaviazaný MPB.PE prostredníctvom 400μΙ dávky čerstvo redukovanej vlhkej Thiopropyl Sepharose 6B (Pharmacia, Švédsko). Zmes sa inkubovala 4 hodiny pri laboratórnej teplote. Thiopropyl Sepharose 6B sa odstránila centrifugáciou a výsledný roztok sa neutralizoval na pH 7,0. Neutralizačný roztok sa nahradil s OEG (54 mg/ml).
Roztoky pripravené ako bolo opísané vyššie, sa pridali ku roztokom na prípravu DOSPER virozómov. V priebehu formovania virozómov sa Fab’-MPB.PE molekuly začlenili do lipidovej dvojvrstvy.
Mikrografy DOSPER virozómov potvrdzujú výhodnú unilamelárnu štruktúru vezikúl s priemerným priemerom približne 120 až 180 nm, čo sa stanovuje laserovým svetelným rozptylom. Jasne sú viditeľné HA proteínové ihlice influenza vírusu.
Plná fuzogénna aktivita predložených DOSPER virozómov sa potvrdila kvantitatívnym testom založeným na fluorescenčnom uvoľňovaní opísanom v Hoekstra a ďalší (1984), Biochemistry 23: 5675-5681 a L. Lúscher a ďalší (1993), Árch. Virol. 130: 317-326. Fluorescenčná sonda, oktadecyl rodamín B chlorid (R18) (získaná od Molecular Probes Inc., Eugene, USA), sa začlenila s vysokou hustotou do membrány DOSPER virozómov nanesením tlmeného OEG (Ci2E8) roztoku obsahujúceho DOSPER a HA na tenký suchý film fluorescenčnej sondy, nasledovalo trepanie 5 až 10 minút na rozpustenie sondy, potom sa pokračovalo ako je opísané v časti Príprava DOSPER virozómov.... Rozpúšťanie potlačeného rodamínu sa pozorovalo prostredníctvom inkubovania rodamínom značených DOSPER virozómov s modelovými lipozómami (pomer DOSPER/DOPC:lipozomálnemu fosfolipidu = 1:20). Fluorescencia sa merala Perkin-Elmer 1000 spektrofluorimetrom pri excitačnej vlnovej dĺžke 560 nm a emisnej vlnovej dĺžke 590 nm.
Príklad 2
Príjem virozómov bunkami
Začleňovanie 3H-značených plazmidov do DOSPER virozómov
-16V zásade sa začleňovanie nukleokyselinových zlúčenín do virozómov uskutočňovalo nasledujúcimi troma spôsobmi:
1. Dialýzou: Nukleokyselinové zlúčeniny sa obaľovali v priebehu vytvárania virozómov, pričom detergent Oktyl-POE (od Alexis Corp., Laeufelfingen, Švajčiarsko) sa odstránil dialýzou.
2. Biobeads: Nukleokyselinové zlúčeniny sa obaľovali v priebehu vytvárania virozómov, pričom detergent OEG sa odstránil prostredníctvom mikronosičov, napr. Biobeads SM2.
3. Ultrasonifikácia: Nukleokyselinové zlúčeniny sa obaľovali katiónovými lipidmi, výhodne DOSPER, a získané lipozómy alebo lipidové komplexy obsahujúce nukleovú kyselinu, výhodne DOSPER lipozómy alebo lipidové komplexy, sa fúzovali s DOSPER virozómami ultrasonifikáciou.
Keďže najlepšie rýchlosti začleňovania sa získali tretím spôsobom, väčšina experimentov sa uskutočňovala použitím tohto fúzovacieho spôsobu na začleňovanie nukleokyselinového materiálu do virozómov.
Plazmid pGREEN LANTERN® (GIBCO-BRL) sa produkoval v E. coli v prítomnosti 3H-metyltymidínu, aby sa získali rádioaktívne značené plazmidy na presnú kvantifikáciu účinnosti transfekcie. Špecifická aktivita plazmidu bola 6,625x1010 dpm/g (= 29,84 mCi/g).
11,6 μg 3H značeného plazmidu (17,5 μΙ) sa rozpustilo v 480 μΙ HEPES-NaCI tlmivého roztoku. Po pridaní 116 μg DOSPER (1 μg/μl) sa výsledná zmes 30 sekúnd ultrasonifikovala a potom sa nechala 15 min. v pokoji. Týmto spôsobom sa vytvorili lipidové komplexy pozostávajúce s DOSPER plazmidu. Alternatívne je namiesto lipidových komplexov možné produkovať DOSPER lipozómy a to bežnými metódami, napr. z tlmeného roztoku OEG, ktorý obsahuje DOSPER a plazmid a následným odstránením detergentu použitím dialýzy alebo mikronosičov absorbujúcich detergent, pričom voliteľne nasleduje ultrasonifikácia, čo vedie k vytvoreniu DOSPER lipozómov naplnených plazmidmi.
K roztoku obsahujúcemu lipidové komplexy alebo lipozómy naplnené plazmidom sa pridalo 93 μΙ vopred vyrobených (napr. podľa príkladu 1) prázdnych DOSPER virozómov. Zmes sa ultrasonifikovala 1 min., aby sa fúzovali DOSPER virozómy s lipozómami alebo lipidovými komplexami, aby sa začlenili plazmidy do
- 17virozómov. Tento spôsob zavádzania požadovaného materiálu do virozómov sa môže aplikovať aj na zavádzanie liečiv alebo látok líšiacich sa od nukleokyselinového materiálu, výhodne na zavádzanie negatívne nabitých látok.
Porovnanie účinnosti transfekcie 3H značeného plazmidu DOSPER virozómami a DOSPER lipozómami pg značenej plazmidovej DNA sa enkapsulovalo do DOSPER virozómov a 11,7 pg do vopred vyrobených DOSPER lipozómov. Štyri rozličné adherentné bunkové línie, tzn. HeLa, 293T, COS-1 a NIH3T3, a okrem toho bunkové línie K562 a P3/NSI/1-Ag4-1 rastúce v suspenznej kultúre, sa transfekovali s DOSPER virozómami a DOSPER lipozómami.
5x105 buniek každého bunkového typu sa inkubovalo v 500 pl (= 0,5 ml) média s 25 pl buď roztoku DOSPER virozómov obsahujúcich plazmid, alebo roztoku DOSPER lipozómov obsahujúcich plazmid, 2, 3, 6 a 24 hodín pri 37 °C. Pridané alikvoty DOSPER virozómov a DOSPER lipozómov obsahovali 400 ng značeného plazmidu, čo zodpovedalo rádioaktivite 26500 dpm (= 100 %). Po inkubovaní sa bunky premyli, lyžovali a príjem rádioaktivity sa meral betasnímačom.
Hodnotil sa vplyv dĺžky času transfekcie (inkubačného času) na množstvo prijatej plazmidovej DNA a výsledky sú graficky uvedené na obrázkoch 1 až 6. Vyššie uvedený Stručný opis obrázkov sumarizuje bunkové línie na každom z obrázkov. Z obrázkov 1 až 6 jasne vyplýva, že DOSPER virozómy sú vynikajúce na transfekciu v porovnaní s DOSPER lipozómami pri všetkých typoch buniek a pri všetkých inkubačných časoch. Dlhší inkubačný čas, 6 a 24 hodín, s DOSPER lipozómami viedol len k veľmi minimálnemu zvýšeniu príjmu DNA, zatiaľ čo dlhší inkubačný čas s DOSPER virozómami viedol k značne zvýšenému príjmu DNA. Tento výsledok naznačuje, že HA-sprostredkovaný príjem virozómov je oveľa účinnejší ako príjem indukovaný DOSPER lipozómami bez pomoci akýchkoľvek vírusových väzobných ligandov pre bunkové receptory. Je zaujímavé, že v prípade DOSPER virozómov inkubačné časy 6 až 24 hodín neviedli k saturácii začleňovania DNA, ale ďalej sa zvyšoval príjem DNA, čo je efekt, ktorý môže byť spôsobený rýchlou výmenou membránových receptorov po ich odstránení prostredníctvom receptorom sprostredkovanej endocytózy virozómov na bunkovom povrchu. Vo
-18všeobecnosti sa zistilo, že adherentné bunkové línie (rastúce v monovrstvách) boli účinnejšie transfekované ako bunkové línie transfekované v suspenznej kultúre.
Príklad 3
Časovo závislý príjem plazmidov eukaryotickými bunkami
Príklad 2 sa opakoval s iným 3H-značeným plazmidom, tzn. pcDNA3.1/His B/lacZ (dodávateľ: Invitrogen, Groningen, Holandsko). Bunkové línie COS-1, K562, 293T a P3X63Ag8 sa transfekovali DOSPER virozómami naplnenými týmto plazmidom a inkubovali sa 2, 4 a 72 hodín. Porovnanie s DOSPER lipozómami sa v tomto experimente neuskutočňovalo.
Výsledky sú graficky uvedené na obrázku 7. Je z neho možné odvodiť, že predlžovanie času inkubovania by mohlo viesť k ďalšiemu zvyšovaniu príjmu značeného plazmidu bunkou, keď sa použijú predložené virozómy. V skutočnosti, použitím predložených DOSPER virozómov, ako vysoko účinného prenosového systému pre nukleokyselinový materiál je možné dodať 60 až 80 % celkového množstva nukleokyselinového (napr. plazmidu) vstupu do požadovaných cieľových buniek. Všetky testované bunkové línie boli porovnateľne prístupné virozómu, a tým príjmu plazmidu.
Príklad 4
Porovnanie DOSPER virozómov a DOTAP virozómov
Virozómy penetrujú cicavčie bunky prostredníctvom HA-poháňaného receptorom sprostredkovaného mechanizmu známeho z influenza A vírusu. Neočakávalo sa, že by chemická povaha lipidovej dvojvrstvy virozómovej membrány mohla hrať dôležitú úlohu pokiaľ sa správne zachovával prirodzený status a fuzogénna aktivita HA. Preto sa verilo, že DOSPER virozómy a DOTAP virozómy majú približne rovnakú účinnosť transfekcie nukleokyselinového materiálu do cicavčích buniek.
Avšak prekvapujúco, výsledky experimentov zostavených na porovnávanie transfekčných účinností DOSPER a DOTAP virozómov boli iné, tzn. významne sa
-19líšili od očakávaní. Experimenty sa uskutočňovali podľa príkladov 1 a 2, pričom sa použil trítiom značený plazmid pcDNA3.1/His B/lacZ na enkapsuláciu a transfekciu. DOTAP virozómy sa pripravili podľa príkladu 1 vo WO97/41834 a zavedenie plazmidu sa uskutočnilo ako je opísané tu vyššie, použitím rovnakého postupu ako pre DOSPER virozómy. Rovnaké množstvo 3H-značeného plazmidu, ako je opísané v príklade 2 pre DOSPER virozómy, sa enkapsulovalo do DOTAP virozómov. Bunkové línie 293T, K562, Sp2 a HeLa sa inkubovali s DOSPER a DOTAP virozómami v rovnakých podmienkach ako je opísané vyššie, v príklade 2.
Výsledky sú graficky uvedené na obrázkoch 8 až 11. Je z nich zrejmé, že transfekčná účinnosť DOSPER virozómov je aspoň dvojnásobne vyššia ako transfekčná účinnosť DOTAP virozómov a môže byť až desaťnásobne vyššia. Najjasnejšie je viditeľný rozdiel v transfekčnej účinnosti najmä pri bunkových líniách rastúcich v suspenznej kultúre, ako napríklad v bunkovej línii Sp2 (obrázok 10). Príčine tohto javu sa ešte úplne nerozumie, ale môže byť aspoň čiastočne spôsobený rozdielnou chemickou povahou týchto dvoch lipidov, pričom polárna hlava DOSPER molekuly obsahuje štyri voľné aminoskupiny, zatiaľ čo polárna hlava DOTAP molekuly obsahuje len jednu voľnú aminoskupinu. Predpokladáme, bez viazanosti na teóriu, že enkapsulácia negatívne nabitého materiálu, ako napríklad plazmidov, do virozómov obsahujúcich DOSPER môže viesť k vyšším množstvám užitočných virozómov. Na rozdiel od toho, enkapsulácia plazmidu do DOTAP virozómov môže viesť k väčšiemu počtu defektných vezikúl s nízkym transfekčným potenciálom. Z druhej hypotézy by vyplývalo posilnenie účinku DOSPER v priebehu viazania sa virozómov na bunkovú membránu cieľových buniek, čo je názor, ktorý nemôžme vylúčiť.
Výsledky tak demonštrujú, že použitie polykatiónového lipidu DOSPER vykazuje prekvapujúco vynikajúcu transfekčnú účinnosť v porovnaní s najčastejšie používaným katiónovým lipidom DOTAP.
Príklad 5
Génová expresia po transfekcii s predloženými virozómami
-20Kvantitatívne stanovovanie použitím β-Gal ELISA kitu (dodávateľ: Boehringer Mannheim) expresie β-galaktozidázy uskutočňovanej cieľovými bunkami v experimentoch podľa príkladu 3, ktoré obdržali plazmid pcDNA3.1/His B/Iac Z prostredníctvom virozomálnej transfekcie, tiež potvrdilo, že nie len transfekčná rýchlosť virozómom dodávaného plazmidu bola vynikajúca v porovnaní s transfekčnou rýchlosťou lipozómom dodávaného plazmidu, ale aj jeho expresia v cieľových bunkách. Výsledkom experimentov bola dvadsaťnásobne až štyridsaťnásobne vyššia expresia β-galaktozidázy, keď sa použili DOSPER virozómy namiesto DOSPER lipozómov na transfekciu plazmidu do cieľových buniek (obrázok 12).
Avšak pozorovalo sa aj to, že existuje silná závislosť hladiny expresie βgalaktozidázy na koncentrácii plazmidu vo vnútri virozómov:
Tabuľka 2
Porovnanie virozómových prípravkov
| Celkové množ. plazmidu en- kapsulovaného vo virozóme [pg] | Celkové množ. DOSPER vo virozómoch [pg] | Relatívny počet virozómov [zvolené jednotky] | Pomer plazmid/DOSPER [pg/pg] | |
| prípravok 1 | 0,4 | 6,45 | 100 | 0,062 |
| prípravok 2 | 0,2 | 4,45 | 100 | 0,045 |
| prípravok 3 | 0,4 | 8,9 | 200 | 0,045 |
| prípravok 4 | 0,13 | 3,78 | 100 | 0,034 |
| prípravok 5 | 0,4 | 11,35 | 300 | 0,035 |
Virozómy v prípravku 2 obsahujú o polovicu menej plazmidu ako virozómy v prípravku 1, pričom počet virozómov je rovnaký v oboch prípravkoch. Prípravok 1 zodpovedá výhodnému virozómovému prípravku, ktorý sa používal vo väčšine tu opísaných experimentov. Prípravok 3 obsahuje rovnaké množstvo plazmidu, tento však je distribuovaný v dvojnásobnom počte virozómov. Prípravok 4 obsahuje ešte menšie množstvo plazmidu enkapsulované v rovnakom množstve virozómov ako v
-21 prípravkoch 1 a 2. Prípravok 5 obsahuje rovnaké množstvo plazmidu ako prípravky 1 a 3, avšak toto množstvo je enkapsulované v takom počte virozómov, ktoré je trojnásobne vyššie ako v prípravku 1.
Výsledky, ktoré sú graficky znázornené na obrázku 13, dosvedčujú, že empiricky odvodená, výhodná DOSPER virozómová formulácia je dosť optimálna, a ďalej, že znižovanie plazmidovej koncentrácie v prípravkoch 2, 3 a 4 neviedlo k zvýšenej úrovni expresie. Hypotéza, že preplnenie cieľových buniek prostredníctvom transfekcie s virozómovými prípravkami podobnými vyššie opísanému prípravku 1 by možno mohlo inhibovať expresiu, sa preto ukázala ako ďalej neudržateľná.
Claims (27)
1. Lipidová vezikula s dvojvrstvovou membránou, ktorá má pozitívny sieťový náboj pri fyziologickom pH, pričom vezikula okrem toho obsahuje aspoň jeden aktívny fuzogénny peptid, ktorý je iný ako Sendai vírusový hemaglutinín, ktorý spôsobuje internalizáciu vezikúl cieľovými bunkami prostredníctvom receptorom sprostredkovanej fagocytózy alebo endocytózy, vyznačujúca sa tým, že vezikulová membrána obsahuje 5 až 30 % hmotn, vztiahnuté na celkový obsah membránových lipidov, 1,3-dioleoyloxy-2-(6-karboxyspermyl)propylamidu (DOSPER) a vyváženie 95 až 70 % hmotn. iných lipidov zahŕňajúcich fosfatidylcholín (PC) alebo jeho deriváty a voliteľne fosfatidyletanolamín (PE) a/alebo katiónové lipidy iné ako DOSPER.
2. Vezikula podľa nároku 1, vy z n a č u j ú c a sa t ý m , že ďalej obsahuje požadované liečivo alebo látku na dodanie do cieľových buniek, pričom uvedené požadované liečivo alebo látka sú výhodne negatívne nabité a výhodne vybrané zo skupiny obsahujúcej farbičku, stopovaciu látku, kozmetické činidlo, farmaceutický alebo biologicky aktívnu látku a nukleokyselinový materiál.
3. Vezikula podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že požadovaným liečivom alebo látkou je nukleokyselinový materiál vybraný zo skupiny zahŕňajúcej DNA alebo RNA s krátkymi reťazcami, deoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidové selenoáty, oligodeoxyribonukleotidové fosforotioáty, oligodeoxyribonukleotidové fosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidové metylfosfonáty, peptidové nukleové kyseliny, ribonukleotidy, oligoribonukleotidy, oligoribonukleotidové fosforotioáty, 2’-Ome-oligoribonukleotidové fosfáty, 2'-0meoligoribonukleotidové fosforotioáty, ribozýmy, gény, plazmidy a vektory.
4. Vezikula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúca sa tým, že požadovaným liečivom alebo látkou je nukleokyselinový materiál a vezikula obsahuje uvedený nukleokyselinový materiál v množstve v rozsahu od 0,03
-26do 0,1, výhodne 0,045 do 0,065, pg nukleokyselinového materiálu na 1 pg DOSPER.
5. Vezikula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúca sa tý m , že priemerný priemer vezikuly je v rozsahu 120 až 180 nm.
6. Vezikula podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje aspoň jeden bunkovo špecifický marker pripojený na vezikulovú membránu.
7. Vezikula podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že vezikulová membrána ďalej obsahuje fosfatidyletanolamín (PE) a bifunkčnú molekulu na vytváranie priečnych väzieb, ktorá je jedným zo svojich väzobných miest pripojená na voľnú aminoskupinu fosfatidyletanolamínu a druhým svojim väzobným miestom je pripojená na bunkovo špecifický marker.
8. Vezikula podľa nároku 6 alebo 7, vyznačujúca sa tým, že bunkovo špecifickým markerom je biologicky aktívny proteín na naviazanie sa na receptor cieľových buniek vybraný zo skupiny pozostávajúcej z protilátky, protilátkového fragmentu, cytokínu a rastového faktora.
9. Vezikula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúca sa t ý m , že hemaglutinín je odvodený od vírusu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z rabdovírusu, parainfluenza vírusu typu II, Semliki Forest vírusu a togavírusu.
10. Vezikula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúca sa tým, že vezikulová membrána obsahuje DOSPER v koncentrácii 10 až 30 %, výhodne 20 až 25 % hmotn., vztiahnuté na celkový obsah membránových lipidov.
11. Vezikula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúca sa tým, že vezikulová membrána obsahuje, vztiahnuté na celkový obsah lipidov, 25 % hmotn. DOSPER a 75 % hmotn. PC, výhodne dioleoylfosfatidylcholínu (DOPC).
-2712. Prostriedok na použitie na kozmetické, farmaceutické alebo diagnostické aplikácie, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rôzne vezikuly podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11.
13. Spôsob výroby lipidovej vezikuly podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa nasledujúce kroky:
a) prípravu tlmivého roztoku, ktorý obsahuje neiónový detergent, a ktorý okrem toho obsahuje DOSPER a iné lipidy a aspoň jeden aktívny fuzogénny peptid, ktorým je iný ako Sendai vírusový hemaglutinín, ktorý spôsobuje internalizáciu vezikúl cieľovými bunkami prostredníctvom receptorom sprostredkovanej fagocytózy alebo endocytózy;
b) nastavenie lipidových koncentrácií, vztiahnuté na celkový obsah membránových lipidov, na 5 až 30 % hmotn. DOSPER a vyváženie 95 až 70 % hmotn. inými lipidmi zahŕňajúcimi fosfatidylcholín (PC) alebo jeho deriváty a voliteľne fosfatidyletanolamín (PE) a/alebo katiónové lipidy iné ako DOSPER; a
c) odstránenie detergentu dialýzou alebo ošetrením roztoku s mikronosičovými guľôčkami na vytvorenie pozitívne nabitých lipidových dvojvrstvových vezikúl.
14. Spôsob podľa nároku 13, vy z n a č u j ú c i sa t ý m , že ďalej zahŕňa krok zavedenia určitého množstva požadovaného lieku alebo látky do vezikúl na dodanie do cieľových buniek, pričom požadovaný liek alebo látka je výhodne negatívne nabitá a najmä vybraná zo skupiny obsahujúcej farbičku, stopovaciu látku, kozmetické činidlo, farmaceutický alebo biologicky aktívnu látku a nukleokyselinový materiál.
15. Spôsob podľa nároku 13 alebo 14, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že ďalej zahŕňa krok prípravy konjugátových molekulových komplexov pozostávajúcich z fosfatidyletanolamínu (PE), bifunkčnej molekuly na vytváranie priečnych väzieb a bunkovo špecifického markera takým spôsobom, že bifunkčná molekula na vytváranie priečnych väzieb je jedným väzobným miestom pripojená na voľnú aminoskupinu fosfatidyletanolamínu a druhým svojim väzobným miestom je
-28pripojená na tiolovú skupinu bunkovo špecifického markera; odstránenie nekonjugovaného materiálu a pridanie molekulových komplexov ku roztoku v kroku a).
16. Spôsob podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že zavádzanie požadovaného liečiva alebo látky sa uskutočňuje pridávaním požadovaného liečiva alebo látky ku roztoku v kroku a), a potom sa v kroku c) formujú vezikuly obsahujúce uvedené liečivo alebo látku.
17. Spôsob podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že zavádzanie požadovaného liečiva alebo látky do vezikúl sa uskutočňuje pridávaním požadovaného liečiva alebo látky ku vezikulám vzniknutým v kroku c), sonifikáciou zmesi na integráciu liečiva alebo látky do vezikúl, a odstránením neintegrovaného materiálu, výhodne gólovou filtráciou.
18. Spôsob podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že zavádzanie požadovaného liečiva alebo látky do vezikúl sa uskutočňuje pridávaním pozitívne nabitých lipidových komplexov alebo lipozómov naplnených požadovaným liečivom alebo látkou ku vezikulám vzniknutým v kroku c) a sonifikáciou výslednej zmesi na fúzovanie lipidových komplexov alebo lipozómov s vezikulami na integráciu liečiva alebo látky do vezikúl.
19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že pozitívne nabité lipidové komplexy alebo lipozómy obsahujú 50 až 100 % hmotn, vztiahnuté na celkový obsah lipidov, DOSPER lipidu.
20. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 18, vyznačujúci sa tým , že bunkovo špecifický marker je vybraný zo skupiny obsahujúcej protilátku, protilátkový fragment, cytokín a rastový faktor.
21. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 20, vyznačujúci sa t ý m, že požadované liečivo alebo látka je nukleokyselinový materiál vybraný zo
-29skupiny zahŕňajúcej DNA alebo RNA s krátkymi reťazcami, deoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidové selenoáty, oligodeoxyribonukleotidové fosforotioáty, oligodeoxyribonukleotidové fosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidové metylfosfonáty, peptidové nukleové kyseliny, ribonukleotidy, oligoribonukleotidy, oligoribonukleotidové fosforotioáty, 2'-Ome-oligoribonukleotidové fosfáty, 2'-Ome-oligoribonukleotidové fosforotioáty, ribozýmy, gény, plazmidy a vektory.
22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že nukleokyselinový materiál sa do virozómov zavádza v koncentrácii 0,03 až 0,1, výhodne 0,045 až 0,065, pg nukleokyselinového materiálu na 1 pg DOSPER lipidu.
23. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 22, vyznačujúci sa tým, že neiónovým detergentom je oktaetylénglykol monododecyléter (Ci2E8) alebo n-oktyl-oligoxyetylén.
24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 23, vyznačujúci sa tým, že činidlom na vytváranie priečnych väzieb je heterobifunkčná organická molekula majúca aspoň jednu maleimidoskupinu a aspoň jednu karboxylovú skupinu a výhodne je vybraná zo skupiny obsahujúcej bis-/V-sukcínimidylové deriváty a fotoaktivovateľné sukcínimidylové deriváty.
25. Použitie vezikuly podľa nároku 1 na výrobu prostriedku na kozmetické, diagnostické alebo medicínske aplikácie, najmä na dodávanie požadovaného liečiva alebo látky do pokojových alebo proliferujúcich cieľových buniek.
26. Použitie podľa nároku 25, ktoré zahŕňa inkubovanie cieľových buniek in vitro v prítomnosti vezikúl a voliteľne prenos inkubovaných cieľových buniek do organizmu in vivo.
-3027. Použitie podľa nároku 25 alebo 26, kde cieľové bunky sú vybrané zo skupiny obsahujúcej rakovinové bunky, leukemické bunky a vírusom infikované bunky.
28. Použitie podľa nároku 27, kde metabolická alebo proliferatívna aktivita cieľových buniek sa pri inkubovaní v prítomnosti vezikúl redukuje.
29. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 28, kde požadovaným liečivom alebo látkou je nukleokyselinový materiál, ktorý obsahuje aspoň jeden antisense oligonukleotid, výhodne antisense oligonukleotid, ktorého cieľom sú protoonkogény alebo onkogénom kódovaná mRNA.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/414,872 US6210708B1 (en) | 1996-05-08 | 1999-10-08 | Cationic virosomes as transfer system for genetic material |
| PCT/EP2000/009540 WO2001026628A1 (en) | 1999-10-08 | 2000-09-29 | Cationic dosper virosomes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK4782002A3 true SK4782002A3 (en) | 2002-09-10 |
Family
ID=23643351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK478-2002A SK4782002A3 (en) | 1999-10-08 | 2000-09-29 | Lipidic vesicles, a method for the manufacture thereof pharmaceutical composition containing the same and use thereof |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1217990B1 (sk) |
| JP (1) | JP2003512306A (sk) |
| KR (1) | KR100869195B1 (sk) |
| AT (1) | ATE258428T1 (sk) |
| AU (1) | AU778399B2 (sk) |
| CA (1) | CA2388053A1 (sk) |
| CO (1) | CO5280052A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ20021216A3 (sk) |
| DE (1) | DE60008006T2 (sk) |
| DK (1) | DK1217990T3 (sk) |
| ES (1) | ES2215073T3 (sk) |
| HU (1) | HUP0202809A2 (sk) |
| NO (1) | NO20021607L (sk) |
| PE (1) | PE20010703A1 (sk) |
| PL (1) | PL355231A1 (sk) |
| RU (1) | RU2002112224A (sk) |
| SK (1) | SK4782002A3 (sk) |
| TR (1) | TR200200930T2 (sk) |
| WO (1) | WO2001026628A1 (sk) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100488491C (zh) * | 2002-11-21 | 2009-05-20 | 派维翁生物技术有限公司 | 高效融合小泡,其制备方法和含有该小泡的药物组合物 |
| JP4497894B2 (ja) * | 2003-11-07 | 2010-07-07 | 明彦 河合 | 物質導入剤およびその製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL296382A1 (en) * | 1991-02-02 | 1993-11-02 | Nika Health Products Ltd Li Li | Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system |
| DE19521412A1 (de) * | 1995-06-14 | 1996-12-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue kationische und polykationische Amphiphile, diese enthaltende Reagenzien und deren Verwendung |
| NZ332666A (en) * | 1996-05-08 | 2000-05-26 | Nika Health Products Ltd | Cationic virosomes having a positively charged lipid bilayer membrane with an integrated viral fusogenic peptide as genetic transfer systems for use in gene therapy |
| ATE340259T1 (de) * | 1996-07-16 | 2006-10-15 | Archibald James Mixson | Kationisches vehikel: dns komplexe und ihre verwendung in gentherapie |
-
2000
- 2000-09-29 CZ CZ20021216A patent/CZ20021216A3/cs unknown
- 2000-09-29 WO PCT/EP2000/009540 patent/WO2001026628A1/en active IP Right Grant
- 2000-09-29 CA CA002388053A patent/CA2388053A1/en not_active Abandoned
- 2000-09-29 JP JP2001529418A patent/JP2003512306A/ja active Pending
- 2000-09-29 HU HU0202809A patent/HUP0202809A2/hu unknown
- 2000-09-29 TR TR2002/00930T patent/TR200200930T2/xx unknown
- 2000-09-29 RU RU2002112224/15A patent/RU2002112224A/ru unknown
- 2000-09-29 KR KR1020027004325A patent/KR100869195B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-09-29 EP EP00967824A patent/EP1217990B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-29 PL PL00355231A patent/PL355231A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-09-29 DE DE60008006T patent/DE60008006T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-29 ES ES00967824T patent/ES2215073T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-29 AU AU77850/00A patent/AU778399B2/en not_active Ceased
- 2000-09-29 SK SK478-2002A patent/SK4782002A3/sk unknown
- 2000-09-29 AT AT00967824T patent/ATE258428T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-29 DK DK00967824T patent/DK1217990T3/da active
- 2000-10-06 PE PE2000001071A patent/PE20010703A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-10-06 CO CO00076243A patent/CO5280052A1/es not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-04-05 NO NO20021607A patent/NO20021607L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL355231A1 (en) | 2004-04-05 |
| EP1217990B1 (en) | 2004-01-28 |
| PE20010703A1 (es) | 2001-07-11 |
| DE60008006T2 (de) | 2004-09-09 |
| CZ20021216A3 (cs) | 2002-10-16 |
| WO2001026628A1 (en) | 2001-04-19 |
| AU778399B2 (en) | 2004-12-02 |
| CA2388053A1 (en) | 2001-04-19 |
| CO5280052A1 (es) | 2003-05-30 |
| NO20021607D0 (no) | 2002-04-05 |
| DK1217990T3 (da) | 2004-05-24 |
| JP2003512306A (ja) | 2003-04-02 |
| KR20020063872A (ko) | 2002-08-05 |
| TR200200930T2 (tr) | 2002-08-21 |
| EP1217990A1 (en) | 2002-07-03 |
| NO20021607L (no) | 2002-06-07 |
| RU2002112224A (ru) | 2004-01-10 |
| AU7785000A (en) | 2001-04-23 |
| ES2215073T3 (es) | 2004-10-01 |
| HUP0202809A2 (hu) | 2002-12-28 |
| ATE258428T1 (de) | 2004-02-15 |
| KR100869195B1 (ko) | 2008-11-18 |
| DE60008006D1 (de) | 2004-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6210708B1 (en) | Cationic virosomes as transfer system for genetic material | |
| US7993672B2 (en) | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production | |
| US6008202A (en) | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production | |
| JP2003535832A (ja) | ポリヌクレオチドおよび薬物の標的化リポソームへのカプセル化 | |
| US20200283795A1 (en) | Plant virus movement proteins and methods of using same | |
| JP2002538096A (ja) | 生理活性複合体のリポソームへのカプセル化 | |
| JP2008501729A (ja) | カチオン性脂質および使用方法 | |
| AU2008295666B2 (en) | Improved liposomes and uses thereof | |
| EP1217990B1 (en) | Cationic dosper virosomes | |
| Yanagihara et al. | Liposome-mediated gene transfer | |
| SK43199A3 (en) | Method for preparing compositions for transferring nucleic acids | |
| Düzgünes et al. | Intracellular delivery of therapeutic oligonucleotides in pH-sensitive and cationic liposomes | |
| Narainpersad | Cationic liposome mediated targeted gene delivery with and without pegylated accessories. |