DE69826488T2

DE69826488T2 - Stabile partikuläre komplexe lamellarer struktur mit neutraler oder negativer gesamtladung

Info

Publication number: DE69826488T2
Application number: DE69826488T
Authority: DE
Inventors: Alain Thierry
Original assignee: Ceva Sante Animale SA
Current assignee: Ceva Sante Animale SA
Priority date: 1997-07-30
Filing date: 1998-07-30
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-07-31
Also published as: EP1001750B1; ATE276742T1; WO1999006026A1; FR2766706A1; ES2229534T3; CA2296394A1; AU9260898A; DE69826488D1; FR2766706B1; JP2001511440A; EP1001750A1; WO1999006026A9; US6096335A

Description

Die Erfindung betrifft aus Partikeln bestehende Komplexe, die durch die Assoziierung von biologisch aktiven Substanzen mit Vesikeln entstehen und als Vektoren aktiver Substanzen nützlich sind. Sie betrifft auch die Verwendung von Vesikeln, die zur Bildung dieser Komplexe geeignet sind, sowie Zusammensetzungen, welche diese Komplexe enthalten. Schließlich betrifft die Erfindung die Herstellung dieser Vesikel und von Komplexen und Zusammensetzungen, welche diese enthalten.
Viele Systeme für die Vektorisierung aktiver Substanzen sind bereits bekannt, wie Liposome, Nanopartikel, Polymerpartikel, Immuno- und Ligandkomplexe und Cyclodextrine (Drug Transport in antimicrobial and anticancer chemotherapy. G. Papadakou Ed. CRC Press. 1995).
Jedoch hat sich keines dieser Systeme als wirklich befriedigend erwiesen für den in vivo-Transport von Nukleinsäuren, wie beispielsweise Desoxyribonukleinsäure (DNA). Dieses Manko ist eines der Probleme, mit denen sich die als Gentherapie bekannt Methode befaßt (R. G. Crystal, Science, 270, 404–410, 1995). Bei der Gentherapie handelt es sich um die Transfektion eines auf einer Nukleinsäure beruhenden Produkts, wie eines Gens, in die Zellen eines Organismus. Das Gen wird in den Zellen exprimiert, nachdem es in den Organismus eingeführt wurde.
Gegenwärtig gibt es mehrere Methoden der Zelltransfektion. Diese Methoden können in Gruppen wie folgt eingeordnet werden:

– Verwendung von Calciumphosphat oder Polykationen, Mikroinjektion, Protoplasmafusion;
– Elektroporation und Injektion von freier DNA;
– virale Infektion;
– synthetische Vektoren.

Methoden der ersten Gruppe sind nicht anwendbar bei der in vivo-Transfektion. Als ein Ergebnis beruhen die meisten anfänglichen klinischen Untersuchungen der Gentherapie auf der Grundalge der Verwendung von retroviralen und adenoviralen Vektoren. Diese Vektoren sind wirksam beim stabilen Transfizieren heterologer Gene in Zellen zur Expression. Jedoch erscheint die klinische Verwendung von Vektoren viralen Ursprungs problematisch wegen ihrer potentiellen Toxizität.
DNA-Viren wie Adenoviren oder Herpesvirus sind potentielle Transporter von DNA, bereiten jedoch Probleme mit bezug auf Immunogenizität, Toxizität und Herstellungskosten.
Die Elektroporation und Injektion von freier DNA bieten eine brauchbare Alternative, sind jedoch verhältnismäßig wenig wirksam und auf nur lokale Verabreichung begrenzt.
Es besteht ein steigendes Interesse an der Verwendung von synthetischen Vektoren, wie Lipid- oder Polypeptidvektoren, da diese Strategie weniger toxisch als die viralen Vektoren erscheint. Das zu übertragende genetische Material ist gewöhnlich ein Plasmid (pDNA), dessen Produktion einfach und billig ist. Das Plasmid, das gewöhnlich in Bakterien produziert wird, enthält nicht nur das Gen sondern auch Sequenzen, welche die cis-Kontrolle der Regulierung der Expression des Gens gewährleisten. Zu den üblichen Kontrollsequenzen gehören Promoter, Enhancer-Sequenzen, operative Sequenzen, ribosomale Attachmentstellen, Initiationskodons, Transkriptionsendesignale und Polyadenylierungssignale. Es können auch andere DNA-Sequenzen eingesetzt werden, wie Puffersequenzen, Replikationsursprungsstellen, homologe Rekombinationsstellen oder Introns.
Im allgemeinen ist der Transport von Nukleinsäuren (NA) durch ihre starke Biodegradierbarkeit begrenzt. Besonders pDNA muß vollkommen intakt dem Kern der Zielzelle übergeben werden, um die Expression des Transgens zu ermöglichen. Der pDNA-Pathway nach der systemischen Verabreichung umfaßt viele Stufen, von denen jede eine mögliche Schranke für die Transgen-Expression ist:

– Transport im strömenden Blut von der Injektionsstelle zu Zielgeweben/-zellen;
– Diffusion vom intravaskulären Kompartment zum extravaskulären Kompartment, was auch als Extravasation in Geweben bezeichnet wird, und Eintritt in Zellen;
– Freisetzung von synthetischen Vektorpartikeln/pDNA oder von freier pDNA in dem cytoplasmischen Kompartment;
– Trennung von pDNA von synthetischen Vektoren;
– Transfer vom Cytoplasma zum Kern;
– nukleare Penetration;
– transgene Expression.

Die Eigenschaften eines optimalen Transportsystems für Gentransfer sind die folgenden:

– Gewinnung von synthetischen Vektorpartikeln/homogener DNA von kleiner Größe, was die Kondensation von DNA, d. h. deren Überführung in einen kompakteren Zustand ermöglicht.
– Schutz der DNA gegen Nukleasen.
– Gewinnung von Partikeln mit einer verbesserten Plasma-Halbwertzeit, infolge verringerter Wechselwirkungen mit Blutzellen oder Plasmaproteinen.
– Transport von DNA in die Zielzelle.
– Freisetzung von DNA in Cytoplasma und Nukleoplasma.
– Fähigkeit zur Zellzielfindung (Cell targeting).

Unter synthetischen Vektoren scheinen Lipidvektoren und Liposome gegenüber Polypeptid-Vektoren den Vorteil zu haben, daß sie potentiell weniger immunogen und zur Zeit wirksamer sind. Jedoch ist die Verwendung von üblichen Liposomen zur DNA-Übertragung sehr begrenzt wegen der geringen Einkapselungsrate und ihrer Unfähigkeit, große Moleküle, wie Nukleinsäuren, zu kompaktieren.
Die Bildung von DNA-Komplexen mit kationischen Lipiden wurde neuerdings in vielen Forschungsstellen untersucht (Felgner et al., PNAS 84, 7413 bis 7417 (1987); Gao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 280 bis 285, (1991); Behr, Bioconj. Chem. 5, 382–389 (1994)). Diese DNA-kationischen Lipid-Komplexe sind in der Vergangenheit auch als Lipoplexe bezeichnet worden (P. Felgner et al., Hum. Genet. Ther., 8, 511 bis 512, 1997). Kationische Lipide ermöglichen die Bildung von elektrostatischen Komplexen mit DNA, die eine polyanionische Substanz ist.
Es hat sich gezeigt, daß die Verwendung von kationischen Lipiden beim Transport von pDNA in Zellkultur wirksam ist. Jedoch ist die in vivo-Anwendung dieser Komplexe, besonders nach systemischer Verabreichung, zum Gentransfer kaum dokumentiert (Zhu et al., Science 261, 209 bis 211 (1993); Thierry et al., PNAS 92, 9742 bis 9746 (1995); Hofland et al., PNAS 93, 7305 bis 7309 (1996)).
Dennoch ist diese Art von Verabreichung von wesentlichem Interesse bei bestimmten medizinischen Anwendungen. Die Erklärung liegt in der Schwierigkeit, Komplexe zu erhalten, die von homogener Größe und Struktur und verhältnismäßig stabil gegenüber Biodegradierung sind. Beispielsweise betrifft die Patentanmeldung WO 96/03977 des National Institute of Health für die DNA-Übertragung in vitro verwendbare Liposome, die aus kationischen Lipiden und neutralen Lipiden aufgebaut sind. Jedoch ist die insgesamt kationische Art dieser Liposome in Kombination mit pDNA eine deutliche Begrenzung dieser Art von System für einige Anwendungen.
Bisher war es unmöglich, stabile und homogene Lipoplexe zu erhalten, die eine neutrale oder negative globale Ladung haben und die für Zelltransfektion wirksam wären. Die für die Bildung von Lipoplexen verwendeten Reaktionen erfordern die Bildung von elektrostatischen Bindungen zwischen polyanionischen Bestandteilen. Die Bildung solcher Bindungen ist schwierig zu steuern.
Es ist anerkannt, daß positive Partikel wirksam und unspezifisch an Serumproteine binden, von denen die meisten eine negative globale Ladung tragen. Solches Binden führt zur Inaktivierung und raschen Plasmaeliminierung der Proteine, was zu einer erhöhten Toxizität und potentiell zu einer Entzündungsreaktion führt. Außerdem treten positiv geladene Partikel in eine positive Wechselwirkung mit extrazellularen Matrizes und zeigen als Ergebnis eine begrenzte Extravasation vom vaskularen Raum zum interstitiellen Raum.
Der kationische Charakter der bisher entwickelten Lipoplexe ist eine sehr erhebliche Begrenzung für ihre Anwendung bei ihrer Verwendung durch systemische Verabreichung. Das besonders erklärt den großen Unterschied zwischen der Wirksamkeit in vitro und der in vivo.
In dieser Hinsicht ist es interessant zu bemerken, daß bereits entwickelte Lipoplexe für eine Muskelzellentransfektion nach intramuskulärer Injektion nicht wirksam sind, dagegen HVJ-Liposomen wirksam sind (Yanagihara et al., Gene Ther. 3, 549 bis 557 (1996)). HVJ (Hemagglutinin Virus of Japan) Liposomen sind neutrale Liposomzubereitungen, deren Membranen inerte Partikel von HVJ-Virus enthalten und welche pDNA einkapseln, die zuvor mit HMGI-Histonen eingekapselt wurde. Dieses System hat sich als wirksam für verschiedene Anwendungen in vivo gezeigt. Seine klinische Anwendung erscheint jedoch ernsthaft begrenzt wegen Problemen der Immunogenität und Toxizität, die mit der Anwesenheit von viralen Partikeln zusammenhängen. Die Gründe für die bessere Wirksamkeit von HVJ-Liposomen in Muskelzellen im Vergleich mit der von kationischen Lipidvektoren könnte erklärt werden durch bessere endosomale Freisetzung und die neutrale Ladung.
Es wurde auch gezeigt (H. Komatsu et al., BBA 1235, 270 bis 280 (1995)), daß bestimmte nichtwäßrige hydrophile Lösungsmittel, z. B. Ethanol, die Ultrastruktur von Lipidmembranen modifizieren, welche Liposommembranen bilden. In einem wäßrigen Lösungsmittel bilden die Fettsäureketten der Lipide Doppelschichten (Bilayers), worin die hydrophoben Schwänze der Fettsäuren in einer der Schichten sich neben die hydrophoben Schwänze der anderen Schicht legen, wodurch ein Zwischenraum zwischen den zwei Schichten verbleibt. Durch Löslichmachung der Lipide mit einer geeigneten Verdünnung eines nichtwäßrigen hydrophilen Lösungsmittels in einer wäßrigen Lösung interagieren die Fettsäuren in einer Schicht und vermischen sich mit den hydrophoben Schwänzen der anderen Schicht, wodurch die Membranfluidität verstärkt wird. Vesikel, welche solche modifizierten Doppelschichten enthalten, können als "interdigitiert" (interdigitated) bezeichnet werden. Diese Membranen sind auch weniger dick als die sich in wäßrigen Lösungsmitteln bildenden Lipid-Doppelschichten (< 60 Angström) und haben ein unilamellares Aussehen wie das von SUVs (Small Unilamellar Vesicles).
Bisher wurden aktive Substanzen in Vesikeln ohne strukturelle Umordnung verkapselt. Die Forschung des Anmelders hat es ihm ermöglicht, Vesikel herzustellen, die besonders geeignet sind für die Formulierung von anionischen biologischen Substanzen, wie DNA, und dadurch stabile Komplexe zu erhalten, welche den Transport dieser biologischen Substanzen als Teil von Vektoren für medizinische Zwecke ermöglichen. In dieser Beschreibung werden biologische Substanzen, die Teil von Vektoren sind, als vektorisiert bezeichnet.
Die hier betroffene Erfindung soll dazu dienen, ein Transportsystem für aktive Agenzien und besonders Nukleinsäuren zu schaffen, das frei von den Nachteilen früherer Systeme ist. Die erfindungsgemäße Formulierung ermöglicht besonders optimalen Gentransfer, da sie die im folgenden aufgeführten Vorteile bietet, welche die Basis wirksamer Transfektion sind:

– Kondensation von DNA.
– Schutz der DNA gegen Nukleasen.
– Verbesserte Plasma-Halbwertzeit, über verringerte Wechselwirkung mit Blutzellen oder Plasmaproteinen.
– Transport in das DNA-Ziel.
– Freisetzung von DNA im Cytoplasma und Nukleoplasma.
– Fähigkeit zur Zellzielbestimmung (Cell targeting).

ZUSAMMENFASSUNG
Dieses Ziel wird erreicht, indem ein stabiler aus Partikeln bestehender Komplex mit einer sphärischen Form und einer lamellenförmigen gerollten und kondensierten, aus Partikeln bestehenden Struktur bereitgestellt wird, wobei der Komplex eine global anionische biologisch aktive Substanz und eine Mischung eines kationischen Bestandteils und eines anionischen Bestandteils beinhaltet, worin wenigstens einer des kationischen Bestandteils und des anionischen Bestandteils ein Lipid ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Komplex eine globale negative oder neutrale Ladung. In einer anderen Ausführungsform beinhalten die Komplexe weiterhin einen neutralen Bestandteil.
Die erfindungsgemäßen Komplexe liefern ein System zur Vektorisierung von aktiven Substanzen in partikulärer Form. Die Komplexe werden im folgenden als Neutraplex^TM-Komplexe bezeichnet. Im Vergleich mit bisher verfügbaren Komplexen sind Neutraplex^TM(Nx)Komplexe Lipoplexe, die stabil sind und eine kondensierte partikuläre Struktur haben, die sphärisch geformt ist, wie in 1 und 2 gezeigt. Die Neutraplex^TM-Komplexe haben eine geordnete flüssigkristalline Struktur, die eine lamellare gerollte Anordnung zeigt.
Die Komplexe können eine positive, neutrale oder negative globale Ladung haben. Die Komplexe haben vorzugsweise eine neutrale oder negative globale Ladung.
Das erfindungsgemäße System ist bemerkenswert, indem es den partikulären Komplex mit neutraler oder negativer globaler Ladung zur Verfügung stellt, den Vorteil bietet, daß DNA, wie pDNA signifikant kondensiert werden kann und daß er fusogen ist (z. B., in der Lage, intrazellulare Membranen, wie beispielsweise endosomale Membranen zu zerreißen). Allgemein gesagt, ist es vorzuziehen, ein Übertragungssystem zu verwenden, das im wesentlichen neutral oder schwach negativ ist, da für die systemische Anwendung die Übertragungsausbeute der aktiven Substanz an ihrer Wirkungsstelle stark verbessert wird im Vergleich mit einem positiv geladenen System, das hinsichtlich seiner Bioverteilung und Toxizität begrenzt ist. Die negative globale Ladung oder im wesentlichen Neutralität des Komplexes verringert die pharmakologischen und physiologischen Schranken und verbessert besonders den Transport in die Gewebezellenmatrix oder verstärkt unter bestimmten Umständen die Extravasation. Statt dessen sind Komplexe mit positiver globaler Ladung unter bestimmten Umständen vorteilhaft, beispielsweise für parenterale/lokale Verabreichung.
FIGURENBESCHREIBUNG
1. Die 1A und 1B sind Mikrophotographien der Ultrastruktur von Nx2D-Vesikeln bzw. Nx2D/pDNA-Komplexen mittels Kryoelektronen-Mikroskopie. Die Maßstabsstrecke ist 50 nm. 1C zeigt die Größenverteilung von Nx2D/pDNA-Komplexen bestimmt durch dynamische Lichtstreuung.
2 2A zeigt ein Kryoelektronen-Mikroskopie-Bild eines Neutraplex^TM gebildet mit der langen doppelsträngigen DNA des T4 Phagen-Virus. 2B zeigt eine SAXS-Analyse von Nx2D/pDNA (gestrichelte Linie) und Nx/T4DNA (durchgezogene Linie).
3 ist ein Diagramm, das die Struktur und Herstellung von Neutraplex^TM-Komplexen zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
In dieser Beschreibung sind alle Zahlen Näherungswerte, falls nicht anders angegeben, oder sonst durch den Zusammenhang, in welchem die Zahl verwendet wird, erforderlich. Die Worte "beinhaltend", "beinhalten" und "beinhaltet" und dergleichen bedeuten einschließlich, ohne Begrenzung darauf. Die Worte "bestehend aus", "bestehen aus", "besteht aus" und dergleichen bedeuten einschließlich und begrenzt darauf.
Einer der Vorteile der erfindungsgemäßen Komplexe ist die Kondensation, d. h. die Kompaktierung der vektorisierten biologisch aktiven Substanz. Dies Ziel wird vorzugsweise besonders erreicht mit einem kationischen Bestandteil, der Kondensationseigenschaften für die anionische Substanz hat.
Die in der Zusammensetzung der partikulären Komplexe der Erfindung beteiligte biologisch aktive Substanz ist vorzugsweise eine Nukleinsäure, und die Erfindung zieht besonders in Betracht, daß der kationische Bestandteil eine Substanz mit DNA-Kondensationseigenschaften sein sollte, jedoch ist im Rahmen der Erfindung jede kationische Verbindung annehmbar, z. B. Histone, Spermine oder Spermidine. Bevorzugt wird dennoch ein kationischer Bestandteil von Lipidart. Jedes Lipid mit einer positiven Gesamtladung ist geeignet. Zu einigen bevorzugten positiv geladenen Lipiden gehören Lipomonoamine, wie DOTAP und DOTMA, Lipopolymaine, wie DOGS und DOSPA, und Phosphonolipide, wie Dioleoyltrimethylammoniumphosphonolipid und Myristoyltrimethylammoniumphosphonolipid.
DOTAP: 1,2-Dioleoyloxy-3(trimethylamino)propan,
DOTMA: N[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid,
DOGS: Dioctadecylamidoglycilspermin,
DOSPA: 2,3-Dioleoyloxy-N(2-spermincarboxamido)ethyl-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoroacetat.
Als ein Ergebnis des speziellen Herstellungsverfahrens der erfindungsgemäßen Komplexe kann der kationische Bestandteil von Nicht-Lipidart sein, wenn der anionische Bestandteil ein Lipid ist. Zu Bestandteilen von Nicht-Lipidart gehören Polymere, wie Polypeptide, Lipopeptide, Polysaccharide, Chitosan, Polylysin, Polyethylenimin und kationische Netzmittel, wie beispielsweise CTAB, die auch für ihre Fähigkeit zum Kompaktieren von DNA bekannt sind.
Der in der Zusammensetzung der erfindungsgemäßen partikulären Komplexe beteiligte anionische Bestandteil sollte vorzugsweise auch ein Lipid, besonders bevorzugt ein Phospholipid sein. Jedes Lipid mit einer negativen Gesamtladung, wie Phosphatidylserin oder Phosphatidylinosit und deren Derivate ist im Rahmen der Erfindung brauchbar.
Als anionischer Bestandteil besonders bevorzugt sind Cardiolipin oder dessen natürliche oder synthetische Derivate. Cardiolipin ist ein natürliches Diphosphatidylglycerin, das aus Säugetierherz extrahiert werden kann und etwa 90% C18:2 und 9% C18:1 enthält. Es ist erhältlich von Avanti Polar Lipids Incorporated in Alabaster, Alabama, U.S.A. und von Sigma-Aldrich Fine Chemicals, siehe beispielsweise Lipids 6, 260 bis 265 (1965).
Jedoch kann der anionische Bestandteil der erfindungsgemäßen Komplexe auch von Nicht-Lipidart sein, wenn der kationische Bestandteil ein Lipid ist. Zu einigen Beispielen geeigneter anionischer Bestandteile von Nicht-Lipidart gehören polymere Verbindungen, wie beispielsweise Polyglutaminsäure oder anionische Netzmittel, wie beispielsweise Lysophosphatidylglycerin.
Wenn die aktive Substanz eine Nukleinsäure ist, wird besonders bevorzugt, daß der anionische Bestandteil ein Lipid ist, der hauptsächlich ein Diphosphatidylglycerin umfaßt, z. B. Cardiolipin oder eines seiner synthetischen Analogen oder Derivate. Obgleich Cardiolipin fusogen ist, schließt der erfindungsgemäße Komplex vorzugsweise ein neutrales Lipid ein, z. B. ein anderes fusogenes Lipid, wie Phosphatidylethanolamin oder dessen Derivate, z. B. Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE). Die erfindungsgemäßen Komplexe haben dann die fusogenische Eigenschaft, welche für die Freisetzung der DNA aus Endosomen in das Cytoplasma wesentlich ist.
Weiterhin kann ein neutraler Bestandteil, wie ein neutrales Lipid, z. B. Cholesterin oder DOPE an der Stabilisierung der Struktur der erfindungsgemäßen Komplexe mitwirken. Dieser neutrale Bestandteil kann auch eine zwitterionische Lipidverbindung sein, wie Sphingomyelin, welche in den erfindungsgemäßen Komplexen ein fusogenes Potential haben kann.
Das in dieser Erfindung beteiligte DNA-Transportsystem ist also vorzugsweise eine einzigartige Kombination von einer oder mehreren oder allen der folgenden Eigenschaften, die wesentlich sind, um einen optimalen DNA-Vektor zu erhalten:

– vorzugsweise von ausschließlich Lipidart, daher minimal immunogen;
– gute DNA-Kondensation, was zelluläre Penetration der DNA gewährleistet;
– Fusogenizität;
– hochstrukturierter Membrancharakter.

In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Komplex schlagen die Anmelder erstmalig die Assoziierung eines anionischen Bestandteils mit einem kationischen Bestandteil vor, um so ein Vesikel zu erhalten, das Nukleinsäure kondensiert und dabei die Herstellung von stabilen Komplexen mit einer negativen oder neutralen Gesamtladung gewährleistet, welche die oben erwähnten Eigenschaften haben.
Die Gesamtladung (globale Ladung) der erfindungsgemäßen Komplexe ist das Ergebnis der relativen Zahl von positiven zu negativen Ladungen und kann als Ausdruck ihrer Ladungsverhältnisse gemessen werden. In dieser Beschreibung werden Ladungsverhältnisse in Übereinstimmung mit Felgner et al., Human Gene Therapy 8, 511 bis 512 (1997) wie folgt definiert:
Zu den gesamten kationischen Komponenten gehören kationische Bestandteile, wie kationische Lipide. Zu den gesamten anionischen Komponenten gehören anionische Bestandteile, wie anionische Lipide und die global anionische biologisch aktive Substanz.
Die erfindungsgemäßen Komplexe können positiv sein, sind aber vorzugsweise negativ. Vorzugsweise haben die Komplexe Ladungsverhältnisse von etwa 0,01 bis 10, mehr bevorzugt 0,01 bis 1,0 und am meisten bevorzugt etwa 0,01 bis 0,9. Beispielsweise hat eine Neutraplex^TM-Formulierung, die 1 mg DOGS (3 positive Ladungen/Molekül, 1263 MW), 1 mg DOPE (0 elektrische globale Ladung), 0,5 mg Cardiolipin (2 negative Ladungen/Molekül, 1573 MW), ein theoretisches Ladungsverhältnis von 2,14 und 0,68, wenn 10 bzw. 60 μg pDNA (1 negative Ladung/340 g) zugesetzt werden. Experimentell gibt das Zeta-Potential, ausgedrückt als MV, das Partikel-Ladungsverhältnis an. Das Zeta-Potential kann durch einen Zeta-Potential-Analysator bestimmt werden.
Vorzugsweise sollen die Membranen der erfindungsgemäßen Komplexe außer Partikeln der aktiven Substanz keine Komponenten haben, die unerwünschte Nebenwirkungen verursachen. Zu unerwünschten Nebenwirkungen gehören beispielsweise unerwünschte Immunogenizität oder Toxizität. Besonders bevorzugt sollen die Membranen der erfindungsgemäßen Komplexe keine viralen Partikel, wie beispielsweise HVJ-Partikel haben.
Aktive Substanzen, die in den erfindungsgemäßen Komplexen mit Vesikeln kombiniert sind, sind vorzugsweise biologische oder chemische Substanzen mit einer biologischen Wirkung und vorzugsweise mit therapeutischen, prophylaktischen (d. h. vakzinartigen) oder diagnostischen Eigenschaften.
Die Erfindung zielt besonders auf aktive Substanzen, die global negative Verbindungen oder Polyanionen sind. Zu einigen bevorzugten Beispielen gehören doppelsträngige oder einsträngige Nukleinsäuremoleküle, virale Genome, Teile von viralen Genomen, Prokaryoten-Genome, Teile von Prokaryoten-Genomen, Chromosome oder Teile von Chromosomen. Zu einigen Beispielen von Nukleinsäuremolekülen gehören DNA- oder RNA-Sequenzen, Oligonukleotide und Ribozyme. Auch andere Verbindungen können in die erfindungsgemäßen Komplexe eintreten, z. B. andere Polyanionen, wie Heparin und Ganglioside, oder global negative Verbindungen, die ausgewählt sind unter Proteinen, Peptiden, Lipoproteinen, Glykolipiden, Hormonen, Nukleosiden und Vitaminen, sowie deren Konjugaten. Das erfindungsgemäße System ermöglicht die Vektorisierung von wenigstens einer von biologisch aktiven Substanzen. Es ist auch möglich, Komplexe herzustellen, in denen in einem lamellaren Partikel mehrere biologisch aktive Substanzen assoziiert sind, die besonders aus den oben erwähnten ausgewählt sind.
Das erfindungsgemäße System ist besonders geeignet für den Transport von Nukleinsäuren. Die aktive Substanz kann beispielsweise eine DNA sein, die für ein Protein codiert, wie solche, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: Zellmediatoren (z. B. Cytokine, Wachstumsfaktoren, Chemokine und Interleukine usw.), Transkriptionsfaktoren, Membranproteine, virale Proteine und Epitope, Blutgerinnungsfaktoren, Hormone usw.
Die erfindungsgemäßen Komplexe haben vorzugsweise eine solche Größe, daß sie in kleinen Blutgefäßen von Säugetieren, wie dem Menschen, leicht fließen können. Demgemäß haben die erfindungsgemäßen Komplexe vorzugsweise eine Größe von weniger als 400 nm.
Die Erfindung umfaßt auch Zusammensetzungen aus identischen oder verschiedenen Komplexen, wie oben beschrieben, in einem mit der aktiven Substanz verträglichen Medium, d. h. einem pharmazeutisch annehmbaren Medium, welches auch die Beibehaltung der neutralen oder negativen Gesamtladung der erfindungsgemäßen Komplexe gewährleistet.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden kationische oder neutrale unilamellare Vesikel mit einer verschränkten (interdigitierten) Membran bei der Herstellung der neutralen oder global anionischen Komplexe der Erfindung verwendet. für die Zwecke dieser Beschreibung ist eine verschränkte Membran eine Lipidmembran, in der die hydrophoben Schwänze der Lipidmoleküle nicht Kopf an Kopf liegen sondern verschachtelt (interconnected) sind. Mit anderen Worten sind die hydrophoben Schwänze in der Zweischichtmembran einander nicht mehr zugewandt. Der Raum zwischen den benachbarten Schwänzen wurde stark verringert und die Schwänze vermischen sich miteinander, wodurch die Membranfluidität gesteigert wird. Die Membranen werden gebildet von einem kationischen Bestandteil, einem anionischen Bestandteil und gegebenenfalls einem neutralen Bestandteil. Wenigstens einer der kationischen und anionischen Bestandteile ist vorzugsweise ein Lipid.
Die erfindungsgemäßen Vesikel sind vorteilhafterweise von kleiner Größe und aufgebaut aus verschränkten (interdigitierten) und/oder SUV (Small Unilamellar Vesicles) Membranen mit einer positiven oder neutralen Gesamtladung.
Die erfindungsgemäßen Vesikel sind besonders bestimmt zur Verwendung in der Zusammensetzung von Komplexen, wie oben definiert, und haben als Ergebnis die bei der Beschreibung der Komplexe angegebenen Eigenschaften. Als Ergebnis ist der kationische Bestandteil eine Substanz, welche anionische Substanzen kondensiert.
Vorzugsweise ist der kationische Bestandteil ein Lipid. Wenn das in einen Komplex mit den erfindungsgemäßen Vesikeln zu bringende aktive Mittel ein Nukleinsäuremolekül ist, wie DNA oder RNA, wird besonders bevorzugt, daß der kationische Bestandteil eine Substanz ist, die Nukleinsäuremoleküle kondensiert. Zu geeigneten kationischen Bestandteilen gehören beispielsweise Lipomonoamine und Lipopolyamine, wie oben erwähnt.
Jedoch kann der kationische Bestandteil auch nicht-lipidartig sein, wenn der anionische Bestandteil ein Lipid ist. Zu nicht-lipidartigen kationen Bestandteilen, wie oben erwähnt, gehören besonders kationische Polypeptide oder Polysaccharide.
Ähnlich sollte der anionische Bestandteil vorzugsweise auch ein Lipid, vorzugsweise ein Phospholipid sein, und in dieser Hinsicht sieht die Erfindung speziell Cardiolipin und seine natürlichen oder synthetischen Derivate vor. Der anionische Bestandteil kann jedoch auch ein Nicht-Lipid sein, wenn der kationische Bestandteil ein Lipid ist. Wenn der neutrale Bestandteil vorhanden ist, ist er vorzugsweise ein neutrales Lipid, wie DOPE.
Die Erfindung betrifft also auch Zusammensetzungen, die identische oder verschiedene Vesikel der Erfindung in einem verträglichen Medium umfassen.
Die Erfindung umfaßt auch die Herstellung der obigen Vesikel und Komplexe, sowie von solche enthaltenden Zusammensetzungen.
Die neutralen oder negativen Komplexe der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden erhalten durch Verwendung eines besonderen Typs von Vesikel, wie oben beschrieben, und ein Verfahren zu deren Formulierung, zusammen mit der Verwendung einer Zusammensetzung, welche die anionische Substanz einschließt. Dieses Verfahren und die Zusammensetzung sind darauf gerichtet, unter anderem das Problem zu lösen, das durch die Zugabe der anionischen Substanz zu einer Zubereitung von stabilen Vesikeln von homogener Struktur entsteht. Es ist bekannt (Y. Xu, F. C. Szoka, Biochem. 35, 5616 bis 5623, 1996), daß die Zugabe eines anionischen Phospholipids die Stabilität des Komplexes stark stört durch Wettbewerb mit bezug auf die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem kationischen Lipid und einem Polyanion, wie einer Nukleinsäure.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexe und Vesikel ist dadurch gekennzeichnet, daß der kationische Bestandteil und der anionische Bestandteil, von denen wenigstens einer ein Lipid, vorzugsweise ein Phospholipid ist, in einem oder mehreren nichtwäßrigen hydrophilen polaren Lösungsmitteln dispergiert werden, bevor oder während für die Herstellung der erfindungsgemäßen Vesikel gemischt wird.
Das nichtwäßrige Lösungsmittel kann protisch oder aprotisch sein und ist vorzugsweise wasserlöslich. Zu einigen geeigneten Beispielen protischer Lösungsmittel gehören Alkohole mit 1 bis 4, vorzugsweise 2 bis 3 Kohlenstoffatomen. Die bevorzugten Alkohole sind Ethanol und Isopropanol. Zu anderen Beispielen protischer Lösungsmittel gehören Ethylenglykol, Propylenglykol und Glycerin. Zu einigen Beispielen aprotischer Lösungsmittel gehören Dimethylsulfoxid, Acetonitril und Aceton.
Die nichtwäßrigen hydrophilen polaren Lösungsmittel können bis zu etwa 50% vorzugsweise bis zu etwa 40% und mehr bevorzugt bis zu etwa 30% Wasser enthalten. Allgemein enthalten Lösungsmittel für Lipidbestandteile vorteilhafterweise sehr wenig, falls überhaupt, Wasser, z. B. 0 bis 5%, vorzugsweise 0 bis 3%, weiter bevorzugt 0 bis 2% und am meisten bevorzugt 0 bis 1%. Lösungsmittel für einige hydrophobe polymere Bestandteile enthalten vorteilhafterweise etwa 10 bis 20% Wasser.
Mehr im einzelnen umfaßt das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexe die folgenden Stufen:

a) Ein kationischer Bestandteil und ein anionischer Bestandteil, von denen wenigstens einer vorzugsweise ein Lipid und vorzugsweise ein Phospholipid ist, werden miteinander gemischt. Die kationischen und anionischen Bestandteile können entweder getrennt in gleichen oder verschiedenen Lösungsmitteln dispergiert und dann gemischt oder zusammen in ein Lösungsmittel gegeben und dispergiert werden. Das Lösungsmittel ist ein nichtwäßriges hydrophiles polares Lösungsmittel.
b) Ein Überschuß einer wäßrigen Lösung, wie eine wäßrige Salz- oder Pufferlösung wird zugesetzt.
c) Wenigstens eine global anionische biologisch aktive Substanz in Lösung, vorzugsweise in einer wäßrigen Lösung, wird der obigen Mischung zugesetzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des obigen Verfahrens umfaßt die Stufe (a) das Mischen eines kationischen Bestandteils mit einem anionischen Bestandteil in einem Lösungsmittel, wobei wenigstens einer dieser Bestandteile ein Lipid. vorzugsweise eine Phospholipid, ist.
Mehr bevorzugt sind beide Bestandteile, der kationische und der anionische Bestandteil, Lipide. In diesem Fall werden die erfindungsgemäßen Vesikel vorzugsweise mit etwa 0,1 bis 5% (Gew/Gew) Lipide, bezogen auf das Lösungsmittel, hergestellt, was die Bildung von supramolekularen Komplexen mit anionischen Verbindungen, wie DNA, begünstigt.
Speziell bevorzugt wird die Verwendung eines nichtwäßrigen hydrophilen polaren Lösungsmittels für das Mischen der kationischen und anionischen Bestandteile in Stufe (a) des Verfahrens, und vorzugsweise eines alkoholischen Lösungsmittels, wie Ethanol.
Es ist zweckmäßig, diese kationischen und anionischen Bestandteile in einem Mol-Verhältnis zwischen 0,1 : 2 und 10 : 1 zu mischen.
Die in Stufe (b) zugesetzte wäßrige Lösung besteht vorzugsweise aus Wasser und wird dem Gemisch der kationischen und anionischen Bestandteile in einem Verhältnis von etwa 100 bis 200 μl pro mg zugesetzt.
In einer bevorzugten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Mischung der Stufe (a) bei einer Temperatur von etwa 30 bis 50°C hergestellt und so bis zur Stufe (b) gehalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch den Zusatz eines neutralen Bestandteils, vorzugsweise eines Lipids, in Stufe (a) umfassen.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren, wo die in Lösung befindliche global anionische biologisch aktive Substanz ausgewählt ist aus doppel- oder einsträngigen Nukleinsäuren, Chromosomen oder Teilen von Chromosomen, DNA- oder RNA-Sequenzen, Oligonukleotiden oder Antisense-Oligonukleotiden und Ribozymen, wird sie in der Stufe (c) in einem Anteil von zwischen etwa 10 und 500 μg pro mg der kationischen und anionischen Bestandteile zugesetzt.
Ein bevorzugtes Verfahren der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, in Stufe (a) einen Film eines kationischen oder anionischen Lipids mit einem möglichst kleinen Volumen einer alkoholischen Lösung des Lipids mit einer Ladung entgegengesetzt der des Film und an ihrer Grenze der Solvatisierung aufzunehmen.
Wenn der Film aus einem kationischen Lipid besteht, umfaßt die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß er mit einer alkoholischen Lösung eines anionischen Lipids aufgenommen wird. Wenn dagegen der Film aus einem anonischen Lipid besteht, umaßt die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß er mit einer alkoholischen Lösung eines kationischen Lipids aufgenommen wird.
Das Lösungsmittel des Lipids mit einer Ladung entgegengesetzt der des Films der Stufe (a) wird ausgewählt aus nichtwäßrigen hydrophilen polaren Lösungsmitteln, wie Alkoholen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Ethanol und Isopropanol, Ethylenglykol, Propylenglykol, Glycerin, DMSO, Aceton und Acetonitril.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten kationischen, anionischen und neutralen Bestandteile sind ähnlich den oben für die erfindungsgemäßen Komplexe und Vesikel definierten.
Die erfindungsgemäßen Vesikel werden gemäß den Stufen (a) und (b) des oben beschriebenen Verfahrens hergestellt. Um das Ethanol/Lipoplex-Verhältnis aus Gründen der pharmakologischen Toxizität so niedrig wie möglich zu halten und dabei die Eigenschaften des Lösungsmittels für Membranmobilität beizubehalten, schlägt die Erfindung ein optimales Verfahren für die Herstellung der erfindungsgemäßen Vesikel vor, welches die folgenden Stufen umfaßt:

– Trocknen von DOGS zu einem Film in einem Vakuum;
– Auflösen dieses Films mit einer alkoholischen Lösung von Cardiolipin: obige Stufe (a);
– Erwärmen auf eine lauwarme Temperatur, um die Auflösung zu vervollständigen und zu gewährleisten;
– Zufügen eines Überschusses an Wasser: obige Stufe (b).

Genauer gesagt, wird 1 mg DOGS, gegebenenfalls getrocknet, in 50 μl einer 10 mg/ml Ethanol-Lösung von Cardiolipin gelöst. Das bevorzugte Verhältnis von kationischem Bestandteil (DOGS)/anionischem Bestandteil (Cardiolipin) beträgt in der Größenordnung von 0,05 bis 10 (Gew./Gew.).
Neutraplex^TM-Komplexe können gesondert aus Vesikelpräparationen hergestellt werden, die nach Stufe (b) bei 4°C gelagert wurden. Idealerweise werden die biologisch aktiven Substanzen, besonders eine Nukleinsäure, den Vesikeln mit Konzentrationen in der Grßenordnung von 10 bis 500 μg/mg der Vesikel und 10 bis 2000 μg/ml der Endpräparate zugesetzt.
Aus dieser Erfindung abgeleitete Präparate können erhalten werden, indem während wenigstens einer der Stufen (a) bis (c) oder nach der Stufe (c) Verbindungen mit Eigenschaften zugesetzt werden, von denen bekannt ist, daß sie das Transportpotential von Lipoplexen im allgemeinen verbessern:

– Stabilisierung der Membranstruktur, z. B. mit Cholesterin.
– Steigerung der Plasmazirkulation, z. B. mit auf PEG (Polyethylenglykol) basierenden Derivaten.
– Zellzielfindung (Targeting) durch Zugabe von Liganden oder Antikörpern.
– Schutz der DNA-Struktur, z. B. mit Histonen oder Nukleoproteinen.
– Aufrollen der DNA zur Transkription, z. B. mit Topoisomerase oder anderen Transkriptionsfaktoren.
– Zusatz von Polyanionen, wie Oligodesoxynukleotiden oder Polykationen, wie Polylysin.

Ein bemerkenswerter Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Verwendung eines nichtwäßrigen hydrophilen polaren Lösungsmittels während der Formulierung. Das bevorzugte Lösungsmittel ist Ethanol. Abgesehen von seinen Lösungsmitteleigenschaften, ist das nichtwäßrige hydrophile polare Lösungsmittel auch brauchbar als ein Netzmittel, das eine oberflächenaktive Rolle spielt. Das nichtwäßrige hydrophile polare Lösungsmittel erleichtert die Mobilität im hydrophoben Inneren von Lipidmembranen und wird in der Lipiddoppelschicht gehalten, die aus einer kationischen Verbindung und einer anionischen Verbindung aufgebaut ist. Wenn die aktive Substanz eine Nukleinsäure ist, erleichtert das nichtwäßrige hydrophile polare Lösungsmittel anscheinend auch das Gleiten und Umhüllen der stark anionischen Nukleinsäure auf den kationisch geladenen äußeren und inneren Oberflächen der Doppelschicht von Vesikeln in einem thermodynamischen Gleichgewicht.
Die global anionische biologisch aktive Substanz, zumeist eine Nukleinsäure, kondensiert dann die Lipiddoppelschicht und assoziiert sich mit den zwei polaren Oberflächen, wobei die polaren Teile der Membran in Richtung auf die polyanionische Kette umorientiert werden. Das führt zu einer spontanen Selbstvereinigungsreaktion, die zu einer neuen stabilen Struktur führt, die ein Neutraplex^TM genannt wird. Die global anionische biologisch aktive Substanz bildet einen integralen Teil der Partikelstruktur des Neutraplex^TM.
Im Stand der Technik wurden neutrale und negativ geladene Lipoplexe und Polyplexe beschrieben. Jedoch wurden im Gegensatz zu dem Neutraplex^TM die bisher bekannten Lipoplexe und Polyplexe einfach nur mit Aggregation gebildet. Dagegen wird das Neutraplex^TM aus einer plötzlichen und spontanen Veränderung in der ursprünglich liposomalen (unilamellaren) Partikelstruktur gebildet, welche in eine flüssigkristalline Phase eintritt und zu einer lamellaren, gerollten und kondensierten Partikelstruktur wird, die sphärisch geformt und stabil ist, wie in 1 und 2 gezeigt.
Mit anderen Worten haben die erfindungsgemäßen Komplexe eine sphärische Form. Die sphärische Form hat eine Helix-Mikrostruktur mit verknäuelten (coiled) Lagen des Polyanions, assoziiert mit den polaren Oberflächen der Mischung der kationischen und anionischen Bestandteilen.
Die flüssigkristalline Phase der erfindungsgemäßen Komplexe kann manchmal auch eine hexagonale Struktur zeigen. Weiterhin können sowohl die lamellare (lamellenförmige) und hexagonale Phase im gleichen Partikel koexistieren (1B). Die Länge und der Typ des anionischen Bestandteils (Arzneimittels) kann den Übergang zwischen den zwei Phasen beeinflussen. Die Struktur des erfindungsgemäßen Komplexes kann möglicherweise der 3-D hexagonalen kristallinen Phase von DNA entsprechen, wie sie in Virusphagen gefunden wird (M. E. Ceritelli et al., Cell 91, 271 bis 280 (1997); (J. Lepault, J. Dubochet, W. Baschong, E. Kellenberger, EMBO J. 6, 1507 bis 1512 (1987)). Die hexagonale Phase neigt zum Fusionieren mit den Membranen der Zielzelle und zur intrazellulären Übertragung der biologischen Verbindungen, während die laminare Phase dazu neigt, die biologischen Verbindungen zu kondensieren und wirksam zu schützen.
So erleichtert das nichtwäßrige hydrophile polare Lösungsmittel durch Erhöhung der Membranfluidität das Erreichen des thermodynamischen Gleichgewichts, was zur Erzeugung dieser Partikelstruktur trotz der dagegen gerichteten ionischen Kräfte der verschiedenen Bestandteile führt und neutrale oder negative Lipoplexe (Neutraplex^TM-Komplexe) liefert. Einige geeignete nichtwäßrige hydrophile polare Lösungsmittel sind oben erwähnt. Das bevorzugte Lösungsmittel ist Ethanol. Zusätzlich zu Cardiolipin, das dazu neigt, eine hexagonale Phase zu bilden, hilft das Lösungsmittel dabei, die hexagonale flüssigkristalline Phase in Neutraplex^TM-Komplexen zu erhalten.
Als ein Beispiel der durch das in dieser Beschreibung beschriebene Verfahren erhaltenen Stabilität sind die in Beispiel 2 hergestellten Neutraplex^TM-Partikel selbst nach einer Konzentration der Materialien stabil. Nach Dialyse in Dextran wurde ein stabiles Neutraplex^TM-Präparat mit einem Gehalt von 1 mg/ml pDNA und 7,8 mg/ml Lipiden erhalten. Zusätzlich kann ein äquivalenter oder höherer Transfektions-Wirkungsgrad in Zellkultur in Gegenwart von Serum als in Abwesenheit von Serum erhalten werden. Es ist auch möglich, erfindungsgemäße Partikel herzustellen durch Verwendung eines kationischen Bestandteils oder eines Gemisches eines kationischen Bestandteils und eines neutralen Bestandteils, d. h. in Abwesenheit eines anionischen Bestandteils.
Andere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden verdeutlicht durch die im folgenden gegebenen Beispiele, welche die Herstellung und den Gebrauch der Komplexe und Vesikel gemäß der Erfindung betreffen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung von Nx1D-Vesikeln mit der Zusammensetzung DOGS/Cardiolipin
1 mg DOGS kationisches Lipopolyamin, aufgelöst in Ethanol, wird in einem rotierenden Rundkolben (Reagenzglas) aus Borosilikatglas zur Trockne verdampft. Der erhaltene trockne Lipidfilm wird in 50 μl einer Lösung von Cardiolipin in Ethanol (10 mg/ml) wieder suspendiert. Das Verhältnis DOGS/Cardiolipin beträgt 1/0,5. Die Resuspension wird begünstigt durch leichtes Schütteln und Erhitzen des Kolbens in einem Bad bei 30 bis 35°C während 15 Minuten. Dann werden 350 μl entionisiertes steriles Wasser rasch zu der Lipidlösung zugesetzt und durch Whirlmixer sanft gerührt. Das Präparat kann bei 4°C gelagert werden.
Beispiel 2: Herstellung von Nx1D/pDNA Neutraplex^TM mit der Zusammensetzung DOGS/Cardiolipin/pDNA
Ein Präparat von DOGS/Cardiolipin, wie in Beispiel 1 hergestellt, wird in einer 150 mM NaCl-Lösung verdünnt (25 μl des Präparats in 50 μl von 150 mM NaCl-Lösung) und 15 Minuten bei Raumtemperatur belassen. 30 μg pDNA, verdünnt in einem Puffer (60 μl) werden dem Präparat rasch zugesetzt, und die Mischung wird sanft geschüttelt und dann homogenisiert. Das so erhaltene Lipoplexpräparat wird eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und bei 4°C gelagert. Die erhaltenen Komplexe haben eine neutrale Ladung: diese sind Neutraplex^TM-Komplexe.
Beispiel 3: Herstellung von Nx2D-Vesikeln mit der Zusammensetzung DOGS/DOPE/Cardiolipin
1 mg DOGS kationisches Lipopolyamin und 1 mg DOPE, löslich gemacht in Ethanol, werden in einem rotierenden Rundkolben (Reagenzglas) aus Borosilikatglas zur Trockne eingedampft. Der erhaltene trockne Lipidfilm wird in 50 μl einer Lösung von Cardiolipin in Ethanol (10 mg/ml) resuspendiert, wobei das DOGS/DOPE/Cardiolipin-Gewichtsverhältnis 1/1/0,5 beträgt. Die Resuspension wird durch leichtes Schütteln und Erwärmen des Kolbens in einem Bad bei 30 bis 35°C während 15 Minuten begünstigt. 350 μl entionisiertes steriles Wasser werden dann rasch zur Lipidlösung zugesetzt, und die Mischung wird durch Whirlmixer schwach gerührt. Das Präparat kann bei 4°C gelagert werden.
Beispiel 4: Herstellung von Nx2D-pDNA Neutraplex^TM mit der Zusammensetzung DOGS/DOPE/Cardiolipin
Ein Präparat von DOGS/DOPE/Cardiolipin, wie in Beispiel 3 hergestellt, wird in einer 150 mM NaCl-Lösung verdünnt (25 μl Präparat in 150 μl der 150 mM NaCl-Lösung) und 15 Minuten bei Raumtemperatur belassen. 30 μg pDNA, verdünnt in einem Puffer (70 μl), werden rasch dem Präparat zugesetzt, und die Mischung wird leicht geschüttelt und dann homogenisiert. Das so erhaltene Lipoplexpräparat wird eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und bei 4°C gelagert. Die erhaltenen Komplexe haben eine neutrale Ladung. Wenn mehr als 30 μg pDNA zugesetzt werden, haben die Komplexe eine negative Ladung.
Beispiel 5: Optimierung der Formulierung von Neutraplex^TM-Komplexen

Mehrere Typen von Formulierungen wurden getestet, um eine stabile und homogene Suspension von Vesikeln als Ergebnis des Zusammenmischens eines kationischen Lipids (DOGS) und eines anionischen Lipids (Cardiolipin = CL) zu erhalten. Die verglichenen Formulierungen sind:

A =	Lipidfilmsuspension in Wasser.
B =	Lipidfilmsuspension in Ethanol.
C =	Mischung von kationischen und anionischen Lipiden in einer ethanolischen Lösung.
D =	Kationische Lipidfilmsuspension mit einer ethanolischen Lösung von anionischem Lipid.

Die folgende Tabelle 5-1 zeigt die mit den obigen Formulierungen bei Verwendung verschiedener Lipide und einer festgelegten DNA-Konzentration von 30 μg DNA/60 μg DOGS erhaltenen Ergebnisse.
Tabelle 5-1
Tabelle 5-1 zeigt, daß nur die Formulierungen C und D, die jeweils aus einer Mischung von kationischen und anionischen Lipiden in einer ethanolischen Lösung und Zusatz von Cardiolipin in einer ethanolischen Lösung (EtOH) zu einem trockenen Film von kationischem Lipid erhalten wurden, zur Suspension der Vesikel unter Bildung von stabilen und homogenen Neutraplex^TM-Komplexen führten.
Beispiel 6: Partikelanalyse der Komplexe und Vesikel der Erfindung
Ein Laser-Streulichtanalysator (dynamische Lichtstreuung) wurde zur Partikelanalyse verwendet. Die Ergebnisse, die mit nach den Beispielen 1 (Nx1D) und 3 (Nc2D) hergestellten Vesikeln und mit nach den in Beispiel 2 (Nx1D/pDNA) und Beispiel 4 (Nx2D/pDNA) beschriebenen Formulierungen aus Neutraplex^TM-Komplexen erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle 6-1 angegeben.
Tabelle 6-1
Z-Mittel ist die mittlere Größe in Nanometern der Partikelpopulation.
Der Polydispersionskoeffizient liefert eine Bewertung der Homogenität der Partikelpopulation. Im Hinblick auf die Art der erfindungsgemäßen Vesikel wird eine Polydispersität von unter 0,350 als annehmbar angesehen.
Die Ergebnisse zeigen, daß Nx1D und Nx2D Partikelpräparate eine kleine mittlere Größe hatten und eine homogene Population bildeten. Präparate von Komplexen mit DNA hatten eine größere mittlere Größe als Präparate von Vesikeln ohne DNA. Das Präparat Nx2D/pDNA und in geringerem Ausmaß das Präparat Nx1D/pDNA zeigten annehmbare Homogenität. Die Präparate Nx2D und Nx2D/pDNA waren reproduzierbar und sehr stabil nach einmonatlicher Lagerung bei 4°C.
Beispiel 7: Ultrastruktur der multilaminaren Komplexe
Die Verwendung der Kryoelektronen-Mikroskopie (cryoEM) ermöglicht die Sichtbarmachung von DNA-Makromolekülen in der Neutraplex^TM-Struktur in Kombination mit anderen analytischen Methoden, was einen kritischen Einblick in die Phänomene der DNA-Packung in Neutraplex^TM-Übertragungspartikeln liefert.
Eine Untersuchung des Nx2D-Vesikelpräparats nach Beispiel 3 zeigte die Anwesenheit von nur unilamellaren sphärischen Vesikeln vom liposomalen Typ (1A). Die Dicke der Membran dieser Vesikel (50 Angström) war geringer als die von klassischen liposomalen Partikeln (60 Angström) und ließ auf das Vorhandensein von Verschränkungen (Interdigitationen) infolge der Umordnung von Lipiden in Gegenwart von Alkohol schließen.
Neutraplex^TM-Komplexe, die mit pBKd1 RSVluc pDNA (10,4 kbp) und Vesikeln gebildet waren, die mit DOGS, DOPE und Cardiolipin hergestellt waren, wurden der cryoEM unterworfen. Wie in 1 gezeigt, läßt die cryoEM-Untersuchung sphärische Partikel erkennen, die zwei Arten von Strukturen zeigen: zumeist (> 80% der gesamten Partikel) eine multilaminare Organisation von Spherulit-ähnlichem Muster und in einem geringeren Ausmaß (< 20%) ein punktiertes Muster. Die Unterscheidung des ersteren konzentrischen Ringmotivs und der Anzahl der konzentrischen Schichten hängt vom beobachteten sphärischen Kondensat ab. Typischerweise werden 5 bis 10 konzentrische Schalen beobachtet, die eine Mittelfläche eines gepunkteten Musters umgeben. Keine freie SUV konnte auf den Quadraten der Gitter in 1B beobachtet werden. Alle Komplexe sind sehr empfindlich gegenüber den Elektronenstrahlen, was eine hohe Materialdichte anzeigt und auch die Anwesenheit von DNA nahelegt. Genauer zeigt die cryoEM (1B), daß das Muster von konzentrischen Ringen aus abwechselnden Schichten besteht, die anscheinend quergestreift sind, und aus Schichten mit niedriger Dichte. Aufgrund der cryoEM-Bilder hat die Dicke der gestreiften Schichten einen Mittelwert von 5,3 nm mit einer Periode von 7,5 nm. Die äußere gestreifte Schicht hat eine Dicke von 4,1 nm. Senkrecht zu diesen Schichten können schwache Streifen hauptsächlich am Rand und auch innerhalb der Partikel erkannt werden. Diese Streifen sind 2,0 nm dick mit einer Periode von 3,4 nm (1B).
Die Analyse durch SAXS einer Nx2D/pDNA-Probe (2B) zeigte drei Beugungsspitzen: eine, welche wiederholte Abstände von 2 π/0,094 = 6,9 +/– 1 nm anzeigt, und die zweite und vierte Ordnung, welche die Mehrlagenstruktur anzeigt (2π/0,18). Die relative Breite der Röntgenbeugung wies hin auf hochgeordnete Spherulit-ähnliche Partikel aufgebaut aus wenigstens einem Dutzend Schichten. So bestätigte SAXS klar die ultralaminare Struktur von Nx2D/pDNA und die mit cryoEM beobachtete Periode. Die Untersuchung durch dynamische Lichtstreuung zeigte eine Neutraplex^TM-Mittelgröße von 254 nm (Breite: 108 nm) und offenbarte eine monomodale Population mit einer Polydispersität von 0,193 (2C). Diese Spherulit-Struktur mit verschiedenen Packungstypen wurde auch durch cryoEM bei Verwendung von linearer doppelsträngiger DNA, einzelsträngiger DNA und Oligodesoxynukleotiden beobachtet (Daten nicht gezeigt). Bemerkenswert ist, daß der Anteil von Partikeln, welche eine punktierte Anordnung zeigen, größer ist (bis zu 50%) in Neutraplex^TM geformt mit linearer doppelsträngiger DNA, einzelsträngiger DNA. Solche spezifische supramolekulare Organisation ist das Ergebnis von thermodynamischen Kräften, welche eine Kompaktierung durch konzentrisches Aufwickeln von DNA in einer flüssigkristallinen Phase verursachen.
Wir haben T4-Phagen-DNA (Sigma, St. Louis, USA), unter Verwendung der gleichen Formulierung wie zuvor in Neutraplex^TM, eingepackt. CryoEM zeigt Partikel mit sphärischer Form, die eine punktierte Anordnung, umgeben von einer dünnen Schicht und lamellaren Partikeln, zeigten (2A). Bei weniger Partikeln konnten wir die multilamellare Struktur beobachten, wie zuvor beschrieben im Fall von Neutraplex^TM, zusammengesetzt aus anderen hier untersuchten DNA-Typen. Wie in cryoEM beobachtet, zeigt die Größenverteilung dieser punktierten T4-DNA-gefüllten Partikel einen mittleren Durchmesser von 62 nm (n = 38). Zeitweilig sind einige Elemente von Streifung in Neutraplex^TM-T4 und T4-Phagenpartikeln kaum erkennbar (2A). SAXS-Muster sind vollkommen verschieden von den für Neutraplex^TM-DNA erhaltenen, wie in 2B gezeigt. Drei Reflexionen mit Abstandsverhältnissen von 1 : √3 : √4 in deρ Einheit Q werden beobachtet. Zwei sehr schwache Reflexionen mit Abstandsverhältnissen von 1 : √7 : √9 werden ebenfalls manchmal entdeckt (in 2 nicht sichtbar). Das zeigt eine hexagonale Struktur zwischen parallelen DNA-Ketten umgeben von Lipiden. Die Parameter a_H (Abstand zwischen zwei DNA-Molekülen) dieses hexagonalen Gitters scheinen von den Einzelproben abzuhängen. Werte im Bereich von 7 bis 8 nm werden gefunden. Umgekehrt sind spherulit/konzentrisches Motiv die Hauptspezies in Neutraplex^TM-pDNA cryoEM-Bildern, was übereinstimmt mit der durch SAXS nachgewiesenen Lamellarität. Eine punktierte und multilamellare Struktur war in einigen Lipoplex(Lx)-Partikeln assoziiert. Beide, flüssigkristalline und hexagonale Phasen können im gleichen Partikel koexistieren. Da T4-DNA mehr als 16 mal länger ist als die in dieser Untersuchung verwendete pDNA, beeinflussen Länge und Typ der DNA möglicherweise den Übergang zwischen beiden Phasen.
Die cryoEM-Bilder von mit T4-DNA gebildeten punktierten Neutraplex^TM-Partikeln, die beobachtet wurden, sind außerordentlich ähnlich den Bildern der T4-Lambdaphasemutante mit vollständiger Schwanzabspaltung (Lepault et al.) und von T7 Phagen (Cerittelli et al.). Diese mit T4 verwandten Phagenpartikel zeigten eine sphärische Form und einen durchschnittlichen Durchmesser von 80 nm. Neuere Untersuchungen (Lepault et al., Cerittelli et al.), die unter Verwendung von schwanzlosen Mutanten durchgeführt wurden, zeigten DNA-Packungsdomänen in viralen Partikeln. Es ist beachtenswert, daß T7-Schwanzabspaltungsmutanten in cryoEM-Bildern ein konzentrisches Ringmotiv sowie ein punktiertes Motiv zeigen, wie bei Neutraplex^TM(Nx)-pDNA beobachtet. Neutraplex^TM-T4 und -pDNA cryoEM-Bilder und SAXS zeigen den strukturellen Übergang von lamellaren und hexagonalen Phasen in Neutraplex^TM. Diese hexagonale flüssigkristalline Phase ist das Ergebnis der Verwendung eines hydrophilen nichtwäßrigen Lösungsmittels und von Verbindungen wie DOPE oder Cardiolipin. Cerittelli et al. haben angegeben, daß der Zustand von DNA-Kompaktierung in phagenviralen Partikeln der 3-D hexagonalen kristallinen Phase von DNA entsprechen sollte. Nx1D/pDNA gemäß Beispiel 2 zeigt ebenso die lamellare flüssigkristalline Phase. CryoEM-Beobachtung von Neutraplex^TM-Komplexen wurde durchgeführt in salzhaltigen Medien und ist bis zu wenigstens drei Monaten reproduzierbar.
Diese Untersuchung liefert den Nachweis der radikalen Veränderung der Partikelstruktur, die auf die Zugabe von DNA zu den Vesikeln folgt. Der erhaltene nukleolipidpartikuläre Komplex ist nicht das Ergebnis einer einfachen Aggregation sondern von supramolekularer Wiedervereinigung (reassembly), die zu stabilen Partikeln mit einer definierten und relativ homogenen Struktur führt.
Beispiel 8: In vitro-Transfektion unter Verwendung von Neutraplex^TM-Komplexen
Humane embryone 293 Nieren Zellen in halbkonfluenter Kultur wurden einem Nx2D/pGFP-DNA-Präparat (2 μg) ausgesetzt. Plasmid pGFP-DNA codiert für GFP (Green Fluorescent Protein), das ein in UV-Licht leicht nachweisbares Protein ist, 48 Stunden nach 70 bis 80% Transfektion von GFP-exprimierenden Zellen. Das Transfektionsniveau war äquivalent, wenn das gleiche Nx2D/pDNA-Präparat drei Wochen nach Lagerung bei 4°C verwendet wurde.
Beispiel 9: Expression von Humanfaktor IX in Mausblut nach intravenöser Verabreichung unter Verwendung des Neutraplex^TM-Systems
Das Humanfaktor-IX-Gen (hFIX) eingesetzt in ein Expressionsplasmid (pLIXSN) wurde mit dem Neutraplex^TM-System gemäß Beispiel 2 (Nx1D/pDNA) und Beispiel 4 (Nx2D/pDNA) assoziiert und via eine kaudale Vene Black 6 C57 Mäusen intravenös verabreicht. Diese Mäuse bildeten keine spezifischen Antikörper gegen Humanfaktor IX. 20 μg pLIXSN-DNA in der Form von Nx1D/pLIXSN-DNA Neutraplex^TM-Komplexen wurden pro Maus verabreicht. Blutproben wurden vom retro-orbitalen Sinus der Mäuse 2,5 Tage nach der Injektion entnommen und in Reagenzgläser gebracht, die Heparin oder Zitrat enthielten, und bei –20°C gelagert. hFIX wurde improvisiert nachgewiesen unter Verwendung eines ELISA-Tests. Die folgende Tabelle 9-1 faßt die erhaltenen Ergebnisse zusammen.
Tabelle 9-1
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Injektion des einen oder anderen Neutraplex^TM-Präparats eine siginifikante Expression von hFIX im strömenden Blut induzierte. Die gefundenen hFIX-Niveaus scheinen 5 bis 10 mal größer zu sein als die in der Vergangenheit nach Gentransfer unter Verwendung synthetischer Vektoren gefundenen (Baru et al., Gene 161, 143 bis 150, 1995).
Beispiel 10: Neutraplex^TM-Formulierung mit verschiedenen Nukleinsäuren

Neutraplex^TM-Formulierungen wurden mit verschiedenen Arten von Nukleinsäuren hergestellt, wie lineare doppelsträngige DNA, lineare einzelsträngige DNA, RNA und Oligodesoxynukleotide (Tabelle 10-1). Die Nukleinsäuren wurden alle formuliert, wie zuvor in Beispiel 2 beschrieben und bildeten alle stabile multilamellare monodisperse partikuläre Komplexe. Die multilamellare Struktur wurde in diesen Neutraplex^TM-Komplexen mittels cryoEM noch mehrere Monate nach der Herstellung beobachtet, was ihre hohe Stabilität zeigt Tabelle 10-1

Nukleinsäure	Größe (Polydispersität)
Lineare doppelsträngige DNA	221 nm (0,048)
Lange lineare doppelsträngige DNA	224 nm (0,198)
Lineare einzelsträngige DNA	261 nm (0,113)
RNA	188 nm (0,172)
Oligodesoxynukleotide	184 nm (0,045)

Die lange lineare doppelsträngige DNA ist die T4-Phagen-DNA (169.372 Basenpaare). Die lineare einzelsträngige DNA (M13mp8, 7.229 Basen) ist die DNA von M13-Bakteriophagenderivaten. Die lineare doppelsträngige DNA (M13mp8; 7.229 Basenpaare) ist die intrazellulare replikative Form der M13mp8 Phage produziert durch chronische Infektion in E. coli (Sigma, St. Quentin, Frankreich). RNA (Ribonukleotid) ist die 18S und 28S ribosomale RNA von Kalbsleber (2000 und 5300 Basen). ODN ist ein 27 Basen-Oligodesoxynukleotid. (XbaI, Promega, WI).
Beispiel 11: Verwendung einer monokationischen Lipidkomponente in Neutraplex^TM-Formulierungen
Phosphonolipide, wie das Dioleoyltrimethylammonium (C₁₈H₃₅O)₂-P=O-N(CH₃)₃, (GLB.43) und Dimyristoyltrimethylammonium (C₁₄H₂₉O)₂-P=O-N(CH₃)₃ (GLB.73) Phosphonolipide sind monokationische Lipide, die bei der Formulierung in Neutraplex^TM stabile monodisperse Partikel mit pDNA (pCMVβgal, 7,2 kb, CLONTECH) bildeten (Tabelle 11-1, Neutraplex^TM #1–8). Diese Präparate wurden zu HeLa-Zellen zugesetzt (2 μg pDNA/400.000 Zellen). Nach Inkubation während zwei Tagen in serumhaltigem Kulturmedium wurden die Zellen gesammelt und die β-Galactosidaseaktivität wurde unter Verwendung des Promega-Tests assayd. Das erhaltene Neutraplex^TM zeigte eine hohe Transfektionswirksamkeit in kultivierten Zellen (Tabelle 11-1). Neutraplex^TM mit negativer Ladung (d. h. Neutraplex^TM #4) haben unter den in diesem Versuch angewandten Bedingungen eine höhere Transfektionswirksamkeit im Vergleich mit denen mit positiver Ladung (d. h. Neutraplex^TM #3).
Tabelle 11-1
Beispiel 12: Verwendung von Cardiolipinderivaten und Phosphatidylserin als anionische Komponente in Neutraplex^TM-Formulierungen
Dioleoyldiphosphatidylglycerin (Cardio-C18) und Dimyristoyldiphosphatidylglycerin (Cardio-C14) sind synthetische Cardiolipinderivate (Avanti, AL, USA) und wurden anstelle des natürlichen extrahierten Cardiolipins in der Neutraplex^TM-Formulierung verwendet. Stabile Komplexe wurden gebildet mit pCMVβgal (Tabelle 11-1, Neutraplex^TM #1–5 und 8). Der gebildete Neutraplex^TM zeigte eine hohe Transfektionswirksamkeit in kultivierten Zellen.
Dioleoylphosphatidylglycerin und Dimyristoylphosphatidylglycerin (Pserin-C18 und Pserin-14) sind anionische Phospholipide, die anstelle des natürlichen extrahierten Cardiolipins in Neutraplex^TM-Formulierungen verwendet wurden (Tabelle 11-1, Neutraplex^TM #6 und 7). Stabile Komplexe wurden mit pCMVβgal gebildet. Die gebildeten Neutraplex^TM-Partikel zeigten eine hohe Transfektionswirksamkeit in kultivierten Zellen (Tabelle 11-1).
Beispiel 13: Verwendung von Cholesterin als die neutrale Komponente in Neutraplex^TM-Formulierungen
Cholesterin wurde als die neutrale Komponente in der Neutraplex^TM-Formulierung verwendet. Die mit pCMVβgal erhaltenen Komplexe bildeten stabile monodisperse Partikel. Der gebildete Neutraplex^TM zeigte hohe Transfektionswirksamkeit in kultivierten Zellen (Tabelle 11-1, Nx4, 6–8). Neutraplex^TM-Partikel, die ohne eine neutrale Komponente (Nx5) mit den gleichen positiven und negativen Komponenten und der gleichen Menge DNA formuliert wurden (Nx4, Nx5) zeigten niedrige Transfektionswirksamkeit. Außerdem ist bemerkenswert, daß die Transfektionswirksamkeit von positiven sowie negativen Neutraplexen^TM gleich oder höher war in Gegenwart von Serum im Vergleich mit der Abwesenheit von Serum (4 Stunden Inkubation) war ihre hohe Stabilität in einer biologischen Umgebung zeigt.
Beispiel 14: Verwendung von Polymeren in Neutraplex^TM-Formulierungen
Poly-L-Glutamat (Sigma) mit 1000 MW, ein negativ geladenes peptidisches Polymer das sechs Ladungen pro Molekül enthält, wurde in der Neutraplex^TM-Formulierung anstelle des negativen Bestandteils verwendet. Poly-L-Glutamat wurde dem Lipidfilm in 50 oder 150 μl von 90%-igem Ethanol (1 mg/ml) zugesetzt.
Glucidex 6 QAE, ein kationisches polysaccharidisches Polymer mit sechzehn Zuckereinheiten wurde mit Kationen derivatisiert (1,82 mEq/mg). Glucidex 6 QAE wurde in der Neutraplex^TM-Formulierung anstelle des positiven Bestandteils verwendet. Es wurde dem neutralen Lipid in 200 μl 80%-igem Ethanol (6,6 mg/ml) zugesetzt um einen getrockneten Film zu bilden. SUV wurden gebildet nach Zugabe von Wasser zur Ethanolmischung. pDNA (pCMVβgal) und SUV wurden vor dem Mischen in Wasser verdünnt. Die Größenverteilung und Ladung der erhaltenen Partikel wurden analysiert durch dynamische Lichtstreuung mit einem ZetaSizer 3000 von Malvern.
Einige Präparate wurden der HeLa-Zellkultur zugesetzt, und die β-Galaktosidase-Aktivität wurde durch Spektrometrie unter Verwendung des Promega Tests (Promega, Paris) bestimmt. Transfektionsexperimente wurden doppelt durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14-1 zusammengefaßt:
Tabelle 14-1
Die mit den Kontrollpräparaten 1 bis 5, welche kein Poly-L-Glutamat enthielten, erhaltenen Daten zeigen, daß keine negativ geladene Partikeln erhalten werden konnten, selbst in Gegenwart von 60 μg pDNA/2 mg Lipid. Wenn Polyglutaminsäure zugesetzt wurde (Neutraplex^TM-Präparate 6–10) erschienen negativ geladene Partikel, was den Einbau von Glutaminsäure in die Komplexe beweist. Im Gegensatz dazu korrelierte der Zusatz von steigender Konzentration pDNA mit einer Abnahme des Zetapotentials, was den Übergang zu negativ geladenen Partikeln anzeigt (Neutraplex^TM-Präparate 6–10). Die Neutraplex-Formulierungen Nr. 6 und Nr. 9 (positiv geladen) und Nr. 10 (negativ geladen) führten zu Transgenexpression mit 3.1, 2.9 und 2.2 mU/ml.
Die mit den Kontrollpräparaten Nr. 11 bis 13 erhaltenen Daten zeigten, daß in Abwesenheit eines kationischen Bestandteils keine Komplexe oder Partikel gebildet werden können. In Gegenwart von Glucidex 6 QAE anstelle des kationischen Bestandteils (Nx4) werden mit DNA partikuläre Komplexe gebildet. Die Zugabe steigender Konzentrationen an pDNA korrelierte mit einer Abnahme des Zetapotentials, was den Übergang zu negativ geladenen Partikeln anzeigt (Neutraplex^TM-Präparate 14–16).
Beispiel 15: Verwendung von Detergentien in Neutraplex^TM-Formulierungen
CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid), ein kationisches Netzmittel (Amphiphil) wurde als die kationische Komponente in einer Neutraplex^TM-Formulierung verwendet. Wenn 15 μg bzw. 60 μg pCMVβgal mit 0,8 mg CTAB, 1 mg DOPE und 0,5 mg Cardiolipin formuliert wurden, zeigten die Präparate stabile und monodispergierte Partikel (222 nm, Polydispersität 0,028 bzw. 205 nm, Polydispersität 0,172) und ein Zetapotential von 17 bzw. –37 mV. Die Anwesenheit von transfizierten Zellen wurde nachgewiesen durch β-Galaktosidase-histochemische Analyse.
Lysophosphatidylglycerin, ein anionisches Netzmittel (Amphiphil) wurde als die anionische Komponente in einer Neutraplex^TM-Formulierung verwendet. Wenn 15 μg und 60 μg pCMVβgal mit 1,8 μg GLB.43, 0.5 mg Cholesterin und 0,5 mg Lysophosphatidylglycerin formuliert wurden, zeigten die Präparate stabile und monodispergierte Partikel (196 nm, Polydispersität 0,187 bzw. 308 nm, Polydispersität 0,186) und ein Zetapotential von 64 bzw. –8 mV. Die Transfektionswirksamkeit der obigen Neutraplex^TM-Formulierungen betrug 2,1 mU βgal bei Zugabe von 60 mg DNA.
Beispiel 16: Verwendung von Nukleosid als das negative therapeutische Mittel, das in Neutraplex^TM-Formulierung zu übergeben ist
8-Azidoadenin-5'-monophosphat (AZA) ist ein Nukleosid, das ähnlich AZT ist, welches das für AIDS-Therapie verwendete antivirale Arzneimittel ist. Wegen seiner anionischen Art (eine Ladung/Molekül, 388,2 mW) wurde AZA in einem Neutraplex^TM-Partikel, wie in Beispiel 2 beschrieben, formuliert als ein Beispiel einer anstelle der Nukleinsäuren verwendeten biologisch aktiven Substanz. In Wasser verdünntes AZA (5 mg/ml) wurde den Vesikeln zugesetzt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 16-1 zusammengefaßt
Tabelle 16-1
Die erhaltenen Komplexe zeigten hohe Stabilität und monodispergierte Populationsgröße, wenn AZA zugefügt wurde. Eine Erhöhung der AZA-Konzentration führte zu einer Abnahme des Zetapotentials, was den ansteigenden Einbau von AZA in das Neutraplex^TM zeigte.
Beispiel 17: Verwendung von Isopropanol als Lösungsmittel in der Neutraplex^TM-Formulierung
Isopropanol wurde als das nicht wäßrige Lösungsmittel für die Herstellung von SUV verwendet, das aus 1,8 mg GLB.43, 0.5 mg Cholesterin und 0,5 Cardio-C14:0 hergestellt war. Wenn 15 bzw. 40 μg pCMVβgal mit solchem SUV gemischt wurden, wurden stabile und monodispergierte partikuläre Komplexe erhalten (231 nm, Polydispersität 0.025, 69 mV bzw. 233 nm, Polydispersität 0.114, –27 mV).

Claims

Ein stabiler, aus Partikeln bestehender Komplex mit einer globalen negativen oder neutralen Ladung, einer sphärischen Form, und einer lamellenförmigen, gerollten und kondensierten aus Partikeln bestehenden Struktur, wobei der Komplex eine global anionische biologisch aktive Substanz und eine Mischung eines kationischen Bestandteils und eines anionischen Bestandteils beinhaltet, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer des kationischen Bestandteils und des anionischen Bestandteils ein Lipid ist.
Ein Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung zusätzlich einen neutralen Bestandteil beinhaltet.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex ein Ladungsverhältnis von ungefähr 0,01 bis 1 aufweist.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex ein Ladungsverhältnis von ungefähr 0,01 bis 0,9 aufweist.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der kationische Bestandteil fähig ist, die global anionische biologisch aktive Substanz zu kondensieren.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid ein Phospholipid ist.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der kationische Bestandteil ein Lipomonoamin oder ein Lipopolyamin beinhaltet.
Ein Komplex nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipopolyamin DOGS beinhaltet.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der anionische Bestandteil ein Diphosphatidylglycerin enthält.
Ein Komplex nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Diphosphatidylglycerin Cardiolipin ist.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl der kationische Bestandteil als auch der anionische Bestandteil Lipide sind.
Ein Komplex nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipide Phospholipide sind.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der kationische Bestandteil ein Nicht-Lipid ist.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der anionische Bestandteil ein Nicht-Lipid ist.
Ein Komplex nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Nicht-Lipid ein Polymer oder ein Detergens ist.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis des kationischen Bestandteils zum anionischen Bestandteil ungefähr 0,1 : 2 bis 10 : 1 ist.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der neutrale Bestandteil ein Lipid enthält.
Ein Komplex nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid ein Phospholipid ist.
Ein Komplex nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid DOPE enthält.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der neutrale Bestandteil Cholesterin enthält.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis des kationischen Bestandteils: neutralen Bestandteils: anionischen Bestandteils ungefähr 1 : 1 : 0,1 bis 1 : 1: 1 ist.
Ein Komplex nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der kationische Bestandteil DOGS, der anionische Bestandteil Cardiolipin und der neutrale Bestandteil DOPE oder Cholesterin ist.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die global anionische biologisch aktive Substanz ein Nukleinsäuremolekül ist.
Ein Komplex nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuremolekül eine doppel- oder einzelsträngige DNA oder RNA enthält.
Ein Komplex nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder RNA ein Oligonukleotid oder Ribosom enthält.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die global anionische biologisch aktive Substanz Heparin oder ein Gangliosid enthält.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die global anionische biologisch aktive Substanz ein Chromosom oder ein Fragment eines Chromosoms, ein Prokaryot oder virales Genom oder ein Fragment eines Prokaryoten oder eines viralen Genoms ist.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die global anionische biologisch aktive Substanz ein Protein, Peptid, Glykopeptid, Lipoprotein, Glykolipid, Nukleosid, Hormon oder Vitamin enthält.
Ein Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 28, der zusätzlich ein kompatibles Medium für pharmazeutischen Gebrauch enthält.