CN113039174A - 可电离的胺脂质 - Google Patents

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Abstract

本公开提供可电离的胺脂质及其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其可用于递送生物活性剂，例如将生物活性剂递送到细胞以制备工程化细胞。本文公开的可电离的胺脂质可用作基于脂质纳米颗粒的组合物的配制中的可电离脂质。

Description

可电离的胺脂质
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月2日提交的美国临时专利申请号62/740274的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
背景技术
用可电离的含胺脂质配制的脂质纳米颗粒可以用作用于将生物活性剂，特别是多核苷酸，诸如RNA、mRNA和向导RNA递送到细胞中的货物媒介物。含有可电离的脂质的LNP组合物可促进寡核苷酸剂递送穿过细胞膜，并且可用于将用于基因编辑的组分和组合物引入活细胞中。特别难以递送到细胞的生物活性剂包括蛋白质、基于核酸的药物及其衍生物，特别是包含相对大的寡核苷酸如mRNA的药物。用于将有前景的基因编辑技术递送到细胞中，例如用于递送CRISPR/Cas9系统组分的组合物受到特别关注(例如，编码核酸酶的mRNA和相关的向导RNA(gRNA))。
需要用于将CRISPR/Cas的蛋白质和核酸组分递送到细胞如患者中的细胞的组合物。特别地，用于递送编码CRISPR蛋白组分的mRNA和用于递送CRISPR向导RNA的组合物受到特别关注。具有用于体外和体内递送的有用性质的组合物也受到特别关注，所述组合物可稳定化和递送RNA组分。
发明内容
本公开提供可用于配制脂质纳米颗粒(LNP)组合物的含胺脂质。这样的LNP组合物可具有有利于将核酸货物如CRISPR/Cas基因编辑组分递送到细胞的性质。
在某些实施方案中，本发明涉及一种式I化合物
Figure BDA0003041605620000021
其中，在每次出现时独立地，
X1为C5-11亚烷基，
Y1为C3-11亚烷基，
Y2为
Figure BDA0003041605620000022
其中a1为与Y1键合的键，并且a2为与R1键合的键，
Z1为C2-4亚烷基，
Z2选自-OH、-NH2、-OC(＝O)R3、-OC(＝O)NHR3、-NHC(＝O)NHR3和-NHS(＝O)2R3，
R1为C4-12烷基或C3-12烯基，
每个R2独立地为C4-12烷基，并且
R3为C1-3烷基，
或其盐。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中所述盐为药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中X1为直链C5-11亚烷基，例如直链C6-10亚烷基，优选直链C7亚烷基或直链C9亚烷基。在某些实施方案中，X1为直链C8亚烷基。在某些实施方案中，X1为直链C6亚烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中Y1为直链C4-9亚烷基，例如，Y1为直链C5-9亚烷基或直链C6-8亚烷基，优选地，Y1为直链C7亚烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中Y2为
Figure BDA0003041605620000031
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中R1为C4-12烯基，诸如C9烯基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中选择Y1、Y2和R1以形成16-21个原子、优选16-18个原子的直链。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中Z1为直链C2-4亚烷基，优选Z1为C2亚烷基或C3亚烷基。
在某些实施方案中，Z2为-OH。在一些实施方案中，Z2为-NH2。在某些实施方案中，Z2选自-OC(＝O)R3、-OC(＝O)NHR3、-NHC(＝O)NHR3和-NHS(＝O)2R3，例如，Z2为-OC(＝O)R3或-OC(＝O)NHR3。在一些实施方案中，Z2为-NHC(＝O)NHR3或-NHS(＝O)2R3。
在某些实施方案中，R3为甲基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中R1为直链C4-12烷基，例如R1为直链C6-11烷基，诸如直链C8-10烷基，优选R1为直链C9烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中R1为支链C6-12烷基，例如R1为支链C7-11烷基，诸如支链C8烷基、支链C9烷基或支链C10烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2独立地为C5-12烷基，诸如直链C5-12烷基。在一些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2独立地为直链C6-10烷基，例如直链C6-8烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2独立地为支链C5-12烷基。在一些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2独立地为支链C6-10烷基，例如支链C7-9烷基，诸如支链C8烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中选择X1和R2部分之一以形成16-18个原子的直链，所述原子包括缩醛的碳和氧原子。
在某些实施方案中，本公开涉及一种式II化合物：
Figure BDA0003041605620000041
其中，在每次出现时独立地，
X1为C5-11亚烷基，
Y1为C3-10亚烷基，
Y2为
Figure BDA0003041605620000042
其中a1为与Y1键合的键，并且a2为与R1键合的键，
Z1为C2-4亚烷基，
R1为C4-12烷基或C3-12烯基，
每个R2独立地为C4-12烷基，
或其盐。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中所述盐为药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中X1为直链C5-11亚烷基，例如直链C6-8亚烷基，优选直链C7亚烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中Y1为直链C5-9亚烷基，例如，Y1为C4-9亚烷基或直链C6-8亚烷基，优选地，Y1为直链C7亚烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中Y2为
Figure BDA0003041605620000051
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中R1为C4-12烯基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中选择Y1、Y2和R1以形成16-21个原子、优选16-18个原子的直链。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中Z1为直链C2-4亚烷基，优选Z1为C2亚烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中R1为直链C4-12烷基，例如R1为直链C8-10烷基，优选R1为直链C9烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2为C5-12烷基，诸如直链C5-12烷基。在一些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2为直链C6-10烷基，例如直链C6-8烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中选择X1和R2部分之一以形成16-18个原子的直链，所述原子包括缩醛的碳和氧原子。
在某些实施方案中，本发明涉及一种化合物，其选自：
Figure BDA0003041605620000061
Figure BDA0003041605620000071
Figure BDA0003041605620000081
Figure BDA0003041605620000091
Figure BDA0003041605620000101
Figure BDA0003041605620000111
Figure BDA0003041605620000121
或其盐，优选药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中所述化合物的质子化形式的pKa为约5.1至约8.0，例如约5.7至约6.5、约5.7至约6.4或约5.8至约6.2。在一些实施方案中，化合物的质子化形式的pKa为约5.5至约6.0。在某些实施方案中，化合物的质子化形式的pKa为约6.1至约6.3。
在某些实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含本文所述的任何化合物和脂质组分，例如包含约50％的前述权利要求中任一项的化合物和脂质组分，例如胺脂质，优选式(I)或式(II)化合物。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何组合物，其中所述组合物为LNP组合物。例如，本发明涉及一种LNP组合物，其包含本文所述的任何化合物和脂质组分。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中脂质组分包含辅助脂质和PEG脂质。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中脂质组分包含辅助脂质、PEG脂质和中性脂质。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其还包含冷冻保护剂。在某些实施方案中，本发明涉及本文描述的任何LNP组合物，其还包含缓冲液。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其还包含核酸组分。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其还包含RNA或DNA组分。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中LNP组合物具有约3-10的N/P比，例如N/P比为约6±1，或者N/P比为约6±0.5。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中LNP组合物具有约6的N/P比。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中RNA组分包含mRNA。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中RNA组分包含RNA导向的DNA结合剂，例如Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA或Cas9核酸酶mRNA。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中mRNA为修饰的mRNA。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中RNA组分包含gRNA核酸。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中gRNA核酸为gRNA。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的LNP组合物，其中RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中gRNA核酸为或编码双向导RNA(dgRNA)。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中gRNA核酸为或编码单向导RNA(sgRNA)。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中gRNA为修饰的gRNA。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中修饰的gRNA在5'端的前五个核苷酸中的一个或多个处包含修饰。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其中修饰的gRNA在3'端的最后五个核苷酸中的一个或多个处包含修饰。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何LNP组合物，其还包含至少一种模板核酸。
在某些实施方案中，本发明涉及一种基因编辑的方法，其包括使细胞与LNP接触。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其包括裂解DNA。
在某些实施方案中，本发明涉及一种裂解DNA的方法，其包括使细胞与LNP组合物接触。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其中裂解步骤包括引入单链DNA切口。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其中裂解步骤包括引入双链DNA断裂。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其中LNP组合物包含2类Cas mRNA和向导RNA核酸。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其还包括将至少一种模板核酸引入细胞中。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其包括使细胞与包含模板核酸的LNP组合物接触。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述方法包括将LNP组合物施用到动物，例如人。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述方法包括将LNP组合物施用到细胞，诸如真核细胞。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述方法包括施用配制在第一LNP组合物和第二LNP组合物中的所述mRNA，所述第二LNP组合物包含mRNA、gRNA、gRNA核酸和模板核酸中的一种或多种。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中第一LNP组合物和第二LNP组合物同时施用。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中第一LNP组合物和第二LNP组合物顺序施用。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述方法包括施用配制在单一LNP组合物中的mRNA和向导RNA核酸。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中基因编辑导致基因敲除。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中基因编辑导致基因校正。
附图说明
图1是显示如实施例52中的所述的使用包含式(I)或式(II)化合物或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中B2M编辑百分比的图形。
图2A是显示如实施例53中所述的使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物(化合物1)或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中TTR编辑百分比的图形。还显示剂量反应数据。
图2B是显示如实施例53中所述的血清TTR(μg/mL)的图形。还显示剂量反应数据。
图2C是显示如实施例53中所述的血清TTR(％TSS)的图形。还显示剂量反应数据。
图3是显示如实施例53中所述的使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物(化合物1)或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中B2M编辑的剂量反应百分比的图形。
图4是显示如实施例54中所述的使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物(化合物4)或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中B2M编辑的剂量反应百分比的图形。
图5A是显示如实施例55中所述的使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中TTR编辑百分比的图形。还显示剂量反应数据。
图5B是显示如实施例55中所述的血清TTR(μg/mL)的图形。还显示剂量反应数据。
图5C是显示如实施例55中所述的血清TTR(％TSS)的图形。还显示剂量反应数据。
图6A是显示如实施例58中所述的使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中TTR编辑百分比的图形。
图6B是显示如实施例58中所述的血清TTR(μg/mL)的图形。
图7A是显示如实施例59中所述的使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中TTR编辑百分比的图形。
图7B是显示如实施例59中所述的血清TTR(μg/mL)的图形。
图8A是显示如实施例60中所述的使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中TTR编辑百分比的图形。
图8B是显示如实施例60中所述的血清TTR(μg/mL)的图形。
图9A是显示如实施例61中所述的使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中TTR编辑百分比的图形。
图9B是显示如实施例61中所述的血清TTR(μg/mL)的图形。
图10A是显示如实施例62中所述的使用包含化合物19、式(I)或式(II)化合物或对照的LNP递送之后小鼠肝细胞中TTR编辑百分比的图形。
图10B是显示如实施例62中所述的血清TTR(μg/mL)的图形。
具体实施方式
本公开提供可用于将生物活性剂递送到细胞的脂质，特别是可电离的脂质，以及制备和使用这类组合物的方法，所述生物活性剂包括核酸，诸如CRISPR/Cas组分RNA(“货物”)。提供所述脂质及其药学上可接受的盐，任选地作为包含所述脂质的组合物，包括LNP组合物。在某些实施方案中，LNP组合物可包含生物活性剂，例如RNA组分，和脂质组分，所述脂质组分包括如本文所定义的式(I)或式(II)化合物。在某些实施方案中，RNA组分包括RNA。在一些实施方案中，RNA组分包含核酸。在一些实施方案中，脂质用于将生物活性剂，例如核酸如mRNA递送到细胞如肝细胞。在某些实施方案中，RNA组分包括gRNA和任选地编码2类Cas核酸酶的mRNA。还提供使用这些组合物的基因编辑方法和制造工程化细胞的方法。
脂质纳米颗粒组合物
本文公开用于递送生物活性剂的各种LNP组合物，所述生物活性剂诸如为核酸，例如mRNA和向导RNA，包括CRISPR/Cas货物。这样的LNP组合物包括“可电离的胺脂质”以及中性脂质、PEG脂质和辅助脂质。“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指但不限于包含通过分子间力彼此物理缔合的多种(即，多于一种)LNP组分的颗粒。
脂质
本公开提供可用于LNP组合物的脂质。
在某些实施方案中，本发明涉及一种式I化合物
Figure BDA0003041605620000181
其中，在每次出现时独立地，
X1为C5-11亚烷基，
Y1为C3-11亚烷基，
Y2为
Figure BDA0003041605620000191
其中a1为与Y1键合的键，并且a2为与R1键合的键，
Z1为C2-4亚烷基，
Z2选自-OH、-NH2、-OC(＝O)R3、-OC(＝O)NHR3、-NHC(＝O)NHR3和-NHS(＝O)2R3，
R1为C4-12烷基或C3-12烯基，
每个R2独立地为C4-12烷基，并且
R3为C1-3烷基，
或其盐。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中所述盐为药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中X1为直链C5-11亚烷基，例如直链C6-10亚烷基，优选直链C7亚烷基或直链C9亚烷基。在某些实施方案中，X1为直链C8亚烷基。在某些实施方案中，X1为直链C6亚烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中Y1为直链C4-9亚烷基，例如，Y1为直链C5-9亚烷基或直链C6-8亚烷基，优选地，Y1为直链C7亚烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中Y2为
Figure BDA0003041605620000192
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中R1为C4-12烯基，诸如C9烯基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中选择Y1、Y2和R1以形成16-21个原子、优选16-18个原子的直链。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中Z1为直链C2-4亚烷基，优选Z1为C2亚烷基或C3亚烷基。
在某些实施方案中，Z2为-OH。在一些实施方案中，Z2为-NH2。在某些实施方案中，Z2选自-OC(＝O)R3、-OC(＝O)NHR3、-NHC(＝O)NHR3和-NHS(＝O)2R3，例如，Z2为-OC(＝O)R3或-OC(＝O)NHR3。在一些实施方案中，Z2为-NHC(＝O)NHR3或-NHS(＝O)2R3。
在某些实施方案中，R3为甲基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中R1为直链C4-12烷基，例如R1为直链C6-11烷基，诸如直链C8-10烷基，优选R1为直链C9烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中R1为支链C6-12烷基，例如R1为支链C7-11烷基，诸如支链C8烷基、支链C9烷基或支链C10烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2独立地为C5-12烷基，诸如直链C5-12烷基。在一些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2独立地为直链C6-10烷基，例如直链C6-8烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2独立地为支链C5-12烷基。在一些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中每个R2独立地为支链C6-10烷基，例如支链C7-9烷基，诸如支链C8烷基。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的任何化合物，其中选择X1和R2部分之一以形成16-18个原子的直链，所述原子包括缩醛的碳和氧原子。
在某些实施方案中，脂质是具有式(II)结构的化合物：
Figure BDA0003041605620000211
其中，在每次出现时独立地，
X1为C5-11亚烷基；
Y1为C3-10亚烷基；
Y2为
Figure BDA0003041605620000212
其中a1为与Y1键合的键，并且a2为与R1键合的键；
Z1为C2-4亚烷基；
R1为C4-12烷基或C3-12烯基；并且
每个R2独立地为C4-12烷基，
或其盐，诸如其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，X1为直链C5-11亚烷基，优选直链C6-8亚烷基，更优选C7亚烷基。
在某些实施方案中，Y1为直链C5-9亚烷基，例如直链C6-8亚烷基或直链C4-9亚烷基，优选直链C7亚烷基。
在某些实施方案中，Y2为
Figure BDA0003041605620000221
在一些实施方案中，R1为C4-12烷基，优选直链C8-10烷基，更优选直链C9烷基。在一些实施方案中，R1为C4-12烯基。
在某些实施方案中，Z1为直链C2-4亚烷基，优选C2亚烷基。
在某些实施方案中，R2为直链C5-12烷基，例如直链C6-10烷基，诸如直链C6-8烷基。
代表性的式(I)化合物包括：
Figure BDA0003041605620000222
Figure BDA0003041605620000231
Figure BDA0003041605620000241
Figure BDA0003041605620000251
Figure BDA0003041605620000261
Figure BDA0003041605620000271
Figure BDA0003041605620000281
Figure BDA0003041605620000291
在某些实施方案中，如本文所公开配制的脂质组合物中至少75％的式(I)或式(II)化合物在施用后8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从受试者的血浆中清除。在某些实施方案中，至少50％的包含如本文所公开的式(I)或式(II)化合物的脂质组合物在施用后8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从受试者的血浆中清除，这可例如通过测量脂质(例如式(I)或式(II)化合物)、RNA(例如mRNA)或血浆中的其他组分来确定。在某些实施方案中，测量脂质组合物的包封脂质和游离脂质、RNA或核酸组分。
脂质清除可如文献中所述测量。参见Maier,M.A.等人，Biodegradable LipidsEnabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAiTherapeutics.Mol.Ther.2013,21(8),1570-78(“Maier”)。例如，在Maier中，通过经侧尾静脉进行的静脉推注，以0.3mg/kg对六至八周龄雄性C57Bl/6小鼠施用含有靶向荧光素酶的siRNA的LNP-siRNA系统。在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96和168小时收集血液、肝脏和脾脏样品。在组织收集之前用盐水灌注小鼠，并处理血液样品以获得血浆。处理所有样品并通过LC-MS分析。另外，Maier描述评估施用LNP-siRNA组合物后的毒性的工序。例如，以5mL/kg的剂量体积，经单次静脉推注，以0、1、3、5和10mg/kg(5只动物/组)对雄性Sprague-Dawley大鼠施用靶向荧光素酶的siRNA。24小时后，从有意识的动物的颈静脉获得约1mL血液，并分离血清。在给药后72小时，将所有动物安乐死进行剖检。进行临床病征、体重、血清化学、器官重量和组织病理学的评估。尽管Maier描述用于评估siRNA-LNP组合物的方法，但这些方法可用于评估施用本公开的脂质组合物如LNP组合物的清除、药代动力学和毒性。
在某些实施方案中，使用本文公开的式(I)或式(II)化合物的脂质组合物相对于替代性可电离的胺脂质表现出增加的清除率。在一些这样的实施方案中，清除率为脂质清除率，例如式(I)或式(II)化合物从血液、血清或血浆中清除的速率。在一些实施方案中，清除率为货物(例如生物活性剂)清除率，例如货物组分从血液、血清或血浆清除的速率。在一些实施方案中，清除率为RNA清除率，例如从血液、血清或血浆中清除mRNA或gRNA的速率。在一些实施方案中，清除率为LNP从血液、血清或血浆中清除的速率。在一些实施方案中，清除率为LNP从组织如肝组织或脾组织中清除的速率。理想地，高清除率可引起没有实质性副作用的安全性特征，和/或在循环和/或组织中的LNP累积减少。
本公开的式(I)或式(II)化合物可取决于它们所处的介质的pH而形成盐。例如，在弱酸性介质中，式(I)或式(II)化合物可质子化，并且因此带有正电荷。相反，在弱碱性介质中，例如pH为大约7.35的血液中，式(I)或式(II)化合物可未质子化，并且因此不带电荷。在一些实施方案中，本公开的式(I)或式(II)化合物可在至少约9的pH下主要质子化。在一些实施方案中，本公开的式(I)或式(II)化合物可在至少约10的pH下主要质子化。
式(I)或式(II)化合物主要质子化时的pH与其固有pKa有关。在优选的实施方案中，本公开的式(I)或式(II)化合物的盐具有在约5.1至约8.0，甚至更优选约5.5至约7.5，例如约6.1至约6.3范围内的pKa。在优选的其他实施方案中，本公开的式(I)化合物的盐具有在约5.3至约8.0，例如约5.7至约6.5范围内的pKa。在其他实施方案中，本公开的式(I)或式(II)化合物的盐具有在约5.7至约6.4，例如约5.8至约6.2范围内的pKa。在其他优选的实施方案中，本公开的式(I)化合物的盐具有在约5.7至约6.5，例如约5.8至约6.4范围内的pKa。替代地，本公开的式(I)或式(II)化合物的盐具有在约5.8至约6.5范围内的pKa。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的质子化形式的pKa为约5.5至约6.0。本公开的式(I)或式(II)化合物的盐可具有在约6.0至约8.0，优选约6.0至约7.5范围内的pKa。式(I)或式(II)化合物的盐的pKa可为配制LNP中的重要考虑因素，因为已经发现用具有在约5.5至约7.0范围内的pKa的某些脂质配制的LNP对于体内递送货物例如到肝脏是有效的。另外，已经发现用具有在约5.3至约6.4范围内的pKa的某些脂质配制的LNP对于体内递送例如到肿瘤是有效的。参见，例如WO 2014/136086。
额外脂质
适用于本公开的脂质组合物中的“中性脂质”包括例如多种中性脂质、不带电脂质或两性离子型脂质。适用于本公开的中性磷脂的实例包括但不限于二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺及其组合。在某些实施方案中，中性磷脂可选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，优选二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
“辅助脂质”包括类固醇、固醇和烷基间苯二酚。适用于本公开的辅助脂质包括但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在某些实施方案中，辅助脂质可为胆固醇或其衍生物，诸如胆固醇半琥珀酸酯。
PEG脂质可影响纳米颗粒可在体内(例如，在血液中)存在的时间长度。PEG脂质可通过例如降低颗粒聚集和控制粒度而有助于配制过程。本文所用的PEG脂质可调节LNP的药代动力学性质。通常，PEG脂质包含脂质部分和基于PEG(有时称为聚(环氧乙烷))(PEG部分)的聚合物部分。适用于具有本公开的式(I)或式(II)化合物的脂质组合物的PEG脂质和关于这类脂质的生物化学的信息可在Romberg等人，Pharmaceutical Research 25(1),2008，第55-71页和Hoekstra等人，Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52中见到。额外合适的PEG脂质公开于例如WO 2015/095340(第31页第14行至第37页第6行)、WO 2006/007712和WO 2011/076807(“隐形脂质”)中。
在一些实施方案中，脂质部分可衍生自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，包括包含二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团的那些，所述二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团具有独立地包含约C4至约C40个饱和或不饱和碳原子的烷基链长，其中所述链可包含一个或多个官能团，例如酰胺或酯。在一些实施方案中，烷基链长度包含约C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团还可包含一个或多个取代的烷基。链长可为对称的或不对称的。
除非另外指明，否则本文所用的术语“PEG”意指任何聚乙二醇或其他聚亚烷基醚聚合物，诸如任选取代的线性或支化的乙二醇或环氧乙烷聚合物。在某些实施方案中，PEG部分是未取代的。替代地，PEG部分可被例如一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。例如，PEG部分可包含PEG共聚物，诸如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见，例如，J.MiltonHarris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedicalapplications(1992))；替代地，PEG部分可为PEG均聚物。在某些实施方案中，PEG部分具有约130至约50,000，例如约150至约30,000，或甚至约150至约20,000的分子量。类似地，PEG部分可具有约150至约15,000、约150至约10,000、约150至约6,000、或甚至约150至约5,000的分子量。在某些优选的实施方案中，PEG部分具有约150至约4,000、约150至约3,000、约300至约3,000、约1,000至约3,000、或约1,500至约2,500的分子量。
在某些优选的实施方案中，PEG部分为“PEG-2K”，也称为“PEG2000”，其具有约2,000道尔顿的平均分子量。PEG-2K在此由下式(II)表示，其中n为45，意味着数均聚合度包含约45个亚单位
Figure BDA0003041605620000331
然而，可以使用本领域已知的其他PEG实施方案，包括例如其中数均聚合度包含约23个亚单位(n＝23)和/或68个亚单位(n＝68)的那些。在一些实施方案中，n可在约30至约60的范围内。在一些实施方案中，n可在约35至约55的范围内。在一些实施方案中，n可在约40至约50的范围内。在一些实施方案中，n可在约42至约48的范围内。在一些实施方案中，n可为45。在一些实施方案中，R可选自H、取代的烷基和未取代的烷基。在一些实施方案中，R可为未取代的烷基，诸如甲基。
在本文所述的任一实施方案中，PEG脂质可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，得自NOF,Tokyo,Japan)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)(目录号DSPE-020CN，NOF,Tokyo,Japan)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(目录号880120C，得自Avanti Polar Lipids,Alabaster,Alabama,USA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，NOF Tokyo,Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在某些这样的实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMG。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSG。在其他实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSPE。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMA。在再其他实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C-DMA。在某些实施方案中，PEG脂质可为化合物S027，其公开于WO2016/010840(第[00240]段至第[00244]段)中。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSA。在其他实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C11。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C14。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C16。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C18。
适用于本发明的脂质组合物的阳离子脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、N-(1-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油酰基氨基甲酰基-3-二甲基铵-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亚麻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲基铵丙烷(DLTAP)、二-十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)、DC-Choi、二油酰氧基-N-[2-(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙三氟乙酸铵(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯氧基)丙胺(DODMA)、2-[5'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯氧基苯甲胺(DMOBA)和1,2-N,N'-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)。在一个实施方案中，阳离子脂质为DOTAP或DLTAP。
适用于本发明的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)和赖氨酰磷脂酰甘油。
脂质组合物
本发明提供一种脂质组合物，其包含至少一种式(I)或式(II)化合物或其盐(例如，其药学上可接受的盐)和至少一种其他脂质组分。这样的组合物还可含有生物活性剂，任选地与一种或多种其他脂质组分组合。在一些实施方案中，脂质组合物包含脂质组分和包含生物活性剂的水性组分。
在一个实施方案中，脂质组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种其他脂质组分。在另一个实施方案中，脂质组合物还包含生物活性剂，任选地与一种或多种其他脂质组分组合。在另一个实施方案中，脂质组合物为脂质体的形式。在另一个实施方案中，脂质组合物为脂质纳米颗粒(LNP)的形式。在另一个实施方案中，脂质组合物适于递送到肝脏。
在一个实施方案中，脂质组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以及另一种脂质组分。这样的其他脂质组分包括但不限于中性脂质、辅助脂质、PEG脂质、阳离子脂质和阴离子脂质。在某些实施方案中，脂质组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐和中性脂质如DSPC，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在另一个实施方案中，脂质组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐和辅助脂质如胆固醇，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在另外的实施方案中，脂质组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐和PEG脂质，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在另外的实施方案中，脂质组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐和阳离子脂质，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在另外的实施方案中，脂质组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐和阴离子脂质，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在一个子实施方案中，脂质组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐、辅助脂质和PEG脂质，任选地具有中性脂质。在另外的子实施方案中，脂质组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐、辅助脂质、PEG脂质和中性脂质。
含有式(I)或式(II)脂质或其药学上可接受的盐的组合物或其脂质组合物可为各种形式，包括但不限于可用于递送各种分子到细胞的颗粒形成递送剂，所述颗粒形成递送剂包括微粒、纳米颗粒和转染剂。具体组合物在转染或递送生物活性剂方面是有效的。优选的生物活性剂为RNA和DNA。在另外的实施方案中，生物活性剂选自mRNA、gRNA和DNA。在某些实施方案中，货物包括编码RNA导向的DNA结合剂(例如Cas核酸酶、2类Cas核酸酶或Cas9)的mRNA，和gRNA或编码gRNA的核酸，或mRNA与gRNA的组合。
用于上述脂质组合物的示例性式(I)化合物在实施例中给出。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物1。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物2。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物3。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物4。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物5。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物6。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物7。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物8。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物9。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物10。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物11。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物12。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物13。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物14。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物15。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物16。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物17。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物20。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物21。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物22。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物23。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物24。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物25。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物27。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物28。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物29。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物30。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物31。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物32。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物33。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物34。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物35。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物36。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物37。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物38。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物39。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物40。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物41。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物42。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物43。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物44。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物45。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物46。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物47。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物48。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物49。在某些实施方案中，式(I)化合物为化合物50。在某些实施方案中，化合物为选自表1中化合物的化合物，条件是所述化合物不是化合物18、化合物19或化合物26。
LNP组合物
脂质组合物可作为LNP组合物提供。脂质纳米颗粒可为例如微球(包括单层和多层囊泡，例如“脂质体”-层状相脂质双层，其在一些实施方案中实质上是球形的，并且在更具体的实施方案中可包含水性核，例如包含实质部分的RNA分子)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
LNP的尺寸为约1nm至约1,000nm、约10nm至约500nm、约20nm至约500nm，在一个子实施方案中为约50nm至约400nm，在一个子实施方案中为约50nm至约300nm，在一个子实施方案中为约50nm至约200nm，在一个子实施方案中为约50nm至约150nm，且在另一个子实施方案中为约60nm至约120nm。优选地，LNP具有约60nm至约100nm的尺寸。完全形成的LNP的平均尺寸(直径)可通过在Malvern Zetasizer上的动态光散射来测量。将LNP样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，使得计数速率为大约200-400kcps。数据表示为强度度量的加权平均值。
本公开的实施方案提供根据组合物中的组分脂质的相应摩尔比描述的脂质组合物。所有的摩尔％数都作为脂质组合物或更具体地LNP组合物的脂质组分的分数给出。在某些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的摩尔％可为约30摩尔％至约70摩尔％。在某些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的摩尔％可为至少30摩尔％、至少40摩尔％、至少50摩尔％或至少60摩尔％。
在某些实施方案中，中性脂质的摩尔％可为约0摩尔％至约30摩尔％。在某些实施方案中，中性脂质的摩尔％可为约0摩尔％至约20摩尔％。在某些实施方案中，中性脂质的摩尔％可为约9摩尔％。
在某些实施方案中，辅助脂质的摩尔％可为约0摩尔％至约80摩尔％。在某些实施方案中，辅助脂质的摩尔％可为约20摩尔％至约60摩尔％。在某些实施方案中，辅助脂质的摩尔％可为约30摩尔％至约50摩尔％。在某些实施方案中，辅助脂质的摩尔％可为30摩尔％至约40摩尔％或约35摩尔％至约45摩尔％。在某些实施方案中，辅助脂质的摩尔％基于式(I)或式(II)化合物、中性脂质和/或PEG脂质浓度调节，以使脂质组分达到100摩尔％。
在某些实施方案中，PEG脂质的摩尔％可为约1摩尔％至约10摩尔％。在某些实施方案中，PEG脂质的摩尔％可为约1摩尔％至约4摩尔％。在某些实施方案中，PEG脂质的摩尔％可为约1摩尔％至约2摩尔％。在某些实施方案中，PEG脂质的摩尔％可为约1.5摩尔％。
在各种实施方案中，LNP组合物包含式(I)或式(II)化合物或其盐(诸如其药学可接受的盐(例如，如本文所公开))、中性脂质(例如，DSPC)、辅助脂质(例如，胆固醇)和PEG脂质(例如，PEG2k-DMG)。在一些实施方案中，LNP组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学可接受的盐(例如，如本文所公开)、DSPC、胆固醇和PEG脂质。在一些这样的实施方案中，LNP组合物包含PEG脂质，所述PEG脂质包含DMG，诸如PEG2k-DMG。在某些优选的实施方案中，LNP组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。
在某些实施方案中，脂质组合物如LNP组合物包含脂质组分和核酸组分，例如RNA组分，并且可测量式(I)或式(II)化合物与核酸的摩尔比。本公开的实施方案还提供脂质组合物，所述脂质组合物具有式(I)或式(II)化合物的药学上可接受的盐的带正电荷的胺基(N)和待包封的核酸的带负电荷的磷酸基团(P)之间的限定的摩尔比。这在数学上可表示为方程N/P。在一些实施方案中，脂质组合物如LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐；和核酸组分，其中N/P比为约3至10。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含式(I)或式(II)化合物或其药学可接受的盐；和RNA组分，其中N/P比为约3至10。例如，N/P比可为约4-7。替代地，N/P比可为约6，例如6±1或6±0.5。
在一些实施方案中，水性组分包含生物活性剂。在一些实施方案中，水性组分包含多肽，任选地与核酸组合。在一些实施方案中，水性组分包含核酸，诸如RNA。在一些实施方案中，水性组分为核酸组分。在一些实施方案中，核酸组分包含DNA，并且其可被称为DNA组分。在一些实施方案中，核酸组分包含RNA。在一些实施方案中，水性组分如RNA组分可包含mRNA，诸如编码RNA导向的DNA结合剂的mRNA。在一些实施方案中，RNA导向的DNA结合剂为Cas核酸酶。在某些实施方案中，水性组分可包含编码Cas9的mRNA。在某些实施方案中，水性组分可包含gRNA。在一些包含编码RNA导向的DNA结合剂的mRNA的组合物中，所述组合物还包含gRNA核酸，诸如gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含RNA导向的DNA结合剂和gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含Cas核酸酶mRNA和gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。
在某些实施方案中，脂质组合物如LNP组合物可包含编码Cas核酸酶如2类Cas核酸酶的mRNA、式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐、辅助脂质，任选地中性脂质和PEG脂质。在包含编码Cas核酸酶如2类Cas核酸酶的mRNA的某些组合物中，辅助脂质为胆固醇。在包含编码Cas核酸酶如2类Cas核酸酶的mRNA的其他组合物中，中性脂质为DSPC。在包含编码Cas核酸酶如2类Cas核酸酶如Cas9的mRNA的额外的实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。在具体的组合物中，所述组合物包含编码Cas核酸酶如2类Cas核酸酶的mRNA和式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐。在某些组合物中，所述组合物还包含gRNA，诸如dgRNA或sgRNA。
在一些实施方案中，脂质组合物如LNP组合物可包含gRNA。在某些实施方案中，组合物可包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐、gRNA、辅助脂质、任选地中性脂质和PEG脂质。在某些包含gRNA的LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在包含gRNA的额外实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。在某些组合物中，gRNA选自dgRNA和sgRNA。
在某些实施方案中，脂质组合物如LNP组合物包含在水性组分中的编码RNA导向的DNA结合剂的mRNA和gRNA以及在脂质组分中的式(I)或式(II)化合物，所述gRNA可为sgRNA。例如，LNP组合物可包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐、编码Cas核酸酶的mRNA、gRNA、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的额外实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。
在某些实施方案中，脂质组合物如LNP组合物包含RNA导向的DNA结合剂如2类CasmRNA和至少一种gRNA。在某些实施方案中，LNP组合物包含约1:1或约1:2的gRNA与RNA导向的DNA结合剂mRNA如2类Cas核酸酶mRNA的比率。在一些实施方案中，所述比率为约25:1至约1:25、约10:1至约1:10、约8:1至约1:8、约4:1至约1:4或约2:1至约1:2。
本文公开的脂质组合物如LNP组合物可包含模板核酸，例如DNA模板。模板核酸可与包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受盐的脂质组合物一起或单独递送，所述脂质组合物包括LNP组合物。在一些实施方案中，根据所需的修复机制，模板核酸可为单链或双链的。模板可具有与靶DNA同源的区域，例如在靶DNA序列内，和/或与靶DNA相邻的序列。
在一些实施方案中，LNP通过将RNA水溶液与基于有机溶剂的脂质溶液混合形成。合适的溶液或溶剂包括或可含有：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、乙醇、氯仿、乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。例如，有机溶剂可为100％乙醇。可使用例如用于体内施用LNP的药学上可接受的缓冲液。在某些实施方案中，使用缓冲液以将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 6.5。在某些实施方案中，使用缓冲液以将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 7.0。在某些实施方案中，组合物具有约7.2至约7.7范围内的pH。在额外的实施方案中，组合物具有约7.3至约7.7范围内或约7.4至约7.6范围内的pH。在另外的实施方案中，组合物具有约7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7的pH。组合物的pH值可用微pH探针测量。在某些实施方案中，冷冻保护剂包含在组合物中。冷冻保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。示例性组合物可包含至多10％冷冻保护剂，例如蔗糖。在某些实施方案中，组合物可包含tris盐水蔗糖(TSS)。在某些实施方案中，LNP组合物可包含约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％冷冻保护剂。在某些实施方案中，LNP组合物可包含约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％蔗糖。在一些实施方案中，LNP组合物可包含缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液可包含磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及其混合物。在某些示例性实施方案中，缓冲液包含NaCl。在某些实施方案中，缓冲液缺乏NaCl。NaCl的示例性量可在约20mM至约45mM范围内。NaCl的示例性量可在约40mM至约50mM范围内。在一些实施方案中，NaCl的量为约45mM。在一些实施方案中，缓冲液为Tris缓冲液。Tris的示例性量可在约20mM至约60mM范围内。Tris的示例性量可在约40mM至约60mM范围内。在一些实施方案中，Tris的量为约50mM。在一些实施方案中，缓冲液包含NaCl和Tris。LNP组合物的某些示例性实施方案含有在Tris缓冲液中的5％蔗糖和45mM NaCl。在其他示例性实施方案中，组合物含有以约5％w/v的量的蔗糖、约45mM NaCl和约50mM Tris pH 7.5。盐、缓冲液和冷冻保护剂的量可以变化，从而维持整个组合物的渗透压。例如，最终渗透压可维持在低于450mOsm/L。在另外的实施方案中，渗透压在350mOsm/L和250mOsm/L之间。某些实施方案具有300+/-20mOsm/L或310+/-40mOsm/L的最终渗透压。
在一些实施方案中，使用RNA水溶液和脂质溶液在有机溶剂中的微流体混合、T混合或交叉混合。在某些方面，流速、接头大小、接头几何形状、接头形状、管径、溶液和/或RNA和脂质浓度可以变化。LNP或LNP组合物可例如经透析、离心过滤、切向流过滤或色谱分离浓缩或纯化。LNP可例如以悬浮液、乳液或冻干粉末的形式储存。在一些实施方案中，LNP组合物在2-8℃下储存，在某些方面，LNP组合物在室温下储存。在额外的实施方案中，LNP组合物被冷冻储存，例如在-20℃或-80℃下储存。在其他实施方案中，LNP组合物在约0℃至约-80℃范围内的温度下储存。冷冻的LNP组合物可在使用前例如在冰上、在室温下或在25℃下解冻。
LNP可为例如微球(包括单层和多层囊泡，例如“脂质体”-在一些实施方案中为实质性球形的层状相脂质双层-并且，在更具体的实施方案中，可包含水性核，例如包含实质部分的RNA分子)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
优选的脂质组合物如LNP组合物是生物可降解的，因为它们在体内以治疗有效剂量并不累积到细胞毒性水平。在一些实施方案中，组合物在治疗剂量水平下不引起导致实质性副作用的先天免疫反应。在一些实施方案中，本文提供的组合物在治疗剂量水平下不导致毒性。
在一些实施方案中，本文公开的LNP具有可在约0.005至约0.75范围内的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，LNP具有可在约0.01至约0.5范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP具有可在约零至约0.4范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP具有可在约零至约0.35范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP具有可在约零至约0.35范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP PDI可在约零至约0.3范围内。在一些实施方案中，LNP具有可在约零至约0.25范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP PDI可在约零至约0.2范围内。在一些实施方案中，LNP具有可小于约0.08、0.1、0.15、0.2或0.4的PDI。
本文公开的LNP具有约1nm至约250nm的尺寸(例如Z-平均直径)。在一些实施方案中，LNP具有约10nm至约200nm的尺寸。在另外的实施方案中，LNP具有约20nm至约150nm的尺寸。在一些实施方案中，LNP具有约50nm至约150nm的尺寸。在一些实施方案中，LNP具有约50nm至约100nm的尺寸。在一些实施方案中，LNP具有约50nm至约120nm的尺寸。在一些实施方案中，LNP具有约60nm至约100nm的尺寸。在一些实施方案中，LNP具有约75nm至约150nm的尺寸。在一些实施方案中，LNP具有约75nm至约120nm的尺寸。在一些实施方案中，LNP具有约75nm至约100nm的尺寸。除非另外指明，否则本文所提及的所有尺寸都是完全成形纳米颗粒的平均尺寸(直径)，如通过Malvern Zetasizer上的动态光散射所测量。将纳米颗粒样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，使得计数速率为大约200-400kcps。数据表示为强度度量的加权平均值(Z-平均直径)。
在一些实施方案中，LNP以约50％至约100％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以约50％至约95％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以约70％至约90％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以约90％至约100％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以约75％至约95％范围内的平均包封效率形成。
货物
经LNP组合物递送的货物可为生物活性剂。在某些实施方案中，所述货物是或包含一种或多种生物活性剂，诸如mRNA、向导RNA、核酸、RNA导向的DNA结合剂、表达载体、模板核酸、抗体(例如单克隆的、嵌合的、人源化的、纳米抗体及其片段等)、胆固醇、激素、肽、蛋白质、化疗剂和其他类型的抗肿瘤剂、低分子量药物、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、形成三螺旋的寡核苷酸、反义DNA或RNA组合物、嵌合DNA:RNA组合物、同种酶、适体、核酶、诱饵及其类似物、质粒和其他类型的载体，以及小核酸分子、RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和“自复制RNA”(编码复制酶活性并能够在体内引导其自身复制或扩增)分子、肽核酸(PNA)、锁核酸核糖核苷酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、sisiRNA(小的内部片段化干扰RNA)和iRNA(不对称干扰RNA)。生物活性剂的上述列表仅是示例性的，而并未意欲是限制性的。这样的化合物可为纯化的或部分纯化的，并且可为天然存在的或合成的，并且可为化学修饰的。
经LNP组合物递送的货物可为RNA，诸如编码目标蛋白的mRNA分子。例如，包括用于表达蛋白质如绿色荧光蛋白(GFP)、RNA导向的DNA结合剂或Cas核酸酶的mRNA。提供LNP组合物，其包含Cas核酸酶mRNA，例如允许在细胞中表达2类Cas核酸酶如Cas9或Cpf1蛋白的2类Cas核酸酶mRNA。另外，货物可含有一种或多种向导RNA或编码向导RNA的核酸。例如用于修复或重组的模板核酸也可包含在组合物中，或者模板核酸可用于本文所述的方法中。在一个子实施方案中，货物包含编码化脓链球菌Cas9的mRNA，任选地和化脓链球菌gRNA。在另一子实施方案中，货物包含编码脑膜炎奈瑟球菌Cas9的mRNA，任选地和nme gRNA。
“mRNA”是指多核苷酸，并且包含可翻译成多肽(即，可作为由核糖体和氨基酰化tRNA翻译的底物)的开放阅读框。mRNA可包含包括核糖残基或其类似物如2’-甲氧基核糖残基的磷酸酯-糖主链。在一些实施方案中，mRNA磷酸酯-糖主链的糖基本上由核糖残基、2’-甲氧基核糖残基或其组合组成。通常，mRNA不含实质量的胸苷残基(例如，0个残基或少于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置处含有修饰的尿苷。
CRISPR/Cas货物
在某些实施方案中，所公开的组合物包含编码RNA导向的DNA结合剂如Cas核酸酶的mRNA。在具体实施方案中，所公开的组合物包含编码2类Cas核酸酶如化脓链球菌Cas9的mRNA。
如本文所用，“RNA导向的DNA结合剂”意指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或这样的复合物的DNA结合亚单位，其中DNA结合活性具有序列特异性并且取决于RNA的序列。示例性RNA导向的DNA结合剂包括Cas裂解酶/切口酶及其未活化形式(“dCas DNA结合剂”)。如本文所用，“Cas核酸酶”涵盖Cas裂解酶、Cas切口酶和dCas DNA结合剂。Cas裂解酶/切口酶和dCas DNA结合剂包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚单位；I型CRISPR系统的级联复合物，其Cas3亚单位；以及2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”为具有RNA导向的DNA结合活性的单链多肽。2类Cas核酸酶包括2类Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A变体)，其还具有RNA导向的DNA裂解酶或切口酶活性；和2类dCas DNA结合剂，其中裂解酶/切口酶活性未被活化。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如，N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如，K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如，K848A,K1003A,R1060A变体)蛋白质及其修饰形式。Cpf1蛋白质(Zetsche等人，Cell,163:1-13(2015))与Cas9同源并且含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以引用的方式整体并入。参见例如Zetsche，表S1和表S3。参见例如Makarova等人，Nat Rev Microbiol,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人，Molecular Cell,60:385-397(2015)。
如本文所用，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指与RNA导向的DNA结合剂如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA结合剂(例如Cas9)一起的向导RNA。在一些实施方案中，向导RNA将RNA导向的DNA结合剂如Cas9导向到靶序列，并且向导RNA与靶序列杂交并且所述剂结合靶序列；在其中所述剂为裂解酶或切口酶的情况下，结合之后可以是裂解或切口。
在本公开的一些实施方案中，用于LNP组合物的货物包含至少一种向导RNA，所述向导RNA包含将RNA导向的DNA结合剂引导至靶DNA的向导序列，所述RNA导向的DNA结合剂可为核酸酶(例如Cas核酸酶，诸如Cas9)。gRNA可将Cas核酸酶或2类Cas核酸酶导向到靶核酸分子上的靶序列。在一些实施方案中，gRNA与2类Cas核酸酶结合并提供由2类Cas核酸酶裂解的特异性。在一些实施方案中，gRNA和Cas核酸酶可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas复合物，诸如CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可为II型CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可为V型CRISPR/Cas复合物，诸如Cpf1/向导RNA复合物。Cas核酸酶和同源gRNA可以配对。与每种2类Cas核酸酶配对的gRNA支架结构随具体CRISPR/Cas系统而变化。
“向导RNA”、“gRNA”和简单的“向导”在本文中可互换地用于指crRNA(也称为CRISPR RNA)或crRNA与trRNA的组合(也称为tracrRNA)。向导RNA可包括如本文所述的修饰的RNA。crRNA和trRNA可作为单个RNA分子(单向导RNA，sgRNA)或在两个单独的RNA分子(双向导RNA，dgRNA)中缔合。“向导RNA”或“gRNA”是指每种类型。trRNA可为天然存在的序列，或者是与天然存在的序列相比具有修饰或变异的trRNA序列。
如本文所用，“向导序列”是指向导RNA内的序列，其与靶序列互补并且发挥作用以将向导RNA引导至靶序列以便通过RNA导向的DNA结合剂结合或修饰(例如裂解)。“向导序列”也可被称为“靶向序列”或“间隔序列”。向导序列的长度可为20个碱基对，例如，在化脓链球菌(即，间谍Cas9)和相关Cas9同源物/直向同源物的情况下。更短或更长的序列也可用作向导，例如长度为15-、16-、17-、18-、19-、21-、22-、23-、24-或25-核苷酸。在一些实施方案中，靶序列例如在基因中或在染色体上，并且与向导序列互补。在一些实施方案中，向导序列与其对应靶序列之间的互补性或同一性的程度可为约或至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，向导序列和靶区域可在至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域上100％互补或相同。在其他实施方案中，向导序列和靶区域可含有至少一个错配。例如，向导序列和靶序列可含有1、2、3或4个错配，其中靶序列的总长度为至少17、18、19、20或更多个碱基对。在一些实施方案中，向导序列和靶区域可含有1-4个错配，其中向导序列包含至少17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，当向导序列包含20个核苷酸时，向导序列和靶区域可含有1、2、3或4个错配。
RNA导向的DNA结合蛋白如Cas蛋白的靶序列包括基因组DNA的正链和负链(即，给定的序列和序列的反向互补序列)，因为Cas蛋白的核酸底物为双链核酸。因此，当向导序列被称为“与靶序列互补”时，应理解，向导序列可引导向导RNA以结合靶序列的反向互补序列。因此，在一些实施方案中，在向导序列结合靶序列的反向互补序列的情况下，除了在向导序列中U取代T之外，向导序列与靶序列(例如，不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸相同。
靶向序列的长度可取决于CRISPR/Cas系统和使用的组分。例如，来自不同细菌物种的不同2类Cas核酸酶具有不同的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列的长度可为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或多于50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列长度比天然存在的CRISPR/Cas系统的向导序列长或短0、1、2、3、4或5个核苷酸。在某些实施方案中，Cas核酸酶和gRNA支架将衍生自相同的CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，靶向序列可包含18-24个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含19-21个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含20个核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，sgRNA为能够介导由Cas9蛋白进行的RNA导向的DNA裂解的“Cas9 sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA为能够介导由Cpf1蛋白进行的RNA导向的DNA裂解的“Cpf1 sgRNA”。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cas9蛋白形成活性复合物并介导RNA导向的DNA裂解的crRNA和tracr RNA。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cpf1蛋白形成活性复合物并介导RNA导向的DNA裂解的crRNA。参见Zetsche 2015。
本发明的某些实施方案还提供编码本文所述的gRNA的核酸，例如表达盒。“向导RNA核酸”在本文中用以指向导RNA(例如sgRNA或dgRNA)和向导RNA表达盒，其为编码一种或多种向导RNA的核酸。
修饰的RNA
在某些实施方案中，脂质组合物如LNP组合物包含修饰的核酸，包括修饰的RNA。
修饰的核苷或核苷酸可存在于RNA，例如gRNA或mRNA中。将包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的gRNA或mRNA例如称为“修饰的”RNA，以描述替代或附加至规范A、G、C和U残基使用的一个或多个非天然和/或天然存在的组分或配置的存在。在一些实施方案中，用非规范核苷或核苷酸(本文中称为“修饰的”)合成修饰的RNA。
修饰的核苷和核苷酸可包含以下一种或多种：(i)改变，例如替换一个或两个非连接磷酸氧和/或主链磷酸二酯键中的一个或多个连接磷酸氧(示例性主链修饰)；(ii)改变，例如替换核糖的成分，例如核糖上的2’羟基(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头整体替换磷酸部分(示例性主链修饰)；(iv)修饰或替换天然存在的核碱基，包括用非规范核碱基修饰或替换(示例性碱基修饰)；(v)替换或修饰核糖-磷酸主链(示例性主链修饰)；(vi)修饰寡核苷酸的3’端或5’端，例如去除、修饰或替换末端磷酸基团或缀合部分、帽或接头(如3’或5’帽修饰可包含糖和/或主链修饰)；和(vii)修饰或替换糖(示例性糖修饰)。某些实施方案包含对mRNA、gRNA或核酸的5'端修饰。某些实施方案包括对mRNA、gRNA或核酸的3'端修饰。修饰的RNA可含有5'端修饰和3'端修饰。修饰的RNA可在非末端位置含有一个或多个修饰的残基。在某些实施方案中，gRNA包括至少一个修饰的残基。在某些实施方案中，mRNA包括至少一个修饰的残基。
未修饰的核酸可倾向于由例如细胞核酸酶或血清中见到的那些酶降解。例如，核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。因此，一方面，本文所述的RNA(例如mRNA、gRNA)可含有一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如以引入对细胞的或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，在体内和离体引入细胞群体时，本文所述的修饰的gRNA分子可表现出减少的先天免疫反应。术语“先天免疫反应”包括对包括单链核酸的外源核酸的细胞反应，其涉及细胞因子表达和释放(尤其是干扰素)及细胞死亡的诱导。
因此，在一些实施方案中，公开的LNP组合物中的RNA或核酸包含至少一种修饰，其赋予核酸增加或增强的稳定性，包括例如改善的对体内核酸酶消化的抗性。如本文所用，术语“修饰”和“修饰的”作为涉及本文提供的核酸的术语，包括至少一种改变，其优选地增强稳定性并使RNA或核酸比野生型或天然存在版本的RNA或核酸更稳定(例如，对核酸酶消化有抗性)。如本文所用，术语“稳定的”和“稳定性”作为涉及本发明的核酸的术语并且特别是关于RNA，是指对由例如通常能够降解这类RNA的核酸酶(即，内切核酸酶或外切核酸酶)降解的抗性增加或增强。增加的稳定性可包括例如对靶细胞或组织内的内源酶(例如，内切核酸酶或外切核酸酶)或条件的水解或其他破坏的敏感性较低，从而增加或增强这类RNA在靶细胞、组织、受试者和/或细胞质中的停留。本文提供的稳定化RNA分子相对于其天然存在的未修饰的对应物(例如mRNA的野生型版本)展示更长的半衰期。术语“修饰”和“修饰的”作为涉及本文公开的LNP组合物的mRNA的术语还涵盖改善或增强mRNA核酸的翻译的改变，包括例如包含在蛋白质翻译起始中起作用的序列(例如Kozac共有序列)。(Kozak,M.,NucleicAcids Res 15(20):8125-48(1987))。
在一些实施方案中，本文公开的LNP组合物的RNA或核酸已经历化学或生物学修饰以使其更稳定。对RNA的示例性修饰包括碱基的缺失(例如，通过缺失或通过一个核苷酸取代另一个核苷酸)或碱基的修饰，例如碱基的化学修饰。如本文所用的短语“化学修饰”包括引入与天然存在的RNA中所见的那些化学性质不同的化学性质的修饰，例如共价修饰，诸如引入修饰的核苷酸(例如核苷酸类似物，或包括在这类RNA分子中非天然存在的侧基)。
在主链修饰的一些实施方案中，修饰的残基的磷酸基团可通过用不同的取代基替换一个或多个氧而被修饰。另外，修饰的残基，例如修饰的核酸中存在的修饰的残基，可包括用如本文所述的修饰的磷酸基团整体替换未修饰的磷酸部分。在一些实施方案中，磷酸酯主链的主链修饰可包括导致不带电荷的接头或具有不对称电荷分布的带电荷的接头的改变。
修饰的磷酸基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷基磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未修饰的磷酸基团中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子团之一替换非桥连氧之一可使磷原子具有手性。立体异构磷原子可具有“R”构型(本文为Rp)或“S”构型(本文为Sp)。主链也可通过用氮(桥连氨基磷酸酯)、硫(桥连硫代磷酸酯)和碳(桥连亚甲基膦酸酯)替换桥连的氧(即连接磷酸酯与核苷的氧)来修饰。替换可发生在连接氧或两个连接氧上。在某些主链修饰中，磷酸基可被不含磷的连接物替换。在一些实施方案中，带电荷的磷酸基团可被中性部分替换。可替换磷酸基团的部分的实例可包括但不限于，例如，甲基膦酸酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼基、亚甲基二甲基肼基和亚甲基氧甲基亚氨基。
mRNA
在一些实施方案中，本文公开的组合物或制剂包含mRNA，所述mRNA包含编码RNA导向的DNA结合剂如本文所述的Cas核酸酶或2类Cas核酸酶的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，提供、使用或施用包含ORF的mRNA，所述ORF编码RNA导向的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶或2类Cas核酸酶。mRNA可包含5'帽、5'非翻译区(UTR)、3'UTR和多聚腺苷酸尾中的一种或多种。mRNA可包含修饰的开放阅读框，例如编码核定位序列或使用替代密码子以编码蛋白质。
公开的LNP组合物中的mRNA可编码例如分泌的激素、酶、受体、多肽、肽或其他正常分泌的目标蛋白。在本发明的一个实施方案中，mRNA可任选地具有化学或生物学修饰，其例如改善这类mRNA的稳定性和/或半衰期或改善或以其他方式促进蛋白质产生。
此外，合适的修饰包括密码子的一个或多个核苷酸的改变，使得密码子编码相同的氨基酸，但比在mRNA的野生型版本中见到的密码子更稳定。例如，已经证明RNA的稳定性与较高数目的胞苷(C)和/或尿苷(U)残基之间的反比关系，并且已经发现缺乏C残基和U残基的RNA对大多数RNA酶是稳定的(Heidenreich等人，J Biol Chem269,2131-8(1994))。在一些实施方案中，mRNA序列中C残基和/或U残基的数目减少。在另一个实施方案中，通过用一个编码具体氨基酸的密码子取代另一个编码相同或相关氨基酸的密码子来减少C残基和/或U残基的数目。本发明的mRNA核酸的预期修饰还包括掺入假尿苷。将假尿苷掺入本发明的mRNA核酸中可增强稳定性和翻译能力，以及减少体内免疫原性。参见，例如，Karikó,K.等人，Molecular Therapy 16(11):1833-1840(2008)。对本发明的mRNA的取代和修饰可通过本领域普通技术人员容易知道的方法进行。
与非翻译区相比，减少序列中C残基和U残基的数目的限制条件在mRNA的编码区内可能更大(即，可能不能消除信使中存在的所有C残基和U残基，同时仍然保持信使编码所需氨基酸序列的能力)。然而，遗传密码的简并性提供允许序列中存在的C残基和/或U残基的数目减少，同时维持相同编码能力的机会(即，根据由密码子编码的氨基酸，可能存在修饰RNA序列的几种不同可能性)。
术语修饰还包括例如将非核苷酸连接或修饰的核苷酸掺入本发明的mRNA序列中(例如，对编码功能性分泌蛋白或酶的mRNA分子的3’端和5'端之一或两者的修饰)。这样的修饰包括向mRNA序列添加碱基(例如，包括poly A尾或更长的poly A尾)，改变3'UTR或5'UTR，使mRNA与剂(例如，蛋白质或互补核酸分子)复合，以及包括改变mRNA分子的结构的元件(例如，其形成二级结构)。
认为poly A尾稳定天然信使。因此，在一个实施方案中，可将长poly A尾加到mRNA分子上，因此使mRNA更稳定。可使用各种本领域公认的技术添加Poly A尾。例如，可使用poly A聚合酶将长poly A尾加到合成的或体外转录的mRNA上(Yokoe等，NatureBiotechnology.1996；14:1252-1256)。转录载体也可编码长poly A尾。此外，可通过直接从PCR产物转录来添加poly A尾。在一个实施方案中，poly A尾的长度为至少约90、200、300、400、至少500个核苷酸。在一个实施方案中，调节poly A尾的长度以控制本发明的修饰的mRNA分子的稳定性，并且因此控制蛋白质的转录。例如，由于poly A尾的长度可影响mRNA分子的半衰期，因此可调节poly A尾的长度以改变mRNA对核酸酶的抗性水平，并且从而控制细胞中蛋白质表达的时程。在一个实施方案中，稳定的mRNA分子对体内降解(例如，由核酸酶降解)具有足够的抗性，使得它们可在没有转移媒介物的情况下被递送到靶细胞。
在一个实施方案中，mRNA可通过掺入野生型mRNA中非天然存在的3'和/或5'非翻译(UTR)序列来修饰。在一个实施方案中，天然侧接mRNA并编码第二不相关蛋白的3'和/或5'侧接序列可掺入编码治疗性或功能性蛋白的mRNA分子的核苷酸序列中以对其进行修饰。例如，可将稳定的mRNA分子(例如球蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)的3'或5'序列掺入有义mRNA核酸分子的3'和/或5'区以增加有义mRNA分子的稳定性。参见，例如US2003/0083272。
mRNA修饰的更详细描述可在US2017/0210698A1第57-68页中见到，其内容并入本文中。
模板核酸
本文公开的组合物和方法可包含模板核酸。模板可用于在RNA导向的DNA结合蛋白如Cas核酸酶，例如2类Cas核酸酶的靶位点处或其附近改变或插入核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括将模板引入细胞。在一些实施方案中，可提供单一模板。在其他实施方案中，可提供两种或更多种模板以使得编辑可在两个或更多个靶位点处发生。例如，可提供不同模板以编辑细胞中的单一基因或细胞中的两种不同基因。
在一些实施方案中，模板可用于同源重组中。在一些实施方案中，同源重组可导致模板序列或模板序列的一部分整合至靶核酸分子中。在其他实施方案中，模板可用于同源定向修复，所述同源定向修复涉及核酸中裂解位点处的DNA链侵袭。在一些实施方案中，同源定向修复可导致编辑的靶核酸分子中包括模板序列。在再其他实施方案中，模板可用于由非同源末端连接介导的基因编辑。在一些实施方案中，模板序列与裂解位点附近的核酸序列不具有类似性。在一些实施方案中，掺入模板或模板序列的一部分。在一些实施方案中，模板包括侧接反向末端重复(ITR)序列。
在一些实施方案中，模板序列可对应于、包含或由靶细胞的内源序列组成。其可另外或替代地对应于、包含或由靶细胞的外源序列组成。如本文所用，术语“内源序列”是指原生于细胞的序列。术语“外源序列”是指非原生于细胞的序列，或在细胞的基因组中的原生位置处于不同位置的序列。在一些实施方案中，内源序列可为细胞的基因组序列。在一些实施方案中，内源序列可为染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，内源序列可为细胞的质粒序列。
在一些实施方案中，模板含有ssDNA或dsDNA，其含有侧接反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，模板作为载体、质粒、微环、纳米环或PCR产物提供。
在一些实施方案中，对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀、醇沉淀或等效方法，例如如本文所述)对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用基于色谱的方法，诸如基于HPLC的方法或等效方法(例如，如本文所述)对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者对核酸进行纯化。在一些实施方案中，通过切向流过滤(TFF)对核酸进行纯化。
化合物或组合物通常但不一定包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。术语“赋形剂”包括除本公开的一种或多种化合物、一种或多种其他脂质组分和生物活性剂以外的任何成分。赋形剂可赋予组合物功能(例如药物释放速率控制)和/或非功能(例如加工助剂或稀释剂)特征。赋形剂的选择在很大程度上将取决于诸如具体施用模式、赋形剂对溶解度和稳定性的影响以及剂型的性质等因素。
肠胃外制剂通常是水性或油性溶液或悬浮液。当制剂为水性时，可使用诸如糖(包括但不限于葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选至3至9的pH)的赋形剂，但对于一些应用，制剂可更适当地配制为无菌非水性溶液或待与合适的媒介物如无菌无热原质水(WFI)结合使用的干燥形式。
虽然结合所说明的实施方案来描述本发明，但应理解并非意欲将本发明限于那些实施方案。相反，本发明意欲涵盖所有替代方案、修改和等效物，包括特定特点的等效物，它们可包括在如由所附权利要求所定义的本发明内。
前述一般描述和具体实施方式两者以及下述实施例仅为示例性和解释性的并且不限制教导内容。本文所用的章节标题仅出于组织目的，而不应理解为以任何方式限制所需主题。在以引用方式并入的任何文献与本说明书中定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。除非另外陈述，否则本申请中给出的所有范围均涵盖端点。
定义
应注意，除非上下文另外明确指示，否则如本申请中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述/该”包括复数指示物。因此，例如，提及的“组合物”包括多种组合物并且提及的“细胞”包括多个细胞等等。除非另外陈述，否则使用的“或”为包括性的并且意指“和/或”。
除非在上述说明书中明确指出，否则本说明书中陈述“包含”各种组分的实施方案还预期为“由”所述组分“组成”或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“由”各种组分“组成”还预期为“包含”所述组分或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“约”各种组分的实施方案还预期为“处于”所述组分；并且本说明书中陈述“基本上由”各种组分“组成”还预期为“由”所述组分“组成”或“包含”所述组分(这种互换性不适用于在权利要求中使用这些术语)。
数值范围包括限定范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，所测量和可测量的值应理解为近似值。如本申请中所用，术语“约”和“大约”具有它们的本领域理解的含义；使用一个/种对另一个/种不一定意味着不同的范围。除非另外指明，否则应理解本申请中使用的数字，带有或不带有诸如“约”或“大约”的修饰词，应理解为涵盖正常的发散和/或波动，这一点将为相关领域的普通技术人员所理解。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指在所述参考值的任一方向上的(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了在这样的数值将超过可能值的100％的情况下)。
如本文所用，术语“接触”意指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使哺乳动物细胞与纳米颗粒组合物接触意指使哺乳动物细胞和纳米颗粒共享物理连接。在体内和离体使细胞与外部实体接触的方法在生物学领域中是公知的。例如，使纳米颗粒组合物与置于哺乳动物体内的哺乳动物细胞接触可通过不同的施用途径(例如，静脉内、肌内、皮内和皮下)进行，并且可涉及不同量的纳米颗粒组合物。此外，多于一种哺乳动物细胞可被纳米颗粒组合物接触。
如本文所用，术语“递送”意指向目的地提供实体。例如，向受试者递送治疗剂和/或预防剂可涉及向受试者施用包括治疗剂和/或预防剂的纳米颗粒组合物(例如，通过静脉内、肌内、皮内或皮下途径)。将纳米颗粒组合物施用到哺乳动物或哺乳动物细胞可包括使一种或多种细胞与纳米颗粒组合物接触。
如本文所用，“包封效率”是指相对于用于制备纳米颗粒组合物的治疗剂和/或预防剂的初始总量，成为纳米颗粒组合物的一部分的治疗剂和/或预防剂的量。例如，如果97mg的治疗剂和/或预防剂包封在最初提供给组合物的总共100mg治疗剂和/或预防剂中的纳米颗粒组合物中，则包封效率可给出为97％。如本文所用，“包封”可指完全、基本或部分包封、限制、围绕或包围。
如本文所用，术语“可生物降解的”用以指当引入细胞中时，通过细胞机制(例如酶降解)或通过水解被分解成细胞可再利用或处置而对细胞没有一种或多种明显毒性作用的组分的材料。在某些实施方案中，通过生物可降解材料的分解产生的组分在体内不诱导炎症和/或其他副作用。在一些实施方案中，生物可降解材料被酶促分解。可选地或另外地，在一些实施方案中，可生物降解的材料通过水解被分解。
如本文所用，“N/P比”是在脂质中，例如在包含脂质组分和RNA的纳米颗粒组合物中，可电离的(在生理pH范围内)氮原子与RNA中的磷酸基团的摩尔比。
组合物还可包含一种或多种化合物的盐。盐可为药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式(例如通过使游离碱基与合适的有机酸反应)来改变母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖庚糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成。通常，这样的盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表见Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版编，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985，第1418页，PharmaceuticalSalts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Wiley-VCH,2008；和Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，其各自通过引用整体并入本文。
如本文所用，“多分散指数”是描述系统的粒度分布的均匀性的比率。例如小于0.3的小值表明窄的粒度分布。在一些实施方案中，多分散指数可小于0.1。
如本文所用，“转染”是指将物种(例如RNA)引入细胞。转染可发生在例如体外、离体或体内。
如本文所用的术语“烷基”是1至24个碳原子的支链或无支链饱和烃基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可为环状或非环状的。烷基可为支链的或无支链的(即，直链的)。烷基也可为取代或未取代的(优选未取代的)。例如，烷基可被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、亚砜、磺酸酯、羧酸酯或硫醇，如本文所述。“低级烷基”是含有一至六个(例如一至四个)碳原子的烷基。
如本文所用，术语“烯基”是指含有至少一个双键的脂族基团，并且意欲包括“未取代的烯基”和“取代的烯基”两者，后者是指具有置换烯基的一个或多个碳上的氢的取代基的烯基部分。这样的取代基可出现在包括或不包括在一个或多个双键中的一个或多个碳上。此外，这样的取代基包括所有对于烷基预期的那些，如下讨论，除非稳定性是禁止的。例如，预期可用一个或多个烷基、碳环基、芳基、杂环基或杂芳基取代烯基。示例性烯基包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
“亚烷基”是指二价烷基，其可为支链的或无支链的(即，直链的)。任何上述单价烷基可通过从烷基中夺取第二氢原子而转化成亚烷基。代表性亚烷基包括C2-4亚烷基和C2-3亚烷基。典型的亚烷基包括但不限于-CH(CH3)-、-C(CH3)2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2C(CH3)2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-等。亚烷基也可为取代的或未取代的。例如，亚烷基可被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于烷基、芳基、杂芳基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、亚砜、磺酸酯、磺酰胺、脲、酰胺、氨基甲酸酯、酯、羧酸酯或硫醇，如本文所述。
术语“亚烯基”包括二价的、直链或支链的、不饱和的、非环烃基，其具有至少一个碳-碳双键，并且在一个实施方案中，不具有碳-碳三键。任何上述单价烯基可通过从烯基夺取第二氢原子而转化成亚烯基。代表性亚烯基包括C2-6亚烯基。
术语“Cx-y”在与化学部分如烷基或亚烷基结合使用时意指包括在链中含有x至y个碳的基团。例如，术语“Cx-y烷基”是指取代或未取代的饱和烃基，其包括在链中含有x至y个碳的直链烷基和支链烷基和亚烷基。
参考并入
本文提及或引用的文章、专利和专利申请的内容以及所有其他文献和电子可用信息通过引用整体并入本文，其程度如同明确且单独地指明将每篇单独的出版物通过引用并入本文一样。申请人保留将来自任何这样的文章、专利申请或其他物理和电子文档的任何和所有材料和信息物理地并入本申请的权利。
实施例
表1.化合物
Figure BDA0003041605620000601
Figure BDA0003041605620000611
Figure BDA0003041605620000621
Figure BDA0003041605620000631
Figure BDA0003041605620000641
Figure BDA0003041605620000651
Figure BDA0003041605620000661
Figure BDA0003041605620000671
通用信息
所有试剂和溶剂均购自商业供应商并按原样使用，或者根据引用的工序合成。所有中间体和最终化合物均使用硅胶快速柱色谱法纯化。NMR光谱在Bruker或Varian 400MHz光谱仪上记录，并且NMR数据在环境温度下在CDCl3中收集。化学位移以相对于CDCl3(7.26)的百万分率(ppm)报道。1H NMR的数据如下报道：化学位移、多重性(br＝宽，s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，dd＝双二重峰，dt＝双三重峰，m＝多重峰)、偶联常数和积分。MS数据记录在具有电喷雾电离(ESI)源的Waters SQD2质谱仪上。最终化合物的纯度通过UPLC-MS-ELS使用装备有SQD2质谱仪的Waters Acquity H-类液相色谱仪测定，所述质谱仪具有光电二极管阵列(PDA)和蒸发光散射(ELS)检测器。
实施例1-化合物1
中间体1a：8-溴辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000681
在15-25℃下向8-溴辛酸(5.0g，22.4mmol)和壬-1-醇(1-2当量)在DCM(56mL)中的溶液中顺序地添加DIEA(2-3当量)、DMAP(0.1-0.25当量)和EDC·HCl(1-1.5当量)至少4小时。完成后，用DCM稀释反应混合物，用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。使用硅胶色谱法(0-33％EtOAc/己烷)纯化，提供为澄清油的所需产物(4.5g，13mmol，59％收率)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.06(t,J＝6.6Hz,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),1.185(m,2H),1.61(m,4H),1.43(m,2H),1.31(m,18H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H)ppm。
中间体1b：8-(2-羟基乙基氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000682
将中间体1a(12g，34.35mmol)和2-氨基乙醇(20-40当量)在乙醇(EtOH)(10mL)中的溶液在20℃下搅拌至少12小时。然后浓缩反应物以去除EtOH，倒入水中，并且提取到EtOAc(3x)中。将合并的有机层用盐水洗涤2次，用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，过滤，并真空浓缩。将粗残余物用硅胶色谱法(20-100％EtOAc/石油醚，然后MeOH)纯化，提供为黄色固体的所需产物(4g，12mmol，35％收率)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ3.99(t,J＝6.8Hz,2H),3.57(t,J＝5.2Hz,2H),2.69(t,J＝5.2Hz,2H),2.54(t,J＝7.2Hz,2H),2.22(t,J＝7.4Hz,2H),1.56-1.20(m,24H),0.81(t,J＝6.8Hz,3H)ppm。
中间体1c：8-溴辛醛
Figure BDA0003041605620000691
向8-溴辛-1-醇(45.1mL，263mmol)在DCM(700mL)中的溶液中添加氯铬酸吡啶鎓(PCC)(1-2当量)。在15℃下搅拌至少2小时后，过滤反应混合物并真空浓缩。将粗残余物用硅胶色谱法(2-20％EtOAc/石油醚)纯化，提供为无色油的所需产物(37.5g，163.0mmol，62％收率)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.77(t,J＝1.8Hz,1H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.43(m,2H),1.86(m,2H),1.63(m,2H),1.45(m,2H)1.34(m,4H)ppm。
中间体1d：8-溴-1,1-二辛氧基-辛烷
Figure BDA0003041605620000692
向8-溴辛醛(12.5g，60.3mmol)和辛-1-醇(2-3当量)在DCM(300mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸一水合物(0.1-0.2当量)和Na2SO4(2-3当量)。将反应混合物在15℃下搅拌至少24小时，然后过滤，并真空浓缩。将粗残余物使用硅胶色谱法(100％石油醚)纯化，提供为无色油的所需产物(6g，13.4mmol，22％收率)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.6Hz,1H),3.56(m,2H),3.41(m,4H),1.84(m,2H),1.59(m,6H),1.33-1.28(m,34H),0.89(t,J＝6.6Hz,6H)ppm。
化合物1：8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000693
将中间体1d(1g，2.22mmol)、中间体1b(0.9-1.1当量)、K2CO3(2-4当量)和KI(0.1-0.5当量)在3:1MeCN/CPME(0.1-0.5M)中的混合物脱气，且用N2净化三次。将反应混合物升温至82℃并在惰性气氛下搅拌至少2小时。然后将反应混合物用水稀释，且用EtOAc提取至少2次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，且真空浓缩。将粗残余物用硅胶色谱法(10-33％EtOAc/石油醚)纯化，提供为无色油的所需产物(700mg，1.00mmol，45％收率)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.50(t,J＝5.8Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.54(m,4H),3.40(m,2H),2.56(t,J＝5.4Hz,2H),2.42(t,J＝7.4Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.58(m,10H),1.45-1.21(m,50H)0.88(t,J＝6.8Hz,9H)ppm。MS:699.29m/z[M+H]。
实施例2-化合物2
中间体2a：1-(8-溴-1-壬氧基-辛氧基)壬烷
Figure BDA0003041605620000701
使用中间体1d所采用的方法，由中间体1c和壬-1-醇合成中间体2a，收率为24％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.8Hz,1H),3.56(m,2H),3.41(m,4H),1.86(m,2H),1.57(m,6H),1.33(m,32H),0.89(6,J＝6.8Hz,6H)ppm。
化合物2：8-[8,8-双(壬氧基)辛基-(2-羟乙基)氨基]辛酸酯
Figure BDA0003041605620000702
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体2a合成化合物2，收率为54％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.50(t,J＝5.6Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.54(m,4H),3.40(m,2H),2.56(t,J＝5.4Hz,2H),2.42(t,J＝7.4Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.58(m,10H),1.46-1.21(m,54H),0.88(t,J＝6.6Hz,9H)ppm。MS:727.01m/z[M+H]。
实施例3-化合物3
中间体3a：1-(8-溴-1-脱氧-辛氧基)癸烷
Figure BDA0003041605620000711
使用中间体1d所采用的方法，由中间体1c和癸-1-醇合成中间体3a，收率为24％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.8Hz,1H),3.56(m,2H),3.40(m,4H),1.86(m,2H),1.57(m,6H),1.33(m,36H),0.89(t,J＝6.8Hz,6H)ppm。
化合物3：8-[8,8-二脱氧辛基(2-羟乙基)氨基]辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000712
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体3a合成化合物3，收率为28％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.50(t,J＝5.8Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.53(m,4H),3.39(m,2H),2.56(t,J＝5.4Hz,2H),2.43(t,J＝7.4Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.58(m,10H),1.46-1.20(m,58H),0.88(t,J＝6.6Hz,9H)ppm。MS:755.04m/z[M+H]。
实施例4-化合物4
中间体4a：10-溴辛醛
Figure BDA0003041605620000713
使用中间体1c所采用的方法，由10-溴辛醛合成中间体4a，收率为55％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.77(s,1H),3.41(t,J＝7.0Hz,2H),2.42(t,J＝7.4Hz,2H),1.85(m,2H),1.63(m,2H),1.42(m,2H),1.30(m,8H)ppm。
中间体4b：10-溴-1,1-二庚氧基-癸烷
Figure BDA0003041605620000721
使用中间体1d所采用的方法，由中间体4a和庚-1-醇合成中间体4b，收率为32％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.8Hz,1H),3.56(m,2H),3.41(m,4H),1.86(m,2H),1.58(m,6H),1.33(m,28H),0.89(t,J＝7.0Hz,6H)ppm。
化合物4：8-[10,10-二庚氧基癸基(2-羟乙基)氨基]辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000722
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体4b合成化合物4，收率为19％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.8Hz,1H),4.05(t,J＝6.6Hz,2H),3.55(m,4H),3.40(m,4H),2.59(t,J＝5.4Hz,2H),2.45(m,4H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),1.59(m,10H),1.44-1.22(m,50H),0.88(t,J＝7.0Hz,9H)ppm。MS:699.53m/z[M+H]。
实施例5-化合物5
中间体5a：10-溴-1,1-二庚氧基-癸烷
Figure BDA0003041605620000723
使用中间体1d所采用的方法，由中间体4a和辛-1-醇合成中间体5a，收率为34％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.45(t,J＝5.8Hz,1H),3.55(m,2H),3.40(m,4H),1.85(m,2H),1.57(m,6H),1.33(m,32H),0.88(t,J＝6.8Hz,6H)ppm。
化合物5：8-[10,10-二辛氧基癸基(2-羟乙基)氨基]辛酸酯
Figure BDA0003041605620000731
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体5a合成化合物5，收率为27％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.8Hz,1H),4.06(t,J＝6.8Hz,2H),3.56(m,4H),3.40(m,2H),2.58(t,J＝5.4Hz,2H),2.45(m,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.59(m,10H),1.47-1.25(m,54H),0.89(t,J＝6.6Hz,9H)ppm。UPLC-MS-ELS:r.t.＝6.58min,727.54m/z[M+H]。
实施例6-化合物6
中间体6a：10-溴-1,1-双(壬氧基)癸烷
Figure BDA0003041605620000732
使用中间体1d所采用的方法，由中间体4a和壬-1-醇合成中间体6a，收率为41％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.8Hz,1H),3.56(m,2H),3.41(m,4H),1.86(m,2H),1.58(m,6H),1.42-1.28(m,36H),0.89(t,J＝6.8Hz,6H)ppm。
化合物6：8-[10,10-双(壬氧基)癸基-(2-羟乙基)氨基]辛酸酯
Figure BDA0003041605620000741
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体6a合成化合物6，收率为41％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.45(t,J＝5.8Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.54(m,4H),3.39(m,2H),2.57(t,J＝5.4Hz,2H),2.44(t,J＝7.6Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.58(m,10H),1.46-1.24(m,58H),0.88(t,J＝6.6Hz,9H)ppm。MS:755.71m/z[M+H]。
实施例7-化合物7
中间体7a：8-溴-1,1-双(庚氧基)辛烷
Figure BDA0003041605620000742
使用中间体1d所采用的方法，由中间体1c和庚-1-醇合成中间体7a，收率为39％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.8Hz,1H),3.56(m,2H),3.41(m,4H),1.86(m,2H),1.57(m,6H),1.32(m,24H),0.89(t,J＝7.0Hz,6H)ppm。
化合物7：8-((8,8-双(庚氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000743
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体7a合成化合物7，收率为22％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.45(t,J＝5.8Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.60–3.48(m,4H),3.40(m,2H),2.56(t,J＝5.4Hz,2H),2.43(dd,J＝8.5,6.3Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.67–1.52(m,10H),1.48-1.19(m,46H),0.88(m,9H)ppm。MS:671.66m/z[M+H]。
实施例8-化合物8
中间体8a：8-溴-1,1-双(己氧基)辛烷
Figure BDA0003041605620000751
使用中间体1d所采用的方法，由中间体1c和己-1-醇合成中间体8a，收率为38％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.6Hz,1H),3.57(m,2H),3.40(m,4H),1.85(m,2H),1.57(m,6H),1.35(m,20H),0.89(t,J＝6.8Hz,6H)ppm。
化合物8：8-((8,8-二(己氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000752
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体8a合成化合物8，收率为13％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.45(t,J＝5.8Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.60–3.49(m,4H),3.40(m,2H),2.57(t,J＝5.4Hz,2H),2.43(t,J＝7.6Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.58(m,10H),1.47-1.19(m,42H),0.88(m,9H)ppm。MS:643.58m/z[M+H]。
实施例9-化合物9
中间体9a：9-溴壬醛
Figure BDA0003041605620000753
使用中间体1c所采用的方法，由9-溴辛醇合成中间体9a，收率为40％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.70(t,J＝1.8Hz,1H),3.34(t,J＝6.8Hz,2H),2.36(m,2H),1.78(m,2H),1.57(m,2H),1.36(m,2H),1.26(m,6H)ppm。
中间体9b：9-溴-1,1-双(辛氧基)壬烷
Figure BDA0003041605620000761
使用中间体1d所采用的方法，由中间体9a和己-1-醇合成中间体9b，收率为44％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.6Hz,1H),3.57(m,2H),3.41(m,4H),1.86(m,2H),1.57(m,6H),1.31(m,30H),0.89(t,J＝6.8Hz,6H)ppm。
化合物9：8-((9,9-双(辛氧基)壬基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000762
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体9b合成化合物9，收率为17％。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.45(t,J＝5.8Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.62–3.49(m,4H),3.40(m,2H),2.57(t,J＝5.4Hz,2H),2.44(t,J＝7.6Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.58(m,10H),1.48-1.19(m,52H),0.88(t,J＝6.6Hz,9H)ppm。MS:713.52m/z[M+H]。
实施例10-化合物10
中间体10a：7-溴庚醛
Figure BDA0003041605620000763
使用中间体1c所采用的方法，由7-溴庚醇合成中间体10a，收率为35％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.77(s,1H),3.41(t,J＝6.6Hz,2H),2.44(m,2H),1.87(m,2H),1.65(m,2H),1.47(m,2H),1.37(m,2H)ppm。
中间体10b：1-((7-溴-1-(辛氧基)庚基)氧基)辛烷
Figure BDA0003041605620000771
使用中间体1d所采用的方法，由中间体10a和辛-1-醇合成中间体10b，收率为42％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.6Hz,1H),3.57(m,2H),3.41(m,4H),1.85(m,2H),1.58(m,6H),1.33(m,26H),0.89(t,J＝6.8Hz,6H)ppm。
化合物10：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000772
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体10b合成化合物10，收率为19％。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.46(t,J＝5.8Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.59–3.49(m,4H),3.39(m,2H),2.56(t,J＝5.4Hz,2H),2.43(t,J＝7.4Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.58(m,10H),1.47-1.21(m,48H),0.88(t,J＝6.6Hz,9H)ppm。MS:685.75m/z[M+H]。
实施例11-化合物11
中间体11a：2-((8,8-双(辛氧基)辛基)氨基)乙-1-醇
Figure BDA0003041605620000773
向中间体1d(24g，115.88mmol)和辛-1-醇(2-4当量)在DCM(240mL)中的溶液中添加TsOH·H2O(0.1-0.3当量)和Na2SO4(2-3当量)。在25℃下搅拌混合物至少12小时。完成后，将反应混合物减压浓缩以去除DCM。将残余物用水稀释且用EtOAc提取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩，得到残余物。残余物通过柱色谱法(EtOAc/己烷)纯化，得到为无色油的产物(25g，48％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.38(t,J＝5.8Hz,1H),3.61–3.54(m,2H),3.49(dt,J＝9.3,6.6Hz,2H),3.33(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.75–2.66(m,2H),2.55(t,J＝7.2Hz,2H),1.97(d,J＝12.5Hz,3H),1.58–1.35(m,8H),1.34–1.01(m,27H),0.93–0.72(m,6H)ppm。MS:430.4m/z[M+H]。
中间体11b：10-溴癸酸庚酯
Figure BDA0003041605620000781
使用中间体1a所采用的方法，由10-溴癸酸和庚-1-醇合成中间体11b，收率为32％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.99(t,J＝6.7Hz,2H),3.33(t,J＝6.9Hz,2H),2.22(t,J＝7.5Hz,2H),1.83–1.68(m,2H),1.55(d,J＝14.3Hz,4H),1.35(t,J＝7.5Hz,2H),1.22(m,16H),0.86–0.78(m,3H)ppm。
化合物11：10-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)癸酸庚酯
Figure BDA0003041605620000782
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体11b合成化合物11，收率为19％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.67–3.60(m,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.70(s,2H),2.58(s,4H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.67–1.44(m,15H),1.29(m,46H),0.94–0.81(m,9H)ppm。MS:699.35m/z[M+H]。
实施例12-化合物12
中间体12a：7-溴庚酸癸酯
Figure BDA0003041605620000791
使用中间体1a所采用的方法，由7-溴庚酸和癸-1-醇合成中间体12a，收率为26％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.09(t,J＝6.7Hz,2H),3.44(t,J＝6.8Hz,2H),2.34(t,J＝7.5Hz,2H),1.96–1.83(m,2H),1.70–1.57(m,4H),1.49(m,2H),1.44–1.22(m,16H),0.97–0.85(m,3H)ppm。
化合物12：7-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)庚酸癸酯
Figure BDA0003041605620000792
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体12a合成化合物12，收率为56％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.60–3.51(m,4H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.61(t,J＝5.3Hz,2H),2.55–2.41(m,4H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.69–1.51(m,10H),1.51–1.20(m,49H),0.94–0.83(m,9H)ppm。MS:699.52m/z[M+H]。
实施例13-化合物13
中间体13a：6-溴己酸十一烷酯
Figure BDA0003041605620000801
使用中间体1a所采用的方法，由6-溴己酸和十一烷-1-醇合成中间体13a，收率为22％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.06(t,J＝6.7Hz,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.31(t,J＝7.4Hz,2H),1.87(dt,J＝14.2,6.9Hz,2H),1.70–1.57(m,4H),1.53–1.42(m,2H),1.38–1.19(m,16H),0.87(t,J＝6.7Hz,3H)ppm。
化合物13：6-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)己酸十一烷酯
Figure BDA0003041605620000802
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体13a合成化合物13，收率为64％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.60–3.52(m,4H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.62(t,J＝5.3Hz,2H),2.50(q,J＝6.7Hz,4H),2.30(t,J＝7.5Hz,2H),1.70–1.40(m,15H),1.40–1.17(m,45H),0.93–0.83(m,9H)ppm。MS:699.31m/z[M+H]。
实施例14-化合物14
中间体14a：5-溴戊酸十二烷酯
Figure BDA0003041605620000803
使用中间体1a所采用的方法，由5-溴戊酸和十二烷-1-醇合成中间体14a，收率为21％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.00(t,J＝6.7Hz,2H),3.35(t,J＝6.6Hz,2H),2.27(t,J＝7.3Hz,2H),1.83(m,2H),1.71(m,2H),1.55(t,J＝7.1Hz,2H),1.31–1.13(m,18H),0.85–0.78(m,3H)ppm。
化合物14：5-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)戊酸十二烷酯
Figure BDA0003041605620000811
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体14a合成化合物14，收率为62％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.06(t,J＝6.8Hz,2H),3.63–3.49(m,4H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.62(t,J＝5.3Hz,2H),2.58–2.44(m,4H),2.32(t,J＝7.3Hz,2H),1.68–1.40(m,15H),1.40–1.19(m,47H),0.94–0.83(m,9H)ppm。MS:699.48m/z[M+H]。
实施例15-化合物15
中间体15a：8-溴辛酸庚酯
Figure BDA0003041605620000812
使用中间体1a所采用的方法，由8-溴辛酸和庚-1-醇合成中间体15a，收率为15％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.99(t,J＝6.7Hz,2H),3.33(t,J＝6.8Hz,2H),2.23(t,J＝7.5Hz,2H),1.78(m,2H),1.63–1.50(m,4H),1.42–1.13(m,14H),0.87–0.77(m,3H)ppm。
化合物15：8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸庚酯
Figure BDA0003041605620000813
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体15a合成化合物15，收率为64％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.62–3.50(m,4H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.64(t,J＝5.2Hz,2H),2.51(t,J＝7.6Hz,4H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.66–1.40(m,15H),1.40–1.19(m,43H),0.88(m,9H)ppm。MS:671.84m/z[M+H]。
实施例16-化合物16
中间体16a：8-溴辛酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯
Figure BDA0003041605620000821
使用中间体1a所采用的方法，由8-溴辛酸和(Z)-壬-2-烯-1-醇合成中间体16a，收率为26％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.70–5.58(m,1H),5.58–5.47(m,1H),4.62(dd,J＝6.9,1.3Hz,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.30(t,J＝7.5Hz,2H),2.09(m,2H),1.85(m,2H),1.67–1.58(m,2H),1.52–1.09(m,13H),0.94–0.80(m,3H)ppm。
化合物16：8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯
Figure BDA0003041605620000822
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体16a合成化合物16，收率为59％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.70–5.58(m,1H),5.52(m,1H),4.62(dd,J＝6.9,1.3Hz,2H),4.45(t,J＝5.7Hz,1H),3.64–3.48(m,4H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.64(t,J＝5.3Hz,2H),2.51(t,J＝7.6Hz,4H),2.30(t,J＝7.5Hz,2H),2.09(m,2H),1.68–1.41(m,12H),1.41–1.18(m,41H),0.96–0.81(m,9H)ppm。MS:697.33m/z[M+H]。MS:697.33m/z[M+H]。
实施例17-化合物17
中间体17a：8-溴辛酸十一烷-3-基酯
Figure BDA0003041605620000831
使用中间体1a所采用的方法，由8-溴辛酸和十一烷-3-醇合成中间体17a，收率为50％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.74(m,1H),3.33(t,J＝6.8Hz,2H),2.22(t,J＝7.5Hz,2H),1.85–1.67(m,2H),1.62–1.09(m,25H),0.89–0.74(m,6H)ppm。
化合物17：8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸十一烷-3-基酯
Figure BDA0003041605620000832
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体17a合成化合物17，收率为65％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.80(m,1H),4.45(t,J＝5.8Hz,1H),3.55(dt,J＝9.3,6.4Hz,4H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.62(t,J＝5.3Hz,2H),2.49(t,J＝7.6Hz,4H),2.28(t,J＝7.5Hz,2H),1.66–1.40(m,16H),1.40–1.17(m,45H),0.87(m,12H)ppm。MS:727.34m/z[M+H]。
实施例18-化合物18
化合物18：8-((2-羟乙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯
Figure BDA0003041605620000841
根据Mol.Ther.2018,26,1509-1519(化合物5)和US 2017/0210698 A1(化合物18)中所述的方法合成化合物18。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.86(m,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.59(br t,J＝5.1Hz,2H),2.75–2.39(br m,6H),2.28(m,4H),1.61(m,6H),1.49(m,8H),1.38–1.20(m,49H),0.87(m,9H)ppm；MS:711m/z[M+H]。
实施例19-化合物19
化合物19：(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-二(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-(((((3-(二乙基氨基)丙氧基))-羰基)氧基)甲基)丙酯
Figure BDA0003041605620000842
根据WO 2015/095340 Al(实施例13)中所述的方法合成化合物19。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.35(m,4H),4.48(t,J＝5.6Hz,1H),4.17(m,8H),3.56(m,2H),3.40(m,2H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),2.55(q,J＝7.2Hz,6H),2.40(m,3H),2.30(t,J＝7.6Hz,2H),2.05(q,J＝6.8Hz,4H),1.92(m,2H),1.84(m,2H),1.57(m,6H),1.30(m,34H),1.03(t,J＝7.2Hz,6H),0.88(m,9H)ppm；MS:853m/z[M+H]。
实施例20-化合物20
中间体20a：7-溴-1,1-双(庚氧基)庚烷
Figure BDA0003041605620000851
使用中间体1d所采用的方法，由中间体10a和庚-1-醇合成中间体20a，收率为24％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.77(t,J＝1.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,1H),3.40(t,J＝6.8Hz,4H),2.44(td,J＝7.3,1.7Hz,2H),2.33(dt,J＝25.0,7.4Hz,1H),1.93–1.79(m,4H),1.71–1.53(m,5H),1.51–1.29(m,9H)。
化合物20：8-((7,7-双(庚氧基)庚基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000852
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体20a合成化合物20，收率为60％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.55(dt,J＝9.3,5.9Hz,4H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.62(t,J＝5.3Hz,2H),2.49(t,J＝7.6Hz,4H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.67–1.41(m,15H),1.41–1.19(m,40H),0.96–0.81(m,9H)。MS:657.2m/z[M+H]。
实施例21-化合物21
中间体21a：8-溴辛酸癸-2-基酯
Figure BDA0003041605620000853
向含有8-溴辛酸(2.0g，1.0当量)在DCM(0.4M)中的溶液中添加癸-2-醇(1.0当量)、DMAP(0.2当量)、Et3N(3.5当量)和EDCI(1.2当量)。在室温下搅拌反应物168小时。完成后，通过添加水和DCM使反应淬灭。将有机层用1M HCl洗涤1次，且用5％NaHCO3洗涤1次。有机层用Na2SO4干燥，过滤且浓缩。通过柱(EtOAc/hex)纯化得到为无色油的产物(485mg,12％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.97–4.82(m,1H),3.53(t,J＝6.7Hz,2H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.76(dq,J＝7.8,6.8Hz,2H),1.66–1.58(m,2H),1.51–1.40(m,3H),1.37–1.23(m,15H),1.19(d,J＝6.3Hz,3H),0.93–0.84(m,3H)。
化合物21：8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸癸-2-基酯
Figure BDA0003041605620000861
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体21a合成化合物21，收率为29％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.89(ddt,J＝12.1,7.4,6.3Hz,1H),4.45(t,J＝5.7Hz,1H),3.62–3.50(m,4H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.64(t,J＝5.2Hz,2H),2.51(t,J＝7.6Hz,4H),2.26(t,J＝7.5Hz,2H),1.66–1.40(m,15H),1.29(dd,J＝16.9,6.2Hz,44H),1.19(d,J＝6.2Hz,3H),0.95–0.82(m,9H)。MS:713.5m/z[M+H]。
实施例22-化合物22
中间体22a：十一烷酸6-溴己酯
Figure BDA0003041605620000862
将十一烷酸(5g，1.0当量)、6-溴己-1-醇(1.0当量)、EDCI(1.0当量)、DMAP(0.16当量)和DIPEA(3.0当量)在DCM(0.2M)中的混合物脱气且用N2净化3次，然后在20℃下在惰性气氛下搅拌混合物5小时。完成后，将反应混合物减压浓缩以去除DCM。将残余物用H2O稀释且用EtOAc提取3次。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱(EtOAc/己烷)纯化得到为无色油的产物(2.3g,25％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.00(t,J＝6.6Hz,2H),3.34(t,J＝6.8Hz,2H),2.22(t,J＝7.6Hz,2H),1.84–1.74(m,2H),1.63–1.50(m,4H),1.45–1.36(m,2H),1.36–1.28(m,2H),1.20(d,J＝9.9Hz,15H),0.86–0.78(m,3H)。
化合物22：十一烷酸6-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)己酯
Figure BDA0003041605620000871
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体22a合成化合物22，收率为63％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.64(t,J＝5.2Hz,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.71(t,J＝5.2Hz,2H),2.60(t,J＝7.6Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.69–1.05(m,62H),0.95–0.79(m,9H)。MS:699.4m/z[M+H]。
实施例23-化合物23
中间体23a：壬酸8-溴辛酯
Figure BDA0003041605620000872
使用中间体22a所采用的方法，由壬酸和8-溴辛-1-醇合成中间体23a，收率为19％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.99(t,J＝6.7Hz,2H),3.34(t,J＝6.8Hz,2H),2.22(t,J＝7.6Hz,2H),1.78(p,J＝6.9Hz,2H),1.55(t,J＝7.0Hz,4H),1.42–1.10(m,19H),0.87–0.74(m,3H)。
化合物23：壬酸8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酯
Figure BDA0003041605620000881
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体23a合成化合物23，收率为32％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.63(t,J＝5.3Hz,2H),3.56(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.70(t,J＝5.2Hz,2H),2.58(t,J＝7.7Hz,4H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.68–1.17(m,65H),0.88(t,J＝6.7Hz,9H)。MS:699.4m/z[M+H]。
实施例24-化合物24
中间体24a：庚酸10-溴癸酯
Figure BDA0003041605620000882
使用中间体22a所采用的方法，由庚酸和10-溴癸-1-醇合成中间体24a，收率为26％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.40(t,J＝6.9Hz,2H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.85(dt,J＝14.5,6.9Hz,2H),1.61(p,J＝7.7,7.2Hz,4H),1.48–1.23(m,18H),0.93–0.84(m,3H)。
化合物24：庚酸10-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)癸酯
Figure BDA0003041605620000883
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体24a合成化合物24，收率为40％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.66–3.50(m,4H),3.40(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),2.69(t,J＝5.2Hz,2H),2.57(t,J＝7.6Hz,4H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.69–0.98(m,63H),0.97–0.70(m,9H)。MS:699.6m/z[M+H]。
实施例25-化合物25
中间体25a：8-溴-1,1-双(1-甲基庚氧基)辛烷
Figure BDA0003041605620000891
向8-溴辛醛(100mg，1.0当量)在辛-2-醇(15当量)中的溶液中添加硫酸(0.1当量)。在20℃下搅拌混合物12小时。完成后，将反应混合物用冰水淬灭且用EtOAc提取2次。减压浓缩合并的有机层且通过柱(EtOAc/己烷)纯化得到为无色油的产物(20mg,9％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.44(td,J＝5.6,3.9Hz,1H),3.64–3.49(m,2H),3.33(t,J＝6.9Hz,2H),1.78(p,J＝7.0Hz,2H),1.60–1.41(m,4H),1.41–1.14(m,24H),1.10(dd,J＝6.2,2.2Hz,3H),1.03(d,J＝6.1Hz,3H),0.81(td,J＝6.8,2.5Hz,6H)。
化合物25：8-[8,8-双(1-甲基庚氧基)辛基-(2-羟乙基)氨基]辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000901
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体25a合成化合物25。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.46–4.40(m,1H),3.99(t,J＝6.7Hz,2H),3.57(tq,J＝11.4,5.9Hz,2H),3.47(t,J＝5.3Hz,2H),2.52(t,J＝5.3Hz,2H),2.39(t,J＝7.5Hz,4H),2.22(t,J＝7.5Hz,2H),1.61–1.42(m,7H),1.41–1.15(m,39H),1.10(dd,J＝6.2,2.1Hz,3H),1.03(d,J＝6.1Hz,3H),0.81(t,J＝6.5Hz,9H)。MS:699.7m/z[M+H]。
实施例26-化合物26
化合物26：8-((2-羟基乙基)(10-辛基十八烷基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000902
根据WO 2017/049245 A3(实施例153)中描述的方法合成化合物26。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.99(t,J＝6.7Hz,2H),3.46(t,J＝5.4Hz,2H),2.51(t,J＝5.4Hz,2H),2.38(t,J＝7.5Hz,4H),2.22(t,J＝7.5Hz,3H),1.54(t,J＝7.1Hz,5H),1.37(t,J＝7.2Hz,4H),1.33–1.07(m,63H),0.81(t,J＝6.6Hz,9H)。MS:694.6m/z[M+H]。
实施例27-化合物27
中间体27a：8-溴辛酸辛-2-基酯
Figure BDA0003041605620000911
在0℃下在惰性气氛下向8-溴辛酸(10g，1.1当量)和辛-2-醇(1.0当量)在DCM(150mL)中的混合物中一次性添加EDCI(1.1当量)、DMAP(0.1当量)和DIPEA(3.0当量)。在15℃下搅拌混合物至少12小时。完成后，减压浓缩反应混合物，并且通过柱色谱法纯化所得粗残余物，得到为无色油的产物(4.1g,30％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.90–4.76(m,1H),3.33(t,J＝6.8Hz,2H),2.20(t,J＝7.5Hz,2H),1.78(p,J＝7.0Hz,2H),1.60–1.46(m,3H),1.39(dt,J＝15.5,6.6Hz,3H),1.31–1.16(m,12H),1.13(d,J＝6.3Hz,3H),0.86–0.77(m,3H)。
化合物27：8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸辛-2-基酯
Figure BDA0003041605620000912
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体27a合成化合物27，收率为45％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.93–4.84(m,1H),4.45(t,J＝5.7Hz,1H),3.78(s,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.6Hz,2H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.77(d,J＝52.0Hz,5H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.93–1.40(m,17H),1.39–1.21(m,37H),1.19(d,J＝6.3Hz,3H),0.99–0.67(m,9H)。MS:685.6m/z[M+H]。
实施例28-化合物28
中间体28a：8-溴辛酸壬-3-基酯
Figure BDA0003041605620000913
使用中间体27a所采用的方法，由8-溴辛酸和壬-3-醇合成中间体28a，收率为31％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.75(p,J＝6.2Hz,1H),3.33(t,J＝6.8Hz,2H),2.22(t,J＝7.5Hz,2H),1.78(p,J＝7.0Hz,2H),1.55(td,J＝8.9,8.2,5.7Hz,2H),1.47(dtd,J＝14.2,7.1,3.2Hz,4H),1.36(dt,J＝10.1,6.4Hz,2H),1.32–1.12(m,12H),0.88–0.76(m,6H)。
化合物28：8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬-3-基酯
Figure BDA0003041605620000921
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体28a合成化合物28，收率为53％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.81(ddd,J＝12.5,6.9,5.5Hz,1H),4.45(t,J＝5.7Hz,1H),3.80(s,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),2.81(s,5H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),1.79–1.40(m,18H),1.40–1.02(m,42H),0.95–0.73(m,12H)。MS:699.3m/z[M+H]。
实施例29-化合物29
中间体29a：8-溴辛酸戊酯
Figure BDA0003041605620000922
使用中间体27a所采用的方法，由8-溴辛酸和戊-1-醇合成中间体29a，收率为47％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.99(td,J＝6.8,1.6Hz,2H),3.33(td,J＝6.8,1.6Hz,2H),2.23(t,J＝7.5Hz,2H),1.84–1.75(m,2H),1.56(q,J＝7.0Hz,4H),1.47–1.33(m,2H),1.26(qt,J＝5.0,1.8Hz,8H),0.86–0.80(m,3H)。
化合物29：8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸戊酯
Figure BDA0003041605620000931
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体29a合成化合物29，收率为58％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.44(t,J＝5.7Hz,1H),4.06(t,J＝6.8Hz,2H),3.94(s,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.03(d,J＝38.0Hz,5H),2.29(dd,J＝8.5,6.4Hz,2H),1.79(s,4H),1.67–1.41(m,14H),1.41–1.12(m,37H),1.02–0.76(m,9H)。MS:643.4m/z[M+H]。
实施例30-化合物30
中间体30a：8-溴辛酸庚-3-基酯
Figure BDA0003041605620000932
使用中间体27a所采用的方法，由8-溴辛酸和庚-3-醇合成中间体30a，收率为47％。
化合物30：8-((8,8-双(辛氧基)辛基)(2-羟乙基)氨基)辛酸庚-3-基酯
Figure BDA0003041605620000933
使用化合物11所采用的方法，由中间体11a和中间体30a合成化合物30，收率为66％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.81(ddd,J＝12.5,6.8,5.5Hz,1H),4.45(t,J＝5.8Hz,1H),3.77(d,J＝53.2Hz,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.71(s,5H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.83–1.44(m,17H),1.30(dq,J＝18.1,3.8,3.2Hz,37H),1.02–0.69(m,12H)。MS:671.5m/z[M+H]。
实施例31-化合物31
中间体31a：2-((7,7-双(辛氧基)庚基)氨基)乙-1-醇
Figure BDA0003041605620000941
向中间体10b(15g，1.0当量)在EtOH(22mL)中的溶液中添加2-氨基乙醇(30当量)。在15℃下搅拌混合物12小时。完成后，将反应混合物减压浓缩，得到残余物，所述残余物通过柱色谱法纯化。浓缩含有产物的级分后，将所得残余物在MeCN中重构，且用己烷提取3次。将合并的己烷层浓缩以得到为无色油的产物(10.55g，73％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.47(t,J＝5.7Hz,1H),3.68–3.62(m,2H),3.58(dt,J＝9.3,6.6Hz,2H),3.42(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),2.82–2.76(m,2H),2.63(t,J＝7.1Hz,2H),1.67–1.45(m,8H),1.45–1.19(m,26H),0.96–0.84(m,6H)。
化合物31：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-羟乙基)氨基)辛酸庚酯
Figure BDA0003041605620000942
使用化合物11所采用的方法，由中间体31a和中间体15a合成化合物31，收率为68％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.06(t,J＝6.8Hz,2H),3.73(s,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),2.58(d,J＝135.2Hz,6H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.59(ddt,J＝21.1,14.3,6.8Hz,15H),1.44–1.02(m,40H),0.88(td,J＝7.0,2.9Hz,9H)。MS:657.4m/z[M+H]。
实施例32-化合物32
化合物32：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-羟乙基)氨基)辛酸辛-2-基酯
Figure BDA0003041605620000951
使用化合物11所采用的方法，由中间体31a和中间体27a合成化合物32，收率为64％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.89(h,J＝6.3Hz,1H),4.45(t,J＝5.7Hz,1H),3.55(dt,J＝9.4,6.8Hz,5H),3.40(dt,J＝9.3,6.8Hz,2H),3.07–2.32(m,7H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.79–1.40(m,15H),1.40–1.22(m,38H),1.19(d,J＝6.2Hz,3H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H)。MS:671.4m/z[M+H]。
实施例33-化合物33
化合物33：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬-3-基酯
Figure BDA0003041605620000952
使用化合物11所采用的方法，由中间体31a和中间体28a合成化合物33，收率为60％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.81(p,J＝6.3Hz,1H),4.45(t,J＝5.7Hz,1H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,4H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.89–2.40(m,5H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.57(dtt,J＝21.7,14.5,6.4Hz,14H),1.41–1.08(m,35H),0.88(td,J＝7.1,2.8Hz,10H)。MS:685.7m/z[M+H]。
实施例34-化合物34
化合物34：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-羟乙基)氨基)辛酸戊酯
Figure BDA0003041605620000961
使用化合物11所采用的方法，由中间体31a和中间体29a合成化合物34，收率为72％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.75(s,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.39(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.94–2.40(m,6H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.83–1.43(m,15H),1.42–1.09(m,36H),0.89(dt,J＝11.2,7.0Hz,9H)。MS:629.4m/z[M+H]。
实施例35-化合物35
化合物35：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-羟乙基)氨基)辛酸庚-3-基酯
Figure BDA0003041605620000962
使用化合物11所采用的方法，由中间体31a和中间体30a合成化合物35，收率为73％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.85–4.78(m,1H),4.45(t,J＝5.7Hz,1H),3.68(s,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.39(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.86–2.37(m,6H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.53(dtd,J＝14.4,7.4,5.6Hz,16H),1.43–1.08(m,37H),0.97–0.80(m,12H)。MS:657.6m/z[M+H]。
实施例36-化合物36
化合物36：8-((2-氨基乙基)(7,7-双(辛氧基)庚基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000971
在0℃下在惰性气氛下向化合物10(5.1g，1.0当量)和TEA(1.35mL，1.3当量)在DCM(50mL)中的混合物中滴加MsCl(721uL，1.25当量)。在15℃下搅拌混合物12小时。TLC指明起始材料被完全消耗。将反应物用H2O稀释，且用DCM提取2次，用Na2SO4干燥，过滤，并且减压浓缩滤液，得到残余物。
将所得粗制甲磺酸酯溶解在DMF(60mL)中，然后在15℃下在惰性气氛下一次性添加NaN3(2.78g，5.0当量)。在100℃下搅拌混合物4小时。TLC指明完全替换。将反应物用H2O稀释，且用EtOAc提取2次，用Na2SO4干燥，过滤，并且减压浓缩滤液，得到残余物。
将所得粗制叠氮化物溶解在EtOH(5mL)中，然后在惰性气氛下添加Pd/C(1g，10％w/w)。将悬浮液真空脱气且用H2净化若干次。在15℃下在H2(15psi)下搅拌混合物12小时。完成后，过滤反应混合物且减压浓缩滤液，得到残余物。残余物通过柱色谱法纯化三次，然后将分离的物质用MeCN和己烷洗涤，得到为黄色油的产物(2.3g，39％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.80(s,3H),4.38(t,J＝5.7Hz,1H),3.98(t,J＝6.8Hz,2H),3.48(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),3.33(dt,J＝9.5,6.8Hz,2H),2.82(t,J＝5.9Hz,2H),2.57(t,J＝6.0Hz,2H),2.50–2.36(m,4H),2.22(t,J＝7.5Hz,2H),1.62–1.33(m,15H),1.33–1.04(m,45H),0.81(t,J＝6.6Hz,9H)。MS:683.6m/z[M+H]。
实施例37-化合物37
中间体37a：8-((3-羟基丙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000981
在20℃下搅拌8-溴辛酸壬酯(10g，1.0当量)和3-氨基丙-1-醇(66.22mL，30当量)在EtOH(15mL)中的混合物12小时。完成后，将反应混合物减压浓缩以得到残余物。残余物通过柱色谱法纯化，得到为无色油的产物(10g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.07(t,J＝6.7Hz,2H),3.84(dt,J＝10.5,5.4Hz,2H),3.66(t,J＝5.6Hz,6H),3.43(q,J＝6.2Hz,6H),2.89(t,J＝5.6Hz,2H),2.61(t,J＝7.1Hz,2H),2.30(t,J＝7.5Hz,2H),2.03(s,10H),1.66(dt,J＝29.5,6.6Hz,14H),1.47(t,J＝7.0Hz,3H),1.31(d,J＝14.6Hz,16H),0.90(t,J＝6.6Hz,3H)。
化合物37：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(3-羟丙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000982
使用化合物1所采用的方法，由中间体1b和中间体37a合成化合物37，收率为30％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.47(t,J＝5.7Hz,2H),4.08(t,J＝6.7Hz,2H),3.81(t,J＝5.1Hz,2H),3.60–3.55(m,2H),3.42(dt,J＝9.3,6.7Hz,3H),2.68–2.62(m,2H),2.47–2.38(m,4H),2.31(t,J＝7.5Hz,2H),1.61(dt,J＝21.4,7.2Hz,21H),1.31(dt,J＝15.0,4.1Hz,51H),0.90(t,J＝6.7Hz,9H)。MS:698.7m/z[M+H]。
实施例38-化合物38
化合物38：8-((3-氨基丙基)(7,7-双(辛氧基)庚基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000991
使用化合物36所采用的方法，由化合物37合成化合物38。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.38(t,J＝5.7Hz,1H),3.98(t,J＝6.8Hz,2H),3.48(dt,J＝9.5,6.7Hz,2H),3.33(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),2.77(q,J＝5.2,4.0Hz,2H),2.48(t,J＝6.9Hz,2H),2.43–2.31(m,4H),2.22(t,J＝7.5Hz,2H),1.54(dtd,J＝28.3,13.8,6.7Hz,12H),1.43–1.11(m,49H),0.81(t,J＝6.7Hz,9H)。MS:697.8m/z[M+H]。
实施例39-化合物39
化合物39：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-((甲基氨甲酰基)氧基)乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620000992
向化合物10(1.0当量)在甲苯(0.1M)中的混合物中添加异氰酸甲酯(1.4当量)。将反应物在23℃下搅拌24小时，接着在60℃下搅拌48小时。完成后，将反应物用水稀释且用DCM提取3次。将合并的有机层浓缩且通过柱色谱法纯化以得到产物(33％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.44(t,J＝5.7Hz,1H),4.19(s,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.39(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.79(d,J＝4.9Hz,3H),2.28(t,J＝7.5Hz,2H),1.58(dp,J＝21.1,7.0Hz,13H),1.31(ddd,J＝23.5,12.5,5.9Hz,46H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H)。MS:742.7m/z[M+H]。
实施例40-化合物40
化合物40：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(3-((甲基氨甲酰基)氧基)丙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001001
使用化合物39所采用的方法，由化合物37合成化合物40，收率为34％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.57–3.52(m,2H),3.40(dt,J＝9.4,6.8Hz,2H),2.79(d,J＝4.8Hz,4H),2.37(s,4H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.58(dp,J＝21.2,7.0Hz,13H),1.30(ddt,J＝17.9,11.6,5.7Hz,49H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H)。MS:756.4m/z[M+H]。
实施例41-化合物41
化合物41：8-((2-乙酰氨基乙基)(7,7-双(辛氧基)庚基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001002
向化合物36(1.0当量)在DCM(0.2M)中的混合物中添加TEA(1.1当量)并冷却至0℃。滴加乙酰氯(1.04当量)，并将混合物搅拌4小时。完成后，将反应物用饱和碳酸氢钠溶液淬灭且用DCM提取3次。将合并的有机层浓缩且通过柱色谱法纯化以得到为无色油的产物(55％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.44(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.42–3.37(m,2H),3.35(d,J＝13.8Hz,2H),2.56(d,J＝48.6Hz,5H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.98(s,3H),1.66–1.41(m,15H),1.41–1.20(m,48H),0.90–0.83(m,9H)。MS:740.9m/z[M+H]。
实施例42-化合物42
化合物42：8-((3-乙酰氨基丙基)(7,7-双(辛氧基)庚基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001011
使用化合物41所采用的方法，由化合物38合成化合物42，收率为51％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.44(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.55(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),3.39(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.32(q,J＝5.6Hz,2H),2.52(t,J＝6.0Hz,2H),2.46–2.35(m,3H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.93(s,3H),1.68–1.50(m,12H),1.44(h,J＝6.9,6.1Hz,4H),1.39–1.21(m,45H),0.92–0.84(m,9H)。MS:742.7m/z[M+H]。
实施例43-化合物43
化合物43：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(3-((甲氧基羰基)氨基)丙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001012
向化合物38(1.0当量)在DCM(0.2M)中的混合物中添加TEA(1.1当量)并冷却至0℃。滴加氯甲酸甲酯(1.1当量)，且将混合物搅拌4小时。完成后，将反应物用饱和碳酸氢钠溶液淬灭且用DCM提取3次。将合并的有机层浓缩且通过柱色谱法纯化以得到为无色油的产物(31％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.64(s,3H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),3.26(q,J＝6.1Hz,2H),2.41(d,J＝44.1Hz,4H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.68–1.50(m,13H),1.50–1.20(m,49H),0.93–0.83(m,9H)。MS:756.0m/z[M+H]。
实施例44-化合物44
化合物44：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-((甲氧基羰基)氨基)乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001021
使用化合物43所采用的方法，由化合物36合成化合物44，收率为56％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.66(s,3H),3.58–3.50(m,2H),3.40(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),3.21(s,2H),2.44(d,J＝49.2Hz,5H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.65–1.50(m,11H),1.48–1.16(m,52H),0.91–0.83(m,9H)。MS:742.4m/z[M+H]。
实施例45-化合物45
化合物45：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-(3-甲基脲基)乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001031
向化合物36(1.0当量)在甲苯(0.02M)中的混合物中添加异氰酸甲酯(1.4当量)。在23℃下搅拌反应物4小时。完成后，将反应物用水稀释且用DCM提取3次。将合并的有机层浓缩且通过柱色谱法纯化以得到产物(23％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.20(s,1H),4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.27(d,J＝18.4Hz,2H),2.75(d,J＝4.8Hz,3H),2.54(d,J＝51.5Hz,5H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.67–1.40(m,15H),1.40–1.19(m,46H),0.92–0.84(m,9H)。MS:741.3m/z[M+H]。
实施例46-化合物46
化合物46：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(3-(3-甲基脲基)丙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001032
使用化合物45所采用的方法，由化合物38合成化合物46，收率为24％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.40(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.25(h,J＝5.0Hz,2H),2.75(d,J＝4.8Hz,3H),2.48(s,5H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.73–1.40(m,16H),1.40–1.19(m,44H),0.92–0.83(m,9H)。MS:755.0m/z[M+H]。
实施例47-化合物47
化合物47：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-(甲基磺酰氨基)乙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001041
向化合物36(1.0当量)在DCM(0.25M)中的混合物中添加MsCl(10当量)。将混合物在23℃下搅拌15分钟，然后用水洗涤2次且真空浓缩。通过柱色谱法纯化以得到为无色残余物的产物(13％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.47(t,J＝5.7Hz,1H),4.08(t,J＝6.8Hz,2H),3.58(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.42(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),3.22(s,1H),2.98(s,3H),2.60(d,J＝77.4Hz,4H),2.31(t,J＝7.5Hz,2H),1.69–1.42(m,15H),1.42–1.23(m,46H),0.94–0.86(m,9H)。MS:762.9m/z[M+H]。
实施例48-化合物48
化合物48：8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(3-(甲基磺酰氨基)丙基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001042
使用化合物47所采用的方法，由化合物38合成化合物48，收率为16％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.44(t,J＝5.6Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.6Hz,2H),3.43–3.32(m,4H),2.97(s,7H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.09(s,2H),1.88–1.50(m,15H),1.43–1.18(m,41H),0.97–0.76(m,9H)。MS:776.5m/z[M+H]。
实施例49-化合物49
化合物49：8-((2-乙酰氧基乙基)(7,7-双(辛氧基)庚基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001051
向化合物10(1.0当量)在吡啶(10当量)中的混合物中添加乙酸酐(10当量)。在23℃下搅拌混合物24小时。完成后，反应物通过添加水淬灭且用DCM提取3x。将合并的有机层真空浓缩且通过柱色谱法纯化以得到为无色油的产物(55％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.44(t,J＝5.7Hz,1H),4.14(q,J＝5.8,5.4Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.55(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),3.39(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.74(s,2H),2.49(s,4H),2.28(t,J＝7.5Hz,2H),2.05(s,3H),1.66–1.50(m,11H),1.50–1.39(m,4H),1.39–1.19(m,48H),0.91–0.84(m,9H)。MS:727.4m/z[M+H]。
实施例50-化合物50
化合物50：8-((3-乙酰氧基丙基)(7,7-双(辛氧基)庚基)氨基)辛酸壬酯
Figure BDA0003041605620001061
使用化合物49所采用的方法，由化合物37合成化合物50，收率为42％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45(t,J＝5.7Hz,1H),4.07(dt,J＝17.3,6.6Hz,4H),3.55(dt,J＝9.3,6.6Hz,2H),3.39(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.42(d,J＝38.1Hz,5H),2.28(t,J＝7.5Hz,2H),2.04(s,3H),1.75(s,2H),1.66–1.49(m,11H),1.45–1.21(m,52H),0.91–0.84(m,9H)。MS:741.2m/z[M+H]。
实施例51-pKa测量
根据Jayaraman等人(Angewandte Chemie,2012)中的方法，采用以下改编测定每种胺脂质的pKa。测定在乙醇中浓度为2.94mM的未配制的胺脂质的pKa。将脂质在0.1M磷酸盐缓冲液(Boston Bioproducts)中稀释至100μM，其中pH范围为4.5-9.0。使用321nm和448nm的激发波长和发射波长测量荧光强度。表2显示所列化合物的pKa测量。
表2-pKa值
Figure BDA0003041605620001062
Figure BDA0003041605620001071
实施例52-用于在小鼠中体内编辑的LNP组合物
用胺脂质制备各种LNP组合物的制剂。在小鼠中肝编辑百分比的测定中，将Cas9mRNA和化学修饰的sgRNA以1:1w/w比或1:2w/w比配制在LNP中。LNP用给定的可电离脂质(例如胺脂质)、DSPC、胆固醇和PEG-2k-DMG的组合物配制，其中N:P比为6.0。
LNP制剂-交叉流动
通过将乙醇中的脂质与两体积的RNA溶液和一体积的水撞击射流混合形成LNP。通过混合交叉将乙醇中的脂质与两体积的RNA溶液混合。第四水流通过直列三通与十字管的出口流混合。(参见例如WO2016010840，图2。)将LNP在室温下保持1小时，并用水(大约1:1v/v)进一步稀释。使用在平板滤筒(Sartorius，100kD MWCO)上的切向流过滤浓缩稀释的LNP，然后通过渗滤将缓冲液交换到50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(TSS)中。或者，用PD-10脱盐柱(GE)完成最终缓冲液交换为TSS。如果需要，通过用Amicon100kDa离心过滤器(Millipore)离心浓缩组合物。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。最终LNP在4℃或-80℃下储存，直到进一步使用。
LNP组成分析
使用动态光散射(“DLS”)表征本公开的LNP的多分散性指数(“pdi”)和尺寸。DLS测量由将样品置于光源下而产生的光散射。如根据DLS测量所测定，PDI表示群体中粒度的分布(平均粒度周围)，其中完全均匀群体的PDI为零。
使用电泳光散射表征指定pH下LNP的表面电荷。表面电荷或ζ电位是LNP悬浮液中的粒子之间的静电斥力/引力的量值的量度。
非对称流场流分离-多角度光散射(AF4-MALS)用于根据流体动力学半径分离组合物中的粒子，然后测量分离粒子的分子量、流体动力学半径和均方根半径。这允许评估分子量和尺寸分布以及二级特征，诸如Burchard-Stockmeyer曲线图(表明粒子的内部核心密度的随时间推移的均方根(“rms”)半径与流体动力学半径的比率)和rms构造图(rms半径的对数相对于分子量的对数，其中所得线性拟合的斜率给出相对于伸长率的紧密度)的能力。
纳米粒子追踪分析(NTA，Malvern Nanosight)可用于测定粒度分布以及粒子浓度。将LNP样品适当地稀释并且注射到显微镜载片上。相机在粒子缓慢输注通过视场时记录散射光。在捕获影片之后，纳米粒子追踪分析通过追踪像素并计算扩散系数来处理影片。所述扩散系数可转译成粒子的流体动力学半径。仪器还对分析中计数的单个粒子的数目计数以得到粒子浓度。
低温电子显微镜法(“cryo-EM”)可用于测定LNP的粒度、形态和结构特征。
可根据液体色谱法继之以电气溶胶检测法(LC-CAD)测定LNP的脂质组成分析。所述分析可提供实际脂质含量相对于理论脂质含量的比较。
分析LNP组合物的平均粒度、多分散性指数(pdi)、总RNA含量、RNA包封效率和ζ电位。可进一步通过脂质分析、AF4-MALS、NTA和/或cryo-EM表征LNP组合物。通过动态光散射(DLS)使用Malvern Zetasizer仪器测量平均粒度和多分散性。在通过DLS进行测量之前，将LNP样品用PBS缓冲液稀释。连同数均直径和pdi一起报告Z-平均直径，所述Z-平均直径为平均粒度的基于强度的测量。还使用Malvern Zetasizer仪器来测量LNP的ζ电位。在测量之前，将样品在0.1X PBS，pH 7.4中以1:17(50μL于800μL中)稀释。
使用基于荧光的测定(
Figure BDA0003041605620001091
ThermoFisher Scientific)来测定总RNA浓度和游离RNA。包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。用含有0.2％Triton-X 100的1xTE缓冲液适当地稀释LNP样品以测定总RNA或用1x TE缓冲液稀释以测定游离RNA。通过利用用于制造组合物并且在1x TE缓冲液+/-0.2％Triton-X 100中稀释的起始RNA溶液制备标准曲线。接着将稀释的
Figure BDA0003041605620001101
染料(根据制造商的说明书)添加到标准品和样品中的每一种中，并且使它们在不存在光的情况下在室温下孵育大约10分钟。使用SpectraMax M5微板读数器(Molecular Devices)，以分别在设定成488nm、515nm和525nm的激发波长、自动截止波长和发射波长下读取样品。自适当标准曲线测定总RNA和游离RNA。
包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。可使用相同工序来测定基于DNA的货物组分的包封效率。对于单链DNA，可使用Oligreen染料，并且对于双链DNA，可使用Picogreen染料。
使用AF4-MALS以自那些计算查看分子量和尺寸分布以及二次统计数据。将LNP适当地稀释并且使用HPLC自动进样器注射至AF4分离通道中，LNP在所述自动进样器中集中，然后跨越通道在交叉流中以指数梯度洗脱。所有流体通过HPLC泵和Wyatt Eclipse仪器驱动。自AF4通道洗脱的粒子流经UV检测器、多角度光散射检测器、准弹性光散射检测器和差示折光率检测器。通过使用Debeye模型处理原始数据以根据检测器信号测定分子量和rms半径。
通过耦合至电气溶胶检测器(CAD)的HPLC定量分析LNP中的脂质组分。通过反相HPLC来实现4种脂质组分的色谱分离。CAD为破坏性的基于质量的检测器，其检测所有非挥发性化合物并且不管分析物结构如何，信号都是一致的。
Cas9 mRNA和gRNA货物
通过体外转录制备Cas9 mRNA货物。包含1X NLS(SEQ ID NO:3)或PCT/US2019/053423的表24的序列(其通过引用并入本文)的加帽和聚腺苷酸化的Cas9 mRNA通过使用线性化质粒DNA模板和T7RNA聚合酶体外转录而产生。例如，通过在以下条件下与XbaI一起在37℃下孵育2小时来线性化含有T7启动子和100nt poly(A/T)区域的质粒DNA：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)和1x反应缓冲液。可通过在65℃下加热反应物20分钟来使XbaI失活。可使用二氧化硅最大旋柱(Epoch Life Sciences)自酶和缓冲盐纯化线性化质粒并且通过琼脂糖凝胶加以分析以证实线性化。产生Cas9修饰的mRNA的IVT反应通过在37℃下在以下条件下孵育4小时来进行：50ng/μL线性化质粒；2mM GTP、ATP、CTP和N1-甲基假UTP(Trilink)中的每一种；10mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠类RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。在4小时孵育之后，添加TURBO DNA酶(ThermoFisher)至0.01U/μL的最终浓度，并且再孵育反应物30分钟以去除DNA模板。用含LiCl沉淀的方法纯化Cas9 mRNA。
sgRNA(例如G650；SEQ ID NO:2)是化学合成的，并且任选地来源于商业供应商。
LNP
这些LNP以1:1w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。LNP的脂质组分中脂质的摩尔浓度表示为mol％胺脂质/DSPC/胆固醇/PEG-2k-DMG，例如50/10/38.5/1.5。根据以上提供的分析方法表征最终的LNP以确定包封效率、多分散性指数和平均粒度。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表3中。
表3-组成分析
Figure BDA0003041605620001111
Figure BDA0003041605620001121
化合物19的结构和合成方法公开于US 2017/0196809A1中，其全部内容并入本文。
除非另有说明，否则以0.1mg/kg的单剂量向小鼠施用LNP，并如下所述分离基因组DNA用于NGS分析。
LNP的体内递送
在每个研究中使用6-10周龄的CD-1雌性小鼠。将动物称重并根据体重分组，以基于组平均重量制备给药溶液。LNP通过侧尾静脉以每只动物0.2mL的体积(大约10mL/千克体重)给药。给药后至少24小时定期观察动物的给药后副作用。在异氟烷麻醉下，在6天或7天通过心脏穿刺放血对动物实施安乐死。将血液收集到血清分离器管中或收集到含有如本文所述的用于血浆的缓冲柠檬酸钠的管中。对于涉及体内编辑的研究，从每只动物收集肝组织用于DNA提取和分析。
通过下一代测序(NGS)测量小鼠群组的肝脏编辑。
NGS测序
简短地讲，为了定量测定基因组中靶位置处的编辑效率，分离基因组DNA且利用深度测序来鉴定由基因编辑引入的插入和缺失的存在。
在靶位点(例如B2M)周围设计PCR引物，并且扩增目标基因组区。根据制造商的协定(Illumina)进行另外PCR以为测序添加必要的化学品。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量得分的那些读出之后，将读出与人参考基因组(例如hg38)比对。将所得含有读出的文件定位至参考基因组(BAM文件)，其中选择与目标靶区域重叠的读出，且计算野生型读出的数目相对于含有插入、取代或缺失的读出的数目。
编辑百分比(例如“编辑效率”或“百分比编辑”)定义为具有插入或缺失的序列读出总数除以包括野生型的序列读出总数。
图1显示如通过NGS测量的小鼠肝脏中的编辑百分比。如图1和表4中所示，体内编辑百分比范围为约8％至超过35％肝编辑。
表4.在小鼠肝脏中B2M的编辑效率
条件 编辑(％) 标准偏差 样品数(n)
TSS 0.0 0.1 5
化合物19 12.0 3.2 4
化合物1 36.8 7.0 5
化合物2 17.7 2.9 5
化合物3 8.8 2.0 5
化合物5 13.2 2.7 5
化合物6 8.2 1.8 5
实施例53-肝脏中编辑的剂量反应
为了评估剂量的可扩展性，用化合物1在体内进行剂量反应实验。将实施例52的Cas9 mRNA与靶向TTR(G282；SEQ ID NO:1)或B2M(G650；SEQ ID NO:2)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:1w/w比的单一向导RNA和Cas9 mRNA配制。使用如表5中所述的组成使用交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比，并且如果需要，在使用Amicon PD-10过滤器(GE Healthcare)浓缩后，以表5中所述的浓度使用。
如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA的包封效率。
平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表5中。
表5：组成分析
Figure BDA0003041605620001141
CD-1雌性小鼠以0.1mpk或0.3mpk静脉内给药。在给药后6天，处死动物。对于用靶向TTR的G282给药的动物，收集血液和肝脏且测量血清TTR和编辑。对于用靶向B2M的G650给药的动物，收集肝脏且测量编辑。
运甲状腺素蛋白(TTR)ELISA分析
如所示收集血液并分离血清。使用Mouse Prealbumin(Transthyretin)ELISA试剂盒(Aviva Systems Biology,目录号OKIA00111)测定总小鼠TTR血清水平。简短地讲，用试剂盒样品稀释剂将血清系列稀释到10,000倍最终稀释度用于0.1mpk和2,500倍最终稀释度用于0.3mpk。然后将所述稀释的样品添加到ELISA板中，然后根据说明书进行测定。
表6和图2A至图2C显示在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。在各剂量下，化合物1制剂在肝脏中显示出比化合物19制剂高的TTR编辑。化合物1制剂显示在0.1mpk和0.3mpk两种剂量下TTR编辑在55-60％范围内，表明在低剂量下的功效。
表6：用于剂量反应的TTR肝编辑和血清TTR水平
Figure BDA0003041605620001142
Figure BDA0003041605620001151
表7和图3显示肝脏中的B2M编辑结果。在各剂量下，化合物1在肝脏中显示出比化合物19高的B2M编辑。在0.1mpk剂量和0.3mpk剂量之间，化合物1和化合物19显著增加肝脏中B2M的编辑。
表7：用于剂量反应的B2M肝编辑
条件 剂量(mpk) 编辑(％) 标准偏差 样品数(n)
TSS 0.1 0.1 5
化合物19 0.1 25.5 10.1 5
化合物19 0.3 43.4 10.1 5
化合物1 0.1 41.0 9.0 5
化合物1 0.3 62.9 2.3 5
表54-用包含化合物4的组合物在小鼠肝脏中的B2M编辑
用包含化合物4的组合物中的不同的剂量和PEG脂质浓度评估编辑。将实施例52中描述的Cas9 mRNA与靶向B2M(G650；SEQ ID NO:2)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:1w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。使用如表8中所述的组成使用交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比。所有LNP都使用Amicon PD-10过滤器(GE Healthcare)和/或切向流过滤进行浓缩，并以表8中所述的浓度使用。
如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA的包封效率。
平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表8中。
表8-组成分析
Figure BDA0003041605620001161
CD-1雌性小鼠以0.1mpk或0.3mpk静脉内给药。在给药后7天，处死动物，收集肝脏并通过NGS测量编辑。表9和图4显示肝脏中的B2M编辑结果。与0.1mpk剂量相比，包含化合物4的组合物在0.3mpk剂量下显示增加的编辑，化合物19比较组合物也是如此。
表9-使用化合物4在小鼠肝脏中的B2M编辑
条件 剂量(mpk) ％编辑 标准偏差 样品数(n)
TSS - 0 0 5
化合物19 0.1 13 6 5
化合物19 0.3 44 15 5
化合物4 0.1 29 6 5
化合物4 0.3 57 7 5
实施例55-在小鼠肝脏中的TTR编辑
对于另外的组合物评估编辑。将实施例52中描述的Cas9 mRNA与靶向TTR(G282；SEQ ID NO:1)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:1w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。用如表10中所述的组成使用如实施例52中所述的交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比。以表10中所述的浓度使用LNP。如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA的包封效率。
平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表10中。
表10-组成分析
Figure BDA0003041605620001171
CD-1雌性小鼠以0.1mpk静脉内给药。在给药后7天，处死动物。收集血液和肝脏，并且如上所述测量血清TTR和编辑。表11和图5显示在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。
表11
Figure BDA0003041605620001172
在所述实施例中测试的式(I)或式(II)的每种胺脂质显示TTR编辑为约40-50％，血清TTR水平相应降低约80％。这些LNP与参考相比是有利的。
实施例56-在小鼠肝脏中的TTR编辑
对于另外的胺脂质制剂评估编辑。将实施例52的Cas9 mRNA与靶向TTR(G282；SEQID NO:1)的向导RNA一起配制成LNP。用如表12中所述的组成使用如实施例52中所述的交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比。LNP以约0.06mg/ml的浓度使用。如实施例52所述，分析LNP制剂的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA的包封效率。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表12中。
表12-组成分析
可电离的脂质 组成比 包封(％) Z-平均尺寸(nm) PDI 数均尺寸(nm)
化合物19 50/9/38/3 97 79.18 0.047 63.19
化合物18 50/10/38.5/1.5 81 106.6 0.112 69.77
化合物5 50/10/38.5/1.5 98 108.1 0.273 48.59
CD-1雌性小鼠以0.1mpk静脉内给药。在给药后7天，处死动物。收集血液和肝脏，并且如上所述测量血清TTR和编辑。表13描述在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。
表13-在小鼠肝脏和血清TTR水平下的编辑
Figure BDA0003041605620001181
实施例57-表达的蛋白质的测量
对于mRNA货物，蛋白质表达是脂质纳米颗粒递送的一种量度。例如，ELISA可用于测量生物样品中多种蛋白质的蛋白质水平。以下方案可用于测量来自生物样品的表达的蛋白质，例如Cas9蛋白质表达。简短地讲，通过二辛可宁酸测定来确定澄清的细胞裂解物的总蛋白浓度。根据制造商的方案，使用Cas9小鼠抗体(Origene，目录号CF811179)作为捕获抗体和Cas9(7A9-3A3)小鼠mAb(Cell Signaling Technology，目录号14697)作为检测抗体，制备MSD GOLD 96-孔链霉亲和素SECTOR板(Meso Scale Diagnostics，目录号L15SA-1)。重组Cas9蛋白在具有不含EDTA的1X HaltTM蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisher，目录号78437)的稀释剂39(Meso Scale Diagnostics)中用作校准标准。使用Meso QuickplexSQ120仪器(Meso Scale Discovery)读出ELISA板，并用Discovery Workbench 4.0软件包(Meso Scale Discovery)分析数据。
实施例58-在小鼠肝脏中的TTR编辑
对于另外的组合物评估编辑。将实施例52中描述的Cas9 mRNA与靶向TTR(G282；SEQ ID NO:1)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:1w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。用如表14中所述的组成使用如实施例52中所述的交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比。以表14中所述的浓度使用LNP。如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA的包封效率。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表14中。
表14-组成分析
Figure BDA0003041605620001191
五只CD-1雌性小鼠对于每种条件以0.1mpk静脉内给药。在给药后6天，处死动物。收集血液和肝脏，并且如上所述测量血清TTR和编辑。表15和图6显示在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。
表15-在小鼠肝脏和血清TTR水平下的编辑
Figure BDA0003041605620001201
实施例59-在小鼠肝脏中的TTR编辑
对于另外的组合物评估编辑。将实施例52中描述的Cas9 mRNA与靶向TTR(G282；SEQ ID NO:1)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:1w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。用如表16中所述的组成使用如实施例52中所述的交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比。LNP以约0.05mg/ml的浓度使用。如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA的包封效率。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表16中。
表16-组成分析
Figure BDA0003041605620001202
Figure BDA0003041605620001211
CD-1雌性小鼠以0.1mpk静脉内给药。在给药后7天，处死动物。收集血液和肝脏，并且如上所述测量血清TTR和编辑。表17和图7显示在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。
表17-在小鼠肝脏和血清TTR水平下的编辑
Figure BDA0003041605620001212
实施例60-在小鼠肝脏中的TTR编辑
对于另外的组合物评估编辑。将实施例52中描述的Cas9 mRNA与靶向TTR(G502；SEQ ID NO:4)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:2w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。用如表18中所述的组成使用如实施例52中所述的交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比。LNP以约0.05的浓度使用。如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA的包封效率。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表18中。
表18-组成分析
Figure BDA0003041605620001213
Figure BDA0003041605620001221
CD-1雌性小鼠以0.1mpk静脉内给药。在给药后6天，处死动物。收集血液和肝脏，并且如上所述测量血清TTR和编辑。表19和图8显示在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。
表19-在小鼠肝脏和血清TTR水平下的编辑
Figure BDA0003041605620001222
实施例61-在小鼠肝脏中的TTR编辑
对于另外的组合物评估编辑。将实施例52中描述的Cas9 mRNA与靶向TTR(G282；SEQ ID NO:1)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:1w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。用如表20中所述的组成使用如实施例52中所述的交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比。以表20中所述的浓度使用LNP。如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA的包封效率。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表20中。
表20-组成分析
Figure BDA0003041605620001223
Figure BDA0003041605620001231
CD-1雌性小鼠以0.1mpk静脉内给药。在给药后7天，处死动物。收集血液和肝脏，并且如上所述测量血清TTR和编辑。表21和图9显示在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。
表21-在小鼠肝脏和血清TTR水平下的编辑
Figure BDA0003041605620001232
实施例62-肝脏中编辑的剂量反应
为了评估剂量的可扩展性，在体内进行剂量反应实验。将实施例52的Cas9 mRNA与靶向TTR(G282；SEQ ID NO:1)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:2w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。用如表22中所述的组成使用交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比，并且如果需要，在使用Amicon PD-10过滤器(GE Healthcare)浓缩后，以表22中所述的浓度使用。
如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA的包封效率。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表22中。
表22：组成分析
Figure BDA0003041605620001233
Figure BDA0003041605620001241
CD-1雌性小鼠以0.1mpk或0.03mpk静脉内给药。在给药后7天，处死动物。收集血液和肝脏且测量血清TTR和编辑。表23和图10显示在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。
表23：用于剂量反应的TTR肝编辑和血清TTR水平
Figure BDA0003041605620001242
实施例63-在小鼠肝脏中的TTR编辑
对于另外的组合物评估编辑。将实施例52中描述的Cas9 mRNA与靶向TTR(G282；SEQ ID NO:1)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:1w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。用如表24中所述的组成使用如实施例52中所述的交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比。以如表24中所述的浓度使用LNP。如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表24中。
表24-组成分析
Figure BDA0003041605620001243
Figure BDA0003041605620001251
CD-1雌性小鼠以0.1mpk静脉内给药。在给药后7天，处死动物。收集血液和肝脏且如上所述测量血清TTR和编辑。表25显示在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。
表25-在小鼠肝脏和血清TTR水平下的编辑
Figure BDA0003041605620001252
实施例64-在小鼠肝脏中的TTR编辑
对于另外的组合物评估编辑。将实施例52中描述的Cas9 mRNA与靶向TTR(G282；SEQ ID NO:1)的向导RNA一起配制成LNP。这些LNP以1:1w/w比的单向导RNA和Cas9 mRNA配制。用如表26中所述的组成使用如实施例52中所述的交叉流动工序组装LNP。所有LNP都具有6.0的N:P比。以如表26中所述的浓度使用LNP。如实施例52所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA的包封效率的分析示于表26中。
表26-组成分析
Figure BDA0003041605620001261
CD-1雌性小鼠以0.1mpk静脉内给药。在给药后7天，处死动物。收集血液和肝脏且如上所述测量血清TTR和编辑。表27显示在肝脏和血清TTR水平下的TTR编辑结果。
表27-在小鼠肝脏和血清TTR水平下的编辑
Figure BDA0003041605620001262
Figure BDA0003041605620001271
序列表
Figure BDA0003041605620001272
Figure BDA0003041605620001281
Figure BDA0003041605620001291
Figure BDA0003041605620001301
2′-O-甲基修饰和如下所示的硫代磷酸酯键(m＝2’-OMe；*＝硫代磷酸酯)。

Claims (104)

1.一种式(I)化合物
Figure FDA0003041605610000011
其中，在每次出现时独立地，
X1为C5-11亚烷基，
Y1为C3-11亚烷基，
Y2为
Figure FDA0003041605610000012
其中a1为与Y1键合的键，并且a2为与R1键合的键，
Z1为C2-4亚烷基，
Z2选自-OH、-NH2、-OC(＝O)R3、-OC(＝O)NHR3、-NHC(＝O)NHR3和-NHS(＝O)2R3，
R1为C4-12烷基或C3-12烯基，
每个R2独立地为C4-12烷基，并且
R3为C1-3烷基，
或其盐。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述盐为药学上可接受的盐。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中X1为直链C5-11亚烷基。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X1为直链C6-10亚烷基。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X1为直链C6亚烷基、直链C7亚烷基、直链C8亚烷基或直链C9亚烷基。
6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Y1为直链C4-9亚烷基。
7.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Y1为直链C6-8亚烷基。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Y1为直链C7亚烷基。
9.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1为C4-12烯基。
10.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1为C9烯基。
11.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Y2为
Figure FDA0003041605610000021
12.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中选择Y1、Y2和R1以形成16-21个原子的直链。
13.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中选择Y1、Y2和R1以形成16-18个原子的直链。
14.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z1为直链C2-4亚烷基。
15.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z1为C2亚烷基或C3亚烷基。
16.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z2为-OH。
17.如权利要求1-15中任一项所述的化合物，其中Z2为-NH2。
18.如权利要求1-15中任一项所述的化合物，其中Z2为-OC(＝O)R3、-OC(＝O)NHR3、-NHC(＝O)NHR3或-NHS(＝O)2R3。
19.如权利要求18所述的化合物，其中R3为甲基。
20.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1为直链C4-12烷基。
21.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1为直链C8-10烷基。
22.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1为直链C9烷基。
23.如权利要求1-19中任一项所述的化合物，其中R1为支链C6-12烷基。
24.如权利要求23所述的化合物，其中R1为支链C8烷基、支链C9烷基或支链C10烷基。
25.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中每个R2独立地为直链C5-12烷基。
26.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中每个R2独立地为直链C6-8烷基。
27.如权利要求1-24中任一项所述的化合物，其中每个R2独立地为支链C5-12烷基。
28.如权利要求27所述的化合物，其中每个R2独立地为支链C6-8烷基。
29.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中选择X1和所述R2部分之一以形成16-18个原子的直链，所述原子包括缩醛的碳和氧原子。
30.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为式(II)化合物
Figure FDA0003041605610000041
其中，在每次出现时独立地，
X1为C5-11亚烷基，
Y1为C3-10亚烷基，
Y2为
Figure FDA0003041605610000042
其中a1为与Y1键合的键，并且a2为与R1键合的键，
Z1为C2-4亚烷基，
R1为C4-12烷基或C3-12烯基，
每个R2独立地为C4-12烷基，
或其盐。
31.如权利要求30所述的化合物，其中所述盐为药学上可接受的盐。
32.如权利要求30或31所述的化合物，其中X1为直链C5-11亚烷基。
33.如权利要求32所述的化合物，其中X1为直链C6-8亚烷基。
34.如权利要求33所述的化合物，其中X1为直链C7亚烷基。
35.如权利要求30-34中任一项所述的化合物，其中Y1为直链C4-9亚烷基。
36.如权利要求30-35中任一项所述的化合物，其中Y1为直链C5-9亚烷基。
37.如权利要求30-36中任一项所述的化合物，其中Y1为直链C6-8亚烷基。
38.如权利要求30-37中任一项所述的化合物，其中Y1为直链C7亚烷基。
39.如权利要求30-38中任一项所述的化合物，其中Y2为
Figure FDA0003041605610000051
40.如权利要求30-39中任一项所述的化合物，其中R1为C4-12烯基。
41.如权利要求30-40中任一项所述的化合物，其中R1为C9烯基。
42.如权利要求30-41中任一项所述的化合物，其中选择Y1、Y2和R1以形成16-21个原子的直链。
43.如权利要求30-42中任一项所述的化合物，其中选择Y1、Y2和R1以形成16-18个原子的直链。
44.如权利要求30-43中任一项所述的化合物，其中Z1为直链C2-4亚烷基。
45.如权利要求30-44中任一项所述的化合物，其中Z1为C2亚烷基。
46.如权利要求30-39和42-45中任一项所述的化合物，其中R1为直链C4-12烷基。
47.如权利要求30-39和42-46中任一项所述的化合物，其中R1为直链C8-10烷基。
48.如权利要求30-39和42-47中任一项所述的化合物，其中R1为直链C9烷基。
49.如权利要求30-48中任一项所述的化合物，其中每个R2独立地为C5-12烷基。
50.如权利要求30-49中任一项所述的化合物，其中每个R2为直链C5-12烷基。
51.如权利要求30-50中任一项所述的化合物，其中每个R2为直链C6-10烷基。
52.如权利要求30-51中任一项所述的化合物，其中每个R2为直链C6-8烷基。
53.如权利要求30-52中任一项所述的化合物，其中选择X1和所述R2部分之一以形成16-18个原子的直链，所述原子包括所述缩醛的碳和氧原子。
54.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
Figure FDA0003041605610000071
Figure FDA0003041605610000081
Figure FDA0003041605610000091
Figure FDA0003041605610000101
Figure FDA0003041605610000111
Figure FDA0003041605610000121
Figure FDA0003041605610000131
或其盐。
55.如权利要求55所述的化合物，其中所述盐为药学上可接受的盐。
56.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物的质子化形式的pKa为约5.1至约8.0。
57.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物的质子化形式的pKa为约5.7至约6.4。
58.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物的质子化形式的pKa为约5.8至约6.2。
59.如权利要求1-56中任一项所述的化合物，其中所述化合物的质子化形式的pKa为约5.5至约6.0。
60.如权利要求59所述的化合物，其中所述化合物的质子化形式的pKa为约6.1至约6.3。
61.一种组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的化合物和脂质组分。
62.如权利要求61所述的组合物，其中所述组合物包含约50％的如前述权利要求中任一项所述的化合物和脂质组分。
63.如权利要求61或62所述的组合物，其中所述组合物为LNP组合物。
64.如权利要求61-63中任一项所述的组合物，其中所述脂质组分包含辅助脂质和PEG脂质。
65.如权利要求61-64中任一项所述的组合物，其中所述脂质组分包含辅助脂质、PEG脂质和中性脂质。
66.如权利要求61-65中任一项所述的组合物，其还包含冷冻保护剂。
67.如权利要求61-66中任一项所述的组合物，其还包含缓冲液。
68.如权利要求61-67中任一项所述的组合物，其还包含核酸组分。
69.如权利要求68所述的组合物，其中所述核酸组分为RNA或DNA组分。
70.如权利要求68或69所述的组合物，其中所述组合物具有约3-10的N/P比。
71.如权利要求70所述的组合物，其中所述N/P比为约6±1。
72.如权利要求70所述的组合物，其中所述N/P比为约6±0.5。
73.如权利要求70所述的组合物，其中所述N/P比为约6。
74.如权利要求61-73中任一项所述的组合物，其包含RNA组分，其中所述RNA组分包含mRNA。
75.如权利要求74所述的组合物，其中所述RNA组分包含RNA导向的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶mRNA。
76.如权利要求74或75所述的组合物，其中所述RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA。
77.如权利要求74-76中任一项所述的组合物，其中所述RNA组分包含Cas9核酸酶mRNA。
78.如权利要求74-77中任一项所述的组合物，其中所述mRNA为修饰的mRNA。
79.如权利要求74-78中任一项所述的组合物，其中所述RNA组分包含gRNA核酸。
80.如权利要求79所述的组合物，其中所述gRNA核酸为gRNA。
81.如权利要求74-78中任一项所述的组合物，其中所述RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。
82.如权利要求79-81中任一项所述的组合物，其中所述gRNA核酸为或编码双向导RNA(dgRNA)。
83.如权利要求79-81中任一项所述的组合物，其中所述gRNA核酸为或编码单向导RNA(sgRNA)。
84.如权利要求79-83中任一项所述的组合物，其中所述gRNA为修饰的gRNA。
85.如权利要求84所述的组合物，其中所述修饰的gRNA在5'端的前五个核苷酸中的一个或多个处包含修饰。
86.如权利要求84或85所述的组合物，其中所述修饰的gRNA在3'端的最后五个核苷酸中的一个或多个处包含修饰。
87.如权利要求61-86中任一项所述的组合物，其还包含至少一种模板核酸。
88.一种基因编辑的方法，其包括使细胞与如权利要求61-87中任一项所述的组合物接触。
89.一种裂解DNA的方法，其包括使细胞与如权利要求61-87中任一项所述的组合物接触。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述接触步骤产生单链DNA切口。
91.如权利要求89所述的方法，其中所述接触步骤产生双链DNA断裂。
92.如权利要求88所述的方法，其中所述组合物包含2类Cas mRNA和向导RNA核酸。
93.如权利要求88或92所述的方法，其还包括将至少一种模板核酸引入所述细胞。
94.如权利要求93所述的方法，其包括使所述细胞与包含模板核酸的组合物接触。
95.如权利要求88-94中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述组合物施用到动物。
96.如权利要求88-95中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述组合物施用到人。
97.如权利要求88-94中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述组合物施用到细胞。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
99.如权利要求88所述的方法，其中所述方法包括施用配制在第一LNP组合物和第二LNP组合物中的所述mRNA，所述第二LNP组合物包含mRNA、gRNA、gRNA核酸和模板核酸中的一种或多种。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物同时施用。
101.如权利要求99所述的方法，其中所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物顺序施用。
102.如权利要求99所述的方法，其中所述方法包括施用配制在单一LNP组合物中的所述mRNA和所述向导RNA核酸。
103.如权利要求88-102中任一项所述的方法，其中所述基因编辑产生基因敲除。
104.如权利要求88-102中任一项所述的方法，其中所述基因编辑产生基因校正。
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