CZ20021216A3 - Lipidové váčky obsahující DOSPER - Google Patents
Lipidové váčky obsahující DOSPER Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20021216A3 CZ20021216A3 CZ20021216A CZ20021216A CZ20021216A3 CZ 20021216 A3 CZ20021216 A3 CZ 20021216A3 CZ 20021216 A CZ20021216 A CZ 20021216A CZ 20021216 A CZ20021216 A CZ 20021216A CZ 20021216 A3 CZ20021216 A3 CZ 20021216A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dosper
- virosomes
- substance
- pouch
- vesicles
- Prior art date
Links
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 55
- 239000000277 virosome Substances 0.000 claims abstract description 160
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 39
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- -1 nucleic acid compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108010093857 Viral Hemagglutinins Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 107
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 66
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 33
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 31
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 20
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 20
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 20
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 20
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 13
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 claims description 13
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 claims description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 7
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 5
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 claims description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 3
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 claims description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 claims description 2
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims 2
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 claims 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 claims 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 claims 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 claims 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims 1
- YYELLDKEOUKVIQ-UHFFFAOYSA-N octaethyleneglycol monododecyl ether Chemical group CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO YYELLDKEOUKVIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 claims 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002801 charged material Substances 0.000 abstract description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 5
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 4
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 4
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 125000004035 thiopropyl group Chemical group [H]SC([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000189662 Calla Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 2
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical group ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LWAVGNJLLQSNNN-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-azidobenzoate Chemical compound C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LWAVGNJLLQSNNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGXDNMNOQDVTRL-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-(4-azido-2-nitroanilino)hexanoate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O NGXDNMNOQDVTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L (2-dodecoxy-2-oxoethyl)-[6-[(2-dodecoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]hexyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CCCCCC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCCCC XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 1-dodecoxydodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCCCCCCCCCCC CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- LAGUSEHJTGJJRJ-UHFFFAOYSA-N 2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)-2-oxoethyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(C(=O)CNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC LAGUSEHJTGJJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQYYUNVPCWLGJT-UHFFFAOYSA-N 2-amino-n-[3-[4-(3-aminopropylamino)butylamino]propyl]acetamide Chemical compound NCCCNCCCCNCCCNC(=O)CN SQYYUNVPCWLGJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- ZQCIMPBZCZUDJM-UHFFFAOYSA-N 2-octoxyethanol Chemical group CCCCCCCCOCCO ZQCIMPBZCZUDJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 101900156543 Influenza A virus Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710151803 Mitochondrial intermediate peptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000713102 Mus musculus C-C motif chemokine 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150109894 TGFA gene Proteins 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MCIDNMJNWYUTMB-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n'-tetradecyl-3-(tetradecylamino)propanimidamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCNCCC(NC(C)(C)C)=NCCCCCCCCCCCCCC MCIDNMJNWYUTMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- LUYQYZLEHLTPBH-UHFFFAOYSA-N perfluorobutanesulfonyl fluoride Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)S(F)(=O)=O LUYQYZLEHLTPBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Lipidové váčky obsahující DOSPER
Oblast techniky
Předkládaný vynález se obecně týká oboru biochemie, genové biotechnologie a genové terapie, a konkrétně se týká nových virozomů, t j. pozitivně nabitých lipozomových váčků obsahujících v membráně virové glykoproteiny, které jsou užitečné pro vysoce účinný přenos požadovaného materiálu, zejména genetického materiálu, do cílového místa, a dále se vynález týká jejich užitečných aplikací. Kationtové virozómy podle vynálezu jsou zejména vhodné pro specifické a nespecifické, neinfekční podávání (přenos) negativně nabitých sloučenin, výhodně genů, do cílových buněk in vitro a in vivo.
Dosavadní stav techniky
Mezinárodní patentová přihláška WO 92/13525, jejíž celý obsah je formou citace vložen do předkládaného popisu, popisuje, že virozómy tvořené fosfolipidovou dvojvrstevnou membránou, které jsou cíleny pomocí virových povrchových (spike) proteinů z viru chřipky a buněčně-specifickými markéry jako jsou např. monoklonální protilátky, velmi účinně fúzují s modelovými membránami a živočišnými buňkami, a to díky penetračnímu mechanismu podobnému virům, tj. receptorem zprostředkovanou endocytózou. Přestože tyto virozómy byly úspěšně použity k přenosu chemických látek a požadovaných léčiv do cílových míst, mají jisté nevýhody pokud jde o trvalou inkorporaci a přenos nabitých molekul, jako jsou např. negativně nabité nukleové kyseliny.
- 2 • · · · ·· ···· • ti · ti ti · · • ti ti ti titititi • ti • tititi titi titi tititi
Mezinárodní patentová přihláška WO 97/41834, jejíž celý obsah je formou citace vložen do předkládaného popisu,, popisuje kationtové virozómy pro účinný, buněčně specifický přenos genetického materiálu do cílových buněk in vitro a in vivo. Dále popisuje způsob přípravy takových virozómů a také způsoby jejich použití.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález představuje další vývoj vynálezu popsaného v mezinárodní přihlášce WO 97/41834 a týká se nových kationtových virozómů, které, membrány, mohou být velmi negativně nabitým materiálem, díky specifickému složení své účinně naplněny požadovaným výhodně genetickým materiálem, obsahujícím dlouhé a krátké řetězce DNA nebo RNA, oligodeoxynukleotidy, ribonukleotidy, peptidové nukleové kyseliny (PNA), ribozymy (RNA molekuly s enzymatickou aktivitou), geny, plazmidy a vektory. Neočekávaně bylo zjištěno, že užitím DOSPER v kombinaci s dalšími lipidy virozómy, které přesahují až jakožto kationtového lipidu lze připravit vysoce účinné desetkrát transfekční účinnost
DOTAP virozómů (viz WO 97/41834), která je i tak dosti vysoká. Tohoto překvapivého účinku bylo možno dosáhnout jedině tím, že byl jako kationtový lipid použit DOSPER a když současně byl DOSPER kombinován s dalšími lipidy v poměru, který je odlišný od známého poměru kationtových lipidů (DOTAP) k ostatním lipidům, který byl explicitně popsán v mezinárodní patentové přihlášce WO 97/41834, kde je též předmětem patentových nároků.
• · · · · · • · · · ·
- 3 ···· ·· ·· ··· ·· ····
P.?EÍ
Obr.
Obr.
Obr.
Obr.
Obr.
Obr.
i obrázků
1: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté
Plazmidové DNA. 5xl05 buněk humánní, transformované linie primárních embryonálních ledvinných buněk 293T v 0,5 ml média bylo transfekováno DOSPER-virozómy a DOSPER-lipozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
2: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk linie opičích fibroblastů COS-1 bylo transfekováno DOSPER-virozómy a DOSPERlipozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
3: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk humánní line epitheloidních buněk cervikálního karcinomu HeLa v 0,5 ml média bylo transfekováno DOSPER-virozómy a DOSPER-lipozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
4: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk linie myších fibroblastů NIH3T3 bylo transfekováno DOSPER-virozómy a DOSPERlipozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
5: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk linie humánních buněk myeloidni leukémie K562 bylo transfekováno DOSPERvirozómy a DOSPER-lipozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
6: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk myší linie myelomových • · · · • · · · · • · · · • · • · · ·
- 4 Obr.
Obr.
Obr.
Obr.
Obr.
···· ·· ·· ··· ·· ···· buněk P3 bylo transfekováno DOSPER-virozómy a DOSPERlipozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pGreen Lantern.
7: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk linií COS-1, 293T, K562 a P3X63Ag8 bylo transfekováno DOSPER-virozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pcDNA3.1 /His B/lacZ.
8: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk humánní, transformované linie primárních embryonálních ledvinných buněk 293 T v 0,5 ml média bylo transfekováno DOSPER-virozómy a DOTAP-virozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pcDNA3.1/HisB/lacZ his (0,4 pg DNA; 24000 dpm = 100%).
9: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk linie humánních buněk myeloidní leukémie K562 v 0,5 ml média bylo transfekováno DOSPER-virozómy a DOTAP-virozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pcDNA3.1/HisB/lacZ his (0,4 pg DNA; 24000 dpm = 100%).
10: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk hybridní, nesekretující linie myších buněk Sp2 v 0,5 ml média bylo transfekováno DOSPER-virozómy a DOTAP-virozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pcDNA3.1/His B/lacZ his (0,4 pg DNA; 24000 dpm =100%).
11: Vliv délky doby transfekce na množství přijaté plazmidové DNA. 5xl05 buněk humánní line epitheloidních buněk cervikálního karcinomu HeLa v 0,5 ml média bylo transfekováno DOSPER-virozómy a • ·
- 5 DOTAP virozómy obsahujícími 3H-značený plazmid pGreen
Lantern.
Obr. 12: Exprese β-galaktozidázy v buňkách NIH3T3, které byly transfekovány DOSPER-virozómy nebo DOSPER-lipozómy, v uvedeném pořadí, průměrné hodnoty ze tří experimentů A, B a C.
Obr. 13: Exprese β-galaktozidázy v buňkách NIH3T3 a 293T, které byly transfekovány DOSPER-virozómy (experiment A), užitím plazmidů pcDNA3.1 /His B/lacZ v různých koncentracích podaných prostřednictvím různého počtu virozómů; hodnoty jsou uvedeny v ng/mg proteinu po 4 dnech.
Podrobný popis výhodných provedení vynálezu
Virozómy podle předkládaného vynálezu jsou lipidové váčky (vezikuly, měchýřky) , které typicky obsahují membránu, mající čistý pozitivní náboj vzhledem k přítomnosti kationtových lipidů. Dále obsahují fúzogenní peptidy virového původu, zejména glykopeptidy virové obálky jako je např. hemaglutinin viru chřipky, kteréžto peptidy způsobí to, že virozóm je inkorporován do cílových buněk prostřednictvím penetračního mechanismu zprostředkovaného receptorem. Virozómy případně mohou dále obsahovat buněčně-specifické markéry pro výhodné navázání k požadovaným cílovým buňkám in vivo. Přítomnost fosfatidylethanolaminu (PE) v membráně je výhodná pro zakotvení takového buněčně-specifického markéru na virozóm a sice prostřednictvím bifunkčního zesíťujícího činidla (zesíťující činidlo). Když není potřebné buněčně-specifické směrování virozómů (např. při aplikaci v definované buněčné kultuře in vitro) nebo když je buněčně-specifický markér ♦ ·
- 6 navázán na membránu jiným způsobem než prostřednictvím bifunkčního zesíťujícího činidla, nemusí pak případně v membráně virozómu být PE.
V jednom provedení vynálezu, které je výhodné pro in vivo aplikace virozómů, se předkládaný vynález také týká ireverzibilní kovalentní vazby buněčně specifických markérů na kationtové virozómy sloučenin, jako jsou monoklonální protilátky, protilátkové fragmenty jako jsou fragmenty F(ab')2 a Fab', cytokiny, a/nebo růstové faktory, přičemž tento výčet není omezující, které jsou užitečné pro selektivní detekci a vazbu cílové buňky. Jsou navázány na membránu váčků tak, že vyčnívají ven a projevují nezbytně plnou funkční aktivitu vzhledem k detekci receptoru a jeho navázání. Výhodným způsobem přípravy virozómů obsahujících místně-orientované zesítění buněčně-specifických markérů je podrobně popsáno v příkladu 1 v dokumentu W097141834 pro DOTAP virozóm. Tímto způsobem jsou buněčně přeformované molekuly specifické markéry navázány na „fosfatidylethanolamin-zesíťuj ící činidlo, jako je např. N-[4-(p-maleimidofenylbutyryl]fosfatidylethanolamin (MPB.PE) v přítomnosti detergentu.
Sepharose 6B molekulového činidlo-marker
Pro dosažení nej lepších možných výsledků je výhodné izolovat a purifikovat virové glykoproteiny před rekonstitucí, aby se zabránilo inaktivaci buďto proteolytickým štěpením nebo redukcí intramolekulárních disulfidických vazeb S-S. Tudíž je výhodné, když se konjugované markéry, např. marker-MPB.PE, separují od nekojugovaných molekul fosfatidylethanolaminzesíťující činidlo (např. MPB.PE) afinitní chromatografii s náplní z aktivované agarózy, výhodně z redukované Thiopropyl Alikvoty purifikovaného konjugovaného komplexu „fosfatidylethanolamin-zesíťuj ící přidají k roztoku detergentu pak se obsahujícímu směs rozpuštěných membránových lipidů, fúzních to ·
- 7 peptidů a dalších požadovaných přísad, před tím, než se z nich vytvoří kationtové virozómy.
Je výhodné provádět kondenzační proces bifunkčního zesíťujícího činidla s fosfolipidem a buněčně-specifickým markérem v oddělených postupech před přípravou virozómů. Takový postup dovoluje lepší kontrolu a optimalizaci povrchové hustoty membrán virozómů, zejména pokud jde o počet buněčněspecifických markérů navázaných na membránu. Zlepšená kontrola koncentrace proteinových molekul zapuštěných do membrány nebo navázaných na membránu je důležitá, neboť nevyvážený poměr fúzních peptidů (např. hemaglutininu) a buněčněspecifických markérů (např. protilátkových fragmentů Fab’) na membráně virozómů snižuje nebo dokonce úplně ničí jejich selektivní vlastnosti a - v extrémním případě - může vést ke shlukování a precipitaci váčků.
Výhody použití protilátkových fragmentů F(ab')2 a Fab' jakožto buněčně-specifických markérů místo molekul celých protilátek byly podrobně diskutovány v mezinárodní patentové přihlášce WO 97/41834. Bunščně-specifické virozómy podle předkládaného vynálezu projevují selektivitu pro různé buněčné typy díky jejich buněčně-specifickým markérům na membráně a současně vysoké schopnosti penetrace buněk endocytózou, která je dána virovými fúzogenními peptidy, např. hemaglutininem. Virozóm s fragmenty Fab', které rozpoznávají antigeny spojené s nádory („tumor-associated antigens) jako je např. TAG72, CEA, 17-1A, CA 19-9 nebo s antigeny spojené s leukémií, jako je např. CD10 (CALLA = „Common Acute Lymphocytic Leukemia Antigen) a CD20, se váží selektivně, tj. přednostně na nádorové nebo leukemické buňky nesoucí uvedené antigeny na buněčném povrchu.
Nové váčky nebo virozómy podle vynálezu jsou zvláště užitečné pro přenos jakéhokoliv požadovaného negativně • 9 99 9· ·999
9 9 9 9 · 9
9 9 9999
- 8 nabitého materiálu, výhodné genetického materiálu, do cílových míst, zejména do živočišných nebo humánních buněk a tkání, a to in vitro a in vivo. Je nutno zdůraznit, že nové virozómy jsou schopny penetrovat nejen proliferující, tj. replikující se buňky, ale také neproliferující buňky, t j. klidové buňky, a právě tato vlastnost dává novým virozómům širokou využitelnost v oblasti biologických věd, farmakologie a medicíny, a to jako nástrojů ve výzkumu a diagnostice, a také pro léčebné účely jakožto léčiv. Použití virozómů podle vynálezu jako přenašečů cytotoxických činidel nebo nukleových kyselin je vhodné pro aplikace při různých patologických stavech jako jsou např. virové infekce, rakovinná onemocnění, nádory, leukémie a další nemoci, včetně nemocí způsobených genetickými defekty, které mohou reagovat na metody genové terapie prováděné pomocí virozómů podle vynálezu.
Virozómy podle předkládaného vynálezu se mohou užít jak in vitro tak in vivo. Tak např. čištění kostní dřeně je součástí léčebných postupů při některých neopláziích, včetně akutní a chronické leukémie. V současnosti se kostní dřeň zbavuje leukemických buněk užitím různých činidel, jako jsou např. imunologická činidla a chemoterapeutika. ODN enkapsulovaný (zapouzdřený) ve virozómů namířeném proti jednomu onkogenu, který poskytuje růstovou výhodu leukemickým buňkám, je terapeuticky užitečný a navíc v eliminaci leukemických buněk mnohem selektivnější než konvenční chemoterapeutika, neboť šetří normální prekurzorové buňky..
Pro použití jako léčiva jsou virozómy podle předkládaného vynálezu složkou farmaceutického přípravku, který dále obsahuje obvyklá aditiva a farmaceutické přijatelné nosiče. Je výhodné, když je farmaceutický přípravek podle vynálezu ve formě injekčního roztoku, ale pro některé aplikace jsou výhodné jiné lékové formy přípravků, např. emulze, krémy, gely, masti pro topické nebo systémové podávání.
- 9 ·· · «rt«
Takže předmětem podle vynálezu je dále použití virozómů podle vynálezu pro výrobu farmaceutického přípravku vhodného k profylaxi a/nebo léčení zvířat nebo lidí, kteří takové léčení potřebují. Dalším předmětem vynálezu je použití virozómů podle vynálezu pro výrobu diagnostických souprav (kitů) pro in vitro a in vivo použití.
Váčky podle předkládaného vynálezu jsou výhodně připravovány způsobem analogickým způsobu pro přípravu DOTAP-virozómů, který byl popsán v příkladech 1 až 3 a 6 mezinárodní patentové přihlášky WO 97/41834, s výjimkou toho, že místo DOTAP se užije DOSPER, a že výsledná koncentrace DOSPER ve virozómové membráně je vhodně nastavena, jak bude ještě níže popsáno, konkrétně nepřesahuje 30 % (hmot.) z celkového obsahu lipidů ve virozómů.
Ve stručnosti, způsob přípravy virozómů podle zahrnuje následující kroky:
vynálezu
a) příprava pufru, který obsahuje neiontové detergenty a dále obsahuje DOSPER a další lipidy a alespoň jeden aktivní fúzogenní peptid, který je hemagalutinin jiného typu než Sendai-viru, který umožňuje internalizaci váčků do cílových buněk prostřednictvím receptorem zprostředkované fagocytózy nebo endocytózy;
b) nastavení koncentrace lipidů na, přičemž hodnoty jsou vztaženy k celkovému obsahu lipidů v membráně, 5 až 30 % (hmot.) DOSPER a 95 až 70 % (hmot.) dalších lipidů vybraných ze skupiny obsahující fosfatidylcholin (PC) nebo jeho deriváty, případně fosfatidylethanolamin (PE) a/nebo kationtové lipidy jiné než DOSPER; a (c) odstranění detergentu užitím dialýzy nebo ošetřením roztoku mikroperličkami (microcarrier beads), čímž se fcfc • · fc fc fc • fcfc · • fcfc fcfc • fcfcfc fcfc fcfc fcfcfc
9 999 • · fcfcfc • fc fcfc • · · vytvoří pozitivně nabité váčky tvořené lipidovou dvojvrstvou; a výhodně (d) vložení požadovaného množství léčiva nebo jiné látky, která má být přenesena do cílových buněk, přičemž léčivo nebo látka je výhodně negativně nabitá a je vybrána zejména ze skupiny obsahující barviva, značící látky, kosmetická činidla, farmaceuticky nebo biologicky účinné látky, a nukleové kyseliny.
V jiném provedení vynálezu výhodném pro použití virozómů in vivo, se užívá vhodné bifunkční zesíťující činidlo (zesíťující činidlo) k navázání buněčně-specifického markéru ireverzibilním způsobem na membránu váčků. Buněčně-specifický markér, který je namířen proti buněčnému receptoru zodpovědnému za selektivní navázání virozómů na buňku, je navázán k zesíťujícímu činidlu takovým způsobem, že je plně biologicky aktivní. Je výhodné, když se užije zesíťovací Činidlo ve formě přeformovaných molekulových komplexů, kde zesíťovací činidlo je kovalentně navázáno na fosfatidylethanolamin a buněčně-specifický markér, jak je definován v nárocích.
Termín fúzogenní peptid označuje peptid nebo protein, který je schopen indukovat a/nebo podporovat fúzní reakci mezi virozómovou membránou a lipidovou membránou cílové buňky.. Ve většině provedení vynálezu označuje virové povrchové (spike) glykoproteiny obsahující fúzní peptidy, zejména pak kompletní hemaglutininový trimer tvořící hřebíkovité struktury na virovém povrchu, nebo jeho monomer, nebo jednu či obě rozštěpené podjednotky, glykopeptidy HA1 a HA2, obsahující funkční fúzní peptidy. V jiném provedení vynálezu se termín týká čistého fúzního peptidu samotného, buďto izolovaného z přírodních zdrojů nebo připraveného synteticky. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu tyto polypeptidy obsahující fúzní • 9 99 » 9 4 1
4 4
44 • 4 · I
4 I
4444 94
4949 peptidy jsou hemaglutininy chřipkového viru, např. subtypu A-H1N1.
Místo nebo navíc k hemaglutininu chřipkového viru se mohou vhodně užít pro virozómy podle vynálezu jako fúzní peptidy (proteiny) i hemaglutininy z jiných virů, pokud mají v podstatě shodné penetrační mechanismy zprostředkované pH jako má hemaglutinin chřipkového viru. K vhodným hemaglutininům patří např. hemaglutinin z rhabdovirů, z viru parainfluenzy typu III, viru Semliki Forest a togavirů, jak byly popsány mezinárodní patentové přihlášce WO 97/41834.
Termín zesíťující činidlo (crosslinker) označuje organickou heterobifunkční molekulu, která je schopná navázat se na povrch vezikulu připraveného způsobem podle vynálezu a
Ve výhodném provedení molekuly obsahují navázání aminoskupiny také je schopná vázat polypeptidy. předkládaného vynálezu tyto
N-hydroxysukcinimidovou skupinu pro fosfatidylethanolaminu a maleimidovou skupinu pro kondenzaci s buněčně-specifickým markérem, např. fragmentem monoklonální protilátky. K vhodným zesíťujícím činidlům patří 4-(Nmaleimidomethyl)-cyklohexan-l-karboxylát, ester m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidu, ester m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysulfosukcinimidu, sukcinimidyl-4(p-maieimidofenyl)butyrát, sulfosukcinimidyl-4(p-maleimidofenyl)butyrát.
Alternativně zesíťující činidlo může být molekula, která obsahuje N-hydroxysukcinimidovou skupinu a fotoreaktivní azidoskupinu pro navázání markérů jako např. cytokinů, jako je např. N-hydroxysukcinimidylsuberát (NHS-SA), N-hydroxysukcinimidyl-4-azidobenzoát (HASAB), N-sukcinimidyl-6-(4'azido-2'-nitrofenylamino)hexanoát (SANPAH), Nsulfosukcinimidyl-6-(4'-azido-2-nitrofenylamino)hexanoát. Je výhodné, když je zesíťující činidlo užito ve formě přeformovaného ·· • · * · «« to • · · • to to ••to* ·· toto toto·* • · • toto· to • « to · toto • · to • to n • c · · • * · ··· · • · · toto tototo · molekulového komplexu lipidu a zesíťujícího buněčně-specifického markéru.
činidla a
Termín buněčně-specifický protein nebo buněčněspecifický markér se týká proteinu, který je schopen navázat se na zesíťující činidlo nebo na komplex lipidu a zesíťujícího činidla, a dále je schopen navázat se na receptor cílové buňky. Ve výhodném provedení vynálezu jde o monoklonální protilátku, protilátkový fragment, cytokin nebo růstový faktor. Buněčně-specifický markér umožňuje selektivní detekci a vazbu na cílovou buňku a tak zlepšuje účinek fúzogenního peptidu současně přítomného na membráně virozómu. Výhodné protilátkové fragmenty jsou např. fragmenty F(ab')2 a Fab'. K buněčně-specifickým markérům dále patří interleukiny a další cytokiny, zejména uvedené v následující tabulce 1.
Tabulka 1
Cytokiny (mezinárodní zkratky)
| BDNF | IFNa | ΜΙΡ-Ια | PDGF |
| CNTF | ΙΕΝβ | MIP-113 | PF-4 |
| EGF | IFNy | MIP-2 | RANTES |
| Epo | IL-1 až 5 | NGF | SCF |
| FGF | LIF | NT-3 | TGFa |
| G-CSF | LT (TNFP) | NT-4 | TGFP |
| GM-CSF | MCP-1 až 3 | OSM | TNFa |
| 1-309/TCA-3 | M-CSF | PBP | Tpo |
| γΙΡ-10 | MIF | PBSF | jVEGF |
φφ ·* • · · · • · · * · > *·<· »·
Λ * · »· ··· ·· »· * · * · • · * • * · * · · ·· ·«·« sloučeninu
Ν—{(1,2,3— (DOTMA)
Termín kationtový lipid v předkládaném popisu označuje organickou molekulu, která obsahuje kationtovou složku a nepolární složku (ocásek), jde o amfifilní tvořící hlavičku s ocáskem jako např. dioleoyloxy)propyl]-Ν,Ν,Ν-trimethylamoniumchlorid (Felgner et al.; Proč Nati Acad USA 84:7413-7417, 1987),
N-[1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-Ν,N,Ntrimethylamoniummethylsulfát (DOTAP); nebo N-t-butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidin (Ruysschaert et al.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 203:1622-1628, 1994). Pokud není výslovné uvedeno jinak, termín také zahrnuje níže definované polykatíontové lipidy.
dioktadecylamidoNatl. Acad. USA
Termín polykationtový lipid ounačuje organickou molekulu, která obsahuje polykationtovou složku a nepolární složku (ocásek) jako např. lipospermin: 1,3-dipalmitoyl-2fosfatidylethanolamidospermin (DPPES) a glycylspermin (DOGS) (Behr et al.; Proč
86:6982-6986, 1989); 2,3-dioleoyloxy-N-[2-(sperminkarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanamoniumtrifluoracetát (DOSPA); 1,3-dioleoyloxy-2-(6-karboxyspermyl)propylamid (DOSPER); Ν,Ν,Ν',N'-tetramethyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)2,3dioleoyloxy-1,4-butandiamoniumjodid (THDOB).
Je nezbytné, aby všechny virozómy podle předkládaného vynálezu obsahovaly DOSPER a jeden nebo více dalších přírodních nebo syntetických lipidů, které jsou pozitivně nabité nebo neutrální. Termínem pozitivně nabitý se míní to, že lipid má čistý pozitivní náboj při fyziologickém pH. Takže positivně nabité lipidy, membrány nebo virozómy jsou lipidy, membrány nebo virozómy, které mají čistý pozitivní náboj při fyziologickém pH. Termín neutrální lipidy označuje takové lipidy, které nemají žádný čistý náboj při fyziologickém pH a patří sem např. lipidy jako je cholesterol nebo jeho deriváty, a/nebo lipidy zwitteriontového typu, které mají v molekule • · ti ·
- 14 » • ti • ti ti ti pozitivně a negativně nabité oblasti, které stechiometricky své náboje navzájem ruší.
Termín negativně nabitý materiál v předkládaném popisu označuje jakékoliv požadované léčivo nebo látku nesoucí při fyziologickém pH čistý negativní náboj.
Termín požadované léčivo nebo látka v předkládaném popisu označuje jakoukoliv chemickou látku, sloučeninu nebo směs sloučenin, které jsou využitelné v kosmetice, diagnostice, farmacii, lékařství nebo k jakémukoliv vědeckému účelu. K takovým látkám patří látky, které mohou být analyticky monitorovány in vitro nebo in vivo jako jsou barviva, fluorescenční barviva, radioaktivně nebo jiným způsobem značené sloučeniny, stopovací nebo markerové (značkovací) látky, a patří sem i proteinová nebo neproteinová léčiva a jakékoliv další farmaceuticky nebo biologicky účinné látky, zejména pak konvenční protivirová nebo protirakovinová léčiva, a také nukleové kyseliny, jak jsou zde definovány. Jelikož virozóm podle vynálezu jsou pozitivně nabité při fyziologickém pH, je výhodné, když jsou naplněny buďto neutrálním nebo negativně nabitým požadovaným léčivem nebo látkou, neboť pak je inkorporace o virozómů nejúčinnější a stabilní.
Termíny nukleová kyselina nebo genetický materiál v předkládaném popisu označují krátké řetězce DNA nebo RNA, deoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidselenoáty, oligodeoxyribonucleotidfosforothioáty (OPT), oligodeoxyribonukleotidfosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidmethylfosfonáty, peptidové nukleové kyseliny (PNA), ribonukleotidy, oligoribonukleotidy, oiigoribonukleotidfosforothioáty, 2'-Ome-oligoribonukleotidfosfáty, 2'-Omeoligoribonukleotidfosforothioáty, ribozymy (RNA molekuly • 4
4 · 4 • · • · • 4 »4 4 4 4 s enzymatickou aktivitou), geny, plazmidy a vektory (klonovací nosiče).
Termín virozóm v předkládaném popisu označuje, ve své nej jednodušší formě, lipozomové váčky s dvojvrstevnou membránou, která obsahuje kationtové lipidy a vnitřní prostor, výhodně obsahující vodu, přičemž membrána dále obsahuje virové proteiny, zejména virové glykoproteiny. Ve výhodném provedení, virové proteiny obsahují alespoň jeden fúzogenní peptid nebo protein mající plnou biologickou fúzní aktivitu, zejména povrchové glykoproteiny hemaglutinin a/nebo neuraminidáza viru chřipky A (např. A/Singapore). Je třeba rozumět, že k virovým proteinům patří i synteticky připravené aminokyselinové sekvence odpovídající nebo shodné s fúzními peptidy chřipkového viru, jak jsou zde popsány. K membránovým lipidům patří kationtové lipidy definované výše, ale patří sem případně i další přírodní a/nebo syntetické lipidy, výhodně fosfolipidy jako je např. fosfatidylcholin (PC) a fosfatidylethanolamin (PE).
Přestože kationtové virozómy podle předkládaného vynálezu mohou být v mnohých případech, zejména při in vitro experimentech s buněčnými kulturami, úspěšně použity bez buněčně-specifických markérů na membráně, je zvláště výhodné pro použití in vivo, když dále obsahují alespoň jeden buněčně-specifický markér na membráně, jak byl výše definován. Průměrná hodnota velikosti průměru váčků je 120 až 180 nm, jak se stanoví elektronovou mikroskopií a dynamickým rozptylem světla.
Užitím kationtových virozómů podle předkládaného vynálezu jakožto nosičů pro požadovaná léčiva nebo jiné látky, včetně genetického materiálu, je možné odstranit nebo alespoň zmenšit nežádoucí vedlejší účinky způsobené toxicitou těchto léčiv nebo látek. Tohoto prospěšného účinkuje dosaženo tím, že * » • · · · · *
- 16 • · · · · · · · · ·<
kationtové virozómy podle vynálezu mají, ve srovnání s dosud známými lipozómy nebo virozómy, podstatně vyšší aktivitu a účinnost v přenosu nich uzavřeného materiálu, zejména negativně nabitého materiálu jako jsou např. antisense oligonukleotidy, do cílové buňky, a, což je ještě důležitější, i při expresi přenesených nukleových kyselin v cílové buňce.
Takže předkládaný vynález poskytuje DOSPER virozómy definované v nároku 1 a jejich varianty definované v dalších provedeních v následujících nárocích 2 až 11. Vynález také poskytuje přípravek, který obsahuje nové virozómy společně s nosičem vhodným pro různé aplikace, jak je definováno např. v nároku 12.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob přípravy nových virozómů, který je definován v nároku 13, s dalšími variantami v nárocích 14 až 24.
Ještě dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou specifické způsoby použití virozómů podle vynálezu definované v nárocích 25 až 29.
Pro úplnost popisu a plné porozumění vynálezu jsou dále uvedeny příklady provedení vynálezu. Tyto příklady slouží k ilustraci vynálezu a v žádném směru předmět vynálezu neomezuj i.
• · • * · · ·· • « • ·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava DOSPER virozómů s plně fúzně-aktivním virového hemaglutininu z viru chřipky trimerem
Hemaglutinin (HA) z kmene A/Singapore/6/86 viru chřipky byl izolován postupem, který popsali Skehef a Schild (1971), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:968-972. Ve stručnosti shrnuto: virus byl pěstován v alantoidní dutině vajíček, a byl purifikován dvojí ultracentrifugací v sacharózovém gradientu. Purifikovaný virus byl stabilizován v pufru obsahujícím 7,9 mg/ml NaCl, 4,4 mg/ml vodného citrátu sodného, 2,1 mg/ml 2morfolinoethansulfonové kyseliny a 1,2 mg/ml N-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonové kyseliny, pH 7,3. 53 ml virové suspenze obsahující 345 ng HA v 1 ml bylo peletováno ultracentrifugací při 100,000 x g po 10 minut. 7,7 ml pufrovaného roztoku detergentu obsahujícího 145 mM NaCl, 2,5 mM HEPES a 54 mg/ml neiontového detergentu oktaethyleneglykolmonododecyletheru (OEG = C^Es), pH 7,4, bylo přidáno k peletu chřipkového viru. Pelet byl úplně rozpuštěn užitím ultrasonikace po dobu 2 minuty při teplotě místnosti. Roztok pak byl ultracentrifugován při 100,000 x g po 1 hodinu. Získaný supematant obsahoval solubilizovaný HA trimer (1,635 mg HA/ml) a stopová množství neuraminidázy. 0,5 až 2 mg DOSPER a 5,5 až 4 mg (tak aby celkové množství bylo 6 mg lipidu) dioleoylfosfatidylcholinu (DOPC) bylo přidáno k 3,7 ml supernatantu (6 mg HA) a rozpuštěno. Roztok byl sterilizován šestkrát přes 0,2pm filtr a pak přenesen do skleněné nádobky obsahující 1,15 g sterilních mikroperliček, výhodně Biobeads SM-2. Nádobka byla 1 hodinu třepána na třepačce REAX2 firmy Heidolph (Kelheim, Germany). Když bylo třeba, postup se
- 18 opakoval až třikrát s 0,58 mg mikroperliček Biobeads. Po tomto kroku byl získán slabě transparentní roztok DOSPER virozómů.
Nej lepších výsledků bylo dosaženo s virozómovými preparáty, které obsahovaly poměr lipidů 1,5 mg DOSPER (25 % z hmotnosti všech lipidů) ku 4,5 mg DOPC. Vyšší koncentrace DOSPER, např. nad 30 až 35 % (hmot.) nevedly k vytvoření virozómů po odstranění detergentu.
Částečné nahrazení DOPC užitím PE (fosfatidylethanolaminu) a/nebo jiných kationtových lipidů jako je DOTAP nebo DOSPA bylo možné bez významné ztráty transfekční aktivity.
Inkorporace fosforothioátových oligodeoxyribonukleotidů do DOSPER virozómů fosforamiditů
Pentadekamery
Antisense a sense oligodeoxyribonukleotidfosforothioáty (OPT) genu L-myc byly použity jako příklad pro demonstraci vysoké účinnosti kationtových virozómů při transfekci. 5'FITC-OPT byl syntetizován metodou založenou na užití (Microsynth GmbH, Balgach, Switzerland).
(5'-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3') a (5'-FITCGCGGACATGGACTAC-3') byly použity jakožto antisense OPT a sense OPT, v uvedeném pořadí. Kontrolní OPT se smíšenou sekvencí (msc) tvořené nukleotidy stejné délky byly syntetizovány jako antisense a sense OPT.
ml DOSPER virozómů byl přidán ke každému z
a) 2 mg antisense FITC-OPT (1,3 μιηοΐ)
b) 3,4 mg sense FITC-OPT (1,3 pmol) a « · 9 9 9 9 · · ·· • * · · « · 9
- 19 c) 3.1 mg msc FITC-OPT (1,3 pmol).
FITC-OPT byly rozpuštěny a roztoky pak byly sonikovány po dobu 2 minut při 26 °C. Neopouzdřené FITC-OPT (t j. ty, které se neinkorporovaly do virozómů) byly separována od virozómů gelovou filtrací na koloně High Load Superdex 200 (Pharmacia, Sweden). Kolona byla ekvilibrována sterilním PBS. Frakce obsahující DOSPER virozómy s uzavřenými FITC-OPT byly eluovány PBS a odebrány. Koncentrace FITC-OPT uzavřeného ve virozómech byla stanovena fluorometricky po té, co byly virozómy úplně rozpuštěny v 0,1 M NaOH obsahujícím 0,1 % (obj.) Triton X-100. Pro kalibraci fluorescenční škály byla jako nula nastavena fluorescence prázdných DOSPER-virozómů, které byly rozpuštěny ve výše popsaném roztoku detergentu.
Pro navázání fragmentů Fab' na virozómy pomocí přeformovaných komplexů fosfatidylethanolamin-bifunkční zesíťující molekula 3 mg čerstvě redukovaných Fab' z myší monoklonální protilátky anti-CDlO (AntiCALLA) rozpuštěné ve 2,8 ml citrátového pufru (100 mM NaCl, 40 mM kyseliny citrónové, 35 mM Na2HPO4.2H20, 2 mM EDTA, pH 5,5) se přidalo k roztoku 0,524 mg N-[4-(p-maleimidofenyl) butyryl]fosfatidylethanolaminu (MPB.PE) v 215 μΐ citrátového pufru obsahujícího 0,5 % n-oktyloligooxyethylenu. Směs pak byla inkubována v dusíkové atmosféře po dobu 16 hodin ve 4° C za jemného míchání. Po inkubaci byl odstraněn nenavázaný MPB.PE dávkou 400 μΐ čerstvě redukované zvlhčené Thiopropyl Sepharose 6B (Pharmacia, Sweden). Směs byla inkubována 4 hodiny při teplotě místnosti. Thiopropyl Sepharose 6B pak byla odstraněna centrifugací a vzniklý roztok byl neutralizován na hodnotu pH 7,0. K neutralizovanému roztoku byl přidán (54 mg/ml).
Roztoky připravené výše popsaným způsobem byly přidány k roztokům pro přípravu DOSPER virozómů. Molekuly Fab’-MPB.PE • ♦ • ·
- 20 se pak v průběhu vytváření virozómů inkorporovaly do lipidové dvojvrstvy. Mikrofotografie DOSPER virozómů potvrdily výhodnou jednovrstevnou (unilamelární) strukturu váčků s průměrem přibližně 120 až 180 nm, jak bylo stanoveno pomocí rozptylu laserového paprsku. Povrchové proteiny (spike) HA viru chřipky byly jasně pozorovatelné.
Plná fúzogenní aktivita DOSPER virozómů podle vynálezu byla potvrzena kvantitativním testem založeným na snížení zhášení fluorescence (podle Hoekstra et al.
(1984:
Biochemistry 23:5675-5681 a L. Luscher et al. (1993), Arch. Virol. 130:317-326). Fluorescenční sonda chlorid oktadecylrhodaminu B (R18) (získaná od firmy Molecular Probes Inc., Eugene, USA) byla ve vysoké hustotě inkorpotrována do membrány DOSPER virozómů tím, že se pufrovaný roztok OEG (Ci2E8) obsahující DOSPER a HA přidal k tenkému filmu fluorescenční sondy a pak následovalo třepání 5 až 10 minut, aby se sonda rozpustila, přičemž další postup byl stejný jak byl popsán v části příprava DOSPER virozómů...”. Ředění zhášení rhodaminu bylo pozorováno po inkubaci rhodaminem-značených DOSPER virozómů s modelovými lipozómy (poměr DOSPER/DOPC k lipozómovým fosfolipidům = 1:20). Fluorescence byla měřena užitím spektrofluorimetru Perkin-Elmer 1000 při excitační a emsisní vlnové délce 560 a 590 nm, v uvedeném pořadí.
Příklad 2
Příjem virozómů buňkami
Inkorporace 3H-značených plazmidů do DOSPER virozómů:
V zásadě byla inkorporace nukleových kyselin do virozómů provedena následujícími třemi způsoby:
4 4 4 • · • · • « « 9 4 4
- 21 • · ♦ ♦ » · 9 • · · · 4 4 »
4 4 4 4 » ·
4 4 4 4 4
4» 44» 4 · 4 4 4>
1. Dialýza: nukleové kyseliny byly opouzdřeny (enkapsulovány) v průběhu vytváření virozómů, když byl detergent Oktyl-POE (od firmy Alexis Corp., Laeufelfingen, Switzeriand) odstraňován dialýzou.
2. Bioperličky: nukleové kyseliny byly opouzdřeny v průběhu vytváření virozómů, když byl detergent OEG odstraňován pomocí mikronosičů jak jsou např. mikroperličky Biobeads SM2.
3. Ultrasonikace: nukleové kyseliny byly opouzdřeny kationtovými lipidy, výhodně DOSPER, a takto připravené lipozómy nebo lipidové komplexy naplněné nukleovou kyselinou, výhodně DOSPER lipozómy nebo lipidové komplexy, byly dále fúzovány s DOSPER virozómy ultrasonikací.
Jelikož nej lepší míry inkorporace bylo dosaženo při užití třetí z výše popsaných metod, většina dalších experimentů byla provedena pomocí této fúzní metody inkorporace nukleových kyselin do virozómů.
Plazmid pGREEN LANTERN-I (GIBCO-BRL) byl namnožen v E. coli za přítomnosti 3H-methylthymidinu, čímž byl získán radioaktivně značený plazmid vhodný ke kvantitativnímu stanovení účinnosti transfekce. Specifická aktivita plazmidu byla 6, 625 χ 1O10 dpm/g (= 29, 84 mCi/g) .
11,6 pg 3H značeného plazmid (17,5 μί) bylo rozpuštěno ve 480 μί pufru HEPES-NaCl. Po přidání 116 pg DOSPER (1 pg/μί) byla vzniklá směs ošetřena ultrasonikací (působením ultrazvuku) po dobu 30 sekund a pak ponechána v klidu po dobu 15 minut. Tím byly vytvořeny lipidové komplexy obsahující DOSPER a plazmid. Alternativně místo lipid komplexů byly připraveny DOSPER lipozómy konvenčním způsobem, tedy např. z pufrovaného roztoku OEG obsahujícího DOSPER a plazmid, a následným odstraněním detergentu pomocí dialýzy nebo fc· fc··· fcfc fcfcfc fcfcfc • fcfcfcfc · fc • · • fc fcfc·· • fc fcfcfc fcfc · fcfc fc
-22detergent-absorbujících mikronosičů (mikroperliček), přičemž pak případně následovala ultrasonikace, kterou byly vytvořeny DOSPER lipozómy naplněné plazmidy.
K roztoku obsahujícímu plazmidem naplněné lipidové komplexy nebo lipozómy bylo přidáno 93 μΐ předem připravených (např. postupem podle příkladu 1) prázdných DOSPER virozómů. Směs byla ultrasonikována po dobu 1 minuty, aby došlo k fúzi DOSPER virozómů s lipozómy nebo lipidovými komplexy, čímž se plazmidy inkorporovaly do virozómů. Tato metoda inkorporace požadovaného materiálu do virozómů je použitelná také pro inkorporaci léčiv nebo látek jiných než jsou nukleové kyseliny, výhodně látek negativně nabitých.
Srovnání transfekční účinnosti 3H-značených plazmidů užitím DOSPER virozómů a DOSPER lipozómů:
pg značené plazmidové DNA bylo opouzdřeno do DOSPER virozómů a 11,7 pg do předem připravených DOSPER lipozómů. Čtyři různé adherentní buněčné linie, a sice HeLa, 293T, COS-1 a NIH3T3, a navíc buněčné linie K562 a P3/NSl/l-Ag4-l rostoucí v suspenzních kulturách, byly transfekovány DOSPER virozómy a DOSPER lipozómy.
χ 105 buněk každého typu bylo inkubováno v 500 pl (= 0,5 ml) média s 25 pl roztoku buďto plazmid-obsahujících DOSPER-virozómů nebo plazmid-obsahujících DOSPER-lipozómů, a to po dobu 2, 4, 6 a 24 hodin při teplotě 37 °C. Přidané alikvoty DOSPER-virozómů a DOSPER-lipozómů obsahovaly 400 ng značeného plazmidu, což odpovídalo radioaktivitě 26500 dpm (= 100 %) . Po inkubaci byly buňky opláchnuty, lyžovány a radioaktivita přijatá (inkorporovaná) do buněk byla měřena betapočítačem.
- 23 •to ·· ·· ·♦·· ·· ·· • •toto · » · · · · · ·· · · · · · · · · * • •♦•toto · · · to to • •toto toto ·· ·*· ·· ··*·
Vliv délky transfekce (tj. doby inkubace) na množství buňkami přijaté plazmidové DNA bylo vyhodnoceno a tyto výsledky jsou shrnuty v grafické podobě na obr. 1 až 6. Stručný popis k obrázkům, uvedený výše, poskytuje souhrnné informace o buněčných liniích na každém obrázku.
Obr. 1 až 6 jasně ukazují, že DOSPER-virozómy jsou lepší pro transfekci než DOSPER-lipozómy pro všechny použité buněčné typy a Pii všech dobách transfekce. Delší doby transfekce jako 6 a 24 hodin s DOSPER-lipozómy vedly pouze k minimálnímu zvýšení příjmu DNA, zatímco tato delší doba inkubace s DOSPERvirozómy vedla k výrazně vyššímu příjmu DNA. Tyto výsledky naznačují, že HA-zprostředkovaný příjem virozómů je mnohem účinnější než příjem indukovaný DOSPER-lipozómy bez pomoci virových vazebných ligandů pro buněčné receptory. Je zajímavé, že v případě DOSPER-virozómů, inkubační doba 6 až 24 hodin nevedla k nasycení DNA inkorporace, ale k dalšímu zvyšování příjmu DNA, což je účinek, který může být způsoben rychlým nahrazováním membránových receptorů po jejich odstranění receptorem-zprostředkovanou endocytózou virozómů z povrchu buňky.. Obecně bylo zjištěno, že adherentní buněční linie (rostoucí v monovrstvách) byly mnohem účinněji transfekovány než buněčné linie rostoucí v suspenzních kulturách.
Příklad 3
Časově-závislý příjem plazmidů eukaryotickými buňkami
Příklad 2 byl opakován s jiným 3H-značeným plazmidem, tj. pcDNA3.1/HisB/lacZ (od firmy Invitrogen, Groningen, The Netherlands). Buněčné linie COS-1, K562, 293 T a P3X63Ag8 byly transfekovány DOSPER virozómy naplněnými tímto plazmidem a inkubovány po dobu 2, 4, a 72 hodin. Srovnání s DOSPER lipozómy nebylo v tomto experimentu provedeno.
• 9 * · • · • ♦ · ♦ · * • fcfcfc · fcfc· *
- 24 • · · fc · · fc ·
Výsledky jsou graficky znázorněny na obr. 7. Lze z nich soudit na to, že prodloužení doby inkubace při použití virozómů podle vynálezu vede plazmidu do buňky..
k dalšímu zvětšení A skutečné užitím vynálezu je jakožto přijmu
DOSPER vysoce značeného virozómů podle předkládaného výkonného systému pro přenos nukleových kyselin je možné přenést do buňky 60 až 80 % z celkového množství podané nukleové kyseliny (např. plazmidu) podaného požadovaným buňkám. Všechny testované buněčné linie byly srovnatelně vnímavé k virozómy zprostředkovanému příjmu plazmidu.
Příklad 4
Srovnání DOSPER virozómů s DOTAP virozómy
Virozómy penetrují savčí buňky HA-řízeným receptoremzprostředkovaným mechanismem, který je znám u viru chřipky A. Nedalo se očekávat, že chemická povaha lipidové dvojvrstvy virozómové membrány by mohla hrát důležitou roli, pokud je přiměřeně zachován nativní stav a fúzogenní aktivita HA. Mělo se tudíž za to, že DOSPER virozómy a DOTAP virozómy budou mít přibližně stejnou transfekční účinnost při přenosu nukleových kyselin do savčích buněk.
Avšak překvapivě experimenty navržené ke srovnání transfekční účinnosti DOSPER a DOTAP virozómů vedly k odlišným výsledkům, t j. výrazně se lišily od toho, co se očekávalo. Experimenty byly provedeny podle příkladů 1 a 2, přičemž byl pro opouzdření a transfekci použit tritiem-značený plazmid pcDNA3.1/HisB/lacZ. DOTAP virozómy byly připraveny postupem podle příkladu 1 z mezinárodnípatentové přihlášky WO97/41834 a inkorporace plazmidu byla provedena postupem, který byl popsán výše pro DOSPER virozómy. Stejné množství 3H-značeného plazmidu jako v příkladu 2 pro DOSPER-virozómy bylo opouzdřeno
99 ·* *·»· ·· ··
9 9 9 9 0 0 9 9 9
9 9 9 9 09 9 1 9 0
1 0 0 9 0 9 0 0 9 9
1 1 0 9 9 0 9 9
9090 09 00 009 ·0 0000 v DOTAP-virozómech. Buněčné linie 293T, K562, Sp2 a HeLa byly inkubovány s DOSPER a DOTAP virozómy ve stejných podmínkách jaké byly popsány výše v příkladu 2.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obr. 8 až 11. Výsledky jasně ukazují, že transfekční účinnost DOSPER virozómů je přinejmenším dvakrát vyšší než účinnost DOTAP virozómů a může být až desetkrát vyšší. Zejména u buněčných linií rostoucích v suspenzních kulturách, jako je např. Sp2 (Obr. 10), byly rozdíly v transfekční účinnosti zvláště zřetelně patrné. Důvod není zatím zcela jasný, ale příčinou může být alespoň částečně odlišná chemická povaha dvou užitých lipidů, neboť polární hlavička molekuly DOSPER obsahuje čtyři volné aminoskupiny, zatímco polární hlavička molekuly DOTAP obsahuje jen jednu volnou aminoskupinu. To vede k předpokladu, bez ohledu na známé konkrétní teorie, že opouzdření (enkapsulace) negativně nabitého materiálu, jako jsou např. plazmidy, do virozómů obsahujících DOSPER může vést k vyššímu počtu použitelných virozómů. Naproti tomu opouzdření plazmidu do DOTAP-virozómů vede ke vzniku vyššího počtu defektních váčků s nízkým transfekčním potenciálem. Druhá hypotéza vyvozuje zesilující účinek DOSPER při navazování virozómů na buněčnou membránu cílových buněk, což je názor, který nelze vyloučit.
Výsledky ukázaly, že použití polykationtového lipidu DOSPER se projevilo překvapivě lepší transfekční účinností ve srovnání s dosud nej častěji užívaným kationtovým lipidem DOTAP.
0
0
- 26 ·« ····
Příklad 5
Genová exprese po transfekci virozómy podle vynálezu
Kvantitativní stanovení exprese β-galaktozidázy cílovými buňkami z příkladu 3, kterým byl podán virozómovou transfekci plazmid pcDNA3.1/HisB/lacZ, provedené užitím soupravy β-Gal ELISA (od firmy Boehringer Mannheim), dále potvrdilo, že nejenom míra transfekce virozómy přenášeného plazmidů byla vyšší ve srovnání s lipozómovým přenosem plazmidů, ale byla také vyšší exprese genu přeneseného do cílových buněk. Experiment ukázal dvacetkrát až čtyřicetkrát vyšší expresi βgalaktozidázy při použití DOSPER virozómů místo DOSPER lipozómů pro transfekci plazmidů do cílových buněk (Obr. 12).
Bylo také pozorováno, že se projevovala silná závislost hladiny exprese β-galaktozidázy na koncentraci plazmidů ve virozómech:
Tabulka 2
Složení virozómových preparátů
| Preparát č. | Celkové množství plazmidů (gg) ve virozómů | Celkové množství DOSPER (gg) ve virozómů | Počet virozómů (relativní jednotky) | Poměr plazmid/DOSPER (gg/gg) |
| 1 | 0,4 | 6,45 | 100 | 0,062 |
| 2 | 0,2 | 4,45 | 100 | 0,045 |
| 3 | 0,4 | 8,91 | 200 | 0,045 |
| 4 | 0,13 | 3,78 | 100 | 0,034 |
| 5 | 0,4 | 11,35 | 300 | 0,035 |
♦ 4 44 44 444· ·4 44 «44« ♦ 4 * ·444
4 4 4 4 4 4 «4 4
444 4 444 4 4
444 ·· 4 444
4444 4· 44 *·» ·· 444·
Virozómy z preparátu 2 obsahovaly je poloviční množství plazmidu ve srovnání s virozómy preparátu 1, zatímco počet virozómů byl stejný v obou preparátech.
Preparát 1 představuje výhodné virozómy, které byly užity ve většině experimentů popsaných v předkládané přihlášce. Preparát 3 obsahuje stejné množství plazmidu, avšak distribuované do dvojnásobného virozómů.
Preparát 4 obsahuje ještě nižší množství plazmidu opouzdřeného ve stejném počtu virozómů jako v preparátech 1 a
2.
Preparát 5 obsahuje stejné množství plazmidu jako preparáty 1 a 3, avšak opouzdřeného v počtu virozómů, který je třikrát vyšší než v preparátu 1.
Výsledky graficky shrnuté na obr. 13 potvrzují, že empiricky odvozená formulace, výhodné formulace DOSPER virozómů, byla v podstatě optimální, a že další snižování koncentrace plazmidu v preparátech 2, 3 a 4 nevedlo již ke zvýšení exprese. Takže hypotéza, že přeplnění cílové buňky transfekcí virozómovými přípravky podobnými výše uvedenému preparátu 1, by mohlo inhibovat expresi, není již dále udržitelná.
Seznam zkratek použitých v popisu
2'-Ome 2’-O-methyl
CALLA obecný antigen akutní lymfoblastické leukémie
CAT chloramfenikolacetyltransferáza
Claims (4)
1. Lipidový váček mající dvojvrstevnou membránu, která má při fyziologickém pH čistý pozitivní náboj, kterýžto váček dále obsahuje alespoň jeden fúzogenní peptid, kterým je virový hemaglutinin kromě Sendai-viru a který způsobuje, že váčky jsou internalizovány cílovými buňkami mechanismem receptorem-zprostředkované fagocytózy nebo endocytózy, přičemž membrána váčku obsahuje 5 až 30 % (hmot.), vzaženo k celkovým membránovým lipidům, 1,3-dioleoyloxy-2-(6karboxyspermyl)propylamidu (DOSPER) doplněného 95 až 70 % (hmot.) jiných lipidů jako je fosfatidylcholin (PC) nebo jeho deriváty a případně fosfatidylethanolamin (PE) a/nebo kationtové lipidy jiné než DOSPER.
2. Váček podle nároku 1 který dále obsahuje požadované léčivo nebo látku, které mají být přeneseny do cílové buňky, přičemž požadované léčivo nebo látka jsou výhodně negativně nabity a jsou zejména vybrány ze skupiny obsahující barviva, stopovací látky, kosmetická činidla, farmaceuticky nebo biologicky aktivní látky a materiál nukleové kyseliny.
3. Váček podle nároku 2, kde požadované léčivo nebo látka je materiál nukleové kyseliny vybraný ze skupiny obsahující krátké řetězce DNA nebo RNA, deoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidselenoáty, oligodeoxyribonukleotidfosforothioáty, oligodeoxyribonukleotidfosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidmethylfosfonáty, peptidové nukleové kyseliny, ribonukleotidy, oligoribonukleotidy, oligoribonukleotidfosforothioáty,
2'-Ome-oligoribonukleotidfosfáty, 2'-Ome-oligoribonukleotidfosforothioáty, ribozymy, geny, plazmidy a vektory.
• to ·· toto ···« ·· ·· ···· · ♦ · ···· toto· ·· ··· ·· · • •••to ···· ···· to· ** *♦· ·· ····
- 31 4. Váček podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde požadované léčivo nebo látka je materiál nukleové kyseliny a přitom váček obsahuje materiál nukleové kyseliny v množství 0,03 až 0,1, výhodně 0,045 až 0,065, gg materiálu nukleové kyseliny na 1 gg DOSPER.
5. Váček podle kteréhokoliv z nároků 1 to 4, který má průměrnou hodnotu velikosti průměru 120 až 180 nm.
6. Váček podle kteréhokoliv z nároků 1 to 5, který dále obsahuje alespoň jeden buněčně-specifický markér navázaný na membránu váčku.
7. Váček podle nároku 6, kde membrána váčku dále obsahuje fosfatidylethanolamin (PE) a bifunkční zesíťující činidlo, které je navázáno jedním ze svých vazebných míst na volnou aminoskupinu PE a druhým vazebným místem na buněčněspecifický markér.
8. Váček podle nároku 6 nebo 7, kde buněčně-specifický markér je biologicky aktivní protein pro vazbu k receptorů cílových buněk vybraný ze skupiny obsahující protilátku, protilátkový fragment, cytokin a růstový faktor.
9. Váček podle kteréhokoliv z nároků 1 to 8, kde hemaglutinin pochází z viru vybraného ze skupiny obsahující rhabdovirus, virus parainfluenzy typu III, virus Semliki Forest a togavirus.
10. Váček podle kteréhokoliv z nároků 1 to 9, kde membrána váčku obsahuje DOSPER v koncentraci 10 až 30 %, výhodně 20 až 25 % (hmot.), vztaženo k celkovým membránovým lipidům.
11. Váček podle kteréhokoliv z nároků 1 to 10, kde membrána váčku obsahuje, vztaženo k celkovým membránovým lipidům,
9· m #· ···> ·· ** ···· ··♦ 8 9 9·
8 9 9 9 9 899 9 8 ·
0 9 9 8 8 9 9 8 9 9 9
9 9 8 8 8 8 0 9 8
9999 9· ·8 9*9 89 9989
25 % (hmot.) DOSPER a 75 % (hmot.) PC, výhodně dioleoylfosfatidylcholinu (DOPC).
12. Přípravek vyznačující se tím, že obsahuje množství váčků podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 v kombinaci s vhodným nosičem pro použití v kosmetice, farmacii nebo při diagnostice.
13. Způsob výroby lipidových váčků podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy (a) připraví se roztok pufru, který obsahuje neiontový detergent a dále obsahuje DOSPER a další lipidy a alespoň jeden aktivní fúzogenní peptid, kterým je virový hemagalutinin jiného typu než Sendai-viru, který způsobuje internalizaci váčků do cílových buněk prostřednictvím receptorem zprostředkované fagocytózy nebo endocytózy, (b) nastaví se koncentrace lipidů, přičemž hodnoty jsou vztaženy k celkovému obsahu lipidů v membráně, na 5 až 30 % (hmot.) DOSPER a doplní se 95 až 70 % (hmot.) dalších lipidů vybraných ze skupiny obsahující fosfatidylcholin (PC) nebo jeho deriváty, případně fosfatidylethanolamin (PE) a/nebo kationtové lipidy jiné než DOSPER, a (c) odstraní se detergent použitím dialýzy nebo ošetřením roztoku mikronosičovými perličkami, čímž se vytvoří pozitivně nabité váčky tvořené lipidovou dvojvrstvou.
14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok, kdy se do váčků inkorporuje množství požadovaného léčiva nebo látky, které mají být přeneseny do cílových buněk, přičemž požadované léčivo nebo látka jsou výhodně negativně nabité a zejména jsou vybrané ze skupiny obsahující barviva, stopovací látky, kosmetická činidla,
molekulové komplexy sestávající z fosfatidylethanolaminu (PE), bifunkčního zesíťujícího činidla a buněčněspecifického markéru, a to takovým způsobem, že bifunkční zesíťující činidlo se váže jedním svým vazebným místem na aminoskupinu PE a druhým na thiolovou skupinu buněčněspecifického markéru, odstraní se nekondenzovaný materiál a molekulové komplexy se přidají k roztoku podle kroku (a).
16. Způsob podle nároku 14 nebo 15 vyznačující se tím, že inkorporace požadovaného léčiva nebo látky se provádí tak, že se přidá požadované léčivo nebo látka k roztoku podle kroku (a), přičemž po té se v kroku (c) tvoří váčky obsahující požadované léčivo nebo látku.
17. Způsob podle nároku 14 nebo 15 vyznačující se tím, že inkorporace požadovaného léčiva nebo látky do váčků se provádí tak, že se k váčkům vzniklým v kroku (c) přidá požadované léčivo nebo látka, tato směs se sonikuje, aby se požadované léčivo nebo látka integrovaly do váčků, a neintegrovaný materiál se odstraní, výhodně gelovou filtrací.
18. Způsob podle nároku 14 nebo 15 vyznačující se tím, že inkorporace požadovaného léčiva nebo látky do váčků se provádí tak, že se k váčkům vzniklým v kroku (c) přidají pozitivně nabité lipidové komplexy nebo lipozómy naplněné požadovaným léčivem nebo látkou, a vzniklá směs se sonikuje, čímž doje k fúzi lipidových komplexů nebo lipozómů s váčky a léčivo nebo látka se integruje do váčků.
«« »* «ν ·«·»♦ *» *·*· · «» ···· « · 4 · * · « « · · · ·· · ♦ · * · · · « · • · · * · » * * · • ••4 ·· ·« ·€· ·· ····
- 34 19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že pozitivně nabité lipidové komplexy nebo lipozómy obsahují 50 až 100% (hmot.), vztaženo k celkovému obsahu lipidů, lipidu DOSPER.
20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 15 až 19 vyznačující se tím, že buněčně-specif ický markér je vybraný ze skupiny obsahující protilátku, protilátkový fragment, cytokin a růstový faktor.
21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 20 vyznačující se tím, že požadované léčivo nebo látka materiál nukleové kyseliny vybraný ze skupiny obsahující krátké řetězce DNA nebo RNA, deoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidselenoáty, oligodeoxyribonukleotidfosforothioáty, oligodeoxyribonukleotidfosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidmethylfosfonáty, peptidové nukleové kyseliny, ribonukleotidy, oligoribonukleotidy, oligoribonukleotidfosforothioáty, 2'-Ome-oligoribonukleotidfosfáty, 2'-Ome-oligoribonukleotidfosforothioáty, ribozymy, geny, plazmidy a vektory.
22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že materiál nukleové kyseliny je inkorporován do virozómů v koncentraci 0,03 až 0,1, výhodně 0,045 až 0,065 gg materiálu nukleové kyseliny na 1 gg lipidu DOSPER.
23. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 13 až 22 vyznačující se tím, že neiontový detergent je oktaethylenglykolmonododecylether (O^Eg) nebo n-oktyloligooxyethylen.
24. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 15 až 23 vyznačující se tím, že zesíťující činidlo je heterobifunkční organická molekula mající alespoň jednu maleimidovou a alespoň jednu karboxylovou skupinu, a výhodně je vybrané ze
4« 4 4 *4 ··*< 44 44
4444 4 4 4 4 4»· • 4 4 4 4 444 4 4 4
444 4· 4 444
4444 44 44 444 44 4444
- 35 skupiny obsahující bis-N-sukcinimidylové deriváty a fotoaktivovatelné sukcinimidylové deriváty.
25. Použití váčku podle nároku 1 pro výrobu přípravku vhodného pro kosmetické, diagnostické nebo lékařské použití, zejména pro přenos požadovaného léčiva nebo látky do klidových nebo proliferujících cílových buněk.
26. Použití podle nároku 25, které zahrnuje inkubaci cílových buněk in vitro v přítomnosti váčků a případně přenesení inkubovaných cílových buněk do organismu in vivo.
27. Použití podle nároku 25 nebo 26, kdy cílové buňky jsou vybrané ze skupiny obsahující nádorové buňky, leukemické buňky a buňky infikované viry.
28. Použití podle nároku 27, kdy metabolická nebo proliferativní aktivita cílových buněk se sníží inkubací v přítomnosti váčků.
29. Použití podle kteréhokoliv z nároků 25 až 28, kdy požadované léčivo nebo látka je materiál nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň jeden antisense oligonukleotid, výhodně antisense oligonukleotid, který je namířen na protoonkogenem nebo onkogenem kódovanou mRNA.
1/7 ΤΟΜ-ν-ίζ,
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/414,872 US6210708B1 (en) | 1996-05-08 | 1999-10-08 | Cationic virosomes as transfer system for genetic material |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021216A3 true CZ20021216A3 (cs) | 2002-10-16 |
Family
ID=23643351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021216A CZ20021216A3 (cs) | 1999-10-08 | 2000-09-29 | Lipidové váčky obsahující DOSPER |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1217990B1 (cs) |
| JP (1) | JP2003512306A (cs) |
| KR (1) | KR100869195B1 (cs) |
| AT (1) | ATE258428T1 (cs) |
| AU (1) | AU778399B2 (cs) |
| CA (1) | CA2388053A1 (cs) |
| CO (1) | CO5280052A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20021216A3 (cs) |
| DE (1) | DE60008006T2 (cs) |
| DK (1) | DK1217990T3 (cs) |
| ES (1) | ES2215073T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0202809A2 (cs) |
| NO (1) | NO20021607L (cs) |
| PE (1) | PE20010703A1 (cs) |
| PL (1) | PL355231A1 (cs) |
| RU (1) | RU2002112224A (cs) |
| SK (1) | SK4782002A3 (cs) |
| TR (1) | TR200200930T2 (cs) |
| WO (1) | WO2001026628A1 (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100488491C (zh) * | 2002-11-21 | 2009-05-20 | 派维翁生物技术有限公司 | 高效融合小泡,其制备方法和含有该小泡的药物组合物 |
| JP4497894B2 (ja) * | 2003-11-07 | 2010-07-07 | 明彦 河合 | 物質導入剤およびその製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL296382A1 (en) * | 1991-02-02 | 1993-11-02 | Nika Health Products Ltd Li Li | Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system |
| DE19521412A1 (de) * | 1995-06-14 | 1996-12-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue kationische und polykationische Amphiphile, diese enthaltende Reagenzien und deren Verwendung |
| NZ332666A (en) * | 1996-05-08 | 2000-05-26 | Nika Health Products Ltd | Cationic virosomes having a positively charged lipid bilayer membrane with an integrated viral fusogenic peptide as genetic transfer systems for use in gene therapy |
| ATE340259T1 (de) * | 1996-07-16 | 2006-10-15 | Archibald James Mixson | Kationisches vehikel: dns komplexe und ihre verwendung in gentherapie |
-
2000
- 2000-09-29 CZ CZ20021216A patent/CZ20021216A3/cs unknown
- 2000-09-29 WO PCT/EP2000/009540 patent/WO2001026628A1/en active IP Right Grant
- 2000-09-29 CA CA002388053A patent/CA2388053A1/en not_active Abandoned
- 2000-09-29 JP JP2001529418A patent/JP2003512306A/ja active Pending
- 2000-09-29 HU HU0202809A patent/HUP0202809A2/hu unknown
- 2000-09-29 TR TR2002/00930T patent/TR200200930T2/xx unknown
- 2000-09-29 RU RU2002112224/15A patent/RU2002112224A/ru unknown
- 2000-09-29 KR KR1020027004325A patent/KR100869195B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-09-29 EP EP00967824A patent/EP1217990B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-29 PL PL00355231A patent/PL355231A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-09-29 DE DE60008006T patent/DE60008006T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-29 ES ES00967824T patent/ES2215073T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-29 AU AU77850/00A patent/AU778399B2/en not_active Ceased
- 2000-09-29 SK SK478-2002A patent/SK4782002A3/sk unknown
- 2000-09-29 AT AT00967824T patent/ATE258428T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-29 DK DK00967824T patent/DK1217990T3/da active
- 2000-10-06 PE PE2000001071A patent/PE20010703A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-10-06 CO CO00076243A patent/CO5280052A1/es not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-04-05 NO NO20021607A patent/NO20021607L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL355231A1 (en) | 2004-04-05 |
| EP1217990B1 (en) | 2004-01-28 |
| PE20010703A1 (es) | 2001-07-11 |
| DE60008006T2 (de) | 2004-09-09 |
| WO2001026628A1 (en) | 2001-04-19 |
| AU778399B2 (en) | 2004-12-02 |
| CA2388053A1 (en) | 2001-04-19 |
| CO5280052A1 (es) | 2003-05-30 |
| NO20021607D0 (no) | 2002-04-05 |
| DK1217990T3 (da) | 2004-05-24 |
| JP2003512306A (ja) | 2003-04-02 |
| KR20020063872A (ko) | 2002-08-05 |
| TR200200930T2 (tr) | 2002-08-21 |
| EP1217990A1 (en) | 2002-07-03 |
| NO20021607L (no) | 2002-06-07 |
| RU2002112224A (ru) | 2004-01-10 |
| SK4782002A3 (en) | 2002-09-10 |
| AU7785000A (en) | 2001-04-23 |
| ES2215073T3 (es) | 2004-10-01 |
| HUP0202809A2 (hu) | 2002-12-28 |
| ATE258428T1 (de) | 2004-02-15 |
| KR100869195B1 (ko) | 2008-11-18 |
| DE60008006D1 (de) | 2004-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Albertsen et al. | The role of lipid components in lipid nanoparticles for vaccines and gene therapy | |
| US6210708B1 (en) | Cationic virosomes as transfer system for genetic material | |
| Simões et al. | On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times | |
| Hope et al. | Cationic lipids, phosphatidylethanolamine and the intracellular delivery of polymeric, nucleic acid-based drugs | |
| AU2001275423B2 (en) | Encapsulation of polynucleotides and drugs into targeted liposomes | |
| JP2002538096A (ja) | 生理活性複合体のリポソームへのカプセル化 | |
| JPWO2006101201A1 (ja) | 目的物質を効率的に核内に送達可能なリポソーム | |
| Asadikaram et al. | Niosomal virosome derived by vesicular stomatitis virus glycoprotein as a new gene carrier | |
| Kong et al. | Membrane-fusogenic biomimetic particles: a new bioengineering tool learned from nature | |
| JP2004508012A (ja) | エンドソーム膜不安定剤を用いたｓｐｌｐ媒介性トランスフェクションの強化方法 | |
| MacLachlan et al. | Diffusible‐PEG‐Lipid Stabilized Plasmid Lipid Particles | |
| CZ20021216A3 (cs) | Lipidové váčky obsahující DOSPER | |
| EP4355882A2 (en) | Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression | |
| Yanagihara et al. | Liposome-mediated gene transfer | |
| CZ119299A3 (cs) | Způsob přípravy prostředku pro přenos nukleových kyselin | |
| Muralidharan et al. | Lipid Nanocarriers for RNAi-Based Cancer Therapy | |
| Mkhwanazi | The use of cholesterol-galacto compounds in liver directed gene delivery. | |
| Narainpersad | Cationic liposome mediated targeted gene delivery with and without pegylated accessories. | |
| Daniels | Elucidation of gene function using RNA interference in a cancer cell culture model. |