ES2208763T3 - Formulaciones de emulsion para el suministro de acidos nucleicos a las celulas. - Google Patents

Formulaciones de emulsion para el suministro de acidos nucleicos a las celulas.

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ES2208763T3
ES2208763T3 ES96933899T ES96933899T ES2208763T3 ES 2208763 T3 ES2208763 T3 ES 2208763T3 ES 96933899 T ES96933899 T ES 96933899T ES 96933899 T ES96933899 T ES 96933899T ES 2208763 T3 ES2208763 T3 ES 2208763T3
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Dexi Liu
Feng Liu
Jing-Ping Yang
Leaf Huang
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Abstract

SE DESCRIBEN NUEVOS FORMULADOS EN EMULSION Y MICELARES, ASI COMO COMPLEJOS DE ESTOS FORMULADOS CON SUSTANCIAS BIOLOGICAMENTE ACTIVAS. LOS NUEVOS FORMULADOS DIFIEREN DE LOS VECTORES LIPIDICOS CATIONICOS, TALES COMO LIPOSOMAS CATIONICOS, EN QUE LOS COMPLEJOS FORMADOS ENTRE LAS SUSTANCIAS BIOLOGICAMENTE ACTIVAS Y LOS FORMULADOS EN EMULSION Y MICELARES DE ESTA INVENCION SON FISICAMENTE ESTABLES Y SU ACTIVIDAD DE TRANSFECCION RESULTA RESISTENTE A LA PRESENCIA DE SUERO. ESTOS NUEVOS FORMULADOS SE DESCRIBEN COMO UTILES EN AREAS TALES COMO LA TERAPIA GENICA O LA ADMINISTRACION DE VACUNAS.

Description

Formulaciones de emulsión para el suministro de ácidos nucléicos a las células.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al uso de dispersiones de lípidos para suministrar substancias biológicamente activas a las células. En particular la presente invención se refiere a formulaciones de emulsión y a la capacidad de estas formulaciones para formar complejos estables con substancias biológicamente activas y facilitar con ello el suministro de estas substancias a las células.
Antecedentes de la invención
Los liposomas catiónicos son de interés como vehículo no viral para el suministro de substancias biológicamente activas tales como fármacos, hormonas, enzimas, ácidos nucléicos y antígenos, incluyendo virus, a células tanto in vitro como in vivo. Ciertamente, se ha demostrado que los liposomas catiónicos suministran genes in vivo (Nabel, E.G. et al. (1990) Science, 249: 1285-1288), (Brigham, K.L., et al. (1989) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 195-200, Stribling, R., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 89: 11277-11281), (Plautz, G.E., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 90: 4645-4649, Stewart, M.J., et al. (1992) Hum. Gene Ther., 3: 267-275). Sin embargo, la inhibición por componentes del suero de la transferencia de ácidos nucléicos por liposomas catiónicos limita la aplicación de los liposomas como vector para los ácidos nucleicos in vivo para administraciones regionales que evitan la exposición al suero.
Además, la estabilidad es el principal problema que limita el uso de liposomas tanto con respecto a la vida de almacenamiento como después de la administración in vivo. De este modo, es deseable explorar el uso de otros tipos de dispersiones de lípidos como utilidad de sistemas de suministro para substancias biológicamente activas.
La patente de EE.UU. 4.610.888 se refiere al uso como sistema de suministro de fármaco de emulsiones de agua en aceite en las que el volumen de la fase acuosa varía de alrededor de 0,7% a alrededor de 10,25% del volumen de los componentes lípidos usados. Sin embargo, tales emulsiones de agua en aceite son inapropiadas para suministrar substancias en sangre o en otros tejidos corporales acuosos.
El documento WO 95/12384 describe una formulación de aceite autoemulsionable (SEOF) que contiene un componente aceitoso y un tensioactivo. La SEOF se caracteriza porque el componente aceitoso contiene un vector aceitoso y un lípido catiónico y, opcionalmente, un alcohol graso aceitoso lipófilo. La emulsión de aceite en agua que se forma por la mezcla de la SEOF tiene gotas aceitosas que están positivamente cargadas.
El documento WO 93/18852 describe una emulsión de aceite en agua útil como vehículo de suministro de ingredientes hidrófobos tales como fármacos farmacéuticos y agentes activos cosméticos en la que las partículas de la emulsión tienen una carga positiva neta.
El documento EP-A-387647 describe una composición farmacéutica muy dispersa en forma de una microemulsión que comprende una substancia ácida o básica o su sal; un material catiónico o iónico; un componente graso, que es miristato de isopropilo, 2-octildodecanol, aceite de parafina, nicotinato de tocoferol y/o triacetina; un tensioactivo que es un éster de ácido graso polioxietilenado y/o un éter de alcohol graso y polioxietileno y un co-tensioactivo que es un éster de ácido graso y glicerina polioxietilenado, y agua.
El documento WO 93/05162 describe un método para facilitar la transferencia de ácidos nucléicos a células, que comprende preparar una dispersión mixta de lípidos de un lípido catiónico con un co-lípido en un vehículo disolvente apropiado.
Treiner et al., J. Coloid Interface Sci 125 No. 1 (1988), 261-270 describe la solubilización micelar en sistemas de tensioactivo binario acuoso, específicamente ácidos barbitúricos en mezclas de aniónico más no iónico o catiónico más no iónico.
Farhood et al., Biochim. Biophys. Acta 1111 No. 2 (1992), 239-246 describen el efecto de derivados de colesterol catiónicos sobre la transferencia de genes y la actividad de la proteína quinasa C.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a nuevas formulaciones de emulsión útiles para suministrar substancias biológicamente activas a las células. Las formulaciones de emulsión de esta invención son compatibles con la sangre, retienen la actividad en presencia de suero y son estables en el almacenamiento. Las emulsiones de esta invención comprenden componentes lípidos, un ácido nucleico y un vehículo acuoso, en las que los componentes lípidos comprenden un componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico, preferentemente un lípido catiónico y un componente tensioactivo no iónico. Las formulaciones micelares (no reivindicadas aquí) comprenden componentes lípidos, un ácido nucléico y un vehículo acuoso, en las que los componentes lípidos comprenden un componente anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no iónico. Los componentes lípidos de la formulación de emulsión de la presente invención pueden comprender adicionalmente un componente fosfolípido neutro.
El "componente" tal como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se define como: que comprende por lo menos un compuesto anfifílico catiónico o una mezcla de compuestos anfifílicos cuando se usa en la frase "componente anfifílico"; que comprende por lo menos un aceite o una mezcla de aceites cuando se usa en la frase "componente aceitoso"; que comprende por lo menos un tensioactivo no iónico o una mezcla de tensioactivos no iónicos cuando se usa en la frase "componente tensioactivo no iónico"; que comprende por lo menos un fosfolípido neutro o una mezcla de fosfolípidos neutros cuando se usa en la frase "componente fosfolípido neutro".
La invención se refiere a complejos formados combinando un ácido nucléico y opcionalmente otras substancias biológicamente activas y las formulaciones de emulsión anteriormente identificadas. Los complejos de ácido nucléico:emulsión son estables en el tiempo y pueden tener utilidad terapéutica y/o profiláctica in vivo dependiendo de la actividad del ácido nucléico contenido en el complejo.
Esta invención también proporciona un método in vitro para suministrar un ácido nucléico a las células exponiendo las células a los complejos de esta invención. En una realización, se proporciona un método de exponer células a un ácido nucléico, comprendiendo dicho método cultivar dichas células en presencia de un complejo de ácido nucléico:emulsión facilitando con ello el suministro del ácido nucléico a las células.
La invención proporciona adicionalmente el uso de una formulación de emulsión para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un estado en un animal o ser humano, siendo dicho estado uno en el que el tratamiento comprende el suministro de un ácido nucléico a las células del ser humano o animal. Se debe entender que los complejos usados para el suministro de un ácido nucléico a células in vitro o in vivo pueden ser recientemente preparados por mezcla, o se pueden preparar antes y almacenar previamente a su uso.
La invención proporciona también un kit que contiene un complejo formado entre un ácido nucléico y una formulación de emulsión.
También se proporcionan aquí métodos para producir formulaciones de emulsión según la invención.
En una realización, un método para producir una formulación de emulsión de esta invención comprende
a) combinar un disolvente orgánico con un componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no iónico;
b) retirar el disolvente orgánico para dejar una película de lípido; y
c) suspender la película de lípido en un vehículo acuoso para producir dicha formulación de emulsión miscible en disolución acuosa.
En una realización alternativa, el aceite puede servir como disolvente orgánico en la etapa (a) de tal modo que el método para producir una formulación de emulsión de esta invención comprende
a) combinar un componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no iónico; y
b) añadir un vehículo acuoso a la combinación de la etapa (a).
Cuando se va a incluir un componente fosfolípido neutro en la emulsión, el componente fosfolípido neutro se combina con los componentes anteriores en la etapa (a).
El método para producir una formulación micelar miscible en disolución acuosa comprende:
a) combinar un disolvente orgánico con un componente anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no iónico;
b) retirar el disolvente orgánico para dejar una película de lípido; y
c) suspender la película de lípido en un vehículo acuoso para producir dicha formulación micelar miscible en disolución acuosa.
Cuando se va a incluir un componente fosfolípido neutro en la formulación micelar, el componente fosfolípido neutro se combina con los componentes anteriores en la etapa (a).
Descripción de las figuras
La figura 1 muestra la optimización de la transfección de células BL6 con complejos formados entre ADN de pCMV-Luc y las formulaciones nº 21 (\bullet-\bullet), nº 27 (\blacksquare-\blacksquare), nº 28 (\blacktriangle-\blacktriangle) o nº 30 (\medcirc-\medcirc) (véase la Tabla 3 para las composiciones de las formulaciones) mezclando 6 \mul de cada formulación (6 \mul de cada formulación contenían en 4,5 \mug de DC-Chol) con cantidades variables de ADN de pCMV-Luc como se indica en el eje horizontal.
La figura 2 muestra la optimización de la transfección de células BL6 con complejos formados entre ADN de pCMV-Luc y cantidades variables de las formulaciones nº 21 (\bullet-\bullet), nº 27 (\blacksquare-\blacksquare), nº 28 (\blacktriangle-\blacktriangle) o nº 30 (\medcirc-\medcirc) tal como se indica en el eje horizontal (véase la Tabla 3 para las composiciones de las formulaciones) La cantidad de ADN de pCMV-Luc se fijó en 2\mug para las formulaciones nº 27 y nº 30 y en 1,5 \mug de ADN de pCMV-Luc para las formulaciones nº 21 y nº 28 y "\mug de formulación" en el eje horizontal se refiere a \mug de componentes lípidos totales presentes en la cantidad de formulación combinada con ADN de pCMV-Luc para formar el complejo.
La figura 3 muestra la estabilidad de los complejos formados entre ADN y las formulaciones micelar o de emulsión indicadas (véase la Tabla 3 para la composición de las formulaciones). El complejo se preparó con 2 \mug de pCMVCAT y 16 \mul de las formulaciones indicadas que contienen la misma cantidad de DC-Chol (12 \mug) en un volumen final de 250 \mul, excepto para los complejos de DC-Chol/liposoma DOPE:ADN que se prepararon con 1 \mug de pCMVCAT y 6 \mug de liposoma en un volumen final de 250 \mul.
La figura 4 muestra el efecto de variar la concentración de Tween 80 en emulsiones que contienen 0,25 mg de aceite, 0,25 mg de DOPE, 0,75 mg de DC-Chol y x mg de Tween 80 por ml en el diámetro medio de complejos de ADN de pCMV-Luc/emulsión concentrados (\bullet-\bullet), y diluidos (\medcirc-\medcirc).
Las figuras 5A y 5B muestran el efecto del Tween 80 en la actividad de transfección de complejos de ADN de pCMV-Luc/emulsión concentrados (Figura 5A) y diluidos (Figura 5B) en células BL6 en un medio que contiene 0 ó 20% de suero. Las formulaciones de emulsión usadas para producir los complejos de ADN/emulsión diluidos y concentrados contenían 0,25 mg de aceite, 0,25 mg de DOPE, 0,75 mg de DC-Chol y cantidades variables de Tween 80 por ml. El complejo de ADN/emulsión concentrado se formó añadiendo 2 \mul de disolución que contiene 8 \mug de ADN de pCMV-Luc a 72 \mul de emulsión y el complejo de ADN/emulsión diluido se formó combinando 2 \mug de ADN de pCMV-Luc en 125 \mul con 18 \mul de emulsión diluida hasta 125 \mul.
La figura 6 muestra la expresión del gen indicador de la CAT en ratones inyectada vía la vena de la cola con complejos de ADN:emulsión o ADN:micela. Los complejos se formaron como sigue: 200 \mul de cada uno de los concentrados 4 veces de formulaciones nº 21 (1100 \mug de componentes lípidos totales), nº 28 (1000 \mug de componentes lípidos totales), nº 34 (900 \mug de componentes lípidos totales) y nº 31 (700 \mug de componentes lípidos totales) se mezclaron con 6 \mul de NaCl 5 M hasta una concentración final de NaCl de 0,15 M y a continuación se combinaron con 25 \mul de ADN de pCMV-CAT 4 \mug/\mul (100 \mug). La cantidad de DC-Chol contenida en cada complejo de ADN:emulsión y ADN:micela era 600 \mug. Después de dos días, se escindieron los órganos y se extrajo la proteína. La actividad de la CAT se midió usando [^{14}C]cloranfenicol de 0,1 \muCi como substrato. Cada barra representa la media de dos ratones.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a formulaciones de emulsión que forman complejos estables con un ácido nucléico y facilitan con ello el suministro del ácido nucléico a las células.
Las formulaciones de emulsión de esta invención son emulsiones de aceite en agua que comprenden un vehículo acuoso y los siguientes componentes lípidos, un componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico, un componente tensioactivo no iónico y opcionalmente, un componente fosfolípido neutro.
Preferentemente, los componentes lípidos totales están presentes en la formulación de emulsión en una cantidad de alrededor de 0,001 a alrededor de 20% en peso, más preferentemente de alrededor de 0,01 a alrededor de 10% en peso y lo más preferentemente de alrededor de 0,05 a alrededor de 2% en peso, siendo el resto de la emulsión en peso vehículo acuoso. De este modo, por ejemplo, para la formulación nº 1 en la Tabla 1 en la que están presentes 0,625 mg de los componentes lípidos totales en 0,5 ml de PBS, el % en peso de los componentes lípidos totales en la formulación nº 1 se puede calcular como sigue: Suponiendo que 1 ml de PBS, como 1 ml de agua, pesa aproximadamente 1000 mg, entonces 0,5 ml de PBS pesan 500 mg y el % en peso de los componentes lípidos totales contenidos en la formulación nº 1 es
\frac{0,625 \ mg}{0,625 \ mg + 500 \ mg} \ x \ 100 = 0,125%
De los componentes lípidos totales presentes en las formulaciones de emulsión de esta invención, preferentemente, el componente anfifílico está presente en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 80% en peso de los componentes lípidos totales en la formulación de emulsión; el componente aceitoso está presente en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 80% en peso de los componentes lípidos totales; el componente tensioactivo no iónico está presente en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 50% en peso de los componentes lípidos totales, y opcionalmente, el componente fosfolípido neutro está presente en la formulación en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 25% en peso del componente lípido total.
Más preferentemente, el componente aceitoso está presente en una cantidad de alrededor de 10-60% en peso de los componentes lípidos totales en la formulación de emulsión; el componente anfifílico está presente en una cantidad de alrededor de 20-60% en peso de los componentes lípidos totales; el componente tensioactivo no iónico está presente en una cantidad de alrededor de 10-50% en peso de los componentes lípidos totales y opcionalmente, un componente fosfolípido neutro está presente en una cantidad de alrededor de 10-40% en peso de los componentes lípidos totales.
Lo más preferentemente, la formulación de emulsión comprende el componente aceitoso en una cantidad de alrededor de 10-20% en peso de los componentes lípidos totales; el componente anfifílico en una cantidad de alrededor de 40-60% en peso de los componentes lípidos totales, el componente tensioactivo no iónico en una cantidad de alrededor de 20-50% en peso de los componentes lípidos totales y opcionalmente el componente fosfolípido neutro en una cantidad de alrededor de 10-20% en peso de los componentes lípidos totales. Una formulación de emulsión particularmente preferida contiene un aceite, un compuesto anfifílico catiónico, un tensioactivo no iónico y un fosfolípido neutro con una relación en peso de alrededor de 2:6:1:2.
Las formulaciones micelares son compatibles con la sangre. Las formulaciones micelares comprenden un vehículo acuoso y los siguientes componentes lípidos: un componente anfifílico catiónico, un componente tensioactivo no iónico y opcionalmente, un componente fosfolípido neutro.
Preferentemente, los componentes lípidos totales están presentes en la formulación micelar en una cantidad que varía de alrededor de 0,0001 a alrededor de 70% en peso, más preferentemente de alrededor de 0,001 a alrededor de 60% en peso y lo más preferentemente de alrededor de 0,001 a alrededor de 50% en peso, siendo en resto en peso de la formulación micelar un vehículo acuoso. De este modo por ejemplo, para la formulación nº 15 en la Tabla 2 en la que 1,25 mg de los componentes lípidos totales están presentes en 1 ml de PBS, el % en peso de los componentes lípidos totales en la formulación nº 15 se puede calcular como sigue: Suponiendo que 1 ml de PBS, como 1 ml de agua, pesa aproximadamente 1000 mg, entonces el % en peso de los componentes lípidos totales en la formulación nº 15 es
\frac{1,25 \ mg}{1,25 \ mg + 1000 \ mg} \ x \ 100 = 0,125%
De los componentes lípidos totales contenidos en las formulaciones micelares preferentemente, el componente anfifílico está presente en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 90% en peso de los componentes lípidos totales en la formulación micelar, el componente tensioactivo no iónico está presente en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 90% en peso de los componentes lípidos totales; y opcionalmente, el componente fosfolípido neutro está presente en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 40% en peso de los componentes lípidos totales.
Más preferentemente, el componente anfifílico está presente en una cantidad de alrededor de 30 a alrededor de 90% en peso de los componentes lípidos totales en la formulación micelar, el componente tensioactivo no iónico está presente en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 70% en peso de los componentes lípidos totales y opcionalmente, el componente fosfolípido neutro está presente en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 30% en peso de los componentes lípidos totales.
Lo más preferentemente, el componente anfifílico está presente en una cantidad de alrededor de 50 a alrededor de 90% en peso de los componentes lípidos totales en la formulación micelar, el componente tensioactivo no iónico está presente en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 50% en peso de los componentes lípidos totales y opcionalmente, el componente fosfolípido neutro está presente en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 20% en peso de los componentes lípidos totales. Una formulación micelar particularmente preferida contiene un compuesto anfifílico catiónico, un tensioactivo no iónico y un fosfolípido neutro con una relación en peso de alrededor de 6:1:2.
Por componente aceitoso tal como se usa aquí se entiende cualquier componente inmiscible en agua que se denomina convencionalmente un aceite. Se debe entender que el componente aceitoso puede incluir mezclas de dos o más aceites. Los ejemplos de aceites que se pueden usar para producir las formulaciones de emulsión de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, aceites naturales tales como aceite de almendra, aceite de coco, aceite de hígado de bacalao, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de ricino, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite de menta piperita, aceite de Rose, aceite de azafrán, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de girasol y aceite vegetal y aceites sintéticos tales como trietilglicerol y dietilglicerol. Un aceite preferido es aceite de ricino.
El componente anfifílico catiónico de las formulaciones de esta invención puede ser cualquier compuesto anfifílico catiónico o mezcla de compuestos anfifílicos que es efectiva para su uso en liposomas o para producir complejos de lípido capaces de suministrar una substancia biológicamente activa a las células. Por ejemplo, los compuestos anfifílicos descritos en Bolcsak et al., patente de EE.UU. 5.100.662. serían apropiados para su uso en esta invención. Los ejemplos adicionales de compuestos anfifílicos catiónicos apropiados para formular las formulaciones de emulsión de esta invención incluyen lípidos catiónicos tales como 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP); cloruro de N-[1,-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) u otros tensioactivos de N-(N,N-1-dialcoxi)-alquil-N,N,N-amonio trisubstituido; 1,2-dioleoil-3-(4'-trimetilamonio)butanoil-sn-glicerol (DOBT) o (4'-trimetilamonio)butanoato de colesterilo (ChOTB) en el que el grupo trimetilamonio está conectado vía un brazo espaciador de butanoilo a la doble cadena (para DOTB) o al grupo colesterilo (para ChOTB); DORI (DL-1,2-dioleoil-3-dimetilaminopropil-B-hidroxietilamonio) o DORIE (DL-1,2-O-dioleoil-3-dimetilaminopropil-\beta-hidroxietilamonio) (DORIE) o sus análogos como se describe en el documento WO 93/03709; éster de colina y 1,2-dioleoil-3-succinil-sn-glicerol (DOSC); éster hemisuccinato de colesterilo (ChOSC); lipopoliaminas tales como dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS) y fosfatidiletanolamidoespermina dipalmitoilo (DPPES) o los lípidos catiónicos descritos en la patente de EE.UU. número 5.283.185, yoduro de colesteril-3\beta-carbonil-amido-etilenotrimetilamonio, yoduro de carboxilato de 1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesterilo, colesteril-3\beta-carboxiamidoetilenoamina, yoduro de colesteril-3\beta-oxisuccinamidoetilenotrimetilamonio, yoduro de 1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesteril-3\beta-oxisuccinato, yoduro de 2-[(2-trimetilamonio)-etilmetilamino]etil-colesteril-3\beta-oxisuccinato, 3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol), y 3\beta-[N-(polietilenimina)-carbamoil]colesterol.
Los ejemplos de compuestos anfifílicos preferidos incluyen yoduro de colesteril-3\beta-carboxiamidoetilenotri-metilamonio, yoduro de carboxilato de 1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesterilo, colesteril-3\beta-carboxiamidoetilenamina, yoduro de colesteril-3\beta-oxisuccinamidoetilenotrimetilamonio, yoduro de 1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesteril-3\beta-oxisuccinato, yoduro de 2-[(2-trimetilamonio)etilmetilamino]etil-colesteril-3\beta-oxisuccinato, 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]-colesterol (DC-Chol), y 3\beta[N-(polietilenimina)-carbamoil]colesterol.
Dado que un atributo de las formulaciones micelar y de emulsión de la presente invención es su estabilidad cuando se almacena sola o como complejos con substancias biológicamente activas, se entenderá por aquellos de experiencia media en la técnica que los compuestos anfifílicos catiónicos son los lípidos catiónicos en los que los enlaces entre el grupo lipófilo y el grupo amino son estables en disolución acuosa. Tales enlaces incluyen enlaces amida, enlaces éster, enlaces éter y enlaces carbamoilo. Un lípido catiónico más preferido es DC-Chol.
El componente tensioactivo no iónico de las formulaciones de esta invención incluye por lo menos un tensioactivo no iónico de un peso molecular entre 200 y 20.000. En una realización, estos tensioactivos se pueden formar haciendo reaccionar un compuesto hidrófobo que contiene hidroxilo (por ejemplo, un alcohol o fenol) con óxido de etileno en el que se pueden aumentar el número de grupos óxido de etileno hasta cualquier límite deseado. Sin embargo, los de experiencia media en la técnica entenderían que la capacidad para estabilizar las emulsiones o micelas de esta invención puede depender de la cantidad relativa de óxido de etileno añadido a un grupo hidrófobo dado. Se entiende adicionalmente que los tensioactivos que tienen restos de óxido de etileno de cadena ramificada cubren más área de la superficie que los tensioactivos que tienen restos de óxido de etileno de cadena lineal y que por lo tanto, los tensioactivos de cadena lineal se tienen que usar en cantidades más grandes que los tensioactivos de cadena ramificada para producir la formulación micelar y de emulsión de esta invención.
Los ejemplos de tensioactivos no iónicos de esta invención incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol, derivados de fosfatidiletanolamina y detergentes sintéticos comercialmente disponibles con los nombres comerciales Span,
1
Brij,
CH_{3}(CH_{2})_{y}-(OCH_{2}CH_{2}O)_{x}-OH
Brij 72 y = 17 x = 2
Brij 76 y = 17 x = 10
Brij 78 y = 17 x = 20
Brij 100 y = 17 x = 100
Tween,
2
F68 y F127,
HO(CH_{2}CH_{2}O)_{X}-(
\uelm{C}{\uelm{\para}{CH _{3} }}
HCH_{2}O)_{Y}-(CH_{2}CH_{2}O)_{Z}-H
Pluronic F68 x = 75 y = 30 z = 75
Pluronic F127 x = 98 y = 67 z = 98
Triton X-100 y Triton X-114
5
Los tensioactivos preferidos son tensioactivos de cadena ramificada tales como Tween 20, Tween 40, Tween 60 y Tween 80.
Cuando se añaden opcionalmente a las formulaciones micelar y de emulsión, el componente fosfolípido neutro puede ser un fosfolípido neutro único o una mezcla de fosfolípidos neutros. Los ejemplos de fosfolípidos neutros que se pueden añadir opcionalmente a las formulaciones de esta invención incluyen, pero no están limitados a, fosfatidilcolina (PC) o fosfatidiletanolamina (PE) o fosfatidilcolinas (PC) totalmente saturadas o parcialmente hidrogenadas o fosfatidiletanolaminas (PE) que tienen cadenas alifáticas entre 6 y 24 átomos de longitud tales como dioleil-PC (DOPC) y dioleil-PE (DOPE). Un fosfolípido neutro preferido es DOPE.
También se proporcionan métodos para producir las formulaciones de emulsión de la presente invención.
Un método para producir formulaciones de emulsión de esta invención comprende:
(a) combinar un disolvente orgánico con un componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico, un componente tensioactivo no iónico y opcionalmente un componente fosfolípido neutro;
(b) retirar el disolvente orgánico para dejar una película de lípido; y
(c) suspender la película de lípido en un vehículo acuoso para producir dicha formulación de emulsión.
Un método alternativo para producir las formulaciones de emulsión de esta invención comprende:
(a) combinar un componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico, un componente tensioactivo no iónico y opcionalmente un componente fosfolípido neutro;
(b) añadir un vehículo acuoso a la combinación de componentes en la etapa (a) para producir dicha emulsión.
Preferentemente, los diámetros medios de las formulaciones de emulsión son menores de alrededor de 1000 nm, más preferentemente menores de 800 nm, y lo más preferentemente menores de 500 nm.
Los componentes preferidos de las emulsiones de la presente invención incluyen disolución salina tamponada con fosfato (PBS) como vehículo acuoso, aceite de ricino como componente aceitoso, DC-Chol como componente anfifílico, Tween 80 como componente tensioactivo no iónico y opcionalmente fosfatidilcolina o DOPE como componente fosfolípido neutro.
Un método para producir las formulaciones micelares comprende:
(a) combinar un disolvente orgánico con un componente anfifílico catiónico, un componente tensioactivo no iónico y opcionalmente un componente fosfolípido neutro;
(b) retirar el disolvente orgánico para dejar una película de lípido; y
(c) suspender la película de lípido en un vehículo acuoso para formar dicha formulación micelar.
Preferentemente, los diámetros medios de las formulaciones micelares son menores de alrededor de 1000 nm, más preferentemente menores de alrededor de 800 nm; y lo más preferentemente menores de alrededor de 500 nm.
Los componentes preferidos de las formulaciones micelares incluyen disolución salina tamponada con fosfato como vehículo acuoso, DC-Chol como componente anfifílico, Tween 80 como componente tensioactivo no iónico y opcionalmente, PC o DOPE como componente fosfolípido neutro.
Cuando se usa un disolvente orgánico en los métodos anteriores para producir las formulaciones micelar y de emulsión, es apropiado para su uso cualquier disolvente orgánico que no deje un residuo tóxico después de la retirada y que solubilice los componentes lípidos de las formulaciones micelar y de emulsión. Los ejemplos de disolventes apropiados incluyen alcoholes inferiores, dimetoxietano, dioxano, tetrahidrofurano, tetrahidropirano, éter dietílico, acetona, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamidas (DMF) e hidrocarburos halogenados, tales como cloroformo, acetonitrilo o sus mezclas. Un disolvente orgánico preferido es cloroformo.
El disolvente orgánico se puede retirar secando la combinación de la etapa (a) en un gas apropiado tal como argón o nitrógeno y/o a vacío. La película seca se puede liofilizar a continuación y almacenar de alrededor de -80 a alrededor de 37ºC o se puede resuspender en un vehículo acuoso apropiado. Los vehículos acuosos apropiados para su uso en esta invención son no tóxicos para las células y pueden estar o no estar tamponados. Cuando los vehículos están tamponados, los tampones apropiados incluyen tampones tales como citrato, carbonato, bicarbonato, acetato, Tris, glicinato y maleato. Los vehículos acuosos que se pueden usar en las formulaciones de esta invención incluyen, pero no están limitados a, agua destilada, disolución salina normal y disolución salina tamponada con fosfato. Se debe entender que un intervalo de pH preferido para las formulaciones micelar y de emulsión es un intervalo de pH en el que el componente anfifílico catiónico particular presente en una formulación está positivamente cargado. Los de experiencia media en la técnica serían capaces fácilmente de determinar tal intervalo de pH a partir del pKa del componente anfifílico catiónico presente en una formulación particular.
Se debe entender adicionalmente que el vehículo acuoso en el que se suspende la película de lípido puede incluir ingredientes tales como estabilizantes, antibióticos, o agentes antifúngicos y antimicóticos.
Una vez formadas, las formulaciones micelar y de emulsión se pueden mezclar con un ácido nucléico para producir complejos que son estables en el almacenamiento como se refleja por una retención de la actividad del ácido nucléico con el tiempo o por la retención del diámetro de la formulación micelar o de emulsión con el tiempo.
En una realización, se puede ensayar la capacidad de una formulación de emulsión de esta invención para suministrar un ácido nucléico a una célula exponiendo células a complejos formados entre una formulación micelar o de emulsión y una construcción de plásmido que contiene un gen indicador como ácido nucléico. Tales genes indicadores son conocidos por los de experiencia media en la técnica e incluyen el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa, el gen de la luciferasa, el gen de la \beta-galactosidasa y el gen de la hormona de crecimiento humano.
Por "substancia biológicamente activa" tal como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y reivindicaciones se entiende una molécula, compuesto, o composición que cuando está presente en una cantidad efectiva, reacciona con y/o afecta a las células vivas y organismos. Se debe entender que dependiendo de la naturaleza de la substancia activa, la substancia activa puede ser activa en la superficie de la célula o producir su actividad, tal como con ADN o ARN, después de ser introducida dentro de la célula.
Los ejemplos de substancias biológicamente activas incluyen, pero no están limitados a, ácidos nucléicos tales como ADN, cADN, ARN (mARN completo, ribozimas, ARN antisentido, señuelos), oligodesoxinucleótidos (fosfodiésteres, fosfotioatos, fosforamiditas, y todas las otras modificaciones químicas), oligonucleótido (fosfodiésteres, etc.) o ADN de plásmido lineal y circular cerrado; carbohidratos; proteinas y péptidos, incluyendo proteínas recombinantes tales como, por ejemplo, citoquinas (por ejemplo, interleuquinas), factores trófico y de crecimiento o maduración (por ejemplo, NGF, G-CSF, GM-CSF), enzimas, vacunas (por ejemplo, HbsAg, gp120); vitaminas, prostaglandinas, fármacos tales como anestésicos locales (por ejemplo, procaína), agentes antimalaria (por ejemplo, cloroquina), compuestos que necesitan cruzar la barrera sangre-cerebro tales como agentes anti-parkinson (por ejemplo, levo-DOPA), antagonistas del receptor adrenérgico (por ejemplo, propanolol), agentes anti-neoplasticos (por ejemplo, doxorubicina), antihistaminas, aminas biogénicas (por ejemplo, dopamina), antieméticos (por ejemplo, clorpromazina) y analgésicos (por ejemplo, codeína, morfina) o fármacos de pequeño peso molecular tales como cisplatino que mejoran la actividad de transfección, o prolongan la duración del ADN dentro y fuera de las células.
Cuando la substancia biológicamente activa es una proteína o péptido antigénico, los complejos formados por las formulaciones micelar o de emulsión se pueden utilizar como vacunas. En esta realización, la presencia de aceite en la formulación de emulsión puede mejorar un efecto adyuvante del complejo.
En una realización preferida los ácidos nucléicos son ácidos nucléicos que codifican un gen o un fragmento de gen o que efectúan transcripción y/o traducción.
Los complejos de la presente invención se pueden utilizar para suministrar un ácido nucléico a células in vitro o in vivo.
Se cree que el compuesto anfifílico catiónico se une al ácido nucléico negativamente cargado. Preferentemente, los complejos de ácido nucléico:emulsión de esta invención que se va a usar in vitro o in vivo tienen una relación en peso de ácido nucléico:componentes lípidos totales en la emulsión de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:50, más preferentemente una relación en peso de ácido nucléico:componentes lípidos totales en la emulsión de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:30 y lo más preferentemente una relación en peso de ácido nucléico:componentes lípidos totales en la emulsión de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:20. De este modo por ejemplo, en el Ejemplo 11 en el que el complejo de ADN:emulsión se formó combinando 100 \mug de ADN con un volumen de la formulación de emulsión nº 21 que contiene 1100 \mug de componentes lípidos totales, la relación en peso de ADN:componentes lípidos totales de la emulsión nº 21 en el complejo era 100 \mug/1100 \mug o 1:11.
Preferentemente, los complejos de ácido nucléico:micela que se van a usar in vitro o in vivo tienen una relación en peso de ácido nucléico:componentes lípidos totales en la micela de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:50, más preferentemente una relación en peso de ácido nucléico:componentes lípidos totales en la micela de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:30 y lo más preferentemente una relación en peso de ácido nucléico:componentes lípidos totales en la micela de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:20. De este modo por ejemplo, en el Ejemplo 11 en el que se formó un complejo de ADN:micela combinando 100 \mug de ADN con un volumen de formulación micelar nº 31 que contiene 700 \mug de componentes lípidos totales, la relación en peso de ADN:componentes lípidos totales de la micela nº 31 en el complejo era 100 \mug/700 \mug o 1:7.
Se debe entender que la combinación de formulaciones micelar o de emulsión con un ácido nucléico para formar los complejos de ácido nucléico:emulsión o ácido nucléico:micelar se puede llevar a cabo durante por lo menos 5 minutos en presencia o ausencia de suero a una temperatura de alrededor de 4ºC a alrededor de 37ºC. Los complejos de ácido nucléico:emulsión y ácido nucléico:micela resultantes se pueden usar a continuación inmediatamente in vitro o in vivo o se pueden almacenar previamente a su uso.
Preferentemente, los diámetros medios de los complejos de ácido nucléico:emulsión o ácido nucléico:micela que se van a usar in vitro o in vivo son 100-4000 nm, más preferentemente 100-2000 nm y lo más preferentemente 100-1000 nm.
En una realización, los complejos de ácido nucléico:emulsión de esta invención se pueden usar para transfectar células con ácido nucléico. Las células apropiadas para la transfección in vitro incluyen células eucariotas, que incluyen todas las líneas celulares de mamíferos apropiadas para transfección por lípidos catiónicos, células colocadas en cultivo primario de un hospedante, o células que son el resultado del paso del cultivo primario.
Cuando, por ejemplo, se transfectan 10^{5} células in vitro, la transfección se lleva a cabo exponiendo las células a preferentemente de 0,1 a alrededor de 5 \mug de complejo de ácido nucléico:emulsión, más preferentemente de alrededor de 5 a alrededor de 2 \mug de complejo de ácido nucléico:emulsión.
Cuando se van a transfectar 10^{5} células con complejo de ácido nucléico:micela, la transfección se lleva a cabo exponiendo las células a preferentemente de alrededor de 0,1 a alrededor de 20 \mug de complejo de ácido nucléico:micela; más preferentemente de alrededor de 1 a alrededor de 10 \mug de complejo de ácido nucléico:micela.
Tal como se usa aquí, \mug de complejo de ácido nucléico:emulsión o \mug de complejo de ácido nucléico:micela se refieren a la suma de la cantidad de \mug de ácido nucléico y la cantidad de \mug de componentes lípidos totales en la formulación micelar o de emulsión contenida en el complejo. Por ejemplo, 5 \mug de complejo de ácido nucléico:emulsión pueden contener 0,5 \mug de ácido nucléico y 4,5 \mug de componentes lípidos totales de la formulación de emulsión.
Los de experiencia media en la técnica entenderían fácilmente que la cantidad total de complejo de ácido nucléico:emulsión o ácido nucléico:micela que se va a usar varía directamente con el número de células que se van a transfectar. Una ventaja de las formulaciones micelar y de emulsión frente a los vectores de lípido catiónico es que las emulsiones y micelas de la invención, cuando se complejan con ácido nucléico, son más efectivas para transfectar células cultivadas en un medio que contiene suero.
Los complejos de ácido nucléico:emulsión y ácido nucléico:micela se pueden usar para suministrar ácidos nucléicos a células en un animal o ser humano in vivo. De este modo los complejos de ácido nucléico:emulsión o ácido nucléico:micela se pueden usar como sistemas de suministro en terapia génica.
Las rutas apropiadas de administración de los complejos que contienen ácido nucléico de esta invención a un animal o ser humano incluyen la inoculación o inyección, por ejemplo, por ruta intravenosa, oral, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intra-ótica, intraarticular o intra-mamaria, aplicación tópica, por ejemplo sobre la piel, cuero cabelludo, orejas u ojos y por absorción a través de los tejidos epitelial o mucocutáneo, por ejemplo, nasal, oral, vaginal, rectal y gastrointestinal entre otros, y en forma de aerosol. Los de experiencia media en la técnica entenderían fácilmente que el modo de administración puede determinar los sitios en el organismo a los que se suministrará la substancia biológicamente activa y puede afectar a la cantidad de complejo que se va a administrar.
Dado que como se muestra en el Ejemplo 11, la administración de aproximadamente 4 \mug de complejo de ácido nucléico:emulsión o ácido nucléico:micela/gramo de peso corporal a un ratón de 25 gramos produjo actividad de transfección in vivo, los de experiencia media en la técnica usando esta relación de 4 \mug de complejo/gramo de peso corporal de ratón podrían obtener otras relaciones de \mug de complejo/gramo de peso corporal que están optimizadas para la actividad de transfección en otros animales o seres humanos.
En una realización alternativa, las formulaciones micelar y de emulsión mismas se pueden unir con biomacromoléculas (es decir, moléculas producidas por el animal o ser humano) in situ después de administraciones sistemática o tópica y se comportan como una reserva local para substancias bioactivas endógenas.
Los siguientes ejemplos ilustran varios aspectos de la invención.
Ejemplos Material y métodos Materiales
Se sintetizó lípido catiónico DC-Chol según Gao and Huang (Biochem. Biophys. Res. Commun., 179:280-285, 1991). El Tween 80 y al aceite de ricino se obtuvieron de Fisher, el copolímero pluronic L63 se obtuvo de BASF. Los tensioactivos Brij, Span, y pluronic F68 y F127 se compraron de Sigma. El dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) y la fosfatidilcolina de huevo (PC) se obtuvieron de Avanti Polar Lipids. Los liposomas de LipofectAMINE (DOSPA (2,3-dioleiloxi-N-[2-(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propaminio) y DOPE) en una relación en peso de 3:1) se obtuvieron de Life Technologies, Inc.
Preparación de emulsiones y micelas
Tween 80 diluido en cloroformo se combinó con DC-Chol (micelas) y, cuando se indicaba DOPE o fosfatidilcolina; o con aceite de ricino, DC-Chol y, cuando se indicaba, DOPE o fosfatidilcolina (emulsiones) con diferentes relaciones de peso. El disolvente orgánico se evaporó a continuación a una corriente de nitrógeno gaseoso y la película de lípido se desecó a vacío a 4ºC durante la noche para retirar el disolvente orgánico residual. Se añadió a continuación un ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y la mezcla se dejó hidratar durante 1 h. La suspensión de lípido se mezcló a continuación con un mezclador de vórtice y se homogeneizó subsecuentemente durante 3-4 minutos usando un disgregador de tejidos a una velocidad de alrededor de 20.000 rpm. Los diámetros medios de las formulaciones micelar o de emulsión y de los complejos de ADN:emulsión o ADN:micela se midieron por dispersión de luz láser usando un medidor de tamaño de partículas submicrométricas Coulter N4SD.
Preparación de liposomas de DC-Chol/DOPE
Se prepararon liposomas pequeños unilamelares de aproximadamente 100 nm de diámetro por microfluidización de una mezcla hidratada de DD-Chol y DOPE (relación en peso de 1:1) y filtro esterilizado. La concentración final de lípido de los liposomas de DC-Chol/DOPE usado en los experimentos de transfección fue 1,2 \mug/\mul de PBS.
Cultivo de tejido
Se cultivaron células BL6 de melanoma murino en medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal. Se cultivaron células 293 de riñón embriónico humano y F_{0} en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal. Las células CHO se cultivaron en medio F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal.
ADN de plásmido
Un plásmido pCDNA_{3}, pCMV-Luc, que contiene el gen de la luciferasa bajo el control del promotor de actividad inmediata de citomegalovirus (CMV) se usó para verificar la eficiencia de la transfección. Un plásmido similar, pRSV-Luc, que contiene el mismo gen de luciferasa bajo el control de un promotor del virus sarcoma de Rous se usó también para verificar la eficiencia de la transfección. El plásmido pCMV-CAT es un plásmido basado en pUC18 que contiene el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) de E. coli por debajo del promotor de CMV. La preparación y purificación del ADN del plásmido se llevó a cabo según un procedimiento estándar (Sambrook, J., Fritsch, E.F., & Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab Press: Plainview 1: pp 21-52, 1989).
Transfección
Se usaron para la transfección células cultivadas en placas de 48 pocillos (alrededor de 70-80% confluentes) y se transfectaron 3 pocillos con cada formulación. Los ADN de plásmido pCMV-Luc o pRSV-Luc se diluyeron en 125 \mul de medio de CHO-S-SFM libre de suero (Life Technologies, Inc.). La emulsión, micela, liposomas de DC-Chol/DOPE o liposomas de lipofectAMINE se diluyeron en 125 \mul de disolución de sal balanceada de Hank (HBSS). El ADN diluido y las formulaciones o liposomas se combinaron, con o sin la adición de 20% de suero bovino fetal, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 min, antes de ser añadidas a las células. Las células se incubaron a 37ºC durante 5 h. El medio de transfección se reemplazó con medio de crecimiento que contiene 10% de suero fetal bovino, y las células se cultivaron a continuación durante 2 días antes de que se realizase el ensayo de la luciferasa.
Ensayo de la luciferasa
Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min en presencia de 100 \mul de tampón de lisis (0,1 M Tris-HC-1, pH 7,8/0,05% Triton X-100/2 mM EDTA) y a continuación se centrifugaron a 12.000 x g. Se tomaron diez \mul de sobrenadante para el ensayo de la luciferasa usando el sistema de ensayo de la luciferasa (Promega) en un medidor de luminosidad (AutoLumat LB953 de EG&G, Berthhold). La actividad de la luciferasa se da en unidades de luz relativas (RLU).
Estudios de animales
Se compraron ratones hembra CD 1 de 5 semanas de edad de Charles River Breeding Laboratories. El cuidado de los animales fue según las directrices institucionales. 200 \mul de cada uno de los concentrados 4 veces (por ejemplo, el concentrado 4 veces de la formulación nº 21 contenía 1,0 ml de aceite, 1,0 mg de PC, 0,5 mg de Tween 80 y 3,0 mg de DC-Chol por ml de PBS) de las formulaciones nº 21 (1100 \mug de componentes lípidos totales), nº 28 (1100 \mug de componentes lípidos totales), nº 34 (900 \mug de componentes lípidos totales), nº 31 (700 \mug de componentes lípidos totales) (600 \mug de DC-Chol por formulación) se mezclaron con NaCl 5 M hasta una concentración final de NaCl de 0,15 M y a continuación se combinaron con 25 \mul de ADN pCMV-CAT 4 \mug/\mul (100 \mug). La mezcla total (231 \mul) se inyectó en ratones por la vena de la cola. Dos días más tarde, los ratones fueron sacrificados y se escindieron el hígado, bazo, riñones, pulmones y corazón para un ensayo de CAT.
Ensayo de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT)
Los órganos escindidos de los animales se homogeneizaron en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5; EDTA 10 mM; NaCl 150 mM. Después de la homogeneización, las células se sometieron a lisis por medio de tres ciclos de congelación-descongelación, y el lisato se calentó a 65ºC durante 10 min para inactivar las desacetilasas y se centrifugó durante 10 min. La concentración de proteína de los extractos de sobrenadante se midió con un ensayo de azul de Coomassie G 250 (Pierce). Se extrajo proteína de cada órgano y se ensayaron a continuación 200 \mug de extracto para ver la actividad de la CAT usando [^{14}C]cloranfenicol en forma de substrato como se describe previamente (Ausubel, F.M., Breht, R., Kingstone, R.E., et al. Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, Boston), Vol. 1, pp 962-965, 1991).
Ejemplo 1 Estabilidad física de las formulaciones de emulsión y capacidad de transfección de los complejos de ADN:emulsión
Para probar que componentes de las formulaciones de emulsión son importantes para la estabilidad física y la capacidad de transfección se formularon 9 diferentes formulaciones de emulsión que contienen diferentes cantidades de aceite de ricino, fosfatidilcolina de huevo (PC), Tween 80 y DC-Chol. Se midió el diámetro medio de las formulaciones así como su capacidad para transfectar células 293 combinando 6 \mul de cada emulsión (7,5 \mug de componentes lípidos totales) con 0,5 \mug de RSV-Luc. Los datos resultantes se presentan en la Tabla 1.
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Los datos muestran que las emulsiones son físicamente estables, variando el tamaño de 150 a 218 nm de diámetro medio tal como se mide por dispersión de luz láser. Adicionalmente, los complejos de ADN con aquellas emulsiones con alto contenido de DC-Chol (0,750 mg), el único componente catiónico en la emulsión, mostraron alta actividad de transfección comparable a la de los liposomas catiónicos de DC-Chol/DOPE y LipofectAMINE.
Ejemplo 2 (no de la invención reivindicada)
Actividad de transfección de los complejos de ADN:emulsión y ADN:micela
Las formulaciones micelares y de emulsión que contenían alto contenido del compuesto anfifílico catiónico DC-Chol (0,75 mg o más) se complejaron con ADN de pRSV-Luc y se examinaron para ver la actividad de transfección en células BL6 y 293. Los datos presentados en la Tabla 2.
(Tabla pasa a página siguiente)
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muestran que los complejos de ADN con las emulsiones y las dos formulaciones micelares (nº 15 y nº 19) eran activos. Sin embargo, el complejo formado combinando ADN con la formulación nº 18 que contenía estearilamina en lugar de DC-Chol mostró baja actividad de transfección que puede ser debida a la toxicidad de la estearilamina para las células como se evidencia por el hecho de que la cantidad de proteína extraible de los pocillos transfectados con el complejo que contiene la formulación nº 18 era menor que la cantidad de proteína extraible de los pocillos transfectados con complejos que contienen todas las demás formulaciones (véase Tabla 2, nota a pie de página b). De interés, las actividades de un complejo de ADN micelar (nº 19) y una emulsión (nº 14) eran altas, y ciertamente más activo que la formulación de liposoma catiónico (DC-Chol/DOPE) en ambas líneas celulares.
Ejemplo 3 Actividad de transfección de más complejos de ADN:emulsión y ADN:micela
Se midió el diámetro físico de las formulaciones micelar y de emulsión adicionales así como la actividad de transfección de los complejos formados entre ADN y estas formulaciones. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
(Tabla pasa a página siguiente)
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Los resultados muestran que los complejos de ADN y micelas que contienen DC-Chol y Tween 80 (nº 30 y nº 31) fueron de nuevo bastante activos, y reemplazar Tween 80 por pluronic L63 (nº 32 y nº 33) no alteró significativamente los diámetros medios de las formulaciones o su actividad de transfección en células 293. Otra micela que contiene DC-Chol, Tween 80 y PC (fosfatidilcolina) (nº 26) era también activa. Las formulaciones restantes (nº 22-25, 27-29) eran emulsiones que contenían aceite de ricino. Los complejos de ADN y estas formulaciones de emulsión fueron bastante activos en la transfección. Cuando los complejos de ADN y estas formulaciones micelar y de emulsión fueron ensayados en otra línea celular (células de melanoma de ratón BL6), se obtuvieron resultados cualitativamente similares excepto que la actividad en esta línea celular era generalmente más baja que la de las células 293.
Las actividades de transfección de los complejos de ADN y estas emulsiones y micelas fueron comparables a la de la formulación de liposoma catiónico (DC-Chol/DOPE) en células 293, pero en cierto modo más bajas en células
BL6.
Ejemplo 4 Optimización de las condiciones de transfección
Para optimizar la actividad de transfección de los complejos de ADN:emulsión y ADN:micela, la cantidad de DC-Chol en cada formulación de emulsión o micela se mantuvo constante en 4,5 \mug (se usaron 6 \mul de las formulaciones nos. 21, 27, 28 y 30, respectivamente; remitirse a la Tabla 3 para las composiciones de las formulaciones) y la cantidad de ADN de pCMV-Luc se varió de 0 a 5 \mug. Como se muestra en la figura 1, los complejos de ADN y las formulaciones nº 27 y nº 30 (remitirse a la Tabla 3 para las composiciones) mostró una actividad máxima de transfección en células BL6 con 2 \mug de ADN mientras que los complejos de ADN y las formulaciones nº 21 y nº 28 mostraron una máxima actividad con 1,5 g de ADN.
A continuación, la cantidad de ADN de pCMV-Luc se fijó en 2 \mug para las formulaciones nº 27 y nº 30 y en
1,5 \mug para las formulaciones nº 21 y nº 28 y se produjeron complejos de ADN y cantidades variables de formulación de emulsión o micela como se indica en el eje horizontal de la Figura 2 (en la que \mug de formulación en el eje horizontal se refiere a \mug de componentes lípidos totales presentes en el volumen de formulación combinada con ADN de pCMV-Luc para formar el complejo). Los resultados presentados en la Figura 2 muestran que los complejos de ADN y las formulaciones nº 27, nº 28 y nº 30 exhibían un pico de actividad relativamente amplio en células BL6 siendo 18 \mug la cantidad óptima de componentes lípidos totales presente en el volumen de formulación combinado con ADN para producir el complejo. Sin embargo, los complejos de ADN y la formulación nº 21 exhibían un pico de actividad más estrecho, siendo 13 \mug la cantidad óptima de componentes lípidos totales presentes en el volumen de formulación combinados con ADN para producir el complejo.
Ejemplo 5 Sensibilidad de la actividad de transfección de complejos de ADN:emulsión y ADN:micela al suero
Todos los experimentos de transfección descritos anteriormente se llevaron a cabo en un medio libre de suero. Por lo tanto, para determinar la sensibilidad de la actividad de transfección de los complejos de ADN:emulsión y ADN:micela a la presencia de suero, se transfectaron células BL6 en el medio que contiene 0 ó 20% de suero
fetal bovino con complejos de ADN y 10 diferentes emulsiones o micelas (o liposomas de DC-Chol/DOPE) como
sigue.
Se prepararon diferentes formulaciones de las composiciones mostradas en la Tabla 4 en un volumen total de 1 ml de PBS (pH 7,4). Se transfectaron a continuación células BL6 en una placa de 48 pocillos con 2 \mug de pCMV-Luc y 16 \mul de cada formulación (que contiene 12 \mug de DC-Chol), o con 2 \mug de pCMV-Luc y 16 \mul de liposomas de DC-Chol/DOPE (1,2 \mug/\mul), en un medio que contiene 0 o 20% de suero bovino fetal y se detectó la actividad de la luciferasa. Cada pocillo contenía aproximadamente 70-80 \mug de proteína extraible. Los resultados que se muestran en la Tabla 4.
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demuestran que la actividad de transfección de liposomas de DC-Chol/DOPE era bastante sensible al suero (solo alrededor del 33% de actividad permanecía en presencia de suero) mientras que de las 10 formulaciones ensayadas, solo el complejo de ADN y la formulación nº 37 mostró sensibilidad al suero, en la que la sensibilidad al suero es una reducción de la actividad de transfección en presencia de suero con relación al nivel de actividad observada en ausencia de suero. Además, el hecho de que el complejo de ADN y la formulación nº 39 no mostró actividad en presencia o ausencia o de suero demostró que la presencia de un compuesto anfifílico catiónico es crítica para la actividad de transfección. Particularmente interesantes son los complejos de ADN y las formulaciones nº 35, nº 36 y nº 40 (que corresponden en composición a las formulaciones nº 21, nº 34 y nº 28 respectivamente en la Tabla 3) que, de las formulaciones ensayadas, exhibían la mayor mejora de actividad de transfección en presencia de suero.
Ejemplo 6 Sensibilidad de la actividad de transfección de complejos de ADN y formulaciones seleccionadas al suero en diferentes líneas celulares
Para determinar si la sensibilidad al suero observada en las células BL6 en la Tabla 4 se observaba en otras líneas celulares, se transfectaron células F_{0}, células CHO y células 293 con 16 \mul de formulaciones seleccionadas (que contiene cada una 12 \mug de DC-Chol/16 \mul) de la Tabla 4 combinadas con 2 \mug de ADN de pCMV-Luc o, con 16 \mul de liposomas de DC-Chol/DOPE (1,2 \mug/\mul) combinadas con 2 \mug de ADN de pCMV-Luc en un medio que contiene 0 ó 20% de suero como en el Ejemplo 5. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 5. Los datos muestran que los complejos de ADN y todas las formulaciones son activos para transfectar células y son en general resistentes al suero.
(Tabla pasa a página siguiente)
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Ejemplo 7 Estabilidad de los complejos de ADN:emulsión y ADN:micela
Cinco formulaciones diferentes (nos. 26, 27, 28, 29 y 34 de la Tabla 3) se ensayaron para ver la estabilidad de su complejo con ADN. El complejo se preparó combinando 2 \mug de ADN de pCMV-CAT y 16 \mul de la formulación de emulsión o de micela indicada (en la que 16 \mul de cada formulación contenían la misma cantidad de DC-Chol, 12 \mug) o combinando 1 \mug de ADN pCMV-CAT y 6 \mug de liposomas de DC-Chol/DOPE. Como se puede ver en la Figura 3, las formulaciones nº 26, nº 28 y nº 29 formaron relativamente pequeños complejos con ADN; el diámetro medio del complejo tal como se mide por dispersión de luz láser variaba de 200 a 300 nm, y permanecía pequeño incluso después de 10 días a 4ºC. Las formulaciones nº 34 y nº 27, por otra parte, formaron complejos más grandes con ADN con diámetros medios de 600 y 900 nm, respectivamente. En contraste, los liposomas de DC-Chol/DOPE habían formado mayores agregados (1.800 nm en el día 1) que habían crecido incluso hasta unos más grandes (>4.000 nm) en el día 3 y subsecuentemente precipitaron en la disolución (no se muestran los datos). De este modo, todas las nuevas formulaciones podrían formar complejos con ADN que tuvieran mejor estabilidad física que la de los complejos formados con los liposomas de DC-Chol/DOPE.
Ejemplo 8 Efecto de diferentes tensioactivos en la actividad de transfección de complejos de ADN y emulsiones compuestas de Aceite/DOPE/DC-Chol/Tensioactivo con una relación en peso de 2:2:6:x
Se prepararon emulsiones que contienen diferentes tensioactivos en 1 ml de PBS que contiene 0,25 mg de aceite, 0,25 mg de DOPE, 0,75 mg de DC-Chol y diferentes cantidades de los tensioactivos indicados, en las que la cantidad total de tensioactivo usado en cada formulación era aproximadamente la misma por mol. A continuación se transfectaron células BL6 con 2 \mug de ADN de pCMV-Luc combinados con 16 \mul de formulación (12 \mug de DC-Chol/16 \mul de cada formulación) y se ensayaron para ver la actividad de la luciferasa. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 6.
TABLA 6 Efecto de diferentes tensioactivos en la actividad de transfección de complejos de ADN y emulsiones compuestas de Aceite/DOPE/DC-Chol/Tensioactivo (0,25 mg:0,25 mg:0,75 mg:X mg por ml de PBS)
12
De los tensioactivos ensayados, los complejos formados a partir de emulsiones que contienen Tween 20, Tween 40, Tween 60, Brij 72, Brij 74, F68 o F127 demostraron actividad de transfección que no era sensible a la presencia de 20% de suero y los complejos formados a partir de formulaciones que contienen la serie Tween de detergentes mostró el mayor incremento en actividad de transfección en presencia de suero con relación a la observada en ausencia de suero.
Ejemplo 9 Efecto de la concentración de Tween 80 en emulsiones sobre los diámetros medios de complejos de ADN/emulsión concentrados y diluidos
Se formó un complejo de ADN/emulsión concentrado añadiendo 2 \mul de disolución que contiene 8 \mug de ADN (pCMV-Luc) directamente a 72 \mul de emulsiones que contienen 0,25 mg de Aceite/0,25 mg de DOPE/0,75 mg de DC-Chol y cantidades variables de mg de Tween 80 por ml. Como en los ejemplos previos se formó complejo de ADN/emulsión diluido combinando 2 \mug de ADN en 125 ml con 18 \mul de las mismas emulsiones usadas en el complejo concentrado pero diluidas hasta 125 \mul. Los diámetros medios de los complejos concentrados y diluidos se midieron 1 hora después de la incubación a temperatura ambiente. Los resultados mostrados en la Figura 4 demuestran que cantidades incrementadas de Tween 80 redujeron el tamaño de los complejos concentrados pero no tuvieron efecto sobre el tamaño de los complejos diluidos.
Ejemplo 10 Efecto de la cantidad de Tween 80 en una emulsión sobre la actividad de transfección de complejos de ADN/emulsión concentrados y diluidos en la presencia o ausencia de 20% de suero
Se prepararon emulsiones y complejos concentrados y diluidos de ADN de pCMV-Luc/emulsión como en el Ejemplo 9 y se midió la actividad de transfección de los complejos en células BL6 en presencia o ausencia de 20% de suero. Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 5A (complejo concentrado) y 5B (complejo diluido). Aunque los complejos diluidos parecen mostrar mejor actividad que los complejos concentrados, la necesidad de mantener pequeño el volumen del complejo administrado al animal puede favorecer el uso de complejos más concentrados in vivo.
Ejemplo 11 Estudios en animales con complejos de ADN:emulsión y ADN:micela
Se ensayaron las formulaciones nos. 21, 28, 31 y 34 (remitirse a la Tabla 3 para las composiciones) para ver la actividad de transferencia génica en ratones. 200 \mul de cada concentrado 4 veces de las formulaciones nº 21 (1100 \mug de componentes lípidos totales), nº 28 (1000 \mug de componentes lípidos totales), nº 34 (900 \mug de componentes lípidos totales), y nº 31 (700 \mug de componentes lípidos totales) se mezclaron con 6 \mul de NaCl 5 M hasta una concentración final de NaCl 0,15 M y a continuación se combinaron con 4 \mug/\mul de ADN de pCMV-CAT (100 \mug). Los complejos se inyectaron a continuación i.v. vía la vena de la cola del ratón (cada ratón pesaba aproximadamente 25 gramos) y se midió la actividad de la CAT en los órganos principales dos días después de la inyección. Los datos presentados en la Figura 6 claramente demuestran que los complejos de ADN y las formulaciones nº 28 (emulsión), nº 31 (micela) o nº 34 (micela) podrían transfectar varios órganos con relativamente alta actividad mientras que el complejo de ADN y la formulación nº 21 (emulsión), por otra parte, fue débil y comparable a la de los liposomas de DC-Chol/DOPE. Además, la actividad del complejo de ADN y la formulación nº 31 parece ser específica del pulmón, ya que ningún otro órgano fue significativamente transfectado; el complejo de ADN y la formulación nº 28 podría transfectar todos los órganos bastante bien, solo con transfección débil del riñón, y el complejo de ADN y la formulación nº 34 mostró una alta actividad en el corazón con muy baja actividad en el riñón.

Claims (22)

1. Un complejo de ácido nucléico:emulsión que comprende un ácido nucléico y una formulación de emulsión de aceite en agua que comprende componentes lípidos y un vehículo acuoso, en el que los componentes lípidos comprenden un componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no iónico.
2. El complejo de la reivindicación 1, en el que en la formulación, el componente aceitoso está presente en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 80% en peso de los componentes lípidos totales, el componente anfifílico catiónico está presente en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 80% en peso de los componentes lípidos totales y el componente tensioactivo no iónico está presente en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 50% en peso de los componentes lípidos totales.
3. El complejo de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente un componente fosfolípido neutro presente en una cantidad de alrededor de 5 a alrededor de 25% en peso de los componentes lípidos totales en la formulación.
4. El complejo de la reivindicación 1, en el que los componentes lípidos comprenden adicionalmente un componente fosfolípido neutro.
5. El complejo de la reivindicación 1, en el que el componente anfifílico catiónico es un lípido seleccionado del grupo que consiste en 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP); cloruro de N-[1,-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), 1,2-dioleoil-3-(4'-trimetilamonio)butanoil-sn-glicerol (DOBT), (4'-trimetilamonio)butanoato de colesterilo (ChOTB), DL-1,2-dioleoil-3-dimetilaminopropil-B-hidroxietilamonio (DORI), DL-1,2-O-dioleoil-3-dimetilaminopropil-\beta-hidroxietilamonio (DORIE), éster de colina y 1,2-dioleoil-3-succinil-sn-glicerol (DOSC); éster hemisuccinato de colina y colesterilo (ChOSC);l dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS) y dipalmitoilfosfatidiletanolamidoespermina (DPPES), yoduro de colesteril-3\beta-carbonil-amido-etilenotrimetilamonio, yoduro de carboxilato de 1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesterilo, colesteril-3\beta-carboxiamidoetilenamina, yoduro de colesteril-3\beta-oxisuccinamidoetilenotrimetilamonio, yoduro de 1-dimetilamino-3-trimetilamonio-DL-2-propil-colesteril-3\beta-oxisuccinato, yoduro de 2-[(2-trimetilamonio)-etilmetilamino]etil-colesteril-3\beta-oxisuccinato, 3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol), y 3\beta-[N-(polietilenimina)-carbamoil]colesterol.
6. El complejo de la reivindicación 1, en el que la relación en peso de ácido nucléico a componentes lípidos totales en la formulación es de alrededor de 1:1 a alrededor de 1:50.
7. El complejo de las reivindicaciones 1 ó 5 para facilitar el suministro del ácido nucléico a las células, en el que el compuesto anfifílico catiónico es 3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol).
8. El complejo de la reivindicación 1, en el que el componente aceitoso es un aceite natural.
9. El complejo de la reivindicación 8, en el que el componente aceitoso es aceite de ricino.
10. El complejo de la reivindicación 1, en el que el tensioactivo no iónico es un detergente sintético.
11. El complejo de la reivindicación 10, en el que el detergente sintético se selecciona del grupo que consiste en éster de ácido graso y sorbitán, éster de ácido graso y sorbitán polioxietilenado, Pluronic F68, Pluronic F127, Triton-X-100 y Triton X-114.
12. El complejo de la reivindicación 11, en el que el componente anfifílico catiónico es 3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol).
13. El complejo de la reivindicación 1, en el que el tensioactivo no iónico se selecciona del grupo que consiste en tensioactivos no iónicos derivados de fosfatidiletanolamina.
14. El complejo de la reivindicación 1, en el que el ácido nucléico se selecciona del grupo que consiste en ADN y ARN.
15. El complejo de la reivindicación 10, en el que el detergente sintético se selecciona del grupo que consiste en monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, monolaurato de sorbitán polioxietilenado, monopalmitato de sorbitán polioxietilenado, monoestearato de sorbitán polioxietilenado, monooleato de sorbitán polioxietilenado, poloxámero 188, poloxámero 407, polioxietileno(10)-isooctilfenil-éter y polioxietileno(8)-isooctilfenil-éter.
16. El complejo de la reivindicación 1, en el que la formulación es apropiada para la transfección in vitro.
17. Un método para suministrar un ácido nucléico a células, que comprende exponer las células in vitro al complejo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes facilitando con ello el suministro del ácido nucléico a las células.
\newpage
18. El método de la reivindicación 17, en el que las células son células de mamífero expuestas al complejo en presencia de suero in vitro.
19. El uso del complejo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un estado de un ser humano o animal, siendo dicho estado uno en el que el tratamiento comprende el suministro de un ácido nucléico a células del ser humano o animal.
20. Un método para producir un complejo de ácido nucléico:emulsión que comprende un ácido nucléico combinado con una formulación de emulsión de aceite en agua, que comprende:
(a) combinar un componente aceitoso, un componente anfifílico catiónico y un componente tensioactivo no iónico;
(b) añadir un vehículo acuoso para producir dicha formulación de emulsión de aceite en agua; y
(c) añadir ácido nucléico a dicha formulación de emulsión de aceite en agua para producir dicho complejo de ácido nucléico:emulsión.
21. El método de la reivindicación 20 que comprende adicionalmente combinar los componentes de la etapa (a) con un componente fosfolípido neutro.
22. El método de la reivindicación 21, en el que los componentes de la etapa (a) se combinan en un disolvente orgánico y el disolvente se retira para dejar una película de lípido previamente a la etapa (b).
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