JP4919397B2

JP4919397B2 - 核酸導入用組成物

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Publication number: JP4919397B2
Application number: JP2006181642A
Authority: JP
Inventors: 寛菊池; 英夫小林; 浩一橋本; 綾子飯島; 大悟浅野; 純子安田
Original assignee: HOKKAIDO SYSTEM SCIENCE Co Ltd
Current assignee: HOKKAIDO SYSTEM SCIENCE Co Ltd
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2026-06-30
Also published as: WO2008001504A1; US20100055684A1; US20130149369A1; JP2008005801A; US8920832B2

Description

本発明は、核酸を細胞内へ導入するための組成物に関する。

遺伝子などの核酸を細胞内に導入する方法として、カチオン性脂質単独またはこれを含むリポソームと核酸とが形成する複合体を用いる方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。実際、この方法用の試薬として、例えば、「リポフェクトアミン」、「リポフェクチン」、「トランスフェクタム」、「ジーントランスファー」、「リポフェクトアミン２０００」などが市販されている。

しかしながら、これら市販の試薬には、次のような問題点が指摘されている。ａ）製剤としての保存安定性が悪く、リポソーム等を用いた遺伝子の細胞内導入・発現において再現性が悪い。ｂ）細胞培養のための培地中に添加する血清（Fetal Bovine Serum）中で非常に不安定であり、細胞を培養している血清入り培地をいったん無血清培地に置き換え、導入後また血清入り培地に戻すという煩雑な手順が用いられている。また最近では、血液中あるいは体内においても非常に不安定であることが明らかになりつつある。ｃ）市販品の多く（例えば、リポフェクトアミン、リポフェクチン、リポフェクトアミン２０００）は既に脂質が水に分散した形でのみ提供されており、ここに外から遺伝子水溶液を添加する手順となっているが、これでは、リポソームの外側に遺伝子が結合した複合体は製造することができても、遺伝子を内封したリポソームを製造することは不可能である。また、リポフェクトアミン２０００はカチオン性脂質の過酸化物形成を避けるため、過剰な撹拌、振盪ができず、細心の注意が必要であるといった煩雑さを有する。ｄ）細胞毒性が非常に強い。

このように、遺伝子などの核酸をカチオン性脂質単独またはリポソームを用いて細胞内に導入させる試薬はいくつか販売されてはいるが、多くの問題をかかえている。

特開平２−１３５０９２号公報

本発明は、細胞毒性が低く、被導入核酸の細胞内導入性および細胞内での発現を改善した核酸導入用組成物を提供することに関する。

本発明者らは、低細胞毒性、遺伝子などの核酸の細胞内導入性、ひいては細胞内での発現を改善方法について鋭意検討した結果、ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドおよびリン脂質を遺伝子などの核酸とともに投与または細胞に供給することにより、細胞毒性なしに、核酸が効率良く導入されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
１）ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドおよびリン脂質を含有する細胞への核酸導入用組成物。
２）ジテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロールを含有する細胞への核酸導入用組成物。
３）ジテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールおよびプロタミンを含有する細胞への核酸導入用組成物。
４）ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライド、リン脂質および核酸を含有する組成物をイン・ビトロまたはイン・ビボで細胞に適用することを特徴とする核酸の細胞への導入方法。

本発明の組成物を用いれば、細胞毒性なくして、核酸を効率良く細胞に導入できる。従って、本発明の組成物は、核酸導入用試薬又は医薬として有用である。

本発明の核酸導入用組成物は、被導入核酸と共に用いて、該核酸を細胞へ導入するための組成物であるが、少なくとも、ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドおよびリン脂質を含有するものであればよく、被導入核酸を含有するもの（核酸含有組成物）、および被導入核酸を含有しないものが包含される。

本発明の組成物に係るジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドは公知化合物であり、公知の方法により製造することができる。この化合物の窒素原子に結合するＣ_12-16アルキル基としては、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基を挙げることができ、窒素原子に結合する２つのＣ_12-16アルキル基は同一の基でも異なる基でもよい。また、ハライドとしては、クロリド、ブロミドなどを挙げることができる。ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドとしては、相互薬工株式会社より、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（製品名：ＤＣ−１−１２）、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド（製品名：ＤＣ−１−１４）、ジヘキサデシルジメチルアンモニウムブロミド（製品名：ＤＣ−１−１６）が市販されており、このものを用いてもよい。本発明においては、ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドとして、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミドが特に好ましい。

本発明の組成物に係るジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドの含有量は、本発明の組成物中の全脂質量に応じて適宜決定すればよいが、全脂質量に対して２０〜６０モル％とするのが好ましく、３０〜５０モル％とするのがより好ましい。

本発明の組成物に係るリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種または２種以上を組み合せて用いることができる。このうち、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンを単独または組み合せて用いるのがより好ましく、ホスファチジルエタノールアミンを用いるのが特に好ましい。なお、これらリン脂質の脂肪酸残基としては、特に限定されるものではなく、炭素数１２〜１８の飽和または不飽和脂肪酸残基が挙げられ、パルミトイル基、オレオイル基、ステアロイル基、リノレイル基等が好ましい。本発明に係るリン脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンが特に好ましい。

上記リン脂質の本発明の組成物への配合量は、全脂質量に応じて適宜検討すればよいが、ジ（Ｃ_12-18アルキル）ジメチルアンモニウムハライドとリン脂質の比（モル比）が１：４〜４：１であることが好ましく、２：３〜３：２であることがより好ましい。

また、本発明の組成物においては、コレステロールおよび／またはコレスタノールなどのステロール類をさらに配合することができ、その配合量としては、組成物中の全脂質量の０〜５０モル％が好ましく、１０〜５０モル％がより好ましい。

本発明の組成物に適用される被導入核酸としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのショートオリゴペプチドや酵素、サイトカイン等の生理活性物質、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子等を挙げることができる。

本発明においては、核酸をより効率良く細胞内に導入するために、ポリＬ−リジン、プロタミンもしくはその塩、プロネクチン、スペルミン、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、酪酸ナトリウムなどのエンハンサーとして知られる成分をさらに配合してもよい、これらは単独でもよく、また組み合わせて用いてもよい。

本発明の組成物において、ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドの含有量は、核酸を細胞内に導入するのに充分な量であればよく、核酸の種類、用途、組成物の形態等に応じて適宜決定すればよいが、例えば、核酸２００ｎｇに対してジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライド１２５〜２０００ｐモル含むものが好ましく、２５０〜１０００ｐモル含むものがより好ましい。また、リン酸基換算で１モルのｓｉＲＮＡに対してジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライド０．１〜１０モル含むものが好ましく、０．５〜２モル含むものがより好ましい。例えば、２７ｍｅｒのｓｉＲＮＡを用いる場合、ｓｉＲＮＡ１モルに対してジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライド５．４〜５４０モル含むものが好ましく、２７〜１０８モル含むものがより好ましい。

本発明の組成物は、ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドとリン脂質やこれらのほかに所望によりステロール類やエンハンサーを含んだ単なる混合物としての形態でもよいし、ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライド、リン脂質およびステロール類との組み合わせで脂質膜構造体を形成した形態でもよい。

当該脂質膜構造体の形態は、特に限定されないが、例えば、乾燥した脂質混合物形態、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態などを挙げることができる。
このうち、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、例えば、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。これらのうちリポソームが好ましい。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には粒子径が５０ｎｍ〜５μｍであり、球状ミセルの場合、粒子径が５〜１００ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５〜１０ｎｍであり、これらが層を形成しているものが好ましい。

以下に、各種の脂質膜構造体について、その製造例を説明する。
１）乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の構成成分全てを一旦クロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。

２）脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。

水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されるべきものではなく、例えば、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）等を加えてもよい。この水系溶媒（分散媒）に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）中の電解質を極力なくすことが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）のｐＨを酸性から中性付近（ｐＨ３．０〜８．０）に設定することや窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが望ましい。
ここで、糖または多価アルコールの濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した状態において、例えば、糖（水溶液）は、２〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５〜１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール（水溶液）は、１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２〜２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）として、緩衝液を用いる場合には、緩衝剤の濃度が５〜５０ｍＭが好ましく、１０〜２０ｍＭがさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）における脂質膜構造体の濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体の構成成分として用いるジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドおよびリン脂質、所望によりステロール類を含む全脂質の濃度は、０．２〜５０ｍＭが好ましく、１〜１０ｍＭがさらに好ましい。

３）脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態を乾燥または凍結させた形態は、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体を通常の凍結乾燥や噴霧乾燥による乾燥または凍結方法等により製造することができる。水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に核酸含有水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために核酸を効率よく脂質膜構造体に保持させることができる長所がある。

凍結乾燥や噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定に長期間保存することができる。また、凍結する場合には、例えば、前記した糖（水溶液）やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール（水溶液）をそれぞれ用いると安定に長期間保存することができる。糖と多価アルコールとを組み合わせて用いてもよい。

本発明の核酸導入用組成物は、被導入核酸を含有させた組成物（核酸含有組成物）とすることができるが、以下にこの場合の組成物について説明する。
組成物の形態としては、ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライド、リン脂質と核酸やこれらのほかに所望によりステロール類やエンハンサーを含んだ単に混合物として存在していてもよいし、ジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライド、リン脂質およびステロール類との組み合わせで形成された脂質膜構造体と核酸とが混合した形態でもよいし、さらに脂質膜構造体に核酸が保持された形態でもよい。ここで、「保持」とは、核酸が脂質膜構造体の脂質膜の中、表面、内部、脂質層中、および／または脂質層の表面に存在することを意味する。脂質膜構造体が、例えばリポソームなどの微粒子である場合には、微粒子内部に核酸を封入することもできる。

また、脂質膜構造体の形態は、前述の脂質膜構造体と同様に、混合乾燥物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態などを挙げることができる。

以下に、各種の脂質膜構造体について、その製造例を説明する。
１）混合乾燥物形態とする場合には、例えば、脂質膜構造体の構成成分と核酸とを一旦クロロホルム等の有機溶媒で溶解させて混合物を得て、次にこれをエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥に付することにより製造することができる。

２）脂質膜構造体と核酸を含む水系溶媒に分散した形態とする場合には、その製造方法としてはいくつかの方法が知られており、脂質膜構造体における核酸の保持様式や混合物の性状などに応じて、下記２−１〜２−５のように適宜の製造法を選択することができる。

２−１）製造法１
上述の混合乾燥物に水系溶媒を添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行い製造する方法である。大きさ（粒子径）を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。この方法の場合、まず、脂質膜構造体の構成成分と核酸との混合乾燥物を作るために、脂質膜構造体と核酸を有機溶媒に溶解する必要があるが、脂質膜構造体の構成成分と核酸との相互作用を最大限に利用できる長所がある。すなわち、脂質膜構造体が層状構造を有する場合にも、核酸は多重層の内部にまで入り込むことが可能であり、この製造方法を用いると核酸の脂質膜構造体への保持率を高くできる長所がある。

２−２）製造法２
脂質膜構造体の構成成分を有機溶媒で一旦溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に、さらに核酸を含む水系溶媒を添加して乳化を行い製造する方法である。大きさ（粒子径）を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解し得る核酸に適用できる。脂質膜構造体がリポソームの場合、内水相部分にも核酸を保持できる長所がある。

２−３）製造法３
水系溶媒に既に分散したリポソーム、エマルション、ミセル、または層状構造物などの脂質膜構造体に、さらに核酸を含む水系溶媒を添加して製造する方法である。対象となる核酸としては、水溶性のものを利用できる。既にでき上がっている脂質膜構造体に外部から核酸を添加する方法であることから、核酸が高分子の場合には、核酸は脂質膜構造体の内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に存在（結合）した存在様式をとる可能性がある。脂質膜構造体としてリポソームを用いた場合、この製造法３を用いると、核酸がリポソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造（一般的には複合体あるいはコンプレックスと呼ばれている。）を形成することが知られている。この製造法では、脂質膜構造体単独の水分散液をあらかじめ製造するため、乳化時における核酸の分解等を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。したがって、製造法１や製造法２に比べて比較的容易に製造することができる。

２−４）製造法４
水系溶媒に分散した脂質膜構造体を製造して乾燥することにより得られた乾燥物に、さらに核酸を含む水系溶媒を添加して製造する方法である。製造法３と同様に対象となる核酸としては、水溶性のものを利用できる。製造法３との相違点は、脂質膜構造体と核酸との存在様式にあり、この製造法４では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥させた乾燥物を製造することから、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるためには、前記したように水系溶媒に、さらに糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。ここで、核酸を含む水系溶媒を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに速やかに水和し始め、脂質膜構造体を再構築することができる。この時、核酸が脂質膜構造体内部に保持された形態の構造体が製造できる。
製造法３では、核酸が高分子の場合には、核酸は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとるが、製造法４はこの点で大きく異なる。すなわち、核酸の一部または全部は脂質膜構造体内部に取り込まれる。この製造法４は、脂質膜構造体単独の分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の核酸の分解を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。従って、製造法１や製造法２に比べて比較的製造が容易である。また、この他に、一旦凍結乾燥または噴霧乾燥を行うため、製剤（核酸含有組成物）としての保存安定性を保証し易く、乾燥製剤を核酸の水溶液で再水和しても大きさ（粒子径）を元に戻せること、高分子の核酸であっても、脂質膜構造体内部に核酸を保持させ易いことなどの長所がある。

２−５）その他
脂質膜構造体と核酸との混合物が水系溶媒に分散した形態を製造するための他の方法としては、リポソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば逆相蒸発法などを採用できる。大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。

３）上記の脂質膜構造体と核酸との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに乾燥させる形態とする場合には、凍結乾燥や噴霧乾燥等する方法を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上述の糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。脂質膜構造体と核酸との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられるが、この場合の水系溶媒としては、糖（水溶液）や多価アルコール（水溶液）を添加した溶媒を用いるのが好ましい。

斯くして得られる本発明の組成物を用いれば、細胞内に核酸を効率良く導入することができる。例えば、イン・ビトロの場合には、標的細胞を含む懸濁液に本発明の核酸含有組成物を添加したり、当該核酸含有組成物を含有する培地で標的細胞を培養する等の手段により、当該標的細胞に核酸を導入できる。また、イン・ビボの場合には、本発明の核酸含有組成物をヒトまたは非ヒト動物に投与すればよい。投与手段としては、経口投与でも、非経口投与でもよく、経口投与の剤形としては、通常知られているものでよく、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤等を挙げることができ、非経口投与の剤形としては、通常知られているものでよく、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。好ましくは、非経口投与である。中でも、注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。

以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（相互薬工株式会社製（製品名：ＤＣ−１−１２））、コレステロール（和光純薬株式会社製）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE；日本油脂株式会社製）を表１の配合比率（モル比）でクロロホルムに溶解させ、これを減圧乾固させて脂質混合物とした。この脂質混合物に9%スクロース溶液を加え、65℃加温下、ソニケーターで間接的に超音波照射することでジドデシルジメチルアンモニウムブロミド濃度2.5mMのリポソーム粗分散液を得た。次に、リポソームの粒子径を揃えるため、孔径0.22μmのフィルターを2枚重ねてイクストリューダーにセットし、約65℃加温、加圧下、イクストルージョン（押し出し濾過）した。更に、孔径0.1μmのフィルターを用いて同様にイクストリュージョンし、これを空のリポソーム分散液とした。このリポソーム分散液を2mLバイアルに1mLずつ分注し、凍結乾燥し、凍結乾燥リポソーム（処方例１および２）を得た。
NICOMP 380ZLS（Particle Sizing Systems社）を用いて、処方例１および２の平均粒子径およびゼータ電位を測定した結果、粒子径は141nm（処方例１）、94nm（処方例２）、ゼータ電位は22mV（処方例１）、26mV（処方例２）であった。

実施例２
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミドにかえて、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド（相互薬工株式会社製（製品名：ＤＣ−１−１４））を用いた以外は実施例１と同様にして表２に示す凍結乾燥リポソーム（処方例３および４）を得た。
実施例１と同様にして、処方例３および４の平均粒子径およびゼータ電位を測定した結果、粒子径は122nm（処方例３）、83nm（処方例４）、ゼータ電位は24mV（処方例３）、13mV（処方例４）であった。

実施例３
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミドにかえて、ジヘキサデシルジメチルアンモニウムブロミド（相互薬工株式会社製（製品名：ＤＣ−１−１６））を用いた以外は実施例１と同様にして表３に示す凍結乾燥リポソーム（処方例５および６）を得た。
実施例１と同様にして、処方例５および６の平均粒子径およびゼータ電位を測定した結果、粒子径は122nm（処方例５）、159nm（処方例６）、ゼータ電位は26mV（処方例５）、20mV（処方例６）であった。

対照例
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミドにかえて、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（相互薬工株式会社製（製品名：ＤＣ−１−１８））を用いた以外は実施例１と同様にして表４に示す凍結乾燥リポソーム（対照例１および２）を得た。
実施例１と同様にして、対照例１および２の平均粒子径およびゼータ電位を測定した結果、粒子径は94nm（対照例１）、177nm（対照例２）、ゼータ電位は26mV（対照例１）、22mV（対照例２）であった。

試験例１ＣＨＯ細胞への核酸導入試験
以下の配列のsiRNAの水溶液（1 pmol/μL）をF-12HAM培地で6.25倍希釈しsiRNA希釈溶液とした。別に処方例１中のＤＣ−１−１２濃度が約1mMとなるように適量の水を加え復水した。

sense 5'- ACAUCACGUACGCGGAAUACUUCGA -AG -3'（配列番号１）
antisense 3'-UA- UGUAGUGCAUGCGCCUUAUGAAGCU -5（配列番号２）
この液をF12Ham培地で3.47倍、20.8倍および125倍に希釈した。各々の液にこれらと等量のsiRNA希釈溶液を添加、混合し、siRNA／リポソーム複合体を形成させた。この時、siRNA由来のアニオン量とＤＣ−１−１２由来のカチオン量の比は、それぞれ約３３、６および１となる。さらにこれらの液にこれらと等量の20％FBS含有F-12HAM培地を添加、混合し、siRNA／リポソーム複合体含有培地とした。CHO（pMAM-luc）細胞（JCRB0136.1、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）の培地をsiRNA／リポソーム複合体含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。37℃、5％CO₂で約41時間培養後、培地を1μMデキサメサゾン、10％FBS含有F-12HAM培地と交換した。37℃、5％CO₂で約6〜8時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性をスコア化（−：視野の85〜100％程度を細胞が占めており、毒性による損傷の痕跡も認められない、±：視野の85〜100％程度を細胞が占めているが、一部に毒性による損傷の痕跡が認められる、＋：視野の70〜80％程度を細胞が占めている、＋＋：視野の50〜70％程度を細胞が占めている、＋＋＋：視野の50％程度未満しか細胞が占めていない）し、結果を表５に示した。培地除去後、PBSで洗浄した。PLBで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記siRNA溶液に代え水を用いて同様の実験を実施した。また、処方例２〜６、対照例１および２についても同様に実施し、ノックダウン率（％）を式（１）に基づき算出した。結果を表５に示した。

式（１）：１００×（siRNA添加時のルシフェラーゼ活性値／siRNA無添加時のルシフェラーゼ活性値）

別に、陽性コントロールとして、リポフェクトアミン2000（商品名：インビトロジェン社）を用いて、ノックダウン率の評価を行った。
siRNA溶液（1 pmol/μL）をF12Ham培地で2.5倍希釈しsiRNA希釈溶液とした。別にリポフェクトアミン2000（商品名：インビトロジェン社）をF-12HAM培地で50倍希釈した。さらにこの液にこれと等量のsiRNA希釈溶液を加え、siRNA／リポフェクトアミン2000含有培地とした。この培地20μLを別途培養中のCHO（pMAM-luc）細胞（培地量：100μL）に添加し、トランスフェクションを開始した。37℃、5％CO₂で約41時間培養後、培地を1μMデキサメサゾン、10％FBS含有F12-Ham培地と交換した。37℃、5％CO₂で約7時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を前述のようにスコア化した。培地除去後、PBS（-）で洗浄した。1×PLBで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記siRNA溶液に代え水を用いて同様の実験を実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果、細胞毒性は、スコアにすると−であったが細胞中に白色の斑点が認められた。ノックダウン率は、４１（％）であった。

試験例２ＨｅＬａ細胞への核酸導入試験
以下の配列のsiRNAの水溶液（1 pmol/μL）をDULBECCO'S MODIFIED EAGLE'S MEDIUM（以下、DMEM）培地で6.25倍希釈しsiRNA希釈溶液とした。別に処方例１中のＤＣ−１−１２濃度が約1mMとなるように適量の水を加え復水した。
sense 5'- ACAUCACUUACGCUGAGUACUUCGA -AG -3' （配列番号３）
antisense 3'-UA- UGUAGUGAAUGCGACUCAUGAAGCU -5 （配列番号４）

この液をDMEM培地で28.8倍、115倍および215倍に希釈した。各々の液にこれらと等量のsiRNA希釈溶液を添加、混合し、siRNA／リポソーム複合体を形成させた。この時、siRNA由来のアニオン量とＤＣ−１−１２由来のカチオン量の比は、それぞれ約４、１および０．５となる。さらにこれらの液にこれらと等量の20％FBS含有DMEM培地を添加、混合し、siRNA／リポソーム複合体含有培地とした。NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line（Panomics社）の培地をsiRNA／リポソーム複合体含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。37℃、5％CO₂で約18時間培養後、培地を10 ng/mLのPMA、0.5 μM Calcium ionophore A23187および10％FBS含有DMEM培地と交換した。37℃、5％CO₂で約6時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化し、結果を表５に示した。培地除去後、PBSで洗浄した。PLBで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記siRNA溶液に代え水を用いて同様の実験を実施した。また、処方例２〜６、対照例１および２についても同様に実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果を表５に示した。

別に、陽性コントロールとして、リポフェクトアミン2000（商品名：インビトロジェン社）を用いて、ノックダウン率の評価を行った。
siRNA溶液（1 pmol/μL）をDMEM培地で2.5倍希釈しsiRNA希釈溶液とした。別にリポフェクタミン2000をDMEM培地で100倍希釈した。さらにこの液にこれと等量のsiRNA希釈溶液を添加し、siRNA／リポフェクトアミン2000含有培地とした。この培地20μLを別途培養中のNFAT Reporter HeLa Stable Cell Line（Panomics社）の培地（100μL）に添加し、トランスフェクションを開始した。37℃、5％CO₂で約18時間培養後、培地を10 ng/mLのPMA、0.5 μM Calcium ionophore A23187および10％FBS含有DMEM培地と交換した。37℃、5％CO₂で約6時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化した。培地除去後、PBS（-）で洗浄した。１×PLBで細胞を溶解後ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記siRNA溶液に代え水を用いて同様の実験を実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果、細胞毒性は、スコアにすると−であったが細胞中に白色の斑点が認められた。ノックダウン率は、９（％）であった。

表５からわかるように、本発明に係る処方例１〜６は優れた核酸導入効率（ノックアウト率）および低細胞毒性を示した。中でも、処方例４はリポフェクトアミン２０００を用いても核酸を導入しづらいＣＨＯ細胞においても、優れた核酸導入効率および低細胞毒性を示した。

実施例４
実施例２と同様にして、表６に示す凍結乾燥リポソーム（製剤例Ａ〜Ｏ）を得た。
実施例１と同様にして、製剤例Ａ〜Ｏの平均粒子径およびゼータ電位を測定した結果、粒子径は98nm（製剤例Ａ）、133nm（製剤例Ｂ）、150nm（製剤例Ｃ）、319nm（製剤例Ｄ）、112nm（製剤例Ｅ）、107nm（製剤例Ｆ）、116nm（製剤例Ｇ）、58nm（製剤例Ｈ）、71nm（製剤例Ｉ）、89nm（製剤例Ｊ）、111nm（製剤例Ｋ）、84nm（製剤例Ｌ）、63nm（製剤例Ｍ）、55nm（製剤例Ｎ）、50nm（製剤例Ｏ）、ゼータ電位は18mV（製剤例Ａ）、27mV（製剤例Ｂ）、23mV（製剤例Ｃ）、26mV（製剤例Ｄ）、27mV（製剤例Ｅ）、25mV（製剤例Ｆ）、16mV（製剤例Ｇ）、17mV（製剤例Ｈ）、22mV（製剤例Ｉ）、19mV（製剤例Ｊ）、23mV（製剤例Ｋ）、24mV（製剤例Ｌ）、22mV（製剤例Ｍ）、18mV（製剤例Ｎ）、24mV（製剤例Ｏ）であった。

試験例３ＣＨＯ細胞への核酸導入試験
試験例１で用いたsiRNA溶液（1 pmol/μL）をF-12HAM培地で6.25倍希釈しsiRNA希釈溶液とした。別に製造例A中のＤＣ−１−１４濃度が約1mMとなるように適量の水を加え復水した。この液をF-12HAM培地で14.4倍、19.2倍および28.8倍に希釈した。各々の液にこれらと等量のsiRNA希釈溶液を添加、混合し、siRNA／リポソーム複合体を形成させた。この時、siRNA由来のアニオン量とＤＣ−１−１４由来のカチオン量の比は、それぞれ約８、６および４となる。さらにこれらの液にこれらと等量の20％FBS含有F-12HAM培地を添加、混合し、siRNA／リポソーム複合体含有培地とした。CHO（pMAM-luc）細胞（JCRB0136.1、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）の培地をsiRNA／リポソーム複合体含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。37℃、5％CO₂で約41時間培養後、培地を1μMデキサメサゾン、10％FBS含有F-12HAM培地と交換した。37℃、5％CO₂で約6〜8時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化した。培地除去後、PBS（-）で洗浄した。１×PLBで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記siRNA溶液に代え水を用いて同様の実験を実施した。また、製造例Ｂ〜Ｏ、処方例３および４についても同様に実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果を表７に示した。
別に、陽性コントロールとして、リポフェクトアミン2000（商品名：インビトロジェン社）を用いて、試験例１と同様に細胞毒性のスコア化およびノックダウン率（％）を算出した。
結果、細胞毒性は−であったが細胞中に白色の斑点が認められた。ノックダウン率は、３２．１±９．４（％）であった。

試験例４ＨｅＬａ細胞への核酸導入試験
試験例２で用いたsiRNA溶液（1 pmol/μL）をDMEM培地で6.25倍希釈しsiRNA希釈溶液とした。別に製造例A中のＤＣ−１−１４濃度が約1mMとなるように適量の水を加え復水した。この液をDMEM培地で28.8倍、57.7倍、115倍および500倍に希釈した。各々の液にこれらと等量のsiRNA希釈溶液を添加、混合し、siRNA／リポソーム複合体を形成させた。さらにこれらの液にこれらと等量の20％FBS含有DMEM培地を添加、混合し、siRNA／リポソーム複合体含有培地とした。NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line（Panomics社）の培地をsiRNA／リポソーム複合体含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。37℃、5％CO₂で約18時間培養後、培地を10 ng/mLのPMA、0.5 μM Calcium ionophore A23187および10％FBS含有DMEM培地と交換した。37℃、5％CO₂で約6時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化した。培地除去後、PBSで洗浄した。PLBで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記siRNA溶液に代え水を用いて同様の実験を実施した。また、製剤例Ｂ〜Ｏ、処方例３および４についても同様に実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果を表８に示した。
別に、陽性コントロールとして、リポフェクトアミン2000（商品名：インビトロジェン社）を用いて、試験例２と同様に細胞毒性のスコア化およびノックダウン率（％）を算出した。
結果、細胞毒性は−であったが細胞中に白色の斑点が認められた。ノックダウン率は、８．９±２．１（％）であった。

表７および８から明らかなように、本発明に係る製造例Ｂ〜Ｄ、Ｆ〜Ｏおよび処方例４は優れた核酸導入効率および低細胞毒性を示した。
核酸の導入においては、導入効率および細胞毒性の観点から、本発明に係るジ（Ｃ_12-16アルキル）ジメチルアンモニウムハライドの濃度を適宜検討することで、より優れた核酸導入組成物を提供することがわかった。
中でも、表７および８からわかるように、核酸導入組成物として製造例Ｃ、Ｊ、Ｎおよび処方例４が優れ、製造例Ｃ、Jおよび処方例４が特に優れていることがわかった。

試験例５ＨｅＬａ細胞への核酸導入試験
96穴プレートにHeLa細胞を7500cells/100μL/well播種し、約24時間培養した。DNA（ｐCMV-SPORT-βgal）をDMEM培地で8μg/mL(200ng/wellの場合)となるように希釈しDNA希釈溶液とした。別に、処方例２、４、６および対照例２中の各カチオニック脂質濃度が約1mMとなるように適量の注射用水を加え復水した。この液もしくは陽性コントロールとしてのリポフェクトアミン2000（インビトロジェン社）をDMEM培地で希釈した（復水した各リポソーム液もしくはリポフェクトアミン2000の細胞への添加量が、表９，１０に示したリポソーム添加量（μL/well）となるように希釈した）希釈後、直ちに各リポソーム希釈液25μLに対しDNA希釈液を25μL加え、混合し、室温にて30分間静置してDNA/リポソーム複合体を形成させた。播種したHeLa細胞（約70〜90%confluent）に、DNA/リポソーム複合体50μLを添加し、トランスフェクションを開始した。37℃、5%CO₂で1時間培養後、10% FBS/DMEM培地を100μL添加し、37℃、5%CO₂で約21時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を下記のようにスコア化（−：細胞密度、形態共に、リポソームfree(細胞&DNAのみ)のウェルの細胞と変わらない、+：10〜20%程度の細胞が丸くなっているの、++：30〜40%程度の細胞が丸くなっている、+++：50〜60%程度の細胞に形態の異常が認められるもしくは細胞密度がやや薄くなっている、++++：殆どの細胞に形態の異常が認められ、細胞密度がかなり薄くなっている）した。
培養上清を除去し、PBS(-)で洗浄後、以下のβ-galactosidase(以下β-gal)活性、タンパク定量、および生細胞数の測定を行った。結果を表９および１０に示した。

（１）β-gal活性測定およびタンパク定量
PBSを完全に吸引除去後、lysis bufferを30μL加え、攪拌し、-80℃で30分以上静置して凍結させ、37℃水浴上にて急速解凍後、再度-80℃で30分以上静置して凍結させ、37℃水浴上にて急速解凍後、2000g x 10分間遠心処理し、遠心上清（サンプル）を10μLずつ96穴マイクロプレートへ分取した。
β-gal活性測定は、β-gal Assay kit（インビトロジェン社）を用いた。すなわち、standard(β-galactosidase)をlysis bufferにて4, 2, 1, 0.5, 0.25 U/mLとなるように希釈した。サンプルおよび各standard希釈液 10μLに2Me含claevage bufferを50μL/well添加し、さらに4mg/mL ONPG水溶液を17μL/well添加し、37℃、30分間インキュベートした。インキュベート後、Stop bufferを120μL/wellを添加して、反応を停止させ、吸光度(405nm)を測定した。
タンパク定量は、BCA protein assay kit（PIERE社）を用いた。すなわち、standard(BSA)をlysis bufferにて500, 300, 100, 50, 25μg/mLとなるように希釈した。サンプルおよび各standard希釈液 10μLにWR液を200μL/well添加し、30秒間攪拌し、37℃で1時間培養した。室温に冷却後、吸光度（562nm）を測定した。

（２）生細胞数測定
生細胞数測定には、WST-1アッセイを測定原理とした Cell Counting Kit（同仁化学研究所）を用いた。すなわち、PBS(-)洗浄した細胞に10%FBS/DMEM培地100μLを添加し、次いでWST-1溶液を10μL添加、攪拌して、37℃、5%CO₂で4時間培養後、吸光度(450nm)を測定した。別途作製した細胞播種数希釈系列から、細胞数 vs A450の標準曲線を作製し、生細胞数を見積もり、リポソームfree(細胞&DNAのみ)のウェルの生細胞数を100%として、各ウェルの生細胞生存率を算出した。

試験例６ＨＴ１０８０細胞への核酸導入試験
ＨｅＬａ細胞にかえてＨＴ１０８０細胞を用いた以外は試験例５と同様にしてβ-gal活性測定、タンパク定量、細胞毒性のスコア化および生細胞数の測定を行った。結果を表９および１０に示した。

表９および１０から明らかなように、本発明に係る処方例の中でも処方例２は優れた核酸導入効率および低細胞毒性を示した。

試験例７ＨｅＬａ細胞への核酸導入試験
試験例５と同様にして、処方例３、４および製造例Ａ〜Ｏについて、β-gal活性測定、タンパク定量、細胞毒性のスコア化および生細胞数の測定を行った。結果を表１１および１２に示した。

試験例８ＨＴ１０８０細胞への核酸導入試験
試験例６と同様にして、処方例３、４および製造例Ａ〜Ｏについて、β-gal活性測定、タンパク定量、細胞毒性のスコア化および生細胞数の測定を行った。結果を表１１および１２に示した。

表１１および１２からわかるように、本発明の核酸導入組成物の中でも製造例Ｃ、Ｊ、Ｎおよび処方例４が優れていることがわかった。

試験例７ＨｅＬａ細胞への核酸導入試験
表１３に示した各種エンハンサーをDMEM培地にて種々濃度に希釈した（最終的な添加量が、表１３に示したエンハンサー添加量（μg/well）となるように希釈した）。そこへ、試験例５と同様に復水した処方例４をDMEM培地にて希釈した液（最終的な添加量が、表１３に示したリポソーム添加量（μL/well）となるように希釈した）を等量加え、室温にて２０分間インキュベーションした。容量をDMEM培地にて調整後、試験例５と同様に、DNA/リポソーム複合体形成およびトランスフェクションを行い、β-gal活性測定、タンパク定量、細胞毒性のスコア化および生細胞数の測定を行った。なお、リポフェクタミン2000は試験例５と同様に試験した。結果を表１３に示した。

試験例８ＨＴ１０８０細胞への核酸導入試験
ＨｅＬａ細胞にかえてＨＴ１０８０細胞を用いた以外は試験例７と同様にしてβ-gal活性測定、タンパク定量、細胞毒性のスコア化および生細胞数の測定を行った。結果を表１４に示した。

表１３および１４から明らかなように、リポソーム液へ種々エンハンサーを適当な濃度添加することにより、優れた核酸導入効率および低細胞毒性を示した。中でも、酪酸ナトリウム、ポリＬ−リジン、プロタミン、プロネクチンの効果が優れていることがわかった。特にポリＬ−リジンおよびプロタミンの効果が優れていることがわかった。

試験例９ HeLa、HT1080、293T、COS-1、NB1RGB細胞への核酸導入試験
製造例Jへ種々濃度のプロタミンを配合した製剤を調製した。すなわち、表１５記載濃度の２倍濃度のプロタミン硫酸塩の水溶液を調製し、ＤＣ−１−１４濃度が約2mMとなるように適量の注射用水を加え復水した製造例Jのリポソーム分散液へ、等量加え、調製した。これらの分散液の核酸導入試験をHeLa、HT1080、293T、COS-1、NB1RGB細胞それぞれの細胞を用いて、試験例５と同様に実施し、β-gal活性測定を行った。結果を表１５に示した。

1mMの製造例Jの中へ約0.6〜1.0mg/mLのプロタミンを配合したリポソーム分散液は、殆どの細胞において優れた核酸導入効率を示した。

本発明の組成物を用いると、低細胞毒性で、核酸が効率良く導入されるため、核酸導入用試薬や医薬として有用である。

Claims

ジテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロールを含有する細胞への核酸導入用組成物。
ジテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールおよびプロタミンを含有する細胞への核酸導入用組成物。
さらに核酸を含有するものである請求項１又は２記載の組成物。
核酸が、遺伝子またはショートオリゴヌクレオチドである請求項３記載の組成物。
脂質膜構造体を形成しているものである請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
リポソームを形成しているものである請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
凍結乾燥物である請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。