ES2229534T3 - Complejos en forma de particulas estables, con carga global neutra o negativa de estructura laminar. - Google Patents

Complejos en forma de particulas estables, con carga global neutra o negativa de estructura laminar.

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Abstract

Esta invención se refiere a complejos particulados estables que tienen una carga global negativa o neutra, forma esférica y una estructura de las partículas lamelar, laminada y condensada. El complejo comprende una sustancia globalmente aniónica biológicamente activa y una mezcla de un constituyente catiónico y de un constituyente aniónico, en el que al menos un constituyente catiónico y el constituyente aniónico es un lípido. Más particularmente, la mezcla comprende además un constituyente neutro. La invención se refiere también a vesículas unilamelares para preparar estos complejos así como su preparación y utilización.

Description

Complejos en forma de partículas estables, con carga global neutra o negativa de estructura laminar.
Esta invención se refiere a complejos en forma de partículas que resultan de la asociación de sustancias biológicamente activas con vesículas útiles como vectores de sustancias activas. También se refiere a la utilización de vesículas apropiadas para la formación de estos complejos así como a composiciones que incluyen estos complejos. Finalmente, la invención se refiere a la preparación de estas vesículas y de los complejos y composiciones que las contienen.
Hoy día se conocen muchos sistemas de vectorización de sustancias activas, tales como los liposomas, las nanopartículas, las partículas de polímero, complejos-ligando e inmuno-complejos y ciclodextrinas (Drug Transport in antimicrobial and anticancer chemotherapy, G. Papadakou Ed. CRC Press, 1995).
Sin embargo, ninguno de estos sistemas ha demostrado ser verdaderamente satisfactorio para el transporte in vivo de ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, el ácido desoxiribonucleico (ADN). Esta deficiencia es uno de los problemas abordados por la técnica conocida como terapia génica (R. G. Crystal, Science, 270, 404-410, 1995). La terapia génica es la transfección de un producto basado en ácido nucleico, tal como un gen, en las células de un organismo. El gen es expresado en las células después de que ha sido introducido en el organismo.
En la actualidad existen varios métodos de transfección celular. Estos métodos pueden ser agrupados como sigue:
\bullet
Uso de fosfato cálcico o de policationes, microinyección, fusión protoplasmática;
\bullet
Electroporación e inyección de ADN libre;
\bullet
Infección vírica;
\bullet
Vectores sintéticos.
Los métodos del primer grupo no son aplicables a la transfección in vivo. Como consecuencia, la mayoría de los ensayos clínicos iniciales de la terapia génica que tienen lugar hoy día están basados en la utilización de vectores retrovirales y adenovirales. Estos vectores son eficaces en la transfección estable de genes heterólogos en células para su expresión. Sin embargo, la utilización clínica de vectores de origen vírico resulta problemática debido a su potencial toxicidad.
Los virus de ADN tales como los adenovirus o el virus del herpes son transportadores potenciales de ADN, pero provocan problemas relacionados con la inmunogenicidad, la toxicidad y los costes de producción.
La electroporación y la inyección de ADN libre, ofrece una alternativa útil pero relativamente ineficaz, y limitada tan sólo a la administración local.
Existe un creciente interés por el uso de vectores sintéticos tales como vectores de lípidos y de polipéptidos, ya que esta estrategia parece ser menos tóxica que los vectores virales. El material genético que va ha ser entregado normalmente es un plásmido (pADN), cuya producción es fácil y barata. El plásmido, que habitualmente se produce en bacterias, no sólo contiene el gen sino también las secuencias que aseguran el control cis de la regulación de la expresión del gen. Las secuencias de control comunes incluyen promotores, secuencias potenciadotas, secuencias operativas, posiciones de unión de ribosomas, codones de iniciación, final de señales de transcripción, y señales de poliadenilación. También se puede insertar otras secuencias de ADN, tales como secuencias tampón, posiciones de origen de replicación, posiciones de recombinación homóloga o intrones.
En general, el transporte de ácidos nucleicos (AN) está limitado por su importante biodegradabilidad. El pADN en particular debe ser entregado totalmente intacto al núcleo de la célula objetivo para permitir la expresión del transgen. La ruta del pADN después de administración sistémica incluye muchas etapas, cada una de las cuales es una barrera potencial para la expresión del transgen:
\bullet
Transporte en la corriente sanguínea desde la zona de inyección hasta las células/tejidos objetivos;
\bullet
Difusión desde el compartimento intravascular hasta el compartimento extravascular, también denominada extravasación en tejidos y entrada a las células;
\bullet
Liberación de las partículas/pADN de vector sintético o de pADN libre en el compartimento citoplasmático;
\bullet
Separación del pADN de los vectores sintéticos;
\bullet
Transferencia desde el citoplasma hasta el núcleo;
\bullet
Penetración nuclear;
\bullet
Expresión del transgen.
A continuación se presentan las características de un sistema de transporte óptimo para la transferencia de genes:
\bullet
Adquisición de partículas de vector sintético/ADN homogéneo de tamaño pequeño para permitir la condensación del ADN (es decir, que se vuelva más compacto).
\bullet
Protección del ADN frente a nucleasas.
\bullet
Adquisición de partículas con una vida media en plasma mejorada, a través de la disminución de las interacciones con células sanguíneas o proteínas del plasma.
\bullet
Transporte del ADN en la célula objetivo.
\bullet
Liberación del ADN en el citoplasma y en el nucleoplasma.
\bullet
Capacidad de acción sobre la célula.
Entre los vectores sintéticos, los vectores de lípidos y los liposomas parecen tener la ventaja sobre los vectores de polipéptidos de ser potencialmente menos inmunogénicos y, durante el tiempo que lo son, de ser más eficaces. Sin embargo, el uso de liposomas convencionales para la entrega de ADN está muy limitado debido a la baja tasa de encapsulación y a su incapacidad para compactar grandes moléculas, tales como los ácidos nucleicos.
La formación de complejos de ADN con lípidos catiónicos ha sido estudiada recientemente en muchos laboratorios (Felgner y col., PNAS 84, 7413-7417 (1987); Gao y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 280-285, (1991); Behr, Bioconj. Chem., 5, 382-389 (1994)). Estos complejos ADN-lípidos catiónicos también han sido designados en el pasado usando el término lipoplejos (P. Felgner y col., Hum. Genet. Ther., 8, 511-512, 1997). Los lípidos catiónicos permiten la formación de complejos electrostáticos con el ADN, que es una sustancia polianiónica.
El uso de lípidos catiónicos ha demostrado ser eficaz en el transporte de pADN en cultivos celulares. Sin embargo, la aplicación in vivo de estos complejos, particularmente después de la administración sistémica, para la transferencia de genes, está poco documentada (Zhu y col., Science 261, 209-211 (1993); Thierry y col., PNAS 92, 9742-9746 (1995); Hofland y col., PNAS 93, 7305-7309 (1996)).
No obstante, este tipo de administración es de especial interés en determinadas aplicaciones médicas. La explicación subyace en la dificultad de obtener complejos que son de tamaño y estructura homogéneos, y que son relativamente estables frente a la biodegradación. La solicitud de patente WO 96/03977 del National Institute of Health, por ejemplo, se refiere a liposomas utilizables en la entrega de ADN in vitro, constituidos por lípidos catiónicos y por lípidos neutros. Sin embargo, la naturaleza catiónica general de estos liposomas combinados con pADN es una notable limitación de este tipo de sistema para determinadas aplicaciones.
Hasta el momento, ha sido imposible obtener lipoplejos estables y homogéneos que presenten una carga neta neutra o negativa, y eso sería eficaz para la transfección celular. Las reacciones usadas en la formación de lipoplejos incluyen la formación de enlaces electrostáticos entre los constituyentes polianiónicos. La formación de dichos enlaces es difícil de controlar.
Es aceptado que las partículas positivas se unen eficazmente y de forma no específica a las proteínas del suero, la mayoría de las cuales presentan una carga neta negativa. Dicha unión conduce a la desactivación y la eliminación rápida del plasma de las proteínas, dando lugar a una mayor toxicidad y, potencialmente, a una reacción de inflamación. Adicionalmente, las partículas cargadas positivamente interactúan positivamente con las matrices extracelulares y, como resultado, muestran una extravasación limitada desde el espacio vascular hacia el espacio intersticial.
La naturaleza catiónica de los lipoplejos desarrollados en el pasado es una limitación grave para su utilización en administración sistémica. Esto explica parcialmente la amplia divergencia entre la eficacia in vitro y la in vivo.
Es de interés, a este respecto, resaltar que los lipoplejos ya desarrollados no son eficaces para la transfección de células musculares después de la inyección intramuscular, pero que los liposomas HVJ sí lo son (Yanagihara y col., Gene Ther. 3, 549-557 (1996)). Los liposomas HVJ (Virus de la Hemaglutinina del Japón, del inglés "Hemmagglutinin Virus of Japan") son preparaciones de liposomas neutras, cuyas membranas contienen partículas inertes de virus HVJ y que encapsulan pADN previamente encapsulado con histonas HMG1. Este sistema ha demostrado ser eficaz en diversas aplicaciones in vivo. Su aplicación clínica, sin embargo, resulta seriamente limitada, debido a problemas de inmunogenecidad y de toxicidad relacionados con la presencia de partículas víricas. Las razones para dicha eficacia superior en células musculares de los liposomas HVJ en comparación con la de los vectores de lípidos catiónicos podrían ser explicadas por una mejor liberación endosomal y por la carga neutra.
También se ha mostrado (H. Komatsu y col., BBA 1235, 270-280) (1995) que determinados disolventes hidrofílicos no acuosos, por ejemplo el etanol, modifican la ultraestructura de las membranas de lípidos que forman las membranas de los liposomas. En un disolvente acuoso, las cadenas de ácidos grasos de los lípidos forman bicapas, en las que las colas hidrófobas de los ácidos grasos de una de las capas se yuxtaponen a las colas hidrófobas de la otra capa, dejando un espacio entre las dos capas. Solubilizando los lípidos con la dilución apropiada de un disolvente hidrófilo no acuoso en una disolución acuosa, los ácidos grasos de una de las capas interactúan y se entremezclan con las colas hidrófobas de la otra capa, aumentado con ello la fluidez de la membrana. Las vesículas que contienen dichas bicapas modificadas pueden ser descritas como "interdigitadas". Estas membranas también son menos gruesas que las bicapas de lípidos que se forman en disolventes acuosos (< 60 Angströms) y tienen una apariencia unilaminar similar a la de las SUVs (Vesículas Unilaminares Pequeñas, del inglés "Small Unilaminar Vesicles").
En el pasado, se han encapsulado sustancias activas en vesículas, sin reconfiguración estructural. La investigación de los solicitantes les ha permitido preparar vesículas particularmente adecuadas para la formulación de sustancias biológicas aniónicas tales como ADN y por tanto para obtener complejos estables, que permiten el transporte de estas sustancias biológicas como parte de los vectores para propósitos médicos. En esta especificación, se dirá que las sustancias biológicas que son parte de los vectores están sectorizadas.
La invención aquí tratada está diseñada para proporcionar un sistema de transporte para agentes activos, y para ácidos nucleicos en particular, libre de las desventajas de los sistemas anteriores. La formulación de la invención permite notablemente la transferencia de genes óptima, ya que ofrece las ventajas enumeradas a continuación que conforman la base de una transfección eficaz:
\bullet
Condensación de ADN.
\bullet
Protección de ADN frente a nucleasas.
\bullet
Vida media en plasma mejorada, a través de una disminución de la interacción con las células sanguíneas o con las proteínas del plasma.
\bullet
Transporte en el ADN objetivo.
\bullet
Liberación del ADN en el citoplasma o en el nucleoplasma.
\bullet
Capacidad de seleccionar células.
Resumen
Este objetivo es alcanzado proporcionando un complejo en forma de partícula estable que tiene forma esférica y estructura particulada laminar, enrollada y condensada, comprendiendo el complejo una sustancia biológicamente activa netamente aniónica y una mezcla de un constituyente catiónico y un constituyente aniónico, en la que al menos uno de los constituyentes catiónico y aniónico es un lípido. En una realización preferida, el complejo presenta una carga neta negativa o neutra. En otra realización, el complejo además comprende un constituyente neutro.
Los complejos de la invención proporcionan un sistema para la vectorización de sustancias activas en forma de partícula. Los complejos serán denominados de aquí en adelante complejos Neutraplex^{TM}. En comparación con los complejos anteriormente disponibles, los complejos Neutraplex^{TM} (Nx) son lipoplejos que son estables, y que presentan una estructura particulada condensada que tiene forma esférica, tal como se muestra en las Figuras 1 y 2. Los complejos Neutraplex^{TM} tienen una estructura ordenada cristalina líquida que presenta una disposición laminar enrollada.
Los complejos pueden tener una carga neta positiva o neutra. Preferiblemente, los complejos tienen una carga neta negativa o neutra.
El sistema de la invención es destacable en que permite la disposición del complejo en forma de partícula de carga neta negativa o neutra, ofreciendo la ventaja de ser capaz de condensar significativamente ADN, tal como pADN; y de ser fusogénico (por ejemplo, capaz de romper membranas intracelulares, tales como, por ejemplo, membranas endosomales). Hablando de forma genérica, es preferible usar un sistema de entrega que es sustancialmente neutro o ligeramente negativo, ya que para la administración sistémica el rendimiento de entrega de la sustancia activa a su lugar de acción se ve enormemente mejorado en comparación con un sistema cargado positivamente, que está limitado debido a su biodistribución y a su toxicidad. La carga neta negativa o la neutralidad sustancial del complejo reducen las barreras farmacológicas y fisiológicas y, en particular, mejora el transporte en la matriz celular del tejido, o, bajo determinadas circunstancias, potencia la extravasación. De forma alternativa, los complejos con carga neta positiva son, en determinadas circunstancias, ventajosos, por ejemplo para la administración parenteral/local.
Descripción de las figuras
Figura 1. Las Figuras 1A y 1B son microfotografías de la ultraestructura de vesículas Nx2D y de complejos Nx2D/pADN, respectivamente, obtenidas por microscopía crioelectrónica. La barra de escala equivale a 50 nm. La Figura 1C muestra la distribución de tamaños de los complejos Nx2D/pADN determinada por dispersión de luz dinámica.
Figura 2. La Figura 2A muestra una imagen de microscopía crioelectrónica de un Neutraplex^{TM} formado con el ADN de cadena larga doble del virus fago T4. La Figura 2B muestra un análisis SAXS del Nx2D/pADN (línea de puntos) y del Nx/T4ADN (línea sólida).
Figura 3. Es un diagrama que muestra la estructura y preparación de complejos Neutraplex^{TM}.
Descripción detallada
En esta especificación, todos los números son aproximados, a menos que se indique lo contrario, o que se requiera en el contexto en el que se usa el número. Las palabras "que comprende", "comprende", "comprenden", y otras similares significan que incluye, pero no que se limita a lo indicado. Las palabras "que consiste en", "consiste en", "consisten en", y otras parecidas significan que incluye y se limita a lo indicado.
Una de las ventajas de los complejos de la invención es la condensación, es decir, aumentar la compactación, de la sustancia biológicamente activa sectorizada. Este objetivo se alcanza preferiblemente en concreto con un constituyente catiónico que presenta propiedades de condensación aniónicas.
La sustancia biológicamente activa incluida en la composición de los complejos en forma de partículas de la invención preferiblemente es un ácido nucleico, y la invención también prevé más particularmente que el constituyente catiónico debería ser una sustancia con propiedades de condensación de ADN, pero cualquier compuesto catiónico es aceptable en el contexto de la invención, por ejemplo, las histonas, las esperminas o las espermidinas. Sin embargo, se muestra preferencia por un constituyente catiónico de naturaleza lipídica. Cualquier lípido con una carga neta positiva es adecuado. Algunos lípidos cargados positivamente preferidos incluyen lipomonoaminas tales como la DOTAP y la DOTMA, lipopoliaminas tales como la DOGS y la DOSPA, y fosfonolípidos tales como el fosfolípido de dioleoiltrimetilamonio y el fosfonolípido de miristoiltrimetilamonio.
DOTAP: 1-2-dioleoiloxi-3-(trimetilamino) propano,
DOTMA: Cloruro de N [1-(2,3-dioleoiloxi) propil]-N,N,N-trimetilamonio,
DOGS: dioctadecilamidoglicilespermidina,
DOSPA: trifluoroacetato de 2,3-diolcoiloxi-N-(2-esperminacarboxamida) etil-N,N-dimetil-1-propanaminio.
Como resultado del método especial de producción de los complejos de la invención, el constituyente catiónico puede no ser un lípido si el constituyente aniónico es un lípido. Los constituyentes de naturaleza no lipídica incluyen polímeros, tales como polipéptidos, lipopéptidos, polisacáridos, chitosán, polilisina, polietilenimina, y detergentes catiónicos, tales como, por ejemplo, el CTAB, que también es conocido por su capacidad para compactar ADN.
El constituyente aniónico incluido en la composición de los complejos en forma de partículas de la invención preferiblemente debería ser también un lípido, más preferiblemente un fosfolípido. Cualquier lípido con una carga neta negativa, tal como la fosfatidilserina o el fosfatidilinositol y sus derivados, es aceptable en el contexto de la invención.
La preferencia particular se decanta por la Cardiolipina o sus derivados naturales o sintéticos como constituyentes aniónicos. La Cardiolipina es un difosfatidilglicerol natural que puede ser extraído del corazón de un mamífero, y que contiene aproximadamente un 90% de C18:2 y un 9% de C18:1. Está disponible en Avanti Polar Lipids Incorporated of Alabaster, Alabama, EE.UU., y en Sigma-Aldrich Fine Chemicals. Véase, por ejemplo, Lipids 6, 260-265 (1965).
Sin embargo, el constituyente aniónico de los complejos de la invención también puede ser no lipídico si el constituyente catiónico es un lípido. Algunos ejemplos de constituyentes aniónicos no lipídicos adecuados incluyen compuestos poliméricos, tales como, por ejemplo, el ácido poliglutámico, o detergentes aniónicos, tales como, por ejemplo, el lisofosfatidilglicerol.
Cuando la sustancia activa es un ácido nucleico, es particularmente preferible que el constituyente aniónico sea un lípido que comprende principalmente un difosfatidilglicerol, por ejemplo la Cardiolipina o uno de sus derivados o análogos sintéticos. Aunque la Cardiolipina es un fusogénico, el complejo de la invención preferiblemente incluye un lípido neutro, por ejemplo otro lípido fusogénico, tal como la etanolamina de fosfatidilo o sus derivados, por ejemplo la etanolamina de dioleilfosfatidilo (DOPE). Los complejos de la invención tienen entonces la propiedad fusogénica esencial para la liberación de ADN desde los endosomas hasta el citoplasma.
Además, un constituyente neutro, tal como un lípido neutro, por ejemplo el colesterol o DOPE, puede participar en la estabilización de la estructura de los complejos de la invención. Este constituyente neutro también puede ser un compuesto lipídico zwitteriónico tal como la esfingomielina, que puede tener potencial fusogénico en los complejos de la invención.
Por lo tanto, el sistema de transporte de ADN incluido en esta invención es preferiblemente una combinación única de una o más, o de todas las propiedades siguientes esenciales para obtener un vector de ADN óptimo:
\bullet
Preferiblemente de naturaleza exclusivamente lipídica, por tanto mínimamente inmunogénico;
\bullet
Buena condensación de ADN que asegure la penetración celular del ADN;
\bullet
Fusogenicidad;
\bullet
Naturaleza de membrana altamente estructurada.
En un complejo preferido de la invención, los solicitantes proponen por primera vez la asociación de un constituyente aniónico con un constituyente catiónico para obtener una vesícula que condensa ácidos nucleicos a la vez que se asegura la preparación de complejos estables con carga neta negativa o neutra que poseen las propiedades mencionadas anteriormente.
La carga neta de los complejos de la presente invención es el resultado del número relativo de cargas positivas frente a cargas negativas y puede ser medida en términos de sus relaciones de carga. En esta especificación las relaciones de cargas se definen de acuerdo con Felgner y col., Human Gene-Therapy 8, 511-512 (1997) como:
Relación de carga = \frac{\text{Equivalentes de carga positiva del total de componentes catiónicos}}{\text{Equivalentes de carga negativa del total de componentes aniónicos}}
El total de componentes catiónicos comprende los constituyentes catiónicos, tales como los lípidos catiónicos. El total de componentes aniónicos comprende los constituyentes aniónicos, tales como los lípidos aniónicos, y la sustancia biológicamente activa netamente aniónica.
Los complejos de la presente invención pueden ser positivos, pero preferiblemente son negativos. Preferiblemente, los complejos presentan relaciones de carga de aproximadamente 0,01-10, más preferiblemente de aproximadamente 0,01-1,0, y aún más preferiblemente de aproximadamente 0,01-0,9. Por ejemplo, una formulación Neutraplex^{TM} que contiene 1 mg de DOGS (3 cargas positivas/molécula, 1263 MW), 1 mg de DOPE (carga eléctrica neta 0), 0,5 mg de Cardiolipina (2 cargas negativas/molécula, 1573 MW) presenta una relación de carga teórica de 2,14 y 0,68 cuando se añaden 10 y 60 \mug de pADN (1 carga negativa/340 g), respectivamente. Experimentalmente, el potencial zeta, expresado como mV, es indicativo de la relación de carga de la partícula. El potencial zeta puede ser determinado mediante un analizador de potencial zeta.
Para las membranas de los complejos de la invención es preferible no tener componentes que provoquen efectos secundarios no deseados, distintos a las partículas de sustancia activa. Los efectos secundarios no deseados incluyen, por ejemplo, inmunogenecidad o toxicidad no deseadas. Para las membranas de los complejos de la invención es particularmente preferido no tener partículas víricas, tales como, por ejemplo, partículas de HVJ.
Las sustancias activas combinadas con vesículas en los complejos de la invención son sustancias preferiblemente biológicas o químicas con un efecto biológico y, preferiblemente, con propiedades terapéuticas, profilácticas (es decir, de vacuna) o de diagnosis.
La invención está dirigida en particular a sustancias activas que son compuestos netamente negativos o polianiones. Algunos ejemplos preferidos incluyen moléculas de ácido nucleico de cadena doble o sencilla, genomas víricos, partes de genomas víricos, genomas procariontes, partes de genomas procariontes, cromosomas, o partes de cromosomas. Algunos ejemplos de moléculas de ácido nucleico incluyen las secuencias de ADN o de ARN, oligonucleótidos, y ribozimas. También se pueden incluir otros compuestos en los complejos de la invención, por ejemplo otros polianiones tales como la heparina y los gangliósidos, o compuestos netamente negativos elegidos entre proteínas, péptidos, lipoproteínas, glicolípidos, hormonas, nucleósidos y vitaminas así como sus conjugados. El sistema de la invención permite la vectorización de al menos una sustancia biológicamente activa. También es posible preparar complejos asociando varias sustancias biológicamente activas, elegidas en particular de entre las mencionadas antes, en una partícula laminar.
El sistema de la invención es particularmente adecuado para el transporte de ácidos nucleicos. La sustancia activa puede, por ejemplo, ser un ADN que codifica una proteína, tal como las elegidas en el siguiente grupo: mediadores celulares (por ejemplo citoquinas, factores de crecimiento, quimioquinas e interleucinas, etc.), factores de transcripción, proteínas de membrana, proteínas víricas y epítopos, factores de coagulación sanguínea, hormonas, etc.
Los complejos de la invención preferiblemente son de un tamaño que puede fluir fácilmente a través de pequeños capilares sanguíneos de mamíferos, tales como los humanos. En consecuencia, los complejos de la invención son preferiblemente más pequeños de 400 nm.
La invención también cubre composiciones fabricadas a partir de complejos idénticos o diferentes a los descritos anteriormente, en un medio compatible con la sustancia activa, es decir un medio farmacéuticamente aceptable, y que asegure la retención de la carga neta neutra o negativa de los complejos de la invención.
En una realización preferida, se usan vesículas unilaminares catiónicas o neutras con una membrana interdigitada en la preparación de los complejos netamente aniónicos o neutros de la invención. Para los propósitos de esta especificación, una membrana interdigitada es una membrana lípida en la que las colas hidrófobas de las moléculas lipídicas no están enfrentadas cabeza con cabeza, sino que están interconectadas. En otras palabras, las colas hidrófobas en la bicapa membrana ya no están enfrentadas unas a otras. El espacio entre las colas adyacentes ha sido eliminado significativamente, y las colas se mezclan unas con otras, aumentando con ello la fluidez de la membrana. Las membranas están constituidas por un constituyente catiónico, un constituyente aniónico, y, opcionalmente, por un constituyente neutro. Al menos uno de los constituyentes catiónico y aniónico se preferiblemente un lípido.
Las vesículas de la invención presentan la ventaja de ser de pequeño tamaño y de estar hechas de membranas interdigitadas y/o de SUV (Vesículas Unilaminares Pequeñas), con una carga neta neutra o positiva.
Las vesículas de la invención están particularmente dirigidas a ser usadas en la composición de los complejos definidos anteriormente, y como resultado presentan las características establecidas cuando se ha descrito los complejos. Como resultado, el constituyente catiónico es una sustancia que condensa sustancias aniónicas.
Preferiblemente, el constituyente catiónico es un lípido. Si el agente activo que va a ser complejado con las vesículas de la invención es una molécula de ácido nucleico, tal como ADN o ARN, es particularmente preferible que el constituyente catiónico sea una sustancia que condense moléculas de ácido nucleico. Los constituyentes catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, las lipomonoaminas y las lipopoliaminas, tal como se ha mencionado antes.
Sin embargo, el constituyente catiónico también puede ser no lipídico si el constituyente aniónico es un lípido. Los constituyentes no lipídicos catiónicos, tal como se ha mencionado anteriormente, incluyen, en concreto, polipéptidos o polisacáridos catiónicos.
De forma similar, es preferible que el constituyente aniónico sea también un lípido, preferiblemente un fosfolípido, y en esta situación la invención específicamente se refiere a Cardiolipina y a sus derivados naturales o sintéticos. Pero el constituyente aniónico también puede ser no lipídico si el constituyente catiónico es un lípido. Cuando está presente, el constituyente neutro es preferiblemente un lípido neutro, tal como DOPE.
Por tanto, la invención también se refiere a composiciones que incluyen vesículas idénticas o diferentes de la invención en un medio compatible.
La invención también cubre la preparación de las anteriores vesículas y complejos, así como las composiciones que las contienen.
Los complejos neutros o negativos de la realización preferida de la invención son obtenidos mediante el uso de un tipo particular de vesícula descrita anteriormente y de un proceso para su formulación, junto con el uso de una composición que incluye la sustancia aniónica. Este proceso y esta composición están dirigidos a resolver, entre otros, el problema originado por la adición de la sustancia aniónica a una preparación de vesículas estables de estructura homogénea. Es conocido (Y. Xu., F. C. Szoka, Biochem. 35, 5616-5623, 1996) que la adición de una sustancia aniónica tal como el fosfolípido aniónico afecta enormemente a la estabilidad del complejo por competición relativa a interacciones electrostáticas entre el lípido catiónico y un poli anión tal como un ácido nucleico.
La preparación de los complejos y vesículas de la invención se caracteriza por el hecho de que el constituyente catiónico y el constituyente aniónico, al menos uno de los cuales es un lípido, preferiblemente un fosfolípido, son dispersados en uno o más disolventes polares hidrofílicos no acuosos, antes o durante el mezclamiento para la preparación de los vesículas de la invención.
El disolvente no acuoso puede ser prótico o aprótico, y es preferiblemente soluble en agua. Algunos ejemplos adecuados de disolventes próticos incluyen alcoholes que tienen de 1 a 4, preferiblemente de 2 a 3, átomos de carbono. Los alcoholes preferidos son etanol e isopropanol. Otros ejemplos de disolventes próticos incluyen etilenglicol, propilenglicol, y glicerol. Algunos ejemplos de disolventes apróticos incluyen dimetilsulfóxido, acetonitrilo y acetona.
Los disolventes polares hidrofílicos no acuosos pueden contener hasta aproximadamente el 50%, preferiblemente hasta aproximadamente el 40%, y más preferiblemente hasta aproximadamente el 30% de agua. En general, los disolventes para los constituyentes lipídicos contienen de forma ventajosa muy poca o ninguna agua, por ejemplo entre 0 y 5%, preferiblemente entre 0 y 3%, más preferiblemente entre 0 y 2%, y aún más preferiblemente entre 0 y 1%. Los disolventes para algunos constituyentes poliméricos hidrófobos contienen de forma ventajosa aproximadamente entre el 10 y el 20% de agua.
Más particularmente, el proceso para la preparación de complejos de acuerdo con la invención incluye las siguientes etapas:
a)
Un constituyente catiónico y un constituyente aniónico, al menos uno de los cuales es preferiblemente un lípido, y más preferiblemente un fosfolípido, son mezclados conjuntamente. Los constituyentes catiónico y aniónico pueden ser dispersados por separado en disolventes idénticos o distintos y a continuación ser mezclados, o pueden ser añadidos y dispersados conjuntamente en un disolvente. El disolvente es un disolvente polar hidrófilo no acuoso.
b)
Se añade un exceso de una disolución acuosa, tal como una disolución tampón o salina acuosa.
c)
Al menos una sustancia netamente aniónica biológicamente activa en disolución, preferiblemente una disolución acuosa, es añadida a la anterior mezcla.
En una versión preferida del anterior proceso, la etapa (a) comprende el mezclamiento en un disolvente de un constituyente catiónico con un constituyente aniónico, siendo al menos uno de estos constituyentes un lípido, preferiblemente un fosfolípido.
Más preferiblemente, los dos constituyentes, catiónico y aniónico, son lípidos. En este caso, las vesículas de la invención se preparan preferiblemente con aproximadamente de 0,1 a 5% (p/p) de lípidos en relación al disolvente, lo que favorece la formación de complejos supramoleculares con compuestos aniónicos, tales como el ADN.
Se muestra una preferencia especial por el uso de un disolvente polar hidrofílico no acuoso para mezclar los constituyentes catiónico y aniónico en la etapa (a) del proceso, y preferiblemente un disolvente alcohólico, tal como el etanol.
De forma conveniente, estos constituyentes catiónico y aniónico son mezclados en una relación molar de entre 0,1:2 y 10:1.
La disolución acuosa añadida en la etapa (b) preferiblemente consiste en agua, y es añadida a la mezcla de los constituyentes catiónico y aniónico en una proporción de aproximadamente 100 y 2000 \mul por mg.
En una aplicación preferida del proceso de la invención, la mezcla de la etapa (a) es preparada y mantenida hasta la etapa (b) a una temperatura de aproximadamente entre 30 y 50ºC.
El proceso de la invención también puede incluir la adición de un constituyente neutro, preferiblemente un lípido, en la etapa (a).
En un proceso de acuerdo con la invención en la que la sustancia netamente aniónica biológicamente activa en disolución es elegida entre ácidos nucleicos de cadena sencilla o doble, cromosomas o partes de cromosomas, secuencias de ADN o de ARN, oligonucleótidos u oligonucleótidos antisentido y ribozimas, se añade en la etapa (c) en una proporción de entre aproximadamente 10 y 500 \mug por mg de los constituyentes catiónico y aniónico.
Un método de aplicación preferido del proceso de la invención consiste en la etapa (a) de tomar una película de un lípido catiónico o aniónico con un volumen mínimo de disolución alcohólica con una carga opuesta a la de la película y como su límite de solvatación.
Si la película consiste en un lípido catiónico, la etapa (a) del proceso de la invención incluye que sea tomada en una disolución alcohólica de un lípido aniónico. Por el contrario, si la película consiste en un lípido aniónico, la etapa (a) del proceso de la invención incluye que sea tomada en una disolución alcohólica de un lípido catiónico.
El disolvente del lípido con una carga opuesta a la de la película de la etapa (a) es elegido entre disolventes polares hidrofílicos no acuosos tales como alcoholes que tengan de uno a cuatro átomos de carbono, preferiblemente el etanol e isopropanol, etilenglicol, propilenglicol, glicerol, DMSO, acetona y acetonitrilo.
Los constituyentes catiónicos, aniónicos y neutros usados en el proceso de la invención son similares a los definidos anteriormente para los complejos y vesículas de la invención.
Las vesículas de la invención son preparadas de acuerdo con las etapas (a) y (b) del proceso descrito anteriormente, con el fin de mantener la mínima relación posible de etanol a lipoplejo por razones farmacológicas de toxicidad, a la vez que se retienen las propiedades del disolvente para la movilidad de la membrana, esta invención propone un proceso óptimo para la preparación de las vesículas de la invención, incluyendo las siguientes etapas:
\bullet
secar DOGS en película a vacío;
\bullet
disolver esta película con una disolución alcohólica de Cardiolipina: etapa (a) anterior;
\bullet
calentar hasta una temperatura tibia para perfeccionar y asegurar una disolución completa;
\bullet
añadir un exceso de agua: etapa (b) anterior.
Más precisamente, se disuelve 1 mg de DOGS, opcionalmente seco, en 50 \mul de una disolución etanólica de 10 mg/ml de Cardiolipina. La relación preferida de constituyente catiónico (DOGS)/constituyente aniónico (Cardiolipina) es del orden de 0,05 a 10 (p/p).
Los complejos Neutraplex^{TM} pueden ser preparados extemporáneamente a partir de preparaciones de vesículas almacenadas a 4ºC después de la etapa (b). Idealmente, las sustancias biológicamente activas, más particularmente un ácido nucleico, son añadidas a las vesículas en concentraciones del orden de 10 a 500 \mug por mg de vesículas y de 10 a 2000 \mug/ml de preparación final.
Las preparaciones derivadas de la invención pueden ser obtenidas mediante la adición, durante al menos una de las etapas (a) a (c) o después de la etapa (c), de compuestos con propiedades que se sabe que mejoran el potencial de transporte de los lipoplejos en general:
\bullet
Estabilización de la estructura de la membrana, por ejemplo con colesterol.
\bullet
Aumento de la circulación en plasma, por ejemplo con derivados basados en PEG (polietilenglicol).
\bullet
Selección de células mediante la adición de ligandos o de anticuerpos.
\bullet
Protección de la estructura de ADN, por ejemplo con histonas o con nucleoproteínas.
\bullet
Desenrollado del ADN para la transcripción, por ejemplo con topoisomerasa u otros factores de transcripción.
\bullet
Adición de polianiones tales como oligodesoxinucleótidos o policationes tales como polilisina.
Un aspecto destacable del proceso de la invención incluye el uso de un disolvente polar hidrofílico no acuoso durante la formulación. El disolvente preferido es etanol. Además de sus propiedades como disolvente, el disolvente polar hidrofílico no acuoso también es útil como detergente haciendo el papel de tensioactivo. El disolvente polar hidrofílico no acuoso facilita la movilidad en el interior hidrofílico de membranas lipídicas y se mantiene en la bicapa de lípidos constituida por un compuesto catiónico y por un compuesto aniónico. Si la sustancia activa es un ácido nucleico, el disolvente polar hidrofílico no acuoso también facilita el deslizamiento y la envoltura del ácido nucleico altamente aniónico sobre las superficies exterior e interior cargadas catiónicamente de las bicapas de vesículas con un equilibrio termodinámico.
La sustancia biológicamente activa netamente catiónica, habitualmente un ácido nucleico, condensa a continuación la bicapa de lípidos y se asocia a las dos superficies polares, reorientando las partes polares de la membrana hacia la cadena polianiónica. Esto conduce a una reacción de auto-ordenamiento espontánea que da como resultado una nueva estructura estable, denominada Neutraplex^{TM}. La sustancia biológicamente activa netamente aniónica forma una parte integral de la estructura de la partícula del Neutraplex^{TM}.
En la técnica anterior, los lipoplejos y poliplejos con carga neutra o negativa han sido descritos. Al contrario que el Neutraplex^{TM}, sin embargo, los lipoplejos y poliplejos de la técnica anterior fueron formados mediante una simple agregación. Por otro lado, el Neutraplex^{TM} se forma a partir de un cambio repentino y espontáneo en la estructura particulada inicialmente liposomal (unilaminar), que entra en una fase cristalina líquida, y se transforma en una estructura particulada laminar condensada y enrollada, de forma esférica, y estable, tal como se muestra en las Figuras 1 y 2.
En otras palabras, los complejos de la invención presentan forma esférica. La forma esférica tiene una microestructura helicoidal que comprende capas enrolladas del polianión asociadas a las superficies polares de la mezcla de los constituyentes catiónico y aniónico.
La fase cristalina líquida de los complejos de acuerdo con la invención, a veces puede exhibir también una estructura hexagonal. Además, tanto las fases laminares como las hexagonales pueden coexistir en la misma partícula (Figura 1B). La longitud y el tipo de fármaco aniónico pueden influir en la transición entre las dos fases. La estructura del complejo según la invención podría corresponderse a la fase cristalina hexagonal 3-D del ADN, tal como se ha descubierto en virus fagos (M. E. Cerriteli y col., Cell. 91, 271-280 (1997); J. Lepault, J. Dubochet, W. Baschong, E. Kellenberger, EMBO J. 6, 1507-1512 (1987)). La fase hexagonal es propensa a fusionarse con las membranas de la célula objetivo y a entregar intracelularmente los compuestos biológicos, mientras que la fase laminar es propensa a condensar y proteger eficazmente los compuestos biológicos.
De este modo, aumentando la fluidez de la membrana, el disolvente polar hidrofílico no acuosos facilita el equilibrio termodinámico que conduce a la creación de esta estructura particulada a pesar de las fuerzas iónicas opuestas de los diversos constituyentes, y proporciona lipoplejos neutros o negativos (complejos Neutraplex^{TM}). Algunos disolventes polares hidrofílicos no acuosos adecuados se mencionan anteriormente. El disolvente preferido es etanol. Además de la Cardiolipina, que es propensa a formar una fase hexagonal, el disolvente ayuda a obtener la fase cristalina líquida hexagonal en los complejos Neutraplex^{TM}.
Como ejemplo de la estabilidad alcanzada mediante el proceso descrito en esta especificación, las partículas de Neutraplex^{TM} preparadas como en el ejemplo 2 son estables incluso después de concentrar los materiales. Tras diálisis en dextrano, se obtuvo una preparación estable de Neutraplex^{TM} que contiene 1 mg/ml de pADN y 7,8 mg/ml de lípidos. Adicionalmente, se puede alcanzar una eficacia de transfección equivalente o superior en un cultivo celular en presencia de suero a la que puede ser alcanzada en ausencia de suero.
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También es posible fabricar partículas de acuerdo con la invención usando un constituyente catiónico o una mezcla de un constituyente catiónico y un constituyente neutro, es decir en ausencia de un constituyente aniónico.
Otras ventajas y características de la invención emergen de los ejemplos presentados a continuación, referidos a la preparación y a la utilización de los complejos y vesículas de la invención:
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de vesículas Nx1D de composición DOGS/Cardiolipina
1 mg de lipopoliamina catiónica DOGS solubilizada en etanol es evaporado hasta sequedad en un tubo rotatorio de vidrio de borosilicato de fondo redondo. La película de lípido seco obtenida es resuspendida en 50 \mul de una disolución de Cardiolipina en etanol (10 mg/ml). La relación DOGS/Cardiolipina es 1/0,5. La resuspensión está favorecida por una agitación suave y por calefacción del tubo en un baño a 30-35ºC durante 15 minutos. A continuación se añaden rápidamente 350 \mul de agua desionizada esterilizada a la disolución de lípido y la mezcla es agitada suavemente empleando un mezclador de remolino. La preparación puede ser almacenada a 4ºC.
Ejemplo 2 Preparación de Neutraplex^{TM} Nx1D/pADN con la composición DOGS/ Cardiolipina/ pADN
Una preparación de DOGS/Cardiolipina preparada tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 es diluida en una disolución de NaCl 150 nM (25 \mul de preparación en 50 \mul de disolución NaCl 150 mM) y es dejada a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añaden rápidamente treinta \mug de pADN diluido en una disolución tampón (60 \mul) a una preparación y la mezcla es agitada suavemente y a continuación es homogeneizada. La preparación de lipoplejos obtenida de este modo es incubada durante una hora a temperatura ambiente y es almacenada a 4ºC. Los complejos obtenidos tienen una carga neutra: estos son los complejos Neutraplex^{TM}.
Ejemplo 3 Preparación de vesículas Nx2D con la composición DOGS /DOPE /Cardiolipina
1 mg de lipopoliamina catiónica DOGS y 1 mg de DOPE solubilizados en etanol son evaporados hasta sequedad en un tubo giratorio de vidrio de borosilicato con el fondo redondo. La película de lípido seco obtenida es resuspendida en 50 \mul de una disolución de Cardiolipina en etanol (10 mg/ml), siendo la relación másica DOGS/ DOPE/ Cardiolipina de 1/1/0,5. La resuspensión está favorecida por una agitación suave y por calefacción del tubo en un baño a 30-35ºC durante 15 minutos. A continuación se añaden rápidamente 350 \mul de agua desionizada esterilizada a la disolución de lípido y la mezcla es agitada suavemente empleando un mezclador de remolino. La preparación puede ser almacenada a 4ºC.
Ejemplo 4 Preparación de Neutraplex^{TM} Nx2D/pADN con la composición DOGS/ DOPE/ Cardiolipina
Una preparación de DOGS/DOPE/Cardiolipina preparada tal como se ha descrito en el Ejemplo 3 es diluida en una disolución de NaCl 150 nM (25 \mul de preparación en 50 \mul de disolución NaCl 150 mM) y es dejada a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añaden rápidamente 30 \mug de pADN diluido en una disolución tampón (70 \mul) a una preparación y la mezcla es agitada suavemente y a continuación es homogeneizada. La preparación de lipoplejos obtenida de este modo es incubada durante una hora a temperatura ambiente y es almacenada a 4ºC. Los complejos obtenidos tienen una carga neutra. Si se añaden más de 30 \mug de pADN, los complejos presentan una carga negativa.
Ejemplo 5 Optimización de la formulación de complejos Neutraplex^{TM}
Se han evaluado diversos tipos de formulación para obtener una suspensión estable y homogénea de vesículas como resultado de la mezcla de un lípido catiónico (DOGS) y de un lípido aniónico (Cardiolipina = CL). Las formulaciones comparadas son:
A = suspensión de película de lípido en agua.
B = suspensión de película de lípido en etanol.
C = mezcla de lípidos catiónicos y aniónicos en una disolución etanólica.
D = suspensión de película de lípidos catiónicos con una disolución etanólica de un lípido aniónico.
La Tabla 5-1, presentada a continuación, muestra los resultados obtenidos con las anteriores formulaciones usando diversos lípidos y una concentración de ADN fija de 30 \mug de ADN/60 \mug de DOGS.
TABLA 5-1 
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1 
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La Tabla 5-1 muestra que sólo las formulaciones C y D, resultantes de una mezcla de lípidos catiónicos y aniónicos en una disolución etanólica y la adición de Cardiolipina en una disolución etanólica (EtOH) a una película seca de lípido catiónico, respectivamente, dieron como resultado una suspensión de vesículas y la formación de complejos Neutraplex^{TM} homogéneos y estables.
Ejemplo 6 Análisis de partículas de los complejos y vesículas de la invención
Se usó un analizador de dispersión láser (dispersión de luz dinámica) para el análisis de las partículas.
Los resultados obtenidos a partir de las composiciones de vesículas preparadas de acuerdo con los ejemplos 1 (Nx1D) y 3 (Nx2D) y a partir de los complejos Neutraplex^{TM} preparados de acuerdo con las formulaciones descritas en el ejemplo 2 (Nx1D/pADN) y el ejemplo 4 (NxD/pADN) se muestran en la Tabla 6-1 siguiente.
TABLA 6-1
2
La z media es el tamaño medio de la población de partículas en nanómetros.
El coeficiente de polidispersidad proporciona una evaluación de la homogeneidad de la población de partículas. En vista de la naturaleza de las vesículas de la invención, se considera que una polidispersidad inferior a 0,350 es aceptable.
Los resultados muestran que las preparaciones de partículas Nx1D y Nx2D presentaron tamaños medios pequeños y formaron una población homogénea. Las preparaciones de complejos que comprenden ADN presentaron mayor tamaño medio que las preparaciones de vesículas, sin ADN. La preparación Nx2D/pADN y, en menor medida, la preparación Nx1D/pADN presentaron una homogeneidad aceptable. Las preparaciones Nx2D/pADN demostraron ser reproducibles y muy estables después de un mes de almacenamiento a 4ºC.
Ejemplo 7 Ultraestructura de los complejos multilaminares
El uso de Microscopía crio-Electrónica (cryoEM) permite la visualización de macromoléculas de ADN en la estructura Neutraplex^{TM} en combinación con otros métodos analíticos, proporcionando un punto de vista crucial del fenómeno de empaquetamiento de ADN en las partículas de entrega de Neutraplex^{TM}.
Un estudio de la preparación de vesículas Nx2D de acuerdo con el ejemplo 3 sólo mostró la presencia de vesículas esféricas unilaminares de tipo liposomal (Figura 1A). El espesor de la membrana de estas vesículas (50 Angstroms) fue inferior al de las partículas liposomales clásicas (60 Angstroms) y esto sugiere la existencia de interdigitaciones debidas a la reorganización de los lípidos en presencia de alcohol.
Los complejos Neutraplex^{TM} formados con el pADN pBKd1 RSVluc (10,4 kpb) y las vesículas preparadas con DOGS, DOPE y Cardiolipina fueron sometidos a Cryo-EM. Tal como se muestra en la Figura 1, el examen mediante cryoEM revela partículas esféricas que presentan dos tipos de estructuras: principalmente (>80% del total de partículas) una organización multilaminar de estructura similar a la esperulita y, en menor medida (<20%), una disposición de agujas. La distinción de la estructura de anillo concéntrico anterior y el número de capas concéntricas depende del condensado esférico observado. Normalmente, se observan de 5 a 10 cubiertas concéntricas rodeando un área central de estructura apuntada. No se pudo observar SUV libre en los cuadrados de las rejillas en la Figura 1B. Todos los complejos son altamente sensibles a los rayos de electrones, lo que indica una elevada densidad de materia y también sugiere la presencia de ADN. Más precisamente, la cryoEM (Figura 1B) reveló que la estructura de anillos concéntricos está compuesta por capas alternas que parecen estriadas transversalmente y por capas con una baja densidad. Basándose en las imágenes de cryoEM, el espesor de las capas estriadas tiene un valor medio de 5,3 nm con una periodicidad de 7,5 nm. La capa estriada exterior tiene un espesor de 4,1 nm. Colocadas perpendicularmente a estas capas, se pueden observar unas débiles estrías principalmente en el límite y también dentro de las partículas. Estas estrías son de 2,0 nm de espesor con una periodicidad de 3,4 nm (Figura 1B).
El análisis mediante SAXS de una muestra de Nx2D/pADN (Figura 2B) reveló tres picos de difracción: uno que indica un espaciado repetido de 2 \phi/0,094 = 6,9 +/- 1 nm, y el segundo y el cuarto orden que indican que la estructura es de multicapa (2 \phi/0,18). La anchura relativa de la difracción de rayos X sugirió la presencia de partículas altamente ordenadas similares a la esferulita compuestas por al menos una docena de capas. De este modo, el SAXS confirmó claramente la estructura multilaminar del Nx2D/pADN y la periodicidad observada con la cryoEM. El examen con dispersión de luz dinámica indicó un tamaño medio de Neutraplex^{TM} de 254 nm (anchura: 108 nm) y presentó una población monomodal con una polidispersidad de 0,193 (Figura 2C). Esta estructura de esferulita con diferentes regímenes de empaquetamiento también fue observada mediante cryoEM cuando se usa un ADN de cadena doble lineal, un ADN de cadena sencilla y oligodesoxinucleótidos (datos no mostrados). Es interesante destacar que la fracción de partículas que presenta una disposición apuntada es superior (de hasta el 50%) en el Neutraplex^{TM} formado con ADN de doble cadena lineal, ADN de cadena sencilla. Dicha organización supramolecular específica es el resultado de fuerzas termodinámicas, lo que provoca que se produzca la compactación a través de las espiras concéntricas del ADN en una fase cristalina líquida.
Hemos empaquetado ADN de fago T4 (Sigma, St. Louis, EE.UU.) en Neutraplex^{TM} usando la misma formulación anterior. La cryoEM mostró partículas de forma esférica que presentan una disposición apuntada rodeada por una capa fina y partículas laminares (Figura 2A). Con menos partículas, pudimos observar la estructura multilaminar como se ha descrito anteriormente para el caso del Neutraplex^{TM} compuesto por otros tipos de ADN evaluados aquí. Tal como se observa en la cryoEM, la distribución de tamaños de estas partículas rellenas de ADN T4 apuntadas presenta un diámetro medio de 62 nm (n = 38). A veces, algunos elementos de estría apenas son detectables en las partículas de Neutraplex^{TM}-T4 y de fago T4 (Figura 2A). Los espectros de SAXS son completamente diferentes a los obtenidos para el Neutraplex^{TM}-pADN como se muestra en la Figura 2B. Se observan tres reflexiones con relaciones de espaciado de 1:v3:v4 en unidades Q. Algunas veces también se detectan dos reflexiones muy débiles con relaciones de espaciado de 1:v7:v9 (no visibles en la Figura 2B). Esto indica la presencia de una estructura hexagonal entre las cadenas de ADN paralelas rodeada por lípidos. Los parámetros a_{H} (espaciado entre dos moléculas de ADN) de esta estructura hexagonal parecen depender de los especimenes. Se obtienen valores que oscilan entre 7 y 8 nm. A la inversa, la especie mayoritaria es la esferulita/estructura concéntrica en las imágenes cryoEM de Neutraplex^{TM}-pADN, lo que corrobora la laminaridad detectada mediante SAXS. Como las estructuras laminar y apuntada estaban asociadas en determinadas partículas de lipoplejo (Lx, del inglés "lipoplex"), las fases cristalinas líquidas y las hexagonales pueden coexistir en la misma partícula. Como el ADN de T4 es más de 16 veces más largo que el pADN usado en este estudio, la longitud y el tipo de ADN podrían influir en la transición entre ambas fases.
Las imágenes cryoEM; de las partículas de Neutraplex^{TM} apuntadas formadas con ADN de T4 que observamos son sorprendentemente similares a las imágenes de la fase lambda (Lepault y col.), del mutante con una completa eliminación de la cola de T4 (Lepault y col.) y de fagos T7 (Cerittelli y col.). Estas partículas de fago relacionadas con T4 mostraron una forma esférica y un diámetro medio de 80 nm^{30}. Investigaciones recientes (Lepault y col., Cerittelli y col.) llevadas a cabo usando mutantes sin cola indicaron que el empaquetamiento de ADN predomina en partículas víricas. Cabe destacar que los mutantes de eliminación de cola de T7 presentan en las imágenes cryoEM una estructura de anillo concéntrico así como una estructura apuntada tal como la observada en el Neutraplex^{TM} (Nx)-pADN. Las imágenes cryoEM de Neutraplex^{TM}-T4 y -pADN y el SAXS ilustran la transición estructural de fases laminares a hexagonales en el Neutraplex^{TM}. Esta fase cristalina líquida hexagonal es el resultado del uso de un disolvente acuoso no hidrófilo y de compuestos tales como el DOPE o la Cardiolipina. Cerritelli y col. Indicaron que el estado de compactación de ADN en partículas fago víricas debería corresponder a la fase cristalina hexagonal 3-D del ADN. El Nx1D-pADN de acuerdo con el Ejemplo 2 presenta también la fase cristalina líquida laminar. La observación mediante cryoEM de los Neutraplex^{TM} se realizó en un medio que contenía sal y fue reproducible hasta al menos tres meses.
Este estudio proporcionó evidencia del cambio radical en la estructura de la partícula después de la adición de ADN a las vesículas. El complejo en forma de partícula núcleo-lípido obtenido no es el resultado de la simple agregación sino de una reorganización supramolecular que conduce a partículas estables con una estructura definida y relativamente homogénea.
Ejemplo 8 Transfección in vitro usando complejos Neutraplex^{TM}
Células embriónicas humanas 293 de riñón, en cultivo medio confluente, fueron expuestas a una preparación de Nx2D/pGFP-ADN (2 \mug). El plásmido pGFP-ADN codifica GFP (Proteína Fluorescente Verde, del inglés "Green Fluorescent Protein") que es una proteína fluorescente fácilmente detectable con luz UV 48 horas después de entre el 70 y el 80% de transfección de la células que expresan GFP. El nivel de transfección fue equivalente a cuando se usó la misma preparación de Nx2D/pADN tres semanas después del almacenamiento a 4ºC.
Ejemplo 9 Expresión de factor IX humano en sangre de ratón después de la administración intravenosa usando el sistema Neutraplex^{TM}
El gen del Factor IX humano (hFIX) insertado en un plásmido de expresión (pLIXSN) fue asociado al sistema Neutraplex^{TM} de acuerdo con el Ejemplo 2 (Nx1D/pADN) y con el Ejemplo 4 (Nx2D/pADN) y fue administrado IV a través de una vena caudal a ratones Negros 6 C57. Estos ratones no desarrollaron anticuerpos específicos para el Factor IX humano. Se administraron 20 \mug de pLIXSN-ADN en forma de complejos Nx1D/pLIXSN-ADN Neutraplex^{TM} por ratón. Se tomó muestras de sangre del seno retro-orbital de los ratones 2,5 días después de la inyección y fueron colocadas en tubos que contienen heparina o citrato, y fueron almacenadas a -20ºC. El hFIX fue detectado extemporáneamente usando un ensayo ELISA.
La Tabla 9-1 mostrada a continuación resume los resultados obtenidos.
TABLA 9-1
Formulación Ratón hFIX (ng/m)
Nx1D/pLIXSN 1 8,6
2 4,7
3 5,8
4 2,3
5 1,2
Media : 4,5
Nx2D/pLIXSN 1 4,3
2 18,5
3 4,4
4 4,8
5 2,8
Media : 6,7
Los resultados obtenidos muestran que la inyección de cualquier preparación de Neutraplex^{TM} indujo una expresión significativa de hFIX en la sangre en circulación. Se descubrió que los niveles de hFIX eran entre 5 y 10 veces superiores que los descubiertos en el pasado después de la transferencia génica usando vectores sintéticos (Baru y col., Gene 161, 143-150, 1995).
Ejemplo 10 Formulación Neutraplex^{TM} con varios ácido nucleicos
Las formulaciones Neutraplex^{TM} fueron fabricadas con diversos tipos de ácidos nucleicos, tales como ADN lineal de doble cadena, ADN lineal de cadena sencilla, ARN y oligodesoxinucleótidos (Tabla 10-1). Los ácidos nucleicos fueron formulados todos como se ha descrito anteriormente para el Ejemplo 2 y todos dieron lugar a complejos en forma de partículas monodispersos multilaminares estables. La estructura multilaminar todavía se observaba mediante cryoEM en estos complejos Neutraplex^{TM} varios meses después de la preparación, lo que demuestra su elevada estabilidad.
TABLA 10-1
Ácido nucleico Tamaño (polidispersidad)
ADN lineal de cadena doble 221 nm (0,048)
ADN lineal de cadena doble larga 224 nm (0,198)
ADN lineal de cadena sencilla 261 nm (0,113)
ARN 188 nm (0,172)
Oligodesoxinucleótidos 184 nm (0,045)
El ADN lineal de cadena doble larga es el ADN del fago T4 (162.372 pares base). El ADN de cadena sencilla (M13mp8, 7.229 bases) es el ADN procedente de derivados de bacteriófago M13. El ADN lineal de doble cadena (M13mp8, 7229 pares base) es la forma replicativa intracelular del fago M13mp8 producida mediante infección crónica en E. Coli (Sigma, St. Quentin, Francia), ARN (ribonucleótido) es el ARN ribosomal 18S y 28S procedente de hígado de ternero (2000 y 5300 bases), el ODN es un oligodesoxinucleótidos de 27 bases. (Xba I, Promega,
WI).
Ejemplo 11 Uso de componente lipídico monocatiónico en formulaciones Neutraplex^{TM}
Los fosfonolípidos tales como los fosfonolípidos dioleoiltrimetilamonio (C_{18}H_{35}O)_{2}-P=O-N(CH_{3})_{3}, (GLB.43) y dimiristoiltrimetilamonio (C_{14}H_{29}O)_{2}-P=O-N(CH_{3})_{3}, (GLB.73), son lípidos monocatiónicos que dieron lugar a partículas monodispersas con pADN (pCMV\betagal, 7,2 kb, CLONTECH) cuando fueron formulados en Neutraplex^{TM} (Tabla 11-1, Neutraplex^{TM} nº 1-8). Estas preparaciones fueron añadidas a células HeLa (2 \mug de pADN/400.000 células). Después de una incubación de dos días en un suero que contiene medio de cultivo, las células fueron cosechadas y se determinó la actividad de \beta-galactosidasa usando el Ensayo Promega. El Neutraplex^{TM} resultante mostró una elevada eficacia de transfección en las células cultivadas (Tabla 11-1). El Neutraplex^{TM} con carga negativa (es decir, el Neutraplex^{TM} nº 4) presenta, en las condiciones usadas en este experimento, una mayor eficacia de transfección en comparación con los de carga positiva (esto es, el Neutraplex^{TM} nº 3).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 11-1
3
Ejemplo 12 Uso de derivados de Cardiolipina y de fosfatidilserina como componente aniónico en los Neutraplex^{TM}
El dioleoildifosfatidilglicerol (Cardio-C18) y el dimiristoildifosfatidilglicerol (cardio-C14) son derivados sintéticos de la Cardiolipina (Avanti, AL, EE.UU.) y fueron usados en lugar de la Cardiolipina natural extraída en las formulaciones Neutraplex^{TM}. Los complejos estables fueron formados con pCMV\betagal (Tabla 11-1, Neutraplex^{TM} nº 1-5 y 8). El Neutraplex^{TM} formado mostró una elevada eficacia de transfección en las células cultivadas.
La dioleoilfosfatidilserina y la dimiristoilfosfatidilserina (Pserina-C18 y Pserina-C14, respectivamente) son fosfolípidos aniónicos usados en lugar de la Cardiolipina natural extraída en la formulación de Neutraplex^{TM} (Tabla 11-1, Neutraplex^{TM} nº 6 y 7). Se formaron complejos estables con pCMV\betagal. Las partículas de Neutraplex^{TM} formadas mostraron una elevada eficacia de transfección en las células cultivadas (Tabla 11-1).
Ejemplo 13 Uso de colesterol como componente neutro en las formulaciones de Neutraplex^{TM}
Se usó colesterol como componente neutro en la formulación de Neutraplex^{TM}. Los complejos resultantes con pCMV\betagal formaron partículas monodispersas estables. El Neutraplex^{TM} formado mostró una elevada eficacia de transfección en células cultivadas (Tabla 11-1, Nx4, 6-8). Las partículas de Neutraplex^{TM} formuladas sin un componente neutro (Nx5) con los mismos componentes positivos y negativos, y con la misma cantidad de ADN (Nx4, Nx5) mostraron menores eficacias de transfección. Además, cabe destacar que la eficacia de transfección de los Neutraplex^{TM} tanto positivos como negativos fue igual o superior en presencia de suero que en ausencia de suero (4 horas de incubación), lo que indica su elevada estabilidad en un entorno biológico.
Ejemplo 14 Uso de polímeros en formulaciones Neutraplex^{TM}
Se usó poli-L-glutamato (Sigma) de 1000 MW, un polímero peptídico cargado negativamente que contiene seis cargas por molécula, en la formulación de Neutraplex^{TM} en lugar del constituyente negativo. Se añadió el poli-L-glutamato a la película lipídica en 50 ó 150 \mul de etanol al 90% (1 mg/ml).
Se derivatizó Glucidex 6 QAE, un polímero de polisacáridos catiónico de dieciséis unidades de azúcar, con cationes (1,82 mEq/mg). Se usó el Glucidex 6 QAE en la formulación de Neutraplex^{TM} en lugar del constituyente positivo. Se añadió al lípido neutro en 200 \mul de etanol al 80% (6,6 mg/ml) para formar una película seca. Se formaron SUV después de la adición de agua a la mezcla de etanol. El pADN (pCMV\betaGal) y los SUV fueron diluidos en agua antes de ser mezclados. La distribución de tamaños y la carga de las partículas resultantes fueron analizadas mediante Dispersión de Luz Dinámica con un ZetaSizer 3000 de Malvern.
Algunas preparaciones fueron añadidas al cultivo de células HeLa y la actividad de \beta-galactisidasa fue determinada mediante espectrometría usando el Ensayo Promega (Promega, Paris). Los experimentos de transfección fueron llevados a cabo por duplicado. Los resultados se resumen en la Tabla 14-1:
TABLA 14-1
4
5
Los datos obtenidos con las preparaciones de control 1 a 5 que no contienen poli-L-glutamato mostraron que no se podían obtener partículas cargadas incluso en presencia de 60 \mug de pADN/2 mg de lípido. Si se añade ácido poliglutámico (preparaciones Neutraplex^{TM} 6-10), aparecieron partículas cargadas negativamente, demostrando la incorporación de ácido glutámico en los complejos. Por el contrario, la adición de una concentración creciente de pADN está relacionada con un descenso del potencial, lo que indica la transición a partículas cargadas negativamente (preparaciones Neutraplex^{TM} 6-10). Las formulaciones Neutraplex^{TM} nº 6 y nº 9 (cargadas positivamente) y nº 10 (cargada negativamente) dieron como resultado la expresión transgénica con 3,1, 2,9 y 2,2 mU/ml.
Los datos obtenidos con las preparaciones de control nº 11-13 mostraron que en ausencia de un constituyente catiónico, no se pueden formar complejos o partículas. En presencia de Glucidex 6 QAE en lugar del constituyente catiónico (Nx4), los complejos en forma de partículas se forman con ADN. La adición de concentraciones crecientes de pADN coincidió con una disminución del potencial zeta, lo que indica la transición a partículas cargadas negativamente (preparaciones Neutraplex^{TM} 14-16).
Ejemplo 15 Uso de detergentes en formulaciones Neutraplex^{TM}
El CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio), un detergente catiónico (anfifílico), fue usado como componente catiónico en una formulación Neutraplex^{TM}. Cuando se formulan 15 \mug y 60 \mug de pCMV\betagal con 0,8 mg de CTAB, 1 mg de DOPE y 0,5 mg de Cardiolipina, las preparaciones dieron lugar a partículas estables y monodispersas (222 nm, polidispersidad de 0,028; y 205 nm, polidispersidad de 0,172, respectivamente) y a un potencial zeta de 17 y -37 mV, respectivamente. La presencia de células transfectadas fue detectada mediante análisis histoquímico de \beta-galactosidasa.
El lisofosfatidilglicerol, un detergente aniónico (anfifílico), fue usado como componente aniónico en una formulación Neutraplex^{TM}. Cuando se formulan 15 \mug y 64 \mug de pCMV\betagal con 1,8 mg de GLB.43, 0,5 mg de colesterol y 0,5 mg de lisofosfatidilglicerol, las preparaciones dieron lugar a partículas estables y monodispersas (196 nm, polidispersidad de 0,187; y 308 nm, polidispersidad de 0,186, respectivamente) y a un potencial zeta de 64 y -8 mV, respectivamente. La eficacia de transfección de las anteriores formulaciones Neutraplex^{TM}, cuando se añaden 60 mg de ADN presentaron 2,1 mU de \beta-gal.
Ejemplo 16 Uso de nucleósido como agente terapéutico negativo para administrar en una formulación Neutraplex^{TM}
El 8-azidoadenina-5'-monofosfato (AZA) es un nucleósido que es similar al AZT, el fármaco antivírico usado para la terapia del VIH. Debido a su naturaleza aniónica (una carga/molécula, 388,2 MW), el AZA fue formulado en una partícula de Neutraplex^{TM} tal como se ha descrito en el Ejemplo 2 como un ejemplo de una sustancia biológicamente activa usada en lugar de los ácidos nucleicos. Se añadió AZA diluido en agua (5 mg/ml) a las vesículas.
Los resultados se resumen en la Tabla 16-1.
TABLA 16-1
6
Los complejos resultantes obtenidos mostraron una elevada estabilidad y un tamaño de población monodisperso cuando se añade AZA. El aumento de la concentración de AZA dio como resultado una disminución del potencial zeta, lo que demuestra la incorporación creciente de AZA en el Neutraplex^{TM}.
Ejemplo 17 Uso de isopropanol como disolvente en la formulación Neutraplex^{TM}
Se usó isopropanol como disolvente no acuoso para la preparación de SUV fabricada a partir de 1,8 mg de GLB.43, 0,5 mg de colesterol y 0,5 mg de cardio-C14:0. Cuando se mezcla 15 y 40 \mug de pCMV\betagal con dicho SUV, se obtuvieron complejos en forma de partículas estables y monodispersos (231 nm, polidispersidad 0,026, 69 mV; y 233 nm, polidispersidad 0,114, - 27 mV, respectivamente).

Claims (29)

1. Un complejo en forma de partícula, estable, que presenta una carga neta negativa o neutra, forma esférica, y una estructura particulada condensada, enrollada y laminar, comprendiendo el complejo una sustancia biológicamente activa aniónica y una mezcla de un constituyente catiónico y un constituyente aniónico, en el que al menos uno de los constituyentes catiónico y aniónico es un lípido.
2. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mezcla comprende además un constituyente neutro.
3. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el complejo presenta una relación de carga de aproximadamente 0,01 a 1.
4. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el que el complejo presenta una relación de carga de aproximadamente 0,01 a 0,9.
5. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el constituyente catiónico es capaz de condensar la sustancia biológicamente activa netamente aniónica.
6. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el lípido es un fosfolípido.
7. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el constituyente catiónico comprende una lipomonoamina o una lipopoliamina.
8. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la lipopoliamina comprende DOGS.
9. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el constituyente aniónico comprende un difosfatidilglicerol.
10. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el difosfatidilglicerol es Cardiolipina.
11. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que tanto el constituyente catiónico como el constituyente aniónico son lípidos.
12. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 11, en el que los lípidos son fosfolípidos.
13. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 9 a 10, en el que el constituyente catiónico es un no lípido.
14. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el constituyente aniónico es un no lípido.
15. Un complejo de acuerdo con las reivindicaciones 13 ó 14, en el que el no lípido es un polímero o un detergente.
16. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la relación molar constituyente catiónico a constituyente aniónico es aproximadamente de 0,1:2 a 10:1.
17. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, en el que el constituyente neutro comprende un lípido.
18. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el lípido es un fosfolípido.
19. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el fosfolípido comprende DOPE.
20. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, en el que el constituyente neutro comprende colesterol.
21. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que la relación de peso constituyente catiónico : constituyente neutro : constituyente aniónico es aproximadamente de 1:1:0,1 a 1:1:1.
22. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el constituyente catiónico es DOGS, el constituyente aniónico es cardiolipina y el constituyente neutro es DOPE o colesterol.
23. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que la sustancia biológicamente activa netamente aniónica es una molécula de ácido nucleico.
24. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la molécula de ácido nucleico comprende ADN de cadena doble o de cadena sencilla o ARN.
25. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el ADN o el ARN comprenden un oligonucleótido o una ribozima.
26. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que la sustancia biológicamente activa netamente aniónica comprende heparina o un gangliósido.
27. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que la sustancia biológicamente activa netamente aniónica es un cromosoma o un fragmento de un cromosoma, un genoma procarionte o vírico o un fragmento de un genoma procarionte o vírico.
28. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que la sustancia biológicamente activa netamente aniónica comprende una proteína, un péptido, un glicopéptido, una lipoproteína, un glicolípido, un nucleósido, una hormona o una vitamina.
29. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, que además comprende un medio compatible para uso farmacéutico.
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WO1999006026A1 (en) 1999-02-11

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