JP4962931B2 - ポリアミドアミンデンドロン脂質を含む遺伝子等運搬媒体組成物 - Google Patents
ポリアミドアミンデンドロン脂質を含む遺伝子等運搬媒体組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4962931B2 JP4962931B2 JP2005332011A JP2005332011A JP4962931B2 JP 4962931 B2 JP4962931 B2 JP 4962931B2 JP 2005332011 A JP2005332011 A JP 2005332011A JP 2005332011 A JP2005332011 A JP 2005332011A JP 4962931 B2 JP4962931 B2 JP 4962931B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipid
- gene
- methanol
- dendron
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 64
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 title claims description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title description 86
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 title description 16
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000006163 transport media Substances 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- -1 polyoxyethylene group Polymers 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 144
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N Methyl acrylate Chemical compound COC(=O)C=C BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 29
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 23
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 19
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 11
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 3-bromoimidazo[1,2-a]pyridine-6-carbonitrile Chemical compound C1=CC(C#N)=CN2C(Br)=CN=C21 UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N chembl1408157 Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(C(=O)O)=CC=1C1=CC=C(O)C=C1 KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229940099563 lactobionic acid Drugs 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 8
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 8
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 7
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 3
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N (2-nonanoyloxy-3-octadeca-9,12-dienoyloxypropoxy)-[2-(trimethylazaniumyl)ethyl]phosphinate Chemical compound CCCCCCCCC(=O)OC(COP([O-])(=O)CC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(Cl)=O)C=C1 NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NPFWZNKPICEPMZ-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-2-yl hydrogen carbonate Chemical group OC(=O)OC1=NC=CN1 NPFWZNKPICEPMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000094 2-phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000005427 anthranyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011363 dried mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005645 linoleyl group Chemical group 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- MJCJUDJQDGGKOX-UHFFFAOYSA-N n-dodecyldodecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCNCCCCCCCCCCCC MJCJUDJQDGGKOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKUFIYBZNQSHQS-UHFFFAOYSA-N n-octadecyloctadecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCNCCCCCCCCCCCCCCCCCC HKUFIYBZNQSHQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 125000002811 oleoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 1
- 125000005561 phenanthryl group Chemical group 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 125000003696 stearoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 125000002889 tridecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005314 unsaturated fatty acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Description
本発明は上記の課題を解決するために先に示したデンドロンタイプの脂質を改良することで発想されたものである。
本発明に用いるデンドロン脂質としては、以下に示されるDL−G1〜DL−G8の化合物である。
DL−G1:R1R2NX(XH2)2
DL−G2:R1R2NX(X(XH2)2)2
DL−G3:R1R2NX(X(X(XH2)2)2)2
DL−G4:R1R2NX(X(X(X(XH2)2)2)2)2
DL−G5:R1R2NX(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2
DL−G6:R1R2NX(X(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2)2
DL−G7:R1R2NX(X(X(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2)2)2
DL−G8:R1R2NX(X(X(X(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2)2)2)2
式中 R1及びR2は、同一または異なったアルキル基、アルコキシ基、アリール基またはアラルキル基を示す。Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を示す。
標的指向性を持たせるために、ポリアミドアミンデンドロン脂質の機能性分子導入サイトに付加するリガンドとしては、ガラクトース等の糖類を用いる。癌細胞の表面に比較的多く存在するレセプターのリガンドと考えられるからである。しかし、付加するリガンドは標的とする相手側のレセプターに応じて変更することができ、糖類に限定されるものではない。
これらのリガンドは、ポリアミドアミンデンドロン脂質のすべての導入サイトにあるのが望ましいが、すべての導入サイトになくても本件発明の効果は得ることができる。
基体となるポリアミドアミンデンドロン脂質のアミノ結合の部分が、機能性分子導入サイトとなる。従って、この部分に結合せさる方法であれば、特に限定されるものではない。例としてはリガンドの一部をエステル化したものを上記サイトと結合させたり、リガンドの糖の1部分を酸にして、ポリアミドアミンデンドロン脂質と直接結合させるなどの方法がある。
他に付加する機能性分子としてはPEGなどの高分子がある。これらをポリアミドデンドロン脂質の表面に付加することで、ベクターの凝集が抑制される。その他、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドンなど水溶性の高分子が使用可能である。
本発明の遺伝子等運搬媒体組成物は、修飾デンドロン脂質の他、ポリアミドアミンデンドロン脂質やリン脂質を好適に含むことができる。このようなリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスズローゲンおよびホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは1種または2種以上を組み合わせて用いることができる。
リン脂質の配合量は特に限定されないが、リン脂質と修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質の合計量を100重量部とした場合にリン脂質30〜90重量部、修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質70〜10重量部、好ましくはリン脂質50〜80重量部、修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質50〜20重量部、より好ましくはリン脂質60〜70重量部、修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質40〜30重量部である。
リン脂質の他に、遺伝子等運搬媒体組成物に含有され得る添加剤としては、コレステロールなどが例示される。
修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質を遺伝子等運搬媒体とした場合、遺伝子と遺伝子等運搬媒体の配合割合は、遺伝子1重量部に対して、遺伝子等運搬媒体を1〜20重量部、好ましくは3〜15重量部、より好ましくは5〜7重量部使用する。また、遺伝子等運搬媒体とリン脂質の混合物を用いる場合、遺伝子と遺伝子等運搬媒体導の配合割合は、遺伝子1重量部に対し、遺伝子等運搬媒体導を1〜50重量部、好ましくは5〜30重量部、より好ましくは10〜15重量部使用する。
遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、DNAおよびRNAのいずれでもよく、特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子が好ましい。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子、リポザイム、siRNAなどを挙げることができる。
遺伝子が導入される細胞としては、ヒトなどの動物細胞、植物細胞などの真核細胞、細菌などの原核細胞が例示できる。
本発明の組成物の形態としては、修飾デンドロン脂質のみが存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロン脂質とリン脂質のどちらか若しくは両方をさらに混合物として使用していてもよく、修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質とリン脂質が組み合わさって脂質膜構造体を形成していてもよい。この脂質膜構造体の存在形態およびその製造方法は特に限定されるべきものではないが、例えば、存在形態としては、乾燥した脂質混合物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態等を挙げることができる。
乾燥した脂質混合物は、例えば、使用する脂質成分をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことで製造することができる。
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リポゾーム、多重層リポソーム、O/W型エマルション。W/O/W型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは、特に限定されるべきものではないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には、粒子系が50nmから数μmであり、球状ミセルの場合、粒子系が5nmから50nmである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その1層あたりの厚みが5nmから10nmでこれらが層を形成していると考えればよい。
水系溶媒(分散媒)の組成も特に限定されるべきものではないが、水のほかに、グルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが重要である。
これらの水系溶媒の添加物の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、2から20%(W/V)が好ましく、5から10%(W/V)がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、1から5%(W/V)が好ましく、2から2.5%(W/V)がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が1から150mMが好ましく、10から50mMがさらに好ましい。
水系溶媒中の脂質膜構造体の濃度は、特に限定されるべきものではないが、本発明においては脂質膜構造体として用いるリン脂質の総量の濃度は、0.001mMから100mMが好ましく、0.01mMから20mMがさらに好ましい。
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した脂質混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することもでき、特に限定されるべきものではない。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン(押し出し濾過)を行えばよい。
また、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体をさらに乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥を挙げることができる。このときの水系溶媒としては、上記したように、糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液、乳糖水溶液を用いるとよい。ここで、水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に遺伝子水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために遺伝子自身も効率よく、脂質膜構造体に保持されることができるといったメリットがある。
本発明の遺伝子等運搬媒体組成物は、遺伝子だけでなく、親水性の大きい薬物、高分子量の生理活性ペプチド類、蛋白質などの細胞内に導入されにくい薬物、生理活性物質、生理活性ペプチド、蛋白質などにも適用できる。本発明の組成物を用いれば、イン・ビトロ及びイン・ビボのいずれにおいても細胞内に遺伝子等を効率良く導入、送達することができる。
本実施例では、DL−G3にラクトビオン酸を結合させることで、DL−G3の末端をガラクトースで修飾する。
本実施例に用いるDL−G3は以下の手順で作成する。なお反応式は化1を参照のこと。
1−1.DL−G―0.5の合成
蒸留したアクリル酸メチル(14ml、0.156mol)にジーn−ドデシルアミン(2.00g、5.66mmol)を溶かし、窒素雰囲気において80℃で18時間還流した。その後、未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶媒は、石油エーテル:ジエチルエーテル=2:1)で精製した。基本となるデンドロン脂質のR1R2がジドデシルタイプのデンドロン脂質であるので、「−2C12」と付記する
DL−G−0.5−2C12(2.162g、4.92mmol)をメタノール(50ml、1.23mol)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(0.048g、0.979mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(100ml、1.50mol)に徐徐(以下「徐々」と記す。)に加え、窒素雰囲気において45℃で50時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadax LH−20カラム(溶離液としてメタノール)によって精製した。
DL−G0−2C12(2.256g。4.82mmol)をメタノール(17.5ml、0.431mol)に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル(43.5ml。0.431mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において35℃で50時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶液として石油エーテル:ジエチルエーテル=2:1 のち ジクロロメタン:メタノール=9:1)で精製した。
DL−G0.5−2C12(0.714g、1.12mmol)をメタノール(20.5ml、0.505mol)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(0.011g、0.224mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(37.5ml、0.562mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で50時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadax LH−20カラム(溶離液としてメタノール)によって精製した。
DL−G1−2C12(1.539g。2.21mmol)をメタノール(86.5ml、2.13mol)に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル(152ml。1.69mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において35℃で50時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶液としてジクロロメタン:メタノール=9:1)で精製した。
DL−G1.5−2C12(1.703g、1.64mmol)をメタノール(46ml、1.13mol)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(0.032g、0.655mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(134ml、2.00mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で50時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadax LH−20カラム(溶離液としてメタノール)によって精製した。
DL−G2−2C12(1.713g。1.49mmol)をメタノール(120ml、2.96mol)に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル(100ml。1.12mol)に徐々に加え、30℃で25時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶液としてジクロロメタン:メタノール=85:15)で精製した。
DL−G2.5−2C12(0.115g、0.063mmol)をメタノール(2.53ml、0.625mol)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(0.0012g、0.025mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(5.00ml、0.075mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で50時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadax LH−20カラム(溶離液としてメタノール)によって精製した。以上の工程を繰り返して所定量のDL−G3−2C12を得た。
N−hydroxysuccinimide(0.24g、2.09mmol)とジシクロヘキシカルボジイミド(DCC)0.47g(2.26mmol)を、ジメチルホルムアミド(DFM)5mlに溶かしたLactobionic acid ラクトビオン酸(0.62g、1.73mmol)に加え、氷冷下で5時間攪拌しA液とした。
DL−G3−2C12(0.28g、0.137mmol)とトリエチルアミン(0.362ml、2.61mmol)をジメチルスルホキシド(DMSO)5mlに溶かし、これをA液に加えて室温で7日間攪拌した。その後反応液をろ過し、ろ液をエーテルで2回再沈殿させ、沈殿物を透析(Mw cutoff 1000)により精製した(3日間)。
以下に反応式を示す。
で比較するとアミノ基に結合している6番目の水素が低磁場側へシフトしているのがわかる。この領域IIの部分の積分値を(B)と(C)で比較すると、(C)の方が減少してい
た。この減少分は6番目の水素のシフトを考慮した全末端が置換された場合の理論値と非常によい一致を見た。この結果から、デンドロン脂質の全末端のプロトンが糖で修飾されたことがわかる。
1HNMR (DMSO): δ 0.85 (1), δ 1.23 and 1.42 (alkyl protons), δ 2.20-2.67 (dendron protons), δ 3.11-5.20 (2-6 and protons of galactosyl residue), δ 7.81 and 7.92 (protons of dendron amide and lactobionamide);
13CNMR (DMSO): δ 14.0 (1), δ 22.1, 26.5, 28.8, 29.0, 29.1 and 31.3 (2), δ 33.1 (5, 10, 15 and 20), δ 36.4 and 36.9 (7, 12 and 17), δ 38.3 and 38.4 (22 and 23), δ 49.5 (4, 9, 14 and 19), δ 52.2 and 52.6 (8, 13 and 18), δ 60.7 (35), δ 62.3 (29), δ 68.3-75.7 (25, 26, 28, 31-34), δ 104.6 (30), δ 171.4, 171.7 and 172.7 (6, 11, 16, 21 and 24).
上記のGal−DL−G3−2C12のDMF溶液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、一晩真空乾燥した。その後、この薄膜にDL−G3−2C12のクロロホルム溶液(66.6μl)とDOPEのクロロホルム溶液(240μl)を加え、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これにPBS(0.5ml)を加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を2分間照射し、脂質分散液を調製した。この分散液を数種々の脂質濃度に調製し、次に、20mMTris−HCl溶液のプラスミドDNA溶液(1μg/50μl)をこれらの脂質分散液に加えて混合し、室温で30分インキュベートして種々のN/P比のGal−DL−G3−2C12リポプレックスを調整した。なお、ここでN/P比は、DNAと脂質膜との比率である。
ヒト肝ガン由来のHepG2細胞を24穴ディッシュ1穴当たり5.0x104個になるように撒き、10%FCS(ウシ胎児血清)含有DMEM(ダルコット改変イーグル培地)0.5ml中、37℃で2日間培養した。
その後、0.36mMCaCl2と0.42mMMgCl2を含むPBS(PBS(+))で2回洗浄した後、FCS非含有DMEM1mlを加え、1穴当たり1μgのプラスミドDNAを含むリポプレックスを細胞に加えたのち4時間インキュベーションした。その後PBS(+)で3回洗浄して細胞に取り込まれていないリポプレックスを除去し、10%FCS含有DMEM1mlを加えた。40時間培養後、ルシフェラーゼアッセイにて遺伝子導入活性を評価した。
遺伝子導入した40時間後、PBS(+)で3回洗浄し、さらにPBSで1回洗浄した後、細胞を1穴当たり50μlの細胞溶解剤に溶かし、エッペンドルフチューブに回収して12000rpmで2分間遠心分離し、その上澄みを回収した。まず、発光基質液を用いて、ルシフェラーゼ活性の定量を行った。ルシフェラーゼ活性の定量は細胞溶解液20μlを13.5μgのルシフェリンを含んだ発光基質液95μl、アルブミン溶液(5mg/ml)5μlと混合し、ルミノメーターLumat LB9507(ベルトールドジャパン)を使って20秒間の発光量を測定した。次に細胞溶解液5μlx3を用いて、細胞内のタンパク質の定量をCoomassie Protein Assay Reagentを用いて行った。定量は細胞溶解液5μlに対してCoomassie Reagentを250μlずつ加え、波長595nmの吸光度をプレートリーダーで測定することによってタンパク質濃度を求めた。そして、細胞のタンパク質当たりのルシフェラーゼ活性を求めた。図3にその結果を示す。
すなわち、Gal−DL−G3−2C12/DL−G3−2C12/DOPEの混合比が0.1/1/10の時の遺伝子導入の効率は、Gal−DL−G3−2C12を含んでいない場合より高くなった。
ラクトビオン酸(4g、1.18X10-2mol)をメタノールに溶解し、50℃にてメタノールの減圧留去を4回繰り返し、ラクトビオンラクトンを得た。これをDMSO5mlに溶解し、4mlのDMSOに溶解したDL−G0−2C12(0.45g、9.53X10-4mol)に滴下して加え、40℃で10時間反応させた。その後、透析(Mw cutoff2000)を2日間行い精製した。さらに、LH−20により精製した。次にシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム/メタノール/水=60/35/5)による精製を行った。そして、透析(Mw cutoff2000)を2日間行い、再度LH−20により精製することによりGal−DL−G0−2C12を得た。以下に反応式を示す。
13CNMR (CD3OD): δ 14.5 (1), δ 23.8, 27.4, 28.6, 30.5, 30.7, 30.8, 31.0 and 33.1 (2), δ 33.7 (5), δ 39.6 and 39.9 (7 and 8), δ 51.0 (4), δ 54.6 (3), δ 62.7 (20), δ 63.8 (14), δ 70.4-77.2 (10, 11, 13, 16-19), δ 83.3 (12), δ 105.7 (15), δ 175.2 (6), δ 175.5 (9).
1.DL-G2-2C18とM-PEG550からPEG550−DL-G2-2C18を合成する。
リポプレックスのin vivoにおける使用には、血清タンパク質との相互作用が重要な問題である。これは、正に帯電したリポプレックスと負に帯電した血清タンパク質の静電相互作用が原因である。このことによってリポプレックスが崩壊したり、凝集が起こる。発明者がすでに開示したDL-G3-DOPE(特開2004−159504号)は、血清中での遺伝子導入が可能である。
1−1.DL−G―0.5−2C18の合成
蒸留したアクリル酸メチル(35ml、0.39mol)にジオクタデシルアミン(2.00g、3.8mmol)を溶かし、窒素雰囲気において80℃で18時間還流した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶媒は、石油エーテル:ジエチルエーテル=2:1)で精製した。
DL−G−0.5(2.0g、3.4mmol)をメタノール(40ml)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(33mg、0.67mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(70ml、1.05mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において50℃で7日間攪拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカ(展開溶媒:クロロホルム/メタノール/水=60/35/5)により精製した。
DL−G0(1.2g、1.9mmol)をメタノール(20ml)に溶かした。この溶液を、アクリル酸メチル(34ml、0.38mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において35℃で50時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶液として石油エーテル:ジエチルエーテル=2:1 のち ジクロロメタン:メタノール=9:1)で精製した。
DL−G0.5(1.5g、1.8mmol)をメタノール(50ml)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(18mg、0.37mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(65ml、0.92mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で60時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadax LH−20カラム(溶離液としてクロロホルム)によって精製した。
DL−G1(1.3g、1.5mmol)をメタノール(60ml)に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル(110ml、1.23mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において35℃で52時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶液としてクロロホルム、後にクロロホルム:メタノール=9:1)で精製した。
DL−G1.5(1.3g、1.1mmol)をメタノール(30ml)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(21mg、0.43mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(95ml、1.42mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で50時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadax LH−20カラム(溶離液としてメタノール)によって精製した。
DL−G2(0.94g、0.71mmol)をメタノール(60ml)に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル(55ml、0.61mol)に徐々に加え、窒素雰囲気中、30℃で50時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル(展開溶液としてクロロホルム:メタノール=95:5のち、クロロホルム:メタノール=80:20)で精製した。
DL−G2.5(0.92g、0.46mmol)をメタノール(40ml)に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム(8.9mg、0.18mmol)を含む蒸留したエチレンジアミン(60ml、0.9mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で55時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Sephadax LH−20カラム(溶離液としてメタノール)によって精製した。以上の工程を繰り返して所定量のDL−G3−2C18を得た。
ポリエチレングリコール(平均分子量550)の一方の末端をメチル基と置換したM−PEG550を用意する。M-PEG550を0.5g(0.91mmol)とトリエチルアミン0.252ml(1.82mmol)をテトラヒドロフタン(THF)10mlに溶解し、これにニトロフェニルクロロホルメイト(4−nitorophenylchroloformate)0.367g(1.82mmol)のTHF溶液(15ml)を氷冷下で加え2時間攪拌した。その後、室温で22時間攪拌した。得られた反応液をろ過し、ろ液を減圧留去後、LH−20(溶離液:メタノール)により精製した。これにより得た物質をM−PEG550−NPCと記す。以下に反応式を示す。
DL−G2−2C18(0.1g、0.076mmol)をDMSO(5ml)に溶解し、これにM−PEG550−NPC(0.45g、0.63mmol)のDMSO溶液(7ml)を加え、室温で5日間攪拌した。その後、24時間透析(Mw Cutoff 1000)を行い、凍結乾燥したのち、LH−20(溶離液:メタノール)により精製した。
13C NMR (CDCl3): δ 14.1 (1), δ 22.7, 27.3, 29.3, 29.4, 29.6, 29.7 and 31.9 (2 and 3), δ 34.1 (6, 11 and 16), δ 37.5 and 37.7 (8 and 13), δ 39.5 (19), δ 40.8 (18), δ 50.1 and 50.4 (9, 10, 14 and 15), δ 52.6 and 52.9 (4 and 5), δ 59.0 (23), δ 61.6, 63.8, 69.6, 70.4, 70.5, 70.8 and 71.9 (21 and 22), δ 156.9 (20), δ 172.7 and 173.3 (7, 12 and 17).
Claims (4)
- 下記式DL−G1〜DL−G8のいずれかで表される化合物のXH2の部分の少なくとも1箇所がXHR3またはXHR4のいずれかに置き換えられた化合物を含む、遺伝子、薬物、生理活性物質、生理活性ペプチド類およびタンパク質から選択される物質を運搬するための運搬媒体組成物。
DL−G1:R1R2NX(XH2)2
DL−G2:R1R2NX(X(XH2)2)2
DL−G3:R1R2NX(X(X(XH2)2)2)2
DL−G4:R1R2NX(X(X(X(XH2)2)2)2)2
DL−G5:R1R2NX(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2
DL−G6:R1R2NX(X(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2)2
DL−G7:R1R2NX(X(X(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2)2)2
DL−G8:R1R2NX(X(X(X(X(X(X(X(XH2)2)2)2)2)2)2)2)2
(式中 R1及びR2は、同一または異なった炭素数12〜18のアルキル基を示す。Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N<を示す。R3は糖類の残基を示す。R4はポリオキシエチレン基またはポリビニルアルコール基または、ポリビニルピロリドン基を示す。) - 前記R3は五員環構造若しくは六員環構造を含む糖類であることを特徴とする請求項1記載の運搬媒体組成物。
- さらにリン脂質を含む請求項1乃至2のいずれか1項に記載の運搬媒体組成物。
- 請求項1乃至3のいずれかに記載の運搬媒体組成物と、遺伝子、薬物、生理活性物質、生理活性ペプチド類およびタンパク質から選択される物質とからなるリポプレックスまたはリポソーム。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005332011A JP4962931B2 (ja) | 2005-11-16 | 2005-11-16 | ポリアミドアミンデンドロン脂質を含む遺伝子等運搬媒体組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005332011A JP4962931B2 (ja) | 2005-11-16 | 2005-11-16 | ポリアミドアミンデンドロン脂質を含む遺伝子等運搬媒体組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007137805A JP2007137805A (ja) | 2007-06-07 |
JP4962931B2 true JP4962931B2 (ja) | 2012-06-27 |
Family
ID=38201120
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005332011A Active JP4962931B2 (ja) | 2005-11-16 | 2005-11-16 | ポリアミドアミンデンドロン脂質を含む遺伝子等運搬媒体組成物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4962931B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013172358A1 (ja) * | 2012-05-14 | 2013-11-21 | 公立大学法人大阪府立大学 | 機能性化合物及びその化合物を含有する分子集合体、並びにそれらを含有する組成物及びキット並びにそれらの使用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3493608B2 (ja) * | 2001-11-28 | 2004-02-03 | 学校法人慶應義塾 | 医用高分子及びその用途 |
US20030215395A1 (en) * | 2002-05-14 | 2003-11-20 | Lei Yu | Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier |
JP4305615B2 (ja) * | 2002-11-08 | 2009-07-29 | 公立大学法人大阪府立大学 | ポリアミドアミンデンドロンを含む遺伝子導入剤組成物 |
-
2005
- 2005-11-16 JP JP2005332011A patent/JP4962931B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2007137805A (ja) | 2007-06-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Nishiyama et al. | Nanostructured devices based on block copolymer assemblies for drug delivery: designing structures for enhanced drug function | |
Mével et al. | DODAG; a versatile new cationic lipid that mediates efficient delivery of pDNA and siRNA | |
Zhang et al. | Cationic compounds used in lipoplexes and polyplexes for gene delivery | |
CA2853689C (en) | Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery | |
AU729077B2 (en) | Cationic lipid-nucleic acid complexes | |
KR101168440B1 (ko) | 지질 캡슐화된 간섭 rna | |
JP3907662B2 (ja) | 自己構築ポリヌクレオチド送達システム | |
JP2011503070A (ja) | 全身遺伝子送達のための自己構築型ミセル様ナノ粒子 | |
CA2587962A1 (en) | Highly branched hk peptides as effective carriers of sirna | |
WO2006090813A1 (ja) | 腫瘍組織で選択的に分解性を示す血中滞留性素子 | |
Berger et al. | Optimizing pDNA lipo-polyplexes: a balancing act between stability and cargo release | |
Zhang et al. | Synthesis, characterization, and in vitro transfection activity of charge-reversal amphiphiles for DNA delivery | |
US20210170046A1 (en) | Improved lipid-peptide nanocomplex formulation for mrna delivery to cells | |
Haynes et al. | Lipid-coated calcium phosphate nanoparticles for nonviral gene therapy | |
US20100297023A1 (en) | Lipid | |
US20150297749A1 (en) | Low-density lipoprotein analogue nanoparticles, and composition comprising same for targeted diagnosis and treatment of liver | |
JP5067733B2 (ja) | 目的物質をミトコンドリア内に送達可能な脂質膜構造体 | |
KR20220110174A (ko) | 핵산 치료제를 위한 종양-표적화 폴리펩티드 나노입자 전달 시스템 | |
JP4962931B2 (ja) | ポリアミドアミンデンドロン脂質を含む遺伝子等運搬媒体組成物 | |
CA2598316A1 (en) | Polyoxyalkylene chain-containing lipid derivative and lipid film structure containing such derivative | |
JP5446119B2 (ja) | 低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質 | |
CN108779063A (zh) | 用于递送生物活性物质至细胞的脂质和复合物 | |
JP4305615B2 (ja) | ポリアミドアミンデンドロンを含む遺伝子導入剤組成物 | |
CN116744979A (zh) | 包含甘露糖的脂质纳米颗粒或其应用 | |
US20140178462A1 (en) | Amphoteric liposomes comprising neutral lipids |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081113 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081216 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111129 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20111130 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120126 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120313 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120319 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4962931 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150406 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |