JP4305615B2 - ポリアミドアミンデンドロンを含む遺伝子導入剤組成物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法に関する。
【0002】
【従来の技術及びその課題】
遺伝子治療等に用いられる効率の高い遺伝子導入剤としてウィルスベクターが知られているが、該ウィルスベクターは、臨床応用において死に至る重篤な副作用が報告されており、より安全な遺伝子導入剤が求められている。
【0003】
非ウィルスベクターは、ウィルスベクターと比較してより安全性が高いが、遺伝子の導入効率が低い欠点があった。
【0004】
本発明は、安全性及び導入効率に優れた遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法を提供することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法を提供するものである。
項1. 下記式DL−G1〜DL−G8のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物。
DL−G1:R1R2NX(XH2)2
DL−G2:R1R2NX(X(XH2)2)2
DL−G3:R1R2NX(X(X(XH2)2)2)2
DL−G4:R1R2NX(X(X(X(XH2)2)2)2)2
DL−G5:R1R2NX(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2
DL−G6:R1R2NX(X(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2)2
DL−G7:R1R2NX(X(X(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2)2)2
DL−G8:R1R2NX(X(X(X(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2)2)2)2
(式中R1及びR2は、同一または異なってアルキル基、アルコキシ基、アリール基またはアラルキル基を示す。Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を示す。)
項2. さらにリン脂質を含む請求項1に記載の遺伝子導入剤組成物。
項3. リン脂質がDOPEである請求項2に記載の組成物。
項4. 項1〜3のいずれかに記載の遺伝子導入剤または遺伝子導入剤組成物を遺伝子とともにイン・ビトロまたはイン・ビボで細胞に適用することを特徴とする遺伝子の細胞への導入方法。
項5. 請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物を含有する遺伝子導入用キット。
【0006】
【発明の実施の形態】
本発明のDL−G1〜DL−G8のいずれかのポリアミドアミンデンドロンにおいて:
アルキル基としては、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、エイコシル、2−エチルヘキシルなどの炭素数6〜20の直鎖または分枝を有するアルキル基が挙げられる。
アルコキシ基としては、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、エイコシルオキシ、2−エチルヘキシルオキシなどの炭素数6〜20の直鎖または分枝を有するアルコキシ基が挙げられる。
アリール基としては、ベンジル、ナフチル、ビフェニル、アントラニル、フェナントリルなどが挙げられる。
アラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。
【0007】
Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を表し、その末端のNは、通常2個の水素原子を有するが、1個の水素原子がロイシン、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシンなどの疎水性アミノ酸で置換されていてもよい。
【0008】
本発明のポリアミドアミンデンドロンは、例えば以下のようにして製造することができる。
【0009】
【化1】
【0010】
本発明の好ましいポリアミドアミンデンドロンを以下に示す。
【0011】
【化2】
【0012】
本発明の遺伝子導入剤組成物は、ポリアミドアミンデンドロンの他に、リン脂質を好適に含むことができる。このようなリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲンおよびホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは1種または2種以上を組み合わせて用いることができる。このうち、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファリジルコリンをそれぞれ単独で、または組み合わせて用いるのが好ましい。これらのリン脂質の脂肪酸残基は、特に限定されるべきものではないが、炭素数12から18の飽和または不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレイル基等を挙げることができ、DOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)が特に好ましい。
【0013】
リン脂質の配合量は特に限定されないが、リン脂質とポリアミドアミンデンドロンの合計量を100重量部とした場合にリン脂質30〜90重量部、ポリアミドアミンデンドロン70〜10重量部、好ましくはリン脂質50〜80重量部、ポリアミドアミンデンドロン50〜20重量部、より好ましくはリン脂質60〜70重量部、ポリアミドアミンデンドロン40〜30重量部である。
【0014】
リン脂質の他に、遺伝子導入剤組成物に含有され得る添加剤としては、コレステロールなどが例示される。
【0015】
ポリアミドアミンデンドロン脂質を単独で用いる場合、遺伝子と遺伝子導入剤の配合割合は、遺伝子1重量部に対し、遺伝子導入剤を1〜20重量部、好ましくは3〜15重量部、より好ましくは5〜7重量部使用する。また、ポリアミドアミンデンドロン脂質とリン脂質の混合物を用いる場合、遺伝子と遺伝子導入剤の配合割合は、遺伝子1重量部に対し、遺伝子導入剤を1〜50重量部、好ましくは5〜30重量部、より好ましくは10〜15重量部使用する。
【0016】
遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、DNAおよびRNAのいずれでもよく、特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子が好ましい。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等を挙げることができる。
【0017】
遺伝子が導入される細胞としては、ヒトなどの動物細胞、植物細胞などの真核細胞、細菌などの原核細胞が例示できる。
【0018】
本発明の組成物の形態としては、ポリアミドアミンデンドロン(DL−G1〜DL−G8)のみが存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロンとリン脂質が単に混合物として存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロンとリン脂質とが組み合わさって脂質膜構造体を形成していてもよい。該脂質膜構造体の存在形態およびその製造方法は特に限定されるべきものではないが、例えば、存在形態としては、乾燥した脂質混合物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態等を挙げることができる。
【0019】
乾燥した脂質混合物は、例えば、使用する脂質成分をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことで製造することができる。
【0020】
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、O/W型エマルション、W/O/W型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは、特に限定されるべきものではないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には、粒子径が50nmから数μmであり、球状ミセルの場合、粒子径が5nmから50nmである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その1層あたりの厚みが5nmから10nmでこれらが層を形成していると考えればよい。
【0021】
水系溶媒(分散媒)の組成も特に限定されるべきものではないが、水のほかに、グルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが重要である。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒のpHを弱酸性から中性付近(pH3.0から8.0)に設定したり、窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが重要である。さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には、糖水溶液を、凍結保存する場合には、糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能である。
【0022】
これらの水系溶媒の添加物の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、2から20%(W/V)が好ましく、5から10%(W/V)がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、1から5%(W/V)が好ましく、2から2.5%(W/V)がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が5から50mMが好ましく、10から20mMがさらに好ましい。
【0023】
水系溶媒中の脂質膜構造体の濃度は、特に限定されるべきものではないが、本発明においては脂質膜構造体として用いるリン脂質の総量の濃度は、0.001mMから100mMが好ましく、0.01mMから20mMがさらに好ましい。
【0024】
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した脂質混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することもでき、特に限定されるべきものではない。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン(押し出し濾過)を行えばよい。
【0025】
また、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体をさらに乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上記したように、糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液、乳糖水溶液を用いるとよい。ここで、水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に遺伝子水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために遺伝子自身も効率よく、脂質膜構造体に保持させることができるといったメリットがある。
【0026】
本発明の遺伝子導入剤は、遺伝子だけでなく、親水性の大きい薬物、高分子量の生理活性ペプチド類、蛋白質などの細胞内に導入されにくい薬物などにも適用できる。本発明の組成物を用いれば、イン・ビトロ及びイン・ビボのいずれにおいても細胞内に遺伝子を効率良く導入することができる。
【0027】
イン・ビトロでの遺伝子導入は、標的とする細胞を含む懸濁液に本発明の遺伝子含有導入剤組成物を添加したり、本発明の遺伝子含有組成物を含有する培地で標的とする細胞を培養する等の手段により、行うことができる。
【0028】
イン・ビボでの遺伝子導入は、本発明の遺伝子含有組成物を宿主に投与すればよい。宿主への投与手段としては、経口投与でも、非経口投与でもよいが、非経口投与が好ましい。剤形としては、通常知られたものでよく、経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等を挙げることができる。また、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。中でも、注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。
【0029】
【発明の効果】
本発明によれば、従来の遺伝子導入剤と比較して、遺伝子導入効率を格段に向上し、かつ、細胞毒性の低い遺伝子導入剤が得られ、安全性及び導入効率の両面に優れた遺伝子導入技術が確立された。
【0030】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
【0031】
なお、以下の実施例において、「リポプレックス」とは本発明のデンドロン脂質とDNAの複合体を意味する。
実施例1
1. デンドロン脂質(DL)の合成
1.1. DL-G−0.5の合成
蒸留したアクリル酸メチル(14ml, 0.156mol)にジ-n-ドデシルアミン(2.00g, 5.66mmol)を溶かし、窒素雰囲気において80℃で18時間還流した。その後、未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶媒 石油エーテル:ジエチルエーテル=2:1)で精製した。(収量2.387g, 96.1%.)
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.85 (m, Ha), δ 1.23 (s, Hb), δ 1.38 (m, Hc), δ 2.35 (t, Hf), δ 2.40 (t, Hd), δ 2.74 (t, He), δ 3.63 (s, OCH3); 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 14.1 (Ca), δ 22.7, 27.1, 27.5, 29.3, 29.6 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.2 (Cf), δ 49.3 (Ce), δ 51.4 (OCH3), δ 53.9 (Cd), δ 173.3 (COOCH3); TOF-MS m/z 440.7 (M+1).
1.2. DL-G0の合成
DL-G−0.5 (2.162g, 4.92mmol)をメタノール(50ml, 1.23mol)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(0.048g, 0.979mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(100ml, 1.50mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で50時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム(溶離液 メタノール) によって精製した。(収量1.945g, 84.6%.)
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.85 (m, Ha), δ 1.23 (s, Hb), δ 1.41 (m, Hc), δ 2.33 (t, Hf), δ 2.39 (t, Hd), δ 2.62 (t, He), δ 2.76 (t, Hh), δ 3.25 (m, Hg), δ 8.65 (m, CONH); 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 14.1 (Ca), δ 22.6, 26.6, 27.6, 29.3, 29.6 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.7 (Cf), δ 41.9 (Ch), δ 42.2 (Cg), δ 50.3 (Ce), δ 53.3 (Cd), δ 173.3 (CONH); TOF-MS m/z 468.2 (M+1).
1.3. DL-G0.5の合成
DL-G0(2.256g, 4.82mmol)をメタノール(17.5ml, 0.431mol)に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル(43.5ml, 0.485mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において35℃で50時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶媒 石油エーテル:ジエチルエーテル=2:1 のち ジクロロメタン:メタノール=9:1)で精製した。(収量2.634g, 85.4%.)
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.84 (m, Ha), δ 1.21 (s, Hb), δ 1.39 (m, Hc), δ 2.30 (t, Hf), δ 2.38 (m, Hj), δ 2.39 (m, Hd), δ 2.49 (t, Hh), δ 2.67 (t, He), δ 2.73 (t, Hi), δ 3.25 (m, Hg), δ 3.63 (s, OCH3), δ 7.76 (m, CONH); 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 14.1 (Ca), δ 22.6, 26.7, 27.6, 29.3, 29.6, 31.9 and 32.5 (Cb, Cc), δ 33.1 (Cj), δ 36.9 (Cf), δ 49.1 (Ci), δ 50.1 (Ce), δ 51.5 (OCH3), δ 53.0 (Cd), δ 53.5 (Ch), δ 172.7 (COOCH3), δ 172.8 (CONH); TOF-MS m/z 640.8 (M+1).
1.4. DL-G1の合成
DL-G0.5(0.714g, 1.12mmol)をメタノール(20.5ml, 0.505mol)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(0.011g, 0.224mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(37.5ml, 0.562mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で50時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム(溶離液 メタノール) によって精製した。(収量0.674g, 86.4%.)
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.84 (m, Ha), δ 1.22 (s, Hb), δ 1.38 (m, Hc), δ 2.12 (m, NH2), δ 2.28 (m, Hj), δ 2.31 (m, Hf), δ 2.36 (m, Hd), δ 2.46 (t, Hh), δ 2.63 (t, He), δ 2.70 (t, Hi), δ 2.79 (t, Hl), δ 3.17 (m, Hg), δ 3.25 (m, Hk), δ 7.45 and 8.63 (m, CONH); 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 14.0 (Ca), δ 22.6, 26.5, 27.6, 29.2, 29.6 and 31.8 (Cb, Cc), δ 32.9 and 34.3 (Cf, Cj), δ 37.8 (Cg), δ 41.3 and 41.9 (Ck, Cl), δ 50.0 (Ci), δ 50.8 (Ce), δ 52.9 (Cd), δ 53.3 (Ch), δ 173.4 and 172.9 (CONH); TOF-MS m/z 697.4 (M+1).
1.5. DL-G1.5の合成
DL-G1(1.539g, 2.21mmol)をメタノール(86.5ml, 2.13mol)に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル(152ml, 1.69mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において35℃で50時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶媒 ジクロロメタン:メタノール=9:1)で精製した。(収量1.703g, 74.0%.)
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.88 (m, Ha), δ 1.26 (s, Hb), δ 1.45 (m, Hc), δ 2.37 (m, Hj), δ 2.44 (m, Hd), δ 2.56 (m, Hh), δ 2.77 (m, Hi), δ 3.29 (m, Hg), δ 3.68 (s, OCH3), δ 7.04 and 8.08 (m, CONH); 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 14.1 (Ca), δ 22.7, 26.5, 27.6, 29.4, 29.6 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.7, 33.0 and 33.9 (Cj), δ 37.2 and 37.5 (Cg), δ 49.3 and 50.0 (Ci), δ 50.2 (Ce), δ 51.7 (OCH3), δ 52.8 (Cd), δ 53.0 and 53.4 (Ch), δ 172.3 (COOCH3), δ 172.7 and 173.1 (CONH); TOF-MS m/z 1041.5 (M+1).
1.6. DL-G2の合成
DL-G1.5(1.703g, 1.64mmol)をメタノール(46ml, 1.13mol)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(0.032g, 0.655mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(134ml, 2.00mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で50時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム(溶離液 メタノール) によって精製した。(収量1.713g, 90.8%.)
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.87 (m, Ha), δ 1.25 (s, Hb), δ 1.42 (m, Hc), δ 2.13 (m, NH2), δ 2.33 (m, Hj), δ 2.36 (m, Hd), δ 2.52 (m, Hh), δ 2.73 (m, Hi), δ 2.82 (m, Hl), δ 3.24 (m, Hg), δ 3.27 (m, Hk), δ 7.74, 7.79 and 8.58 (m, CONH); 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 14.2 (Ca), δ 22.7, 26.6, 27.7, 29.4, 29.7 and 31.9 (Cb, Cc), δ 33.0, 34.0 and 34.3 (Cf, Cj), δ 37.8 (Cg), δ 41.5 and 42.2 (Ck, Cl), δ 50.2 (Ci), δ 50.5 (Ce), δ 53.0 (Cd), δ 53.3 (Ch), δ 172.6, 173.0 and 173.4 (CONH); TOF-MS m/z 1153.0 (M+).
1.7. DL-G2.5の合成
DL-G2(1.713g, 1.49mmol)をメタノール(120ml, 2.96mol)に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル(100ml, 1.12mol)に徐々に加え、30℃で25時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶媒 ジクロロメタン:メタノール=85:15 のち 80:20)で精製した。(収量1.900g, 69.4%.)
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.88 (m, Ha), δ 1.26 (s, Hb), δ 1.45 (m, Hc), δ 2.37 (m, Hj), δ 2.44 (m, Hd), δ 2.56 (m, Hh), δ 2.76 (m, Hi), δ 3.28 (m, Hg), δ 3.68 (s, OCH3), δ 7.13, 7.67 and 8.12 (m, CONH); 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 14.1 (Ca), δ 22.7, 26.5, 27.6, 29.4, 29.6, 29.7 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.7 (Cf), 33.9 (Cj), δ 37.2 and 37.5 (Cg), δ 49.3 and 49.9 (Ci), δ 50.2 (Ce), δ 51.7 (OCH3), δ 52.6 (Cd), δ 53.0 and 53.4 (Ch), δ 172.4 (COOCH3), 173.0 (COOCH3); TOF-MS m/z 1840.7 (M+).
1.8. DL-G3の合成
DL-G2.5(0.115g, 0.063mmol)をメタノール(2.53ml, 0.625mol)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(0.0012g, 0.025mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(5.00ml, 0.075mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で55時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム(溶離液 メタノール) によって精製した。(収量0.114g, 88.4%.)
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.88 (m, Ha), δ 1.26 (s, Hb), δ 1.42 (m, Hc), δ 2.37 (br, Hj), δ 2.54 (br, Hh), δ 2.75 (br, Hi), δ 2.83 (br, Hl), δ 3.24 (br, Hg), δ 3.29 (br, Hk), δ 7.94, 8.07 and 8.57 (br, CONH); 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 14.2 (Ca), δ 22.7, 26.5, 27.7, 29.4, 29.7 and 31.9 (Cb, Cc), δ 34.0 and 34.3 (Cf, Cj), δ 37.8 (Cg), δ 41.4 and 41.9 (Ck, Cl), δ 50.1 (Ci), δ 50.5 (Ce), δ 52.9 (Cd), δ 53.3 (Ch),δ 172.8 and 173.1 (CONH); TOF-MS m/z 2066.0 (M+).
1.9. DL-G3.5の合成
DL-G3(1.004g, 0.486mmol)をメタノール(40ml, 0.986mol)に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル(35ml, 0.39mol)に徐々に加え、25℃で50時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム(溶離液 メタノール) により二度精製後、さらにシリカゲル(展開溶媒 ジクロロメタン:メタノール=8:2)で精製した。(収量1.141g, 68.2%.)
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.88 (m, Ha), δ 1.23 (s, Hb), δ 2.37 (br, Hj), δ 2.44 (br, Hd), δ 2.54 (br, Hh), δ 2.76 (br, Hi), δ 3.27 (br, Hg), δ 3.67 (s, OCH3), δ 7.13, 7.71 and 8.10 (br, CONH); 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 14.1 (Ca), δ 22.7, 29.4, 29.7 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.7 (Cf), 33.8 (Cj), δ 37.2 and 37.5 (Cg), δ 49.3 and 49.9 (Ci), δ 50.6 (Ce), δ 51.7 (OCH3), δ 52.5 (Cd), δ 53.0 (Ch), δ 172.4 (COOCH3), δ 172.6 and 173.1 (CONH).
1.10. DL-G4の合成
DL-G3.5(1.141g, 0.331mmol)をメタノール(18.5ml, 0.456mol)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(0.0065g, 0.133mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(37ml, 0.554mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で55時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム(溶離液 メタノール) により二度精製した。(収量0.699g, 54.2%.)
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 0.85 (m, Ha), δ 1.26 (s, Hb), δ 1.37 (m, Hc), δ 2.20 (br, Hj), δ 2.30 (br, Hd), δ 2.57 (br, Hh), δ 2.65 (br, Hi), δ 3.07 (br, Hk), δ 7.91, 7.98 and 8.16 (br, CONH); 13C NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 14.0 (Ca), δ 22.2, 27.0, 29.1 and 31.4 (Cb, Cc), δ 33.3 (Cf, Cj), δ 37.0 (Cg), δ 41.7 (Ck, Cl), δ 49.7 (Ci), δ 52.2 (Ch), δ 171.6 (CONH).
2. 測定
2.1. 電気泳動による複合体形成能の評価
デンドロン脂質(DL-G1,DLG2,DLG-3,DLG4)のクロロホルム溶液(DLG4についてはメタノール溶液)から溶媒を減圧留去し、脂質薄膜を得た。これにPBS(リン酸緩衝生理食塩水)を加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を2分間照射し、脂質分散液を調製した。次に、調製したデンドロン脂質分散液を20mMTris-HClのプラスミドDNA溶液(1μg/5μl)にN/P比が0.2、0.4、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6になるように加えて混合し(全量10μl)、室温で10分インキュベーションしてリポプレックスを調製した。調製したリポプレックスを0.6wt%アガロースゲルに加え、40mM Tris / 20mM NaOAc / 2mM EDTA-2Naバッファー中において100Vの電位下、30分間電気泳動を行った。なお、電気泳動は Mupidミニゲル泳動槽(ADVANCE Co.)を用いて行った(図1)。
2.2. リポプレックスの調製
2.2.1デンドロン脂質とプラスミドDNAとのリポプレックス
カチオン性脂質(DL-G1、DL-G2、DL-G3、DL-G4)のクロロホルム溶液(DL-G4についてはメタノール溶液)からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これにPBSを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を2分間照射し、脂質分散液を調製した。次に、20mMTris-HClのプラスミドDNA溶液(1μg/50μl)と種々の濃度の脂質分散液(50μl)を加えて混合し、室温で10分間インキュベーションして、リポプレックスを得た図2。
2.2.2.DL-G3、DOPE、プラスミドからなるリポプレックス
DL-G3(41.7μg)と種々の量のDOPEからなる混合薄膜に、PBS 0.5mlを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を2分間照射し、混合脂質分散液を調製した。20mMTris-HClのプラスミドDNA溶液(1μg/50μl)に混合脂質分散液を種々のN/P(DL-G3の1級アミノ基/DNAのリン酸エステル、モル/モル)比に混合し、室温で10分インキュベーションしてリポプレックスを調製した(図3,図4)。
2.2.3.DC-chol、DOPE、プラスミドからなるリポプレックス
カチオン性脂質DC-Chol(3β[N,N-ジメチルアミノエタンカルバモイル]コレステロール)(161.3μg)とDOPE(240μg)の混合薄膜にPBS 2.5mlを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を2分間照射し、混合脂質分散液を調製した。20mMTris-HClのプラスミドDNA溶液(1μg/50μl)に混合脂質分散液をN/P比が2になるように加えて混合し、室温で10分インキュベーションしてリポプレックスを調製した(図4)。
2.3. 遺伝子導入
アフリカミドリザル腎臓由来のCV-1細胞を24穴ディッシュ1穴当たり5.0×104個になるように撒き、10%FBS含有DMEMメディウム0.5ml中、37℃で一晩培養した。その後、0.36mM CaCl2と0.42mM MgCl2を含むPBS(PBS(+))で3回洗浄した後、血清を含まないDMEMメディウム1mlを加え、1穴当たり所定量のプラスミドDNAを含むリポプレックスを細胞に加え、4時間インキュベーションした。その後PBS(+)で3回洗浄して、細胞に取り込まれていないリポプレックスを除去し、10%FBS含有DMEMメディウム1mlを加え40時間培養した(図2,図3,図4)。
【0032】
図1〜図4に示されるように、本発明の遺伝子導入剤は、デンドロンがDL−G2からDL−G4へ大きくなるにつれて高い遺伝子導入効率を発現することが明らかになった。特にDL−G4は高い遺伝子導入効率を有している。
2.4. ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子導入の評価
リポプレックスと処理し、40時間培養した後、PBS(+)で3回洗浄し、さらにPBS(−)で1回洗浄した後、1穴当たり80μlの細胞溶解剤を加えて細胞を溶かし、12000rpmで2分間遠心分離し、その上澄みを回収した。得られた細胞溶解液のルシフェラーゼ活性及びタンパク量を、ピッカジーンルシフェラーゼアッセイキット(東洋インキ)およびBCA Protein Assay Reagent (Pierce) により行った。
2.5. リポプレックスの細胞毒性
リポプレックスで処理した細胞を40時間培養後、メディウムを除去し、新しい10%FBS含有DMEMメディウムを1穴当たり200μlずつ加えた。さらにMTT溶液(5mg/ml PBS)を1穴当たり20μlずつ加え、2時間インキュベーションした。次にメディウムを除去して0.1M HCl含有イソプロパノール(500μl)を加えた。その溶液を遠心チューブに回収し、15000rpmで10秒間遠心分離を行った。上澄み液を570nmの吸光度を測定することによって生細胞数を求め、リポプレックスと処理していない細胞を培養した場合との比(%)を求めた(図4)。
【0033】
図4に示されるように、本発明のデンドロン(DL−G3)は、従来汎用されているDC−cholと比較して遺伝子導入活性が向上し(図4A,B)、かつ、遺伝子導入活性を有する量(DNA量が1〜2μg)において細胞生存率が65%以上と有意に高く(図4C)、高い遺伝子導入活性及び低毒性を同時に達成した、非常に優れた遺伝子導入剤であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図1】デンドロン脂質とDNAの複合体形成を示す。図1において、「A」はDL−G1リポプレックス、「B」はDL−G2リポプレックス、「C」はDL−G3リポプレックス、「D」はDL−G4リポプレックスを各々示す。
【図2】遺伝子導入活性に及ぼす世代数の影響を示す。図2は、各種のN/P比を有するDL−G2,DL−G3またはDL−G4リポプレックスで処理したCV1細胞のルシフェラーゼ活性(gルシフェラーゼ/mg蛋白質(A)およびgルシフェラーゼ/ウェル(B))を示す。細胞(5×104)は血清を含まない培地中1μgのDNAを含むリポプレックスで処理された。NおよびPは、各々脂質の第一級アミノ基及びDNAホスフェートの当量を示す。
【図3】遺伝子導入活性に及ぼす世代数の影響を示す。図3Aは、DOPE/DL−G3比を変化させたリポプレックスで処理されたCV1細胞のルシフェラーゼ活性を示し、図3Bは、N/P比を変化させたリポプレックスで処理されたCV1細胞のルシフェラーゼ活性を示す。
【図4】DC−cholリポプレックスとの比較を示す。図4は、DL−G3/DOPEリポプレックスまたはDC−chol/DOPEリポプレックスで処理されたCV1細胞のルシフェラーゼ活性((A):gルシフェラーゼ/mg蛋白質、(B):gルシフェラーゼ/ウェル)及び細胞生存度(C)を示す。
Claims (5)
- 下記式DL−G1〜DL−G4のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物。
DL−G1:R1R2NX(XH2)2
DL−G2:R1R2NX(X(XH2)2)2
DL−G3:R1R2NX(X(X(XH2)2)2)2
DL−G4:R1R2NX(X(X(X(XH2)2)2)2)2
(式中R1及びR2は、同一または異なって炭素数12〜20のアルキル基またはアルコキシ基を示す。Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を示す。) - さらにリン脂質を含む請求項1に記載の遺伝子導入剤組成物。
- リン脂質がDOPEである請求項2に記載の組成物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の遺伝子導入剤または遺伝子導入剤組成物を遺伝子とともにイン・ビトロまたはイン・ビボ(ただし、ヒトを除く)で細胞に適用することを特徴とする遺伝子の細胞への導入方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物を含有する遺伝子導入用キット。
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