CN108779063A - 用于递送生物活性物质至细胞的脂质和复合物 - Google Patents

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Abstract

包含具有阳离子头部基团和三个C12‑24烃基基团的式(Ia)的三链阳离子的脂质，用于在非病毒基因递送系统中，例如在脂质多聚物转染载体的形成中使用。当核酸和靶肽与本发明的脂质(或与共脂质配制的脂质)配制成为LPD复合物时，观察到了非常好的核酸转染。

Description

用于递送生物活性物质至细胞的脂质和复合物
发明领域
本发明涉及适合用于递送生物活性物质(例如，核酸、蛋白质或小分子)至细胞的脂质衍生物。本发明还涉及用于在制备用于递送生物活性物质至细胞的非病毒载体中使用的复合物，所述复合物包含此类脂质，此类脂质例如与肽组合，以及此类复合物在例如预防、治疗和疫苗接种中或体外实验室环境的用途。
发明背景
用于疗法或其他目的的基因递送是众所周知的，特别是用于诸如囊性纤维化和某些癌症的疾病的治疗。该术语是指基因或基因的一部分向细胞中的递送，以纠正一些缺陷。在本说明书中，该术语也用于指核酸物质向靶细胞中的任何引入，并且包括基因疫苗接种和商业上有用的蛋白质在所谓的细胞工厂中的体外生产。
细胞递送系统分为三大类，即涉及裸DNA或RNA的直接注射的那些、使用病毒或遗传修饰的病毒的那些和使用非病毒递送剂的那些。每种具有其优势和劣势。尽管病毒作为递送剂具有高效率和高细胞选择性的优势，但它们具有毒性、产生炎症反应和难以处理大DNA片段的劣势。
非病毒基因递送系统基于通过DNA或RNA的带负电荷的磷酸主链与阳离子脂质、肽或其他聚合物之间的静电相互作用将遗传物质压缩成纳米颗粒(Erbacher，P.等人，GeneTherapy，1999，6，138-145)。与病毒不同，包括脂质的非病毒转染载体的使用可以导致较低的毒性，尤其是较低的免疫原性；较高的安全性；降低的成本，合理地有效的靶向以及增强的包装能力，例如，处理核酸物质的大片段的能力。不幸的是，已经注意到较低的转染效率。非病毒基因疗法载体已经是近期综述的主题：(Yin H，Kanasty RL，Eltoukhy AA，VegasAJ，Dorkin JR，Anderson DG.Non-viral vectors for gene-based therapy.Naturereviews Genetics.2014；15:541-55；Schroeder A，Levins CG，Cortez C，Langer R，Anderson DG.Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery.J InternMed.2010；267:9-21；Zhao Y,Huang L.Lipid nanoparticles for gene delivery.AdvGenet.2014；88:13-36)。
已知的用于基因递送的复合物包括用于基于脂质的核酸复合物的脂质复合物(lipoplex)、用于基于肽或聚合物的复合物的多聚物(polyplex)和用于杂合系统的脂质多聚物(lipopolyplex)(Felgner等人，Human Gene Therapy8,1997,511-512)。如本文所用，术语“LDP”是脂质多聚物的一种形式，其代表包含脂质、整联蛋白(或其他受体)结合肽和DNA(或其他核酸)的制剂。LPD复合物通过整联蛋白介导的或其他受体介导的通路实现转染；它们不一定需要具有总体正电荷，因此可以减少不被期望的血清相互作用。肽组分提供核酸包装功能，屏蔽DNA或RNA免于细胞内或细胞外降解、内含体的或以其他方式的。脂质组分通过膜融合或透化(permeabilisation)介导与内含体脂质双分子层的相互作用，减少内含体或溶酶体降解并允许核酸载物运输到细胞质中。肽组分可以被设计为细胞类型特异性或细胞表面受体特异性的。例如，整联蛋白或其他受体的特异性程度可赋予LPD复合物一定程度的细胞特异性。特异性是由靶向细胞表面受体(比如整联蛋白受体)导致的结果，并且可以实现与一些腺病毒载体相当的转染效率。(Du Z，Munye MM，Tagalakis AD，ManuntaMD，Hart SL.The role of the helper lipid on the DNA transfection efficiencyoflipopolyplex formulations.Sci Rep.2014；4:7107；Welser K，Campbell F，KudsiovaL，Mohammadi A，Dawson N，Hart SL等人，Gene delivery using ternary lipopolyplexesincorporating branched cationic peptides:the role of Peptide sequence andbranching.Mol Pharm.2013；10:127-41；Meng QH，Irvine S，Tagalakis AD，McAnulty RJ，McEwan JR，Hart SL.Inhibition of neointimal hyperplasia in a rabbit vein graftmodel following non-viral transfection with human iNOS cDNA.Gene Ther.2013；20:979-86；Manunta MD，McAnulty RJ，McDowell A，Jin J，Ridout D，Fleming J等人，Airway deposition of nebulized gene delivery nanocomplexes monitored byradioimaging agents.Am J Respir Cell Mol Biol.2013；49:471-80；Kenny GD，Bienemann AS，Tagalakis AD，Pugh JA，Welser K，Campbell F等人，Multifunctionalreceptor-targeted nanocomplexes for the delivery of therapeutic nucleic acidsto the Brain.Biomaterials.2013；34:9190-200；Tagalakis AD，He L，Saraiva L，Gustafsson KT，Hart SL.Receptor-targeted liposome-peptide nanocomplexes forsiRNA delivery.Biomaterials.2011；32:6302-15；Tagalakis AD，Grosse SM，Meng QH，Mustapa MF，Kwok A，Salehi SE等人，Integrin-targeted nanocomplexes for tumourspecific delivery and therapy by systemic administration.Biomaterials.2011；32:1370-6；Manunta MD，McAnulty RJ，Tagalakis AD，Bottoms SE，Campbell F，Hailes HC等人，Nebulisation of receptor-targeted nanocomplexes for gene delivery to theairway epithelium.PLoS One.2011；6:e26768；Grosse SM，Tagalakis AD，Mustapa MF，Elbs M，Meng QH，Mohammadi A等人，Tumor-specific gene transfer with receptor-mediated nanocomplexes modified by polyethylene glycol shielding andendosomally cleavable lipid and peptide linkers.FASEB J.2010；24:2301-13)。
已经报道了靶向人气道上皮细胞的肽(WO02/072616)。已经报道了靶向树突状细胞的肽(WO2004/108938)。
脂质/肽载体以高效率和低毒性转染一系列细胞系和原代细胞培养物：上皮细胞(40％效率)、血管平滑肌细胞(50％效率)、内皮细胞(30％效率)和造血细胞(10％效率)。此外，已经展示了小鼠支气管上皮的体内转染(Manunta MD，McAnulty RJ，Tagalakis AD，Bottoms SE，Campbell F，Hailes HC等人，Nebulisation of receptor-targetednanocomplexes for gene delivery to the airway epithelium.PLoS One.2011；6:e26768；Tagalakis AD，McAnulty RJ，Devaney J，Bottoms SE，Wong JB，Elbs M等人，Areceptor-targeted nanocomplex vector system optimized for respiratory genetransfer.Mol Ther.2008；16:907-15.Jenkins等人，Formation of LID vectorcomplexes in water alters physicochemical properties and enhances pulmonarygene expression in vivo，Gene Therapy 2003,10,1026-34)，大鼠肺(Jenkins等人，Anintegrin-targeted non-viral vector for pulmonary gene therapy，GeneTherapy2000,7,393-400)以及猪肺(Manunta MD，McAnulty RJ，McDowell A，Jin J，RidoutD，Fleming J等人Airway deposition of nebulized gene delivery nanocomplexesmonitored by radioimaging agents.Am J Respir Cell Mol Biol.2013；49:471-80；Cunningham等人，Evaluation of a porcine model for pulmonary gene transferusing a novel synthetic vector，J Gene Med 2002，4，438-46)并且具有与腺病毒载体相当的效率(Jenkins等人，2000，如上)。
用于此类LPD复合物或脂质/肽复合物的肽必须具有两种官能性：含有细胞表面受体(例如整联蛋白)识别序列的“头部基团”和能够非共价结合DNA的“尾部”。其中这两种组分通过间隔子以不干扰其各自功能的方式共价连接的已知肽包括其中“尾部”是聚阳离子性核酸结合组分的肽，比如WO96/15811中所述的肽6。
涉及包括这样的肽的LPD复合物的初始实验已经表明通过全身或静脉内递送途径的不够高的转染性质。如对于其他聚阳离子载体所描述的，可能的问题是载体与血清蛋白和红细胞膜的缔合(association)，导致差的溶解性和网状内皮系统对载体的快速清除(Dash，P.R.，Read，M.L.，Barrett，L.B.，Wolfert，M.A.，Seymour，L.W.(1999)Gene Therapy6,643-50)。通过全身施用已经显示出一些转染活性的载体主要在比如肝和肺的器官的首过毛细血管床(first-pass capillary bed)中有效(Fenske,D.B.,MacLachlan,I.,Cullis,P.R.(2001).Curr Opin Mol Ther 3,153-8)。虽然这种非特异性转染活性可能具有一些治疗应用，但是对于特定应用的安全临床使用需要具有高得多的靶特异性的载体。
关于LPD复合物的脂质组分，用于这样用途的阳离子脂质由Felgner在20世纪80年代后期开发，并且在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417，1987中以及在US 5,264,618中报道。Felgner开发了现在可商购的由商标“Lipofectin”为人所知的阳离子脂质体，其由细胞转染素DOTMA 1和中性脂质DOPE 2以1:1的比率组成。
此后已经设计了各种其他阳离子脂质体制剂，其中大多数组合了合成的阳离子细胞转染素和中性脂质。一些，例如，基于甘油骨架(比如DOTMA)或基于胆固醇，比如DC-Chol3。
开发新的细胞转染素的目的通常是优化所得载体的递送性质用于许多种细胞类型和用于体内应用。
细胞转染素和其他阳离子脂质是带正电荷的分子，其具有通过某个间隔子附接到疏水尾部的阳离子头部基团。除了DOTMA1类似物之外，还报道了一系列与甘油骨架、可选的烷基链基团和官能化的头部基团具有醚或酯连键的类似物，比如二酯DOTAP 4。可以在Angew.Chem.Int.Ed.37，1768-1785，1998中找到这些物质以及这些物质的运行机制的综述。许多已知的DOTMA 1类似物细胞转染素(cyclofectin)的共同特征是存在在阳离子头部基团上附接的两个疏水尾部。
研究已经证实，对于许多细胞类型，使用DOTMA1和DOTAP 4的体外实验给出了相当水平的转染，但是当在体内使用时，DOTMA1展现出更高的转染活性。报道的其他类似物包括具有N,N-二甲基N-乙醇胺头部基团的二酯DORI 5，对应的二醚DORIE 6，以及C14:0类似物DIMRIE 7。
已经证明了含有这样的季胺羟烷基部分(moiety)的细胞转染素特别令人感兴趣，并且具有较短羟烷基基团的脂质引起了改进的性质。例如，与具有羟丙基-羟戊基基团的脂质相比，在头部基团具有羟乙基部分的DORIE 6与辅助脂质(helper lipid)DOPE 2的共制剂在COS.7细胞中给出了更高的转染效率。所有这些羟烷基细胞转染素比DOTMA1更有活性，并且DMRIE 7也作为更有效的脂质之一被强调。
具有端部羟基基团的细胞转染素据信是特别有效的，因为羟基基团能够增加脂质体与DNA或细胞膜的相互作用，或因为它能够通过电荷中和和/或氢键合稳定阳离子脂质:DOPE 2双分子层结构。
WO 2005/117985描述了包含一个或更多个聚乙二醇(PEG)基团的脂质(即PEG化脂质)，并且示出了这样的PEG化脂质展示出相对于不含PEG基团的脂质(即非PEG化脂质)的优点。特别是，由于它们与血浆蛋白的结合和载体聚集造成的网状内皮系统快速清除脂质的问题，可以通过用聚合的PEG部分屏蔽载体来改善。然而，PEG化通常导致大大降低的转染效率，并且仍然存在对于不被网状内皮系统快速清除但展示令人满意的转染效率的脂质的需要。
脂质，DODEG4 13，一种具有短n-乙二醇头部基团的基于甘油的二醚脂质及其在脂质多聚物(脂质-肽-DNA)靶向递送中的应用先前已经在Hurley,C.A.；Wong,J.B.；Ho,J.；Writer,M.；Irvine,S.A.；Lawrence,M.J.；Hart,S.L.；Tabor,A.B.；Hailes,H.C.Org.Biomol.Chem.2008,6,2554–2559中以及在Welser,K.；Campbell,F.；Kudsiova,L.；Mohammadi,A.；Dawson,N.；Hart,S.L.；Barlow,D.J.；Hailes,H.C.；Lawrence,M.J.；Tabor,A.B.；Mol.Pharm.2013,10,127–141中被报道。
发明概述
本发明人发现了一类新的离子化合物，其作为LPD复合物的脂质部分(part)或作为LPD复合物的脂质部分的组分是有用的。所述离子化合物是三链阳离子性脂质，其具有三个附接到阳离子头部基团的疏水尾部，其中一个通过亚烷基二醇连键附接。已经发现，例如，与已知的双链DOTMA1类似物细胞转染素相比，新的三链脂质提高了它们所掺入的合成转染载体的转染效率，所述双链DOTMA1类似物细胞转染素包括两个附接到阳离子头部基团的疏水尾部。
在第一方面，本发明提供了式(Ia)的离子化合物：
其中：
●X和Y的每一个相同或不同并且选自-O-和-O-C(O)-，其中羰基碳与基团R1或R2键合；
●R1和R2相同或不同并且各自独立地选自C12-24烃基基团，所述C12-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团；
●R3和R4相同或不同并且各自独立地选自C1-10烃基基团，所述C1-10烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素、-OR'、-C(O)OH、-CN、-N(R')2和C(O)R'的一个或更多个取代基取代，其中每个R’相同或不同并且是C1-6烃基基团；
●Sp和W一起是一个键；或
●Sp是C1-8亚烷基基团，所述C1-8亚烷基基团未被取代或被选自羟基、卤素和-OR'的一个或更多个取代基取代，其中R’是C1-6烃基基团；并且W选自键、-O-C(O)-、-C(O)-O-和-O-；
●每个B相同或不同并且是C1-6亚烷基基团，所述C1-6亚烷基基团未被取代或被选自羟基、卤素、-ORA、-NRARA和-OC(O)RA的一个或更多个取代基取代；
其中每个RA独立地选自C1-4烃基；
●m是从1到8的整数；并且
●Q选自-OR5和-O-C(O)-R5，其中R5选自C7-24烃基基团，所述C7-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和-ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团。
在第二方面，本发明提供了包含(i)本发明第一方面的离子化合物的转染复合物。有利地，本发明第二方面的转染复合物还包含(iv)用于递送至细胞的核酸或其他活性化合物。有利地，本发明第二方面的转染复合物适合于作为药物或疫苗使用。
在第三方面，本发明提供了药物组合物，其包含与药学上合适的载剂(carrier)混合或联合的本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物。
在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物，用于在疗法中使用。
在第五方面，本发明提供了用于由在基因中的缺陷和/或缺乏在人类或非人类动物中引起的状况的治疗或预防或用于治疗性或预防性免疫、或用于反义或RNAi疗法的方法，所述方法包括向人类或非人类动物施用本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物。
在第六方面，本发明提供了用于患有癌症的人类或非人类动物的治疗的方法，所述方法包括向人类或非人类动物施用本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物。
在第七方面，本发明提供了本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物在药物生产中的用途，所述药物用于由在基因中的缺陷和/或缺乏在人类或非人类动物中引起的状况的治疗或预防、或用于治疗性或预防性免疫、或用于反义或RNAi疗法。
在第八方面，本发明提供了本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物在药物生产中的用途，所述药物用于在人类或非人类动物中的癌症的治疗或预防。
在第九方面，本发明提供了本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物，用于在由在基因中的缺陷和/或缺乏在人类或非人类动物中引起的状况的治疗或预防、或用于治疗性或预防性免疫、或用于反义或RNAi疗法中使用。
在第十方面，本发明提供了本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物，用于在人类或非人类动物中的癌症的治疗或预防中使用。
在第十一方面，本发明提供了试剂盒，其包含：
(i)本发明第一方面的离子化合物；
包含(ii)聚阳离子性核酸结合组分以及(iii)细胞表面受体结合组分的肽；以及任选地(iv)核酸。
发现包含本发明的三链脂质的LPD(脂质-肽-核酸)脂质多聚物的转染效率显著高于对于二链类似物的。我们先前已经示出，LPD复合物的脂质组分对于胞内跨内含体膜运输特别重要，并且因此假设这些脂质通过促进该过程提高转染效率(Du Z，Munye MM，Tagalakis AD，Manunta MD，Hart SL.The role of the helper lipid on the DNAtransfection efficiency of lipopolyplex formulations.Sci Rep.2014；4:7107)。它们也可能影响纳米复合物的内部结构，从而使得核酸在细胞内更有效地释放成为可能(Munye MM，Ravi J，Tagalakis AD，McCarthy D，Ryadnov MG，Hart SL.Role of liposomeand peptide in the synergistic enhancement of transfection with alipopolyplex vector.Sci Rep.2015；5:9292)。因此，本发明的新的三链脂质提供了基于三条疏水链的使用的新一代有效细胞转染素基因递送载体。
附图简述
图1示出了使用LPD制剂的NIH3T3细胞的转染，所述LPD制剂含有与PEG-酯可切割脂质(ME42)、PEG-酯不可切割脂质(CH300)、本发明的三链PEG-酯脂质(FMM30)或具有通过酯键连接的油酰基的ME42相关脂质(FMM32)(其中一些与中性、融合性脂质DOPE组合)组合的肽ME27和质粒pCI-Luc。
图2示出了与在图1中描述的相同实验，但是用第二细胞系1HAEo-进行的结果。
图3示出了使用LPD制剂的转染，所述LPD制剂含有PEG-酯可切割脂质(ME42)、PEG-酯不可切割脂质(CH300)或本发明的三链PEG-酯脂质(FMM30)、具有通过酯键连接的油酰基的ME42相关脂质(FMM32)、一种二酯：具有C16烷基尾部的不饱和脂质(106a)(其中一些与中性、融合性脂质DOPE组合)。脂质与肽ME27、K16CY、K16Y和K16P组合，并且用于与pCI-Luc一起转染NIH3T3细胞。
图4示出了使用LPD复合物的转染，所述LPD复合物含有与肽K16Y或ME27组合的PEG-酯可切割脂质(ME42)、PEG-酯不可切割脂质(CH300)或本发明的三链PEG-酯脂质(FMM30)。转染在小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro 2A中进行。
图5示出了LPD颗粒的透射电子显微镜(EM)图像，所述LPD颗粒包含重量比率在0.75:4:1(L:P:D)的FMM30与肽ME27。
图6示出了LPD颗粒的透射电子显微镜(EM)图像，所述LPD颗粒包含重量比率在0.75:4:1(L:P:D)的FMM30/DOPE与肽ME27。
图7示出了LPD纳米颗粒的尺寸，所述LPD纳米颗粒含有在不同的脂质体对DNA的重量比率(w/w)的与脂质FMM30或FMM30/DOPE组合的肽ME27。
发明详述
脂质
在第一方面，本发明提供了式(Ia)的离子化合物：
其中：
●X和Y的每一个相同或不同并且选自-O-和OC(O)-，其中羰基碳与基团R1或R2键合；
●R1和R2相同或不同并且各自独立地选自C12-24烃基基团，所述C12-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团；
●R3和R4相同或不同并且各自独立地选自C1-10烃基基团，所述C1-10烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素、-OR'、-C(O)OH、-CN、-N(R')2和C(O)R'的一个或更多个取代基取代，其中每个R’相同或不同并且是C1-6烃基基团；
●Sp和W一起是一个键；或
●Sp是C1-8亚烷基基团，所述C1-8亚烷基基团未被取代或被选自羟基、卤素和-OR'的一个或更多个取代基取代，其中R’是C1-6烃基基团；并且W选自键、-O-C(O)-、-C(O)-O-和-O-；
●每个B相同或不同并且是C1-6亚烷基基团，所述C1-6亚烷基基团未被取代或被选自羟基、卤素、-ORA、-NRARA和-OC(O)RA的一个或更多个取代基取代；
其中每个RA独立地选自C1-4烃基；
●m是从1到8的整数；并且
●Q选自-OR5和-O-C(O)-R5，其中R5选自C12-24烃基基团，所述C12-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团。
任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Ia)，其中Sp和W都是键，或者Sp是未被取代的C1-8亚烷基基团并且W是键、-O-C(O)-、-C(O)-O-或–O-，尤其是键、-C(O)-O-或–O-。有利地，Sp和W都是键，或者Sp是未被取代的C1-8亚烷基基团并且W是-C(O)-O-。
如本文所用，术语“亚烷基”是指衍生自从烷烃中除去两个氢原子的二价自由基，也称为烷二基基团(alkanediyl group)，例如-CH(CH3)CH2-(丙烷-1,2-二基)。
如本文所用，术语“烃基”是指通过从烃中除去氢原子而形成的单价基团，例如乙基或苯基。
本发明第一方面的离子化合物任选地具有式(Ib)：
其中：
●X和Y的每一个相同或不同并且选自-O-和-O-C(O)-，其中羰基碳与基团R1或R2键合；
●R1和R2相同或不同并且各自独立地选自C12-24烃基基团，所述C12-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团；
●R3和R4相同或不同并且各自独立地选自C1-10烃基基团，所述C1-10烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素、-OR'、-C(O)OH、-CN、-N(R')2和-C(O)R'的一个或更多个取代基取代，其中每个R’相同或不同并且是C1-6烃基基团；
●每个B相同或不同并且是C1-6亚烷基基团，所述C1-6亚烷基基团未被取代或被选自羟基、卤素、-ORA、-NRARA和-OC(O)RA的一个或更多个取代基取代，并且优选地未被取代；
其中每个RA独立地选自C1-4烃基；
●m是从1到8的整数；并且
●Q选自-OR5和-O-C(O)-R5，其中R5选自C12-24烃基基团，所述C12-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和-ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团。
任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Ia)或(Ib)，其中每个B选自未被取代的C1-3亚烷基基团，尤其是乙烯。
本发明第一方面的离子化合物任选地具有式(Ic)：
其中：
●X和Y的每一个相同或不同并且选自-O-和-OC(O)-，其中羰基碳与基团R1或R2键合；
●R1和R2相同或不同并且各自独立地选自C12-24烃基基团，所述C12-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团；
●R3和R4相同或不同并且各自独立地选自C1-10烃基基团，所述C1-10烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素、-OR'、-C(O)OH、-CN、-N(R')2和-C(O)R'的一个或更多个取代基取代，其中每个R’相同或不同并且是C1-6烃基基团；
●m是从1到8的整数；并且
●Q选自-OR5和-O-C(O)-R5，其中R5选自C12-24烃基基团，所述C12-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团。
如本文所用，除非另有说明，术语“烃基”是指直链的或支链的、饱和的或不饱和的基团。
任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Ia)、(Ib)或(Ic)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是C14-22烃基基团，例如，具有一个、两个或三个双键的，尤其是一个双键的不饱和C14-22烯基基团。有利地，R1和R2相同或不同并且各自独立地是直链的、具有一个双键的不饱和的C16或C18烯基基团。任选地R1和R2选自-(CH2)5-10CH＝CH(CH2)5-9CH3，尤其是-(CH2)6-9CH＝CH(CH2)6-8CH3，比如-(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3或-(CH2)8CH＝CH(CH2)7CH3。优选地，该双键是顺式的并且R1和R2选自-(CH2)5-10CH[Z]＝CH(CH2)5-9CH3，尤其是-(CH2)6-9CH[Z]＝CH(CH2)6-8CH3，比如-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3或-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3。优选地，X-R1和Y-R2选自-O(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3。优选地，X和Y的每一个相同。优选地，R1和R2的每一个相同。优选地，X-R1和Y-R2的每一个相同。优选地，X-R1和Y-R2的每一个相同并且选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3。
任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Ia)、(Ib)或(Ic)，其中R3和R4相同或不同并且各自独立地选自直链的或支链的、未被取代的C1-10烷基基团，例如，直链的或支链的、未被取代的C1-6烷基基团，尤其是直链的或支链的、未被取代的C1-4烷基基团，比如甲基或乙基。有利地，R3和R4两者相同，例如两者都是甲基或两者都是乙基，尤其是两者都是甲基。
任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Ia)、(Ib)或(Ic)，其中m选自1、2、3、4、5、6或7，例如2、3、4、5或6，尤其是2、3、4或5。在本发明第一方面另外的实施方案中，m是3或4。
任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Ia)、(Ib)或(Ic)，其中Q选自-OR5和-O-C(O)-R5并且R5选自C12-24烃基基团，比如C14-22烃基基团，例如，具有一个、两个或三个双键的不饱和的C14-22烯基基团，尤其是直链的、具有一个双键，尤其是顺式双键的不饱和的C16或C18烯基基团。任选地R5是-(CH2)5-10CH＝CH(CH2)5-9CH3，尤其是-(CH2)6-9CH＝CH(CH2)6- 8CH3，比如-(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3或-(CH2)8CH＝CH(CH2)7CH3。优选地该双键是顺式的并且R5是-(CH2)5-10CH[Z]＝CH(CH2)5-9CH3，尤其是-(CH2)6-9CH[Z]＝CH(CH2)6-8CH3，比如-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3或-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3。优选地，Q选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3。
为了避免疑问，本发明第一方面的脂质的任何任选元素可以在本发明第一方面的其他实施方案中组合。例如，在本发明第一方面的一个实施方案中，离子化合物具有式(Ia)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是C14-22烃基基团；Sp和W两者都是键；R3和R4各自是直链的或支链的、未被取代的C1-6烷基基团；每个B选自未被取代的C1-3亚烷基基团；并且m是3、4、5、6或7。类似地，在本发明第一方面的一个实施方案中，离子化合物具有式(Ib)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是C14-22烃基基团；R3和R4各自是直链的或支链的、未被取代的C1-6烷基基团；每个B选自未被取代的C1-3亚烷基基团；并且m是3、4、5、6或7。又类似地，在本发明第一方面的一个实施方案中，离子化合物具有式(Ic)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是C14-22烃基基团；R3和R4各自是直链的或支链的、未被取代的C1-6烷基基团；并且m是3、4、5、6或7。在本发明第一方面的另外的实施方案中，离子化合物具有式(Ia)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是C14-20烃基基团，例如，具有一个、两个或三个双键的不饱和的C14-20烯基基团；Sp和W两者都是键；R3和R4各自是直链的或支链的、未被取代的C1-4烷基基团；每个B选自未被取代的C1-3亚烷基基团；m是3、4、5或6；并且R5选自C14-20烃基基团，例如，具有一个、两个或三个双键的不饱和的C14-20烯基基团。类似地，在本发明第一方面的另外的实施方案中，离子化合物具有式(Ib)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是C14-20烃基基团，例如，具有一个、两个或三个双键的不饱和的C14-20烯基基团；R3和R4各自是直链的或支链的、未被取代的C1-4烷基基团；每个B选自未被取代的C1-3亚烷基基团；m是3、4、5或6；并且R5选自C14-20烃基基团，例如，具有一个、两个或三个双键的不饱和的C14-20烯基基团。又类似地，在本发明第一方面的另外的实施方案中，离子化合物具有式(Ic)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是C14-20烃基基团，例如，具有一个、两个或三个双键的不饱和的C14-20烯基基团；R3和R4各自是直链的或支链的、未被取代的C1-4烷基基团；m是3、4、5或6；并且R5选自C14-20烃基基团，例如，具有一个、两个或三个双键的不饱和的C14-20烯基基团。在本发明第一方面的再另外的实施方案中，离子化合物具有式(Ia)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是具有一个双键的直链的、不饱和的C16或C18烯基基团；Sp和W两者都是键；R3和R4各自是甲基或乙基；每个B是亚乙基基团；m是3、4或5；并且R5是具有一个双键的直链的、不饱和的C16或C18烯基基团。类似地，在本发明第一方面的再另外的实施方案中，离子化合物具有式(Ib)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是具有一个双键的直链的、不饱和的C16或C18烯基基团；R3和R4各自是甲基或乙基；每个B是亚乙基基团；m是3、4或5；并且R5是具有一个双键的直链的、不饱和的C16或C18烯基基团。又类似地，在本发明第一方面的再另外的实施方案中，离子化合物具有式(Ic)，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是具有一个双键的直链的、不饱和的C16或C18烯基基团；R3和R4各自是甲基或乙基；m是3、4或5；并且R5是具有一个双键的直链的、不饱和的C16或C18烯基基团。
本发明第一方面的离子化合物任选地具有式(Id)：
其中：
●X-R1和Y-R2和Q的每一个选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3；并且
●m是从2到5的整数。
任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Id)，其中m是3或4。
任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Id)，其中X-R1和Y-R2的每一个相同并且选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3。任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Id)，其中X-R1和Y-R2的每一个相同并且选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3，Q选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3,并且m是3或4。
任选地，本发明第一方面的离子化合物具有式(Id)，其中X-R1和Y-R2的每一个相同并且选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3，并且Q是-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3。任选地，本发明第一方面的脂质包含式(Id)的阳离子，其中X-R1和Y-R2的每一个相同并且选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3，Q是-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3，并且m是3或4。
本发明第一方面的离子化合物通常包括无机反离子，例如，药学上可接受的阴离子，比如氯离子或溴离子。
转染复合物
在第二方面，本发明提供了包含(i)本发明第一方面的离子化合物的转染复合物。本发明第二方面的转染复合物任选地还包含(ii)聚阳离子性核酸结合组分以及(iii)细胞表面受体结合组分。通常，聚阳离子性核酸结合组分(ii)以及细胞表面受体结合组分(iii)共同形成肽衍生物。有利地，本发明第二方面的转染复合物还包含(iv)核酸。
本发明第二方面的转染复合物通常是非病毒转染复合物，例如，LPD(或LID)复合物。
在第十一方面，本发明提供了试剂盒，其包含：
(i)核酸，
(ii)如上文所定义的本发明的离子化合物，
(iii)聚阳离子性核酸结合组分，以及
(iv)细胞表面受体结合组分。
例如，本发明提供了试剂盒，其包含：
(i)本发明第一方面的离子化合物；
包含(ii)聚阳离子性核酸结合组分以及(iii)细胞表面受体结合组分的肽；以及任选地(iv)核酸。
本发明第十一方面的试剂盒可以，例如，用于组装本发明第二方面的转染复合物。
在第三方面，本发明提供了药物组合物，其包含与药学上合适的载剂混合或联合的本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物。
肽
在一个实施方案中，本发明第二方面的肽衍生物具有式A-B-C，其中：
A是聚阳离子性核酸结合组分，
B是间隔子元件，并且
C是细胞表面受体结合组分。
已经发现，包含易于在细胞内切割的间隔子元件肽的本发明第二方面的转染复合物在给靶细胞带来转染方面比现有技术复合物更有效，所述现有技术复合物包括不包含易于在细胞内切割的间隔子的肽。
聚阳离子性核酸结合组分A是任何能够与DNA或RNA结合的聚阳离子。聚阳离子可以本身就是聚阳离子性的，或者，只要保留与DNA或RNA结合的能力，其可以具有任何数量的阳离子单体。例如，可以存在从3个到100个阳离子单体，例如，从10个到20个，例如从14个到18个，例如，约16个。
术语“聚阳离子性核酸结合组分”在本领域中是众所周知的，并且指具有至少3个重复阳离子氨基酸残基或其他带有正电荷基团的阳离子单元的聚合物，这种聚合物能够在生理条件下与核酸络合(complexation)。结合核酸的聚阳离子性分子的实例是包含一个或更多个阳离子氨基酸的低聚肽。这样的低聚肽可以是例如低聚赖氨酸分子、低聚组氨酸分子、低聚精氨酸分子、低聚鸟氨酸分子、低聚二氨基丙酸分子或低聚二氨基丁酸分子，或包含组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸和二氨基丁酸残基的任意组合的组合低聚物。上述低聚肽中的任何一种可以具有例如总共从3个到35个、例如从5个到25个残基，优选从10到20个残基，例如，从14个到18个残基，例如16个残基。
低聚赖氨酸是特别优选的，例如，具有从3个到35个，例如，从2个到25个，例如，从10个到20个赖氨酸残基，例如，从13个到19个，例如，从14个到18个，例如，从15个到17个残基，例如，16个残基，即[K]16，“K”表示赖氨酸。
聚阳离子性组分的另外的实例包括树枝状聚合物和聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺(PEI)是一种无毒的、交联的阳离子聚合物，其具有基因递送潜力(Proc.Natl.Acad.Sci.,1995,92,7297-7301)。聚乙烯亚胺可从Fluka(800kDa或从Sigma(50kDa)获得，或作为选择地从PolyPlus-tranfection(Illkirch,France)为转染目的预稀释。通常，当PEI以9倍相对于DNA过量使用时，其效率最高，过量比率以PEI氮:DNA磷酸盐/酯计算，并且在pH 5至8。可以以本领域技术人员熟悉的方式优化这些参数。
间隔子元件肽B有利地易于在细胞内切割。易于在细胞内切割的间隔子元件肽B可能易于在细胞的内含体、溶酶体和/或细胞质内切割。易切割在本文中被理解为意味着该元件在组分A和C保持完整的时间范围内易切割。元件B被切割比细胞肽降解通路更快地生效。
优选地，间隔子元件肽易于酶切割、还原切割或pH依赖性切割(例如水解)。在酶切割的情况下，在本发明的一方面，优选的肽是那些易于被选自NOX(NADH-氧化酶)、GILT(γ-干扰素诱导溶酶体硫醇还原酶)和PDI(蛋白二硫键异构酶)的酶切割的肽。在本发明的另一方面，优选的肽是那些易于被存在于内含体中的酶(例如内含体蛋白酶，比如弗林蛋白酶(furin)或组织蛋白酶(cathepsin))切割的肽。
优选地，间隔子元件肽B包含选自以下的基团：
a)包含二硫键连键的肽链；
b)包含酯连键的肽链；
c)易于被弗林蛋白酶切割的氨基酸序列；以及
d)易于被组织蛋白酶切割的氨基酸序列。
所述二硫连键优选地是在正常大气和生理条件下稳定的，但可以在内含体中还原切割的二硫连键。类似地，本发明的肽链中的酯连键优选地是在中性pH稳定的，但在内含体的酸性环境(例如在pH低于6.0，优选地在pH低于5.5，或在低于5.0时)中断裂的酯连键。
例如，易于被弗林蛋白酶切割的氨基酸序列包括选自以下的序列：
i)RX1KR；以及
ii)RX2RR；
其中X1和X2，其可以相同或不同，各自代表任何氨基酸残基(Zimmer等人，J.Biol.Chem.,2001,276,31642-31650；Nakayama,Biochem.J.,1997,327,625-635)。
优选的氨基酸残基X1包括Lys(K)以及Val(V)，例如Lys(K)。
优选的氨基酸残基X2包括Lys(K)以及Val(V)，例如Val(V)。
例如，组织蛋白酶可以是任何合适的组织蛋白酶(参见Pillay等人，Biochem.J.,2002,363,417-429)。例如，它可以是组织蛋白酶B。例如，易于被组织蛋白酶B切割的氨基酸序列(参见Pechar等人，Macromol.Chem.Phys.,1997,198,1009-1020)包括选自以下的序列：
iii)X3X4，其中X3选自酪氨酸(Tyr，Y)、苯丙氨酸(Phe，F)、亮氨酸(Leu，L)、缬氨酸(Val，V)和异亮氨酸(Ile，I)并且X4选自甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)和谷氨酸(Glu，E)。
优选地，X3选自酪氨酸(Tyr，Y)、苯丙氨酸(Phe，F)和亮氨酸(Leu，L)。
例如，序列X3X4可以呈现为GFX3X4，例如为GFLG(如在Pechar等人，BioconjugateChem.,2000,11,131-139中所使用的)。
间隔子元件肽B可以额外地包含接头，其优选地或是肽，也就是说，其包含氨基酸残基，或是聚乙二醇基团，或是两者的混合。氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。它们可以具有L构型或D构型。接头可以具有两个或更多个氨基酸。它可以，例如，包含三个或更多个氨基酸，例如，四个或更多个，例如，五个或更多个，例如，至多十个氨基酸或更多。氨基酸可以相同或不同，但是在间隔子中一般地应该避免多个赖氨酸残基(或其他适合于用于在载体复合物的聚阳离子性核酸结合组分中使用的阳离子氨基酸)的使用，因为低聚赖氨酸序列具有作为聚阳离子性核酸结合组分的活性。
所述接头可以是，例如，甘氨酸-甘氨酸(GG)或甘氨酸-丙氨酸(GA)二肽。
所述接头可以是或可以包括聚乙二醇部分。聚乙二醇部分可以包含从1到30个乙二醇单元，优选地从1个到15个单元，更优选地从一个到8个单元，例如从2个到6个单元，例如4个单元。
优选地，接头在间隔子元件肽B的末端，所述间隔子元件肽B与聚阳离子性核酸结合组分A键合。
优选地，细胞表面受体结合组分C包含肽。当在细胞表面受体结合组分包含肽的情况下，所述肽可以在长度上是至多20个氨基酸，或者可以更长。肽一般具有至少5个氨基酸，但是可以具有更少的氨基酸。一般地，肽具有从6个到20个(含6个和20个)的任何数量的氨基酸。一般地，对于肽，具有15个氨基酸或更少的氨基酸是优选的，更优选地12个氨基酸或更少，最优选地10个氨基酸或更少。一般地，对于肽，具有5个或更多个氨基酸是优选的，例如6个或更个多氨基酸。最优选地，所述肽具有7个氨基酸。
优选地，细胞表面受体结合组分C包含含有环状区域的肽。环状肽可以通过在肽中提供至少两个半胱氨酸残基而形成，由此使得二硫键的形成成为可能。因此，优选的细胞表面受体结合组分C由具有两个或更多个能够形成一个或更多个二硫键的半胱氨酸残基的肽组成或包含其。优选地，半胱氨酸残基侧接主要的受体结合部分。
在本发明的一个实施方案中，细胞表面受体结合组分C包含结合整联蛋白的肽。结合整联蛋白的肽是任何能够特异性地与在细胞表面发现的整联蛋白结合的肽。结合整联蛋白的肽可以是天然存在的结合整联蛋白的配体，例如，细胞外基质蛋白、病毒衣壳蛋白、细菌蛋白侵染素、蛇毒去整联蛋白蛋白或任何此类蛋白的结合整联蛋白的片段。这样的结合整联蛋白的蛋白及其片段可以从天然来源或重组技术获得。使用结合整联蛋白的肽是优选的，特别是因为它们合成、纯化和储存的简易性、它们对于化学改性的潜力、以及它们潜在的低体内免疫原性。优选的结合整联蛋白的肽是比如在WO 96/15811，并且尤其是在WO 98/54347中描述的那些。例如，结合整联蛋白的肽可以是对于α4β1整联蛋白特异的。
在本实施方案中，细胞表面受体结合组分C优选地包含选自以下的肽：
a)RGD；
b)RRETAWA；
c)LDV。
在本发明另外的实施方案中，细胞表面受体结合组分C包含能够与人类气道上皮(HAE)细胞结合的肽。优选的结合HAE细胞的肽是比如在WO02/072616中描述的那些。在本实施方案中，细胞表面受体结合组分C优选地包含选自以下的肽：
a)X5SM；
b)LX6HK；
c)PSGX7ARA；
d)SX8RSMNF；以及
e)LX9HKSMP；
其中X5是碱性氨基酸残基，X6是Q或P，X7是A或T，X8是酸性氨基酸残基并且X9是P或Q。
优选地，细胞表面受体结合组分C包含选自以下的肽：
a)X5SM；
b)LX6HK；以及
c)PSGAARA，
其中X5是碱性氨基酸残基并且X6是Q或P。
优选地X5是K或R。优选地X6是P。优选地X7是A。优选地X8是E或Q。更优选地X8是E。优选地X9是P。因此，优选的肽是包含选自LQHKSMP、LPHKSMP、VKSMVTH、SERSMNF、VGLPHKF、YGLPHKF、PSGAARA、SQRSMNF和PSGTARA的序列的那些。
在本发明的另一个实施方案中，细胞表面受体结合组分C包含能够与人类树突状细胞结合的肽。
优选的结合人类树突状细胞的肽是比如在WO 2004/108938中描述的那些。例如，这样的肽可以选自包含选自以下的氨基酸序列的肽：
a)PX10X11X12T；
b)PSX13S；
c)QX14X15X16Q；
d)SX17S，
其中X10、X11和X12，其可以相同或不同，各自代表氨基酸残基；
X13代表氨基酸残基；
X14和X16，其可以相同或不同，各自代表氨基酸残基，并且X15代表具有酰胺侧链的氨基酸残基，例如，N或Q。
X17代表具有脂族侧链的氨基酸残基，例如，L或I。
在优选的实施方案中，细胞表面受体结合组分C包含选自以下的肽：
a)CRGDCLG；
b)CRGDCLG；
c)ACDCRGDCFCG；
d)CRGDMFGCA；
e)CRRETAWACG；
f)CRGEMFGCA；
g)CSERSMNFCG；
h)CYGLPHKFCG；以及
i)CLPHKSMPCG。
本发明提供了本发明第二方面的转染复合物在脂质多聚物(LPD)转染载体的形成中的用途。转染载体可用于将实体靶向至细胞，该实体是核酸或另一种分子，例如，治疗或药物活性分子，或包含可检测的标签的分子。
医疗用途
进一步已经发现了，本发明的离子化合物改进了载体复合物对肿瘤细胞的靶向，特别是当与可切割的肽联合使用时。因此，发现第一发明的离子化合物在癌症的治疗、治疗性或预防性免疫、或反义或RNAi疗法中的用途。因此，本发明提供了治疗癌症、治疗性或预防性免疫、或反义或RNAi疗法的方法，包括以有效量将本发明第一方面的离子化合物以合适的复合物施用于患者。因此，发现本发明第二方面的转染复合物在癌症的治疗、用于治疗性或预防性免疫，或用于反义或RNAi疗法中的用途。因此，本发明提供了治疗癌症、治疗性或预防性免疫，或反义或RNAi疗法的方法，包括以有效量向患者施用本发明第二方面的转染复合物。本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物可以在本发明第三方面的药物组合物中施用，该药物组合物包含与药学上合适的载剂混合或联合的离子化合物或转染复合物。
在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物，用于在疗法中使用。本发明还提供了本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物，用于作为药物或疫苗使用。例如，本发明的第四方面提供了本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物，其用于在由基因中的缺陷和/或缺失引起的状况的治疗或预防中使用，用于在癌症的治疗中使用，用于治疗性或预防性免疫，或用于反义或RNAi疗法。
核酸组分(D)可以是任何合适的核酸。它可以是DNA或RNA或化学改性的核酸模拟物，例如PNA分子。它可以，例如，为在靶细胞中具有效用的蛋白质编码。它可以是反义核酸或RNAi核酸。通过将由靶基因产生的细胞信使RNA(mRNA)分子暴露于含有与mRNA分子的短部分互补的序列的双链RNA(dsRNA)分子来实现RNAi。在细胞内，双链RNA分子被切割以产生短(21-23个核苷酸长)的单链和双链片段，这些片段可以与靶mRNA分子结合。这样的结合导致由核酸酶的靶mRNA的切割，从而导致靶基因表达水平的降低。因此，核酸组分本身可以是RNAi分子(“siRNA”)；可选地，所施用的核酸可以是DNA分子，其包含当转录时产生RNAi分子(即能够通过RNA干扰抑制靶基因表达的RNA)的序列。
本发明还提供了用于生产本发明的转染复合物的工艺。
在第五方面，本发明提供了用于由在基因中的缺陷和/或缺失在人类或非人类动物中引起的状况的治疗或预防的方法，所述方法包括将本发明第一方面的离子化合物或本发明第二方面的转染复合物施用于人类或非人类动物。
如本文所用，术语“在基因中的缺陷和/或缺失”不仅表示在基因编码区中的缺陷或缺失，还表示对于基因的控制元件(例如反式或顺式控制元件)中的缺陷或缺失，或者在直接地或间接地参与基因转录或翻译的任何其他元件中的缺陷或缺失。
在第六方面，本发明提供了用于人类或非人类动物的治疗性或预防性免疫的方法，所述方法包括将本发明第一方面的离子化合物与反义核酸(例如反义RNA)或适合用于RNAi疗法的核酸一起，或将包含反义核酸(例如反义RNA)或适合用于RNAi疗法的核酸的本发明第二方面的转染复合物施用于人类或非人类动物。本发明还提供了反义疗法的方法，其包括将本发明第一方面的离子化合物与核酸或包含核酸的本发明第二方面的转染复合物一起施用于人或非人动物，其中核酸是适用于反义疗法的核酸(例如RNA)或适用于RNAi疗法的核酸。
实施例
除非另有说明，用于合成的溶剂和试剂是来自商业供应商的试剂级，并且未经进一步纯化使用。无水的CH2Cl2使用无水氧化铝柱使用在Pangborn,A.B.；Giardello,M.A.；Grubbs,R.H.；Rosen,R.K.；Timmers,F.J.Organometallics 1996,15,1518–1520中描述的程序获得。所有湿敏反应在氮气或氩气气氛下使用经烘箱干燥的玻璃器皿进行。反应通过在Kieselgel60F254板上的TLC通过UV、高锰酸钾和磷钼酸染色检测来监测。使用硅胶(颗粒尺寸40-63μm)进行快速柱色谱法。1H NMR和13C NMR波谱在Bruker AMX300MHz、Avance-500MHz和Avance-600MHz机器上记录。耦合常数以赫兹(Hz)测量，并且除非另有说明，否则在298k获得波谱。质谱在Thermo Finnegan MAT 900XP、Micromass Quattro LC电喷射和VG70-SE质谱仪上记录。红外光谱在Shimadzu FTIR-8700光谱仪上记录。
DODEG4(13)
如先前由Dori,Y.；Bianco-Peled,H.；Satija,S.；Fields,G.B.；McCarthy,J.B.；Tirrell,M.J.Biomed Mater.Res.2000,50,75–81所报道的，从(2,3-双-十八-9-烯基氧基丙基)-二甲胺和溴化4-EG(HO-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-Br)合成{2,3-二[(Z)]-十八烷基-9-烯氧基}-丙基}-N-{2-[2-(2-{2-羟基-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-N,N-二甲基氯化铵(DODEG4)(13)(CH300)。
也可以如在US 7,598,421，实施例4中所描述的合成DODEG4(13)(CH300)。
DODEG4的类似物
可以如在US 7,598,421(特别参见实施例3、5、6和7)中所描述的，制备与DODEG4(13)(CH300)相似的盐，其具有不同的链长的R1和R2烃基基团且具有对于m不同的值(即不同的聚乙二醇链长)。例如，DODEG3可以由US 7,598,421的实施例3的规程集(protocol set)合成。
DODEG3
DOesDEG4(15)
二酯类似物DOesDEG4(15)类似于DODEG4(13)地通过(2,3-双-十七-9-烯基羧丙基)-二甲胺与溴化4-EG的季化反应制备。
叔胺(16)
如在Hurley,C.A.；Wong,J.B.；Hailes,H.C.；Tabor,A.B.J.Org.Chem.2004,69,980–983中所描述的，从十八-9-烯基甲磺酸酯和3-二甲基氨基-1,2-丙二醇制备2,3-二-((9Z)-十八烯基氧基)丙基-N,N-二甲胺(16)。
溴化4-EG(17)
如在Hurley,C.A.；Wong,J.B.；Ho,J.；Writer,M.；Irvine,S.A.；Lawrence,M.J.；Hart,S.L.；Tabor,A.B.；Hailes,H.C.Org.Biomol.Chem.2008,6,2554–2559中所描述的，制备11-溴-3,6,9-三氧十一烷-1-醇(17)。
4-EG油酰酯(20)
由在CH2Cl2中的DMAP和DIC的存在下溴化4-EG(17)与油酸的反应制备4-EG油酰酯(20)。
将在无水二氯甲烷(50mL)中的油酸(2.00mL,6.30mmol)、溴化4-EG17(1.50g,5.83mmol)和DMAP(70mg,0.58mmol)的溶液在室温搅拌持续5分钟。在冷却到0℃后，逐滴添加N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(1.20mL,7.75mmol)并且在室温搅拌混合物持续18小时。真空除去二氯甲烷，添加乙酸乙酯(60mL)，并且混合物用碳酸氢钠(2×60mL)、盐水(60mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过二氧化硅快速色谱法(EtOAc/己烷,1:4)纯化得到作为黄色油的20(1.65g,54％)。RF 0.19(EtOAc/己烷,1:4)；vmax(neat)/cm–1 2923,1736,1457；1H NMR(300MHz；CDCl3)δ0.84(t,J＝6.7Hz,3H),1.18–1.30(m,20H),1.58(m,2H),1.93–2.00(m,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),3.43(t,J＝6.3Hz,2H),3.59–3.67(m,10H),3.77(t,J＝6.3Hz,2H),4.19(t,J＝4.8Hz,2H),5.27–5.36(m,2H)；13C NMR(75MHz；CDCl3)δ14.1,22.6,24.9,27.2,29.1–29.8(信号叠加),30.4,31.9,34.0,63.3,69.2,70-4–70.6(信号叠加),71.2,129.7,130.0,173.6；m/z[HRMS ES+]实测[MNa]+543.2671。C26H49O5 79BrNa要求543.2661。
TC-DODEG4(14)
通过用4-EG油酰酯(20)将(2,3-双-十八-9-烯氧基丙基)-二甲胺(16)季化，合成三链离子化合物(9Z)-N-(2,3-双((9Z)-十八烯基氧基)丙基)-N,N-二甲基-13-氧代-3,6,9,12-四氧杂三十-21-烯-1-溴化铵(TC-DODEG4)(14)。
在90℃搅拌在密封的管中的在丙酮(2mL)中的胺(16)(0.260g,0.420mmol)和4-EG油酰酯(20)(0.240g,0.460mmol)的溶液持续48小时。真空除去丙酮。通过快速二氧化硅色谱法(CH2Cl2/MeOH，19:1)纯化得到作为淡黄色油的TC-DODEG4(14)(171mg，36％)。RF 0.40(CH2Cl2/MeOH,9:1)；vmax(neat)/cm–1 2950,2859,1740,1464；1H NMR(600MHz；CDCl3)δ0.83(t,J＝7.0Hz,9H),1.13–1.22(m,64H),1.51(m,4H),1.57(m,2H),1.92–1.97(m,12H),2.29(t,J＝7.7Hz,2H),3.38–3.51(m,14H),3.51(m,6H),3.58(m,4H),3.92–4.05(m,4H),4.08(m,1H),4.18(m,2H),5.27(m,6H)；13C NMR(150MHz；CDCl3)δ14.2,22.8,25.0,26.1,26.3,27.26,27.30,29.0,29.1–29.9(信号叠加),30.1,32.1,32.7,34.2,53.3,53.4,63.3,65.0,65.2,66.8,68.6,69.29,69.32,70.3,70.4,70.5,70.6,72.1,73.5,127.9–130.5(信号叠加),173.9；m/z[HRMS ES+]实测[M-Br]+1060.9904。C67H130NO7要求1060.9847；m/z(+ES)1061([M-Br]+,100％),980(60),931(70),843(65),306(63)。
叔胺(18)
如在Narang,A.S.；Thoma,L.；Miller,D.D.；Mahato,R.I.BioconjugateChem.2005,16,156–168中所描述的，制备(9Z)-3-(二甲氨基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(18)。
TC-DOesDEG4(19)
通过用4-EG油酰酯(20)将(2,3-双-十七-9-烯基羧丙基)-二甲胺(18)季化，合成三链离子化合物(9Z)-N,N-二甲基-N-(3-(油酰氧基)-2-((9Z)-2-氧代十八烯基氧基)丙基)-13-氧代-3,6,9,12-四氧杂三十-21-烯-1-溴化铵(TC-DOesDEG4)(19)。
在80℃搅拌在密封的管中的在丙酮(2mL)中的胺18(0.610g,0.941mmol)和4-EG油酰酯(20)(0.640g,1.22mmol)的溶液持续48小时。真空除去丙酮。通过快速二氧化硅色谱法(CH2Cl2/MeOH，19:1)纯化得到作为淡黄色油的19(118mg，11％)。RF 0.24(CH2Cl2/MeOH,19:1)；vmax(neat)/cm–1 2924,2854,1740,1465；1H NMR(500MHz；CDCl3)δ0.86(t,J＝6.8Hz,9H),1.25–1.32(m,60H),1.58(m,6H),1.99(m,12H),2.30(t,J＝7.5Hz,4H),2.34(m,2H),3.44(s,3H),3.51(s,3H),3.64–3.68(m,11H),3.82(dd,J＝13.5和10.0Hz,1H),3.94(m,2H),4.05(m,2H),4.13(m,1H),4.20(t,J＝5.0Hz,2H),4.35(d,J＝13.5Hz,1H),4.48(dd,J＝12.3和3.3Hz,1H),5.28–5.35(m,6H),5.64(m,1H)；13C NMR(125MHz；CDCl3)δ14.2,22.7,24.7,24.8,25.0,25.7,27.2,27.3,29.1–29.8,31.6,32.0,34.0,34.3,52.8,52.9,63.2,63.3,64.0,64.9,65.6,65.8,69.3,70.1,70.45,70.48,70.6,129.7–130.1(信号叠加),172.9,173.2,173.8；m/z[HRMS ES+]实测[M-Br]+1088.9382。C67H126NO9要求1088.9433；m/z(+ES)1089([M-Br]+,100％)。
TC-DOesDEG4的类似物
可以通过用3-EG油酰酯将(2,3-双-十八-9-烯氧基丙基)-二甲胺(16)和(2,3-双-十七-9-烯丙基)-二甲胺(18)分别的季化，类似地合成三链脂质TC-DODEG3和TC-DOesDEG3，其中m＝2。
脂质ME42(比较的)
如在WO 2007/138324中所描述的(参见第41页和第42页)制备(2,3-双-十八-9-烯基氧丙基)-(8-羟基-3,6-二氧辛基氧羰基丁基)-二甲基溴化铵(ME42)。
脂质FMM32(比较的)
脂质DHDTMA(106a)(比较的)
DHDTMA是基于甘油骨架的具有通过二醚连键连接的两个不饱和C16烷基链的阳离子脂质，其在Writer M,Hurley CA,Sarkar S,Copeman DM,Wong JB,等人，Analysis andoptimization of the cationic lipid component of a lipid/peptide vectorformulation for enhanced transfection in vitro and in vivo.J LiposomeRes.2006；16:373–389中被描述。
肽合成
使用标准仪器和技术合成所描述的肽(表IA)。
表IA：肽序列
肽 序列
K16 KKKKKKKKKKKKKKKK
ME27 (K)16RVRRGACRGDCLG
K16CY (K)16RVRRGACYGLPHKFCG
K16Y (K)16GACYGLPHKFCG
K16P (K)16GACLPHKSMPCG
表IB-肽质量
肽 质量(g.mol-1)
K16 2068
ME27 3467.5
K16CY 3871
K16Y 3326.8
K16P 3148.1
在SYRO自动化肽合成器上合成ME27。
线性肽序列:肽用2ml注射器以20μmol规模合成，所述注射器具有特氟龙釉料(Teflon frit)以及500μl的偶联体积。预载Fmoc-Gly的NovaSyn TGT树脂或Fmoc-Gly-2-Cl-Trt-树脂被用于这些序列。根据先前报道的程序合成了Fmoc-Peg4-COOH(参见在WO2005/117985的第82页的Fmoc-Haa4-COOH的合成，Fmoc-Haa4-COOH是在那份说明书中给与Fmoc-Peg4-COOH的名称)。将TGT树脂最初溶胀持续10分钟，然而2-Cl-Trt树脂需要在DMF中延长的最初溶胀时间(几小时)。使用四倍的过量的试剂，用HBTU(在DMF中)和DIPEA(在NMP中)进行常规偶联。用在DMF中的40％哌啶溶液切割Fmoc持续3分钟，且用20％溶液切割持续10分钟。合成循环由以下组成：40分钟的偶联时间、用40％哌啶进行Fmoc脱保护的3分钟、用20％哌啶进行Fmoc脱保护的另外10分钟和洗涤步骤。合成以及用DMF的最后洗涤循环后，使用Syro的“manual”/“empty”功能用DCM、甲醇和乙醚洗涤肽(各3次)。再持续应用抽吸一段时间以帮助蒸发乙醚。
在树脂上的二硫键形成：为了在树脂上形成二硫桥，将树脂放置在具有PE釉料的注射器中，并在DMF中溶胀。在除去过量的DMF后，添加新鲜制备的在最少的量的DMF中的碘溶液(例如，对于2ml的注射器500μl，对于树脂负载10当量碘)，并且注射器在4小时期间每4分钟涡旋持续20秒。除去试剂溶液，用DMF洗涤树脂10至20次，用DCM、甲醇和乙醚各洗涤3次。
切割和脱保护：为了切割，将注射器转移到通风橱。用95％TFA、2.5％TIS和2.5％H2O的混合液进行切割。添加最少量的新鲜制备的混合液以覆盖树脂(例如，在2ml注射器中<500μl)。4小时后，使用柱塞将切割溶液通入聚丙烯(PP)管中，并且用另外的少量的切割混合液(例如在2ml注射器中200μl)洗涤树脂。然后用乙醚沉淀肽(例如向2ml注射器的组合的级分中加入约4ml二乙醚)。将PP管在冷冻柜中保持持续至少15分钟，然后以3000rpm离心持续3分钟，并且从肽沉淀物倾倒出溶液。使用约2ml的乙醚重复两次离心和倾倒。最终，将肽溶解在水中或tBuOH/水(4:1)中并冻干。一些肽序列示出非常差的溶解性，并且有时为了获得松散的肽，用不同的溶剂混合物(水、tBuOH或乙腈)进行几次冻干/溶解过程是必要的。
将肽通过反相HPLC分析，并通过反相HPLC纯化至纯度>90％。用MicromassQuattro ES-MS(软件：Masslynx)记录质谱，并且质量被记录在表IB中。
K16CY、K16Y和K16P购自AMS Bio Ltd.,Birmingham,UK，并且使用半自动肽合成化学合成。肽通过反相HPLC分析，并且必要时通过反相HPLC纯化至85％纯度。相对分子质量在表IB中给出。
K16如前文所述购买(Hart等人，Lipid-mediated enhancement of transfectionby a nonviral integrin-targeting vector.Hum Gene Ther.,1998,9,575-585)。相对分子质量在表IB中给出。
所有这些冻干的肽以10mg/ml稀释在水中并在数月期间储存在-20℃。一旦解冻，将肽的等分试样在数周期间储存在4℃。
质粒DNA
质粒pCI-Luc(5.7kb)包含pCI(Promega，Southampton,UK)，其含有由巨细胞病毒(CMV)即刻/早期启动子-增强子驱动的荧光素酶基因。将质粒在大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中生长，并且在细菌碱性裂解后，在树脂柱(Qiagen Ltd.，Crawley,UK)上纯化。将异丙醇沉淀的DNA沉淀物用70％乙醇洗涤，然后以1mg/ml溶解在水中。
体外转染
测试的细胞包括1HAEo-人类气道上皮细胞、NIH3T3鼠成纤维细胞和Neuro2A鼠神经母细胞瘤细胞。以每孔大约2×104个细胞将细胞接种到96孔板中，然后在37℃在完全生长培养基中孵育过夜。第二天，脂质多聚物(LPD)制剂基本上如先前所描述的制备(Hart等人，1998)，通过按以下顺序混合各组分：50μl在OptiMEM中的80μg/ml的脂质(L)，70μl在OptiMEM中的110μg/ml的肽(P)以及50μl在OptiMEM中的40μg/ml的质粒pCI-Luc(D)，分别对应2:4:1的重量比率。通过短暂吸液混合所有复合物，在室温保持持续1小时，并且然后在OptiMEM中稀释至最终1.57ml的体积。在除去完全生长培养基后，将对应0.25μg的质粒DNA的二百毫升的复合物添加到每个培养孔。所有转染各自在6个孔中进行。可以进行离心(1500rpm，5分钟期间)，以促进复合物沉降和细胞接触。将细胞与复合物在37℃孵育持续4小时，然后用新鲜培养基替换持续24小时，之后通过荧光素酶测定(Promega，Madison，WI，USA)分析报告物基因表达。
除非另有说明，包含两种离子化合物例如FMM30和DOPE的混合物的阳离子脂质体以1:1的比率包含离子化合物。
用含有肽ME27和质粒pCI-Luc和以下脂质制剂之一的LPD制剂转染NIH3T3和1HAEo-细胞：
●在1:1的摩尔比率的CH300/DOPE，
●在1:1的摩尔比率的FMM30/DOPE，
●在4:1:5的摩尔比率的CH300/FMM30/DOPE，
●在1:1:2的摩尔比率的CH300/FMM30/DOPE，
●在1:1的摩尔比率的FMM32/DOPE。
作为阳性对照，将细胞用商业转染试剂Lipofectamine 2000(购自LifeTechnologies Inc.的L2K)转染。总脂质:肽:DNA比率是1:4:1、2:4:1或4:4:1。LPD制剂都通过按如上文所描述的顺序L:P:D混合制备。结果展示于图1和图2中。
用四种不同的肽ME27、K16CY、K16Y和K16P制备含有不同脂质组合的LPD制剂，并如上所述用于用pCI-Luc转染NIH3T3细胞。使用的脂质是：
●在1:1的摩尔比率的CH300/DOPE，
●在1:1的摩尔比率的FMM30/DOPE，
●在4:1:5的摩尔比率的CH300/FMM30/DOPE，
●在1:1:2的摩尔比率的CH300/FMM30/DOPE，
●在1:1的摩尔比率的FMM32/DOPE，
●在1:1的摩尔比率的106a(DHDTMA)/DOPE，以及
●在1:1的摩尔比率的DOTMA/DOPE。
商业试剂DOTAP、Lipofectin和Lipofectamine 2000(L2K)也在与肽和DNA的LPD组合中进行了比较。全部L:P:D的重量比率是2:4:1并且每个孔接受了0.25μg的pCI-Luc。结果展示于图3中。
用靶肽ME27或K16Y制备含有不同脂质ME42/DOPE(ME42)、CH300/DOPE(CH300)或FMM30/DOPE的LPD制剂，并且用于转染Neuro-2A鼠神经母细胞瘤细胞。结果展示于图4中。(注：图4中提到的肽“Y”应该更正确地指“K16Y”，因为测试的肽包括聚赖氨酸部分和GACYGLPHKFCG“Y”核心基序)。
荧光素酶和蛋白质测定
用PBS洗涤细胞一次，随后在4℃向细胞中持续20分钟添加20μl 1X报告物裂解缓冲液(Promega，Madison，WI，USA)，然后在-80℃冷冻持续至少30分钟，然后在室温解冻。然后，使用荧光素酶测定系统(Promega，Madison，WI，USA)和Optima Fluostar板阅读器(BMGLabtech)在10秒期间测量荧光素酶活性。按照制造商的说明，用Bio-Rad(Hercules，CA，USA)蛋白质测定试剂确定每种转染裂解物中存在的蛋白质量，将来自荧光素酶测试的20μl加入180μl的5分之1稀释的试剂中，并在室温孵育持续10分钟，然后将OD590与一系列BSA标准进行比较。体外荧光素酶活性作为每毫克蛋白质的相对光单位(RLU)(RLU/mg)表示。
颗粒成像
在图5中示出了LPD颗粒的透射电子显微镜图像，所述LPD颗粒包含重量比率在0.75:4:1(L:P:D)的FMM30与肽ME27，并且在图6中示出了在相同重量比率的脂质FMM30/DOPE(FMM30/DOPE-PD 0.75)。
通过使用NanoZS Zetasizer(Malvern)的动态光散射，在不同的脂质体对DNA的重量比率(w/w)，确定含有肽ME27与脂质FMM30或FMM30/DOPE的LPD纳米颗粒的尺寸。结果示出于图7中。
结果和讨论
脂质在NIH3T3和1HAEo-细胞中的体外转染效率
图1和图2示出了，在NIH3T3和1HAEo-细胞系两者中，使用含有三链离子化合物FMM30的LPD制剂的转染水平比双链脂质CH300高得多。与含有小比例的FMM30的脂质混合物的LPD制剂相比，含有高比率FMM30的脂质混合物(CH300/FMM30/DOPE)的LPD制剂也很有效。含有FMM32/DOPE的制剂给出了与CH300/DOPE制剂类似地低的转染水平。
图3示出了，对于每种肽的制剂，在含有FMM30/DOPE的LPD制剂中的产生了最高的转染水平，并且对于含有FMM30/DOPE的LPD制剂的转染水平比所有三种市售试剂以及C16脂质106a高，C16脂质106a先前被证明为对于转染是最佳的。
脂质在Neuro 2A细胞系中的体外转染效率
先前的结果已经表明，ME27/ME42对于Neuro-2A鼠神经母细胞瘤细胞是最佳的。图4中显示的结果表明，脂质FMM30/DOPE在1:4:1(L:P:D)的比率同样地有效，甚至略好。在LPD转染中，FMM30/DOPE再次显著优于亲代脂质组合CH300/DOPE。
LPD颗粒成像
图5中示出的包含在0.75:4:1(L:P:D)的重量比率的FMM30和肽ME27的纳米颗粒和图6中示出的包含在相同重量比率的脂质FMM30/DOPE的纳米颗粒两者尺寸非常相似，具有包括棒和球的形状组合。
如在图7中所示，除了0.75:4:1之外，在所有重量比中，含有FMM30/DOPE脂质的纳米颗粒小于那些含有FMM30(无DOPE)的纳米颗粒，其中两种颗粒在大约80nm处最小。

Claims (16)

1.一种式(Ia)的离子化合物：
其中：
●X和Y的每一个相同或不同并且选自-O-和-O-C(O)-，其中羰基碳与基团R1或R2键合；
●R1和R2相同或不同并且各自独立地选自C12-24烃基基团，所述C12-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团；
●R3和R4相同或不同并且各自独立地选自C1-10烃基基团，所述C1-10烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素、-OR'、-C(O)OH、-CN、-N(R')2和-C(O)R'的一个或更多个取代基取代，其中每个R’相同或不同并且是C1-6烃基基团；
●Sp和W一起是一个键；或
●Sp是C1-8亚烷基基团，所述C1-8亚烷基基团未被取代或被选自羟基、卤素和OR'的一个或更多个取代基取代，其中R’是C1-6烃基基团；并且W选自键、-O-C(O)-、-C(O)-O-和-O-；
●每个B相同或不同并且是C1-6亚烷基基团，所述C1-6亚烷基基团未被取代或被选自羟基、卤素、-ORA、-NRARA和-OC(O)RA的一个或更多个取代基取代；
其中每个RA独立地选自C1-4烃基；
●m是从1到8的整数；并且
●Q选自-OR5和-O-C(O)-R5，其中R5选自C12-24烃基基团，所述C12-24烃基基团未被取代或被选自羟基、卤素和ORA的一个或更多个取代基取代，其中RA是C1-6烃基基团。
2.如权利要求1所述的离子化合物，其中R1和R2相同或不同并且各自独立地是具有一个或更多个双键的C14-22烃基基团。
3.如任一前述权利要求所述的离子化合物，其中Sp和W都是键，或者Sp是未被取代的C1-8亚烷基基团并且W是键、-C(O)-O-或–O-。
4.如任一前述权利要求所述的离子化合物，其中R3和R4可以相同或不同并且各自是直链的或支链的、未被取代的C1-4烷基基团。
5.如任一前述权利要求所述的离子化合物，其中每个B选自未被取代的C1-3亚烷基基团。
6.如任一前述权利要求所述的离子化合物，其中m是1、2、3、4、5或6。
7.权利要求1所述的离子化合物，其中R1和R2相同或不同，并且各自独立地是具有一个双键的C14-22烃基基团；Sp和W两者都是键；R3和R4各自是直链的或支链的、未被取代的C1-4烷基基团；每个B选自未被取代的C1-3亚烷基基团；m是2、3、4、5或6；并且Q选自-OR5和-O-C(O)-R5并且R5是具有一个双键的C14-22烃基基团。
8.权利要求1所述的离子化合物，所述离子化合物包含式(Id)的阳离子：
其中：
●X-R1和Y-R2和Q的每一个选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3；并且
m是从2到5的整数。
9.如任一前述权利要求所述的离子化合物，其中X-R1和Y-R2的每一个相同并且选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3，Q选自-O-(CH2)8CH[Z]＝CH(CH2)7CH3和-O-C(O)-(CH2)7CH[Z]＝CH(CH2)7CH3，并且m是3或4。
10.一种非病毒转染复合物，所述复合物包含(i)如权利要求1至9中任一项所定义的离子化合物。
11.如权利要求10所述的非病毒转染复合物，所述非病毒转染复合物还包含(ii)聚阳离子性核酸结合组分，(iii)细胞表面受体结合组分，以及任选地，(iv)核酸。
12.一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上合适的载剂混合或联合的权利要求10或权利要求11中所述的转染复合物。
13.一种用于由在基因中的缺陷和/或缺乏在人类或非人类动物中引起的状况的治疗或预防、或用于治疗性或预防性免疫、或用于反义或RNAi疗法、或用于癌症的治疗的方法，所述方法包括向人类或非人类动物施用权利要求10或权利要求11中所述的转染复合物。
14.如权利要求10或权利要求11中所述的转染复合物，用于作为药物，例如作为疫苗使用。
15.如权利要求10或权利要求10中所述的转染复合物，用于在由在基因中的缺陷和/或缺乏在人类或非人类动物中引起的状况的治疗或预防、或用于治疗性或预防性免疫、或用于反义或RNAi疗法、或用于癌症的治疗中使用。
16.如权利要求10或权利要求11中所述的转染复合物在药物生产中的用途，所述药物用于由在基因中的缺陷和/或缺乏在人类或非人类动物中引起的状况的治疗或预防、或用于治疗性或预防性免疫、或用于反义或RNAi疗法、或用于癌症的治疗。
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