ES2208763T3 - Formulaciones de emulsion para el suministro de acidos nucleicos a las celulas. - Google Patents
Formulaciones de emulsion para el suministro de acidos nucleicos a las celulas.Info
- Publication number
- ES2208763T3 ES2208763T3 ES96933899T ES96933899T ES2208763T3 ES 2208763 T3 ES2208763 T3 ES 2208763T3 ES 96933899 T ES96933899 T ES 96933899T ES 96933899 T ES96933899 T ES 96933899T ES 2208763 T3 ES2208763 T3 ES 2208763T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- complex
- emulsion
- component
- formulation
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
SE DESCRIBEN NUEVOS FORMULADOS EN EMULSION Y MICELARES, ASI COMO COMPLEJOS DE ESTOS FORMULADOS CON SUSTANCIAS BIOLOGICAMENTE ACTIVAS. LOS NUEVOS FORMULADOS DIFIEREN DE LOS VECTORES LIPIDICOS CATIONICOS, TALES COMO LIPOSOMAS CATIONICOS, EN QUE LOS COMPLEJOS FORMADOS ENTRE LAS SUSTANCIAS BIOLOGICAMENTE ACTIVAS Y LOS FORMULADOS EN EMULSION Y MICELARES DE ESTA INVENCION SON FISICAMENTE ESTABLES Y SU ACTIVIDAD DE TRANSFECCION RESULTA RESISTENTE A LA PRESENCIA DE SUERO. ESTOS NUEVOS FORMULADOS SE DESCRIBEN COMO UTILES EN AREAS TALES COMO LA TERAPIA GENICA O LA ADMINISTRACION DE VACUNAS.
Description
Formulaciones de emulsión para el suministro de
ácidos nucléicos a las células.
La presente invención se refiere al uso de
dispersiones de lípidos para suministrar substancias biológicamente
activas a las células. En particular la presente invención se
refiere a formulaciones de emulsión y a la capacidad de estas
formulaciones para formar complejos estables con substancias
biológicamente activas y facilitar con ello el suministro de estas
substancias a las células.
Los liposomas catiónicos son de interés como
vehículo no viral para el suministro de substancias biológicamente
activas tales como fármacos, hormonas, enzimas, ácidos nucléicos y
antígenos, incluyendo virus, a células tanto in vitro como
in vivo. Ciertamente, se ha demostrado que los liposomas
catiónicos suministran genes in vivo (Nabel, E.G. et al.
(1990) Science, 249: 1285-1288), (Brigham,
K.L., et al. (1989) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.,
195-200, Stribling, R., et al. (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci U.S.A., 89: 11277-11281), (Plautz,
G.E., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 90:
4645-4649, Stewart, M.J., et al. (1992) Hum.
Gene Ther., 3: 267-275). Sin embargo, la
inhibición por componentes del suero de la transferencia de ácidos
nucléicos por liposomas catiónicos limita la aplicación de los
liposomas como vector para los ácidos nucleicos in vivo para
administraciones regionales que evitan la exposición al suero.
Además, la estabilidad es el principal problema
que limita el uso de liposomas tanto con respecto a la vida de
almacenamiento como después de la administración in vivo. De
este modo, es deseable explorar el uso de otros tipos de
dispersiones de lípidos como utilidad de sistemas de suministro
para substancias biológicamente activas.
La patente de EE.UU. 4.610.888 se refiere al uso
como sistema de suministro de fármaco de emulsiones de agua en
aceite en las que el volumen de la fase acuosa varía de alrededor
de 0,7% a alrededor de 10,25% del volumen de los componentes lípidos
usados. Sin embargo, tales emulsiones de agua en aceite son
inapropiadas para suministrar substancias en sangre o en otros
tejidos corporales acuosos.
El documento WO 95/12384 describe una formulación
de aceite autoemulsionable (SEOF) que contiene un componente
aceitoso y un tensioactivo. La SEOF se caracteriza porque el
componente aceitoso contiene un vector aceitoso y un lípido
catiónico y, opcionalmente, un alcohol graso aceitoso lipófilo. La
emulsión de aceite en agua que se forma por la mezcla de la SEOF
tiene gotas aceitosas que están positivamente cargadas.
El documento WO 93/18852 describe una emulsión de
aceite en agua útil como vehículo de suministro de ingredientes
hidrófobos tales como fármacos farmacéuticos y agentes activos
cosméticos en la que las partículas de la emulsión tienen una carga
positiva neta.
El documento
EP-A-387647 describe una composición
farmacéutica muy dispersa en forma de una microemulsión que
comprende una substancia ácida o básica o su sal; un material
catiónico o iónico; un componente graso, que es miristato de
isopropilo, 2-octildodecanol, aceite de parafina,
nicotinato de tocoferol y/o triacetina; un tensioactivo que es un
éster de ácido graso polioxietilenado y/o un éter de alcohol graso y
polioxietileno y un co-tensioactivo que es un éster
de ácido graso y glicerina polioxietilenado, y agua.
El documento WO 93/05162 describe un método para
facilitar la transferencia de ácidos nucléicos a células, que
comprende preparar una dispersión mixta de lípidos de un lípido
catiónico con un co-lípido en un vehículo disolvente
apropiado.
Treiner et al., J. Coloid Interface Sci 125 No. 1
(1988), 261-270 describe la solubilización micelar
en sistemas de tensioactivo binario acuoso, específicamente ácidos
barbitúricos en mezclas de aniónico más no iónico o catiónico más no
iónico.
Farhood et al., Biochim. Biophys. Acta 1111 No. 2
(1992), 239-246 describen el efecto de derivados de
colesterol catiónicos sobre la transferencia de genes y la
actividad de la proteína quinasa C.
La presente invención se refiere a nuevas
formulaciones de emulsión útiles para suministrar substancias
biológicamente activas a las células. Las formulaciones de emulsión
de esta invención son compatibles con la sangre, retienen la
actividad en presencia de suero y son estables en el
almacenamiento. Las emulsiones de esta invención comprenden
componentes lípidos, un ácido nucleico y un vehículo acuoso, en las
que los componentes lípidos comprenden un componente aceitoso, un
componente anfifílico catiónico, preferentemente un lípido catiónico
y un componente tensioactivo no iónico. Las formulaciones micelares
(no reivindicadas aquí) comprenden componentes lípidos, un ácido
nucléico y un vehículo acuoso, en las que los componentes lípidos
comprenden un componente anfifílico catiónico y un componente
tensioactivo no iónico. Los componentes lípidos de la formulación
de emulsión de la presente invención pueden comprender
adicionalmente un componente fosfolípido neutro.
El "componente" tal como se usa a lo largo
de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se define como: que
comprende por lo menos un compuesto anfifílico catiónico o una
mezcla de compuestos anfifílicos cuando se usa en la frase
"componente anfifílico"; que comprende por lo menos un aceite o
una mezcla de aceites cuando se usa en la frase "componente
aceitoso"; que comprende por lo menos un tensioactivo no iónico
o una mezcla de tensioactivos no iónicos cuando se usa en la frase
"componente tensioactivo no iónico"; que comprende por lo menos
un fosfolípido neutro o una mezcla de fosfolípidos neutros cuando
se usa en la frase "componente fosfolípido neutro".
La invención se refiere a complejos formados
combinando un ácido nucléico y opcionalmente otras substancias
biológicamente activas y las formulaciones de emulsión
anteriormente identificadas. Los complejos de ácido
nucléico:emulsión son estables en el tiempo y pueden tener utilidad
terapéutica y/o profiláctica in vivo dependiendo de la
actividad del ácido nucléico contenido en el complejo.
Esta invención también proporciona un método
in vitro para suministrar un ácido nucléico a las células
exponiendo las células a los complejos de esta invención. En una
realización, se proporciona un método de exponer células a un ácido
nucléico, comprendiendo dicho método cultivar dichas células en
presencia de un complejo de ácido nucléico:emulsión facilitando con
ello el suministro del ácido nucléico a las células.
La invención proporciona adicionalmente el uso de
una formulación de emulsión para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de un estado en un animal o ser humano, siendo
dicho estado uno en el que el tratamiento comprende el suministro
de un ácido nucléico a las células del ser humano o animal. Se debe
entender que los complejos usados para el suministro de un ácido
nucléico a células in vitro o in vivo pueden ser
recientemente preparados por mezcla, o se pueden preparar antes y
almacenar previamente a su uso.
La invención proporciona también un kit que
contiene un complejo formado entre un ácido nucléico y una
formulación de emulsión.
También se proporcionan aquí métodos para
producir formulaciones de emulsión según la invención.
En una realización, un método para producir una
formulación de emulsión de esta invención comprende
a) combinar un disolvente orgánico con un
componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico y un
componente tensioactivo no iónico;
b) retirar el disolvente orgánico para dejar una
película de lípido; y
c) suspender la película de lípido en un vehículo
acuoso para producir dicha formulación de emulsión miscible en
disolución acuosa.
En una realización alternativa, el aceite puede
servir como disolvente orgánico en la etapa (a) de tal modo que el
método para producir una formulación de emulsión de esta invención
comprende
a) combinar un componente aceitoso, un componente
anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no iónico; y
b) añadir un vehículo acuoso a la combinación de
la etapa (a).
Cuando se va a incluir un componente fosfolípido
neutro en la emulsión, el componente fosfolípido neutro se combina
con los componentes anteriores en la etapa (a).
El método para producir una formulación micelar
miscible en disolución acuosa comprende:
a) combinar un disolvente orgánico con un
componente anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no
iónico;
b) retirar el disolvente orgánico para dejar una
película de lípido; y
c) suspender la película de lípido en un vehículo
acuoso para producir dicha formulación micelar miscible en
disolución acuosa.
Cuando se va a incluir un componente fosfolípido
neutro en la formulación micelar, el componente fosfolípido neutro
se combina con los componentes anteriores en la etapa (a).
La figura 1 muestra la optimización de la
transfección de células BL6 con complejos formados entre ADN de
pCMV-Luc y las formulaciones nº 21
(\bullet-\bullet), nº 27
(\blacksquare-\blacksquare), nº 28
(\blacktriangle-\blacktriangle) o nº 30
(\medcirc-\medcirc) (véase la Tabla 3 para las
composiciones de las formulaciones) mezclando 6 \mul de cada
formulación (6 \mul de cada formulación contenían en 4,5 \mug
de DC-Chol) con cantidades variables de ADN de
pCMV-Luc como se indica en el eje horizontal.
La figura 2 muestra la optimización de la
transfección de células BL6 con complejos formados entre ADN de
pCMV-Luc y cantidades variables de las formulaciones
nº 21 (\bullet-\bullet), nº 27
(\blacksquare-\blacksquare), nº 28
(\blacktriangle-\blacktriangle) o nº 30
(\medcirc-\medcirc) tal como se indica en el
eje horizontal (véase la Tabla 3 para las composiciones de las
formulaciones) La cantidad de ADN de pCMV-Luc se
fijó en 2\mug para las formulaciones nº 27 y nº 30 y en 1,5 \mug
de ADN de pCMV-Luc para las formulaciones nº 21 y nº
28 y "\mug de formulación" en el eje horizontal se refiere a
\mug de componentes lípidos totales presentes en la cantidad de
formulación combinada con ADN de pCMV-Luc para
formar el complejo.
La figura 3 muestra la estabilidad de los
complejos formados entre ADN y las formulaciones micelar o de
emulsión indicadas (véase la Tabla 3 para la composición de las
formulaciones). El complejo se preparó con 2 \mug de pCMVCAT y 16
\mul de las formulaciones indicadas que contienen la misma
cantidad de DC-Chol (12 \mug) en un volumen final
de 250 \mul, excepto para los complejos de
DC-Chol/liposoma DOPE:ADN que se prepararon con 1
\mug de pCMVCAT y 6 \mug de liposoma en un volumen final de 250
\mul.
La figura 4 muestra el efecto de variar la
concentración de Tween 80 en emulsiones que contienen 0,25 mg de
aceite, 0,25 mg de DOPE, 0,75 mg de DC-Chol y x mg
de Tween 80 por ml en el diámetro medio de complejos de ADN de
pCMV-Luc/emulsión concentrados
(\bullet-\bullet), y diluidos
(\medcirc-\medcirc).
Las figuras 5A y 5B muestran el efecto del Tween
80 en la actividad de transfección de complejos de ADN de
pCMV-Luc/emulsión concentrados (Figura 5A) y
diluidos (Figura 5B) en células BL6 en un medio que contiene 0 ó
20% de suero. Las formulaciones de emulsión usadas para producir
los complejos de ADN/emulsión diluidos y concentrados contenían
0,25 mg de aceite, 0,25 mg de DOPE, 0,75 mg de
DC-Chol y cantidades variables de Tween 80 por ml.
El complejo de ADN/emulsión concentrado se formó añadiendo 2 \mul
de disolución que contiene 8 \mug de ADN de
pCMV-Luc a 72 \mul de emulsión y el complejo de
ADN/emulsión diluido se formó combinando 2 \mug de ADN de
pCMV-Luc en 125 \mul con 18 \mul de emulsión
diluida hasta 125 \mul.
La figura 6 muestra la expresión del gen
indicador de la CAT en ratones inyectada vía la vena de la cola con
complejos de ADN:emulsión o ADN:micela. Los complejos se formaron
como sigue: 200 \mul de cada uno de los concentrados 4 veces de
formulaciones nº 21 (1100 \mug de componentes lípidos totales), nº
28 (1000 \mug de componentes lípidos totales), nº 34 (900 \mug
de componentes lípidos totales) y nº 31 (700 \mug de componentes
lípidos totales) se mezclaron con 6 \mul de NaCl 5 M hasta una
concentración final de NaCl de 0,15 M y a continuación se combinaron
con 25 \mul de ADN de pCMV-CAT 4 \mug/\mul
(100 \mug). La cantidad de DC-Chol contenida en
cada complejo de ADN:emulsión y ADN:micela era 600 \mug. Después
de dos días, se escindieron los órganos y se extrajo la proteína.
La actividad de la CAT se midió usando
[^{14}C]cloranfenicol de 0,1 \muCi como substrato. Cada
barra representa la media de dos ratones.
La presente invención se refiere a formulaciones
de emulsión que forman complejos estables con un ácido nucléico y
facilitan con ello el suministro del ácido nucléico a las
células.
Las formulaciones de emulsión de esta invención
son emulsiones de aceite en agua que comprenden un vehículo acuoso
y los siguientes componentes lípidos, un componente aceitoso, un
componente anfifílico catiónico, un componente tensioactivo no
iónico y opcionalmente, un componente fosfolípido neutro.
Preferentemente, los componentes lípidos totales
están presentes en la formulación de emulsión en una cantidad de
alrededor de 0,001 a alrededor de 20% en peso, más preferentemente
de alrededor de 0,01 a alrededor de 10% en peso y lo más
preferentemente de alrededor de 0,05 a alrededor de 2% en peso,
siendo el resto de la emulsión en peso vehículo acuoso. De este
modo, por ejemplo, para la formulación nº 1 en la Tabla 1 en la que
están presentes 0,625 mg de los componentes lípidos totales en 0,5
ml de PBS, el % en peso de los componentes lípidos totales en la
formulación nº 1 se puede calcular como sigue: Suponiendo que 1 ml
de PBS, como 1 ml de agua, pesa aproximadamente 1000 mg, entonces
0,5 ml de PBS pesan 500 mg y el % en peso de los componentes lípidos
totales contenidos en la formulación nº 1 es
\frac{0,625 \ mg}{0,625 \ mg
+ 500 \ mg} \ x \ 100 =
0,125%
De los componentes lípidos totales presentes en
las formulaciones de emulsión de esta invención, preferentemente,
el componente anfifílico está presente en una cantidad de alrededor
de 5 a alrededor de 80% en peso de los componentes lípidos totales
en la formulación de emulsión; el componente aceitoso está presente
en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 80% en peso de
los componentes lípidos totales; el componente tensioactivo no
iónico está presente en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor
de 50% en peso de los componentes lípidos totales, y opcionalmente,
el componente fosfolípido neutro está presente en la formulación en
una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 25% en peso del
componente lípido total.
Más preferentemente, el componente aceitoso está
presente en una cantidad de alrededor de 10-60% en
peso de los componentes lípidos totales en la formulación de
emulsión; el componente anfifílico está presente en una cantidad de
alrededor de 20-60% en peso de los componentes
lípidos totales; el componente tensioactivo no iónico está presente
en una cantidad de alrededor de 10-50% en peso de
los componentes lípidos totales y opcionalmente, un componente
fosfolípido neutro está presente en una cantidad de alrededor de
10-40% en peso de los componentes lípidos
totales.
Lo más preferentemente, la formulación de
emulsión comprende el componente aceitoso en una cantidad de
alrededor de 10-20% en peso de los componentes
lípidos totales; el componente anfifílico en una cantidad de
alrededor de 40-60% en peso de los componentes
lípidos totales, el componente tensioactivo no iónico en una
cantidad de alrededor de 20-50% en peso de los
componentes lípidos totales y opcionalmente el componente
fosfolípido neutro en una cantidad de alrededor de
10-20% en peso de los componentes lípidos totales.
Una formulación de emulsión particularmente preferida contiene un
aceite, un compuesto anfifílico catiónico, un tensioactivo no iónico
y un fosfolípido neutro con una relación en peso de alrededor de
2:6:1:2.
Las formulaciones micelares son compatibles con
la sangre. Las formulaciones micelares comprenden un vehículo
acuoso y los siguientes componentes lípidos: un componente
anfifílico catiónico, un componente tensioactivo no iónico y
opcionalmente, un componente fosfolípido neutro.
Preferentemente, los componentes lípidos totales
están presentes en la formulación micelar en una cantidad que varía
de alrededor de 0,0001 a alrededor de 70% en peso, más
preferentemente de alrededor de 0,001 a alrededor de 60% en peso y
lo más preferentemente de alrededor de 0,001 a alrededor de 50% en
peso, siendo en resto en peso de la formulación micelar un vehículo
acuoso. De este modo por ejemplo, para la formulación nº 15 en la
Tabla 2 en la que 1,25 mg de los componentes lípidos totales están
presentes en 1 ml de PBS, el % en peso de los componentes lípidos
totales en la formulación nº 15 se puede calcular como sigue:
Suponiendo que 1 ml de PBS, como 1 ml de agua, pesa aproximadamente
1000 mg, entonces el % en peso de los componentes lípidos totales
en la formulación nº 15 es
\frac{1,25 \ mg}{1,25 \ mg +
1000 \ mg} \ x \ 100 =
0,125%
De los componentes lípidos totales contenidos en
las formulaciones micelares preferentemente, el componente
anfifílico está presente en una cantidad de alrededor de 10 a
alrededor de 90% en peso de los componentes lípidos totales en la
formulación micelar, el componente tensioactivo no iónico está
presente en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 90% en
peso de los componentes lípidos totales; y opcionalmente, el
componente fosfolípido neutro está presente en una cantidad de
alrededor de 5 a alrededor de 40% en peso de los componentes
lípidos totales.
Más preferentemente, el componente anfifílico
está presente en una cantidad de alrededor de 30 a alrededor de 90%
en peso de los componentes lípidos totales en la formulación
micelar, el componente tensioactivo no iónico está presente en una
cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 70% en peso de los
componentes lípidos totales y opcionalmente, el componente
fosfolípido neutro está presente en una cantidad de alrededor de 5
a alrededor de 30% en peso de los componentes lípidos totales.
Lo más preferentemente, el componente anfifílico
está presente en una cantidad de alrededor de 50 a alrededor de 90%
en peso de los componentes lípidos totales en la formulación
micelar, el componente tensioactivo no iónico está presente en una
cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 50% en peso de los
componentes lípidos totales y opcionalmente, el componente
fosfolípido neutro está presente en una cantidad de alrededor de 10
a alrededor de 20% en peso de los componentes lípidos totales. Una
formulación micelar particularmente preferida contiene un compuesto
anfifílico catiónico, un tensioactivo no iónico y un fosfolípido
neutro con una relación en peso de alrededor de 6:1:2.
Por componente aceitoso tal como se usa aquí se
entiende cualquier componente inmiscible en agua que se denomina
convencionalmente un aceite. Se debe entender que el componente
aceitoso puede incluir mezclas de dos o más aceites. Los ejemplos
de aceites que se pueden usar para producir las formulaciones de
emulsión de la presente invención incluyen, pero no están limitados
a, aceites naturales tales como aceite de almendra, aceite de coco,
aceite de hígado de bacalao, aceite de maíz, aceite de semilla de
algodón, aceite de ricino, aceite de oliva, aceite de palma, aceite
de cacahuete, aceite de menta piperita, aceite de Rose, aceite de
azafrán, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de girasol y
aceite vegetal y aceites sintéticos tales como trietilglicerol y
dietilglicerol. Un aceite preferido es aceite de ricino.
El componente anfifílico catiónico de las
formulaciones de esta invención puede ser cualquier compuesto
anfifílico catiónico o mezcla de compuestos anfifílicos que es
efectiva para su uso en liposomas o para producir complejos de
lípido capaces de suministrar una substancia biológicamente activa
a las células. Por ejemplo, los compuestos anfifílicos descritos en
Bolcsak et al., patente de EE.UU. 5.100.662. serían apropiados para
su uso en esta invención. Los ejemplos adicionales de compuestos
anfifílicos catiónicos apropiados para formular las formulaciones
de emulsión de esta invención incluyen lípidos catiónicos tales
como
1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano
(DOTAP); cloruro de
N-[1,-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) u otros tensioactivos de
N-(N,N-1-dialcoxi)-alquil-N,N,N-amonio
trisubstituido;
1,2-dioleoil-3-(4'-trimetilamonio)butanoil-sn-glicerol
(DOBT) o (4'-trimetilamonio)butanoato de
colesterilo (ChOTB) en el que el grupo trimetilamonio está conectado
vía un brazo espaciador de butanoilo a la doble cadena (para DOTB)
o al grupo colesterilo (para ChOTB); DORI
(DL-1,2-dioleoil-3-dimetilaminopropil-B-hidroxietilamonio)
o DORIE
(DL-1,2-O-dioleoil-3-dimetilaminopropil-\beta-hidroxietilamonio)
(DORIE) o sus análogos como se describe en el documento WO
93/03709; éster de colina y
1,2-dioleoil-3-succinil-sn-glicerol
(DOSC); éster hemisuccinato de colesterilo (ChOSC); lipopoliaminas
tales como dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS) y
fosfatidiletanolamidoespermina dipalmitoilo (DPPES) o los lípidos
catiónicos descritos en la patente de EE.UU. número 5.283.185,
yoduro de
colesteril-3\beta-carbonil-amido-etilenotrimetilamonio,
yoduro de carboxilato de
1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesterilo,
colesteril-3\beta-carboxiamidoetilenoamina,
yoduro de
colesteril-3\beta-oxisuccinamidoetilenotrimetilamonio,
yoduro de
1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesteril-3\beta-oxisuccinato,
yoduro de
2-[(2-trimetilamonio)-etilmetilamino]etil-colesteril-3\beta-oxisuccinato,
3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol
(DC-Chol), y
3\beta-[N-(polietilenimina)-carbamoil]colesterol.
Los ejemplos de compuestos anfifílicos preferidos
incluyen yoduro de
colesteril-3\beta-carboxiamidoetilenotri-metilamonio,
yoduro de carboxilato de
1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesterilo,
colesteril-3\beta-carboxiamidoetilenamina,
yoduro de
colesteril-3\beta-oxisuccinamidoetilenotrimetilamonio,
yoduro de
1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesteril-3\beta-oxisuccinato,
yoduro de
2-[(2-trimetilamonio)etilmetilamino]etil-colesteril-3\beta-oxisuccinato,
3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]-colesterol
(DC-Chol), y
3\beta[N-(polietilenimina)-carbamoil]colesterol.
Dado que un atributo de las formulaciones micelar
y de emulsión de la presente invención es su estabilidad cuando se
almacena sola o como complejos con substancias biológicamente
activas, se entenderá por aquellos de experiencia media en la
técnica que los compuestos anfifílicos catiónicos son los lípidos
catiónicos en los que los enlaces entre el grupo lipófilo y el
grupo amino son estables en disolución acuosa. Tales enlaces
incluyen enlaces amida, enlaces éster, enlaces éter y enlaces
carbamoilo. Un lípido catiónico más preferido es
DC-Chol.
El componente tensioactivo no iónico de las
formulaciones de esta invención incluye por lo menos un
tensioactivo no iónico de un peso molecular entre 200 y 20.000. En
una realización, estos tensioactivos se pueden formar haciendo
reaccionar un compuesto hidrófobo que contiene hidroxilo (por
ejemplo, un alcohol o fenol) con óxido de etileno en el que se
pueden aumentar el número de grupos óxido de etileno hasta cualquier
límite deseado. Sin embargo, los de experiencia media en la técnica
entenderían que la capacidad para estabilizar las emulsiones o
micelas de esta invención puede depender de la cantidad relativa de
óxido de etileno añadido a un grupo hidrófobo dado. Se entiende
adicionalmente que los tensioactivos que tienen restos de óxido de
etileno de cadena ramificada cubren más área de la superficie que
los tensioactivos que tienen restos de óxido de etileno de cadena
lineal y que por lo tanto, los tensioactivos de cadena lineal se
tienen que usar en cantidades más grandes que los tensioactivos de
cadena ramificada para producir la formulación micelar y de
emulsión de esta invención.
Los ejemplos de tensioactivos no iónicos de esta
invención incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol,
derivados de fosfatidiletanolamina y detergentes sintéticos
comercialmente disponibles con los nombres comerciales Span,
Brij,
CH_{3}(CH_{2})_{y}-(OCH_{2}CH_{2}O)_{x}-OH
Brij 72 y = 17 x = 2
Brij 76 y = 17 x = 10
Brij 78 y = 17 x = 20
Brij 100 y = 17 x = 100
Tween,
F68 y F127,
HO(CH_{2}CH_{2}O)_{X}-(
\uelm{C}{\uelm{\para}{CH _{3} }}HCH_{2}O)_{Y}-(CH_{2}CH_{2}O)_{Z}-H
Pluronic F68 x = 75 y = 30 z = 75
Pluronic F127 x = 98 y = 67 z = 98
Triton X-100 y Triton
X-114
Los tensioactivos preferidos son tensioactivos de
cadena ramificada tales como Tween 20, Tween 40, Tween 60 y Tween
80.
Cuando se añaden opcionalmente a las
formulaciones micelar y de emulsión, el componente fosfolípido
neutro puede ser un fosfolípido neutro único o una mezcla de
fosfolípidos neutros. Los ejemplos de fosfolípidos neutros que se
pueden añadir opcionalmente a las formulaciones de esta invención
incluyen, pero no están limitados a, fosfatidilcolina (PC) o
fosfatidiletanolamina (PE) o fosfatidilcolinas (PC) totalmente
saturadas o parcialmente hidrogenadas o fosfatidiletanolaminas (PE)
que tienen cadenas alifáticas entre 6 y 24 átomos de longitud tales
como dioleil-PC (DOPC) y dioleil-PE
(DOPE). Un fosfolípido neutro preferido es DOPE.
También se proporcionan métodos para producir las
formulaciones de emulsión de la presente invención.
Un método para producir formulaciones de emulsión
de esta invención comprende:
(a) combinar un disolvente orgánico con un
componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico, un
componente tensioactivo no iónico y opcionalmente un componente
fosfolípido neutro;
(b) retirar el disolvente orgánico para dejar una
película de lípido; y
(c) suspender la película de lípido en un
vehículo acuoso para producir dicha formulación de emulsión.
Un método alternativo para producir las
formulaciones de emulsión de esta invención comprende:
(a) combinar un componente aceitoso, un
componente anfifílico catiónico, un componente tensioactivo no
iónico y opcionalmente un componente fosfolípido neutro;
(b) añadir un vehículo acuoso a la combinación de
componentes en la etapa (a) para producir dicha emulsión.
Preferentemente, los diámetros medios de las
formulaciones de emulsión son menores de alrededor de 1000 nm, más
preferentemente menores de 800 nm, y lo más preferentemente menores
de 500 nm.
Los componentes preferidos de las emulsiones de
la presente invención incluyen disolución salina tamponada con
fosfato (PBS) como vehículo acuoso, aceite de ricino como
componente aceitoso, DC-Chol como componente
anfifílico, Tween 80 como componente tensioactivo no iónico y
opcionalmente fosfatidilcolina o DOPE como componente fosfolípido
neutro.
Un método para producir las formulaciones
micelares comprende:
(a) combinar un disolvente orgánico con un
componente anfifílico catiónico, un componente tensioactivo no
iónico y opcionalmente un componente fosfolípido neutro;
(b) retirar el disolvente orgánico para dejar una
película de lípido; y
(c) suspender la película de lípido en un
vehículo acuoso para formar dicha formulación micelar.
Preferentemente, los diámetros medios de las
formulaciones micelares son menores de alrededor de 1000 nm, más
preferentemente menores de alrededor de 800 nm; y lo más
preferentemente menores de alrededor de 500 nm.
Los componentes preferidos de las formulaciones
micelares incluyen disolución salina tamponada con fosfato como
vehículo acuoso, DC-Chol como componente
anfifílico, Tween 80 como componente tensioactivo no iónico y
opcionalmente, PC o DOPE como componente fosfolípido neutro.
Cuando se usa un disolvente orgánico en los
métodos anteriores para producir las formulaciones micelar y de
emulsión, es apropiado para su uso cualquier disolvente orgánico
que no deje un residuo tóxico después de la retirada y que
solubilice los componentes lípidos de las formulaciones micelar y
de emulsión. Los ejemplos de disolventes apropiados incluyen
alcoholes inferiores, dimetoxietano, dioxano, tetrahidrofurano,
tetrahidropirano, éter dietílico, acetona, dimetilsulfóxido (DMSO),
dimetilformamidas (DMF) e hidrocarburos halogenados, tales como
cloroformo, acetonitrilo o sus mezclas. Un disolvente orgánico
preferido es cloroformo.
El disolvente orgánico se puede retirar secando
la combinación de la etapa (a) en un gas apropiado tal como argón o
nitrógeno y/o a vacío. La película seca se puede liofilizar a
continuación y almacenar de alrededor de -80 a alrededor de 37ºC o
se puede resuspender en un vehículo acuoso apropiado. Los vehículos
acuosos apropiados para su uso en esta invención son no tóxicos
para las células y pueden estar o no estar tamponados. Cuando los
vehículos están tamponados, los tampones apropiados incluyen
tampones tales como citrato, carbonato, bicarbonato, acetato, Tris,
glicinato y maleato. Los vehículos acuosos que se pueden usar en
las formulaciones de esta invención incluyen, pero no están
limitados a, agua destilada, disolución salina normal y disolución
salina tamponada con fosfato. Se debe entender que un intervalo de
pH preferido para las formulaciones micelar y de emulsión es un
intervalo de pH en el que el componente anfifílico catiónico
particular presente en una formulación está positivamente cargado.
Los de experiencia media en la técnica serían capaces fácilmente de
determinar tal intervalo de pH a partir del pKa del componente
anfifílico catiónico presente en una formulación particular.
Se debe entender adicionalmente que el vehículo
acuoso en el que se suspende la película de lípido puede incluir
ingredientes tales como estabilizantes, antibióticos, o agentes
antifúngicos y antimicóticos.
Una vez formadas, las formulaciones micelar y de
emulsión se pueden mezclar con un ácido nucléico para producir
complejos que son estables en el almacenamiento como se refleja por
una retención de la actividad del ácido nucléico con el tiempo o por
la retención del diámetro de la formulación micelar o de emulsión
con el tiempo.
En una realización, se puede ensayar la capacidad
de una formulación de emulsión de esta invención para suministrar
un ácido nucléico a una célula exponiendo células a complejos
formados entre una formulación micelar o de emulsión y una
construcción de plásmido que contiene un gen indicador como ácido
nucléico. Tales genes indicadores son conocidos por los de
experiencia media en la técnica e incluyen el gen de la
cloranfenicol acetiltransferasa, el gen de la luciferasa, el gen de
la \beta-galactosidasa y el gen de la hormona de
crecimiento humano.
Por "substancia biológicamente activa" tal
como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y reivindicaciones
se entiende una molécula, compuesto, o composición que cuando está
presente en una cantidad efectiva, reacciona con y/o afecta a las
células vivas y organismos. Se debe entender que dependiendo de la
naturaleza de la substancia activa, la substancia activa puede ser
activa en la superficie de la célula o producir su actividad, tal
como con ADN o ARN, después de ser introducida dentro de la
célula.
Los ejemplos de substancias biológicamente
activas incluyen, pero no están limitados a, ácidos nucléicos tales
como ADN, cADN, ARN (mARN completo, ribozimas, ARN antisentido,
señuelos), oligodesoxinucleótidos (fosfodiésteres, fosfotioatos,
fosforamiditas, y todas las otras modificaciones químicas),
oligonucleótido (fosfodiésteres, etc.) o ADN de plásmido lineal y
circular cerrado; carbohidratos; proteinas y péptidos, incluyendo
proteínas recombinantes tales como, por ejemplo, citoquinas (por
ejemplo, interleuquinas), factores trófico y de crecimiento o
maduración (por ejemplo, NGF, G-CSF,
GM-CSF), enzimas, vacunas (por ejemplo, HbsAg,
gp120); vitaminas, prostaglandinas, fármacos tales como anestésicos
locales (por ejemplo, procaína), agentes antimalaria (por ejemplo,
cloroquina), compuestos que necesitan cruzar la barrera
sangre-cerebro tales como agentes
anti-parkinson (por ejemplo,
levo-DOPA), antagonistas del receptor adrenérgico
(por ejemplo, propanolol), agentes anti-neoplasticos
(por ejemplo, doxorubicina), antihistaminas, aminas biogénicas (por
ejemplo, dopamina), antieméticos (por ejemplo, clorpromazina) y
analgésicos (por ejemplo, codeína, morfina) o fármacos de pequeño
peso molecular tales como cisplatino que mejoran la actividad de
transfección, o prolongan la duración del ADN dentro y fuera de las
células.
Cuando la substancia biológicamente activa es una
proteína o péptido antigénico, los complejos formados por las
formulaciones micelar o de emulsión se pueden utilizar como
vacunas. En esta realización, la presencia de aceite en la
formulación de emulsión puede mejorar un efecto adyuvante del
complejo.
En una realización preferida los ácidos nucléicos
son ácidos nucléicos que codifican un gen o un fragmento de gen o
que efectúan transcripción y/o traducción.
Los complejos de la presente invención se pueden
utilizar para suministrar un ácido nucléico a células in
vitro o in vivo.
Se cree que el compuesto anfifílico catiónico se
une al ácido nucléico negativamente cargado. Preferentemente, los
complejos de ácido nucléico:emulsión de esta invención que se va a
usar in vitro o in vivo tienen una relación en peso de
ácido nucléico:componentes lípidos totales en la emulsión de
alrededor de 1:1 a alrededor de 1:50, más preferentemente una
relación en peso de ácido nucléico:componentes lípidos totales en la
emulsión de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:30 y lo más
preferentemente una relación en peso de ácido nucléico:componentes
lípidos totales en la emulsión de alrededor de 1:1 a alrededor de
1:20. De este modo por ejemplo, en el Ejemplo 11 en el que el
complejo de ADN:emulsión se formó combinando 100 \mug de ADN con
un volumen de la formulación de emulsión nº 21 que contiene 1100
\mug de componentes lípidos totales, la relación en peso de
ADN:componentes lípidos totales de la emulsión nº 21 en el complejo
era 100 \mug/1100 \mug o 1:11.
Preferentemente, los complejos de ácido
nucléico:micela que se van a usar in vitro o in vivo
tienen una relación en peso de ácido nucléico:componentes lípidos
totales en la micela de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:50, más
preferentemente una relación en peso de ácido nucléico:componentes
lípidos totales en la micela de alrededor de 1:1 a alrededor de
1:30 y lo más preferentemente una relación en peso de ácido
nucléico:componentes lípidos totales en la micela de alrededor de
1:1 a alrededor de 1:20. De este modo por ejemplo, en el Ejemplo 11
en el que se formó un complejo de ADN:micela combinando 100 \mug
de ADN con un volumen de formulación micelar nº 31 que contiene 700
\mug de componentes lípidos totales, la relación en peso de
ADN:componentes lípidos totales de la micela nº 31 en el complejo
era 100 \mug/700 \mug o 1:7.
Se debe entender que la combinación de
formulaciones micelar o de emulsión con un ácido nucléico para
formar los complejos de ácido nucléico:emulsión o ácido
nucléico:micelar se puede llevar a cabo durante por lo menos 5
minutos en presencia o ausencia de suero a una temperatura de
alrededor de 4ºC a alrededor de 37ºC. Los complejos de ácido
nucléico:emulsión y ácido nucléico:micela resultantes se pueden
usar a continuación inmediatamente in vitro o in vivo
o se pueden almacenar previamente a su uso.
Preferentemente, los diámetros medios de los
complejos de ácido nucléico:emulsión o ácido nucléico:micela que se
van a usar in vitro o in vivo son
100-4000 nm, más preferentemente
100-2000 nm y lo más preferentemente
100-1000 nm.
En una realización, los complejos de ácido
nucléico:emulsión de esta invención se pueden usar para transfectar
células con ácido nucléico. Las células apropiadas para la
transfección in vitro incluyen células eucariotas, que
incluyen todas las líneas celulares de mamíferos apropiadas para
transfección por lípidos catiónicos, células colocadas en cultivo
primario de un hospedante, o células que son el resultado del paso
del cultivo primario.
Cuando, por ejemplo, se transfectan 10^{5}
células in vitro, la transfección se lleva a cabo exponiendo
las células a preferentemente de 0,1 a alrededor de 5 \mug de
complejo de ácido nucléico:emulsión, más preferentemente de
alrededor de 5 a alrededor de 2 \mug de complejo de ácido
nucléico:emulsión.
Cuando se van a transfectar 10^{5} células con
complejo de ácido nucléico:micela, la transfección se lleva a cabo
exponiendo las células a preferentemente de alrededor de 0,1 a
alrededor de 20 \mug de complejo de ácido nucléico:micela; más
preferentemente de alrededor de 1 a alrededor de 10 \mug de
complejo de ácido nucléico:micela.
Tal como se usa aquí, \mug de complejo de ácido
nucléico:emulsión o \mug de complejo de ácido nucléico:micela se
refieren a la suma de la cantidad de \mug de ácido nucléico y la
cantidad de \mug de componentes lípidos totales en la formulación
micelar o de emulsión contenida en el complejo. Por ejemplo, 5
\mug de complejo de ácido nucléico:emulsión pueden contener 0,5
\mug de ácido nucléico y 4,5 \mug de componentes lípidos
totales de la formulación de emulsión.
Los de experiencia media en la técnica
entenderían fácilmente que la cantidad total de complejo de ácido
nucléico:emulsión o ácido nucléico:micela que se va a usar varía
directamente con el número de células que se van a transfectar. Una
ventaja de las formulaciones micelar y de emulsión frente a los
vectores de lípido catiónico es que las emulsiones y micelas de la
invención, cuando se complejan con ácido nucléico, son más
efectivas para transfectar células cultivadas en un medio que
contiene suero.
Los complejos de ácido nucléico:emulsión y ácido
nucléico:micela se pueden usar para suministrar ácidos nucléicos a
células en un animal o ser humano in vivo. De este modo los
complejos de ácido nucléico:emulsión o ácido nucléico:micela se
pueden usar como sistemas de suministro en terapia génica.
Las rutas apropiadas de administración de los
complejos que contienen ácido nucléico de esta invención a un
animal o ser humano incluyen la inoculación o inyección, por
ejemplo, por ruta intravenosa, oral, intraperitoneal, intramuscular,
subcutánea, intra-ótica, intraarticular o
intra-mamaria, aplicación tópica, por ejemplo sobre
la piel, cuero cabelludo, orejas u ojos y por absorción a través de
los tejidos epitelial o mucocutáneo, por ejemplo, nasal, oral,
vaginal, rectal y gastrointestinal entre otros, y en forma de
aerosol. Los de experiencia media en la técnica entenderían
fácilmente que el modo de administración puede determinar los
sitios en el organismo a los que se suministrará la substancia
biológicamente activa y puede afectar a la cantidad de complejo que
se va a administrar.
Dado que como se muestra en el Ejemplo 11, la
administración de aproximadamente 4 \mug de complejo de ácido
nucléico:emulsión o ácido nucléico:micela/gramo de peso corporal a
un ratón de 25 gramos produjo actividad de transfección in
vivo, los de experiencia media en la técnica usando esta
relación de 4 \mug de complejo/gramo de peso corporal de ratón
podrían obtener otras relaciones de \mug de complejo/gramo de
peso corporal que están optimizadas para la actividad de
transfección en otros animales o seres humanos.
En una realización alternativa, las formulaciones
micelar y de emulsión mismas se pueden unir con biomacromoléculas
(es decir, moléculas producidas por el animal o ser humano) in
situ después de administraciones sistemática o tópica y se
comportan como una reserva local para substancias bioactivas
endógenas.
Los siguientes ejemplos ilustran varios aspectos
de la invención.
Se sintetizó lípido catiónico
DC-Chol según Gao and Huang (Biochem. Biophys. Res.
Commun., 179:280-285, 1991). El Tween 80 y al aceite
de ricino se obtuvieron de Fisher, el copolímero pluronic L63 se
obtuvo de BASF. Los tensioactivos Brij, Span, y pluronic F68 y F127
se compraron de Sigma. El dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) y
la fosfatidilcolina de huevo (PC) se obtuvieron de Avanti Polar
Lipids. Los liposomas de LipofectAMINE (DOSPA
(2,3-dioleiloxi-N-[2-(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propaminio)
y DOPE) en una relación en peso de 3:1) se obtuvieron de Life
Technologies, Inc.
Tween 80 diluido en cloroformo se combinó con
DC-Chol (micelas) y, cuando se indicaba DOPE o
fosfatidilcolina; o con aceite de ricino, DC-Chol y,
cuando se indicaba, DOPE o fosfatidilcolina (emulsiones) con
diferentes relaciones de peso. El disolvente orgánico se evaporó a
continuación a una corriente de nitrógeno gaseoso y la película de
lípido se desecó a vacío a 4ºC durante la noche para retirar el
disolvente orgánico residual. Se añadió a continuación un ml de
disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y la mezcla
se dejó hidratar durante 1 h. La suspensión de lípido se mezcló a
continuación con un mezclador de vórtice y se homogeneizó
subsecuentemente durante 3-4 minutos usando un
disgregador de tejidos a una velocidad de alrededor de 20.000 rpm.
Los diámetros medios de las formulaciones micelar o de emulsión y de
los complejos de ADN:emulsión o ADN:micela se midieron por
dispersión de luz láser usando un medidor de tamaño de partículas
submicrométricas Coulter N4SD.
Se prepararon liposomas pequeños unilamelares de
aproximadamente 100 nm de diámetro por microfluidización de una
mezcla hidratada de DD-Chol y DOPE (relación en
peso de 1:1) y filtro esterilizado. La concentración final de lípido
de los liposomas de DC-Chol/DOPE usado en los
experimentos de transfección fue 1,2 \mug/\mul de PBS.
Se cultivaron células BL6 de melanoma murino en
medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal. Se
cultivaron células 293 de riñón embriónico humano y F_{0} en
medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal. Las células
CHO se cultivaron en medio F12 suplementado con 10% de suero bovino
fetal.
Un plásmido pCDNA_{3},
pCMV-Luc, que contiene el gen de la luciferasa bajo
el control del promotor de actividad inmediata de citomegalovirus
(CMV) se usó para verificar la eficiencia de la transfección. Un
plásmido similar, pRSV-Luc, que contiene el mismo
gen de luciferasa bajo el control de un promotor del virus sarcoma
de Rous se usó también para verificar la eficiencia de la
transfección. El plásmido pCMV-CAT es un plásmido
basado en pUC18 que contiene el gen de cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT) de E. coli por debajo del promotor
de CMV. La preparación y purificación del ADN del plásmido se llevó
a cabo según un procedimiento estándar (Sambrook, J., Fritsch,
E.F., & Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Lab Press: Plainview 1: pp
21-52, 1989).
Se usaron para la transfección células cultivadas
en placas de 48 pocillos (alrededor de 70-80%
confluentes) y se transfectaron 3 pocillos con cada formulación.
Los ADN de plásmido pCMV-Luc o
pRSV-Luc se diluyeron en 125 \mul de medio de
CHO-S-SFM libre de suero (Life
Technologies, Inc.). La emulsión, micela, liposomas de
DC-Chol/DOPE o liposomas de lipofectAMINE se
diluyeron en 125 \mul de disolución de sal balanceada de Hank
(HBSS). El ADN diluido y las formulaciones o liposomas se
combinaron, con o sin la adición de 20% de suero bovino fetal, y se
incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 min,
antes de ser añadidas a las células. Las células se incubaron a
37ºC durante 5 h. El medio de transfección se reemplazó con medio de
crecimiento que contiene 10% de suero fetal bovino, y las células se
cultivaron a continuación durante 2 días antes de que se realizase
el ensayo de la luciferasa.
Las células se lavaron dos veces con PBS y se
incubaron a temperatura ambiente durante 10 min en presencia de 100
\mul de tampón de lisis (0,1 M
Tris-HC-1, pH 7,8/0,05% Triton
X-100/2 mM EDTA) y a continuación se centrifugaron a
12.000 x g. Se tomaron diez \mul de sobrenadante para el ensayo
de la luciferasa usando el sistema de ensayo de la luciferasa
(Promega) en un medidor de luminosidad (AutoLumat LB953 de
EG&G, Berthhold). La actividad de la luciferasa se da en
unidades de luz relativas (RLU).
Se compraron ratones hembra CD 1 de 5 semanas de
edad de Charles River Breeding Laboratories. El cuidado de los
animales fue según las directrices institucionales. 200 \mul de
cada uno de los concentrados 4 veces (por ejemplo, el concentrado 4
veces de la formulación nº 21 contenía 1,0 ml de aceite, 1,0 mg de
PC, 0,5 mg de Tween 80 y 3,0 mg de DC-Chol por ml
de PBS) de las formulaciones nº 21 (1100 \mug de componentes
lípidos totales), nº 28 (1100 \mug de componentes lípidos
totales), nº 34 (900 \mug de componentes lípidos totales), nº 31
(700 \mug de componentes lípidos totales) (600 \mug de
DC-Chol por formulación) se mezclaron con NaCl 5 M
hasta una concentración final de NaCl de 0,15 M y a continuación se
combinaron con 25 \mul de ADN pCMV-CAT 4
\mug/\mul (100 \mug). La mezcla total (231 \mul) se inyectó
en ratones por la vena de la cola. Dos días más tarde, los ratones
fueron sacrificados y se escindieron el hígado, bazo, riñones,
pulmones y corazón para un ensayo de CAT.
Los órganos escindidos de los animales se
homogeneizaron en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5; EDTA 10
mM; NaCl 150 mM. Después de la homogeneización, las células se
sometieron a lisis por medio de tres ciclos de
congelación-descongelación, y el lisato se calentó
a 65ºC durante 10 min para inactivar las desacetilasas y se
centrifugó durante 10 min. La concentración de proteína de los
extractos de sobrenadante se midió con un ensayo de azul de
Coomassie G 250 (Pierce). Se extrajo proteína de cada órgano y se
ensayaron a continuación 200 \mug de extracto para ver la
actividad de la CAT usando [^{14}C]cloranfenicol en forma
de substrato como se describe previamente (Ausubel, F.M., Breht,
R., Kingstone, R.E., et al. Current Protocols in Molecular Biology
(Wiley, Boston), Vol. 1, pp 962-965, 1991).
Para probar que componentes de las formulaciones
de emulsión son importantes para la estabilidad física y la
capacidad de transfección se formularon 9 diferentes formulaciones
de emulsión que contienen diferentes cantidades de aceite de
ricino, fosfatidilcolina de huevo (PC), Tween 80 y
DC-Chol. Se midió el diámetro medio de las
formulaciones así como su capacidad para transfectar células 293
combinando 6 \mul de cada emulsión (7,5 \mug de componentes
lípidos totales) con 0,5 \mug de RSV-Luc. Los
datos resultantes se presentan en la Tabla 1.
Los datos muestran que las emulsiones son
físicamente estables, variando el tamaño de 150 a 218 nm de
diámetro medio tal como se mide por dispersión de luz láser.
Adicionalmente, los complejos de ADN con aquellas emulsiones con
alto contenido de DC-Chol (0,750 mg), el único
componente catiónico en la emulsión, mostraron alta actividad de
transfección comparable a la de los liposomas catiónicos de
DC-Chol/DOPE y LipofectAMINE.
Ejemplo 2 (no de la invención
reivindicada)
Las formulaciones micelares y de emulsión que
contenían alto contenido del compuesto anfifílico catiónico
DC-Chol (0,75 mg o más) se complejaron con ADN de
pRSV-Luc y se examinaron para ver la actividad de
transfección en células BL6 y 293. Los datos presentados en la
Tabla 2.
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
muestran que los complejos de ADN con las
emulsiones y las dos formulaciones micelares (nº 15 y nº 19) eran
activos. Sin embargo, el complejo formado combinando ADN con la
formulación nº 18 que contenía estearilamina en lugar de
DC-Chol mostró baja actividad de transfección que
puede ser debida a la toxicidad de la estearilamina para las
células como se evidencia por el hecho de que la cantidad de
proteína extraible de los pocillos transfectados con el complejo
que contiene la formulación nº 18 era menor que la cantidad de
proteína extraible de los pocillos transfectados con complejos que
contienen todas las demás formulaciones (véase Tabla 2, nota a pie
de página b). De interés, las actividades de un complejo de ADN
micelar (nº 19) y una emulsión (nº 14) eran altas, y ciertamente
más activo que la formulación de liposoma catiónico
(DC-Chol/DOPE) en ambas líneas
celulares.
Se midió el diámetro físico de las formulaciones
micelar y de emulsión adicionales así como la actividad de
transfección de los complejos formados entre ADN y estas
formulaciones. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los resultados muestran que los complejos de ADN
y micelas que contienen DC-Chol y Tween 80 (nº 30 y
nº 31) fueron de nuevo bastante activos, y reemplazar Tween 80 por
pluronic L63 (nº 32 y nº 33) no alteró significativamente los
diámetros medios de las formulaciones o su actividad de
transfección en células 293. Otra micela que contiene
DC-Chol, Tween 80 y PC (fosfatidilcolina) (nº 26)
era también activa. Las formulaciones restantes (nº
22-25, 27-29) eran emulsiones que
contenían aceite de ricino. Los complejos de ADN y estas
formulaciones de emulsión fueron bastante activos en la
transfección. Cuando los complejos de ADN y estas formulaciones
micelar y de emulsión fueron ensayados en otra línea celular
(células de melanoma de ratón BL6), se obtuvieron resultados
cualitativamente similares excepto que la actividad en esta línea
celular era generalmente más baja que la de las células 293.
Las actividades de transfección de los complejos de ADN y estas emulsiones y micelas fueron comparables a la de la formulación de liposoma catiónico (DC-Chol/DOPE) en células 293, pero en cierto modo más bajas en células
BL6.
Las actividades de transfección de los complejos de ADN y estas emulsiones y micelas fueron comparables a la de la formulación de liposoma catiónico (DC-Chol/DOPE) en células 293, pero en cierto modo más bajas en células
BL6.
Para optimizar la actividad de transfección de
los complejos de ADN:emulsión y ADN:micela, la cantidad de
DC-Chol en cada formulación de emulsión o micela se
mantuvo constante en 4,5 \mug (se usaron 6 \mul de las
formulaciones nos. 21, 27, 28 y 30, respectivamente; remitirse a la
Tabla 3 para las composiciones de las formulaciones) y la cantidad
de ADN de pCMV-Luc se varió de 0 a 5 \mug. Como se
muestra en la figura 1, los complejos de ADN y las formulaciones nº
27 y nº 30 (remitirse a la Tabla 3 para las composiciones) mostró
una actividad máxima de transfección en células BL6 con 2 \mug de
ADN mientras que los complejos de ADN y las formulaciones nº 21 y nº
28 mostraron una máxima actividad con 1,5 g de ADN.
A continuación, la cantidad de ADN de
pCMV-Luc se fijó en 2 \mug para las formulaciones
nº 27 y nº 30 y en
1,5 \mug para las formulaciones nº 21 y nº 28 y se produjeron complejos de ADN y cantidades variables de formulación de emulsión o micela como se indica en el eje horizontal de la Figura 2 (en la que \mug de formulación en el eje horizontal se refiere a \mug de componentes lípidos totales presentes en el volumen de formulación combinada con ADN de pCMV-Luc para formar el complejo). Los resultados presentados en la Figura 2 muestran que los complejos de ADN y las formulaciones nº 27, nº 28 y nº 30 exhibían un pico de actividad relativamente amplio en células BL6 siendo 18 \mug la cantidad óptima de componentes lípidos totales presente en el volumen de formulación combinado con ADN para producir el complejo. Sin embargo, los complejos de ADN y la formulación nº 21 exhibían un pico de actividad más estrecho, siendo 13 \mug la cantidad óptima de componentes lípidos totales presentes en el volumen de formulación combinados con ADN para producir el complejo.
1,5 \mug para las formulaciones nº 21 y nº 28 y se produjeron complejos de ADN y cantidades variables de formulación de emulsión o micela como se indica en el eje horizontal de la Figura 2 (en la que \mug de formulación en el eje horizontal se refiere a \mug de componentes lípidos totales presentes en el volumen de formulación combinada con ADN de pCMV-Luc para formar el complejo). Los resultados presentados en la Figura 2 muestran que los complejos de ADN y las formulaciones nº 27, nº 28 y nº 30 exhibían un pico de actividad relativamente amplio en células BL6 siendo 18 \mug la cantidad óptima de componentes lípidos totales presente en el volumen de formulación combinado con ADN para producir el complejo. Sin embargo, los complejos de ADN y la formulación nº 21 exhibían un pico de actividad más estrecho, siendo 13 \mug la cantidad óptima de componentes lípidos totales presentes en el volumen de formulación combinados con ADN para producir el complejo.
Todos los experimentos de transfección descritos
anteriormente se llevaron a cabo en un medio libre de suero. Por lo
tanto, para determinar la sensibilidad de la actividad de
transfección de los complejos de ADN:emulsión y ADN:micela a la
presencia de suero, se transfectaron células BL6 en el medio que
contiene 0 ó 20% de suero
fetal bovino con complejos de ADN y 10 diferentes emulsiones o micelas (o liposomas de DC-Chol/DOPE) como
sigue.
fetal bovino con complejos de ADN y 10 diferentes emulsiones o micelas (o liposomas de DC-Chol/DOPE) como
sigue.
Se prepararon diferentes formulaciones de las
composiciones mostradas en la Tabla 4 en un volumen total de 1 ml
de PBS (pH 7,4). Se transfectaron a continuación células BL6 en una
placa de 48 pocillos con 2 \mug de pCMV-Luc y 16
\mul de cada formulación (que contiene 12 \mug de
DC-Chol), o con 2 \mug de pCMV-Luc
y 16 \mul de liposomas de DC-Chol/DOPE (1,2
\mug/\mul), en un medio que contiene 0 o 20% de suero bovino
fetal y se detectó la actividad de la luciferasa. Cada pocillo
contenía aproximadamente 70-80 \mug de proteína
extraible. Los resultados que se muestran en la Tabla 4.
demuestran que la actividad de transfección de
liposomas de DC-Chol/DOPE era bastante sensible al
suero (solo alrededor del 33% de actividad permanecía en presencia
de suero) mientras que de las 10 formulaciones ensayadas, solo el
complejo de ADN y la formulación nº 37 mostró sensibilidad al
suero, en la que la sensibilidad al suero es una reducción de la
actividad de transfección en presencia de suero con relación al
nivel de actividad observada en ausencia de suero. Además, el hecho
de que el complejo de ADN y la formulación nº 39 no mostró
actividad en presencia o ausencia o de suero demostró que la
presencia de un compuesto anfifílico catiónico es crítica para la
actividad de transfección. Particularmente interesantes son los
complejos de ADN y las formulaciones nº 35, nº 36 y nº 40 (que
corresponden en composición a las formulaciones nº 21, nº 34 y nº 28
respectivamente en la Tabla 3) que, de las formulaciones ensayadas,
exhibían la mayor mejora de actividad de transfección en presencia
de
suero.
Para determinar si la sensibilidad al suero
observada en las células BL6 en la Tabla 4 se observaba en otras
líneas celulares, se transfectaron células F_{0}, células CHO y
células 293 con 16 \mul de formulaciones seleccionadas (que
contiene cada una 12 \mug de DC-Chol/16 \mul)
de la Tabla 4 combinadas con 2 \mug de ADN de
pCMV-Luc o, con 16 \mul de liposomas de
DC-Chol/DOPE (1,2 \mug/\mul) combinadas con 2
\mug de ADN de pCMV-Luc en un medio que contiene
0 ó 20% de suero como en el Ejemplo 5. Los resultados de estos
experimentos se muestran en la Tabla 5. Los datos muestran que los
complejos de ADN y todas las formulaciones son activos para
transfectar células y son en general resistentes al suero.
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Cinco formulaciones diferentes (nos. 26, 27, 28,
29 y 34 de la Tabla 3) se ensayaron para ver la estabilidad de su
complejo con ADN. El complejo se preparó combinando 2 \mug de ADN
de pCMV-CAT y 16 \mul de la formulación de
emulsión o de micela indicada (en la que 16 \mul de cada
formulación contenían la misma cantidad de DC-Chol,
12 \mug) o combinando 1 \mug de ADN pCMV-CAT y
6 \mug de liposomas de DC-Chol/DOPE. Como se
puede ver en la Figura 3, las formulaciones nº 26, nº 28 y nº 29
formaron relativamente pequeños complejos con ADN; el diámetro medio
del complejo tal como se mide por dispersión de luz láser variaba
de 200 a 300 nm, y permanecía pequeño incluso después de 10 días a
4ºC. Las formulaciones nº 34 y nº 27, por otra parte, formaron
complejos más grandes con ADN con diámetros medios de 600 y 900 nm,
respectivamente. En contraste, los liposomas de
DC-Chol/DOPE habían formado mayores agregados
(1.800 nm en el día 1) que habían crecido incluso hasta unos más
grandes (>4.000 nm) en el día 3 y subsecuentemente precipitaron
en la disolución (no se muestran los datos). De este modo, todas
las nuevas formulaciones podrían formar complejos con ADN que
tuvieran mejor estabilidad física que la de los complejos formados
con los liposomas de DC-Chol/DOPE.
Se prepararon emulsiones que contienen diferentes
tensioactivos en 1 ml de PBS que contiene 0,25 mg de aceite, 0,25
mg de DOPE, 0,75 mg de DC-Chol y diferentes
cantidades de los tensioactivos indicados, en las que la cantidad
total de tensioactivo usado en cada formulación era aproximadamente
la misma por mol. A continuación se transfectaron células BL6 con 2
\mug de ADN de pCMV-Luc combinados con 16 \mul
de formulación (12 \mug de DC-Chol/16 \mul de
cada formulación) y se ensayaron para ver la actividad de la
luciferasa. Los resultados de este experimento se muestran en la
Tabla 6.
De los tensioactivos ensayados, los complejos
formados a partir de emulsiones que contienen Tween 20, Tween 40,
Tween 60, Brij 72, Brij 74, F68 o F127 demostraron actividad de
transfección que no era sensible a la presencia de 20% de suero y
los complejos formados a partir de formulaciones que contienen la
serie Tween de detergentes mostró el mayor incremento en actividad
de transfección en presencia de suero con relación a la observada
en ausencia de suero.
Se formó un complejo de ADN/emulsión concentrado
añadiendo 2 \mul de disolución que contiene 8 \mug de ADN
(pCMV-Luc) directamente a 72 \mul de emulsiones
que contienen 0,25 mg de Aceite/0,25 mg de DOPE/0,75 mg de
DC-Chol y cantidades variables de mg de Tween 80
por ml. Como en los ejemplos previos se formó complejo de
ADN/emulsión diluido combinando 2 \mug de ADN en 125 ml con 18
\mul de las mismas emulsiones usadas en el complejo concentrado
pero diluidas hasta 125 \mul. Los diámetros medios de los
complejos concentrados y diluidos se midieron 1 hora después de la
incubación a temperatura ambiente. Los resultados mostrados en la
Figura 4 demuestran que cantidades incrementadas de Tween 80
redujeron el tamaño de los complejos concentrados pero no tuvieron
efecto sobre el tamaño de los complejos diluidos.
Se prepararon emulsiones y complejos concentrados
y diluidos de ADN de pCMV-Luc/emulsión como en el
Ejemplo 9 y se midió la actividad de transfección de los complejos
en células BL6 en presencia o ausencia de 20% de suero. Los
resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 5A
(complejo concentrado) y 5B (complejo diluido). Aunque los
complejos diluidos parecen mostrar mejor actividad que los complejos
concentrados, la necesidad de mantener pequeño el volumen del
complejo administrado al animal puede favorecer el uso de complejos
más concentrados in vivo.
Se ensayaron las formulaciones nos. 21, 28, 31 y
34 (remitirse a la Tabla 3 para las composiciones) para ver la
actividad de transferencia génica en ratones. 200 \mul de cada
concentrado 4 veces de las formulaciones nº 21 (1100 \mug de
componentes lípidos totales), nº 28 (1000 \mug de componentes
lípidos totales), nº 34 (900 \mug de componentes lípidos
totales), y nº 31 (700 \mug de componentes lípidos totales) se
mezclaron con 6 \mul de NaCl 5 M hasta una concentración final de
NaCl 0,15 M y a continuación se combinaron con 4 \mug/\mul de
ADN de pCMV-CAT (100 \mug). Los complejos se
inyectaron a continuación i.v. vía la vena de la cola del ratón
(cada ratón pesaba aproximadamente 25 gramos) y se midió la
actividad de la CAT en los órganos principales dos días después de
la inyección. Los datos presentados en la Figura 6 claramente
demuestran que los complejos de ADN y las formulaciones nº 28
(emulsión), nº 31 (micela) o nº 34 (micela) podrían transfectar
varios órganos con relativamente alta actividad mientras que el
complejo de ADN y la formulación nº 21 (emulsión), por otra parte,
fue débil y comparable a la de los liposomas de
DC-Chol/DOPE. Además, la actividad del complejo de
ADN y la formulación nº 31 parece ser específica del pulmón, ya que
ningún otro órgano fue significativamente transfectado; el complejo
de ADN y la formulación nº 28 podría transfectar todos los órganos
bastante bien, solo con transfección débil del riñón, y el complejo
de ADN y la formulación nº 34 mostró una alta actividad en el
corazón con muy baja actividad en el riñón.
Claims (22)
1. Un complejo de ácido nucléico:emulsión que
comprende un ácido nucléico y una formulación de emulsión de aceite
en agua que comprende componentes lípidos y un vehículo acuoso, en
el que los componentes lípidos comprenden un componente aceitoso, un
componente anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no
iónico.
2. El complejo de la reivindicación 1, en el que
en la formulación, el componente aceitoso está presente en una
cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 80% en peso de los
componentes lípidos totales, el componente anfifílico catiónico está
presente en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 80% en
peso de los componentes lípidos totales y el componente
tensioactivo no iónico está presente en una cantidad de alrededor de
5 a alrededor de 50% en peso de los componentes lípidos
totales.
3. El complejo de la reivindicación 2, que
comprende adicionalmente un componente fosfolípido neutro presente
en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 25% en peso de los
componentes lípidos totales en la formulación.
4. El complejo de la reivindicación 1, en el que
los componentes lípidos comprenden adicionalmente un componente
fosfolípido neutro.
5. El complejo de la reivindicación 1, en el que
el componente anfifílico catiónico es un lípido seleccionado del
grupo que consiste en
1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano
(DOTAP); cloruro de
N-[1,-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA),
1,2-dioleoil-3-(4'-trimetilamonio)butanoil-sn-glicerol
(DOBT), (4'-trimetilamonio)butanoato de
colesterilo (ChOTB),
DL-1,2-dioleoil-3-dimetilaminopropil-B-hidroxietilamonio
(DORI),
DL-1,2-O-dioleoil-3-dimetilaminopropil-\beta-hidroxietilamonio
(DORIE), éster de colina y
1,2-dioleoil-3-succinil-sn-glicerol
(DOSC); éster hemisuccinato de colina y colesterilo (ChOSC);l
dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS) y
dipalmitoilfosfatidiletanolamidoespermina (DPPES), yoduro de
colesteril-3\beta-carbonil-amido-etilenotrimetilamonio,
yoduro de carboxilato de
1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesterilo,
colesteril-3\beta-carboxiamidoetilenamina,
yoduro de
colesteril-3\beta-oxisuccinamidoetilenotrimetilamonio,
yoduro de
1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesteril-3\beta-oxisuccinato,
yoduro de
2-[(2-trimetilamonio)-etilmetilamino]etil-colesteril-3\beta-oxisuccinato,
3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol
(DC-Chol), y
3\beta-[N-(polietilenimina)-carbamoil]colesterol.
6. El complejo de la reivindicación 1, en el que
la relación en peso de ácido nucléico a componentes lípidos totales
en la formulación es de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:50.
7. El complejo de las reivindicaciones 1 ó 5 para
facilitar el suministro del ácido nucléico a las células, en el que
el compuesto anfifílico catiónico es
3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol
(DC-Chol).
8. El complejo de la reivindicación 1, en el que
el componente aceitoso es un aceite natural.
9. El complejo de la reivindicación 8, en el que
el componente aceitoso es aceite de ricino.
10. El complejo de la reivindicación 1, en el que
el tensioactivo no iónico es un detergente sintético.
11. El complejo de la reivindicación 10, en el
que el detergente sintético se selecciona del grupo que consiste en
éster de ácido graso y sorbitán, éster de ácido graso y sorbitán
polioxietilenado, Pluronic F68, Pluronic F127,
Triton-X-100 y Triton
X-114.
12. El complejo de la reivindicación 11, en el
que el componente anfifílico catiónico es
3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol
(DC-Chol).
13. El complejo de la reivindicación 1, en el que
el tensioactivo no iónico se selecciona del grupo que consiste en
tensioactivos no iónicos derivados de fosfatidiletanolamina.
14. El complejo de la reivindicación 1, en el que
el ácido nucléico se selecciona del grupo que consiste en ADN y
ARN.
15. El complejo de la reivindicación 10, en el
que el detergente sintético se selecciona del grupo que consiste en
monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato
de sorbitán, monooleato de sorbitán, monolaurato de sorbitán
polioxietilenado, monopalmitato de sorbitán polioxietilenado,
monoestearato de sorbitán polioxietilenado, monooleato de sorbitán
polioxietilenado, poloxámero 188, poloxámero 407,
polioxietileno(10)-isooctilfenil-éter y
polioxietileno(8)-isooctilfenil-éter.
16. El complejo de la reivindicación 1, en el que
la formulación es apropiada para la transfección in
vitro.
17. Un método para suministrar un ácido nucléico
a células, que comprende exponer las células in vitro al
complejo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes
facilitando con ello el suministro del ácido nucléico a las
células.
\newpage
18. El método de la reivindicación 17, en el que
las células son células de mamífero expuestas al complejo en
presencia de suero in vitro.
19. El uso del complejo como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un
medicamento para su uso en el tratamiento de un estado de un ser
humano o animal, siendo dicho estado uno en el que el tratamiento
comprende el suministro de un ácido nucléico a células del ser
humano o animal.
20. Un método para producir un complejo de ácido
nucléico:emulsión que comprende un ácido nucléico combinado con una
formulación de emulsión de aceite en agua, que comprende:
(a) combinar un componente aceitoso, un
componente anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no
iónico;
(b) añadir un vehículo acuoso para producir dicha
formulación de emulsión de aceite en agua; y
(c) añadir ácido nucléico a dicha formulación de
emulsión de aceite en agua para producir dicho complejo de ácido
nucléico:emulsión.
21. El método de la reivindicación 20 que
comprende adicionalmente combinar los componentes de la etapa (a)
con un componente fosfolípido neutro.
22. El método de la reivindicación 21, en el que
los componentes de la etapa (a) se combinan en un disolvente
orgánico y el disolvente se retira para dejar una película de
lípido previamente a la etapa (b).
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US534180 | 1995-09-26 | ||
US08/534,180 US6120794A (en) | 1995-09-26 | 1995-09-26 | Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2208763T3 true ES2208763T3 (es) | 2004-06-16 |
Family
ID=24129008
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES96933899T Expired - Lifetime ES2208763T3 (es) | 1995-09-26 | 1996-09-26 | Formulaciones de emulsion para el suministro de acidos nucleicos a las celulas. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6120794A (es) |
EP (1) | EP0852490B1 (es) |
JP (1) | JPH11512712A (es) |
AT (1) | ATE256452T1 (es) |
CA (1) | CA2230940A1 (es) |
DE (1) | DE69631149T2 (es) |
DK (1) | DK0852490T3 (es) |
ES (1) | ES2208763T3 (es) |
PT (1) | PT852490E (es) |
WO (1) | WO1997011682A2 (es) |
Families Citing this family (70)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6509032B1 (en) * | 1991-08-28 | 2003-01-21 | Mcmaster University | Cationic amphiphiles |
US5855911A (en) * | 1995-08-29 | 1999-01-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides |
US6120794A (en) | 1995-09-26 | 2000-09-19 | University Of Pittsburgh | Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells |
US5789244A (en) | 1996-01-08 | 1998-08-04 | Canji, Inc. | Compositions and methods for the treatment of cancer using recombinant viral vector delivery systems |
US6392069B2 (en) | 1996-01-08 | 2002-05-21 | Canji, Inc. | Compositions for enhancing delivery of nucleic acids to cells |
US6258792B1 (en) | 1996-04-12 | 2001-07-10 | University Of Pittsburgh | Cationic cholesteryl derivatives containing cyclic polar groups |
ES2165050T3 (es) | 1996-04-12 | 2002-03-01 | Univ Pittsburgh | Nuevos derivados cationicos de colesterilo que contienen grupos polares ciclicos. |
US6610321B2 (en) | 1996-07-03 | 2003-08-26 | University Of Pittsburgh | Emulsion formulations for hydrophilic active agents |
US7309692B1 (en) * | 1996-07-08 | 2007-12-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1 |
WO1998006437A2 (en) | 1996-08-13 | 1998-02-19 | Chiron Corporation | Compositions and methods for polynucleotide delivery |
US6977244B2 (en) * | 1996-10-04 | 2005-12-20 | Board Of Regents, The University Of Texas Systems | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
US6458373B1 (en) | 1997-01-07 | 2002-10-01 | Sonus Pharmaceuticals, Inc. | Emulsion vehicle for poorly soluble drugs |
US6884430B1 (en) | 1997-02-10 | 2005-04-26 | Aventis Pharma S.A. | Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles |
FR2759298B1 (fr) * | 1997-02-10 | 1999-04-09 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Formulation de particules agent(s) de transfection cationique(s)/acides nucleiques stabilisees |
US6197332B1 (en) | 1997-08-13 | 2001-03-06 | Chiron Corporation | Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof |
US7285288B1 (en) | 1997-10-03 | 2007-10-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
US7704962B1 (en) | 1997-10-03 | 2010-04-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Small oligonucleotides with anti-tumor activity |
AU1198599A (en) * | 1997-10-24 | 1999-05-17 | Neorx Corporation | Delivery vehicles for bioactive agents and uses thereof |
GB9726073D0 (en) * | 1997-12-09 | 1998-02-04 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
US20010003580A1 (en) * | 1998-01-14 | 2001-06-14 | Poh K. Hui | Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend |
US7030155B2 (en) | 1998-06-05 | 2006-04-18 | Sonus Pharmaceuticals, Inc. | Emulsion vehicle for poorly soluble drugs |
US6770282B1 (en) * | 1998-10-23 | 2004-08-03 | Heska Corporation | Cationic lipid-mediated enhancement of nucleic acid immunization of cats |
CA2407074A1 (en) * | 2000-04-21 | 2001-11-01 | Jukka Hartikka | Compositions and methods for in vivo delivery of polynucleotide-based therapeutics |
AU7542301A (en) * | 2000-06-09 | 2001-12-17 | Teni Boulikas | Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes<sup>TM</sup>) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes |
FR2814958B1 (fr) * | 2000-10-06 | 2003-03-07 | Aventis Pasteur | Composition vaccinale |
US6676963B1 (en) * | 2000-10-27 | 2004-01-13 | Barnes-Jewish Hospital | Ligand-targeted emulsions carrying bioactive agents |
US20050227911A1 (en) * | 2001-09-28 | 2005-10-13 | Solubest Ltd. | Hydrophilic dispersions of nanoparticles of inclusion complexes of macromolecules |
US6878693B2 (en) * | 2001-09-28 | 2005-04-12 | Solubest Ltd. | Hydrophilic complexes of lipophilic materials and an apparatus and method for their production |
US20050233003A1 (en) * | 2001-09-28 | 2005-10-20 | Solubest Ltd. | Hydrophilic dispersions of nanoparticles of inclusion complexes of salicylic acid |
US7700851B2 (en) * | 2001-11-13 | 2010-04-20 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof |
WO2003061386A1 (en) * | 2002-01-03 | 2003-07-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Wt1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer |
ATE350638T1 (de) | 2002-01-17 | 2007-01-15 | York Refrigeration Aps | Getauchter verdampfer mit integriertem wärmeaustauscher |
JP2006500420A (ja) * | 2002-09-26 | 2006-01-05 | ファイザー・プロダクツ・インク | ブタ筋細胞によるdna取込みを増大させるための賦形剤の使用 |
US20040115226A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-06-17 | Wenji Li | Free-flowing solid formulations with improved bio-availability of poorly water soluble drugs and process for making the same |
US7772188B2 (en) | 2003-01-28 | 2010-08-10 | Ironwood Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders |
US8802116B2 (en) * | 2003-02-27 | 2014-08-12 | Novasel Australia Pty. Ltd. | Poloxamer emulsion preparations |
US20050095283A1 (en) * | 2003-09-16 | 2005-05-05 | Aphios Corporation | Compositions and methods for topically treating diseases |
GB0401513D0 (en) | 2004-01-23 | 2004-02-25 | Camurus Ab | Compositions |
US20050239747A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-10-27 | Pharmaceutical Industry Technology And Development Center | Compositions and methods of enhanced transdermal delivery of steroid compounds and preparation methods |
WO2005105040A2 (en) * | 2004-04-26 | 2005-11-10 | Micelle Products, Inc. | Water-soluble formulations of fat soluble vitamins and pharmaceutical agents and their applications |
US20060134221A1 (en) * | 2004-12-03 | 2006-06-22 | Vical Incorporated | Methods for producing block copolymer/amphiphilic particles |
US20120269886A1 (en) | 2004-12-22 | 2012-10-25 | Nitto Denko Corporation | Therapeutic agent for pulmonary fibrosis |
JP2009221164A (ja) | 2008-03-17 | 2009-10-01 | Nitto Denko Corp | 肺線維症処置剤 |
JP4121537B2 (ja) | 2004-12-22 | 2008-07-23 | 日東電工株式会社 | 線維化抑制のための薬物担体および薬物担体キット |
US9572886B2 (en) | 2005-12-22 | 2017-02-21 | Nitto Denko Corporation | Agent for treating myelofibrosis |
TWI407971B (zh) | 2007-03-30 | 2013-09-11 | Nitto Denko Corp | Cancer cells and tumor-related fibroblasts |
NZ582586A (en) | 2007-07-21 | 2011-12-22 | Albany Molecular Res Inc | 5-pyridinone substituted indazoles |
CN102026970B (zh) | 2007-11-21 | 2013-07-31 | 解码遗传Ehf公司 | 用于治疗肺部和心血管病症的联芳基pde4抑制剂 |
EP2240481A1 (en) | 2008-01-11 | 2010-10-20 | Albany Molecular Research, Inc. | (1-azinone) -substituted pyridoindoles as mch antagonists |
WO2009142893A2 (en) * | 2008-05-19 | 2009-11-26 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for the delivery of bioactive compounds |
US8900627B2 (en) * | 2008-06-06 | 2014-12-02 | Mirna Therapeutics, Inc. | Compositions for the in vivo delivery of RNAi agents |
KR20110051214A (ko) * | 2008-07-30 | 2011-05-17 | 닛토덴코 가부시키가이샤 | 약물 담체 |
US9445975B2 (en) | 2008-10-03 | 2016-09-20 | Access Business Group International, Llc | Composition and method for preparing stable unilamellar liposomal suspension |
WO2010059836A1 (en) | 2008-11-20 | 2010-05-27 | Decode Genetics Ehf | Substituted aza-bridged bicyclics for cardiovascular and cns disease |
EP2389383B1 (en) | 2009-01-26 | 2019-04-24 | Israel Institute For Biological Research | Bicyclic heterocyclic spiro compounds |
US8040068B2 (en) | 2009-02-05 | 2011-10-18 | Mks Instruments, Inc. | Radio frequency power control system |
WO2011008572A2 (en) | 2009-07-14 | 2011-01-20 | Albany Molecular Research, Inc. | 5-ht3 receptor modulators, methods of making, and use thereof |
RU2625546C2 (ru) | 2010-07-06 | 2017-07-14 | Новартис Аг | Катионные эмульсии "масло-в-воде" |
JP5950428B2 (ja) | 2010-08-05 | 2016-07-13 | 日東電工株式会社 | 線維化組織から正常組織を再生するための組成物 |
JP6120839B2 (ja) | 2011-07-06 | 2017-04-26 | ノバルティス アーゲー | カチオン性水中油型エマルジョン |
WO2013006834A1 (en) | 2011-07-06 | 2013-01-10 | Novartis Ag | Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids |
US20130243867A1 (en) * | 2012-02-23 | 2013-09-19 | University Of South Florida (A Florida Non-Profit Corporation) | Micelle compositions and methods for their use |
JP6340162B2 (ja) | 2012-12-20 | 2018-06-06 | 日東電工株式会社 | アポトーシス誘導剤 |
ES2821966T3 (es) | 2014-04-02 | 2021-04-28 | Nitto Denko Corp | Molécula de direccionamiento derivada de RBP y utilización de la misma |
KR102256453B1 (ko) | 2014-04-07 | 2021-05-25 | 닛토덴코 가부시키가이샤 | 소수성 약물 전달용 신규한 폴리머계 하이드로트로프 |
EA201791437A1 (ru) | 2014-12-31 | 2017-12-29 | Лантеус Медикал Имэджинг, Инк. | Композиции микросфер c инкапсулированным в липиде газом и соответствующие способы |
TWI740937B (zh) | 2016-05-04 | 2021-10-01 | 美商藍瑟斯醫學影像公司 | 用於製備超音波顯影劑之裝置及方法 |
US9789210B1 (en) | 2016-07-06 | 2017-10-17 | Lantheus Medical Imaging, Inc. | Methods for making ultrasound contrast agents |
CA3093340A1 (en) | 2018-03-20 | 2019-09-26 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Kinase inhibitor compounds and compositions and methods of use |
AU2019419414A1 (en) | 2018-12-31 | 2023-04-06 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Kinase inhibitor compounds and compositions and methods of use |
Family Cites Families (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE387647C (de) * | 1922-04-16 | 1924-01-08 | Fritsche & Thein | Einfuehrungslsolator |
US4358013A (en) * | 1980-07-28 | 1982-11-09 | Shebley David P | Meditation supporting device |
US4544545A (en) * | 1983-06-20 | 1985-10-01 | Trustees University Of Massachusetts | Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting |
US5545412A (en) * | 1985-01-07 | 1996-08-13 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-[1, (1-1)-dialkyloxy]-and N-[1, (1-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-n,n,n-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4897355A (en) * | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4610888A (en) | 1985-05-17 | 1986-09-09 | Anheuser-Busch Companies, Inc. | Beer foam enhancing process and apparatus |
US5374548A (en) * | 1986-05-02 | 1994-12-20 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor |
US5540933A (en) * | 1985-05-31 | 1996-07-30 | La Jolla Cancer Research Foundation | Isolation and use of fibronectin receptor |
US5043164A (en) * | 1989-01-17 | 1991-08-27 | The University Of Tennessee Research Corporation | Blood-stable, cholesterol-free liposomes |
DE3908047A1 (de) * | 1989-03-13 | 1990-09-20 | Desitin Arzneimittel Gmbh | Hochdisperse pharmazeutische zusammensetzung |
US4958013A (en) * | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
US5100662A (en) * | 1989-08-23 | 1992-03-31 | The Liposome Company, Inc. | Steroidal liposomes exhibiting enhanced stability |
US5286634A (en) * | 1989-09-28 | 1994-02-15 | Stadler Joan K | Synergistic method for host cell transformation |
US5676954A (en) | 1989-11-03 | 1997-10-14 | Vanderbilt University | Method of in vivo delivery of functioning foreign genes |
US5279833A (en) * | 1990-04-04 | 1994-01-18 | Yale University | Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells |
US5264618A (en) * | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
EP0599850B1 (en) | 1991-08-16 | 1996-01-10 | Vical, Inc. | Composition and method for treating cystic fibrosis |
US5283185A (en) * | 1991-08-28 | 1994-02-01 | University Of Tennessee Research Corporation | Method for delivering nucleic acids into cells |
US5756353A (en) | 1991-12-17 | 1998-05-26 | The Regents Of The University Of California | Expression of cloned genes in the lung by aerosol-and liposome-based delivery |
IL101241A (en) * | 1992-03-16 | 1997-11-20 | Yissum Res Dev Co | Pharmaceutical or cosmetic composition comprising stabilized oil-in-water type emulsion as carrier |
US6113946A (en) * | 1992-04-03 | 2000-09-05 | The Regents Of The University Of California | Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations |
JP3285355B2 (ja) | 1992-06-04 | 2002-05-27 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | invivo遺伝子治療のための方法及び組成物 |
US5334761A (en) * | 1992-08-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
JP2854203B2 (ja) * | 1992-09-03 | 1999-02-03 | 株式会社ディ・ディ・エス研究所 | リポソームの製造法 |
AU6254494A (en) * | 1993-02-16 | 1994-09-14 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Polyelectrolyte dna conjugation and genetic transformation of an animal |
WO1995002698A1 (en) * | 1993-07-12 | 1995-01-26 | Life Technologies, Inc. | Composition and methods for transfecting eukaryotic cells |
IL107471A (en) * | 1993-11-02 | 1997-09-30 | Yissum Res Dev Co | Pharmaceutical preparation comprising a self- emulsifying formulation and process for its production |
US6077835A (en) | 1994-03-23 | 2000-06-20 | Case Western Reserve University | Delivery of compacted nucleic acid to cells |
US5844107A (en) * | 1994-03-23 | 1998-12-01 | Case Western Reserve University | Compacted nucleic acids and their delivery to cells |
AU696455C (en) | 1994-03-23 | 2006-03-02 | Case Western Reserve University | Compacted nucleic acids and their delivery to cells |
US5972901A (en) * | 1994-03-23 | 1999-10-26 | Case Western Reserve University | Serpin enzyme complex receptor--mediated gene transfer |
US5885613A (en) * | 1994-09-30 | 1999-03-23 | The University Of British Columbia | Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes |
US5635487A (en) * | 1994-12-29 | 1997-06-03 | Wolff; Jon A. | Amphipathic, micellar delivery systems for biologically active polyions |
US6008202A (en) * | 1995-01-23 | 1999-12-28 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
US5795587A (en) * | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
US5705385A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US6120794A (en) | 1995-09-26 | 2000-09-19 | University Of Pittsburgh | Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells |
US6270795B1 (en) | 1995-11-09 | 2001-08-07 | Microbiological Research Authority | Method of making microencapsulated DNA for vaccination and gene therapy |
ES2165050T3 (es) | 1996-04-12 | 2002-03-01 | Univ Pittsburgh | Nuevos derivados cationicos de colesterilo que contienen grupos polares ciclicos. |
US6610321B2 (en) | 1996-07-03 | 2003-08-26 | University Of Pittsburgh | Emulsion formulations for hydrophilic active agents |
WO1998008489A1 (en) | 1996-08-26 | 1998-03-05 | Transgene S.A. | Cationic lipid-nucleic acid complexes |
US6271209B1 (en) | 1998-04-03 | 2001-08-07 | Valentis, Inc. | Cationic lipid formulation delivering nucleic acid to peritoneal tumors |
-
1995
- 1995-09-26 US US08/534,180 patent/US6120794A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-09-26 DE DE69631149T patent/DE69631149T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-26 CA CA002230940A patent/CA2230940A1/en not_active Abandoned
- 1996-09-26 EP EP96933899A patent/EP0852490B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-26 AT AT96933899T patent/ATE256452T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-09-26 WO PCT/US1996/015388 patent/WO1997011682A2/en active IP Right Grant
- 1996-09-26 ES ES96933899T patent/ES2208763T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-26 PT PT96933899T patent/PT852490E/pt unknown
- 1996-09-26 JP JP9513608A patent/JPH11512712A/ja not_active Ceased
- 1996-09-26 DK DK96933899T patent/DK0852490T3/da active
-
2002
- 2002-01-02 US US10/038,417 patent/US6586003B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-05-12 US US10/436,950 patent/US20030211143A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69631149T2 (de) | 2004-09-02 |
EP0852490A2 (en) | 1998-07-15 |
ATE256452T1 (de) | 2004-01-15 |
DE69631149D1 (de) | 2004-01-29 |
JPH11512712A (ja) | 1999-11-02 |
US20030211143A1 (en) | 2003-11-13 |
US20020090377A1 (en) | 2002-07-11 |
US6586003B2 (en) | 2003-07-01 |
EP0852490B1 (en) | 2003-12-17 |
PT852490E (pt) | 2004-04-30 |
CA2230940A1 (en) | 1997-04-03 |
US6120794A (en) | 2000-09-19 |
DK0852490T3 (da) | 2004-04-19 |
WO1997011682A2 (en) | 1997-04-03 |
WO1997011682A3 (en) | 1997-07-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2208763T3 (es) | Formulaciones de emulsion para el suministro de acidos nucleicos a las celulas. | |
Albertsen et al. | The role of lipid components in lipid nanoparticles for vaccines and gene therapy | |
Kabanov et al. | Pluronic block copolymers for gene delivery | |
Niculescu-Duvaz et al. | Structure-activity relationship in cationic lipid mediated gene transfection | |
Li et al. | Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery | |
US5965542A (en) | Use of temperature to control the size of cationic liposome/plasmid DNA complexes | |
KR100374482B1 (ko) | 유전자 또는 약물을 효과적으로 전달하는 지질미립구,제형 및 이들의 제조방법 | |
ES2295018T3 (es) | Encapsulacion de complejos bioactivos en liposomas. | |
JP4335310B2 (ja) | 疎水性脂質−核酸複合中間体を通して調製される脂質−核酸粒子、及び遺伝子移送のための使用 | |
Davis et al. | Vectors for airway gene delivery | |
US20130281382A1 (en) | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production | |
US20030203871A1 (en) | Novel cationic cholesteryl derivatives containing cyclic polar groups | |
ES2369869T3 (es) | Complejo de ácido nucleico y composición de suministro de ácido nucleico. | |
US6583131B2 (en) | Cationic cholesteryl derivatives containing cyclic polar groups | |
ES2698565B2 (es) | Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana | |
AU758303B2 (en) | Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells | |
Martin et al. | Advances in cationic lipid-mediated gene delivery | |
AU721245B2 (en) | Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells | |
Lasic et al. | Handbook of Nonmedical Applications of Liposomes, Vol IV From Gene Delivery and Diagnosis to Ecology | |
KR100342835B1 (ko) | 유전자 또는 약물을 효과적으로 전달하는 지방유제, 제형 및 이들의 제조방법 | |
Liu | Development of efficient gene delivery in vitro and in vivo | |
Tsai | Characterisation of non-viral DNA complexes for gene therapy | |
Asokan | Acid-sensitive detergents for macromolecular drug delivery | |
MXPA01008804A (es) | Encapsulacion de complejos bioactivos en liposomas |