TW202028170A - 可離子化胺脂質 - Google Patents

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露比娜 吉爾 帕爾瑪爾
史戴分 Ｓ 史考利
米卡 馬它尼
德瑞克 拉帕卡
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美商英特利亞醫療公司
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Abstract

本揭示案提供可用於遞送生物活性劑、例如遞送生物活性劑至細胞以製備經工程改造之細胞的可離子化胺脂質及其鹽(例如，其醫藥學上可接受之鹽)。本文揭示之該等可離子化胺脂質可用作基於脂質奈米粒子之組合物之調配中的可離子化脂質。

Description

可離子化胺脂質
與可離子化含胺脂質一起調配之脂質奈米粒子可用作貨品子媒劑，用於將生物活性劑，尤其多核苷酸，諸如RNA、mRNA及嚮導RNA遞送至細胞中。含有可離子化脂質之LNP組合物可促進寡核苷酸劑跨越細胞膜遞送，且可用於將基因編輯用組分及組合物引入活細胞中。尤其難以遞送至細胞之生物活性劑包括蛋白質、基於核酸之藥物及其衍生物，尤其包括相對較大寡核苷酸、諸如mRNA之藥物。用於遞送有前景之基因編輯技術至細胞中、諸如遞送CRISPR/Cas9系統組分的組合物尤其令人感興趣(例如，編碼核酸酶之mRNA及相關嚮導RNA (gRNA))。
需要用於遞送CRISPR/Cas之蛋白質及核酸組分至細胞、諸如患者之細胞的組合物。具體而言，用於遞送編碼CRISPR蛋白質組分之mRNA及用於遞送CRISPR嚮導RNA之組合物尤其令人感興趣。具有活體外及活體內遞送之有用性質且可穩定且遞送RNA組分之組合物亦尤其令人感興趣。
本揭示案提供可用於調配脂質奈米粒子(LNP)組合物之含胺脂質。該等LNP組合物可具有有利於遞送核酸貨品子、諸如CRISPR/Cas基因編輯組分至細胞之性質。
在某些實施例中，本發明係關於式I化合物
Figure 02_image001
(I)， 其中，在每次出現時獨立地， X1 係C5-11 伸烷基， Y1 係C3-11 伸烷基， Y2 係
Figure 02_image004
或
Figure 02_image006
，其中a1 係與Y1 之鍵，且a2 係與R1 之鍵， Z1 係C2-4 伸烷基， Z2 係選自-OH、-NH2 、-OC(=O)R3 、-OC(=O)NHR3 、-NHC(=O)NHR3 及-NHS(=O)2 R3 ， R1 係C4-12 烷基或C3-12 烯基， 各R2 獨立地係C4-12 烷基，且 R3 係C1-3 烷基， 或其鹽。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中該鹽係醫藥學上可接受之鹽。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中X1 係直鏈C5-11 伸烷基，例如，直鏈C6-10 伸烷基，較佳地直鏈C7 伸烷基或直鏈C9 伸烷基。在某些實施例中，X1 係直鏈C8 伸烷基。在某些實施例中，X1 係直鏈C6 伸烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Y1 係直鏈C4-9 伸烷基，例如，Y1 係直鏈C5-9 伸烷基或直鏈C6-8 伸烷基，較佳地Y1 係直鏈C7 伸烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Y2 係
Figure 02_image004
。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中R1 係C4-12 烯基，諸如C9 烯基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Y1 、Y2 及R1 經選擇以形成16-21個原子、較佳地16-18個原子之直鏈。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Z1 係直鏈C2-4 伸烷基，較佳地Z1 係C2 伸烷基或C3 伸烷基。
在某些實施例中，Z2 係-OH。在一些實施例中，Z2 係-NH2 。在某些實施例中，Z2 係選自-OC(=O)R3 、-OC(=O)NHR3 、-NHC(=O)NHR3 及-NHS(=O)2 R3 ，例如，Z2 係-OC(=O)R3 或-OC(=O)NHR3 。在一些實施例中，Z2 係-NHC(=O)NHR3 或-NHS(=O)2 R3 。
在某些實施例中，R3 係甲基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中R1 係直鏈C4-12 烷基，例如，R1 係直鏈C6-11 烷基，諸如直鏈C8-10 烷基，較佳地R1 係直鏈C9 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中R1 係支鏈C6-12 烷基，例如，R1 係支鏈C7-11 烷基，諸如支鏈C8 烷基、支鏈C9 烷基或支鏈C10 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 獨立地係C5-12 烷基，諸如直鏈C5-12 烷基。在一些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 獨立地係直鏈C6-10 烷基，例如直鏈C6-8 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 獨立地係支鏈C5-12 烷基。在一些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 獨立地係支鏈C6-10 烷基，例如支鏈C7-9 烷基，諸如支鏈C8 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中X1 及R2 部分之一經選擇以形成16-18個原子、包括縮醛之碳原子及氧原子的直鏈。
在某些實施例中，本發明係關於式II化合物
Figure 02_image008
(II) 其中，在每次出現時獨立地， X1 係C5-11 伸烷基， Y1 係C3-10 伸烷基， Y2 係
Figure 02_image004
或
Figure 02_image006
，其中a1 係與Y1 之鍵，且a2 係與R1 之鍵， Z1 係C2-4 伸烷基， R1 係C4-12 烷基或C3-12 烯基， 各R2 獨立地係C4-12 烷基， 或其鹽。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中該鹽係醫藥學上可接受之鹽。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中X1 係直鏈C5-11 伸烷基，例如，直鏈C6-8 伸烷基，較佳地直鏈C7 伸烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Y1 係直鏈C5-9 伸烷基，例如，Y1 係C4-9 伸烷基或直鏈C6-8 伸烷基，較佳地Y1 係直鏈C7 伸烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Y2 係
Figure 02_image004
。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中R1 係C4-12 烯基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Y1 、Y2 及R1 經選擇以形成16-21個原子、較佳地16-18個原子之直鏈。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Z1 係直鏈C2-4 伸烷基，較佳地Z1 係C2 伸烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中R1 係直鏈C4-12 烷基，例如，R1 係直鏈C8-10 烷基，較佳地R1 係直鏈C9 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 係C5-12 烷基，諸如直鏈C5-12 烷基。在一些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 係直鏈C6-10 烷基，例如直鏈C6-8 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中X1 及R2 部分之一經選擇以形成16-18個原子、包括縮醛之碳原子及氧原子的直鏈。
在某些實施例中，本發明係關於選自以下之化合物：
Figure 02_image010
、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
  
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
  
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、		  
  
Figure 02_image098
及		  
  
Figure 02_image100
，
或其鹽，較佳地醫藥學上可接受之鹽。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中化合物之質子化形式的pKa為約5.1至約8.0，例如約5.7至約6.5、約5.7至約6.4或約5.8至約6.2。在一些實施例中，化合物之質子化形式的pKa為約5.5至約6.0。在某些實施例中，化合物之質子化形式的pKa為約6.1至約6.3。
在某些實施例中，本發明係關於一種組合物，其包含本文所述之任何化合物及脂質組分，例如包含約50%之前述申請專利範圍中任一項之化合物及脂質組分，例如，胺脂質，較佳地式(I)或式(II)化合物。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何組合物，其中該組合物係LNP組合物。舉例而言，本發明係關於包含本文所述之任何化合物及脂質組分的LNP組合物。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中脂質組分包含輔助脂質及PEG脂質。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中脂質組分包含輔助脂質、PEG脂質及中性脂質。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，該LNP組合物進一步包含低溫保護劑。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，該LNP組合物進一步包含緩衝液。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，該LNP組合物進一步包含核酸組分。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，該LNP組合物進一步包含RNA或DNA組分。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中LNP組合物之N/P比率為約3-10，例如N/P比率為約6 ± 1，或N/P比率為約6 ± 0.5。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中LNP組合物之N/P比率為約6。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中RNA組分包含mRNA。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中RNA組分包含RNA導嚮之DNA結合劑，例如Cas核酸酶mRNA，諸如2類Cas核酸酶mRNA或Cas9核酸酶mRNA。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中mRNA係經修飾之mRNA。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中RNA組分包含gRNA核酸。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中gRNA核酸係gRNA。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之LNP組合物，其中RNA組分包含2類Cas核酸酶mRNA及gRNA。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中gRNA核酸係或編碼雙重嚮導RNA (dgRNA)。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中gRNA核酸係或編碼單一嚮導RNA (sgRNA)。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中gRNA係經修飾之gRNA。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中經修飾之gRNA包含在5’端的前五個核苷酸中之一或多者處的修飾。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，其中經修飾之gRNA包含在3’端的後五個核苷酸中之一或多者處的修飾。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何LNP組合物，該LNP組合物進一步包含至少一種模板核酸。
在某些實施例中，本發明係關於一種基因編輯之方法，該方法包括使細胞與LNP接觸。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之基因編輯之任何方法，該方法包括裂解DNA。
在某些實施例中，本發明係關於一種裂解DNA之方法，該方法包括使細胞與LNP組合物接觸。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之裂解DNA之任何方法，其中裂解步驟包括引入單股DNA切口。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之裂解DNA之任何方法，其中裂解步驟包括引入雙股DNA斷裂。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之裂解DNA之任何方法，其中LNP組合物包含2類Cas mRNA及嚮導RNA核酸。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之裂解DNA之任何方法，該方法進一步包括向細胞中引入至少一種模板核酸。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之裂解DNA之任何方法，該方法包括使細胞與包含模板核酸之LNP組合物接觸。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之基因編輯之任何方法，其中該方法包括向動物，例如人類投與LNP組合物。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之基因編輯之任何方法，其中該方法包括向細胞，諸如真核細胞投與LNP組合物。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之基因編輯之任何方法，其中該方法包括投與調配於第一LNP組合物及第二LNP組合物中之mRNA，該第一LNP組合物及該第二LNP組合物包含mRNA、gRNA、gRNA核酸及模板核酸中之一或多者。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之基因編輯之任何方法，其中第一LNP組合物及第二LNP組合物同時投與。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之基因編輯之任何方法，其中第一LNP組合物及第二LNP組合物依序投與。在某些實施例中，本發明係關於本文所述之基因編輯之任何方法，其中該方法包括投與調配於單一LNP組合物中之mRNA及嚮導RNA核酸。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之基因編輯之任何方法，其中基因編輯引起基因剔除。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之基因編輯之任何方法，其中基因編輯引起基因修正。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2018年10月2日提出申請之美國臨時專利申請案第62/740274號之優先權，該案之全部內容以引用方式併入本文中。
本揭示案提供可用於遞送生物活性劑(包括核酸，諸如CRISPR/Cas組分RNA (「貨品子」))至細胞之脂質、尤其可離子化脂質，及製備及使用該等組合物之方法。脂質及其醫藥學上可接受之鹽視情況呈包含脂質之組合物、包括LNP組合物的形式提供。在某些實施例中，LNP組合物可包含生物活性劑，例如RNA組分，及包括如本文所定義之式(I)或式(II)化合物的脂質組分。在某些實施例中，RNA組分包括RNA。在一些實施例中，RNA組分包含核酸。在一些實施例中，脂質用於遞送生物活性劑(例如核酸，諸如mRNA)至細胞(諸如肝細胞)。在某些實施例中，RNA組分包括gRNA及視情況存在之編碼2類Cas核酸酶之mRNA。亦提供基因編輯之方法及使用此等組合物製備經工程改造之細胞之方法。 脂質奈米粒子組合物
本文揭示用於遞送生物活性劑(諸如核酸，例如mRNA及嚮導RNA，包括CRISPR/Cas貨品子)之各種LNP組合物。該等LNP組合物包括「可離子化胺脂質」，以及中性脂質、PEG脂質及輔助脂質。「脂質奈米粒子」或「LNP」係指但不限於意指，包含複數種(亦即，超過一種)藉由分子間力彼此物理締合之LNP組分的粒子。 脂質
本揭示案提供可用於LNP組合物中之脂質。
在某些實施例中，本發明係關於式I化合物
Figure 02_image001
(I) 其中，在每次出現時獨立地， X1 係C5-11 伸烷基， Y1 係C3-11 伸烷基， Y2 係
Figure 02_image004
或
Figure 02_image006
，其中a1 係與Y1 之鍵，且a2 係與R1 之鍵， Z1 係C2-4 伸烷基， Z2 係選自-OH、-NH2 、-OC(=O)R3 、-OC(=O)NHR3 、-NHC(=O)NHR3 及-NHS(=O)2 R3 ， R1 係C4-12 烷基或C3-12 烯基， 各R2 獨立地係C4-12 烷基，且 R3 係C1-3 烷基， 或其鹽。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中該鹽係醫藥學上可接受之鹽。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中X1 係直鏈C5-11 伸烷基，例如，直鏈C6-10 伸烷基，較佳地直鏈C7 伸烷基或直鏈C9 伸烷基。在某些實施例中，X1 係直鏈C8 伸烷基。在某些實施例中，X1 係直鏈C6 伸烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Y1 係直鏈C4-9 伸烷基，例如，Y1 係直鏈C5-9 伸烷基或直鏈C6-8 伸烷基，較佳地Y1 係直鏈C7 伸烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Y2 係
Figure 02_image004
。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中R1 係C4-12 烯基，諸如C9 烯基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Y1 、Y2 及R1 經選擇以形成16-21個原子、較佳地16-18個原子之直鏈。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中Z1 係直鏈C2-4 伸烷基，較佳地Z1 係C2 伸烷基或C3 伸烷基。
在某些實施例中，Z2 係-OH。在一些實施例中，Z2 係-NH2 。在某些實施例中，Z2 係選自-OC(=O)R3 、-OC(=O)NHR3 、-NHC(=O)NHR3 及-NHS(=O)2 R3 ，例如，Z2 係-OC(=O)R3 或-OC(=O)NHR3 。在一些實施例中，Z2 係-NHC(=O)NHR3 或-NHS(=O)2 R3 。
在某些實施例中，R3 係甲基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中R1 係直鏈C4-12 烷基，例如，R1 係直鏈C6-11 烷基，諸如直鏈C8-10 烷基，較佳地R1 係直鏈C9 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中R1 係支鏈C6-12 烷基，例如，R1 係支鏈C7-11 烷基，諸如支鏈C8 烷基、支鏈C9 烷基或支鏈C10 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 獨立地係C5-12 烷基，諸如直鏈C5-12 烷基。在一些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 獨立地係直鏈C6-10 烷基，例如直鏈C6-8 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 獨立地係支鏈C5-12 烷基。在一些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中各R2 獨立地係支鏈C6-10 烷基，例如支鏈C7-9 烷基，諸如支鏈C8 烷基。
在某些實施例中，本發明係關於本文所述之任何化合物，其中X1 及R2 部分之一經選擇以形成16-18個原子、包括縮醛之碳原子及氧原子的直鏈。
在某些實施例中，脂質係具有式(II)之結構之化合物：
Figure 02_image008
(II) 其中，在每次出現時獨立地， X1 係C5-11 伸烷基； Y1 係C3-10 伸烷基； Y2 係
Figure 02_image004
或
Figure 02_image006
，其中a1 係與Y1 之鍵，且a2 係與R1 之鍵； Z1 係C2-4 伸烷基； R1 係C4-12 烷基或C3-12 烯基；且 各R2 獨立地係C4-12 烷基， 或其鹽，諸如其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，X1 係直鏈C5-11 伸烷基，較佳地直鏈C6-8 伸烷基，更佳地C7 伸烷基。
在某些實施例中，Y1 係直鏈C5-9 伸烷基，例如直鏈C6-8 伸烷基或直鏈C4-9 伸烷基，較佳地直鏈C7 伸烷基。
在某些實施例中，Y2 係
Figure 02_image004
。
在一些實施例中，R1 係C4-12 烷基，較佳地直鏈C8-10 烷基，更佳地直鏈C9 烷基。在一些實施例中，R1 係C4-12 烯基。
在某些實施例中，Z1 係直鏈C2-4 伸烷基，較佳地C2 伸烷基。
在某些實施例中，R2 係直鏈C5-12 烷基，例如直鏈C6-10 烷基，諸如直鏈C6-8 烷基。
代表性式(I)化合物包括：
Figure 02_image010
、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
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、		  
  
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、
  
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、		  
  
Figure 02_image098
及		  
  
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。
 
在某些實施例中，在投與後8小時、10小時、12小時、24小時或48小時或3天、4天、5天、6天、7天或10天內自個體之血漿清除如本文揭示之調配之脂質組合物的至少75%之式(I)或式(II)化合物。在某些實施例中，在投與後8小時、10小時、12小時、24小時或48小時或3天、4天、5天、6天、7天或10天內自個體之血漿清除如本文揭示之包含式(I)或式(II)化合物之脂質組合物的至少50%，此可例如藉由量測血漿中之脂質(例如式(I)或式(II)化合物)、RNA (例如mRNA)或其他組分來測定。在某些實施例中，量測脂質組合物之脂質囊封對游離脂質、RNA或核酸組分。
可如文獻中所述量測脂質清除率。參見Maier, M.A.等人Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics.Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 (「Maier 」)。舉例而言，在Maier 中，向六至八週齡之雄性C57Bl/6小鼠經由外側尾靜脈藉由靜脈內濃注注射投與0.3 mg/kg之含有靶向螢光素酶之siRNA的LNP-siRNA系統。在投藥後0.083小時、0.25小時、0.5小時、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時、96小時及168小時收集血液、肝及脾樣品。在組織收集之前用鹽水灌注小鼠且處理血液樣品以獲得血漿。所有樣品皆經處理且藉由LC-MS分析。此外，Maier 闡述用於評估投與LNP-siRNA組合物後之毒性之程序。舉例而言，經由單次靜脈內濃注注射以5 mL/kg之劑量體積向雄性Sprague-Dawley大鼠以0、1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg及10 mg/kg (5隻動物/組)投與靶向螢光素酶之siRNA。24小時後，自有意識動物之頸靜脈獲得約1 mL血液，且分離血清。在投藥後72小時，對所有動物進行安樂死以驗屍。評估臨床體征、體重、血清化學、器官重量及組織病理學。儘管Maier 闡述用於評估siRNA-LNP組合物之方法，但該等方法可應用於評估投與本揭示案之脂質組合物(諸如LNP組合物)之清除率、藥物動力學及毒性。
在某些實施例中，使用本文揭示之式(I)或式(II)化合物的脂質組合物展現相對於替代可離子化胺脂質增加之清除率。在一些該等實施例中，清除率係脂質清除率，例如式(I)或式(II)化合物自血液、血清或血漿清除之速率。在一些實施例中，清除率係貨品子(例如生物活性劑)清除率，例如貨品子組分自血液、血清或血漿清除之速率。在一些實施例中，清除率係RNA清除率，例如mRNA或gRNA自血液、血清或血漿清除之速率。在一些實施例中，清除率係LNP自血液、血清或血漿清除之速率。在一些實施例中，清除率係LNP自組織(諸如肝組織或脾組織)清除之速率。期望地，高清除率可產生無實質不良影響及/或在循環及/或組織中LNP累積減少的安全性概況。
本揭示案之式(I)或式(II)化合物視其所處於之介質之pH值而定可形成鹽。舉例而言，在略微酸性介質中，式(I)或式(II)化合物可質子化且因此帶正電。相反，在略微鹼性介質(諸如，pH值約為7.35之血液)中，式(I)或式(II)化合物可未質子化，且因此不帶電荷。在一些實施例中，本揭示案之式(I)或式(II)化合物可在至少約9之pH值下大部分質子化。在一些實施例中，本揭示案之式(I)或式(II)化合物可在至少約10之pH值下大部分質子化。
式(I)或式(II)化合物大部分質子化之pH值與其固有pKa有關。在較佳實施例中，本揭示案之式(I)或式(II)化合物之鹽的pKa在約5.1至約8.0、甚至更佳約5.5至約7.5、例如約6.1至約6.3的範圍內。在較佳其他實施例中，本揭示案之式(I)化合物之鹽的pKa在約5.3至約8.0、例如約5.7至約6.5的範圍內。在其他實施例中，本揭示案之式(I)或式(II)化合物之鹽的pKa在約5.7至約6.4、例如約5.8至約6.2的範圍內。在其他較佳實施例中，本揭示案之式(I)化合物之鹽的pKa在約5.7至約6.5、例如約5.8至約6.4的範圍內。或者，本揭示案之式(I)或式(II)化合物之鹽的pKa在約5.8至約6.5的範圍內。在一些實施例中，質子化形式之式(I)或式(II)化合物的pKa為約5.5至約6.0。本揭示案之式(I)或式(II)化合物之鹽的pKa可在約6.0至約8.0、較佳地約6.0至約7.5的範圍內。式(I)或式(II)化合物之鹽的pKa可為調配LNP中的重要考慮因素，此乃因已發現，與pKa在約5.5至約7.0範圍內之某些脂質一起調配之LNP有效活體內遞送貨品子至例如肝。此外，已發現，與pKa在約5.3至約6.4範圍內之某些脂質一起調配之LNP有效活體內遞送至例如腫瘤。參見例如WO 2014/136086。 額外脂質
適用於本揭示案之脂質組合物中之「中性脂質」包括例如多種中性、不帶電或兩性離子脂質。適用於本揭示案中之中性磷脂的實例包括(但不限於)二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DAPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉豆蔻醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-棕櫚醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(PMPC)、1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼(PSPC)、1,2-二花生醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(SPPC)、1,2-二(二十烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)、棕櫚醯基油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二亞麻油醯基磷脂醯膽鹼二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺及其組合。在某些實施例中，中性磷脂可選自二硬脂醯基磷酯醯膽鹼(DSPC)及二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)，較佳地二硬脂醯基磷酯醯膽鹼(DSPC)。
「輔助脂質」包括類固醇、固醇及烷基間苯二酚。適用於本揭示案中之輔助脂質包括(但不限於)膽固醇、5-十七烷基間苯二酚及膽固醇半琥珀酸酯。在某些實施例中，輔助脂質可為膽固醇或其衍生物，諸如膽固醇半琥珀酸酯。
PEG脂質可影響奈米粒子可於活體內(例如在血液中)存在之時間長度。PEG脂質可藉由例如減少粒子聚集及控制粒徑有助於調配過程。本文所用PEG脂質可調節LNP之藥物動力學性質。通常，PEG脂質包含脂質部分及基於PEG之聚合物部分(有時稱為聚(氧化乙烯)) (PEG部分)。適用於具有本揭示案之式(I)或式(II)化合物之脂質組合物的PEG脂質及關於該等脂質之生物化學的資訊可參見Romberg等人, Pharmaceutical Research 25(1), 2008, 第55-71頁，及Hoekstra等人, Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52。額外適宜PEG脂質揭示於例如WO 2015/095340 (第31頁第14行至第37頁第6行)、WO 2006/007712及WO 2011/076807 (「隱秘脂質」)。
在一些實施例中，脂質部分可源自二醯基甘油或二醯基咪唑雙醯胺，包括包含具有獨立地包含約C4至約C40飽和或不飽和碳原子之烷基鏈長度的二烷基甘油或二烷基咪唑雙醯胺基團之彼等二醯基甘油或二醯基咪唑雙醯胺，其中鏈可包含一或多個官能基，例如醯胺或酯。在一些實施例中，烷基鏈長度包含約C10至C20。二烷基甘油或二烷基咪唑雙醯胺基團可進一步包含一或多個經取代之烷基。鏈長度可為對稱的或不對稱的。
除非另外指示，否則如本文所用術語「PEG」意指任何聚乙二醇或其他伸烷基醚聚合物，諸如乙二醇或環氧乙烷之視情況地經取代之直鏈或支鏈聚合物。在某些實施例中，PEG部分未經取代。或者，PEG部分可經例如一或多個烷基、烷氧基、醯基、羥基或芳基取代。舉例而言，PEG部分可包含PEG共聚物，諸如PEG-聚胺基甲酸酯或PEG-聚丙烯(例如，參見J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992))；或者，PEG部分可為PEG均聚物。在某些實施例中，PEG部分之分子量為約130至約50,000，諸如約150至約30,000或甚至約150至約20,000。類似地，PEG部分之分子量可為約150至約15,000、約150至約10,000、約150至約6,000或甚至約150至約5,000。在某些較佳實施例中，PEG部分之分子量為約150至約4,000、約150至約3,000、約300至約3,000、約1,000至約3,000或約1,500至約2,500。
在某些較佳實施例中，PEG部分係「PEG-2K」，亦稱為「PEG 2000」，其平均分子量為約2,000道爾頓。PEG-2K在本文中由下式(II)表示，其中n為45，此意味著數量平均聚合度包含約45個子單元
Figure 02_image134
(II)。然而，可使用業內已知之其他PEG實施例，包括例如數量平均聚合度包含約23個子單元(n = 23)及/或68個子單元(n = 68)之彼等PEG實施例。在一些實施例中，n可在約30至約60之範圍內。在一些實施例中，n可在約35至約55之範圍內。在一些實施例中，n可在約40至約50之範圍內。在一些實施例中，n可在約42至約48之範圍內。在一些實施例中，n可為45。在一些實施例中，R可選自H、經取代之烷基及未經取代之烷基。在一些實施例中，R可為未經取代之烷基，諸如甲基。
在本文所述實施例中之任一者中，PEG脂質可選自PEG-二月桂醯基甘油、PEG-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-DMG) (目錄號GM-020，來自NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二棕櫚醯基甘油、PEG-二硬脂醯基甘油(PEG-DSPE) (目錄號DSPE-020CN，NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二月桂基咪唑雙醯胺、PEG-二肉豆蔻基咪唑雙醯胺、PEG-二棕櫚醯基咪唑雙醯胺及PEG-二硬脂醯基咪唑雙醯胺、PEG-膽固醇(1-[8'-(膽固-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛烷基]胺甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB (3,4-二-十四氧基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DMG)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSPE) (目錄號880120C，來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020, NOF Tokyo, Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)及1,2-二硬脂醯基氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSA)。在某些該等實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DMG。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DSG。在其他實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DSPE。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DMA。在其他實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C-DMA。在某些實施例中，PEG脂質可為WO2016/010840 (第[00240]段至第[00244]段)中所揭示之化合物S027。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DSA。在其他實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C11。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C14。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C16。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C18。
適用於本發明之脂質組合物中的陽離子脂質包括(但不限於)氯化N,N-二油醇基-N,N-二甲基銨(DODAC)、溴化N,N-二硬脂醯基-N,N-二甲基銨(DDAB)、氯化N-(1-(2,3-二油醯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTAP)、1,2-二油醯基-3-二甲基銨-丙烷(DODAP)、氯化N-(1-(2,3-二油醇氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)、1,2-二油醯基胺甲醯基-3-二甲基銨-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亞麻油醯氧基-3-二甲基銨-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲基銨丙烷(DLTAP)、二-十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、DC-Choi、三氟乙酸二油醯基氧基-N-[2-(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨(DOSPA)、溴化1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羥基乙基銨(DMRIE)、3-二甲基胺基-2-(膽固-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、N,N-二甲基-2,3-二油醇氧基)丙胺(DODMA)、2-[5'-(膽固-5-烯-3[β]-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9',1-2'-十八二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油醇氧基苄基胺(DMOBA)及1,2-N,N'-二油醇基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)。在一個實施例中，陽離子脂質係DOTAP或DLTAP。
適用於本發明之陰離子脂質包括(但不限於)磷脂醯基甘油、心磷脂、二醯基磷酯醯絲胺酸、二醯基磷脂酸、N-十二烷醯基磷脂醯乙醇胺、N-琥珀醯基磷脂醯乙醇胺、N-戊二醯基磷脂醯乙醇胺膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS)及離胺醯基磷脂醯基甘油。 脂質組合物
本發明提供一種脂質組合物，該脂質組合物包含至少一種式(I)或式(II)化合物或其鹽(例如，其醫藥學上可接受之鹽)及至少一種其他脂質組分。該等組合物亦可含有生物活性劑，視情況與一或多種其他脂質組分組合。在一些實施例中，脂質組合物包含脂質組分及包含生物活性劑之水性組分。
在一個實施例中，脂質組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種其他脂質組分。在另一實施例中，脂質組合物進一步包含生物活性劑，視情況與一或多種其他脂質組分組合。在另一實施例中，脂質組合物係呈脂質體形式。在另一實施例中，脂質組合物係呈脂質奈米粒子(LNP)形式。在另一實施例中，脂質組合物適於遞送至肝。
在一個實施例中，脂質組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽及另一脂質組分。該等其他脂質組分包括(但不限於)中性脂質、輔助脂質、PEG脂質、陽離子脂質及陰離子脂質。在某些實施例中，脂質組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及中性脂質，例如DSPC，視情況具有一或多種額外脂質組分。在另一實施例中，脂質組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及輔助脂質，例如膽固醇，視情況具有一或多種額外脂質組分。在其他實施例中，脂質組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及PEG脂質，視情況具有一或多種額外脂質組分。在其他實施例中，脂質組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及陽離子脂質，視情況具有一或多種額外脂質組分。在其他實施例中，脂質組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及陰離子脂質，視情況具有一或多種額外脂質組分。在子實施例中，脂質組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、輔助脂質及PEG脂質，視情況具有中性脂質。在又一子實施例中，脂質組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、輔助脂質、PEG脂質及中性脂質。
含有式(I)或式(II)之脂質或其醫藥學上可接受之鹽的組合物或其脂質組合物可呈各種形式，包括但不限於形成遞送劑之粒子，該等遞送劑包括可用於遞送各種分子至細胞之微米粒子、奈米粒子及轉染劑。特定組合物可有效轉染或遞送生物活性劑。較佳生物活性劑係RNA及DNA。在其他實施例中，生物活性劑係選自mRNA、gRNA及DNA。在某些實施例中，貨品子包括編碼RNA導嚮之DNA結合劑(例如Cas核酸酶、2類Cas核酸酶或Cas9)之mRNA，及gRNA或編碼gRNA之核酸，或mRNA與gRNA之組合。
實例中給出用於上述脂質組合物之示例性式(I)化合物。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物1。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物2。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物3。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物4。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物5。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物6。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物7。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物8。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物9。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物10。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物11。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物12。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物13。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物14。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物15。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物16。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物17。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物20。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物21。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物22。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物23。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物24。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物25。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物27。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物28。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物29。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物30。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物31。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物32。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物33。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物34。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物35。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物36。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物37。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物38。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物39。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物40。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物41。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物42。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物43。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物44。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物45。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物46。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物47。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物48。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物49。在某些實施例中，該式(I)化合物係化合物50。在某些實施例中，該化合物係選自表1中之化合物的化合物，前提係該化合物不為化合物18、化合物19或化合物26。 LNP組合物
脂質組合物可呈LNP組合物形式提供。脂質奈米粒子可為例如微球體(包括單層及多層囊泡，例如「脂質體」—層狀相脂質雙層，在一些實施例中其實質上為球形，且在更特定實施例中可包含水性核，例如包含很大一部分RNA分子)、於乳液中之分散相、膠束或懸浮液中之內相。
LNP之大小為約1至約1,000 nm、約10至約500 nm、約20至約500 nm，在子實施例中約50至約400 nm，在子實施例中約50至約300 nm，在子實施例中約50至約200 nm，且在子實施例中約50至約150 nm，且在另一子實施例中約60至約120 nm。較佳地，LNP之大小為約60 nm至約100 nm。完全形成之LNP之平均大小(直徑)可藉由Malvern Zetasizer上之動態光散射來量測。將LNP樣品於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋，使得計數率為約200-400 kcps。數據表示為強度量測值之加權平均值。
本揭示案之實施例提供根據組合物中組分脂質之各別莫耳比闡述之脂質組合物。所有mol-%數皆隨LNP組合物或特別是LNP組合物之脂質組分變化給出。在某些實施例中，式(I)或式(II)化合物之mol-%可為約30 mol-%至約70 mol-%。在某些實施例中，式(I)或式(II)化合物之mol-%可為至少30 mol-%、至少40 mol-%、至少50 mol-%或至少60 mol-%。
在某些實施例中，中性脂質之mol-%可為約0 mol-%至約30 mol-%。在某些實施例中，中性脂質之mol-%可為約0 mol-%至約20 mol-%。在某些實施例中，中性脂質之mol-%可為約9 mol-%。
在某些實施例中，輔助脂質之mol-%可為約0 mol-%至約80 mol-%。在某些實施例中，輔助脂質之mol-%可為約20 mol-%至約60 mol-%。在某些實施例中，輔助脂質之mol-%可為約30 mol-%至約50 mol-%。在某些實施例中，輔助脂質之mol-%可為30 mol-%至約40 mol-%或約35% mol-%至約45 mol-%。在某些實施例中，基於式(I)或式(II)化合物、中性脂質及/或PEG脂質濃度調節輔助脂質之mol-%以使脂質組分達到100 mol-%。
在某些實施例中，PEG脂質之mol-%可為約1 mol-%至約10 mol-%。在某些實施例中，PEG脂質之mol-%可為約1 mol-%至約4 mol-%。在某些實施例中，PEG脂質之mol-%可為約1 mol-%至約2 mol-%。在某些實施例中，PEG脂質之mol-%可為約1.5 mol-%。
在各個實施例中，LNP組合物包含式(I)或式(II)化合物或其鹽(諸如其醫藥學上可接受之鹽(例如，如本文所揭示))、中性脂質(例如，DSPC)、輔助脂質(例如，膽固醇)及PEG脂質(例如，PEG2k-DMG)。在一些實施例中，LNP組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽(例如，如本文所揭示)、DSPC、膽固醇及PEG脂質。在一些該等實施例中，LNP組合物包括包含DMG之PEG脂質，諸如PEG2k-DMG。在某些較佳實施例中，LNP組合物包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。
在某些實施例中，脂質組合物(諸如LNP組合物)包含脂質組分及核酸組分(例如RNA組分)，且可量測式(I)或式(II)化合物對核酸之莫耳比。本揭示案之實施例亦提供具有式(I)或式(II)化合物之醫藥學上可接受之鹽的帶正電胺基(N)與欲囊封之核酸之帶負電磷酸根基團(P)之間的界定莫耳比的脂質組合物。此可由等式N/P在數學上表示。在一些實施例中，脂質組合物(諸如LNP組合物)可包括包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的脂質組分；及核酸組分，其中N/P比率為約3至10。在一些實施例中，LNP組合物可包括包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的脂質組分；及RNA組分，其中N/P比率為約3至10。舉例而言，N/P比率可為約4-7。或者，N/P比率可為約6，例如6 ±1或6 ± 0.5。
在一些實施例中，水性組分包含生物活性劑。在一些實施例中，水性組分包含多肽，視情況與核酸之組合。在一些實施例中，水性組分包含核酸，諸如RNA。在一些實施例中，水性組分係核酸組分。在一些實施例中，核酸組分包含DNA且其可稱為DNA組分。在一些實施例中，核酸組分包含RNA。在一些實施例中，水性組分(諸如RNA組分)可包含mRNA，諸如編碼RNA導嚮之DNA結合劑的mRNA。在一些實施例中，RNA導嚮之DNA結合劑係Cas核酸酶。在某些實施例中，水性組分可包含編碼Cas9之mRNA。在某些實施例中，水性組分可包含gRNA。在包含編碼RNA導嚮之DNA結合劑之mRNA的一些組合物中，組合物進一步包含gRNA核酸，諸如gRNA。在一些實施例中，水性組分包含RNA導嚮之DNA結合劑及gRNA。在一些實施例中，水性組分包含Cas核酸酶mRNA及gRNA。在一些實施例中，水性組分包含2類Cas核酸酶mRNA及gRNA。
在某些實施例中，脂質組合物(諸如LNP組合物)可包含編碼Cas核酸酶(諸如2類Cas核酸酶)之mRNA、式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、輔助脂質、視情況中性脂質及PEG脂質。在包含編碼Cas核酸酶(例如2類Cas核酸酶)之mRNA的某些組合物中，輔助脂質係膽固醇。在包含編碼Cas核酸酶(例如2類Cas核酸酶)之mRNA的其他組合物中，中性脂質係DSPC。在包含編碼Cas核酸酶(例如2類Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA的額外實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG。在包含編碼Cas核酸酶(諸如2類Cas核酸酶)之mRNA及式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的具體組合物中。在某些組合物中，組合物進一步包含gRNA，諸如dgRNA或sgRNA。
在一些實施例中，脂質組合物(諸如LNP組合物)可包含gRNA。在某些實施例中，組合物可包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、gRNA、輔助脂質、視情況存在之中性脂質及PEG脂質。在包含gRNA之某些LNP組合物中，輔助脂質係膽固醇。在包含gRNA之一些組合物中，中性脂質係DSPC。在包含gRNA之額外實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG。在某些組合物中，gRNA係選自dgRNA及sgRNA。
在某些實施例中，脂質組合物(諸如LNP組合物)包含水性組分中編碼RNA導嚮之DNA結合劑之mRNA及gRNA (其可為sgRNA)及脂質組分中之式(I)或式(II)化合物。舉例而言，LNP組合物可包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、編碼Cas核酸酶之mRNA、gRNA、輔助脂質、中性脂質及PEG脂質。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及gRNA的某些組合物中，輔助脂質係膽固醇。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及gRNA的一些組合物中，中性脂質係DSPC。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及gRNA的額外實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG。
在某些實施例中，脂質組合物(諸如LNP組合物)包括RNA導嚮之DNA結合劑(諸如2類Cas mRNA)及至少一種gRNA。在某些實施例中，LNP組合物包括約1:1或約1:2之gRNA對RNA導嚮之DNA結合劑mRNA (諸如2類Cas核酸酶mRNA)的比率。在一些實施例中，該比率為約25:1至約1:25、約10:1至約1:10、約8:1至約1:8、約4:1至約1:4或約2:1至約1:2。
本文揭示之脂質組合物(諸如LNP組合物)可包括模板核酸，例如DNA模板。模板核酸可與包含式(I)或式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之脂質組合物、包括LNP組合物一起或分開遞送。在一些實施例中，視期望修復機制而定，模板核酸可為單股或雙股。模板可具有與靶DNA、例如在靶DNA序列內，及/或與毗鄰靶DNA之序列同源之區。
在一些實施例中，LNP係藉由將RNA水溶液與基於有機溶劑之脂質溶液混合來形成。適宜溶液或溶劑包括或可含有：水、PBS、Tris緩衝液、NaCl、檸檬酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、乙醇、氯仿、二乙醚、環己烷、四氫呋喃、甲醇、異丙醇。舉例而言，有機溶劑可為100%乙醇。可使用醫藥學上可接受之緩衝液，例如用於活體內投與LNP。在某些實施例中，使用緩衝液以將包含LNP之組合物之pH值維持於pH 6.5或高於pH 6.5。在某些實施例中，使用緩衝液以將包含LNP之組合物之pH值維持於pH 7.0或高於pH 7.0。在某些實施例中，組合物之pH值在約7.2至約7.7之範圍內。在其他實施例中，組合物之pH值在約7.3至約7.7之範圍內或在約7.4至約7.6之範圍內。在其他實施例中，組合物之pH值為約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。利用微pH探針量測組合物之pH值。在某些實施例中，組合物中包括低溫保護劑。低溫保護劑之非限制性實例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO及乙二醇。示例性組合物可包括高達10%低溫保護劑，諸如蔗糖。在某些實施例中，組合物可包含tris鹽水蔗糖(TSS)。在某些實施例中，LNP組合物可包括約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%低溫保護劑。在某些實施例中，LNP組合物可包括約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%蔗糖。在一些實施例中，LNP組合物可包括緩衝液。在一些實施例中，緩衝液可包含磷酸鹽緩衝液(PBS)、Tris緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液及其混合物。在某些示例性實施例中，緩衝液包含NaCl。在某些實施例中，緩衝液無NaCl。NaCl之示例性量可在約20 mM至約45 mM之範圍內。NaCl之示例性量可在約40 mM至約50 mM之範圍內。在一些實施例中，NaCl之量為約45 mM。在一些實施例中，緩衝液係Tris緩衝液。Tris之示例性量可在約20 mM至約60 mM之範圍內。Tris之示例性量可在約40 mM至約60 mM之範圍內。在一些實施例中，Tris之量為約50 mM。在一些實施例中，緩衝液包含NaCl及Tris。LNP組合物之某些示例性實施例含有5%蔗糖及Tris緩衝液中之45 mM NaCl。在其他示例性實施例中，組合物含有約5% w/v之量的蔗糖、約45 mM NaCl及約50 mM Tris (pH 7.5)。鹽、緩衝液及低溫保護劑之量可變，使得維持整體組合物之滲透壓。舉例而言，可維持最終滲透壓低於450 mOsm/L。在其他實施例中，滲透壓介於350 mOsm/L與250 mOsm/L之間。某些實施例具有300 +/- 20 mOsm/L或310 +/- 40 mOsm/L之最終滲透壓。
在一些實施例中，使用RNA水溶液及有機溶劑中之脂質溶液的微流體混合、T混合或交叉混合。在某些態樣中，流速、接頭大小、接頭幾何學、接頭形狀、管直徑、溶液及/或RNA及脂質濃度可變。LNP或LNP組合物可經由例如透析、離心式過濾器、切向流過濾或層析來濃縮或純化。例如，LNP可呈懸浮液、乳液或凍乾粉末儲存。在一些實施例中，LNP組合物儲存於2-8℃下，在某些態樣中，LNP組合物儲存於室溫下。在其他實施例中，LNP組合物於例如-20℃或-80℃下冷凍儲存。在其他實施例中，LNP組合物儲存於約0℃至約-80℃範圍內之溫度下。冷凍之LNP組合物可在使用之前例如在冰上、於室溫下或於25℃下解凍。
脂質LNP可為例如微球體(包括單層及多層囊泡，例如「脂質體」—層狀相脂質雙層，在一些實施例中其實質上為球形—且在更特定實施例中可包含水性核，例如，包含很大一部分RNA分子)、於乳液中之分散相、膠束或懸浮液中之內相。
較佳脂質組合物(諸如LNP組合物)係生物可降解的，因為其在治療有效劑量下不會在活體內累積至細胞毒性水準。在一些實施例中，組合物在治療劑量水準下不會引起導致明顯不良影響之先天免疫反應。在一些實施例中，本文提供之組合物在治療劑量水準下不會引起毒性。
在一些實施例中，本文揭示之LNP的多分散性指數(PDI)可在約0.005至約0.75之範圍內。在一些實施例中，LNP之PDI可在約0.01至約0.5之範圍內。在一些實施例中，LNP之PDI可在約0至約0.4之範圍內。在一些實施例中，LNP之PDI可在約0至約0.35之範圍內。在一些實施例中，LNP之PDI可在約0至約0.35之範圍內。在一些實施例中，LNP之PDI可在約0至約0.3之範圍內。在一些實施例中，LNP之PDI可在約0至約0.25之範圍內。在一些實施例中，LNP之PDI可在約0至約0.2之範圍內。在一些實施例中，LNP之PDI可小於約0.08、0.1、0.15、0.2或0.4。
本文揭示之LNP之大小(例如Z-平均直徑)為約1至約250 nm。在一些實施例中，LNP之大小為約10至約200 nm。在其他實施例中，LNP之大小為約20至約150 nm。在一些實施例中，LNP之大小為約50至約150 nm。在一些實施例中，LNP之大小為約50至約100 nm。在一些實施例中，LNP之大小為約50至約120 nm。在一些實施例中，LNP之大小為約60至約100 nm。在一些實施例中，LNP之大小為約75至約150 nm。在一些實施例中，LNP之大小為約75至約120 nm。在一些實施例中，LNP之大小為約75至約100 nm。除非另外指示，否則本文中提及之所有大小皆係如藉由Malvern Zetasizer上之動態光散射量測之完全成形之奈米粒子的平均大小(直徑)。將奈米粒子樣品於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋，使得計數率為約200-400 kcps。數據表示為強度量測值之加權平均值(Z-平均直徑)。
在一些實施例中，LNP係以約50%至約100%範圍內之平均囊封效率形成。在一些實施例中，LNP係以約50%至約95%範圍內之平均囊封效率形成。在一些實施例中，LNP係以約70%至約90%範圍內之平均囊封效率形成。在一些實施例中，LNP係以約90%至約100%範圍內之平均囊封效率形成。在一些實施例中，LNP係以約75%至約95%範圍內之平均囊封效率形成。 貨品子
經由LNP組合物遞送之貨品子可為生物活性劑。在某些實施例中，貨品子係或包含一或多種生物活性劑、諸如mRNA、嚮導RNA、核酸、RNA導嚮之DNA結合劑、表現載體、模板核酸、抗體(例如單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、奈米抗體及其片段等)、膽固醇、激素、肽、蛋白質、化學治療劑及其他類型之抗瘤劑、低分子量藥物、維生素、輔因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反義核酸、三聯體形成寡核苷酸、反義DNA或RNA組合物、嵌合DNA:RNA組合物、等位基因酶、適配體、核酶、誘餌及其類似物、質體及其他類型之載體及小核酸分子、RNAi劑、短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)及「自我複製RNA」(編碼複製酶酶活性且能夠引導其自身活體內複製或擴增)分子、肽核酸(PNA)、鎖核酸核糖核苷酸(LNA)、嗎啉基核苷酸、蘇糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、sisiRNA (小內部片段化干擾RNA)及iRNA (不對稱干擾RNA)。生物活性劑之以上清單僅係示例性的，且並不意欲具有限制性。該等化合物可經純化或部分純化，且可為天然存在或合成的，且可經化學修飾。
經由LNP組合物遞送之貨品子可為RNA，諸如編碼所關注蛋白之mRNA分子。舉例而言，包括用於表現蛋白質(諸如綠色螢光蛋白(GFP))、RNA導嚮之DNA結合劑或Cas核酸酶之mRNA。提供包括Cas核酸酶mRNA (例如允許在細胞中表現2類Cas核酸酶(諸如Cas9或Cpf1蛋白)之2類Cas核酸酶mRNA)的LNP組合物。此外，貨品子可含有一或多種嚮導RNA或編碼嚮導RNA之核酸。組合物中亦可包括例如修復或重組用模板核酸，或本文所述之方法中可使用模板核酸。在一子實施例中，貨品子包含編碼釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes ) Cas9之mRNA，視情況以及釀膿鏈球菌gRNA。在又一子實施例中，貨品子包含編碼腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis ) Cas9之mRNA，視情況以及nme gRNA。
「mRNA」係指多核苷酸且包含可轉譯成多肽之開放閱讀框(亦即，可用作由核糖體及胺基-醯化tRNA轉譯之受質)。mRNA可包含磷酸酯-糖主鏈，包括核糖殘基或其類似物，例如2’-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。通常，mRNA不含有大量胸苷殘基(例如，0個殘基或少於30個、20個、10個、5個、4個、3個或2個胸苷殘基；或少於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%胸苷含量)。mRNA可在其一些或所有尿苷位置含有經修飾尿苷。 CRISPR/Cas貨品子
在某些實施例中，所揭示之組合物包含編碼RNA導嚮之DNA結合劑(諸如Cas核酸酶)之mRNA。在特定實施例中，所揭示之組合物包含編碼2類Cas核酸酶(諸如釀膿鏈球菌Cas9)之mRNA。
如本文所用，「RNA導嚮之DNA結合劑」意指具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽之複合物，或該複合物之DNA結合子單元，其中DNA結合活性具有序列特異性且視RNA之序列而定。示例性RNA導嚮之DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用，「Cas核酸酶」涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2子單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3子單元及2類Cas核酸酶。如本文所用，「2類Cas核酸酶」係具有RNA導嚮之DNA結合活性的單鏈多肽。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶/切口酶(例如，H840A、D10A或N863A變異體)，其進一步具有RNA導嚮之DNA裂解酶或切口酶活性；及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性不活化。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如，N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如，K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如，K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白及其修飾形式。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell , 163: 1-13 (2015))與Cas9同源，且含有RuvC樣核酸酶結構域。Zetsche之Cpf1序列以引用方式整體併入。參見例如Zetsche，表S1及S3。參見例如Makarova等人，Nat Rev Microbiol , 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人，Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指嚮導RNA以及RNA導嚮之DNA結合劑，例如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA結合劑(例如，Cas9)。在一些實施例中，嚮導RNA將RNA導嚮之DNA結合劑(例如Cas9)引導至靶序列，且嚮導RNA與靶序列雜交且劑結合至靶序列；在劑係裂解酶或切口酶之情形下，結合後可裂解或切口。
在本揭示案之一些實施例中，LNP組合物之貨品子包括至少一種嚮導RNA，該嚮導RNA包含將可為核酸酶(例如，Cas核酸酶，諸如Cas9)之RNA導嚮之DNA結合劑引導至靶DNA的嚮導序列。gRNA可將Cas核酸酶或2類Cas核酸酶引導至靶核酸分子上之靶序列。在一些實施例中，gRNA結合2類Cas核酸酶且提供由2類Cas核酸酶裂解之特異性。在一些實施例中，gRNA及Cas核酸酶可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas複合物，諸如CRISPR/Cas9複合物。在一些實施例中，CRISPR/Cas複合物可為II型CRISPR/Cas9複合物。在一些實施例中，CRISPR/Cas複合物可為V型CRISPR/Cas複合物，諸如Cpf1/嚮導RNA複合物。Cas核酸酶及同源gRNA可配對。與每一2類Cas核酸酶配對之gRNA支架結構隨著特定CRISPR/Cas系統而變。
「嚮導RNA」、「gRNA」及簡單地「嚮導」在本文中可互換使用，指crRNA (亦稱為CRISPR RNA)或crRNA與trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。嚮導RNA可包括如本文所述之經修飾之RNA。crRNA及trRNA可作為單一RNA分子(單嚮導RNA，sgRNA)或以兩個單獨RNA分子(雙重嚮導RNA，dgRNA)締合。「嚮導RNA」或「gRNA」係指每一類型。trRNA可為天然存在之序列，或與天然存在之序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。
如本文所用，「嚮導序列」係指嚮導RNA內與靶序列互補且用於將嚮導RNA引導至靶序列以由RNA導嚮之DNA結合劑結合或修飾(例如，裂解)之序列。「嚮導序列」亦可稱為「靶向序列」或「間隔序列」。例如，在釀膿鏈球菌(亦即，Spy Cas9)及相關之Cas9同系物/直向同源物之情形下，嚮導序列之長度可為20個鹼基對。亦可使用更短或更長之序列作為嚮導，例如，長度為15個、16個、17個、18個、19個、21個、22個、23個、24個或25個核苷酸。在一些實施例中，例如，靶序列係在基因中或在染色體上，且與嚮導序列互補。在一些實施例中，嚮導序列與其相應靶序列之間的互補或一致性程度可為約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，嚮導序列及靶區可在至少15個、16個、17個、18個、19個或20個鄰接核苷酸上100%互補或一致。在其他實施例中，嚮導序列及靶區可含有至少一個錯配。舉例而言，嚮導序列及靶序列可含有1個、2個、3個或4個錯配，其中靶序列之總長度為至少17個、18個、19個、20個或更多個鹼基對。在一些實施例中，嚮導序列及靶區可含有1-4個錯配，其中嚮導序列包含至少17個、18個、19個、20個或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及靶區可含有1個、2個、3個或4個錯配，其中嚮導序列包含20個核苷酸。
RNA導嚮之DNA結合蛋白(諸如Cas蛋白)之靶序列包括基因組DNA之正股及負股(亦即，給出之序列及序列之反向互補序列)，此乃因為Cas蛋白之核酸受質係雙股核酸。因此，當稱嚮導序列「與靶序列互補」時，應理解，嚮導序列可引導嚮導RNA結合至靶序列之反向互補序列。因此，在嚮導序列結合靶序列之反向互補序列之一些實施例中，嚮導序列與靶序列之某些核苷酸一致(例如，靶序列不包括PAM)，只是在嚮導序列中用U取代T。
靶向序列之長度可視所用之CRISPR/Cas系統及組分而定。舉例而言，來自不同細菌物種之不同2類Cas核酸酶具有改變的最佳靶向序列長度。因此，靶向序列之長度可包含5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個或超過50個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列長度比天然存在之CRISPR/Cas系統之嚮導序列長或短0個、1個、2個、3個、4個或5個核苷酸。在某些實施例中，Cas核酸酶及gRNA支架將源自相同CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，靶向序列可包含18-24個核苷酸或由其組成。在一些實施例中，靶向序列可包含19-21個核苷酸或由其組成。在一些實施例中，靶向序列可包含20個核苷酸或由其組成。
在一些實施例中，sgRNA係能夠介導Cas9蛋白對RNA導嚮之DNA裂解的「Cas9 sgRNA」。在一些實施例中，sgRNA係能夠介導Cpf1蛋白對RNA導嚮之DNA裂解的「Cpf1 sgRNA」。在某些實施例中，gRNA包含足以與Cas9蛋白形成活性複合物且介導RNA導嚮之DNA裂解的crRNA及tracr RNA。在某些實施例中，gRNA包含足以與Cpf1蛋白形成活性複合物且介導RNA導嚮之DNA裂解的crRNA。參見Zetsche 2015。
本發明之某些實施例亦提供編碼本文所述之gRNA的核酸，例如表現卡匣。「嚮導RNA核酸」在本文中用於指嚮導RNA (例如sgRNA或dgRNA)及嚮導RNA表現卡匣(其係編碼一或多種嚮導RNA之核酸)。 經修飾之RNA
在某些實施例中，脂質組合物(諸如LNP組合物)包含經修飾之核酸，包括經修飾之RNA。
經修飾之核苷或核苷酸可存在於RNA (例如gRNA或mRNA)中。例如，包含一或多個經修飾核苷或核苷酸之gRNA或mRNA稱為「經修飾」RNA，以闡述一或多種代替典型A、G、C及U殘基使用或除典型A、G、C及U殘基之外亦使用之非天然及/或天然存在之組分或構形的存在。在一些實施例中，利用非典型核苷或核苷酸合成經修飾之RNA，在此稱為「經修飾」。
經修飾之核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者：(i)改變、例如置換非連接磷酸酯氧中之一者或二者及/或磷酸二酯主鏈連接中之連接磷酸酯氧中之一或多者(示例性主鏈修飾)；(ii)改變、例如置換核糖之成分，例如核糖上之2'羥基(示例性糖修飾)；(iii)用「去磷酸化」連接子大批置換磷酸酯部分(示例性主鏈修飾)；(iv)包括用非典型核鹼基修飾或置換天然存在之核鹼基(示例性鹼基修飾)；(v)置換或修飾核糖-磷酸酯主鏈(示例性主鏈修飾)；(vi)修飾寡核苷酸之3'端或5'端，例如移除、修飾或置換末端磷酸酯基團或結合部分、蓋或連接子(該等3'或5'蓋修飾可包含糖及/或主鏈修飾)；及(vii) 修飾或置換糖(示例性糖修飾)。某些實施例包含對mRNA、gRNA或核酸之5'端修飾。某些實施例包含對mRNA、gRNA或核酸之3'端修飾。經修飾之RNA可含有5'端及3'端修飾。經修飾之RNA可在非末端位置含有一或多個經修飾之殘基。在某些實施例中，gRNA包括至少一個經修飾之殘基。在某些實施例中，mRNA包括至少一個經修飾之殘基。
未經修飾之核酸可易於經例如細胞核酸內切酶或血清中發現之彼等酶降解。舉例而言，核酸酶可水解核酸磷酸二酯鍵。因此，在一個態樣中，本文所述RNA (例如mRNA、gRNA)可含有一或多個經修飾核苷或核苷酸，例如，以引入對細胞內或基於血清之核酸酶之穩定性。在一些實施例中，當活體內及離體引入至細胞群體中時，本文所述之經修飾之gRNA分子可展現降低之先天免疫反應。術語「先天免疫反應」包括對外源性核酸(包括單股核酸)之細胞反應，反應包括誘導細胞介素、尤其是干擾素之表現及釋放，及細胞死亡。
因此，在一些實施例中，所揭示LNP組合物中之RNA或核酸包含至少一個賦予核酸增加或增強之穩定性(包括例如改良之對活體核酸內切酶消化之抗性)的修飾。如本文所用，術語「修飾」及「經修飾」在該等術語涉及本文提供之核酸時包括至少一個較佳地增強RNA或核酸之穩定性且使RNA或核酸比野生型或天然存在型式之RNA或核酸更穩定(例如，抗核酸酶消化)的改變。如本文所用，術語「穩定的」及「穩定性」在該等術語涉及本發明之核酸，且尤其是關於RNA時係指對由例如核酸酶(亦即，核酸內切酶或核酸外切酶)降解之抗性增加或增強，該等核酸酶通常能夠降解該RNA。增加之穩定性可包括例如對水解或由內源性酶(例如，核酸內切酶或核酸外切酶)之其他破壞或靶細胞或組織內之條件的敏感性較小，藉此增加或增強該等RNA在靶細胞、組織、個體及/或細胞質中之保留。本文提供之穩定之RNA分子相對於其天然存在之未經修飾之對應體(例如野生型型式之mRNA)展現更長之半衰期。術語「修飾」及「經修飾」在涉及本文揭示之LNP組合物之mRNA時該等術語亦涵蓋改良或增強mRNA核酸之轉譯的改變，包括例如納入在蛋白質轉譯之起始中起作用的序列(例如，Kozac一致序列)。(Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987))。
在一些實施例中，本文揭示之LNP組合物之RNA或核酸經歷化學或生物學修飾以使其更穩定。RNA之示例性修飾包括減少鹼基(例如，藉由缺失或藉由將一個核苷酸取代為另一個核苷酸)或鹼基修飾，例如鹼基化學修飾。如本文所用，片語「化學修飾」包括引入不同於天然存在之RNA中所觀察到之彼等化學之化學的修飾，例如共價修飾，諸如引入經修飾之核苷酸(例如，核苷酸類似物，或納入在該等RNA分子中未天然發現之懸垂基團)。
在主鏈修飾之一些實施例中，經修飾之殘基之磷酸酯基團可藉由用不同取代基置換一或多個氧來修飾。此外，經修飾之殘基(例如，經修飾之核酸中存在之經修飾之殘基)可包括用如本文所述之經修飾之磷酸酯基團大批置換未經修飾之磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸酯主鏈之主鏈修飾包括產生不帶電連接子或帶有不對稱電荷分佈之帶電連接子的改變。
經修飾之磷酸酯基團之實例包括硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷基磷酸酯(borano phosphates)、硼烷基磷酸酯(borano phosphate esters)、膦酸氫酯、磷醯胺酯、膦酸烷基酯或膦酸芳基酯及磷酸三酯。未經修飾之磷酸酯基團中之磷原子係非對掌性的。然而，用上述原子或原子群中之一者置換非橋接氧中之一者可使磷原子具有對掌性。立體源磷原子可具有「R」構形(本文為Rp)或「S」構形(本文為Sp)。主鏈亦可藉由用氮(橋接磷醯胺酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基膦酸酯)置換橋接氧(亦即，將磷酸酯連接至核苷之氧)來修飾。置換可在任一連接氧或兩個連接氧處發生。在某些主鏈修飾中，磷酸酯基團可由不含磷之連接基團置換。在一些實施例中，帶電之磷酸酯基團可由天然部分置換。可置換磷酸酯基團之部分之實例可包括(但不限於)例如膦酸甲基酯、羥基胺基、矽氧烷、碳酸酯、羧基甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接子、磺酸酯、磺醯胺、硫代甲縮醛、甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基伸肼基、亞甲基二甲基伸肼基及亞甲基氧基甲基亞胺基。 mRNA
在一些實施例中，本文揭示之組合物或調配物包括包含編碼如本文所述之RNA導嚮之DNA結合劑(諸如Cas核酸酶或2類Cas核酸酶)之開放閱讀框(ORF)的mRNA。在一些實施例中，提供、使用或投與包含編碼RNA導嚮之DNA結合劑(諸如Cas核酸酶或2類Cas核酸酶)之ORF的mRNA。mRNA可包含5'帽、5'未轉譯區(UTR)、3' UTR及多腺嘌呤尾中之一或多者。mRNA可包含經修飾之開放閱讀框，例如以編碼核定位序列或使用替代密碼子編碼蛋白質。
所揭示LNP組合物中之mRNA可編碼例如分泌之激素、酶、受體、多肽、肽或正常分泌之其他所關注蛋白質。在本發明之一個實施例中，mRNA可視情況具有化學或生物學修飾，該等修飾例如改良該mRNA之穩定性及/或半衰期或改良或以其他方式有利於蛋白質產生。
另外，適宜修飾包括密碼子之一或多個核苷酸的改變，使得密碼子編碼相同胺基酸，但比野生型型式之mRNA中發現之密碼子更穩定。舉例而言，已證明RNA之穩定性與較大數目之胞苷(C)及/或尿苷(U)殘基之間之反向關係，且已發現無C及U殘基之RNA對於大部分RNA酶穩定(Heidenreich等人 J Biol Chem 269, 2131-8 (1994))。在一些實施例中，mRNA序列中C及/或U殘基之數目減少。在另一實施例中，藉由用編碼特定胺基酸之一個密碼子取代編碼相同或有關胺基酸之另一密碼子來減少C及/或U殘基之數目。所涵蓋之對本發明之mRNA核酸之修飾亦包括納入假尿苷。向本發明之mRNA核酸中納入假尿苷可增強穩定性及轉譯能力，以及降低活體內免疫原性。參見例如Karikó, K.等人，Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008)。對本發明之mRNA之取代及修飾可藉由熟習此項技術者易知之方法來實施。
與未轉譯區相比，對減少序列中C及U殘基之數目的限制在mRNA之編碼區內將可能更大(亦即，將可能無法消除信使中存在之所有C及U殘基，同時仍保留信使編碼期望胺基酸序列之能力)。然而，遺傳代碼之簡併性提供機會允許序列中存在之C及/或U殘基的數目減少，同時維持相同編碼能力(亦即，視密碼子所編碼之胺基酸而定，用於修飾RNA序列之若干不同可能性可為可能的)。
術語修飾亦包括例如向本發明之mRNA序列中納入非核苷酸鍵或經修飾之核苷酸(例如，修飾編碼功能性分泌蛋白質或酶之mRNA分子之3′及5′端中之一者或二者)。該等修飾包括向mRNA序列添加鹼基(例如，納入多A尾或更長的多A尾)、改變3′ UTR或5′ UTR、使mRNA與劑(例如，蛋白質或互補核酸分子)複合及納入改變mRNA分子之結構的要素(例如，該等要素形成二級結構)。
據信多A尾穩定天然信使。因此，在一個實施例中，可將長的多A尾添加至mRNA分子中，因此使得mRNA更穩定。多A尾可使用各種業內公認之技術添加。舉例而言，可使用多A聚合酶將長的多A尾添加至合成或活體外轉錄之mRNA中(Yokoe等人Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256)。轉錄載體亦可編碼長的多A尾。另外，多A尾可藉由直接自PCR產物轉錄來添加。在一個實施例中，多A尾之長度為至少約90個、200個、300個、400個、至少500個核苷酸。在一個實施例中，調節多A尾之長度以控制本發明之經修飾之mRNA分子的穩定性，且因此控制蛋白質之轉錄。舉例而言，由於多A尾之長度可影響mRNA分子之半衰期，故可調節多A尾之長度以修飾mRNA對核酸酶之抗性的水準且藉此控制細胞中蛋白質表現之時程。在一個實施例中，穩定之mRNA分子足以抵抗活體內降解(例如，核酸酶降解)，使得其可在無轉移媒劑之情況下遞送至靶細胞。
在一個實施例中，可藉由納入在野生型mRNA中未天然發現之3′及/或5′未轉譯(UTR)序列修飾mRNA。在一個實施例中，可將天然側接mRNA且編碼第二無關蛋白質之3′及/或5′側接序列納入編碼治療性或功能性蛋白質之mRNA分子的核苷酸序列中以對其進行修飾。舉例而言，可將穩定mRNA分子(例如，珠蛋白、肌動蛋白、GAPDH、微管蛋白、組織蛋白或檸檬酸循環酶)之3′或5′序列納入有義mRNA核酸分子之3′及/或5′區以提高有義mRNA分子之穩定性。參見例如US2003/0083272。
mRNA修飾之更詳細說明可參見US2017/0210698A1，第57-68頁，該案件之內容併入本文中。 模板核酸
本文揭示之組合物及方法可包括模板核酸。模板可用於在RNA導嚮之DNA結合蛋白(諸如Cas核酸酶，例如2類Cas核酸酶)之靶位點處或附近改變或插入核酸序列。在一些實施例中，該等方法包括向細胞引入模板。在一些實施例中，可提供單一模板。在其他實施例中，可提供兩個或更多個模板，使得可在兩個或更多個靶位點處進行編輯。舉例而言，可提供不同模板以編輯細胞中之單一基因，或細胞中之兩個不同基因。
在一些實施例中，模板可用於同源重組。在一些實施例中，同源重組可將模板序列或一部分模板序列整合至靶核酸分子中。在其他實施例中，模板可用於同源性引導之修復，該同源性引導之修復涉及在核酸中之裂解位點處DNA股侵入。在一些實施例中，同源性引導之修復可引起編輯之靶核酸分子中納入模板序列。在其他實施例中，模板可用於由非同源端接合介導之基因編輯。在一些實施例中，模板序列與裂解位點附近之核酸序列無相似性。在一些實施例中，納入模板或一部分模板序列。在一些實施例中，模板包括側接反向末端重複(ITR)序列。
在一些實施例中，模板序列可對應於、包含靶細胞之內源序列或由其組成。其亦可或另一選擇為對應於、包含靶細胞之外源序列或由其組成。如本文所用術語「內源序列」係指細胞天然之序列。術語「外源序列」係指細胞非天然之序列，或在細胞之基因組中之天然位置係在不同位置處的序列。在一些實施例中，內源序列可為細胞之基因組序列。在一些實施例中，內源序列可為染色體或染色體外序列。在一些實施例中，內源序列可為細胞之質體序列。
在一些實施例中，模板含有含側接反向末端重複(ITR)序列之ssDNA或dsDNA。在一些實施例中，模板以載體、質體、微環、奈米環或PCR產物形式提供。
在一些實施例中，核酸係經純化的。在一些實施例中，使用沈澱方法(例如，LiCl沈澱、醇沈澱或例如如本文所述之等效方法)純化核酸。在一些實施例中，使用基於層析之方法(諸如基於HPLC之方法)或等效方法(例如，如本文所述)純化核酸。在一些實施例中，使用沈澱方法(例如，LiCl沈澱)及基於HPLC之方法二者純化核酸。在一些實施例中，藉由切向流過濾(TFF)純化核酸。
化合物或組合物將通常(但不必)包括一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。術語「賦形劑」包括除了本揭示案之化合物、其他脂質組分及生物活性劑以外的任何成分。賦形劑可賦予組合物功能(例如藥物釋放速率控制)及/或非功能(例如加工助劑或稀釋劑)特徵。賦形劑之選擇在很大程度上視諸如特定投與模式、賦形劑對溶解度及穩定性之影響以及劑型之性質的因素而定。
非經腸調配物通常為水性或油性溶液或懸浮液。其中調配物為水性，賦形劑諸如為糖(包括但不限於葡萄糖、甘露醇、山梨醇等)鹽、碳水化合物及緩衝劑(較佳至3至9之pH)，但對於一些應用，可能更適合與無菌非水性溶液調配在一起或調配為乾燥形式以結合適宜媒劑(諸如無菌無致熱源水(WFI))一起使用。
儘管將結合所闡釋實施例來闡述本發明，但應理解，該等實施例並不意欲將本發明限於彼等實施例。相反，本發明意欲涵蓋可包括於隨附申請專利範圍所界定之本發明內之所有替代、修改及等效形式，包括具體特徵之等效形式。
上述一般說明及詳細說明二者以及以下實例僅具有示例性及說明性，且不限制教示。本文所用各部分標題僅出於組織性目的，且不應視為以任何方式限制期望標的物。倘若以引用方式併入之任何文獻與本說明書中定義之任何術語出現衝突，則以本說明書為準。除非另外說明，否則申請案中給出之所有範圍皆涵蓋終點。定義
應注意，除非上下文另外明確說明，否則如本申請案中所用單數形式「一」(「a」、「an」)及「該」包括複數個指示物。因此，例如，在提及「組合物」時包括複數個組合物且在提及「細胞」時包括複數個細胞及諸如此類。「或」之使用具有包括性且除非另外說明，否則意指「及/或」。
除非在上述說明書中另外明確指出，否則說明書中敍述「包含」各種組分之實施例亦涵蓋為「由所敍述組分組成」或「基本上由所敍述組分組成」；說明書中敍述「由各種組分組成」之實施例亦涵蓋為「包含」所敍述組分或「基本上由所敍述組分組成」；說明書中敍述「在各種組分附近」之實施例亦涵蓋為「在所敍述組分處」；且說明書中敍述「基本上由各種組分組成」之實施例亦涵蓋為「由所敍述組分組成」或「包含」所敍述組分(此互換性並不適用於該等術語在申請專利範圍中之使用)。
數字範圍包括界定該範圍之數字。量測值及可量測值應理解為近似值，考慮有效數位及與量測相關之誤差。如本申請案中所用之術語「約」及「大約」具有其業內理解之含義；一與其他之使用不必暗指不同範疇。除非另外指示，否則本申請案中所用之具有或無修飾術語(諸如「約」或「大於」)之數字應理解為涵蓋如有關技術之熟練人員所瞭解之正常發散及/或波動。在某些實施例中，除非另外說明或另外自上下文明了(該數字將超過可能值之100%的情形除外)，否則術語「大約」或「約」係指在任一方向上(大於或小於)所述參照值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內的值之範圍。
如本文所用術語「接觸」意指建立兩個或更多個實體之間之物理連接。舉例而言，使哺乳動物細胞與奈米粒子組合物接觸意指使得哺乳動物細胞及奈米粒子共享物理連接。使細胞與外部實體在活體內及離體接觸之方法係生物技術中所熟知的。舉例而言，使奈米粒子組合物與安置於哺乳動物內之哺乳動物細胞接觸可藉由各種投與途徑(例如，靜脈內、肌內、真皮內及皮下)來實施且可涉及各種量之奈米粒子組合物。此外，超過一種哺乳動物細胞可由奈米粒子組合物接觸。
如本文所用術語「遞送」意指將實體提供至目的地。舉例而言，遞送治療劑及/或預防劑至個體可涉及向個體投與包括治療劑及/或預防劑之奈米粒子組合物(例如，藉由靜脈內、肌內、真皮內或皮下途徑)。向哺乳動物或哺乳動物細胞投與奈米粒子組合物可涉及使一或多個細胞與奈米粒子組合物接觸。
如本文所用之「囊封效率」係指相對於用於製備奈米粒子組合物之治療劑及/或預防劑之初始總量，變為奈米粒子組合物之一部分之治療劑及/或預防劑的量。舉例而言，若在初始提供給組合物之總共100 mg治療劑及/或預防劑中，97 mg治療劑及/或預防劑囊封於奈米粒子組合物中，則囊封效率可給出為97%。如本文所用之「囊封」可指完全、實質或部分圍繞、限制、包圍或包繞。
如本文所用術語「生物可降解」用於指在引入細胞中時藉由細胞機制(例如，酶降解)或藉由水解而分解成細胞可重新使用或處理而對細胞無毒性效應之組分的材料。在某些實施例中，生物可降解材料之分解所生成之組分在活體內不誘發炎症及/或其他不良影響。在一些實施例中，生物可降解材料以酶促方式分解。或者或另外，在一些實施例中，生物可降解材料藉由水解分解。
如本文所用，「N/P比率」係例如包括脂質組分及RNA之奈米粒子組合物中脂質中可離子化(在生理pH範圍內)氮原子與RNA中之磷酸根基團的莫耳比。
組合物亦可包括一或多種化合物之鹽。鹽可為醫藥學上可接受之鹽。如本文所用之「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示化合物之衍生物，其中藉由將現存酸或鹼部分轉化為其鹽形式(例如，藉由使游離鹼基團與適宜有機酸反應)改變母化合物。醫藥學上可接受之鹽之實例包括(但不限於)鹼性殘基(例如胺)之無機酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基(例如羧酸)之鹼性鹽或有機鹽；及諸如此類。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、已酸鹽、氫溴酸鹽、氫氯酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酯酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及諸如此類。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及諸如此類，以及無毒性銨、四級銨及胺陽離子，包括但不限於銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及諸如此類。本揭示案之醫藥學上可接受之鹽包括例如自無毒無機酸或有機酸形成之母化合物之習用無毒鹽。本揭示案之醫藥學上可接受之鹽可藉由習用化學方法自含有鹼性或酸性部分之母化合物來合成。通常，該等鹽可藉由在水或有機溶劑或二者之混合物中使該等化合物之游離酸或鹼形式與化學計算量之適當鹼或酸反應來製備；通常，如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈之非水性介質較佳。適宜鹽之清單可參見Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing公司, Easton, Pa., 1985, 第1418頁, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. H. Stahl及C. G. Wermuth (編輯), Wiley-VCH, 2008，及Berge等人, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)，各自係全文以引用方式併入本文中。
如本文所用，「多分散性指數」係闡述系統之粒徑分佈之均質性的比率。小的值(例如，小於0.3)指示窄的粒徑分佈。在一些實施例中，多分散性指數可小於0.1。
如本文所用之「轉染」係指向細胞中引入物質(例如，RNA)。轉染可在例如活體外、離體或活體內發生。
如本文所用術語「烷基」係1至24個碳原子之支鏈或無支鏈飽和烴基，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、第二戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基及諸如此類。烷基可為環狀的或非環狀的。烷基可為支鏈或無支鏈(亦即，直鏈)。烷基亦可經取代或未經取代(較佳地未經取代)。舉例而言，烷基可經一或多個基團(包括但不限於，如本文所述之烷基、環烷基、烷氧基、胺基、醚、鹵基、羥基、硝基、矽烷基、亞碸基、磺酸酯基、羧酸酯基或硫醇)取代。「低碳烷基」係含有1至6個(例如，1至4個)碳原子之烷基。
如本文所用術語「烯基」係指含有至少一個碳-碳雙鍵之脂族基團且意欲包括「未經取代之烯基」及「經取代之烯基」二者，後者係指具有置換烯基之一或多個碳上之氫的取代基之烯基部分。該等取代基可在一或多個雙鍵中包括或不包括之一或多個碳上出現。此外，該等取代基包括烷基所涵蓋之所有彼等取代基，如下文所論述，只是穩定性禁止之情形除外。舉例而言，涵蓋烯基可經一或多個烷基、碳環基、芳基、雜環基或雜芳基取代。示例性烯基包括(但不限於)乙烯基(-CH=CH2 )、烯丙基(-CH2 CH=CH2 )、環戊烯基(-C5 H7 )及5-己烯基(-CH2 CH2 CH2 CH2 CH=CH2 )。
「伸烷基」係指可為支鏈或無支鏈(亦即，直鏈)之二價烷基。上文所提及單價烷基中之任一者可藉由自該烷基去除第二氫原子而轉化為伸烷基。代表性伸烷基包括C2-4 伸烷基及C2-3 伸烷基。典型伸烷基包括(但不限於) -CH(CH3 )-、-C(CH3 )2 -、-CH2 CH2 -、-CH2 CH(CH3 )-、-CH2 C(CH3 )2 -、-CH2 CH2 CH2 -、-CH2 CH2 CH2 CH2 -及諸如此類。伸烷基亦可經取代或未經取代。舉例而言，伸烷基可經一或多個基團(包括但不限於，如本文所述之烷基、芳基、雜芳基、環烷基、烷氧基、胺基、醚、鹵基、羥基、硝基、矽烷基、亞碸基、磺酸酯基、磺醯胺、脲、醯胺、胺基甲酸酯基、酯、羧酸酯基或硫醇)取代。
術語「伸烯基」包括具有至少一個碳-碳雙鍵且在一個實施例中無碳-碳三鍵之二價、直鏈或支鏈、不飽和、非環狀烴基。上文所提及單價烯基中之任一者可藉由自該烯基去除第二氫原子而轉化為伸烯基。代表性伸烯基包括C2-6 伸烯基。
術語「Cx-y 」在與化學部分(諸如烷基或伸烷基)結合使用時意指包括鏈中含有x至y個碳之基團。舉例而言，術語「Cx-y 烷基」係指經取代或未經取代之飽和烴基，包括鏈中含有x至y個碳之直鏈及支鏈烷基及伸烷基。以引用方式併入
本文中提及或引用之文章、專利及專利申請案以及所有其他文件及電子可用資訊之內容以引用方式全文併入本文中，其併入程度如同每一個別出版物明確且個別地指示以引用方式併入一般。申請人保留將任何此類文章、專利、專利申請案或其他實體及電子文件中之任何及所有材料及資訊以物理方式併入本申請案中的權利。實例 表1. 化合物
化合物 結構
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一般資訊
所有試劑及溶劑係購得且按自商業供應商接收時使用或根據所引用之程序合成。使用矽膠上急驟管柱層析純化所有中間體及最終化合物。在Bruker或Varian 400 MHz光譜儀上記錄NMR譜，且於環境溫度下在CDCl3 中收集NMR數據。化學位移係以相對於CDCl3 (7.26)之百萬分率(ppm)報導。1 H NMR之數據報導如下：化學位移、多重峰(br = 寬峰，s = 單峰，d = 雙重峰，t = 三重峰，q = 四重峰，dd =雙二重峰，dt = 雙三重峰，m = 多重峰)、耦合常數及整合。在具有電噴霧離子化(ESI)源之Waters SQD2質譜儀上記錄MS數據。藉由UPLC-MS-ELS使用配備有SQD2質譜儀與光電二極體陣列(PDA)及蒸發光散射(ELS)偵測器之Waters Acquity H-Class液相層析儀器測定最終化合物之純度。 實例1-化合物1 中間體1a：8-溴辛酸壬酯
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於15-25℃下向8-溴辛酸(5.0 g，22.4 mmol)及壬-1-醇(1-2當量)於DCM (56 mL)中之溶液中依序添加DIEA (2-3當量)、DMAP (0.1-0.25當量)及EDC·HCl (1-1.5當量)，達至少4 h。完成後，將反應混合物用DCM稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮。使用矽膠層析(0-33% EtOAc/己烷)純化，提供澄清油狀期望產物(4.5 g，13 mmol，59%產率)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.06 (t,J = 6.6 Hz, 2H), 3.40 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.29 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 1.185 (m, 2H), 1.61 (m, 4H), 1.43 (m, 2H), 1.31 (m, 18H), 0.88 (t,J = 6.8 Hz, 3H) ppm。 中間體1b：8-(2-羥基乙基胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image187
將中間體1a (12 g，34.35 mmol)及2-胺基乙醇(20-40當量)於乙醇(EtOH) (10 mL)中之溶液於20℃下攪拌至少12 h。接著濃縮反應物以去除EtOH，倒入水中，且萃取至EtOAc中(3次)。將合併之有機層用鹽水洗滌2次，用無水硫酸鈉(Na2 SO4 )乾燥，過濾且在真空中濃縮。使用矽膠層析(20-100%於石油醚中之EtOAc、之後MeOH)純化粗殘餘物，提供黃色固體狀期望產物(4 g，12 mmol，35%產率)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 3.99 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.57 (t,J = 5.2 Hz, 2H), 2.69 (t,J = 5.2 Hz, 2H), 2.54 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.22 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 1.56-1.20 (m, 24H), 0.81 (t,J = 6.8 Hz, 3H) ppm。 中間體1c：8-溴辛醛
Figure 02_image189
向8-溴辛-1-醇(45.1 mL，263 mmol)於DCM (700 mL)中之溶液中添加氯鉻酸吡啶鎓鹽(PCC) (1-2當量)。於15℃下攪拌至少2 h後，過濾反應混合物且在真空中濃縮。使用矽膠層析(2-20%於石油醚中之EtOAc)純化粗殘餘物，提供無色油狀期望產物(37.5 g，163.0 mmol，62%產率)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 9.77 (t,J = 1.8 Hz, 1H), 3.40 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.43 (m, 2H), 1.86 (m, 2H), 1.63 (m, 2H), 1.45 (m, 2H) 1.34 (m, 4H) ppm。 中間體1d：8-溴-1,1-二辛氧基-辛烷
Figure 02_image191
向8-溴辛醛(12.5 g，60.3 mmol)及辛-1-醇(2-3當量)於DCM (300 mL)中之溶液中添加對甲苯磺酸一水合物(0.1-0.2當量)及Na2 SO4 (2-3當量)。將反應混合物於15℃下攪拌至少24 h，接著過濾，且在真空中濃縮。使用矽膠層析(100%石油醚)純化粗殘餘物，提供無色油狀期望產物(6 g，13.4 mmol，22%產率)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.6 Hz, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 1.84 (m, 2H), 1.59 (m, 6H), 1.33-1.28 (m, 34H), 0.89 (t,J = 6.6 Hz, 6H) ppm。 化合物1：8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image010
將中間體1d (1 g，2.22 mmol)、中間體1b (0.9-1.1當量)、K2 CO3 (2-4當量)及KI (0.1-0.5當量)於3:1 MeCN/CPME (0.1-0.5 M)中之混合物脫氣且用N2 吹掃三次。將反應混合物升溫至82℃且在惰性氣氛下攪拌至少2 h。接著將反應混合物用水稀釋且萃取至EtOAc中至少2次。將合併之有機層用鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，過濾，且在真空中濃縮。使用矽膠層析(10-33%於石油醚中之EtOAc)純化粗殘餘物，提供無色油狀期望產物(700 mg，1.00 mmol，45%產率)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.50 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.54 (m, 4H), 3.40 (m, 2H), 2.56 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.42 (t,J = 7.4 Hz, 4H), 2.29 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.58 (m, 10H), 1.45-1.21 (m, 50H) 0.88 (t,J = 6.8 Hz, 9H) ppm。MS: 699.29 m/z [M+H]。 實例2-化合物2 中間體2a：1-(8-溴-1-壬氧基-辛氧基)壬烷
Figure 02_image194
中間體2a係自中間體1c及壬-1-醇使用中間體1d所採用之方法以24%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 1.86 (m, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.33 (m, 32H), 0.89 (6,J = 6.8 Hz, 6H) ppm。 化合物2：8-[8,8-二(壬氧基)辛基-(2-羥基乙基)胺基]辛酸酯
Figure 02_image012
化合物2係自中間體1b及中間體2a使用化合物1所採用之方法以54%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.50 (t,J = 5.6 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.54 (m, 4H), 3.40 (m, 2H), 2.56 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.42 (t,J = 7.4 Hz, 4H), 2.29 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.58 (m, 10H), 1.46-1.21 (m, 54H), 0.88 (t,J = 6.6 Hz, 9H) ppm。MS: 727.01 m/z [M+H]。 實例3-化合物3 中間體3a：1-(8-溴-1-癸氧基-辛氧基)癸烷
Figure 02_image196
中間體3a係自中間體1c及癸-1-醇使用中間體1d所採用之方法以24%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 4H), 1.86 (m, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.33 (m, 36H), 0.89 (t,J = 6.8 Hz, 6H) ppm。 化合物3：8-[8,8-二癸氧基辛基(2-羥基乙基)胺基]辛酸壬酯
Figure 02_image014
化合物3係自中間體1b及中間體3a使用化合物1所採用之方法以28%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.50 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.53 (m, 4H), 3.39 (m, 2H), 2.56 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.43 (t,J = 7.4 Hz, 4H), 2.29 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.58 (m, 10H), 1.46-1.20 (m, 58H), 0.88 (t,J = 6.6 Hz, 9H) ppm。MS: 755.04 m/z [M+H]。 實例4-化合物4 中間體4a：10-溴辛醛
Figure 02_image198
中間體4a係自10-溴辛醇使用中間體1c所採用之方法以55%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 9.77 (s, 1H), 3.41 (t,J = 7.0 Hz, 2H), 2.42 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 1.85 (m, 2H), 1.63 (m, 2H), 1.42 (m, 2H), 1.30 (m, 8H) ppm。 中間體4b：10-溴-1,1-二庚氧基-癸烷
Figure 02_image200
中間體4b係自中間體4a及庚-1-醇使用中間體1d所採用之方法以32%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 1.86 (m, 2H), 1.58 (m, 6H), 1.33 (m, 28H), 0.89 (t,J = 7.0 Hz, 6H) ppm。 化合物4：8-[10, 10-二庚氧基癸基(2-羥基乙基)胺基]辛酸壬酯
Figure 02_image016
化合物4係自中間體1b及中間體4b使用化合物1所採用之方法以19%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.6 Hz, 2H), 3.55 (m, 4H), 3.40 (m, 4H), 2.59 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.45 (m, 4H), 2.29 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 1.59 (m, 10H), 1.44-1.22 (m, 50H), 0.88 (t,J = 7.0Hz, 9H) ppm。MS: 699.53 m/z [M+H]。 實例5-化合物5 中間體5a：10-溴-1,1-二庚氧基-癸烷
Figure 02_image203
中間體5a係自中間體4a及辛-1-醇使用中間體1d所採用之方法以34%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.45 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 3.55 (m, 2H), 3.40 (m, 4H), 1.85 (m, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.33 (m, 32 H), 0.88 (t,J = 6.8 Hz, 6H) ppm。 化合物5：8-[10,10-二辛氧基癸基(2-羥基乙基)胺基]辛酸酯
Figure 02_image018
化合物5係自中間體1b及中間體5a使用化合物1所採用之方法以27%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 4.06 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.56 (m, 4H), 3.40 (m, 2H), 2.58 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.45 (m, 4H), 2.29 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.59 (m, 10H), 1.47-1.25 (m, 54H), 0.89 (t,J = 6.6 Hz, 9H) ppm。UPLC-MS-ELS: r.t. = 6.58 min, 727.54 m/z [M+H]。 實例6-化合物6 中間體6a：10-溴-1,1-雙(壬基氧基)癸烷
Figure 02_image205
中間體6a係自中間體4a及壬-1-醇使用中間體1d所採用之方法以41%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 1.86 (m, 2H), 1.58 (m, 6H), 1.42-1.28 (m, 36H), 0.89 (t,J = 6.8 Hz, 6H) ppm。 化合物6：8-[10,10-二(壬氧基)癸基-(2-羥基乙基)胺基]辛酸酯
Figure 02_image207
化合物6係自中間體1b及中間體6a使用化合物1所採用之方法以41%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.45 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.54 (m, 4H), 3.39 (m, 2H), 2.57 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.44 (t,J = 7.6 Hz, 4H), 2.29 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.58 (m, 10H), 1.46-1.24 (m, 58H), 0.88 (t,J = 6.6 Hz, 9H) ppm。MS: 755.71 m/z [M+H]。 實例7-化合物7 中間體7a：8-溴-1,1-雙(庚基氧基)辛烷
Figure 02_image209
中間體7a係自中間體1c及庚-1-醇使用中間體1d所採用之方法以39%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 1.86 (m, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.32 (m, 24H), 0.89 (t,J = 7.0 Hz, 6H) ppm。 化合物7：8-((8,8-雙(庚基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image020
化合物7係自中間體1b及中間體7a使用化合物1所採用之方法以22%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.45 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.60 - 3.48 (m, 4H), 3.40 (m, 2H), 2.56 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.43 (dd,J = 8.5, 6.3 Hz, 4H), 2.29 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.67 - 1.52 (m, 10H), 1.48-1.19 (m, 46H), 0.88 (m, 9H) ppm。MS: 671.66 m/z [M+H]。 實例8-化合物8 中間體8a：8-溴-1,1-雙(己基氧基)辛烷
Figure 02_image211
中間體8a係自中間體1c及己-1-醇使用中間體1d所採用之方法以38%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.6 Hz, 1H), 3.57 (m, 2H), 3.40 (m, 4H), 1.85 (m, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.35 (m, 20H), 0.89 (t,J = 6.8 Hz, 6H) ppm。 化合物8：8-((8,8-雙(己基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image022
化合物8係自中間體1b及中間體8a使用化合物1所採用之方法以13%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.45 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.60 - 3.49 (m, 4H), 3.40 (m, 2H), 2.57 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.43 (t,J = 7.6 Hz, 4H), 2.29 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.58 (m, 10H), 1.47 - 1.19 (m, 42H), 0.88 (m, 9H) ppm。MS: 643.58 m/z [M+H]。 實例9-化合物9 中間體9a：9-溴壬醛
Figure 02_image213
中間體9a係自9-溴辛醇使用中間體1c所採用之方法以40%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 9.70 (t,J = 1.8 Hz, 1H), 3.34 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.36 (m, 2H), 1.78 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.26 (m, 6H) ppm。 中間體9b：9-溴-1,1-雙(辛基氧基)壬烷
Figure 02_image215
中間體9b係自中間體9a及辛-1-醇使用中間體1d所採用之方法以44%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.6 Hz, 1H), 3.57 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 1.86 (m, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.31 (m, 30H), 0.89 (t,J = 6.8 Hz, 6H) ppm。 化合物9：8-((9,9-雙(辛基氧基)壬基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image024
化合物9係自中間體1b及中間體9b使用化合物1所採用之方法以17%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.45 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.62 - 3.49 (m, 4H), 3.40 (m, 2H), 2.57 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.44 (t,J = 7.6 Hz, 4H), 2.29 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.58 (m, 10H), 1.48 - 1.19 (m, 52H), 0.88 (t,J = 6.6 Hz, 9H) ppm。MS: 713.52 m/z [M+H]。 實例10-化合物10 中間體10a：7-溴庚醛
Figure 02_image217
中間體10a係自7-溴庚醇使用中間體1c所採用之方法以35%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 9.77 (s, 1H), 3.41 (t,J = 6.6 Hz, 2H), 2.44 (m, 2H), 1.87 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.47 (m, 2H), 1.37 (m, 2H) ppm。 中間體10b：1-((7-溴-1-(辛基氧基)庚基)氧基)辛烷
Figure 02_image219
中間體10b係自中間體10a及辛-1-醇使用中間體1d所採用之方法以42%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.6 Hz, 1H), 3.57 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 1.85 (m, 2H), 1.58 (m, 6H), 1.33 (m, 26H), 0.89 (t,J = 6.8 Hz, 6H) ppm。 化合物10：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image026
化合物10係自中間體1b及中間體10b使用化合物1所採用之方法以19%產率合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 4.46 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.59 - 3.49 (m, 4H), 3.39 (m, 2H), 2.56 (t,J = 5.4 Hz, 2H), 2.43 (t,J = 7.4 Hz, 4H), 2.29 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.58 (m, 10H), 1.47 - 1.21 (m, 48H), 0.88 (t,J = 6.6 Hz, 9H) ppm。MS: 685.75 m/z [M+H]。 實例11-化合物11 中間體11a：2-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)胺基)乙-1-醇
Figure 02_image221
向中間體1d (24 g，115.88 mmol)及辛-1-醇(2-4當量)於DCM (240 mL)中之溶液中添加TsOH·H2 O (0.1-0.3當量)及Na2 SO4 (2-3當量)。將混合物於25℃下攪拌至少12 h。在完成後，在減壓下濃縮反應混合物以去除DCM。將殘餘物用水稀釋且用EtOAc萃取3次。將合併之有機層用鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，產生殘餘物。藉由管柱層析(EtOAc/己烷)純化殘餘物，得到無色油狀產物(25 g，48%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.38 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 3.61 - 3.54 (m, 2H), 3.49 (dt,J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 3.33 (dt,J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.75 - 2.66 (m, 2H), 2.55 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 1.97 (d,J = 12.5 Hz, 3H), 1.58 - 1.35 (m, 8H), 1.34 - 1.01 (m, 27H), 0.93 - 0.72 (m, 6H) ppm。MS: 430.4 m/z [M+H]。 中間體11b：10-溴癸酸庚酯
Figure 02_image223
中間體11b係自10-溴癸酸及庚-1-醇使用中間體1a所採用之方法以32%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 3.99 (t,J = 6.7 Hz, 2H), 3.33 (t,J = 6.9 Hz, 2H), 2.22 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.83 - 1.68 (m, 2H), 1.55 (d,J = 14.3 Hz, 4H), 1.35 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.22 (m, 16H), 0.86 - 0.78 (m, 3H) ppm。 化合物11：10-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)癸酸庚酯
Figure 02_image028
化合物11係自中間體11a及中間體11b使用化合物11所採用之方法以19%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t,J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.67 - 3.60 (m, 2H), 3.55 (dt,J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt,J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.70 (s, 2H), 2.58 (s, 4H), 2.29 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.67 - 1.44 (m, 15H), 1.29 (m, 46H), 0.94 - 0.81 (m, 9H) ppm。MS: 699.35 m/z [M+H]。 實例12-化合物12 中間體12a：7-溴庚酸癸酯
Figure 02_image226
中間體12a係自7-溴庚酸及癸-1-醇使用中間體1a所採用之方法以26%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.09 (t,J = 6.7 Hz, 2H), 3.44 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.34 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.96 - 1.83 (m, 2H), 1.70 - 1.57 (m, 4H), 1.49 (m, 2H), 1.44 - 1.22 (m, 16H), 0.97 - 0.85 (m, 3H) ppm。 化合物12：7-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)庚酸癸酯
Figure 02_image030
化合物12係自中間體11a及中間體12a使用化合物11所採用之方法以56%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t,J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.60 - 3.51 (m, 4H), 3.40 (dt,J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.61 (t,J = 5.3 Hz, 2H), 2.55 - 2.41 (m, 4H), 2.29 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.69 - 1.51 (m, 10H), 1.51 - 1.20 (m, 49H), 0.94 - 0.83 (m, 9H) ppm。MS: 699.52 m/z [M+H]。 實例13-化合物13 中間體13a：6-溴己酸十一烷基酯
Figure 02_image228
中間體13a係自6-溴己酸及十一-1-醇使用中間體1a所採用之方法以22%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.06 (t,J = 6.7 Hz, 2H), 3.40 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.31 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 1.87 (dt,J = 14.2, 6.9 Hz, 2H), 1.70 - 1.57 (m, 4H), 1.53 - 1.42 (m, 2H), 1.38 - 1.19 (m, 16H), 0.87 (t,J = 6.7 Hz, 3H) ppm。 化合物13：6-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)己酸十一烷基酯
Figure 02_image032
化合物13係自中間體11a及中間體13a使用化合物11所採用之方法以64%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t,J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.60 - 3.52 (m, 4H), 3.40 (dt,J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.62 (t,J = 5.3 Hz, 2H), 2.50 (q,J = 6.7 Hz, 4H), 2.30 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.70 - 1.40 (m, 15H), 1.40 - 1.17 (m, 45H), 0.93 - 0.83 (m, 9H) ppm。MS: 699.31 m/z [M+H]。 實例14-化合物14 中間體14a：5-溴戊酸十二烷基酯
Figure 02_image231
中間體14a係自5-溴戊酸及十二-1-醇使用中間體1a中所採用之方法以21%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.00 (t,J = 6.7 Hz, 2H), 3.35 (t,J = 6.6 Hz, 2H), 2.27 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 1.83 (m, 2H), 1.71 (m, 2H), 1.55 (t,J = 7.1 Hz, 2H), 1.31 - 1.13 (m, 18H), 0.85 - 0.78 (m, 3H) ppm。 化合物14：5-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)戊酸十二烷基酯
Figure 02_image034
化合物14係自中間體11a及中間體14a使用化合物11所採用之方法以62%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t,J = 5.7 Hz, 1H), 4.06 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.63 - 3.49 (m, 4H), 3.40 (dt,J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.62 (t,J = 5.3 Hz, 2H), 2.58 - 2.44 (m, 4H), 2.32 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 1.68 - 1.40 (m, 15H), 1.40 - 1.19 (m, 47H), 0.94 - 0.83 (m, 9H) ppm。MS: 699.48 m/z [M+H]。 實例15-化合物15 中間體15a：8-溴辛酸庚酯
Figure 02_image233
中間體15a係自8-溴辛酸及庚-1-醇使用中間體1a所採用之方法以15%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 3.99 (t,J = 6.7 Hz, 2H), 3.33 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.23 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.78 (m, 2H), 1.63 - 1.50 (m, 4H), 1.42 - 1.13 (m, 14H), 0.87 - 0.77 (m, 3H) ppm。 化合物15：8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸庚酯
Figure 02_image235
化合物15係自中間體11a及中間體15a使用化合物11所採用之方法以64%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t,J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t,J = 6.7 Hz, 2H), 3.62 - 3.50 (m, 4H), 3.40 (dt,J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.64 (t,J = 5.2 Hz, 2H), 2.51 (t,J = 7.6 Hz, 4H), 2.29 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.66 - 1.40 (m, 15H), 1.40 - 1.19 (m, 43H), 0.88 (m, 9H) ppm。MS: 671.84 m/z [M+H]。 實例16-化合物16 中間體16a：(Z)-8-溴辛酸壬-2-烯-1-基酯
Figure 02_image237
中間體16a係自8-溴辛酸及(Z)-壬-2-烯-1-醇使用中間體1a所採用之方法以26%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 5.70 - 5.58 (m, 1H), 5.58 - 5.47 (m, 1H), 4.62 (dd,J = 6.9, 1.3 Hz, 2H), 3.40 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.30 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 2.09 (m, 2H), 1.85 (m, 2H), 1.67 - 1.58 (m, 2H), 1.52 - 1.09 (m, 13H), 0.94 - 0.80 (m, 3H) ppm。 化合物16：(Z)-8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸壬-2-烯-1-基酯
Figure 02_image038
化合物16係自中間體11a及中間體16a使用化合物11所採用之方法以59%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 5.70 - 5.58 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 4.62 (dd,J = 6.9, 1.3 Hz, 2H), 4.45 (t,J = 5.7 Hz, 1H), 3.64 - 3.48 (m, 4H), 3.40 (dt,J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.64 (t,J = 5.3 Hz, 2H), 2.51 (t,J = 7.6 Hz, 4H), 2.30 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 2.09 (m, 2H), 1.68 - 1.41 (m, 12H), 1.41 - 1.18 (m, 41H), 0.96 - 0.81 (m, 9H) ppm。MS: 697.33 m/z [M+H]。MS: 697.33 m/z [M+H]。 實例17-化合物17 中間體17a：8-溴辛酸十一-3-基酯
Figure 02_image240
中間體17a係自8-溴辛酸及十一-3-醇使用中間體1a所採用之方法以50%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.74 (m, 1H), 3.33 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.22 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.85 - 1.67 (m, 2H), 1.62 - 1.09 (m, 25H), 0.89 - 0.74 (m, 6H) ppm。 化合物17：8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸十一-3-基酯
Figure 02_image040
化合物17係自中間體11a及中間體17a使用化合物11所採用之方法以65%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.80 (m, 1H), 4.45 (t,J = 5.8 Hz, 1H), 3.55 (dt,J = 9.3, 6.4 Hz, 4H), 3.40 (dt,J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.62 (t,J = 5.3 Hz, 2H), 2.49 (t,J = 7.6 Hz, 4H), 2.28 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.66 - 1.40 (m, 16H), 1.40 - 1.17 (m, 45H), 0.87 (m, 12H) ppm。MS: 727.34 m/z [M+H]。 實例18-化合物18 化合物18：8-((2-羥基乙基)(8-(壬基氧基)-8-側氧基辛基)胺基)辛酸十七-9-基酯
Figure 02_image152
化合物18係根據Mol. Ther. 2018 ,26 , 1509-1519 (化合物5)及US 2017/0210698 A1 (化合物18)中所述之方法來合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.86 (m, 1H), 4.05 (t,J = 6.7 Hz, 2H), 3.59 (br t,J = 5.1 Hz, 2H), 2.75 - 2.39 (br m, 6H), 2.28 (m, 4H), 1.61 (m, 6H), 1.49 (m, 8H), 1.38 - 1.20 (m, 49H), 0.87 (m, 9H) ppm；MS: 711 m/z [M+H]。 實例19-化合物19 化合物19：(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-(((((3-(二乙基胺基)丙氧基))-羰基)氧基)甲基)丙基酯
Figure 02_image154
化合物19係根據WO 2015/095340 Al (實例13)中所述之方法來合成。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 5.35 (m, 4H), 4.48 (t,J = 5.6 Hz, 1H), 4.17 (m, 8H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.77 (t,J = 6.6 Hz, 2H), 2.55 (q,J = 7.2 Hz, 6H), 2.40 (m, 3H), 2.30 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q,J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.30 (m, 34H), 1.03 (t,J = 7.2 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm；MS: 853 m/z [M+H]。 實例20-化合物20 中間體20a：7-溴-1,1-雙(庚基氧基)庚烷
Figure 02_image244
中間體20a係自中間體10a及庚-1-醇使用中間體1d所採用之方法以24%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 9.77 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.44 (td, J = 7.3, 1.7 Hz, 2H), 2.33 (dt, J = 25.0, 7.4 Hz, 1H), 1.93 - 1.79 (m, 4H), 1.71 - 1.53 (m, 5H), 1.51 - 1.29 (m, 9H). 化合物20：8-((7,7-雙(庚基氧基)庚基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image246
化合物20係自中間體1b及中間體20a使用化合物1所採用之方法以60%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 5.9 Hz, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.49 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.67 - 1.41 (m, 15H), 1.41 - 1.19 (m, 40H), 0.96 - 0.81 (m, 9H)。MS: 657.2 m/z [M+H]。 實例21-化合物21 中間體21a：8-溴辛酸癸-2-基酯
Figure 02_image248
向含有8-溴辛酸(2.0 g，1.0當量)於DCM (0.4 M)中之溶液中添加癸-2-醇(1.0當量)、DMAP (0.2當量)、Et3 N (3.5當量)及EDCI (1.2當量)。將反應物於室溫下攪拌168 h。完成後，藉由添加水及DCM淬滅反應。將有機層用1 M HCl洗滌1次且用5% NaHCO3 洗滌1次。有機層經Na2 SO4 乾燥，過濾，且濃縮。藉由管柱(EtOAc/hex)純化，得到無色油狀產物(485 mg，12%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.97 - 4.82 (m, 1H), 3.53 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.76 (dq, J = 7.8, 6.8 Hz, 2H), 1.66 - 1.58 (m, 2H), 1.51 - 1.40 (m, 3H), 1.37 - 1.23 (m, 15H), 1.19 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.93 - 0.84 (m, 3H)。 化合物21：8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸癸-2-基酯
Figure 02_image250
化合物21係自中間體11a及中間體21a使用化合物11所採用之方法以29%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.89 (ddt, J = 12.1, 7.4, 6.3 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.62 - 3.50 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.64 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.51 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.26 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.66 - 1.40 (m, 15H), 1.29 (dd, J = 16.9, 6.2 Hz, 44H), 1.19 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.95 - 0.82 (m, 9H)。MS: 713.5 m/z [M+H]。 實例22-化合物22 中間體22a：十一酸6-溴己酯
Figure 02_image252
將十一酸(5 g，1.0當量)、6-溴己-1-醇(1.0當量)、EDCI (1.0當量)、DMAP (0.16當量)及DIPEA (3.0當量)於DCM (0.2 M)中之混合物脫氣且用N2 吹掃3次，且接著將混合物於20℃下在惰性氣氛下攪拌5 h。完成後，在減壓下濃縮反應混合物以去除DCM。將殘餘物用H2 O稀釋且用EtOAc萃取3次。合併之有機層經Na2 SO4 乾燥，過濾，且濃縮。藉由管柱(EtOAc/己烷)純化，得到無色油狀產物(2.3 g，25%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.00 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.34 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.84 - 1.74 (m, 2H), 1.63 - 1.50 (m, 4H), 1.45 - 1.36 (m, 2H), 1.36 - 1.28 (m, 2H), 1.20 (d, J = 9.9 Hz, 15H), 0.86 - 0.78 (m, 3H)。 化合物22：十一酸6-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)己酯
Figure 02_image254
化合物22係自中間體11a及中間體22a使用化合物11所採用之方法以63%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.64 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.71 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.69 - 1.05 (m, 62H), 0.95 - 0.79 (m, 9H)。MS: 699.4 m/z [M+H]。 實例23-化合物23 中間體23a：壬酸8-溴辛酯
Figure 02_image256
中間體23a係自壬酸及8-溴辛-1-醇使用中間體22a中所採用之方法以19%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 3.99 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.34 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.78 (p, J = 6.9 Hz, 2H), 1.55 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 1.42 - 1.10 (m, 19H), 0.87 - 0.74 (m, 3H)。 化合物23：壬酸8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酯
Figure 02_image258
化合物23係自中間體11a及中間體23a使用化合物11所採用之方法以32%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.63 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.58 (t, J = 7.7 Hz, 4H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.68 - 1.17 (m, 65H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 9H)。MS: 699.4 m/z [M+H]。 實例24-化合物24 中間體24a：庚酸10-溴癸酯
Figure 02_image260
中間體24a係自庚酸及10-溴癸-1-醇使用中間體22a中所採用之方法以26%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.85 (dt, J = 14.5, 6.9 Hz, 2H), 1.61 (p, J = 7.7, 7.2 Hz, 4H), 1.48 - 1.23 (m, 18H), 0.93 - 0.84 (m, 3H)。 化合物24：庚酸10-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)癸酯
Figure 02_image262
化合物24係自中間體11a及中間體24a使用化合物11所採用之方法以40%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.66 - 3.50 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 2.69 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.69 - 0.98 (m, 63H), 0.97 - 0.70 (m, 9H)。MS: 699.6 m/z [M+H]。 實例25-化合物25 中間體25a：8-溴-1,1-雙(1-甲基庚氧基)辛烷
Figure 02_image264
向8-溴辛醛(100 mg，1.0當量)於辛-2-醇(15當量)中之溶液中添加硫酸(0.1當量)。將混合物於20℃下攪拌12 h。完成後，將反應混合物用冰水淬滅且用EtOAc萃取2次。在減壓下濃縮合併之有機層且藉由管柱(EtOAc/己烷)純化，以得到無色油狀產物(20 mg，9%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.44 (td, J = 5.6, 3.9 Hz, 1H), 3.64 - 3.49 (m, 2H), 3.33 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.78 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 1.60 - 1.41 (m, 4H), 1.41 - 1.14 (m, 24H), 1.10 (dd, J = 6.2, 2.2 Hz, 3H), 1.03 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 0.81 (td, J = 6.8, 2.5 Hz, 6H)。 化合物25：8-[8,8-雙(1-甲基庚氧基)辛基-(2-羥基乙基)胺基]辛酸壬酯
Figure 02_image266
化合物25係自中間體1b及中間體25a使用化合物1所採用之方法來合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.46 - 4.40 (m, 1H), 3.99 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.57 (tq, J = 11.4, 5.9 Hz, 2H), 3.47 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.52 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.39 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.22 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.61 - 1.42 (m, 7H), 1.41 - 1.15 (m, 39H), 1.10 (dd, J = 6.2, 2.1 Hz, 3H), 1.03 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 0.81 (t, J = 6.5 Hz, 9H)。MS: 699.7 m/z [M+H]。 實例26-化合物26 化合物26：8-((2-羥基乙基)(10-辛基十八烷基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image268
化合物26係根據WO 2017/049245 A3 (實例153)中所述之方法來合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 3.99 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.46 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.51 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.22 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.54 (t, J = 7.1 Hz, 5H), 1.37 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.33 - 1.07 (m, 63H), 0.81 (t, J = 6.6 Hz, 9H)。MS: 694.6 m/z [M+H]。 實例27-化合物27 中間體27a：8-溴辛酸辛-2-基酯
Figure 02_image270
於0℃下在惰性氣氛下向8-溴辛酸(10 g，1.1當量)及辛-2-醇(1.0當量)於DCM (150 mL)中之混合物中一次性添加EDCI (1.1當量)、DMAP (0.1當量)及DIPEA (3.0當量)。將混合物於15℃下攪拌至少12 h。完成後，在減壓下濃縮反應混合物，且藉由管柱層析純化所得粗殘餘物，得到無色油狀產物(4.1 g，30%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.90 - 4.76 (m, 1H), 3.33 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.78 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 1.60 - 1.46 (m, 3H), 1.39 (dt, J = 15.5, 6.6 Hz, 3H), 1.31 - 1.16 (m, 12H), 1.13 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.86 - 0.77 (m, 3H)。 化合物27：8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸辛-2-基酯
Figure 02_image272
化合物27係自中間體11a及中間體27a使用化合物11所採用之方法以45%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.93 - 4.84 (m, 1H), 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.78 (s, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (d, J = 52.0 Hz, 5H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.93 - 1.40 (m, 17H), 1.39 - 1.21 (m, 37H), 1.19 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.99 - 0.67 (m, 9H)。MS: 685.6 m/z [M+H]。 實例28-化合物28 中間體28a：8-溴辛酸壬-3-基酯
Figure 02_image274
中間體28a係自8-溴辛酸及壬-3-醇使用中間體27a所採用之方法以31%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.75 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 3.33 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.78 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 1.55 (td, J = 8.9, 8.2, 5.7 Hz, 2H), 1.47 (dtd, J = 14.2, 7.1, 3.2 Hz, 4H), 1.36 (dt, J = 10.1, 6.4 Hz, 2H), 1.32 - 1.12 (m, 12H), 0.88 - 0.76 (m, 6H)。 化合物28：8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸壬-3-基酯
Figure 02_image276
化合物28係自中間體11a及中間體28a使用化合物11所採用之方法以53%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.81 (ddd, J = 12.5, 6.9, 5.5 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.80 (s, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 2.81 (s, 5H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.79 - 1.40 (m, 18H), 1.40 - 1.02 (m, 42H), 0.95 - 0.73 (m, 12H)。MS: 699.3 m/z [M+H]。 實例29-化合物29 中間體29a：8-溴辛酸戊酯
Figure 02_image278
中間體29a係自8-溴辛酸及戊-1-醇使用中間體27a所採用之方法以47%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 3.99 (td, J = 6.8, 1.6 Hz, 2H), 3.33 (td, J = 6.8, 1.6 Hz, 2H), 2.23 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.84 - 1.75 (m, 2H), 1.56 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.47 - 1.33 (m, 2H), 1.26 (qt, J = 5.0, 1.8 Hz, 8H), 0.86 - 0.80 (m, 3H)。 化合物29：8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸戊酯
Figure 02_image280
化合物29係自中間體11a及中間體29a使用化合物11所採用之方法以58%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.44 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.94 (s, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.03 (d, J = 38.0 Hz, 5H), 2.29 (dd, J = 8.5, 6.4 Hz, 2H), 1.79 (s, 4H), 1.67 - 1.41 (m, 14H), 1.41 - 1.12 (m, 37H), 1.02 - 0.76 (m, 9H)。MS: 643.4 m/z [M+H]。 實例30-化合物30 中間體30a：8-溴辛酸庚-3-基酯
Figure 02_image281
中間體30a係自8-溴辛酸及庚-3-醇使用中間體27a所採用之方法以47%產率合成。 化合物30：8-((8,8-雙(辛基氧基)辛基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸庚-3-基酯
Figure 02_image060
化合物30係自中間體11a及中間體30a使用化合物11所採用之方法以66%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.81 (ddd, J = 12.5, 6.8, 5.5 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.77 (d, J = 53.2 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.71 (s, 5H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.83 - 1.44 (m, 17H), 1.30 (dq, J = 18.1, 3.8, 3.2 Hz, 37H), 1.02 - 0.69 (m, 12H)。MS: 671.5 m/z [M+H]。 實例31-化合物31 中間體31a：2-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)胺基)乙-1-醇
Figure 02_image283
向中間體10b (15 g，1.0當量)於EtOH (22 mL)中之溶液中添加2-胺基乙醇(30當量)。將混合物於15℃下攪拌12 h。完成後，在減壓下濃縮反應混合物，得到殘餘物，藉由管柱層析對其進行純化。濃縮含有產物之部分後，將所得殘餘物重構於MeCN中且用己烷萃取3次。濃縮合併之己烷層，得到無色油狀產物(10.55 g，73%產率)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.47 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.68 - 3.62 (m, 2H), 3.58 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 3.42 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 2.82 - 2.76 (m, 2H), 2.63 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.67 - 1.45 (m, 8H), 1.45 - 1.19 (m, 26H), 0.96 - 0.84 (m, 6H)。 化合物31：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸庚酯
Figure 02_image062
化合物31係自中間體31a及中間體15a使用化合物11所採用之方法以68%產率合成。1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.73 (s, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 2.58 (d, J = 135.2 Hz, 6H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.59 (ddt, J = 21.1, 14.3, 6.8 Hz, 15H), 1.44 - 1.02 (m, 40H), 0.88 (td, J = 7.0, 2.9 Hz, 9H)。MS: 657.4 m/z [M+H]。 實例32-化合物32 化合物32：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸辛-2-基酯
Figure 02_image285
化合物32係自中間體31a及中間體27a使用化合物11所採用之方法以64%產率合成。1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ 4.89 (h, J = 6.3 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.55 (dt, J = 9.4, 6.8 Hz, 5H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.8 Hz, 2H), 3.07 - 2.32 (m, 7H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.79 - 1.40 (m, 15H), 1.40 - 1.22 (m, 38H), 1.19 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H)。MS: 671.4 m/z [M+H]。 實例33-化合物33 化合物33：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸壬-3-基酯
Figure 02_image287
化合物33係自中間體31a及中間體28a使用化合物11所採用之方法以60%產率合成。1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ 4.81 (p, J = 6.3 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.89 - 2.40 (m, 5H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.57 (dtt, J = 21.7, 14.5, 6.4 Hz, 14H), 1.41 - 1.08 (m, 35H), 0.88 (td, J = 7.1, 2.8 Hz, 10H)。MS: 685.7 m/z [M+H]。 實例34-化合物34 化合物34：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸戊酯
Figure 02_image289
化合物34係自中間體31a及中間體29a使用化合物11所採用之方法以72%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.94 - 2.40 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.83 - 1.43 (m, 15H), 1.42 - 1.09 (m, 36H), 0.89 (dt, J = 11.2, 7.0 Hz, 9H)。MS: 629.4 m/z [M+H]。 實例35-化合物35 化合物35：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-羥基乙基)胺基)辛酸庚-3-基酯
Figure 02_image290
化合物35係自中間體31a及中間體30a使用化合物11所採用之方法以73%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.85 - 4.78 (m, 1H), 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.68 (s, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.86 - 2.37 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.53 (dtd, J = 14.4, 7.4, 5.6 Hz, 16H), 1.43 - 1.08 (m, 37H), 0.97 - 0.80 (m, 12H)。MS: 657.6 m/z [M+H]。 實例36-化合物36 化合物36：8-((2-胺基乙基)(7,7-雙(辛基氧基)庚基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image291
於0℃下在惰性氣氛下向化合物10 (5.1 g，1.0當量)及TEA (1.35 mL，1.3當量)於DCM (50 mL)中之混合物中逐滴添加MsCl (721 uL，1.25當量)。將混合物於15℃下攪拌12 h。TLC指示起始物質完全消耗。將反應物用H2 O稀釋且用DCM萃取2次，經Na2 SO4 乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液，產生殘餘物。
將所得粗製甲磺酸鹽溶解於DMF (60 mL)中，之後於15℃下在惰性氣氛下一次性添加NaN3 (2.78 g，5.0當量)。將混合物於100℃下攪拌4 h。TLC指示完全置換。將反應混合物用H2 O稀釋且用EtOAc萃取2次，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液，產生殘餘物。
將所得粗製疊氮化物溶解於EtOH (5 mL)中，之後在惰性氣氛下添加Pd/C (1 g，10% w/w)。將懸浮液在真空下脫氣且用H2 吹掃若干次。將混合物於15℃下在H2 (15 psi)下攪拌12 h。完成後，過濾反應混合物且在減壓下濃縮濾液，產生殘餘物。藉由管柱層析純化殘餘物三次，之後將分離之物質用MeCN及己烷洗滌，得到黃色油狀產物(2.3 g，39%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.80 (s, 3H), 4.38 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.98 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.48 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.33 (dt, J = 9.5, 6.8 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.50 - 2.36 (m, 4H), 2.22 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.62 - 1.33 (m, 15H), 1.33 - 1.04 (m, 45H), 0.81 (t, J = 6.6 Hz, 9H)。MS: 683.6 m/z [M+H]。 實例37-化合物37 中間體37a：8-((3-羥基丙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image293
將8-溴辛酸壬酯(10 g，1.0當量)及3-胺基丙-1-醇(66.22 mL，30當量)於EtOH (15 mL)中之混合物於20℃下攪拌12小時。完成後，在減壓下濃縮反應混合物，產生殘餘物。藉由管柱層析純化殘餘物，得到無色油狀產物(10 g)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.07 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.84 (dt, J = 10.5, 5.4 Hz, 2H), 3.66 (t, J = 5.6 Hz, 6H), 3.43 (q, J = 6.2 Hz, 6H), 2.89 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.61 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.03 (s, 10H), 1.66 (dt, J = 29.5, 6.6 Hz, 14H), 1.47 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.31 (d, J = 14.6 Hz, 16H), 0.90 (t, J = 6.6 Hz, 3H)。 化合物37：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(3-羥基丙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image295
化合物37係自中間體1b及中間體37 a使用化合物1所採用之方法以30%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.47 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.81 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.60 - 3.55 (m, 2H), 3.42 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 3H), 2.68 - 2.62 (m, 2H), 2.47 - 2.38 (m, 4H), 2.31 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.61 (dt, J = 21.4, 7.2 Hz, 21H), 1.31 (dt, J = 15.0, 4.1 Hz, 51H), 0.90 (t, J = 6.7 Hz, 9H)。MS: 698.7 m/z [M+H]。 實例38-化合物38 化合物38：8-((3-胺基丙基)(7,7-雙(辛基氧基)庚基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image297
化合物38係自化合物37使用化合物36所採用之方法合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.38 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.98 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.48 (dt, J = 9.5, 6.7 Hz, 2H), 3.33 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (q, J = 5.2, 4.0 Hz, 2H), 2.48 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.43 - 2.31 (m, 4H), 2.22 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.54 (dtd, J = 28.3, 13.8, 6.7 Hz, 12H), 1.43 - 1.11 (m, 49H), 0.81 (t, J = 6.7 Hz, 9H)。MS: 697.8 m/z [M+H]。 實例39-化合物39 化合物39：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-((甲基胺甲醯基)氧基)乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image299
向化合物10 (1.0當量)於甲苯(0.1 M)中之混合物中添加異氰酸甲酯(1.4當量)。將反應物於23℃下攪拌24 h，之後於60℃下攪拌48 h。完成後，將反應物用水稀釋且用DCM萃取3次。濃縮合併之有機層且藉由管柱層析純化，得到產物(33%)。1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ 4.44 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.19 (s, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.79 (d, J = 4.9 Hz, 3H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.58 (dp, J = 21.1, 7.0 Hz, 13H), 1.31 (ddd, J = 23.5, 12.5, 5.9 Hz, 46H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H)。MS: 742.7 m/z [M+H]。 實例40-化合物40 化合物40：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(3-((甲基胺甲醯基)氧基)丙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image301
化合物40係自化合物37使用化合物39所採用之方法以34%產率合成。1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.57 - 3.52 (m, 2H), 3.40 (dt, J = 9.4, 6.8 Hz, 2H), 2.79 (d, J = 4.8 Hz, 4H), 2.37 (s, 4H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.58 (dp, J = 21.2, 7.0 Hz, 13H), 1.30 (ddt, J = 17.9, 11.6, 5.7 Hz, 49H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H)。MS: 756.4 m/z [M+H]。 實例41-化合物41 化合物41：8-((2-乙醯胺基乙基)(7,7-雙(辛基氧基)庚基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image303
向化合物36 (1.0當量)於DCM (0.2 M)中之混合物中添加TEA (1.1當量)且冷卻至0℃。逐滴添加乙醯氯(1.04當量)，且將混合物攪拌4 h。完成後，將反應物用飽和碳酸氫鈉溶液淬滅且用DCM萃取3次。濃縮合併之有機層且藉由管柱層析純化，得到無色油狀產物(55%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.44 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.42 - 3.37 (m, 2H), 3.35 (d, J = 13.8 Hz, 2H), 2.56 (d, J = 48.6 Hz, 5H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.66 - 1.41 (m, 15H), 1.41 - 1.20 (m, 48H), 0.90 - 0.83 (m, 9H)。MS: 740.9 m/z [M+H]。 實例42-化合物42 化合物42：8-((3-乙醯胺基丙基)(7,7-雙(辛基氧基)庚基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image305
化合物42係自化合物38使用化合物41所採用之方法以51%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.44 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.32 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.52 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.46 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.93 (s, 3H), 1.68 - 1.50 (m, 12H), 1.44 (h, J = 6.9, 6.1 Hz, 4H), 1.39 - 1.21 (m, 45H), 0.92 - 0.84 (m, 9H)。MS: 742.7 m/z [M+H]。 實例43-化合物43 化合物43：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(3-((甲氧基羰基)胺基)丙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image307
將化合物38 (1.0當量)於DCM (0.2 M)及TEA (1.1當量)中之混合物中冷卻至0℃。逐滴添加氯甲酸甲酯(1.1當量)，且將混合物攪拌4 h。完成後，將反應物用飽和碳酸氫鈉溶液淬滅且用DCM萃取3次。濃縮合併之有機層且藉由管柱層析純化，得到無色油狀產物(31%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.64 (s, 3H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.26 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 2.41 (d, J = 44.1 Hz, 4H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.68 - 1.50 (m, 13H), 1.50 - 1.20 (m, 49H), 0.93 - 0.83 (m, 9H)。MS: 756.0 m/z [M+H]。 實例44-化合物44 化合物44：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-((甲氧基羰基)胺基)乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image309
化合物44係自化合物36使用化合物43所採用之方法以56%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.58 - 3.50 (m, 2H), 3.40 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.21 (s, 2H), 2.44 (d, J = 49.2 Hz, 5H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.65 - 1.50 (m, 11H), 1.48 - 1.16 (m, 52H), 0.91 - 0.83 (m, 9H)。MS: 742.4 m/z [M+H]。 實例45-化合物45 化合物45：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-(3-甲基脲基)乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image311
向化合物36 (1.0當量)於甲苯(0.02 M)中之混合物中添加異氰酸甲酯(1.4當量)。將反應物於23℃下攪拌4 h。完成後，將反應物用水稀釋且用DCM萃取3次。濃縮合併之有機層且藉由管柱層析純化，得到產物(23%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 5.20 (s, 1H), 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.27 (d, J = 18.4 Hz, 2H), 2.75 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.54 (d, J = 51.5 Hz, 5H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.67 - 1.40 (m, 15H), 1.40 - 1.19 (m, 46H), 0.92 - 0.84 (m, 9H)。MS: 741.3 m/z [M+H]。 實例46-化合物46 化合物46：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(3-(3-甲基脲基)丙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image313
化合物46係自化合物38使用化合物45所採用之方法以24%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.25 (h, J = 5.0 Hz, 2H), 2.75 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.48 (s, 5H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.73 - 1.40 (m, 16H), 1.40 - 1.19 (m, 44H), 0.92 - 0.83 (m, 9H)。MS: 755.0 m/z [M+H]。 實例47-化合物47 化合物47：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(2-(甲基磺醯胺基)乙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image315
向化合物36 (1.0當量)於DCM (0.25 M)中之混合物中添加MsCl (10當量)。將混合物於23℃下攪拌15 min，之後用水洗滌2次且在真空中濃縮。藉由管柱層析純化，得到呈無色殘餘物之產物(13%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.47 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.08 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.58 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.42 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.22 (s, 1H), 2.98 (s, 3H), 2.60 (d, J = 77.4 Hz, 4H), 2.31 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.69 - 1.42 (m, 15H), 1.42 - 1.23 (m, 46H), 0.94 - 0.86 (m, 9H)。MS: 762.9 m/z [M+H]。 實例48-化合物48 化合物48：8-((7,7-雙(辛基氧基)庚基)(3-(甲基磺醯胺基)丙基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image317
化合物48係自化合物38使用化合物47中所採用之方法以16%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.44 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 3.43 - 3.32 (m, 4H), 2.97 (s, 7H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.09 (s, 2H), 1.88 - 1.50 (m, 15H), 1.43 - 1.18 (m, 41H), 0.97 - 0.76 (m, 9H)。MS: 776.5 m/z [M+H]。 實例49-化合物49 化合物49：8-((2-乙醯氧基乙基)(7,7-雙(辛基氧基)庚基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image319
向化合物10 (1.0當量)於吡啶(10當量)中之混合物中添加乙酸酐(10當量)。將混合物於23℃下攪拌24 h。完成後，藉由添加水淬滅反應物且用DCM萃取3次。在真空下濃縮合併之有機層且藉由管柱層析純化，得到無色油狀產物(55%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.44 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.14 (q, J = 5.8, 5.4 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.74 (s, 2H), 2.49 (s, 4H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.05 (s, 3H), 1.66 - 1.50 (m, 11H), 1.50 - 1.39 (m, 4H), 1.39 - 1.19 (m, 48H), 0.91 - 0.84 (m, 9H)。MS: 727.4 m/z [M+H]。 實例50-化合物50 化合物50：8-((3-乙醯氧基丙基)(7,7-雙(辛基氧基)庚基)胺基)辛酸壬酯
Figure 02_image321
化合物50係自化合物37使用化合物49中所採用之方法以42%產率合成。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.45 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.07 (dt, J = 17.3, 6.6 Hz, 4H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.42 (d, J = 38.1 Hz, 5H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04 (s, 3H), 1.75 (s, 2H), 1.66 - 1.49 (m, 11H), 1.45 - 1.21 (m, 52H), 0.91 - 0.84 (m, 9H)。MS: 741.2 m/z [M+H]。 實例51-pKa量測值
根據Jayaraman等人(Angewandte Chemie, 2012)中之方法進行以下改編來測定每一胺脂質之pKa。測定濃度為2.94 mM之於乙醇中之未調配胺脂質的pKa。將脂質在0.1 M磷酸鹽緩衝液(Boston Bioproducts)中稀釋至100 µM，其中pH在4.5-9.0之範圍內。使用321 nm及448 nm之激發波長及發射波長量測螢光強度。表2顯示所列示化合物之pKa量測值。 表2 - pKa值
化合物 pKA
化合物1 6.30
化合物2 6.23
化合物3 6.19
化合物4 7.04
化合物5 7.08
化合物6 6.3
化合物7 6.16
化合物8 6.37
化合物9 6.12
化合物10 6.05
化合物11 6.35
化合物12 6.38
化合物13 6.35
化合物14 6.46
化合物15 6.34
化合物16 6.34
化合物17 6.21
化合物18 6.6
化合物19 6.4
化合物20 5.81
化合物21 5.99
化合物22 6.18
化合物23 6.04
化合物24 5.95
化合物25 6.1
化合物26 6.19
化合物27 6.41
化合物28 6.41
化合物29 6.54
化合物30 6.48
化合物31 6.47
化合物32 6.36
化合物33 6.33
化合物34 6.47
化合物35 6.37
化合物36 7.2
化合物37 6.3
化合物38 7.81
化合物39 未測定
化合物40 5.71
化合物41 6.82
化合物42 7.19
化合物43 6.02
化合物44 5.62
化合物45 未測定
化合物46 7.64
化合物47 6.93
化合物48 7.61
化合物49 5.32
化合物50 5.45
實例52-用於小鼠中活體內編輯之LNP組合物
利用胺脂質製備各種LNP組合物之製劑。在小鼠中肝編輯%之分析中，將Cas9 mRNA及化學修飾之sgRNA以1:1 w/w比率或1:2 w/w比率調配於LNP中。將LNP與給定可離子化脂質(例如胺脂質)、DSPC、膽固醇及PEG-2k-DMG之組合物以6.0 N:P比率調配在一起。 LNP調配物-交叉流
藉由乙醇中之脂質與兩體積之RNA溶液及一體積之水的碰撞噴射混合形成LNP。乙醇中之脂質經由混合交叉與兩體積之RNA溶液混合。第四水流經由線內T形管與十字架之出口流混合。(例如參見WO2016010840，圖2。)將LNP於室溫下保持1小時，且進一步用水(約1:1 v/v)稀釋。使用切向流過濾在平板盒(Sartorius，100kD MWCO)上濃縮稀釋之LNP，且接著藉由滲濾至50 mM Tris、45 mM NaCl、5%(w/v)蔗糖(pH 7.5) (TSS)中更換緩衝液。或者，用PD-10脫鹽管柱(GE)完成至TSS之最終緩衝液更換。若需要，藉由用Amicon 100 kDa離心過濾器(Millipore)離心來濃縮組合物。接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。將最終LNP儲存於4℃或-80℃下直至進一步使用。 LNP組合物分析學
動態光散射(「DLS」)用於表徵本揭示案之LNP的多分散性指數(「pdi」)及大小。DLS量測將樣品置於光源下而產生之光散射。如自DLS量測所測定之PDI代表群體中之粒徑分佈(在平均粒徑附近)，其中完全均勻之群體的PDI為零。
電泳光散射用於表徵在指定pH下LNP之表面電荷。表面電荷或ζ電位係LNP懸浮液中粒子之間的靜電排斥/吸引大小之量度。
非對稱流場流分離-多角度光散射(AF4-MALS)用於藉由流體力學半徑分離組合物中之粒子，且接著量測分離之粒子的分子量、流體力學半徑及均方根半徑。此允許評價分子量及大小分佈以及二級特徵，諸如Burchard-Stockmeyer圖(隨時間變化之均方根(「rms」)半徑與流體力學半徑之比率，表明粒子之內部核密度，及rms構象圖(均方根半徑之對數對分子量之對數，其中所得線性擬合之斜率給出緊密度對伸長度)。
奈米粒子跟蹤分析(NTA，Malvern Nanosight)可用於確定粒徑分佈以及粒子濃度。將LNP樣品適當稀釋且注射至顯微鏡載玻片上。當經由視野緩慢輸注粒子時，照相機會記錄散射光。捕獲影片後，奈米粒子跟蹤分析藉由跟蹤像素且計算擴散係數來處理影片。此擴散係數可轉化為粒子之流體力學半徑。儀器亦對分析中計數之個別粒子之數目進行計數，以得出粒子濃度。
低溫電子顯微鏡(「cryo-EM」)可用於確定LNP之粒徑、形態及結構特徵。
LNP之脂質組成分析可自液相層析、之後帶電氣溶膠偵測(LC-CAD)來確定。此分析可比較實際脂質含量對理論脂質含量。
分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性指數(pdi)、總RNA含量、RNA之囊封效率及ζ電位。LNP組合物可藉由脂質分析、AF4-MALS、NTA及/或低溫EM進一步表徵。平均粒徑及多分散性係使用Malvern Zetasizer DLS儀器藉由動態光散射(DLS)量測。LNP樣品在藉由DLS量測之前用PBS緩衝液稀釋。報導Z平均直徑以及數目平均直徑及pdi，該Z平均直徑係基於強度之平均粒徑量測值。Malvern Zetasizer儀器亦用於量測LNP之ζ電位。在量測之前，將樣品以1:17 (50 µL稀釋為800 µL)於0.1X PBS (pH 7.4)中稀釋。
基於螢光之分析(Ribogreen®，ThermoFisher Scientific)用於確定總RNA濃度及游離RNA。囊封效率計算為(總RNA - 游離RNA)/總RNA。將LNP樣品用含0.2% Triton-X 100之1x TE緩衝液適當稀釋以確定總RNA，或用1x TE緩衝液適當稀釋以確定游離RNA。藉由利用起始RNA溶液製備標準曲線，該起始RNA溶液用於製備組合物且於1x TE緩衝液+/- 0.2% Triton-X 100中稀釋。接著將稀釋之RiboGreen®染料(根據製造商之說明)添加至標準品及樣品中之每一者中，且在不存在光下在室溫下培育大約10分鐘。SpectraMax M5微讀板儀(Molecular Devices)用於讀取樣品，激發、自動截止及發射波長分別設置為488 nm、515 nm及525 nm。自適當標準曲線確定總RNA及游離RNA。
囊封效率計算為(總RNA - 游離RNA)/總RNA。可使用相同程序確定基於DNA之貨品子組分之囊封效率。對於單股DNA，可使用Oligreen染料，且對於雙股DNA，可使用Picogreen染料。
AF4-MALS用於查看分子量及大小分佈以及來自彼等計算之次級統計學。對LNP進行適當稀釋，且使用HPLC自動取樣器將其注入AF4分離通道中，該等LNP在此處集中且接著跨越通道以交叉流中之指數梯度溶析。所有流體皆由HPLC幫浦及Wyatt Eclipse儀器驅動。自AF4通道溶析之粒子流過UV偵測器、多角度光散射偵測器、準彈性光散射偵測器及示差折射率偵測器。藉由使用Debeye模型處理原始數據，以根據偵測器信號確定分子量及均方根半徑。
藉由與帶電氣溶膠偵測器(CAD)耦合之HPLC定量分析LNP中之脂質組分。藉由逆相HPLC達成4種脂質組分之層析分離。CAD係一種偵測所有非揮發性化合物的基於質量之破壞性偵測器，且無論分析物之結構如何，信號皆一致。 Cas9 mRNA及gRNA貨品子
藉由活體外轉錄製備Cas9 mRNA貨品子。使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶藉由活體外轉錄生成包含1X NLS (SEQ ID NO: 3)或PCT/US2019/053423 (其以引用方式併入本文中)之表24之序列的加帽及多聚腺苷酸化Cas9 mRNA。舉例而言，可藉由在以下條件下在37℃下與XbaI一起培育2小時來線性化含有T7啟動子及100 nt聚(A/T)區的質體DNA：200 ng/µL質體、2 U/µL XbaI (NEB)及1x反應緩衝液。可藉由在65℃下加熱反應20 min使XbaI不活化。可使用二氧化矽maxi旋轉管柱(Epoch Life Sciences)自酶及緩衝液鹽純化線性化質體，且藉由瓊脂糖凝膠進行分析以確認線性化。可藉由在以下條件下在37℃下培育4小時來實施IVT反應以生成Cas9修飾之mRNA：50 ng/µL線性化質體；各2 mM GTP、ATP、CTP及N1-甲基偽-UTP (Trilink)；10 mM ARCA (Trilink)；5 U/µL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/µL鼠類RNA酶抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1x反應緩衝液。4 h培育後，添加TURBO DNA酶(ThermoFisher)至最終濃度為0.01 U/μL，且將反應物再培育30分鐘以去除DNA模板。利用含有LiCl沈澱之方法純化Cas9 mRNA。
sgRNA (例如，G650；SEQ ID NO: 2)係以化學方式合成且視情況源自商業供應商。 LNP
該等LNP係以1:1 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。LNP之脂質組分中脂質之莫耳濃度表示為mol %胺脂質/DSPC/膽固醇/PEG-2k-DMG，例如50/10/38.5/1.5。根據上文提供之分析方法表徵最終LNP，以確定囊封效率、多分散性指數及平均粒徑。表3中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表3 - 組合物分析學
可離子化脂質 組成 濃度(mg/ml) 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 1 98 82.71 0.056 64.97
化合物1 50/10/38.5/1.5 0.5 98 79.49 0.105 57.04
化合物2 50/10/38.5/1.5 0.5 98 79.89 0.068 59.46
化合物3 50/10/38.5/1.5 0.5 98 75.79 0.056 57.41
化合物5 50/10/38.5/1.5 0.5 98 83.93 0.099 59.69
化合物6 50/10/38.5/1.5 0.5 99 78.59 0.075 58.17
化合物19之結構及合成方法揭示於US 2017/0196809A1中，該案件之全文併入本文中。
除非另有說明，否則LNP以0.1 mg/kg之單劑量投與小鼠，且如下所述分離基因組DNA用於NGS分析。 活體內LNP遞送
每個研究中使用在6-10週齡範圍內之CD-1雌性小鼠。稱重動物且根據體重分組，以基於組平均重量製備給藥溶液。經由側尾靜脈以每隻動物0.2 mL (每公斤體重大約10 mL)之劑量給藥LNP。在給藥後至少24小時定期觀察動物之給藥後不良影響。在第6或7天，藉由在異氟醚麻醉下經由心臟穿刺驅血對動物施以安樂死。如本文所述，針對血漿，將血液收集至血清分離管中或含有緩衝檸檬酸鈉之管中。對於涉及活體內編輯之研究，自每隻動物收集肝組織用於DNA提取及分析。
藉由下一代測序(NGS)量測小鼠組之肝編輯。 NGS測序
簡言之，為定量確定在基因組中靶位置處之編輯效率，分離基因組DNA，且利用深度測序來鑑別藉由基因編輯引入之插入及缺失的存在。
在靶位點(例如，B2M)周圍設計PCR引子，且使所關注基因組區擴增。根據製造商之方案(Illumina)實施額外PCR，以添加測序所需之化學物質。在Illumina MiSeq儀器上對擴增子進行測序。在消除具有低品質評分之彼等讀段後，將讀段與人類參考基因組(例如，hg38)進行比對。將含有讀段之所得文件映射至參考基因組(BAM文件)，其中選擇與所關注靶區域重疊之讀段，且計算野生型讀段數對含有插入、取代或缺失之讀段數。
編輯百分比(例如，「編輯效率」或「編輯%」)定義為相對於序列讀段(包括野生型)總數的具有插入或缺失之序列讀段之總數。
圖1顯示如藉由NGS量測之小鼠肝中之編輯百分比。如圖1及表4中所示，活體內編輯百分比在約8%至超過35%肝編輯範圍內。 表4. 小鼠肝中B2M之編輯效率
條件 編輯(%) 標準偏差 樣品數目(n)
TSS 0.0 0.1 5
化合物19 12.0 3.2 4
化合物1 36.8 7.0 5
化合物2 17.7 2.9 5
化合物3 8.8 2.0 5
化合物5 13.2 2.7 5
化合物6 8.2 1.8 5
實例53 -肝中編輯之劑量反應
為評價給藥之可擴縮性，利用化合物1實施活體內劑量反應實驗。將實例52之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G282；SEQ ID NO:1)或B2M (G650；SEQ ID NO:2)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:1 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用交叉流程序用如表5中所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0且若必要在使用Amicon PD-10過濾器(GE Healthcare)濃縮後以表5中所述之濃度使用。
如實例52中所述，分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA之囊封效率。
表5中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表5：組合物分析學
可離子化脂質 組成 囊封 (%) gRNA 濃度 (mg/ml) Z 平均大小 (nm) PDI 數目平均大小 (nm)
化合物19 50/9/38/3 99 G282 0.05 79.83 0.015 62.86
化合物19 50/9/38/3 98 G650 1 82.71 0.056 64.97
化合物1 50/10/38.5/1.5 97 G282 0.043 75.77 0.008 61.19
化合物1 50/10/38.5/1.5 98 G650 0.593 80.96 0.028 65.11
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk或0.3 mpk i.v.給藥。給藥後6天，處死動物。對於投用靶向TTR之G282的動物，收集血液及肝，且量測血清TTR及編輯。對於投用靶向B2M之G650的動物，收集肝且量測編輯。 轉甲狀腺素蛋白(TTR) ELISA分析
如所指示收集血液且分離血清。使用小鼠前白蛋白(轉甲狀腺素蛋白) ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄號OKIA00111)測定總小鼠TTR血清水準。簡言之，將血清用套組樣品稀釋劑連續稀釋至對於0.1 mpk劑量為10,000倍之最終稀釋度且對於0.3 mpk為2,500倍之最終稀釋度。接著將此稀釋之樣品添加至ELISA盤中，且接著根據指示實施分析。
表6及圖2A-圖2C顯示肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。在每一劑量下，化合物1調配物顯示比化合物19調配物更高之肝中之TTR編輯。化合物1調配物在0.1 mpk及0.3 mpk劑量下顯示TTR之編輯在55-60%之範圍內，指示在低劑量下具有功效。 表6：針對劑量反應之TTR肝編輯及血清TTR水準
條件 劑量(mpk) TTR編輯(%) TTR編輯標準偏差 血清TTR (µg/ml) 血清TTR標準偏差 TSS %TSS標準偏差 樣品數目(n)
TSS    0.1 0.1 71 0 00 2 5
化合物19 0.1 13.8 3.9 55 28 85 7 5
化合物19 0.3 45.9 7.8 55 103 3 3 4
化合物1 0.1 55.4 4.8 19 82 5 1 5
化合物1 0.3 59.3 6.5 5 8 5 2 5
表7及圖3顯示肝中之B2M編輯結果。在每一劑量下，化合物1顯示比化合物19更高之肝中之B2M編輯。化合物1及化合物19在0.1 mpk與0.3 mpk劑量之間顯著增加肝中之B2M編輯。 表7：針對劑量反應之B2M肝編輯
條件 劑量(mpk) 編輯(%) 標準偏差 樣品數目(n)
TSS    0.1 0.1 5
化合物19 0.1 25.5 10.1 5
化合物19 0.3 43.4 10.1 5
化合物1 0.1 41.0 9.0 5
化合物1 0.3 62.9 2.3 5
實例54-利用包含化合物4之組合物的小鼠肝中之B2M編輯
利用不同劑量及包含化合物4之組合物中的PEG脂質濃度評價編輯。將實例52中所述之Cas9 mRNA調配為具有靶向B2M (G650；SEQ ID NO: 2)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:1 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用交叉流程序用如表8所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0。所有LNP皆使用Amicon PD-10過濾器(GE Healthcare)及/或切向流過濾進行濃縮，且以表8中所述之濃度使用。
如實例52中所述，分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA之囊封效率。
表8中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表8 - 組合物分析學
可離子化脂質 組成 濃度(mg/ml) 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 1 98 82.71 0.056 64.97
化合物4 50/10/38.5/1.5 0.5 97 77.33 0.056 58.43
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk或0.3 mpk i.v.給藥。給藥後7天，處死動物，收集肝且藉由NGS量測編輯。表9及圖4顯示肝中之B2M編輯結果。包含化合物4之組合物在0.3 mpk劑量下與0.1 mpk劑量相比顯示編輯增加，化合物19比較組合物亦如此。 表9 -使用化合物4之小鼠肝中之B2M編輯
條件 劑量(mpk) 編輯% 標準偏差 樣品數目(n)
TSS - 0 0 5
化合物19 0.1 13 6 5
化合物19 0.3 44 15 5
化合物4 0.1 29 6 5
化合物4 0.3 57 7 5
實例55 -小鼠肝中之TTR編輯
對於額外組合物評價編輯。將實例52中所述之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G282；SEQ ID NO: 1)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:1 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用如實例52中所述之交叉流程序用如表10所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0。LNP係以表10中所述之濃度使用。如實例52中所述，分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA之囊封效率。
表10中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表10-組合物分析學
可離子化脂質 組成 濃度(mg/ml) 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 0.062 98 81.76 0.025 64.95
化合物1 50/10/38.5/1.5 0.057 97 69.94 0.05 55.38
化合物7 50/10/38.5/1.5 0.065 92 74.45 0.065 55.7
化合物8 50/10/38.5/1.5 0.058 84 87.86 0.085 60.2
化合物10 50/10/38.5/1.5 0.069 95 72.36 0.049 55.72
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk i.v.給藥。給藥後7天，處死動物。收集血液及肝，且如上文所述量測血清TTR及編輯。表11及圖5顯示肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。 表11
條件 編輯% 編輯標準偏差 樣品數目(n) 血清TTR (µg/ml) 血清TTR SD 血清TTR (%TSS) %TSS SD 樣品數目(n)
TSS 0 0 5 1136 159 100 14 5
化合物19 29 5 5 528 231 46 20 5
化合物1 43 5 5 391 80 34 7 5
化合物7 50 4 5 234 54 21 5 4
化合物8 43 8 5 387 83 34 7 5
化合物10 50 7 5 206 46 18 4 4
此實例中測試之式(I)或式(II)之各胺脂質顯示TTR之約40-50編輯%，且血清TTR水準相應降低約80%。該等LNP可與參考媲美。 實例56-小鼠肝中之TTR編輯
針對額外胺脂質調配物評價編輯。將實例52之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G282；SEQ ID NO: 1)之嚮導RNA的LNP。使用如實例52中所述之交叉流程序用如表12所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0。LNP係以約0.06 mg/ml之濃度使用。如實例52中所述分析LNP調配物之平均粒徑、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA之囊封效率。表12中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表12-調配物分析學
可離子化脂質 組成比率 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 97 79.18 0.047 63.19
化合物18 50/10/38.5/1.5 81 106.6 0.112 69.77
化合物5 50/10/38.5/1.5 98 108.1 0.273 48.59
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk i.v.給藥。給藥後7天，處死動物。收集血液及肝，且如上文所述量測血清TTR及編輯。表13闡述肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。 表13-小鼠肝中之編輯及血清TTR水準
條件 編輯% 編輯SD 血清TTR µg/ml TTR SD 血清TTR (%TSS) %TSS SD 樣品數目(n)
TSS 0 0 801 115 100 14 5
化合物19 15 9 865 197 108 25 5
化合物18 33 8 415 95 52 12 5
化合物5 9 3 738 122 92 15 5
實例57-表現之蛋白質之量測
在mRNA貨品子下，蛋白質表現係脂質奈米粒子遞送之一個量度。舉例而言，ELISA可用於量測眾多蛋白質之生物樣品中的蛋白質水準。可使用以下方案自生物樣品中量測表現之蛋白，例如Cas9蛋白表現。簡言之，藉由雙金雞納酸分析測定清除之細胞裂解物的總蛋白濃度。根據製造商之方案使用Cas9小鼠抗體(Origene，目錄號CF811179)作為捕獲抗體及Cas9 (7A9-3A3)小鼠mAb (Cell Signaling Technology，目錄號14697)作為偵測抗體製備MSD GOLD 96孔鏈黴抗生物素蛋白SECTOR盤(Meso Scale Diagnostics，目錄號L15SA-1)。重組Cas9蛋白在具有無EDTA之1X Halt™蛋白酶抑制劑混合劑(ThermoFisher，目錄號78437)的稀釋劑39 (Meso Scale Diagnostics)中用作校正標準物。使用Meso Quickplex SQ120儀器(Meso Scale Discovery)讀取ELISA盤，且利用Discovery Workbench 4.0軟體套裝(Meso Scale Discovery)分析數據。 實例58 -小鼠肝中之TTR編輯
對於額外組合物評價編輯。將實例52中所述之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G282；SEQ ID NO: 1)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:1 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用如實例52中所述之交叉流程序用如表14所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0。LNP係以表14中所述之濃度使用。如實例52中所述分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA之囊封效率。表14中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表14-組合物分析學
化合物 組成 濃度(mg/ml) 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 0.05 99 84.99 0.007 71.1
化合物1 50/10/38.5/1.5 0.057 97 69.94 0.05 55.38
化合物11 50/10/38.5/1.5 0.074 86 89.3 0.137 54.58
化合物12 50/10/38.5/1.5 0.073 98 75.44 0.014 62.44
化合物13 50/10/38.5/1.5 0.07 98 77.34 0.04 63.34
化合物14 50/10/38.5/1.5 0.078 98 82.2 0.039 65.34
化合物15 50/10/38.5/1.5 0.081 88 82.93 0.092 57.97
化合物16 50/10/38.5/1.5 0.054 78 109.5 0.132 66.66
化合物17 50/10/38.5/1.5 0.071 91 68.72 0.056 54.25
對於每一條件，5隻CD-1雌性小鼠以0.1 mpk i.v.給藥。給藥後6天，處死動物。收集血液及肝，且如上文所述量測血清TTR及編輯。表15及圖6顯示肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。 表15-小鼠肝中之編輯及血清TTR水準
化合物 編輯 血清TTR N
平均插入缺失(Indel) % SD 血清TTR (ug/ml) SD %TSS
TSS 0.1 0.0 989 248 100% 5
化合物19 29.7 7.1 581 180 59% 5
化合物19 19.7 6.4 695 69 70% 5
化合物1 29.5 6.5 656 98 66% 5
化合物11 29.4 8.6 553 41 56% 5
化合物12 33.0 8.3 490 176 50% 5
化合物13 22.6 6.0 703 233 71% 5
化合物14 12.1 1.9 928 134 94% 5
化合物15 50.3 4.6 179 68 18% 5
化合物16 35.2 14.1 516 264 52% 5
化合物17 40.8 9.4 479 204 48% 5
實例59-小鼠肝中之TTR編輯
對於額外組合物評價編輯。將實例52中所述之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G282；SEQ ID NO: 1)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:1 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用如實例52中所述之交叉流程序用如表16所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0。LNP係以約0.05 mg/ml之濃度使用。如實例52中所述分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA之囊封效率。表16中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表16-組合物分析學
化合物 組成 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 98 86.84 0.02 71.49
化合物18 50/10/38.5/1.5 98 75.79 0.093 53.06
化合物1 50/10/38.5/1.5 96 72.21 0.04 57.78
化合物10 50/10/38.5/1.5 98 73.31 0.044 57.14
化合物20 50/10/38.5/1.5 83 84.49 0.102 58.65
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk i.v.給藥。給藥後7天，處死動物。收集血液及肝，且如上文所述量測血清TTR及編輯。表17及圖7顯示肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。 表17-小鼠肝中之編輯及血清TTR水準
化合物 編輯 血清TTR
平均插入缺失% SD N 血清TTR (ug/ml) SD %TSS N
TSS 0.1 0.0 5 933 95 100% 5
化合物19 29.3 7.1 5 438 139 47% 5
化合物18 41.6 12.8 5 324 39 35% 4
化合物1 41.6 17.4 5 327 287 35% 5
化合物10 60.1 5.9 5 80 70 9% 3
化合物20 35.0 8.7 5 210 85 23% 3
實例60-小鼠肝中之TTR編輯
對於額外組合物評價編輯。將實例52中所述之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G502；SEQ ID NO: 4)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:2 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用如實例52中所述之交叉流程序用如表18所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0。LNP係以約0.05之濃度使用。如實例52中所述分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA之囊封效率。表18中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表18-組合物分析學
化合物 組成 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 99 88.6 0.033 73.15
化合物1 50/10/38.5/1.5 97 74.5 0.037 58.01
化合物22 50/10/38.5/1.5 98 82.91 0.029 66.68
化合物23 50/10/38.5/1.5 93 79.04 0.054 61.86
化合物25 50/10/38.5/1.5 92 66.83 0.065 50.74
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk i.v.給藥。給藥後6天，處死動物。收集血液及肝，且如上文所述量測血清TTR及編輯。表19及圖8顯示肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。 表19-小鼠肝中之編輯及血清TTR水準
化合物 編輯 血清TTR   
平均插入缺失% SD 血清TTR (ug/ml) SD %TSS N
TSS 0.2 0.3 1422 325 100% 5
化合物19 41.4 5.5 517 153 36% 5
化合物1 46.3 13.0 353 170 25% 5
化合物22 45.6 11.8 410 186 29% 5
化合物23 53.6 8.4 307 128 22% 5
化合物25 15.3 11.2 985 290 69% 5
實例61-小鼠肝中之TTR編輯
對於額外組合物評價編輯。將實例52中所述之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G282；SEQ ID NO: 1)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:1 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用如實例52中所述之交叉流程序用如表20所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0。LNP係以如表20中所述之濃度使用。如實例52中所述分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA之囊封效率。表20中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表20-組合物分析學
化合物 組成 濃度(mg/ml) 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 0.05 98 86.84 0.02 71.49
化合物18 50/10/38.5/1.5 0.04 90 74.67 0.083 52.25
化合物4 50/10/38.5/1.5 0.05 97 87.27 0.051 68.75
化合物9 50/10/38.5/1.5 0.05 97 75.32 0.021 60.79
化合物10 50/10/38.5/1.5 0.05 94 76.35 0.059 57.86
化合物26 50/10/38.5/1.5 0.05 99 63.25 0.07 48.37
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk i.v.給藥。給藥後7天，處死動物。收集血液及肝，且如上文所述量測血清TTR及編輯。表21及圖9顯示肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。 表21-小鼠肝中之編輯及血清TTR水準
化合物 編輯 血清TTR N
平均插入缺失% SD 血清TTR (ug/ml) SD %TSS
TSS 0.9 0.3 1282 248 100% 5
化合物19 35.9 6.6 438 132 34% 5
化合物18 26.8 3.9 615 87 48% 5
化合物4 46.7 9.7 333 146 26% 5
化合物9 52.1 3.1 218 72 17% 5
化合物10 47.2 10.8 330 146 26% 5
化合物26 2.6 1.1 979 177 76% 5
實例62-肝中之編輯的劑量反應
為評價給藥之可擴縮性，在活體內實施劑量反應實驗。將實例52之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G282；SEQ ID NO: 1)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:2 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用交叉流程序用如表22中所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0且若必要在使用Amicon PD-10過濾器(GE Healthcare)濃縮後以表22中所述之濃度使用。
如實例52中所述分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(pdi)、總RNA含量及RNA之囊封效率。表22中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表22：組合物分析學
化合物 組成 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 99 88.6 0.033 73.15
化合物1 50/10/38.5/1.5 97 74.5 0.037 58.01
化合物10 50/10/38.5/1.5 92 79.49 0.072 59.35
化合物15 50/10/38.5/1.5 89 90.22 0.051 69.95
化合物17 50/10/38.5/1.5 94 62.89 0.072 44.93
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk或0.03 mpk i.v.給藥。給藥後7天，處死動物。收集血液及肝，且量測血清TTR及編輯。表23及圖10顯示肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。 表23：針對劑量反應之TTR肝編輯及血清TTR水準
化合物 劑量(mpk) 編輯 血清TTR
平均插入缺失% SD N 血清TTR (ug/ml) SD %TSS N
TSS TSS 0.1 0.0 5 638 176 100% 5
化合物19 0.03 7.0 5.0 5 560 102 88% 5
化合物19 0.1 27.1 14.9 5 414 167 65% 5
化合物1 0.03 8.9 4.8 5 594 271 93% 5
化合物1 0.1 34.2 9.9 5 241 45 38% 4
化合物10 0.03 15.6 6.6 5 424 142 67% 5
化合物10 0.1 51.3 3.9 5 179 42 28% 5
化合物15 0.03 16.4 6.6 4 548 188 86% 4
化合物15 0.1 57.4 6.6 5 180 33 28% 4
化合物17 0.03 4.0 1.4 5 495 98 78% 5
化合物17 0.1 45.9 9.2 5 304 82 48% 5
實例63-小鼠肝中之TTR編輯
對於額外組合物評價編輯。將實例52中所述之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G282；SEQ ID NO: 1)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:1 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用如實例52中所述之交叉流程序用如表24所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0。LNP係以如表24中所述之濃度使用。如實例52中所述分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率。表24中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表24- 組合物分析學
化合物 組成 濃度(mg/ml) 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 0.05 98% 82 0.03 66
化合物1 50/10/38.5/1.5 0.06 98% 70 0.06 52
化合物27 50/10/38.5/1.5 0.06 94% 80 0.13 54
化合物28 50/10/38.5/1.5 0.06 97% 78 0.30 42
化合物29 50/10/38.5/1.5 0.06 91% 118 0.17 68
化合物30 50/10/38.5/1.5 0.06 93% 108 0.16 61
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk i.v.給藥。給藥後7天，處死動物。收集血液及肝，且如上文所述量測血清TTR及編輯。表25顯示肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。 表25-小鼠肝中之編輯及血清TTR水準
化合物 編輯 血清TTR N
劑量(mpk) 平均插入缺失% SD 血清TTR (ug/ml) SD % TSS
TSS n/a 0.06 0.05 807.03 161.51 100.00 5
化合物19 0.03 30.18 7.90 593.01 268.33 73.48 5
0.1 56.02 6.27 134.54 61.46 16.67 5
化合物1 0.03 10.86 1.36 741.05 125.46 91.82 5
0.1 41.10 14.39 351.76 126.24 43.59 5
化合物27 0.03 27.86 3.69 497.99 115.29 61.71 5
0.1 57.10 1.99 197.22 49.71 24.44 5
化合物28 0.03 20.74 3.72 493.60 57.20 61.16 5
0.1 42.36 4.36 321.26 58.34 39.81 5
化合物29 0.03 5.76 2.94 718.48 57.40 89.03 5
0.1 15.96 3.94 660.46 142.13 81.84 5
化合物30 0.03 27.64 3.50 514.23 34.52 63.72 5
0.1 62.48 5.87 125.89 61.45 15.60 5
實例64-小鼠肝中之TTR編輯
對於額外組合物評價編輯。將實例52中所述之Cas9 mRNA調配為具有靶向TTR (G282；SEQ ID NO: 1)之嚮導RNA的LNP。該等LNP以1:1 w/w比率之單一嚮導RNA及Cas9 mRNA調配。使用如實例52中所述之交叉流程序用如表26所述之組成裝配LNP。所有LNP之N:P比率皆為6.0。LNP係以如表26中所述之濃度使用。如實例52中所述分析LNP組合物之平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率。表26中顯示平均粒徑、多分散性(PDI)、總RNA含量及RNA之囊封效率的分析。 表26- 組合物分析學
化合物 組成 濃度(mg/ml) 囊封(%) Z平均大小(nm) PDI 數目平均大小(nm)
化合物19 50/9/38/3 1.48 98% 83 0.03 65
化合物10 50/10/38.5/1.5 0.06 92% 77 0.05 58
化合物42 50/10/38.5/1.5 0.06 97% 122 0.05 99
化合物41 50/10/38.5/1.5 0.06 95% 92 0.05 70
化合物44 50/10/38.5/1.5 0.06 59% 185 0.25 92
化合物43 50/10/38.5/1.5 0.06 94% 74 0.05 56
化合物46 50/10/38.5/1.5 0.06 98% 104 0.03 86
化合物40 50/10/38.5/1.5 0.06 96% 83 0.06 64
   50/10/38.5/1.5 0.06 100% 57 0.06 43
   50/10/38.5/1.5 0.06 90% 88 0.05 69
CD-1雌性小鼠以0.1 mpk i.v.給藥。給藥後7天，處死動物。收集血液及肝，且如上文所述量測血清TTR及編輯。表27顯示肝中之TTR編輯及血清TTR水準結果。 表27-小鼠肝中之編輯及血清TTR水準
化合物 編輯 血清TTR N
劑量(mpk) 平均插入缺失% SD 血清TTR (ug/ml) SD 血清TTR (%KD)
TSS n/a 0.2 0.05 572.6 13.01    5
化合物19 0.03 5.2 1.28 622.0 8.11 -8.6 5
化合物10 0.03 27.2 5.15 409.2 22.35 28.5 5
化合物42 0.03 9.6 5.66 571.6 11.40 0.2 5
化合物41 0.03 2.4 0.85 567.1 9.10 1.0 5
化合物44 0.03 7.9 3.59 603.9 6.53 -5.5 5
化合物43 0.03 8.6 2.04 619.2 14.61 -8.1 5
化合物46 0.03 8.7 3.82 514.6 7.69 10.1 5
化合物40 0.03 27.5 12.31 417.0 21.05 27.2   
序列表
說明 序列 SEQ ID No.
G000282 靶向小鼠 TTR 之 sgRNA mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 1
G000650 靶向人類 B2M 之 sgRNA mG*mA*mC*AAGCACCAGAAAGACCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2
編碼 Cas9 之 mRNA GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCGCCACCAUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAGCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG 3
G000502 靶向小鼠 TTR 之 sgRNA mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 4
如下文所表示之2’-O-甲基修飾及硫代磷酸酯鍵(m = 2’-OMe；* = 硫代磷酸酯)
圖1係顯示如實例52中所述在使用包含式(I)或式(II)化合物或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中B2M之編輯百分比的圖。
圖2A係顯示如實例53中所述在使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物(化合物1)或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中TTR之編輯百分比的圖。亦顯示劑量反應數據。
圖2B係顯示如實例53中所述血清TTR (µg/mL)的圖。亦顯示劑量反應數據。
圖2C係顯示如實例53中所述血清TTR (%TSS)的圖。亦顯示劑量反應數據。
圖3係顯示如實例53中所述在使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物(化合物1)或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中B2M之編輯的劑量反應百分比的圖。
圖4係顯示如實例54中所述在使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物(化合物4)或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中B2M之編輯的劑量反應百分比的圖。
圖5A係顯示如實例55中所述在使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中TTR之編輯百分比的圖。亦顯示劑量反應數據。
圖5B係顯示如實例55中所述血清TTR (µg/mL)的圖。亦顯示劑量反應數據。
圖5C係顯示如實例55中所述血清TTR (%TSS)的圖。亦顯示劑量反應數據。
圖6A係顯示如實例58中所述在使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中TTR之編輯百分比的圖。
圖6B係顯示如實例58中所述血清TTR (µg/mL)的圖。
圖7A係顯示如實例59中所述在使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中TTR之編輯百分比的圖。
圖7B係顯示如實例59中所述血清TTR (µg/mL)的圖。
圖8A係顯示如實例60中所述在使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中TTR之編輯百分比的圖。
圖8B係顯示如實例60中所述血清TTR (µg/mL)的圖。
圖9A係顯示如實例61中所述在使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中TTR之編輯百分比的圖。
圖9B係顯示如實例61中所述血清TTR (µg/mL)的圖。
圖10A係顯示如實例62中所述在使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或對照之LNP遞送後小鼠肝細胞中TTR之編輯百分比的圖。
圖10B係顯示如實例62中所述血清TTR (µg/mL)的圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 108135763-A0101-11-0001-1

Claims (104)

  1. 一種式(I)化合物
    Figure 03_image001
    (I)， 其中，在每次出現時獨立地， X1 係C5-11 伸烷基， Y1 係C3-11 伸烷基， Y2 係
    Figure 03_image004
    或
    Figure 03_image006
    ，其中a1 係與Y1 之鍵，且a2 係與R1 之鍵， Z1 係C2-4 伸烷基， Z2 係選自-OH、-NH2 、-OC(=O)R3 、-OC(=O)NHR3 、-NHC(=O)NHR3 及-NHS(=O)2 R3 ， R1 係C4-12 烷基或C3-12 烯基， 各R2 獨立地係C4-12 烷基，且 R3 係C1-3 烷基， 或其鹽。
  2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該鹽係醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之化合物，其中X1 係直鏈C5-11 伸烷基。
  4. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中X1 係直鏈C6-10 伸烷基。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中X1 係直鏈C6 伸烷基、直鏈C7 伸烷基、直鏈C8 伸烷基或直鏈C9 伸烷基。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中Y1 係直鏈C4-9 伸烷基。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中Y1 係直鏈C6-8 伸烷基。
  8. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中Y1 係直鏈C7 伸烷基。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中R1 係C4-12 烯基。
  10. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中R1 係C9 烯基。
  11. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中Y2 係
    Figure 03_image004
    。
  12. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中Y1 、Y2 及R1 經選擇以形成16-21個原子之直鏈。
  13. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中Y1 、Y2 及R1 經選擇以形成16-18個原子之直鏈。
  14. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中Z1 係直鏈C2-4 伸烷基。
  15. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中Z1 係C2 伸烷基或C3 伸烷基。
  16. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中Z2 係-OH。
  17. 如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之化合物，其中Z2 係-NH2 。
  18. 如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之化合物，其中Z2 係-OC(=O)R3 、-OC(=O)NHR3 、-NHC(=O)NHR3 或-NHS(=O)2 R3 。
  19. 如申請專利範圍第18項之化合物，其中R3 係甲基。
  20. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中R1 係直鏈C4-12 烷基。
  21. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中R1 係直鏈C8-10 烷基。
  22. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中R1 係直鏈C9 烷基。
  23. 如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之化合物，其中R1 係支鏈C6-12 烷基。
  24. 如申請專利範圍第23項之化合物，其中R1 係支鏈C8 烷基、支鏈C9 烷基或支鏈C10 烷基。
  25. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中各R2 獨立地係直鏈C5-12 烷基。
  26. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中各R2 獨立地係直鏈C6-8 烷基。
  27. 如申請專利範圍第1項至第24項中任一項之化合物，其中各R2 獨立地係支鏈C5-12 烷基。
  28. 如申請專利範圍第27項之化合物，其中各R2 獨立地係支鏈C6-8 烷基。
  29. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中X1 及R2 部分之一經選擇以形成16-18個原子、包括縮醛之碳原子及氧原子的直鏈。
  30. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物係式(II)化合物
    Figure 03_image008
    (II)， 其中，在每次出現時獨立地， X1 係C5-11 伸烷基， Y1 係C3-10 伸烷基， Y2 係
    Figure 03_image004
    或
    Figure 03_image006
    ，其中a1 係與Y1 之鍵，且a2 係與R1 之鍵， Z1 係C2-4 伸烷基， R1 係C4-12 烷基或C3-12 烯基， 各R2 獨立地係C4-12 烷基， 或其鹽。
  31. 如申請專利範圍第30項之化合物，其中該鹽係醫藥學上可接受之鹽。
  32. 如申請專利範圍第30項或第31項之化合物，其中X1 係直鏈C5-11 伸烷基。
  33. 如申請專利範圍第32項之化合物，其中X1 係直鏈C6-8 伸烷基。
  34. 如申請專利範圍第33項之化合物，其中X1 係直鏈C7 伸烷基。
  35. 如申請專利範圍第30項至第34項中任一項之化合物，其中Y1 係直鏈C4-9 伸烷基。
  36. 如申請專利範圍第30項至第35項中任一項之化合物，其中Y1 係直鏈C5-9 伸烷基。
  37. 如申請專利範圍第30項至第36項中任一項之化合物，其中Y1 係直鏈C6-8 伸烷基。
  38. 如申請專利範圍第30項至第37項中任一項之化合物，其中Y1 係直鏈C7 伸烷基。
  39. 如申請專利範圍第30項至第38項中任一項之化合物，其中Y2 係
    Figure 03_image004
    。
  40. 如申請專利範圍第30項至第39項中任一項之化合物，其中R1 係C4-12 烯基。
  41. 如申請專利範圍第30項至第40項中任一項之化合物，其中R1 係C9 烯基。
  42. 如申請專利範圍第30項至第41項中任一項之化合物，其中Y1 、Y2 及R1 經選擇以形成16-21個原子之直鏈。
  43. 如申請專利範圍第30項至第42項中任一項之化合物，其中Y1 、Y2 及R1 經選擇以形成16-18個原子之直鏈。
  44. 如申請專利範圍第30項至第43項中任一項之化合物，其中Z1 係直鏈C2-4 伸烷基。
  45. 如申請專利範圍第30項至第44項中任一項之化合物，其中Z1 係C2 伸烷基。
  46. 如申請專利範圍第30項至第39項及第42項至第45項中任一項之化合物，其中R1 係直鏈C4-12 烷基。
  47. 如申請專利範圍第30項至第39項及第42項至第46項中任一項之化合物，其中R1 係直鏈C8-10 烷基。
  48. 如申請專利範圍第30項至第39項及第42項至第47項中任一項之化合物，其中R1 係直鏈C9 烷基。
  49. 如申請專利範圍第30項至第48項中任一項之化合物，其中各R2 係C5-12 烷基。
  50. 如申請專利範圍第30項至第49項中任一項之化合物，其中各R2 係直鏈C5-12 烷基。
  51. 如申請專利範圍第30項至第50項中任一項之化合物，其中各R2 係直鏈C6-10 烷基。
  52. 如申請專利範圍第30項至第51項中任一項之化合物，其中各R2 係直鏈C6-8 烷基。
  53. 如申請專利範圍第30項至第52項中任一項之化合物，其中X1 及R2 部分之一經選擇以形成16-18個原子、包括縮醛之碳原子及氧原子的直鏈。
  54. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物係選自：
    Figure 03_image010
    、      
    Figure 03_image012
    、      
    Figure 03_image014
    、      
    Figure 03_image016
    、      
    Figure 03_image018
    、      
    Figure 03_image018
    、      
    Figure 03_image020
    、      
    Figure 03_image022
    、      
    Figure 03_image024
    、      
    Figure 03_image026
    、      
    Figure 03_image028
    、      
    Figure 03_image030
    、      
    Figure 03_image032
    、      
    Figure 03_image034
    、      
    Figure 03_image036
    、      
    Figure 03_image038
    、      
    Figure 03_image040
    、             
    Figure 03_image042
    、
    Figure 03_image044
    、
    Figure 03_image046
    、
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    、
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    及      
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    ，
    或其鹽。
  55. 如申請專利範圍第55項之化合物，其中該鹽係醫藥學上可接受之鹽。
  56. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中該化合物之質子化形式的pKa為約5.1至約8.0。
  57. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中該化合物之質子化形式的pKa為約5.7至約6.4。
  58. 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中該化合物之質子化形式的pKa為約5.8至約6.2。
  59. 如申請專利範圍第1項至第56項中任一項之化合物，其中該化合物之質子化形式的pKa為約5.5至約6.0。
  60. 如申請專利範圍第59項之化合物，其中該化合物之質子化形式的pKa為約6.1至約6.3。
  61. 一種組合物，該組合物包含如前述申請專利範圍中任一項之化合物及脂質組分。
  62. 如申請專利範圍第61項之組合物，其中該組合物包含約50%之如前述申請專利範圍中任一項之化合物及脂質組分。
  63. 如申請專利範圍第61項或第62項之組合物，其中該組合物係LNP組合物。
  64. 如申請專利範圍第61項至第63項中任一項之組合物，其中該脂質組分包含輔助脂質及PEG脂質。
  65. 如申請專利範圍第61項至第64項中任一項之組合物，其中該脂質組分包含輔助脂質、PEG脂質及中性脂質。
  66. 如申請專利範圍第61項至第65項中任一項之組合物，該組合物進一步包含低溫保護劑。
  67. 如申請專利範圍第61項至第66項中任一項之組合物，該組合物進一步包含緩衝液。
  68. 如申請專利範圍第61項至第67項中任一項之組合物，該組合物進一步包含核酸組分。
  69. 如申請專利範圍第68項之組合物，其中該核酸組分係RNA或DNA組分。
  70. 如申請專利範圍第68項或第69項之組合物，其中該組合物之N/P比率為約3-10。
  71. 如申請專利範圍第70項之組合物，其中該N/P比率為約6 ± 1。
  72. 如申請專利範圍第70項之組合物，其中該N/P比率為約6 ± 0.5。
  73. 如申請專利範圍第70項之組合物，其中該N/P比率為約6。
  74. 如申請專利範圍第61項至第73項中任一項之組合物，該組合物包含RNA組分，其中該RNA組分包含mRNA。
  75. 如申請專利範圍第74項之組合物，其中該RNA組分包含RNA導嚮之DNA結合劑，諸如Cas核酸酶mRNA。
  76. 如申請專利範圍第74項或第75項之組合物，其中該RNA組分包含2類Cas核酸酶mRNA。
  77. 如申請專利範圍第74項至第76項中任一項之組合物，其中該RNA組分包含Cas9核酸酶mRNA。
  78. 如申請專利範圍第74項至第77項中任一項之組合物，其中該mRNA係經修飾之mRNA。
  79. 如申請專利範圍第74項至第78項中任一項之組合物，其中該RNA組分包含gRNA核酸。
  80. 如申請專利範圍第79項之組合物，其中該gRNA核酸係gRNA。
  81. 如申請專利範圍第74項至第78項中任一項之組合物，其中該RNA組分包含2類Cas核酸酶mRNA及gRNA。
  82. 如申請專利範圍第79項至第81項中任一項之組合物，其中該gRNA核酸係或編碼雙重嚮導RNA (dgRNA)。
  83. 如申請專利範圍第79項至第81項中任一項之組合物，其中該gRNA核酸係或編碼單一嚮導RNA (sgRNA)。
  84. 如申請專利範圍第79項至第83項中任一項之組合物，其中該gRNA係經修飾之gRNA。
  85. 如申請專利範圍第84項之組合物，其中該經修飾之gRNA包含在5’端的前五個核苷酸中之一或多者處的修飾。
  86. 如申請專利範圍第84項或第85項之組合物，其中該經修飾之gRNA包含在3’端的後五個核苷酸中之一或多者處的修飾。
  87. 如申請專利範圍第61項至第86項中任一項之組合物，該組合物進一步包含至少一種模板核酸。
  88. 一種基因編輯之方法，該方法包括使細胞與如申請專利範圍第61項至第87項中任一項之組合物接觸。
  89. 一種裂解DNA之方法，該方法包括使細胞與如申請專利範圍第61項至第87項中任一項之組合物接觸。
  90. 如申請專利範圍第89項之方法，其中該接觸步驟產生單股DNA切口。
  91. 如申請專利範圍第89項之方法，其中該接觸步驟產生雙股DNA斷裂。
  92. 如申請專利範圍第88項之方法，其中該組合物包含2類Cas mRNA及嚮導RNA核酸。
  93. 如申請專利範圍第88項或第92項之方法，該方法進一步包括向該細胞中引入至少一種模板核酸。
  94. 如申請專利範圍第93項之方法，該方法包括使該細胞與包含模板核酸之組合物接觸。
  95. 如申請專利範圍第88項至第94項中任一項之方法，其中該方法包括向動物投與該組合物。
  96. 如申請專利範圍第88項至第95項中任一項之方法，其中該方法包括向人類投與該組合物。
  97. 如申請專利範圍第88項至第94項中任一項之方法，其中該方法包括向細胞投與該組合物。
  98. 如申請專利範圍第97項之方法，其中該細胞係真核細胞。
  99. 如申請專利範圍第88項之方法，其中該方法包括投與調配於第一LNP組合物及第二LNP組合物中之mRNA，該第一LNP組合物及該第二LNP組合物包含mRNA、gRNA、gRNA核酸及模板核酸中之一或多者。
  100. 如申請專利範圍第99項之方法，其中該第一LNP組合物及該第二LNP組合物係同時投與。
  101. 如申請專利範圍第99項之方法，其中該第一LNP組合物及該第二LNP組合物係依序投與。
  102. 如申請專利範圍第99項之方法，其中該方法包括投與調配於單一LNP組合物中之該mRNA及該嚮導RNA核酸。
  103. 如申請專利範圍第88項至第102項中任一項之方法，其中該基因編輯引起基因剔除。
  104. 如申請專利範圍第88項至第102項中任一項之方法，其中該基因編輯引起基因修正。
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