CN113260607A - 改性的胺脂质 - Google Patents

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S·S·斯库利
M·梅塔尼
R·马伊祖布
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Intelia Therapeutics Co ltd
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Abstract

本公开提供可电离的胺脂质及其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其可用于递送生物活性剂，例如将生物活性剂递送到细胞以制备工程化细胞。本文公开的可电离的胺脂质可用作基于脂质纳米颗粒的组合物的配制中的可电离脂质。

Description

改性的胺脂质
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月5日提交的美国临时专利申请号62/775,783的优先权，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术
用可电离的含胺脂质配制的脂质纳米颗粒可以用作用于将生物活性剂，特别是多核苷酸，诸如RNA、mRNA和向导RNA递送到细胞中的货物媒介物。含有可电离的脂质的LNP组合物可促进寡核苷酸剂递送穿过细胞膜，并且可用于将用于基因编辑的组分和组合物引入到活细胞中。特别难以递送到细胞的生物活性剂包括蛋白质、基于核酸的药物及其衍生物，特别是包含相对大的寡核苷酸(诸如mRNA)的药物。用于将有前景的基因编辑技术递送到细胞中，诸如用于递送CRISPR/Cas9系统组分的组合物受到特别关注(例如，编码核酸酶的mRNA和相关的向导RNA(gRNA))。
需要用于将CRISPR/Cas的蛋白质和核酸组分递送到细胞(诸如患者中的细胞)的组合物。具体地说，用于递送编码CRISPR蛋白组分的mRNA和用于递送CRISPR向导RNA的组合物受到特别关注。具有用于体外和体内递送的有用性质的组合物也受到特别关注，所述组合物可稳定化和递送RNA组分。
发明内容
本公开提供可用于配制脂质纳米颗粒(LNP)组合物的含胺脂质。此类LNP组合物可具有有利于将诸如CRISPR/Cas基因编辑组分的核酸货物递送到细胞的性质。
在某些实施方案中，本公开涉及一种具有式(IA)的结构的化合物：
Figure BDA0003132577440000021
其中，在每次出现时独立地，
X1为C1-3亚烷基或
Figure BDA0003132577440000022
X2选自O、NH、NMe和键，
X3为C2-4亚烷基，
X4为C1亚烷基或键，
X5为C1亚烷基或键，
R1为C1-3烷基，
R2为C1-3烷基，或者
R2与氮原子和R1或X3的碳原子一起形成4元、5元或6元环，
Y1选自键、-CH＝CH-、-(C＝O)O-和-O(C＝O)-，
Y2选自-CH2-CH＝CH-和C3-C4亚烷基，
R3选自H、C5-7环烷基、C8-C10烯基和C3-18烷基，
R4为C4-8烷基，
或其盐，
其条件是当R2为Me，R3为直链C12烷基，X1为C2亚烷基，X2为O，X3为C3亚烷基，X4为键，X5为C1亚烷基，Y1为顺式-CH＝CH-，并且-Y2–R4为顺式-CH2-CH＝CH-(C5-烷基)时，则R1为C2-3烷基。
在某些实施方案中，本公开涉及一种具有式(I)的结构的化合物：
Figure BDA0003132577440000031
其中，在每次出现时独立地，
X1为C2-3亚烷基，
X2选自O、NH、NMe和键，
X3为C2-4亚烷基，
X4为C1亚烷基或键，
X5为C1亚烷基或键，
R1为C1-2烷基，
R2为C1-2烷基，或者
R2与氮原子和R1或X3的碳原子一起形成5元或6元环，
Y1选自-CH＝CH-、-(C＝O)O-和-O(C＝O)-，
R3选自H、C5-7环烷基和C3-18烷基，
R4为C4-7烷基，
或其盐，
其条件是当R2为Me，R3为直链C12烷基，X1为C2亚烷基，X2为O，X3为C3亚烷基，X4为键，X5为C1亚烷基，Y1为顺式-CH＝CH-，并且R4为C5烷基时，则R1为C2烷基，或其盐，诸如其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其条件是当R2为Me，R3为直链C12烷基，X1为C2亚烷基，X2为O，X3为C3亚烷基，X4为键，X5为C1亚烷基，并且Y1为顺式-CH＝CH-时，则R1为C2烷基。
在某些实施方案中，X1为直链C2亚烷基。在其他实施方案中，X1为C1亚烷基。在一些实施方案中，X1为直链C3亚烷基或支链C3亚烷基。
在一些其他实施方案中，X2为NH或O。在某些优选实施方案中，X2为O且X3为C3-4亚烷基。在一些实施方案中，X3为C2-3亚烷基。在某些实施方案中，X2为NMe或键。
在某些实施方案中，R2与X3的碳原子一起形成4元环。在某些实施方案中，R2与X3的碳原子一起形成5元环。在一些实施方案中，R2与X3的碳原子一起形成6元环。可替代地，R2可以为C2烷基。在一些情况下，R2为C1烷基。在一些实施方案中，R2例如被羟基取代，R2的实例包括羟基取代的C2烷基。
在某些实施方案中，R1为C1烷基。可替代地，R1可以为C2烷基。在一些实施方案中，R1例如被羟基取代，R1的实例包括羟基取代的C2烷基。在其他实施方案中，R1与R2一起形成4元环。在其他实施方案中，R1与R2一起形成5元环。在其他实施方案中，R1与R2一起形成6元环。
在一些实施方案中，R3为线性C8-16烷基，例如线性C7-12烷基，诸如线性C7-9烷基。可替代地，R3可以为直链C3-6烷基。在一些实施方案中，R3为支链C6-10烷基。在其他实施方案中，R3为C5-7环烷基，例如C6环烷基。在一些实施方案中，R3为H。在一些实施方案中，R3为C8-10烯基。
在某些实施方案中，R4为直链C5-6烷基。
在一些实施方案中，X4为键。
在某些实施方案中，X5为C1亚烷基。
在一些实施方案中，Y2–R4为–CH2-CH＝CH-R4。
在其他实施方案中，Y2为直链C3亚烷基。
在一些实施方案中，Y1选自键、-CH＝CH-和-O(C＝O)-，例如-CH＝CH-和-O(C＝O)-。
在某些实施方案中，所述化合物是式II的化合物：
Figure BDA0003132577440000061
其中变量如式(IA)所定义。
在某些实施方案中，所述化合物是式III的化合物；
Figure BDA0003132577440000062
Figure BDA0003132577440000063
其中变量如式(IA)所定义。
式(IA)或(I)的代表性化合物包括：
Figure BDA0003132577440000064
Figure BDA0003132577440000071
Figure BDA0003132577440000081
Figure BDA0003132577440000091
Figure BDA0003132577440000101
Figure BDA0003132577440000111
Figure BDA0003132577440000121
Figure BDA0003132577440000131
Figure BDA0003132577440000141
Figure BDA0003132577440000151
Figure BDA0003132577440000161
Figure BDA0003132577440000171
Figure BDA0003132577440000181
Figure BDA0003132577440000191
Figure BDA0003132577440000201
Figure BDA0003132577440000211
Figure BDA0003132577440000221
Figure BDA0003132577440000231
Figure BDA0003132577440000241
Figure BDA0003132577440000251
Figure BDA0003132577440000261
Figure BDA0003132577440000271
Figure BDA0003132577440000281
Figure BDA0003132577440000291
Figure BDA0003132577440000301
Figure BDA0003132577440000311
Figure BDA0003132577440000321
Figure BDA0003132577440000331
或其盐，优选地药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物选自：
Figure BDA0003132577440000341
Figure BDA0003132577440000351
Figure BDA0003132577440000361
Figure BDA0003132577440000362
或其盐。
在其他实施方案中，所述化合物选自：
Figure BDA0003132577440000363
Figure BDA0003132577440000371
Figure BDA0003132577440000381
Figure BDA0003132577440000382
或其盐。
而在其他实施方案中，所述化合物选自：
Figure BDA0003132577440000383
Figure BDA0003132577440000391
Figure BDA0003132577440000401
Figure BDA0003132577440000402
或其盐。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何化合物，其中所述化合物的质子化形式的pKa为约5.1至约8.0，例如约5.6至约7.2、约5.7至约6.5或约5.8至约6.2。在一些实施方案中，化合物的质子化形式的pKa为约5.5至约6.0。在某些实施方案中，化合物的质子化形式的pKa为约6.1至约6.3。
在某些实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含本文所述的任何化合物。
在某些实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含本文所述的任何化合物和脂质组分，例如包含约50重量％的本文所述的化合物和脂质组分，例如胺脂质，优选地式(IA)、(I)、(II)或(III)的化合物。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何组合物，其中所述组合物是LNP组合物。例如，本公开涉及一种LNP组合物，其包含本文所述的任何化合物和脂质组分。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述脂质组分包含辅助脂质和PEG脂质。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述脂质组分包含辅助脂质、PEG脂质和中性脂质。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其还包含冷冻保护剂。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其还包含缓冲液。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其还包含核酸组分。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其还包含RNA或DNA组分。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中LNP组合物的N/P比为约3-10，例如N/P比为约6±1，或者N/P比为约6±0.5。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述LNP组合物的N/P比为约6。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述RNA组分包含mRNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述RNA组分包含RNA导向的DNA结合剂，例如Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA或Cas9核酸酶mRNA。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述mRNA为修饰的mRNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述RNA组分包含gRNA核酸。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述gRNA核酸为gRNA。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的LNP组合物，其中所述RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述gRNA核酸为或编码双向导RNA(dgRNA)。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述gRNA核酸为或编码单向导RNA(sgRNA)。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述gRNA为修饰的gRNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述修饰的gRNA在5’端的前五个核苷酸中的一个或多个处包含修饰。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中所述修饰的gRNA在3’端的最后五个核苷酸中的一个或多个处包含修饰。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其还包含至少一种模板核酸。
在某些实施方案中，本公开涉及一种基因编辑的方法，其包括使细胞与LNP接触。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其包括裂解DNA。
在某些实施方案中，本公开涉及一种裂解DNA的方法，其包括使细胞与LNP组合物接触。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其中所述裂解步骤包括引入单链DNA切口。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其中所述裂解步骤包括引入双链DNA断裂。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其中所述LNP组合物包含2类Cas mRNA和向导RNA核酸。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其还包括将至少一种模板核酸引入到所述细胞中。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的裂解DNA的任何方法，其包括使所述细胞与包含模板核酸的LNP组合物接触。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述方法包括将所述LNP组合物施用到动物，例如人。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述方法包括将所述LNP组合物施用到细胞，诸如真核细胞。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述方法包括施用配制在第一LNP组合物和第二LNP组合物中的mRNA，所述第二LNP组合物包含mRNA、gRNA、gRNA核酸和模板核酸中的一种或多种。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物同时施用。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物依序施用。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述方法包括施用配制在单一LNP组合物中的mRNA和向导RNA核酸。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述基因编辑产生基因敲除。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的基因编辑的任何方法，其中所述基因编辑产生基因校正。
附图说明
图1A-图1C示出了TTR基因座处的体内编辑以及测定中测试的化合物。图1A示出了所测试的化合物的化学结构。图1B示出了递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图1C示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图2是示出使用包含式(IA)化合物或对照化合物的LNP递送后，小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比的图。还示出了剂量反应数据。
图3A-图3B示出了使用包含式(IA)化合物的LNP递送后的结果。图3A是示出递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比的图。图3B是示出递送后血清TTR(μg/mL)的图。
图4A-图4C示出了TTR基因座处的体内编辑以及测定中测试的化合物。图4A示出了测试化合物的化学结构。图4B示出了递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图4C示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图5A-图5C示出了式(IA)的化合物以及使用所述化合物的递送结果。图5A示出了测试化合物的化学结构。图5B示出了递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图5C示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图6A-图6C示出了式(IA)的化合物以及使用所述化合物的递送结果。图6A示出了测试化合物的化学结构。图6B示出了递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图6C示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图7A-图7C示出了式(IA)的化合物以及使用所述化合物的递送结果。图7A示出了测试化合物的化学结构。图7B示出了递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图7C示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图8A-图8C示出了式(IA)的化合物以及使用所述化合物的递送结果。图8A示出了测试化合物的化学结构，其中n＝1、2或3。图8B示出了递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图8C示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图9A-图9C示出了式(IA)的化合物以及使用所述化合物的递送结果。图9A示出了测试化合物的化学结构。图9B示出了递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图9C示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图10A-图10C示出了式(IA)的化合物以及使用所述化合物的递送结果。图10A示出了测试化合物的化学结构。图10B示出了递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图10C示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图11A-图11D示出了式(IA)的化合物以及使用所述化合物的递送结果。图11A和图11B示出了测试化合物的化学结构。图11C示出了递送后小鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图11D示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图12A-图12B示出了式(IA)的化合物以及使用所述化合物的递送结果。图12A示出了递送后大鼠肝细胞中TTR的编辑百分比。图12B示出了递送后血清TTR水平(μg/mL)。
图13A-图13B示出了式(IA)的化合物以及使用所述化合物的递送结果。图13A示出了测试化合物的化学结构。图13B示出了递送后HUH7细胞中TTR的编辑百分比。
具体实施方式
本公开提供了可用于将生物活性剂递送到细胞的脂质，特别是可电离的脂质，以及用于制备和使用此类组合物的方法，所述生物活性剂包括核酸，诸如CRISPR/Cas组分RNA(“货物”)。提供所述脂质及其药学上可接受的盐，任选地作为包含所述脂质的组合物，包括LNP组合物。在某些实施方案中，LNP组合物可包含生物活性剂，例如RNA组分，以及脂质组分，所述脂质组分包括如本文所定义的式(IA)、(I)、(II)或(III)的化合物。在一些实施方案中，RNA组分包含核酸。在一些实施方案中，脂质用于将生物活性剂，例如核酸诸如mRNA递送到细胞诸如肝细胞。在某些实施方案中，RNA组分包括gRNA和任选地编码2类Cas核酸酶的mRNA，以及任选地gRNA或编码gRNA的核酸。还提供使用这些组合物的基因编辑方法和制备工程化细胞的方法。
脂质纳米颗粒组合物
本文公开了用于递送生物活性剂(诸如核酸，例如mRNA和gRNA，包括CRISPR/Cas货物)的各种LNP组合物。此类LNP组合物包括“可电离的胺脂质”以及中性脂质、PEG脂质和辅助脂质。“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指但不限于包含通过分子间力彼此物理缔合的多种(即，多于一种)LNP组分的颗粒。
脂质
本公开提供了可用于LNP组合物的脂质。
在某些实施方案中，本公开涉及一种具有式(IA)的结构的化合物：
Figure BDA0003132577440000461
其中，在每次出现时独立地，
X1为C1-3亚烷基或
Figure BDA0003132577440000462
X2选自O、NH、NMe和键，
X3为C2-4亚烷基，
X4为C1亚烷基或键，
X5为C1亚烷基或键，
R1为C1-3烷基，
R2为C1-3烷基，或者
R2与氮原子和R1或X3的碳原子一起形成4元、5元或6元环，
每个Y1独立地选自键、-CH＝CH-、-(C＝O)O-和-O(C＝O)-，
每个Y2独立地选自-CH2-CH＝CH-和C3-C4亚烷基，
R3选自H、C5-7环烷基、C8-C10烯基和C3-18烷基，
每个R4独立地为C4-8烷基，
或其盐，
其条件是当R2为Me，R3为直链C12烷基，X1为C2亚烷基，X2为O，X3为C3亚烷基，X4为键，X5为C1亚烷基，Y1为顺式-CH＝CH-，并且-Y2–R4为顺式-CH2-CH＝CH-(C5-烷基)时，则R1为C2-3烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其条件是当R2为Me时，R1为C2-3烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中R2不是Me。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中R1不是Me。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中R3不是直链C12烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中X1不是C2亚烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中X2不是O。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中X3不是C3亚烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中X4不是键。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中X5不是C1亚烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中Y1不是顺式-CH＝CH-。
在某些实施方案中，所述化合物是式(IA)的化合物，其中-Y2–R4不是顺式-CH2-CH＝CH-(C5-烷基)。
在某些实施方案中，本公开涉及一种式(I)的化合物：
Figure BDA0003132577440000481
其中，在每次出现时独立地，
X1为C2-3亚烷基，
X2选自O、NH、NMe和键，
X3为C2-4亚烷基，
X4为C1亚烷基或键，
X5为C1亚烷基或键，
R1为C1-2烷基，
R2为C1-2烷基，或者
R2与氮原子和R1或X3的碳原子一起形成5元或6元环，
Y1选自-CH＝CH-、-(C＝O)O-和-O(C＝O)-，
R3选自H、C5-7环烷基和C3-18烷基，
R4为C4-7烷基，
或其盐，
其条件是当R2为Me，R3为直链C12烷基，X1为C2亚烷基，X2为O，X3为C3亚烷基，X4为键，X5为C1亚烷基，Y1为顺式-CH＝CH-，并且R4为C5烷基时，则R1为C2烷基，或其盐，诸如其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其条件是当R2为Me，R3为直链C12烷基，X1为C2亚烷基，X2为O，X3为C3亚烷基，X4为键，X5为C1亚烷基，并且Y1为顺式-CH＝CH-时，则R1为C2烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其条件是当R2为Me时，R1为C2烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其中R2不是Me。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其中R1不是Me。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其中R3不是直链C12烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其中X1不是C2亚烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其中X2不是O。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其中X3不是C3亚烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其中X4不是键。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其中X5不是C1亚烷基。
在某些实施方案中，所述化合物是式(I)的化合物，其中Y1不是顺式-CH＝CH-。
在一些实施方案中，所述化合物是对映体富集的或非对映体富集的，例如，所述化合物是对映体富集的。
在某些实施方案中，X1为直链C2亚烷基。在其他实施方案中，X1为C1亚烷基。在一些实施方案中，X1为直链C3亚烷基或支链C3亚烷基。
在一些其他实施方案中，X2为NH或O。在某些优选实施方案中，X2为O且X3为C3-4亚烷基。在一些实施方案中，X3为C2-3亚烷基。在某些实施方案中，X2为NMe或键。
在某些实施方案中，R2与X3的碳原子一起形成4元环。在某些实施方案中，R2与X3的碳原子一起形成5元环。在一些实施方案中，R2与X3的碳原子一起形成6元环。可替代地，R2可以为C2烷基。在一些情况下，R2为C1烷基。在一些实施方案中，R2例如被羟基取代，R2的实例包括羟基取代的C2烷基。
在某些实施方案中，R1为C1烷基。可替代地，R1可以为C2烷基。在一些实施方案中，R1例如被羟基取代，R1的实例包括羟基取代的C2烷基。在一些实施方案中，R1是未取代的。在一些实施方案中，R2是未取代的。在优选的实施方案中，R1和R2均是未取代的。在其他实施方案中，R1与R2一起形成4元环。在其他实施方案中，R1与R2一起形成5元环。在其他实施方案中，R1与R2一起形成6元环。
在一些实施方案中，R3为线性C8-16烷基，例如线性C7-12烷基，诸如线性C7-9烷基。可替代地，R3可以为直链C3-6烷基。在一些实施方案中，R3为支链C6-10烷基。在其他实施方案中，R3为C5-7环烷基，例如C6环烷基。在一些实施方案中，R3为H。在一些实施方案中，R3为C8-10烯基。
在某些实施方案中，R4为直链C5-6烷基。
在一些实施方案中，X4为键。
在某些实施方案中，X5为C1亚烷基。
在一些实施方案中，Y2–R4为–CH2-CH＝CH-R4。
在其他实施方案中，Y2为直链C3亚烷基。
在一些实施方案中，Y1选自键、-CH＝CH-和-O(C＝O)-，例如-CH＝CH-和-O(C＝O)-。
在某些实施方案中，所述化合物是式II的化合物：
Figure BDA0003132577440000521
其中变量如式(IA)所定义。
在某些实施方案中，X1为直链C2亚烷基。在其他实施方案中，X1为C1亚烷基。在一些实施方案中，X1为直链C3亚烷基或支链C3亚烷基。
在一些实施方案中，R3为线性C8-16烷基，例如线性C7-12烷基，诸如线性C7-9烷基。可替代地，R3可以为直链C3-6烷基。在一些实施方案中，R3为支链C6-10烷基。在其他实施方案中，R3为C5-7环烷基，例如C6环烷基。在一些实施方案中，R3为H。在一些实施方案中，R3为C8-10烯基。
在某些实施方案中，R4为直链C5-6烷基。
在一些实施方案中，X4为键。
在某些实施方案中，X5为C1亚烷基。
在一些实施方案中，Y2–R4为–CH2-CH＝CH-R4。
在其他实施方案中，Y2为直链C3亚烷基。
在一些实施方案中，Y1选自键、-CH＝CH-和-O(C＝O)-，例如-CH＝CH-和-O(C＝O)-。
在某些实施方案中，所述化合物选自：
Figure BDA0003132577440000531
Figure BDA0003132577440000541
Figure BDA0003132577440000542
或其盐。
在某些实施方案中，所述化合物是式III的化合物；
Figure BDA0003132577440000543
Figure BDA0003132577440000544
其中变量如式(IA)所定义。
在某些实施方案中，X1为直链C2亚烷基。在其他实施方案中，X1为C1亚烷基。在一些实施方案中，X1为直链C3亚烷基或支链C3亚烷基。
在一些其他实施方案中，X2为NH或O。在某些优选实施方案中，X2为O且X3为C3-4亚烷基。在一些实施方案中，X3为C2-3亚烷基。在某些实施方案中，X2为NMe或键。
在某些实施方案中，R2与X3的碳原子一起形成4元环。在某些实施方案中，R2与X3的碳原子一起形成5元环。在一些实施方案中，R2与X3的碳原子一起形成6元环。可替代地，R2可以为C2烷基。在一些情况下，R2为C1烷基。在一些实施方案中，R2例如被羟基取代，R2的实例包括羟基取代的C2烷基。
在某些实施方案中，R1为C1烷基。可替代地，R1可以为C2烷基。在一些实施方案中，R1例如被羟基取代，R1的实例包括羟基取代的C2烷基。在一些实施方案中，R1是未取代的。在一些实施方案中，R2是未取代的。在优选的实施方案中，R1和R2均是未取代的。在其他实施方案中，R1与R2一起形成4元环。在其他实施方案中，R1与R2一起形成5元环。在其他实施方案中，R1与R2一起形成6元环。
在一些实施方案中，R3为直链C8-16烷基，例如直链C7-12烷基，诸如直链C7-9烷基。可替代地，R3可以为直链C3-6烷基。在一些实施方案中，R3为支链C6-10烷基。在其他实施方案中，R3为C5-7环烷基，例如C6环烷基。在一些实施方案中，R3为H。在一些实施方案中，R3为C8-10烯基。
在一些实施方案中，X4为键。
在某些实施方案中，X5为C1亚烷基。
式(IA)或(I)的代表性化合物包括：
Figure BDA0003132577440000561
Figure BDA0003132577440000571
Figure BDA0003132577440000581
Figure BDA0003132577440000591
Figure BDA0003132577440000601
Figure BDA0003132577440000611
Figure BDA0003132577440000621
Figure BDA0003132577440000631
Figure BDA0003132577440000641
Figure BDA0003132577440000651
Figure BDA0003132577440000661
Figure BDA0003132577440000671
Figure BDA0003132577440000681
Figure BDA0003132577440000691
Figure BDA0003132577440000701
Figure BDA0003132577440000711
Figure BDA0003132577440000721
Figure BDA0003132577440000731
Figure BDA0003132577440000741
Figure BDA0003132577440000751
Figure BDA0003132577440000761
Figure BDA0003132577440000771
Figure BDA0003132577440000781
Figure BDA0003132577440000791
Figure BDA0003132577440000801
Figure BDA0003132577440000811
Figure BDA0003132577440000821
Figure BDA0003132577440000831
或其盐，诸如其药学上可接受的盐。
式(IA)或(I)的代表性化合物包括：
Figure BDA0003132577440000832
Figure BDA0003132577440000841
Figure BDA0003132577440000851
Figure BDA0003132577440000861
Figure BDA0003132577440000871
Figure BDA0003132577440000881
Figure BDA0003132577440000891
Figure BDA0003132577440000901
Figure BDA0003132577440000911
Figure BDA0003132577440000921
Figure BDA0003132577440000931
Figure BDA0003132577440000941
Figure BDA0003132577440000951
在一些实施方案中，所述化合物选自：
Figure BDA0003132577440000952
Figure BDA0003132577440000961
Figure BDA0003132577440000971
Figure BDA0003132577440000972
或其盐。
在其他实施方案中，所述化合物选自：
Figure BDA0003132577440000981
Figure BDA0003132577440000991
Figure BDA0003132577440000992
或其盐。
而在其他实施方案中，所述化合物选自：
Figure BDA0003132577440001001
Figure BDA0003132577440001011
Figure BDA0003132577440001012
或其盐。
在某些实施方案中，如本文所公开配制的脂质组合物中至少75％的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物在施用后8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从受试者的血浆中清除。在某些实施方案中，至少50％的包含如本文所公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的脂质组合物在施用后8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从受试者的血浆中清除，这可例如通过测量脂质(例如式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物)、RNA(例如mRNA)或血浆中的其他组分来确定。在某些实施方案中，测量脂质组合物的包封脂质和游离脂质、RNA或核酸组分。
脂质清除可如文献中所述测量。参见Maier,M.A.等人，Biodegradable LipidsEnabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAiTherapeutics.Mol.Ther.2013,21(8),1570-78(“Maier”)。例如，在Maier中，通过经由侧尾静脉进行的静脉内团注，以0.3mg/kg对六至八周龄雄性C57Bl/6小鼠施用含有靶向荧光素酶的siRNA的LNP-siRNA系统。在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96和168小时收集血液、肝脏和脾脏样品。在组织收集之前用盐水灌注小鼠，并处理血液样品以获得血浆。处理所有样品并通过LC-MS分析。此外，Maier描述用于评估施用LNP-siRNA组合物后的毒性的工序。例如，以5mL/kg的剂量体积，经由单次静脉内团注，以0、1、3、5和10mg/kg(5只动物/组)对雄性Sprague-Dawley大鼠施用靶向荧光素酶的siRNA。24小时后，从清醒动物的颈静脉获得约1mL血液，并分离血清。在给药后72小时，将所有动物安乐死进行尸检。进行临床体征、体重、血清化学、器官重量和组织病理学的评估。尽管Maier描述了用于评估siRNA-LNP组合物的方法，但这些方法可用于评估施用诸如LNP组合物的本公开的脂质组合物的清除、药代动力学和毒性。
在某些实施方案中，使用本文公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的脂质组合物相对于替代性可电离的胺脂质表现出增加的清除率。在一些此类实施方案中，清除率是脂质清除率，例如式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物从血液、血清或血浆中清除的速率。在一些实施方案中，清除率是货物(例如生物活性剂)清除率，例如货物组分从血液、血清或血浆中清除的速率。在一些实施方案中，清除率是RNA清除率，例如mRNA或gRNA从血液、血清或血浆中清除的速率。在一些实施方案中，清除率是LNP从血液、血清或血浆中清除的速率。在一些实施方案中，清除率是LNP从组织诸如肝组织或脾组织中清除的速率。理想地，高清除率可导致没有实质性副作用的安全性特征，和/或在循环和/或组织中的LNP累积减少。
本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物可根据其所处介质的pH而形成盐。例如，在弱酸性介质中，式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物可质子化，并且因此带有正电荷。相反，在弱碱性介质中，例如像pH为大约7.35的血液中，式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物可未质子化，并且因此不带电荷。在一些实施方案中，本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物可主要在至少约9的pH下质子化。在一些实施方案中，本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物可主要在至少约10的pH下质子化。
式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物主要质子化时的pH与其固有pKa有关。在优选的实施方案中，本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的盐的pKa在约5.1至约8.0，甚至更优选地约5.5至约7.5，例如约6.1至约6.3范围内。在其他优选的实施方案中，本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的盐的pKa在约5.3至约8.0，例如约5.6至约7.2、约5.7至约6.5范围内。在其他实施方案中，本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的盐的pKa在约5.7至约6.4，例如约5.8至约6.2范围内。在其他优选的实施方案中，本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的盐的pKa在约5.7至约6.5，例如约5.8至约6.4范围内。可替代地，本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的盐的pKa在约5.8至约6.5范围内。在一些实施方案中，式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的质子化形式的pKa为约5.5至约6.0。本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的盐可具有在约6.0至约8.0，优选地约6.0至约7.5范围内的pKa。式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的盐的pKa可以是配制LNP中的重要考虑因素，因为已经发现用pKa在约5.5至约7.0范围内的某些脂质配制的LNP对于体内递送货物例如到肝脏是有效的。此外，已经发现用pKa在约5.3至约6.4范围内的某些脂质配制的LNP对于体内递送例如到肿瘤是有效的。参见例如WO 2014/136086。
在某些实施方案中，本公开涉及一种对映体富集的式(IA)、(I)、(II)或(III)的化合物。化合物的对映体富集水平可以表示为对映体过量(ee)。化合物的ee可以通过将对映体的分数之差除以对映体的分数之和来测量。例如，如果发现化合物包含98％(S)-对映体和2％(R)对映体，则所述化合物的ee为(98-2)/(98+2)，或者96％。在某些实施方案中，式(IA)、(I)、(II)或(III)的化合物具有约30％ee或更大、40％ee或更大、50％ee或更大、60％ee或更大、70％ee或更大、约80％ee、约85％ee、约88％ee、约90％ee、约91％ee、约92％ee、约93％ee、约94％ee、约95％ee、约96％ee、约97％ee、约98％ee、约99％ee或高于约99％ee，即使此％ee大于起始材料的％ee，诸如0％ee(外消旋)。在某些实施方案中，式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物是对映体富集的。在某些实施方案中，式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物是对映体纯的。在化合物具有一个以上立体中心的实施方案中，该立体中心可以基本上独立于分子的任何其他立体中心的立体化学分布/富集而富集。例如，本文所述的化合物在特定立体中心可具有30％de或更大、40％de或更大、50％de或更大、60％de或更大、70％de或更大、80％de或更大、90％de或更大、95％de或更大，或者甚至98％de或更大。
额外脂质
适用于本公开的脂质组合物中的“中性脂质”包括例如多种中性脂质、不带电脂质或两性离子型脂质。适用于本公开的中性磷脂的实例包括但不限于二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺及其组合。在某些实施方案中，中性磷脂可选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)，优选地二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。
“辅助脂质”包括类固醇、固醇和烷基间苯二酚。适用于本公开的辅助脂质包括但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在某些实施方案中，辅助脂质可以是胆固醇或其衍生物，诸如胆固醇半琥珀酸酯。
PEG脂质可影响纳米颗粒可在体内(例如，在血液中)存在的时间长度。PEG脂质可通过例如降低颗粒聚集和控制粒度而有助于配制过程。本文所用的PEG脂质可调节LNP的药代动力学性质。通常，PEG脂质包含脂质部分和基于PEG(有时称为聚(环氧乙烷))(PEG部分)的聚合物部分。适用于具有本公开的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的脂质组合物的PEG脂质以及关于此类脂质的生物化学的信息可见于Romberg等人,Pharmaceutical Research25(1),2008,第55-71页以及Hoekstra等人,Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52。额外合适的PEG脂质公开于例如WO 2015/095340(第31页第14行至第37页第6行)、WO2006/007712和WO 2011/076807(“隐形脂质”)中。
在一些实施方案中，脂质部分可衍生自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，包括包含二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团的那些，所述二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团具有独立地包含约C4至约C40个饱和或不饱和碳原子的烷基链长，其中所述链可包含一个或多个官能团，例如像酰胺或酯。在一些实施方案中，烷基链长包含约C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团还可包含一个或多个取代的烷基。链长可以是对称的或不对称的。
除非另外指出，否则本文所用的术语“PEG”意指任何聚乙二醇或其他聚亚烷基醚聚合物，诸如任选取代的乙二醇或环氧乙烷的直链或支链聚合物。在某些实施方案中，PEG部分是未取代的。可替代地，PEG部分可被例如一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。例如，PEG部分可包含PEG共聚物，诸如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.MiltonHarris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedicalapplications(1992))；可替代地，PEG部分可以是PEG均聚物。在某些实施方案中，PEG部分的分子量为约130至约50,000，诸如约150至约30,000，或者甚至约150至约20,000。类似地，PEG部分可具有约150至约15,000、约150至约10,000、约150至约6,000、或者甚至约150至约5,000的分子量。在某些优选的实施方案中，PEG部分具有约150至约4,000、约150至约3,000、约300至约3,000、约1,000至约3,000、或约1,500至约2,500的分子量。
在某些优选的实施方案中，PEG部分是“PEG-2K”，也称为“PEG2000”，其平均分子量为约2,000道尔顿。PEG-2K在本文中由下式(II)表示，其中n为45，意味着数均聚合度包含约45个亚单位
Figure BDA0003132577440001061
然而，可以使用本领域已知的其他PEG实施方案，包括例如其中数均聚合度包含约23个亚单位(n＝23)和/或68个亚单位(n＝68)的那些。在一些实施方案中，n可在约30至约60的范围内。在一些实施方案中，n可在约35至约55的范围内。在一些实施方案中，n可在约40至约50的范围内。在一些实施方案中，n可在约42至约48的范围内。在一些实施方案中，n可以是45。在一些实施方案中，R可选自H、取代的烷基和未取代的烷基。在一些实施方案中，R可以是未取代的烷基，诸如甲基。
在本文所述的任一实施方案中，PEG脂质可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，得自NOF,Tokyo,Japan)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)(目录号DSPE-020CN，NOF,Tokyo,Japan)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)(目录号880150P，得自Avanti Polar Lipids,Alabaster,Alabama,USA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(目录号880120C，得自Avanti PolarLipids,Alabaster,Alabama,USA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，NOF Tokyo,Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在某些此类实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DMG。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DSG。在其他实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DSPE。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DMA。而在其他实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C-DMA。在某些实施方案中，PEG脂质可以是化合物S027，其公开于WO2016/010840(第[00240]段至第[00244]段)中。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DSA。在其他实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C11。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C14。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C16。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C18。
适用于本公开的脂质组合物的阳离子脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、N-(1-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油酰基氨基甲酰基-3-二甲基铵-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亚麻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲基铵丙烷(DLTAP)、二-十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)、DC-Choi、二油酰氧基-N-[2-(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙三氟乙酸铵(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯氧基)丙胺(DODMA)、2-[5'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯氧基苯甲胺(DMOBA)和1,2-N,N'-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)。在一个实施方案中，阳离子脂质为DOTAP或DLTAP。
适用于本公开的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)和赖氨酰磷脂酰甘油。
脂质组合物
本公开提供一种脂质组合物，其包含至少一种式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其盐(例如，其药学上可接受的盐)和至少一种其他脂质组分。此类组合物还可包含生物活性剂，任选地与一种或多种其他脂质组分组合。在一些实施方案中，脂质组合物包含脂质组分以及包含生物活性剂的水性组分。
在一个实施方案中，脂质组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种其他脂质组分。在另一个实施方案中，脂质组合物还包含生物活性剂，任选地与一种或多种其他脂质组分组合。在另一个实施方案中，脂质组合物呈脂质体的形式。在另一个实施方案中，脂质组合物呈脂质纳米颗粒(LNP)的形式。在另一个实施方案中，脂质组合物适用于递送到肝脏。
在一个实施方案中，脂质组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐以及另一种脂质组分。此类其他脂质组分包括但不限于中性脂质、辅助脂质、PEG脂质、阳离子脂质和阴离子脂质。在某些实施方案中，脂质组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐以及中性脂质例如DSPC，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在另一个实施方案中，脂质组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐以及辅助脂质例如胆固醇，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在其他实施方案中，脂质组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐以及PEG脂质，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在其他实施方案中，脂质组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐以及阳离子脂质，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在其他实施方案中，脂质组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐以及阴离子脂质，任选地具有一种或多种额外的脂质组分。在子实施方案中，脂质组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐、辅助脂质和PEG脂质，任选地具有中性脂质。在其他子实施方案中，脂质组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐、辅助脂质、PEG脂质和中性脂质。
含有式(IA)、(I)、(II)或(III)脂质或其药学上可接受的盐的组合物或其脂质组合物可呈各种形式，包括但不限于可用于递送各种分子到细胞的颗粒形成递送剂，所述颗粒形成递送剂包括微粒、纳米颗粒和转染剂。具体组合物在转染或递送生物活性剂方面是有效的。优选的生物活性剂为RNA和DNA。在其他实施方案中，生物活性剂选自mRNA、gRNA和DNA。gRNA可以是dgRNA或sgRNA。在某些实施方案中，货物包括编码RNA导向的DNA结合剂(例如Cas核酸酶、2类Cas核酸酶或Cas9)的mRNA、gRNA或编码gRNA的核酸，或mRNA和gRNA的组合。
用于上述脂质组合物的示例性式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物在实施例2-48、50-97、99-103和105-113中给出。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物2。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物3。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物4。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物5。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物6。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物7。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物8。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物9。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物10。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物11。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物12。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物13。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物14。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物15。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物16。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物17。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物18。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物19。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物20。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物21。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物22。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物23。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物24。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物25。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物26。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物27。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物28。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物29。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物30。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物31。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物32。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物33。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物34。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物35。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物36。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物37。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物38。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物39。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物40。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物41。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物42。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物43。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物44。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物45。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物46。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物47。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物48。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物50。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物51。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物52。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物53。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物54。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物55。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物56。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物57。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物58。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物59。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物60。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物61。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物62。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物63。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物64。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物65。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物66。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物67。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物68。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物69。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物70。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物71。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物72。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物73。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物74。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物75。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物76。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物77。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物78。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物79。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物80。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物81。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物82。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物83。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物84。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物85。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物86。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物87。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物88。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物89。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物90。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物91。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物92。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物93。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物94。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物95。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物96。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物97。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物99。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物100。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物101。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物102。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物103。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物105。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物106。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物107。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物108。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物109。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物110。
在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物111。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物112。在某些实施方案中，式(IA)化合物是化合物113。
在某些实施方案中，所述化合物不是化合物1。在某些实施方案中，所述化合物不是化合物49。在某些实施方案中，所述化合物不是化合物114。
LNP组合物
脂质组合物可作为LNP组合物提供。脂质纳米颗粒可以是例如微球(包括单层和多层囊泡，例如“脂质体”—在一些实施方案中基本上是球形的层状相脂质双层，并且在更具体的实施方案中可包含水性核，例如包含实质部分的RNA分子)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
LNP的大小为约1nm至约1,000nm、约10nm至约500nm、约20nm至约500nm，在子实施方案中为约50nm至约400nm，在子实施方案中为约50nm至约300nm，在子实施方案中为约50nm至约200nm，在子实施方案中为约50nm至约150nm，并且在另一个子实施方案中为约60nm至约120nm。优选地，LNP大小为约60nm至约100nm。完全形成的LNP的平均大小(直径)可通过在Malvern Zetasizer上的动态光散射来测量。将LNP样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，使得计数速率为大约200–400kcps。数据表示为强度度量的加权平均值。
本公开的实施方案提供根据组合物中的组分脂质的相应摩尔比描述的脂质组合物。所有的摩尔％数都作为脂质组合物或更具体地LNP组合物的脂质组分的分数给出。在某些实施方案中，式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的摩尔％可以是约30摩尔％至约70摩尔％。在某些实施方案中，式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的摩尔％可以是至少30摩尔％、至少40摩尔％、至少50摩尔％或至少60摩尔％。
在某些实施方案中，中性脂质的摩尔％可以是约0摩尔％至约30摩尔％。在某些实施方案中，中性脂质的摩尔％可以是约0摩尔％至约20摩尔％。在某些实施方案中，中性脂质的摩尔％可以是约10摩尔％。在某些实施方案中，中性脂质的摩尔％可以是约9摩尔％。
在某些实施方案中，辅助脂质的摩尔％可以是约0摩尔％至约80摩尔％。在某些实施方案中，辅助脂质的摩尔％可以是约20摩尔％至约60摩尔％。在某些实施方案中，辅助脂质的摩尔％可以是约30摩尔％至约50摩尔％。在某些实施方案中，辅助脂质的摩尔％可以是30摩尔％至约40摩尔％或约35摩尔％至约45摩尔％。在某些实施方案中，基于式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物、中性脂质和/或PEG脂质浓度来调节辅助脂质的摩尔％，以使脂质组分达到100摩尔％。
在某些实施方案中，PEG脂质的摩尔％可以是约1摩尔％至约10摩尔％。在某些实施方案中，PEG脂质的摩尔％可以是约1摩尔％至约4摩尔％。在某些实施方案中，PEG脂质的摩尔％可以是约1摩尔％至约2摩尔％。在某些实施方案中，PEG脂质的摩尔％可以是约1.5摩尔％。
在各种实施方案中，LNP组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其盐(诸如其药学上可接受的盐(例如，如本文所公开))、中性脂质(例如DSPC)、辅助脂质(例如胆固醇)和PEG脂质(例如PEG2k-DMG)。在一些实施方案中，LNP组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐(例如，如本文所公开)、DSPC、胆固醇和PEG脂质。在一些此类实施方案中，LNP组合物包含PEG脂质，所述PEG脂质包含DMG，诸如PEG2k-DMG。在某些优选的实施方案中，LNP组合物包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。
在某些实施方案中，脂质组合物(诸如LNP组合物)包含脂质组分和核酸组分，例如RNA组分，并且可测量式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物与核酸的摩尔比。本公开的实施方案还提供脂质组合物，所述脂质组合物具有式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物的药学上可接受的盐的带正电荷的胺基(N)与待包封的核酸的带负电荷的磷酸基团(P)之间的限定的摩尔比。这在数学上可表示为方程N/P。在一些实施方案中，脂质组合物诸如LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐；以及核酸组分，其中N/P比为约3至10。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学可接受的盐；以及RNA组分，其中N/P比为约3至10。例如，N/P比可以是约4-7。可替代地，N/P比可以是约6，例如6±1或6±0.5。
在一些实施方案中，水性组分包含生物活性剂。在一些实施方案中，水性组分包含多肽，任选地与核酸组合。在一些实施方案中，水性组分包含核酸，诸如RNA。在一些实施方案中，水性组分是核酸组分。在一些实施方案中，核酸组分包含DNA，并且其可被称为DNA组分。在一些实施方案中，核酸组分包含RNA，并且其可被称为RNA组分。在一些实施方案中，水性组分诸如RNA组分可包含mRNA，诸如编码RNA导向的DNA结合剂的mRNA。在一些实施方案中，RNA导向的DNA结合剂是Cas核酸酶。在某些实施方案中，水性组分可包含编码Cas9的mRNA。在某些实施方案中，水性组分可包含gRNA。在一些包含编码RNA导向的DNA结合剂的mRNA的组合物中，所述组合物还包含gRNA核酸，诸如gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含RNA导向的DNA结合剂以及gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含Cas核酸酶mRNA和gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。
在某些实施方案中，脂质组合物诸如LNP组合物可包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA、式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐、辅助脂质，任选地中性脂质和PEG脂质。在包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的某些组合物中，辅助脂质是胆固醇。在包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的其他组合物中，中性脂质是DSPC。在包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶例如Cas9)的mRNA的额外实施方案中，PEG脂质是PEG2k-DMG。在具体的组合物中，所述组合物包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA以及式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐。在某些组合物中，所述组合物还包含gRNA，诸如dgRNA或sgRNA。
在一些实施方案中，脂质组合物诸如LNP组合物可包含gRNA。在某些实施方案中，组合物可包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐、gRNA、辅助脂质、任选地中性脂质和PEG脂质。在某些包含gRNA的LNP组合物中，辅助脂质是胆固醇。在一些包含gRNA的组合物中，中性脂质是DSPC。在包含gRNA的额外实施方案中，PEG脂质是PEG2k-DMG。在某些组合物中，gRNA选自dgRNA和sgRNA。
在某些实施方案中，脂质组合物诸如LNP组合物包含水性组分中的编码RNA导向的DNA结合剂的mRNA和gRNA以及脂质组分中的式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物，所述gRNA可以是sgRNA。例如，LNP组合物可包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐、编码Cas核酸酶的mRNA、gRNA、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶的mRNA以及gRNA的组合物中，辅助脂质是胆固醇。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA以及gRNA的组合物中，中性脂质是DSPC。在包含编码Cas核酸酶的mRNA以及gRNA的额外实施方案中，PEG脂质是PEG2k-DMG。
在某些实施方案中，脂质组合物诸如LNP组合物包含RNA导向的DNA结合剂(诸如2类Cas mRNA)以及至少一种gRNA。在某些实施方案中，LNP组合物包含约1:1或约1:2的gRNA比RNA导向的DNA结合剂mRNA(诸如2类Cas核酸酶mRNA)的比率。在一些实施方案中，所述比率为约25:1至约1:25、约10:1至约1:10、约8:1至约1:8、约4:1至约1:4或约2:1至约1:2。
本文公开的脂质组合物诸如LNP组合物可包含模板核酸，例如DNA模板。模板核酸可与包含式(IA)、(I)、(II)或(III)化合物或其药学上可接受的盐的脂质组合物一起或单独递送，所述脂质组合物包含LNP组合物。在一些实施方案中，根据所需的修复机制，模板核酸可以是单链或双链的。模板可具有与靶DNA同源的区域，例如在靶DNA序列内，和/或与靶DNA相邻的序列。
在一些实施方案中，LNP通过将水性RNA溶液与基于有机溶剂的脂质溶液混合来形成。合适的溶液或溶剂包括或可含有：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、乙醇、氯仿、乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。例如，有机溶剂可以是100％乙醇。可使用例如用于体内施用LNP的药学上可接受的缓冲液。在某些实施方案中，使用缓冲液以将包含LNP的组合物的pH保持处于或高于pH 6.5。在某些实施方案中，使用缓冲液以将包含LNP的组合物的pH保持处于或高于pH 7.0。在某些实施方案中，所述组合物的pH在约7.2至约7.7范围内。在额外的实施方案中，所述组合物的pH在约7.3至约7.7范围内或约7.4至约7.6范围内。在其他实施方案中，所述组合物的pH为约7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。组合物的pH可用微pH探针测量。在某些实施方案中，冷冻保护剂包含在组合物中。冷冻保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。示例性组合物可包含至多10％冷冻保护剂，例如像蔗糖。在某些实施方案中，所述组合物可包含tris盐水蔗糖(TSS)。在某些实施方案中，LNP组合物可包含约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％冷冻保护剂。在某些实施方案中，LNP组合物可包含约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％蔗糖。在一些实施方案中，LNP组合物可包含缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液可包含磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及其混合物。在某些示例性实施方案中，缓冲液包含NaCl。在某些实施方案中，缓冲液缺乏NaCl。NaCl的示例性量可在约20mM至约45mM范围内。NaCl的示例性量可在约40mM至约50mM范围内。在一些实施方案中，NaCl的量为约45mM。在一些实施方案中，缓冲液是Tris缓冲液。Tris的示例性量可在约20mM至约60mM范围内。Tris的示例性量可在约40mM至约60mM范围内。在一些实施方案中，Tris的量为约50mM。在一些实施方案中，缓冲液包含NaCl和Tris。LNP组合物的某些示例性实施方案包含Tris缓冲液中的5％蔗糖和45mM NaCl。在其他示例性实施方案中，组合物包含以约5％w/v的量的蔗糖、约45mM NaCl和约50mM Tris pH 7.5。盐、缓冲液和冷冻保护剂的量可以变化，从而保持整个组合物的渗透压。例如，最终渗透压可保持在低于450mOsm/L。在其他实施方案中，渗透压在350mOsm/L与250mOsm/L之间。某些实施方案的最终渗透压为300+/-20mOsm/L或310+/-40mOsm/L。
在一些实施方案中，使用水性RNA溶液和脂质溶液在有机溶剂中的微流体混合、T混合或交叉混合。在某些方面，流速、接头大小、接头几何形状、接头形状、管径、溶液和/或RNA和脂质浓度可以变化。LNP或LNP组合物可例如经由透析、离心过滤、切向流过滤或色谱浓缩或纯化。LNP可例如以悬浮液、乳液或冻干粉末的形式储存。在一些实施方案中，LNP组合物在2-8℃下储存，在某些方面，LNP组合物在室温下储存。在额外的实施方案中，LNP组合物例如在-20℃或-80℃下被冷冻储存。在其他实施方案中，LNP组合物在约0℃至约-80℃范围内的温度下储存。冷冻的LNP组合物可在使用前例如在冰上、在室温下或在25℃下解冻。
LNP可以是例如微球(包括单层和多层囊泡，例如“脂质体”—在一些实施方案中基本上是球形的层状相脂质双层—并且，在更具体的实施方案中，可包含水性核，例如包含实质部分的RNA分子)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
优选的脂质组合物诸如LNP组合物是生物可降解的，因为它们在治疗有效剂量下不会在体内累积到细胞毒性水平。在一些实施方案中，所述组合物在治疗剂量水平下不引起导致实质性副作用的先天免疫反应。在一些实施方案中，本文提供的组合物在治疗剂量水平下不引起毒性。
在一些实施方案中，本文公开的LNP具有可在约0.005至约0.75范围内的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，LNP具有可在约0.01至约0.5范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP具有可在约零至约0.4范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP具有可在约零至约0.35范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP具有可在约零至约0.35范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP PDI可在约零至约0.3范围内。在一些实施方案中，LNP具有可在约零至约0.25范围内的PDI。在一些实施方案中，LNP PDI可在约零至约0.2范围内。在一些实施方案中，LNP具有可小于约0.08、0.1、0.15、0.2或0.4的PDI。
本文公开的LNP的大小(例如Z-平均直径)为约1nm至约250nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约10nm至约200nm。在其他实施方案中，LNP的大小为约20nm至约150nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50nm至约150nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50nm至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50nm至约120nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约60nm至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75nm至约150nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75nm至约120nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75nm至约100nm。除非另外指出，否则本文所提及的所有大小都是完全成形纳米颗粒的平均大小(直径)，如通过Malvern Zetasizer上的动态光散射所测量。将纳米颗粒样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，使得计数速率为大约200-400kcps。数据表示为强度度量的加权平均值(Z-平均直径)。
在一些实施方案中，LNP以约50％至约100％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以约50％至约95％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以约70％至约90％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以约90％至约100％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以约75％至约95％范围内的平均包封效率形成。
货物
经由LNP组合物递送的货物可以是生物活性剂。在某些实施方案中，所述货物是或包含一种或多种生物活性剂，诸如mRNA、向导RNA、核酸、表达载体、模板核酸、RNA导向的DNA结合剂、抗体(例如单克隆的、嵌合的、人源化的、纳米抗体及其片段等)、胆固醇、激素、肽、蛋白质、化疗剂和其他类型的抗肿瘤剂、低分子量药物、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、形成三螺旋的寡核苷酸、反义DNA或RNA组合物、嵌合DNA:RNA组合物、同种酶、适体、核酶、诱饵及其类似物、质粒和其他类型的载体，以及小核酸分子、RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和“自复制RNA”(编码复制酶活性并能够在体内引导其自身复制或扩增)分子、肽核酸(PNA)、锁核酸核糖核苷酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、sisiRNA(小的内部片段化干扰RNA)和iRNA(不对称干扰RNA)。生物活性剂的上述列表仅是示例性的，并且不旨在是限制性的。此类化合物可以是纯化的或部分纯化的，并且可以是天然存在的或合成的，并且可以是化学修饰的。
经由LNP组合物递送的货物可以是RNA，诸如编码目标蛋白的mRNA分子。例如，包括用于表达蛋白质诸如绿色荧光蛋白(GFP)、RNA导向的DNA结合剂或Cas核酸酶的mRNA。提供LNP组合物，其包含Cas核酸酶mRNA，例如允许在细胞中表达2类Cas核酸酶(诸如Cas9或Cpf1蛋白)的2类Cas核酸酶mRNA。此外，货物可包含一种或多种向导RNA或编码向导RNA的核酸。例如用于修复或重组的模板核酸也可包含在组合物中，或者模板核酸可用于本文所述的方法中。在子实施方案中，货物包含编码化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9的mRNA，任选地和化脓链球菌gRNA。在另一子实施方案中，货物包含编码脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)Cas9的mRNA，任选地和nme gRNA。
“mRNA”是指多核苷酸，并且包含可翻译成多肽(即，可用作由核糖体和氨基酰化tRNA翻译的底物)的开放阅读框。mRNA可包含包括核糖残基或其类似物例如2’-甲氧基核糖残基的磷酸酯-糖主链。在一些实施方案中，mRNA磷酸酯-糖主链的糖基本上由核糖残基、2’-甲氧基核糖残基或其组合组成。通常，mRNA不包含实质量的胸苷残基(例如，0个残基或少于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置处包含修饰的尿苷。
CRISPR/Cas货物
在某些实施方案中，所公开的组合物包含编码RNA导向的DNA结合剂诸如Cas核酸酶的mRNA。在具体实施方案中，所公开的组合物包含编码2类Cas核酸酶诸如化脓链球菌Cas9的mRNA。
如本文所用，“RNA导向的DNA结合剂”意指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此类复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性具有序列特异性并且取决于RNA的序列。示例性RNA导向的DNA结合剂包括Cas裂解酶/切口酶及其灭活形式(“dCas DNA结合剂”)。如本文所用，“Cas核酸酶”涵盖Cas裂解酶、Cas切口酶和dCas DNA结合剂。Cas裂解酶/切口酶和dCas DNA结合剂包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基；I型CRISPR系统的级联复合物，其Cas3亚基；以及2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”是具有RNA导向的DNA结合活性的单链多肽。2类Cas核酸酶包括2类Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A变体)，其还具有RNA导向的DNA裂解酶或切口酶活性；以及2类dCas DNA结合剂，其中裂解酶/切口酶活性被灭活。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如K848A,K1003A,R1060A变体)蛋白质及其修饰形式。Cpf1蛋白质(Zetsche等人,Cell,163:1-13(2015))与Cas9同源并且包含RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以引用的方式整体并入。参见例如Zetsche，表S1和表S3。参见例如Makarova等人,Nat RevMicrobiol,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人,Molecular Cell,60:385-397(2015)。
如本文所用，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指与RNA导向的DNA结合剂诸如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA结合剂(例如Cas9)一起的向导RNA。在一些实施方案中，向导RNA将RNA导向的DNA结合剂(诸如Cas9)导向到靶序列，并且向导RNA与靶序列杂交并且所述剂结合靶序列；在其中所述剂是裂解酶或切口酶的情况下，结合后可以是裂解或切口。
在本公开的一些实施方案中，用于LNP组合物的货物包含至少一种向导RNA，所述向导RNA包含将RNA导向的DNA结合剂引导至靶DNA的向导序列，所述RNA导向的DNA结合剂可以是核酸酶(例如Cas核酸酶，诸如Cas9)。gRNA可将Cas核酸酶或2类Cas核酸酶导向到靶核酸分子上的靶序列。在一些实施方案中，gRNA与2类Cas核酸酶结合并提供由2类Cas核酸酶裂解的特异性。在一些实施方案中，gRNA和Cas核酸酶可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas复合物，诸如CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可以是II型CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可以是V型CRISPR/Cas复合物，诸如Cpf1/向导RNA复合物。Cas核酸酶和同源gRNA可以配对。与每种2类Cas核酸酶配对的gRNA支架结构随具体CRISPR/Cas系统而变化。
“向导RNA”、“gRNA”和简单的“向导”在本文中可互换地用于指用于RNA导向的DNA结合剂的同源向导核酸。gRNA可以是crRNA(也称为CRISPR RNA)或crRNA与trRNA的组合(也称为tracrRNA)。向导RNA可包括如本文所述的修饰的RNA。crRNA和trRNA可作为单个RNA分子(单向导RNA，sgRNA)或在两个单独的RNA分子(双向导RNA，dgRNA)中缔合。“向导RNA”或“gRNA”是指每种类型。trRNA可以是天然存在的序列，或者是与天然存在的序列相比具有修饰或变异的trRNA序列。
如本文所用，“向导序列”是指向导RNA内的序列，其与靶序列互补并且发挥作用以将向导RNA引导至靶序列以便通过RNA导向的DNA结合剂结合或修饰(例如裂解)。“向导序列”也可被称为“靶向序列”或“间隔序列”。向导序列的长度可以是20个碱基对，例如，对于化脓链球菌(即Spy Cas9)和相关Cas9同源物/直向同源物而言。更短或更长的序列也可用作向导，例如长度为15个、16个、17个、18个、19个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列例如在基因中或在染色体上，并且与向导序列互补。在一些实施方案中，向导序列与其对应靶序列之间的互补性或同一性的程度可以是约或至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，向导序列和靶区域在至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域上可以是100％互补或相同的。在其他实施方案中，向导序列和靶区域可包含至少一个错配。例如，向导序列和靶序列可包含1、2、3或4个错配，其中靶序列的总长度为至少17、18、19、20或更多个碱基对。在一些实施方案中，向导序列和靶区域可包含1-4个错配，其中向导序列包含至少17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，当向导序列包含20个核苷酸时，向导序列和靶区域可包含1、2、3或4个错配。
RNA导向的DNA结合蛋白(诸如Cas蛋白)的靶序列包括基因组DNA的正链和负链(即，给定的序列和序列的反向互补序列)，因为Cas蛋白的核酸底物是双链核酸。因此，当向导序列被称为“与靶序列互补”时，应理解，向导序列可引导gRNA以与靶序列的反向互补序列结合。因此，在一些实施方案中，在向导序列结合靶序列的反向互补序列的情况下，除了向导序列中U取代T以外，向导序列与靶序列(例如，不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸相同。
靶向序列的长度可取决于CRISPR/Cas系统和使用的组分。例如，来自不同细菌物种的不同2类Cas核酸酶具有不同的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列的长度可为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或多于50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列长度比天然存在的CRISPR/Cas系统的向导序列长或短0、1、2、3、4或5个核苷酸。在某些实施方案中，Cas核酸酶和gRNA支架将衍生自相同的CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，靶向序列可包含18-24个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含19-21个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含20个核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，sgRNA是能够介导由Cas9蛋白进行的RNA导向的DNA裂解的“Cas9 sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA是能够介导由Cpf1蛋白进行的RNA导向的DNA裂解的“Cpf1 sgRNA”。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cas9蛋白形成活性复合物并介导RNA导向的DNA裂解的crRNA和tracr RNA。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cpf1蛋白形成活性复合物并介导RNA导向的DNA裂解的crRNA。参见Zetsche 2015。
本公开的某些实施方案还提供编码本文所述的gRNA的核酸，例如表达盒。“向导RNA核酸”在本文中用于指向导RNA(例如sgRNA或dgRNA)和向导RNA表达盒，其是编码一种或多种向导RNA的核酸。
修饰的RNA
在某些实施方案中，脂质组合物诸如LNP组合物包含修饰的核酸，包括修饰的RNA。
修饰的核苷或核苷酸可存在于RNA，例如gRNA或mRNA中。例如包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的gRNA或mRNA被称为“修饰的”RNA，以描述替代或附加至规范A、G、C和U残基使用的一个或多个非天然和/或天然存在的组分或构型的存在。在一些实施方案中，用非规范的核苷或核苷酸(本文中称为“修饰的”)合成修饰的RNA。
修饰的核苷和核苷酸可包含以下一种或多种：(i)改变，例如替换一个或两个非连接磷酸氧和/或主链磷酸二酯键中的一个或多个连接磷酸氧(示例性主链修饰)；(ii)改变，例如替换核糖的成分，例如核糖上的2’羟基(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头大规模替换磷酸部分(示例性主链修饰)；(iv)修饰或替换天然存在的核碱基，包括用非规范核碱基修饰或替换(示例性碱基修饰)；(v)替换或修饰核糖-磷酸主链(示例性主链修饰)；(vi)修饰寡核苷酸的3’端或5’端，例如去除、修饰或替换末端磷酸基团或缀合部分、帽或接头(如3’或5’帽修饰可包含糖和/或主链修饰)；以及(vii)修饰或替换糖(示例性糖修饰)。
某些实施方案包括对mRNA、gRNA或核酸的修饰。某些实施方案包括对mRNA、gRNA或核酸的5'端修饰。某些实施方案包括对mRNA、gRNA或核酸的3'端修饰。修饰的RNA可包含5'端修饰和3'端修饰。修饰的RNA可在非末端位包含一个或多个修饰的残基。在某些实施方案中，gRNA包括至少一个修饰的残基。在某些实施方案中，mRNA包括至少一个修饰的残基。
未修饰的核酸可倾向于由例如细胞内核酸酶或血清中见到的那些酶降解。例如，核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。因此，在一方面，本文所述的RNA(例如mRNA、gRNA)可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如以引入对细胞内的或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，当体内和离体引入到细胞群体中时，本文所述的修饰的gRNA分子可表现出减少的先天免疫反应。术语“先天免疫反应”包括对包括单链核酸的外源核酸的细胞反应，其涉及细胞因子表达和释放(特别是干扰素)以及细胞死亡的诱导。
因此，在一些实施方案中，公开的LNP组合物中的RNA或核酸包含至少一种修饰，其赋予核酸增加或增强的稳定性，包括例如改善的对体内核酸酶消化的抗性。如本文所用，术语“修饰”和“修饰的”作为涉及本文提供的核酸的此类术语，包括至少一种改变，其优选地增强稳定性并使RNA或核酸比野生型或天然存在型式的RNA或核酸更稳定(例如，对核酸酶消化有抗性)。如本文所用，术语“稳定的”和“稳定性”作为涉及本公开的核酸的此类术语并且特别是关于RNA，是指对由例如通常能够降解此类RNA的核酸酶(即，核酸内切酶或核酸外切酶)降解的抗性增加或增强。增加的稳定性可包括例如对靶细胞或组织内的内源酶(例如，核酸内切酶或核酸外切酶)或条件的水解或其他破坏的敏感性较低，从而增加或增强此类RNA或核酸在靶细胞、组织、受试者和/或细胞质中的驻留。本文提供的稳定的RNA或核酸分子相对于其天然存在的未修饰的对应物(例如mRNA的野生型型式)表现出更长的半衰期。术语“修饰”和“修饰的”作为涉及本文公开的LNP组合物的mRNA的此类术语还涵盖改善或增强mRNA核酸的翻译的改变，包括例如包含在蛋白质翻译起始中起作用的序列(例如Kozak共有序列)。(Kozak,M.,Nucleic Acids Res 15(20):8125-48(1987))。
在一些实施方案中，本文公开的LNP组合物的RNA或核酸已经历化学或生物修饰以使其更稳定。对RNA(诸如mRNA)的示例性修饰包括碱基的缺失(例如，通过缺失或通过一个核苷酸取代另一个核苷酸)或碱基的修饰，例如碱基的化学修饰。如本文所用，短语“化学修饰”包括引入与天然存在的RNA或核酸中所见的那些化学性质不同的化学性质的修饰，例如共价修饰，诸如引入修饰的核苷酸(例如核苷酸类似物，或包含在此类RNA或核酸分子中非天然存在的侧基)。
在主链修饰的一些实施方案中，修饰的残基的磷酸基团可通过用不同的取代基替换一个或多个氧而被修饰。此外，修饰的残基，例如存在于修饰的核酸中的修饰的残基，可以包括用本文所述的修饰的磷酸基团大规模替换未修饰的磷酸部分。在一些实施方案中，磷酸盐主链的主链修饰可以包括导致不带电荷的接头或具有不对称电荷分布的带电荷的接头的改变。
修饰的磷酸基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷基磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未修饰的磷酸基团中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子团中的一种替换非桥接氧中的一种可以使磷原子具有手性。立体磷原子可具有“R”构型(在本文中为Rp)或“S”构型(在本文中为Sp)。主链还可以通过用氮(桥接的氨基磷酸酯)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基膦酸酯)替换桥接氧(即，将磷酸盐连接至核苷的氧)来进行修饰。替换可发生在连接氧或两个连接氧上。在某些主链修饰中，磷酸基团可被不含磷的连接物替换。在一些实施方案中，带电荷的磷酸基团可被中性部分替换。可替换磷酸基团的部分的实例可包括但不限于例如，甲基膦酸酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼基、亚甲基二甲基肼基和亚甲基氧甲基亚氨基。
mRNA
在一些实施方案中，本文公开的组合物或制剂包含mRNA，所述mRNA包含编码RNA导向的DNA结合剂诸如本文所述的Cas核酸酶或2类Cas核酸酶的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，提供、使用或施用包含ORF的mRNA，所述ORF编码RNA导向的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶或2类Cas核酸酶。mRNA可包含5'帽、5'非翻译区(UTR)、3'UTR和多聚腺苷酸尾中的一种或多种。mRNA可包含修饰的开放阅读框，例如编码核定位序列或使用替代密码子以编码蛋白质。
公开的LNP组合物中的mRNA可编码例如分泌的激素、酶、受体、多肽、肽或其他正常分泌的目标蛋白。在一个实施方案中，mRNA可任选地具有化学或生物修饰，其例如改善此类mRNA的稳定性和/或半衰期或改善或以其他方式促进蛋白质产生。
此外，合适的修饰包括密码子的一个或多个核苷酸的改变，使得密码子编码相同的氨基酸，但比在mRNA的野生型型式中见到的密码子更稳定。例如，已经证明RNA的稳定性与较高数量的胞苷(C)和/或尿苷(U)残基之间的反比关系，并且已经发现缺乏C残基和U残基的RNA对大多数RNA酶是稳定的(Heidenreich等人,J Biol Chem269,2131-8(1994))。在一些实施方案中，mRNA序列中C残基和/或U残基的数量减少。在另一个实施方案中，通过用编码具体氨基酸的一个密码子取代编码相同或相关氨基酸的另一个密码子来减少C残基和/或U残基的数量。mRNA核酸的预期修饰还包括掺入假尿苷。将假尿苷掺入mRNA核酸中可增强稳定性和翻译能力，以及降低体内免疫原性。参见，例如Karikó,K.等人,MolecularTherapy 16(11):1833-1840(2008)。对mRNA的取代和修饰可通过本领域普通技术人员容易知道的方法进行。
与非翻译区相比，减少序列中C残基和U残基的数量的限制在mRNA的编码区内可能更大(即，可能不能消除信使中存在的所有C残基和U残基，同时仍然保留信使编码所需氨基酸序列的能力)。然而，遗传密码的简并性提供允许序列中存在的C残基和/或U残基的数量减少，同时保持相同编码能力的机会(即，根据由密码子编码的氨基酸，可能存在修饰RNA序列的几种不同可能性)。
术语修饰还包括例如将非核苷酸键或修饰的核苷酸掺入mRNA序列中(例如，对编码功能性分泌蛋白或酶的mRNA分子的3’端和5'端中的一者或两者的修饰)。此类修饰包括向mRNA序列添加碱基(例如，包括poly A尾或更长的poly A尾)，改变3'UTR或5'UTR，使mRNA与剂(例如，蛋白质或互补核酸分子)复合，以及包括改变mRNA分子的结构的元件(例如，其形成二级结构)。
认为poly A尾稳定天然信使。因此，在一个实施方案中，可将长poly A尾加入到mRNA分子中，因此使mRNA更稳定。可使用各种本领域公认的技术添加Poly A尾。例如，可使用poly A聚合酶将长poly A尾加入到合成的或体外转录的mRNA中(Yokoe等,NatureBiotechnology.1996；14:1252-1256)。转录载体也可编码长poly A尾。此外，可通过直接从PCR产物转录来添加poly A尾。在一个实施方案中，poly A尾的长度为至少约90、200、300、400、至少500个核苷酸。在一个实施方案中，调节poly A尾的长度以控制修饰的mRNA分子的稳定性，并且因此控制蛋白质的转录。例如，由于poly A尾的长度可影响mRNA分子的半衰期，因此可调节poly A尾的长度以改变mRNA对核酸酶的抗性水平，并且从而控制细胞中蛋白质表达的时程。在一个实施方案中，稳定的mRNA分子对体内降解(例如，通过核酸酶)具有足够的抗性，使得它们可在没有转移媒介物的情况下被递送到靶细胞。
在一个实施方案中，mRNA可通过掺入野生型mRNA中非天然存在的3'和/或5'非翻译(UTR)序列来修饰。在一个实施方案中，天然侧接mRNA并编码第二不相关蛋白的3'和/或5'侧接序列可掺入编码治疗性或功能性蛋白的mRNA分子的核苷酸序列中以对其进行修饰。例如，可将稳定的mRNA分子(例如球蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)的3'或5'序列掺入有义mRNA核酸分子的3'和/或5'区以增加有义mRNA分子的稳定性。参见，例如US2003/0083272。
mRNA修饰的更详细描述可见于US2017/0210698A1第57-68页中，其内容并入本文。
模板核酸
本文公开的组合物和方法可包含模板核酸。模板可用于在RNA导向的DNA结合蛋白诸如Cas核酸酶，例如2类Cas核酸酶的靶位点处或其附近改变或插入核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括将模板引入到细胞中。在一些实施方案中，可提供单一模板。在其他实施方案中，可提供两种或更多种模板以使得编辑可在两个或更多个靶位点处发生。例如，可提供不同模板以编辑细胞中的单一基因或细胞中的两种不同基因。
在一些实施方案中，模板可用于同源重组。在一些实施方案中，同源重组可导致模板序列或模板序列的一部分整合至靶核酸分子中。在其他实施方案中，模板可用于同源定向修复，所述同源定向修复涉及核酸中裂解位点处的DNA链侵袭。在一些实施方案中，同源定向修复可导致编辑的靶核酸分子中包括模板序列。而在其他实施方案中，模板可用于由非同源末端连接介导的基因编辑。在一些实施方案中，模板序列与裂解位点附近的核酸序列不具有类似性。在一些实施方案中，掺入模板或模板序列的一部分。在一些实施方案中，模板包括侧接反向末端重复(ITR)序列。
在一些实施方案中，模板序列可对应于、包含或由靶细胞的内源序列组成。其还可或替代地对应于、包含或由靶细胞的外源序列组成。如本文所用，术语“内源序列”是指原生于细胞的序列。术语“外源序列”是指非原生于细胞的序列，或在细胞的基因组中的原生位置处于不同位置的序列。在一些实施方案中，内源序列可以是细胞的基因组序列。在一些实施方案中，内源序列可以是染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，内源序列可以是细胞的质粒序列。
在一些实施方案中，模板包含ssDNA或dsDNA，其包含侧接反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，模板作为载体、质粒、微环、纳米环或PCR产物提供。
在一些实施方案中，对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀、醇沉淀或等效方法，例如如本文所述)对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用基于色谱的方法，诸如基于HPLC的方法或等效方法(例如，如本文所述)对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者对核酸进行纯化。在一些实施方案中，通过切向流过滤(TFF)对核酸进行纯化。
化合物或组合物通常但不一定包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。术语“赋形剂”包括除本公开的一种或多种化合物、一种或多种其他脂质组分和生物活性剂以外的任何成分。赋形剂可赋予组合物功能(例如药物释放速率控制)和/或非功能(例如加工助剂或稀释剂)特征。赋形剂的选择在很大程度上将取决于诸如具体施用方式、赋形剂对溶解度和稳定性的影响以及剂型的性质等因素。
肠胃外制剂通常是水性或油性溶液或悬浮液。当制剂为水性时，可使用诸如糖(包括但不限于葡萄糖、甘露醇、山梨醇等)、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地pH为3至9)的赋形剂，但对于一些应用，制剂可更适当地配制为无菌非水性溶液或待与合适的媒介物诸如无菌无热原水(WFI)结合使用的干燥形式。
虽然结合所说明的实施方案来描述本发明，但应理解并非旨在将本发明限于那些实施方案。相反，本发明旨在涵盖所有替代方案、修改和等效物，包括特定特征的等效物，它们可包括在如由所附权利要求所定义的本发明内。
前述一般描述和具体实施方式两者以及以下实施例仅为示例性和解释性的并且不限制教导内容。本文所用的章节标题仅出于组织目的，而不应解释为以任何方式限制所需主题。在以引用方式并入的任何文献与本说明书中定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。除非另外陈述，否则本申请中给出的所有范围均涵盖端点。
定义
应注意，除非上下文另外明确规定，否则如本申请中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述/该”包括复数参考。因此，例如，提及的“组合物”包括多种组合物并且提及的“细胞”包括多个细胞等。除非另外陈述，否则使用的“或”是包括性的并且意指“和/或”。
除非在上述说明书中明确指出，否则本说明书中陈述“包含”各种组分的实施方案还预期为“由”所述组分“组成”或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“由”各种组分“组成”还预期为“包含”所述组分或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“约”各种组分的实施方案还预期为“处于”所述组分；并且本说明书中陈述“基本上由”各种组分“组成”还预期为“由”所述组分“组成”或“包含”所述组分(这种互换性不适用于在权利要求中使用这些术语)。
数值范围包括限定范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，所测量和可测量的值应理解为近似值。如本申请中所用，术语“约”和“大约”具有它们的本领域理解的含义；使用一个/种对另一个/种不一定意味着不同的范围。除非另外指出，否则本申请中使用的带有或不带有修饰词(诸如“约”或“大约”)的数字应理解为涵盖正常的发散和/或波动，如相关领域的普通技术人员所理解。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指在所述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以其他方式从上下文显而易见(除了在此类数字将超过可能值的100％的情况下)。
如本文所用，术语“接触”意指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使哺乳动物细胞与纳米颗粒组合物接触意指使哺乳动物细胞和纳米颗粒共享物理连接。在体内和离体使细胞与外部实体接触的方法是生物领域中众所周知的。例如，使纳米颗粒组合物与置于哺乳动物体内的哺乳动物细胞接触可通过不同的施用途径(例如静脉内、肌肉内、皮内和皮下)来进行，并且可涉及不同量的纳米颗粒组合物。此外，一种以上哺乳动物细胞可被纳米颗粒组合物接触。
如本文所用，术语“递送”意指向目的地提供实体。例如，向受试者递送治疗剂和/或预防剂可涉及向受试者施用包括治疗剂和/或预防剂的纳米颗粒组合物(例如，通过静脉内、肌肉内、皮内或皮下途径)。将纳米颗粒组合物施用到哺乳动物或哺乳动物细胞可涉及使一种或多种细胞与纳米颗粒组合物接触。
如本文所用，“包封效率”是指相对于用于制备纳米颗粒组合物的治疗剂和/或预防剂的初始总量，成为纳米颗粒组合物的一部分的治疗剂和/或预防剂的量。例如，如果97mg的治疗剂和/或预防剂包封在最初提供给组合物的总共100mg的治疗剂和/或预防剂中的纳米颗粒组合物中，则包封效率可给出为97％。如本文所用，“包封”可指完全、基本或部分包封、限制、围绕或包围。
如本文所用，术语“可生物降解的”用以指当引入到细胞中时，通过细胞机制(例如酶降解)或通过水解被分解成细胞可再利用或处置而对细胞没有一种或多种明显毒性作用的组分的材料。在某些实施方案中，通过可生物降解材料的分解产生的组分在体内不诱导炎症和/或其他副作用。在一些实施方案中，可生物降解材料被酶促分解。可替代地或另外地，在一些实施方案中，可生物降解材料通过水解被分解。
如本文所用，“N/P比”是例如在包含脂质组分和RNA的纳米颗粒组合物中，脂质(例如式I化合物)中可电离的(在生理pH范围内)氮原子与RNA中的磷酸基团的摩尔比。
组合物还可包含一种或多种化合物的盐。盐可以是药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式(例如通过使游离碱基与合适的有机酸反应)来改变母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机盐或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱金属盐或有机盐等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖庚糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可由包含碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法来合成。通常，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水性介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表见于Remington'sPharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use；P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Wiley-VCH,2008；以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，所述参考各自以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，“多分散指数”是描述系统的粒度分布的均匀性的比率。例如小于0.3的小值表明窄的粒度分布。在一些实施方案中，多分散指数可小于0.1。
如本文所用，“转染”是指将物种(例如RNA)引入到细胞中。转染可发生在例如体外、离体或体内。
如本文所用，术语“烷基”是1至24个碳原子的支链或无支链饱和烃基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可以是环状或无环的。烷基可以是支链的或无支链的(即直链的)。烷基也可以是取代的或未取代的(优选地未取代的)。例如，烷基可被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、亚砜、磺酸酯、羧酸酯或硫醇，如本文所述。“低级烷基”是包含一至六个(例如一至四个)碳原子的烷基。
如本文所用，术语“烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的脂族基团，并且旨在包括“未取代的烯基”和“取代的烯基”两者，后者是指具有置换烯基的一个或多个碳上的氢的取代基的烯基部分。此类取代基可出现在包括或不包括在一个或多个双键中的一个或多个碳上。此外，此类取代基包括所有对于烷基预期的那些取代基，如下讨论，除非稳定性是禁止的。例如，预期可用一个或多个烷基、碳环基、芳基、杂环基或杂芳基取代烯基。示例性烯基包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
“亚烷基”是指二价烷基，其可以是支链的或无支链的(即直链的)。任何上述单价烷基可通过从烷基中夺取第二氢原子而转化成亚烷基。代表性亚烷基包括C2-4亚烷基和C2-3亚烷基。典型的亚烷基包括但不限于-CH(CH3)-、-C(CH3)2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2C(CH3)2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-等。亚烷基也可以是取代的或未取代的。例如，亚烷基可被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于烷基、芳基、杂芳基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、亚砜、磺酸酯、磺酰胺、脲、酰胺、氨基甲酸酯、酯、羧酸酯或硫醇，如本文所述。
术语“亚烯基”包括二价的、直链或支链的、不饱和的、无环烃基，其具有至少一个碳-碳双键，并且在一个实施方案中，不具有碳-碳三键。任何上述单价烯基可通过从烯基中夺取第二氢原子而转化成亚烯基。代表性亚烯基包括C2-6亚烯基。
术语“Cx-y”当与化学部分诸如烷基或亚烷基结合使用时意指包括在链中包含x至y个碳的基团。例如，术语“Cx-y烷基”是指取代的或未取代的饱和烃基，其包括在链中包含x至y个碳的直链和支链的烷基和亚烷基。
参考并入
本文提及或引用的文章、专利和专利申请的内容以及所有其他文件和电子可用信息在此以引用的方式整体并入，其程度如同每个单独的出版物具体地和单独地被指示为以引用的方式并入。申请人保留将来自任何此类文章、专利、专利申请或其他物理和电子文件的任何和所有材料和信息物理地并入本申请的权利。
实施例
通用信息
所有试剂和溶剂均购自商业供应商并按原样使用，或者根据引用的工序合成。所有中间体和最终化合物均使用硅胶上的快速柱色谱纯化。在Bruker或Varian 400MHz光谱仪上记录NMR光谱，并且在环境温度下在CDCl3中收集NMR数据。化学位移以相对于CDCl3(7.26)的百万分率(ppm)报道。1H NMR的数据如下报道：化学位移、多重性(br＝宽，s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，dd＝双二重峰，dt＝双三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，ddd＝双双二重峰，td＝三重双峰，tt＝三重三重峰，tdd＝三重双二重峰，dddd＝双双双二重峰)、偶联常数和积分。MS数据记录在具有电喷雾电离(ESI)源的Waters SQD2质谱仪上。最终化合物的纯度通过UPLC-MS-ELS使用装备有SQD2质谱仪的Waters Acquity H-类液相色谱仪测定，所述质谱仪具有光电二极管阵列(PDA)和蒸发光散射(ELS)检测器。
根据Jayaraman等人(Angewandte Chemie,2012)中的方法，使用以下改编测定每种胺脂质的pKa。测定乙醇中未配制的胺脂质的pKa。将脂质储备溶液(2.94mM)稀释到不同pH(pH范围：4.5-9.0)的磷酸钠缓冲液(0.1M，Boston Bioproducts)中，得到的最终脂质浓度为约100μM。测试样品补充有TNS{6-(对甲苯胺)-2-萘磺酸钠盐}，进行孵育并分别使用321nm和448nm的激发和发射波长测量荧光强度。对记录的数据进行归一化，并从S形拟合中得出相应的pKa值。
表1.化合物
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Figure BDA0003132577440001651
实施例1–比较化合物1
中间体1a：4-氧代十六酸
Figure BDA0003132577440001652
将琥珀酸酐(3.0g，1.0当量)在THF(0.1M)中的溶液冷却至-78℃，然后在5min内逐滴加入十二烷基溴化镁(1.0M在己烷中的溶液，0.5当量)。将反应保持在-78℃至少18h，然后通过加入水和1M HCl将其淬灭。将反应混合物在真空中浓缩，并将所得水层用DCM萃取3次。然后将合并的DCM层用2M NaOH萃取2次，并使用浓HCl将合并的水层酸化至pH＝1。然后将混合物用DCM萃取3次。合并的DCM层经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩以得到粗制材料。将粗制材料与己烷一起研磨3次，并将所得沉淀物过滤以得到呈白色固体的产物(1.31g，33％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.72(ddd,J＝7.0,5.8,1.1Hz,2H),2.67–2.60(m,2H),2.44(t,J＝7.5Hz,2H),1.59(q,J＝7.4Hz,2H),1.26(d,J＝2.7Hz,18H),0.91–0.85(m,3H)。
中间体1b：2-氧代丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001661
向二羟基丙酮(1.55g，1.0当量)在DCM(0.1M)中的溶液中加入亚油酸(2.05当量)、DMAP(0.2当量)、DIPEA(2.4当量)和EDCI(2.4当量)。将反应在室温下搅拌至少18h。完成后，通过加入水将混合物淬灭，并将有机层用1M HCl洗涤1次，且用5％NaHCO3洗涤1次。然后将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制材料通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化为呈无色油状物的产物(8.0g，75％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.28(m,8H),4.75(s,4H),2.82–2.74(m,4H),2.42(t,J＝7.5Hz,4H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),1.67(q,J＝7.4Hz,4H),1.40–1.24(m,28H),0.95–0.86(m,6H)。
中间体1c：2-羟基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰氧基]丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
Figure BDA0003132577440001662
将中间体1b(8.1g，1.0当量)在4:2:1THF/水/甲苯(0.05-0.1M)中的溶液冷却至0-5℃，然后加入NaBH4(1.7当量)。将反应在0-25℃下搅拌至少1h。完成后，通过加入水和EtOAc将混合物淬灭并将混合物用EtOAc萃取3次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制材料通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(5.9g，73％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46–5.26(m,8H),4.23–4.10(m,4H),2.81–2.73(m,4H),2.42(d,J＝4.8Hz,1H),2.38–2.31(m,4H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),1.68–1.57(m,4H),1.42–1.23(m,29H),0.93–0.85(m,6H)。
中间体1d：2-((4-氧代十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001671
向中间体1c(1.0当量)在DCM(0.2M)中的溶液中加入中间体1a(1.0-1.2当量)、Et3N或DIPEA(1.5-4.5当量)、DMAP(0.1-0.2当量)和EDCI(1-2当量)。将反应在室温下搅拌至少12h，然后通过加入水将其淬灭。将混合物用1M HCl洗涤1次，且用5％NaHCO3洗涤1次。然后将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制材料通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(780mg，79％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.28(m,8H),5.24(tt,J＝5.9,4.3Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.15(dd,J＝11.9,5.8Hz,2H),2.84–2.74(m,4H),2.71(t,J＝6.8Hz,2H),2.59(t,J＝6.3Hz,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),2.32(t,J＝7.6Hz,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.60(dd,J＝14.7,7.3Hz,6H),1.44–1.20(m,49H),0.88(td,J＝6.9,4.3Hz,9H)。
中间体1e：2-((4-氧代十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001681
将中间体1d(1.43g，1.0当量)在4:2:1THF/水/甲苯(0.05-0.1M)中的溶液冷却至0-5℃，然后加入NaBH4(5.0当量)。将反应在0-25℃下保持至少2h。然后将反应用水和EtOAc稀释，并将所得两相混合物用EtOAc萃取3次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制材料通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的中间体醇。
立即将所得醇溶解在DCM(0.1M)中，然后加入吡啶(2-3当量)和氯甲酸4-硝基苯酯(1-1.5当量)。将反应在室温下搅拌至少1h。通过加入水将混合物淬灭并用DCM萃取3次。将合并的DCM层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制材料通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(910mg，54％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37–8.25(m,2H),7.48–7.40(m,2H),5.49–5.25(m,9H),4.96–4.84(m,1H),4.34(dd,J＝12.0,4.3Hz,2H),4.18(dd,J＝11.9,5.7Hz,2H),2.79(t,J＝6.4Hz,4H),2.49(dd,J＝8.4,6.7Hz,2H),2.33(tt,J＝7.6,4.2Hz,4H),2.16–1.95(m,10H),1.81–1.71(m,1H),1.65(ddq,J＝15.2,7.5,4.8,4.2Hz,6H),1.50–1.13(m,50H),0.90(td,J＝6.8,3.7Hz,9H)。
化合物1：2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001691
向中间体1e(250mg，1.0当量)在MeCN(0.1M)中的溶液中加入吡啶(3.0当量)、3-(二甲基氨基)丙-1-醇(1.5-3.0当量)和DMAP(1.0当量)。将反应在室温下搅拌至少2小时。然后将庚烷(0.1M)加入到反应混合物中，并将庚烷层用MeCN洗涤3次。将合并的MeCN层用庚烷反萃取三次，并将合并的庚烷层最后用MeCN洗涤一次。然后在真空中去除庚烷，并将粗制材料通过柱色谱(MeOH/DCM)纯化，以得到呈无色油状物的产物(100mg，41％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46–5.22(m,9H),4.72(tdd,J＝7.5,5.3,4.0Hz,1H),4.29(dd,J＝12.0,4.4Hz,2H),4.23–4.10(m,4H),2.84–2.73(m,4H),2.62–2.27(m,13H),2.05(q,J＝6.9Hz,8H),2.01–1.84(m,4H),1.68–1.50(m,7H),1.43–1.21(m,50H),0.88(td,J＝6.9,4.1Hz,9H)。MS：1001.2m/z[M+H]。
实施例2–化合物2
化合物2：2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001692
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和3-(二乙基氨基)丙-1-醇合成化合物2，产率为64％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.20(m,9H),4.72(tdd,J＝7.5,5.3,4.0Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.23–4.10(m,4H),2.81–2.73(m,4H),2.57–2.36(m,8H),2.31(td,J＝7.6,1.3Hz,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.97–1.77(m,4H),1.61(t,J＝7.4Hz,6H),1.40–1.21(m,49H),1.01(t,J＝7.1Hz,6H),0.88(td,J＝6.9,4.1Hz,9H)。MS：1029.7m/z[M+H]。
实施例3–化合物3
化合物3：2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001701
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和3-((甲基)乙基氨基)丙-1-醇合成化合物3，产率为79％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.49–5.20(m,9H),4.77–4.67(m,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.16(tdd,J＝11.9,6.2,2.5Hz,4H),2.77(t,J＝6.4Hz,4H),2.70–2.37(m,7H),2.37–2.25(m,7H),2.13–1.82(m,12H),1.69–1.48(m,7H),1.42–1.20(m,46H),1.14(s,2H),0.88(td,J＝6.8,3.9Hz,7H)。MS：1015.7m/z[M+H]。
实施例4–化合物4
化合物4：2-((4-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001711
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和2-二甲基氨基乙-1-醇合成化合物4，产率为93％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.31(m,8H),5.25(tt,J＝5.8,4.3Hz,1H),4.73(tdd,J＝7.6,5.5,4.0Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,4H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,3.4Hz,2H),2.77(td,J＝6.0,1.1Hz,4H),2.70(d,J＝16.4Hz,1H),2.49–2.29(m,11H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.99–1.81(m,2H),1.67–1.50(m,8H),1.40–1.21(m,48H),0.88(td,J＝7.0,4.2Hz,9H)。MS：987.6m/z[M+H]。
实施例5–化合物5
化合物5：2-((4-(((3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001712
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇合成化合物5，产率为54％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.21(m,9H),4.72(tdd,J＝7.3,5.5,4.2Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.17(dddd,J＝15.3,9.1,7.3,3.7Hz,4H),2.77(td,J＝6.0,1.1Hz,4H),2.57(d,J＝8.8Hz,6H),2.40(dt,J＝8.7,6.5Hz,2H),2.31(td,J＝7.6,1.2Hz,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.98–1.83(m,5H),1.80(p,J＝3.2Hz,4H),1.68–1.50(m,7H),1.41–1.18(m,48H),0.96–0.81(m,9H)。MS：1027.6m/z[M+H]。
实施例6–化合物6
实施例6：2-((4-((((1-乙基哌啶-4-基)氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001721
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和1-乙基哌啶-4-醇合成化合物6，产率为53％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.21(m,9H),4.72(tdd,J＝7.6,5.3,4.0Hz,1H),4.64(d,J＝5.1Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,4.1Hz,2H),2.84–2.70(m,6H),2.51–2.36(m,4H),2.31(td,J＝7.6,1.4Hz,4H),2.24(d,J＝23.1Hz,2H),2.11–1.93(m,11H),1.92–1.73(m,4H),1.70–1.52(m,8H),1.43–1.21(m,48H),1.09(t,J＝7.2Hz,3H),0.88(td,J＝7.0,4.2Hz,9H)。MS：1028.2m/z[M+H]。
实施例7–化合物7
化合物7：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001731
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物7，产率为66％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.47–5.08(m,10H),4.76(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.4,1.4Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.9,3.3Hz,2H),3.24(q,J＝6.0Hz,2H),2.82–2.74(m,4H),2.53–2.26(m,10H),2.21(s,3H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.98–1.74(m,2H),1.68–1.41(m,8H),1.41–1.19(m,49H),1.04(t,J＝7.2Hz,3H),0.95–0.82(m,9H)。MS：1001.1m/z[M+H]。
实施例8–化合物8
化合物8：2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001732
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和N1,N1-二甲基丙烷-1,3-二胺合成化合物8，产率为55％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46(t,J＝5.8Hz,1H),5.43–5.28(m,8H),5.24(tt,J＝5.8,4.4Hz,1H),4.75(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.5,2.2Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,1.6Hz,2H),3.23(h,J＝6.4Hz,2H),2.82–2.73(m,4H),2.48–2.20(m,14H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.97–1.42(m,12H),1.42–1.20(m,48H),0.88(td,J＝6.9,4.1Hz,9H)。MS：1000.6m/z[M+H]。
实施例9–化合物9
化合物9：2-((4-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001741
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺合成化合物9，产率为65％。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.45–5.28(m,8H),5.25(ddd,J＝10.2,5.8,4.4Hz,1H),5.19–5.11(m,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.9,3.0Hz,2H),3.44–3.31(m,1H),3.19–3.02(m,2H),2.84–2.72(m,4H),2.46–2.16(m,12H),2.05(q,J＝6.9Hz,8H),1.97–1.66(m,6H),1.66–1.42(m,8H),1.42–1.20(m,49H),0.88(td,J＝7.0,4.2Hz,9H)。MS：1013.1m/z[M+H]。
实施例10–化合物10
化合物10：2-((4-((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001751
将中间体1d(360mg，1.0当量)在4:2:1THF/水/甲苯(0.05M)中的溶液冷却至0℃，然后加入NaBH4(5.0当量)。将反应在0℃下保持18h。然后将反应用水和EtOAc稀释，并将所得两相混合物用EtOAc萃取3次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制材料通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的中间体醇。
立即将所得的粗制醇溶解在DCM(0.1M)中，然后加入1,4-二甲基哌啶-4-羧酸(1.0当量)、DMAP(0.1当量)、DIPEA(4.0当量)和EDCI(1.5当量)。将反应在室温下搅拌。16h后，向反应中加入额外的1,4-二甲基哌啶-4-羧酸(1.0当量)、DMAP(0.05当量)、DIPEA(2.0当量)和EDCI(1.5当量)，并将反应加热至40℃。再过两小时后，通过加入水和DCM将反应淬灭，并将有机层用1M HCl洗涤1次，用5％NaHCO3洗涤1次，且用盐水洗涤1次。将所得的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制材料通过柱色谱(MeOH/DCM)纯化，以得到呈粉红色油状物的产物(94mg，22％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46–5.22(m,9H),4.92(ddd,J＝11.6,7.5,4.7Hz,1H),4.30(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(ddd,J＝12.0,5.8,1.9Hz,2H),2.82–2.74(m,4H),2.67(s,2H),2.41–2.25(m,9H),2.14(d,J＝14.2Hz,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.98–1.78(m,3H),1.66–1.49(m,9H),1.43–1.18(m,50H),0.88(td,J＝6.9,4.3Hz,9H)。
实施例11–化合物11
化合物11：2-((4-((4-(二乙基氨基)丁酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001761
使用实施例10所采用的方法，由中间体1d和3-(二乙基氨基)丁酸合成化合物11，产率为17％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46(t,J＝5.8Hz,1H),5.43–5.28(m,8H),5.24(tt,J＝5.8,4.4Hz,1H),4.75(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.5,2.2Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,1.6Hz,2H),3.23(h,J＝6.4Hz,2H),2.82–2.73(m,4H),2.48–2.20(m,14H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.97–1.42(m,12H),1.42–1.20(m,48H),0.88(td,J＝6.9,4.1Hz,9H)。MS：1013.9m/z[M+H]。
实施例12–化合物12
化合物12：2-((4-(((2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001762
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和N1,N1-二甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物12，产率为67％。1H NMR (400MHz,CDCl3)δ5.44–5.29(m,8H),5.29–5.18(m,2H),4.75(s,1H),4.34–4.24(m,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,3.6Hz,2H),3.25(q,J＝5.8Hz,2H),2.77(td,J＝6.2,1.2Hz,4H),2.47–2.35(m,4H),2.35–2.28(m,4H),2.24(s,6H),2.05(q,J＝7.1Hz,8H),1.98–1.73(m,4H),1.65–1.42(m,7H),1.40–1.20(m,48H),0.88(td,J＝7.0,4.3Hz,9H)。MS：987.2m/z[M+H]。
实施例13–化合物13
化合物13：2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001771
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和N1,N1-二乙基丙烷-1,3-二胺合成化合物13，产率为62％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.93(s,1H),5.44–5.28(m,8H),5.24(ddd,J＝5.8,4.5,1.3Hz,1H),4.74(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.5,2.7Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,1.2Hz,2H),3.24(tt,J＝13.2,6.6Hz,2H),2.81–2.71(m,4H),2.57(d,J＝7.7Hz,6H),2.38(ddd,J＝8.9,6.8,3.2Hz,2H),2.35–2.28(m,4H),2.05(q,J＝6.6Hz,8H),1.94–1.85(m,2H),1.79(dq,J＝14.8,8.1Hz,2H),1.73–1.56(m,7H),1.56–1.43(m,3H),1.40–1.20(m,47H),1.06(t,J＝7.1Hz,6H),0.88(td,J＝7.0,4.3Hz,9H)。MS：1029.2m/z[M+H]。
实施例14–化合物14
化合物14：2-((4-(((4-(二乙基氨基)丁氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001781
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和N1,N1-二甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物14，产率为60％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.30(m,9H),5.28(tt,J＝5.8,4.3Hz,1H),4.78–4.69(m,1H),4.31(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.22–4.09(m,4H),2.79(td,J＝6.1,1.1Hz,4H),2.63(q,J＝7.2Hz,4H),2.55(t,J＝7.6Hz,2H),2.47–2.38(m,2H),2.38–2.30(m,4H),2.07(q,J＝7.1Hz,8H),2.02–1.85(m,2H),1.76–1.51(m,11H),1.45–1.21(m,49H),1.08(t,J＝7.2Hz,6H),0.95–0.82(m,9H)。MS：1044.1m/z[M+H]。
实施例15–化合物15
化合物15：2-((4-(((2-(二乙基氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001782
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和N1,N1-二乙基乙烷-1,2-二胺合成化合物15，产率为75％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.29(m,9H),5.25(ddd,J＝5.8,4.4,1.4Hz,1H),4.75(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.4,1.2Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,3.0Hz,2H),3.23(q,J＝5.7Hz,2H),2.80–2.73(m,4H),2.57(q,J＝7.0Hz,6H),2.38(ddd,J＝9.0,6.6,4.7Hz,2H),2.34–2.28(m,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.90(h,J＝9.0,7.9Hz,1H),1.80(p,J＝7.3,6.5Hz,1H),1.66–1.44(m,7H),1.40–1.20(m,53H),1.03(t,J＝7.1Hz,6H),0.88(td,J＝6.9,4.3Hz,9H)。MS：1014.9m/z[M+H]。
实施例16–化合物16
化合物16：2-((4-(((2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001791
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙-1-醇合成化合物16，产率为78％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.28(m,9H),5.25(tt,J＝5.8,4.3Hz,1H),4.72(qd,J＝7.6,4.6Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.26–4.09(m,4H),3.14(t,J＝8.8Hz,1H),2.82–2.74(m,4H),2.45–2.28(m,9H),2.22(td,J＝11.5,10.9,6.0Hz,2H),2.15–1.91(m,12H),1.69–1.48(m,9H),1.42–1.20(m,50H),0.88(td,J＝6.9,4.1Hz,9H)。MS：1027.9m/z[M+H]。
实施例17–化合物17
中间体17a：十六烷基溴化镁
Figure BDA0003132577440001801
向Mg(15.92g，2当量)在THF(300mL)中的溶液中加入I2(0.01当量)，然后在80℃下将THF(100mL)中的1-溴十六烷(1.0当量)逐滴加入到上述溶液中。将混合物在80℃下搅拌6h。以定量产率获得呈棕色液体的产物，并立即用于下一步。
中间体17b：4-氧代二十酸
Figure BDA0003132577440001802
将琥珀酸酐(54g，1.0当量)在THF(1.2M)中的溶液冷却至-78℃，然后加入中间体17a。将反应在-78℃下保持12h，然后倒入饱和NH4Cl并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱进行纯化，得到呈白色固体的产物(4g，2％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.11(t,J＝6.7Hz,1H),2.80–2.62(m,4H),2.46(t,J＝7.5Hz,1H),1.63(dq,J＝14.7,7.1Hz,2H),1.49–1.20(m,27H),0.90(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体17c：2-((4-氧代二十酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001803
使用中间体1d所采用的方法，由中间体17b和中间体1c合成中间体17c，产率为53％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.21(m,9H),4.29(dt,J＝11.9,4.1Hz,2H),4.14(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),4.06(t,J＝6.8Hz,1H),2.73(dt,J＝22.5,6.5Hz,6H),2.67–2.54(m,4H),2.42(t,J＝7.5Hz,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.04(q,J＝6.9Hz,9H),1.61(q,J＝7.9,7.3Hz,8H),1.42–1.15(m,55H),0.88(td,J＝6.7,4.0Hz,9H)。
中间体17d：2-((4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)二十酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001811
使用中间体1e所采用的方法，由中间体17c合成中间体17d，产率为29％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.33–8.24(m,2H),7.43–7.34(m,2H),5.45–5.23(m,8H),4.92–4.82(m,1H),4.31(dd,J＝12.0,4.3Hz,2H),4.20–4.09(m,2H),2.76(t,J＝6.3Hz,4H),2.47(dd,J＝8.3,6.7Hz,2H),2.30(td,J＝7.6,4.2Hz,4H),2.04(q,J＝7.2Hz,9H),1.61(ddt,J＝11.5,7.4,3.7Hz,4H),1.43–1.22(m,49H),0.88(td,J＝6.9,3.8Hz,9H)。
化合物17：2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001821
使用实施例1所采用的方法，由中间体17d和3-(二甲基氨基)丙-1-醇合成化合物17，产率为74％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.22(m,10H),4.72(tdd,J＝7.5,5.4,4.0Hz,1H),4.36–4.25(m,2H),4.23–4.08(m,4H),2.82–2.71(m,4H),2.50–2.28(m,9H),2.25(s,6H),2.09–1.97(m,9H),1.91–1.80(m,3H),1.70–1.47(m,7H),1.40–1.20(m,57H),0.96–0.82(m,9H)。MS：1058.1m/z[M+H]。
实施例18–化合物18
化合物18：2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001822
使用实施例1所采用的方法，由中间体17d和3-((甲基)乙基氨基)丙-1-醇合成化合物18，产率为77％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.22(m,10H),4.72(qd,J＝7.7,4.7Hz,1H),4.29(dd,J＝12.0,4.4Hz,2H),4.20–4.10(m,4H),2.83–2.73(m,4H),2.51–2.36(m,6H),2.35–2.28(m,4H),2.24(s,3H),2.10–1.99(m,9H),1.91–1.82(m,3H),1.66–1.52(m,6H),1.42–1.19(m,60H),1.06(t,J＝7.1Hz,3H),0.88(td,J＝6.9,4.1Hz,9H)。MS：1072.3m/z[M+H]。
实施例19–化合物19
化合物19：2-((4-(((3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)二十酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001831
使用实施例1所采用的方法，由中间体17d和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇合成化合物19，产率为67％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.22(m,9H),4.72(tt,J＝7.5,4.5Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.24–4.10(m,4H),2.83–2.72(m,4H),2.57(d,J＝8.3Hz,6H),2.40(dt,J＝8.6,6.7Hz,2H),2.31(td,J＝7.6,1.2Hz,4H),2.04(dd,J＝8.5,5.3Hz,8H),2.00–1.86(m,4H),1.86–1.78(m,4H),1.53(ddt,J＝14.1,8.3,4.7Hz,7H),1.44–1.20(m,56H),0.88(td,J＝6.9,4.2Hz,9H)。MS：1084.2m/z[M+H]。
实施例20–化合物20
化合物20：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)二十酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001841
使用实施例1所采用的方法，由中间体17d和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇合成化合物20，产率为73％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.17(m,10H),4.75(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.4,1.3Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,3.4Hz,2H),3.25(d,J＝6.2Hz,2H),2.81–2.73(m,4H),2.50–2.36(m,6H),2.36–2.28(m,4H),2.22(s,3H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.94–1.71(m,4H),1.66–1.20(m,63H),1.05(t,J＝7.1Hz,3H),0.88(td,J＝6.9,4.2Hz,9H)。MS：1056.6m/z[M+H]。
实施例21–化合物21
化合物21：2-((4-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)二十酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001842
使用实施例1所采用的方法，由中间体17d和(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺合成化合物21，产率为85％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.30(m,8H),5.29–5.18(m,2H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.21–4.07(m,2H),3.46–3.30(m,1H),3.11(ddt,J＝22.3,8.9,4.3Hz,2H),2.80–2.72(m,4H),2.45–2.15(m,12H),2.04(dd,J＝8.5,5.3Hz,9H),1.96–1.77(m,4H),1.71(tq,J＝8.4,5.1,4.0Hz,2H),1.65–1.45(m,8H),1.39–1.20(m,60H),0.88(td,J＝6.9,4.4Hz,9H)。MS：1068.8m/z[M+H]。
实施例22–化合物22
中间体22a：(Z)-9-(壬-2-烯-1-基氧基)-9-氧代壬酸
Figure BDA0003132577440001851
在0℃下在一分钟内，向壬二酸(25g，1.3当量)在THF(100mL)中的溶液中逐滴加入草酰氯(1.0当量)。接下来，在一分钟内逐滴加入DMF(0.1当量)。将反应混合物在0℃下搅拌10min，然后在室温下搅拌10min。然后，将反应冷却至0℃，然后加入THF(100mL)中的顺式-2-壬烯-1-醇(1.0当量)。将反应在0℃下搅拌5min，然后在室温下搅拌16h。完成后，将反应在真空中浓缩，用DCM制浆，并过滤。浓缩滤液，并通过柱色谱(80g，MeOH/DCM)纯化以得到呈淡黄色油状物的产物(15g，47％)，所述产物直接用于后续步骤。
中间体22b：9,9'-二((Z)-壬-2-烯-1-基)O'1,O1-(2-氧代丙烷-1,3-二基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440001852
使用中间体1b所采用的方法，通过将二羟基丙酮和中间体22a合并来合成中间体22b，产率为73％。
中间体22c：O'1,O1-(2-羟基丙烷-1,3-二基)9,9'-二((Z)-壬-2-烯-1-基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440001861
使用中间体1c所采用的方法(除了反应在45min后完成以外)，由中间体22b合成中间体22c，产率为71％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.64(dtt,J＝11.0,7.3,1.3Hz,2H),5.52(dtt,J＝10.9,6.8,1.5Hz,2H),4.67–4.58(m,4H),4.23–4.05(m,5H),2.51(d,J＝4.6Hz,1H),2.32(dt,J＝18.1,7.6Hz,8H),2.15–2.00(m,4H),1.61(td,J＝10.0,2.7Hz,8H),1.42–1.20(m,28H),0.93–0.83(m,6H)。
中间体22d：9,9'-二((Z)-壬-2-烯-1-基)O'1,O1-(2-((4-氧代十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440001862
使用中间体1d所采用的方法，由中间体22c和中间体1a合成中间体22d，产率为38％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.66(dtt,J＝11.0,7.3,1.3Hz,2H),5.54(dtt,J＝11.0,6.9,1.5Hz,2H),5.26(tt,J＝5.9,4.3Hz,1H),4.64(dd,J＝6.9,1.3Hz,4H),4.31(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.17(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),2.74(t,J＝6.7Hz,2H),2.68–2.56(m,2H),2.45(t,J＝7.5Hz,2H),2.33(td,J＝7.6,6.0Hz,8H),2.19–2.07(m,4H),1.70–1.57(m,12H),1.43–1.23(m,46H),0.98–0.84(m,9H)。
中间体22e：O'1,O1-(2-((4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)9,9'-二((Z)-壬-2-烯-1-基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440001871
使用中间体1e所采用的方法，由中间体22d合成中间体22e，产率为51％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38–8.31(m,1H),8.31–8.24(m,2H),7.54–7.47(m,1H),7.44–7.36(m,2H),5.64(dtt,J＝11.0,7.3,1.3Hz,2H),5.51(dtt,J＝11.0,6.8,1.5Hz,2H),5.26(tt,J＝5.8,4.3Hz,1H),4.86(ddd,J＝11.8,7.5,4.8Hz,1H),4.65–4.57(m,4H),4.36–4.25(m,2H),4.21–4.10(m,2H),2.50–2.44(m,2H),2.30(td,J＝7.5,4.5Hz,8H),2.13–2.05(m,4H),1.62(d,J＝37.2Hz,9H),1.46–1.18(m,49H),0.94–0.80(m,9H)。
化合物22：O'1,O1-(2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)9,9'-二((Z)-壬-2-烯-1-基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440001872
使用实施例1所采用的方法，由中间体22e和3-(二甲基氨基)丙-1-醇合成化合物22，产率为54％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.71–5.58(m,2H),5.52(dtt,J＝10.9,6.8,1.5Hz,2H),5.25(tt,J＝5.7,4.4Hz,1H),4.72(ddd,J＝11.7,7.4,4.5Hz,1H),4.62(dd,J＝6.8,1.3Hz,4H),4.34–4.25(m,2H),4.25–4.08(m,4H),2.39(ddd,J＝12.9,8.4,6.4Hz,4H),2.34–2.21(m,13H),2.09(tdd,J＝7.4,5.7,1.5Hz,4H),2.02–1.67(m,7H),1.69–1.51(m,11H),1.42–1.19(m,45H),0.97–0.78(m,8H)。MS：1065.7m/z[M+H]。
实施例23–化合物23
化合物23：O'1,O1-(2-((4-(((2-(乙基(甲基(氨基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)9,9'-二((Z)-壬-2-烯-1-基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440001881
使用实施例1中采用的方法，由中间体22e和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物23，产率为59％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.72–5.59(m,2H),5.52(dtt,J＝11.0,6.8,1.5Hz,2H),5.36–5.18(m,2H),4.75(s,1H),4.62(dd,J＝6.9,1.2Hz,4H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,3.5Hz,2H),3.35–3.20(m,2H),2.56–2.43(m,4H),2.38(ddd,J＝8.7,6.6,4.1Hz,2H),2.34–2.19(m,11H),2.10(qd,J＝7.4,1.5Hz,4H),1.96–1.72(m,3H),1.63(d,J＝6.9Hz,11H),1.41–1.18(m,48H),1.07(t,J＝7.1Hz,3H),0.93–0.81(m,9H)。MS：1065.2m/z[M+H]。
实施例24–化合物24
化合物24：O'1,O1-(2-((4-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)9,9'-二((Z)-壬-2-烯-1-基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440001891
使用实施例1中采用的方法，由中间体22e和(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺合成化合物24。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.71–5.59(m,2H),5.52(dtt,J＝10.9,6.8,1.5Hz,2H),5.24(ddd,J＝8.8,5.8,4.4Hz,2H),4.76(s,1H),4.62(dd,J＝6.9,1.3Hz,4H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,3.2Hz,2H),3.39(q,J＝11.2,10.1Hz,1H),3.10(t,J＝14.0Hz,2H),2.50–2.20(m,15H),2.10(qd,J＝7.4,1.5Hz,4H),1.97–1.67(m,6H),1.61(d,J＝7.3Hz,12H),1.41–1.18(m,47H),0.97–0.79(m,9H)。MS：1076.7m/z[M+H]。
实施例25–化合物25
中间体25a：5-氧代十七酸
Figure BDA0003132577440001892
使用中间体1a中采用的方法，由戊二酸酐和十二烷基溴化镁溶液合成中间体25a，产率为64％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.75(t,J＝6.7Hz,1H),2.49(t,J＝7.2Hz,2H),2.44–2.35(m,4H),1.90(p,J＝7.2Hz,2H),1.56(t,J＝7.3Hz,2H),1.26(d,J＝4.0Hz,19H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体25b：2-((5-氧代十七酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001901
使用中间体1d所采用的方法，由中间体25a和中间体1c合成中间体25b，产率为55％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.19(m,9H),4.30(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.12(dd,J＝11.9,5.8Hz,2H),2.76(t,J＝6.4Hz,4H),2.46(t,J＝7.2Hz,2H),2.42–2.24(m,8H),2.04(q,J＝6.8Hz,8H),1.88(p,J＝7.2Hz,2H),1.57(dp,J＝21.3,7.2Hz,6H),1.43–1.18(m,41H),0.87(td,J＝6.8,4.1Hz,8H)。
中间体25c：2-((5-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十七酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001902
使用中间体1e所采用的方法，由中间体25b合成中间体25c，产率为23％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.31–8.24(m,2H),7.42–7.35(m,2H),5.44–5.19(m,9H),4.83(q,J＝5.7Hz,1H),4.31(ddd,J＝12.0,4.4,2.9Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,2.1Hz,2H),2.76(t,J＝6.3Hz,4H),2.34(dt,J＝30.7,7.0Hz,6H),2.04(q,J＝6.9Hz,8H),1.80–1.52(m,14H),1.29(dd,J＝19.3,12.3Hz,44H),0.88(td,J＝6.8,3.7Hz,9H)。
化合物25：2-((5-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十七酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001911
使用实施例1所采用的方法，由中间体25c和3-(二甲基氨基)丙-1-醇合成化合物25，产率为94％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46–5.19(m,9H),4.74–4.65(m,1H),4.29(ddd,J＝11.9,4.4,1.7Hz,2H),4.25–4.07(m,4H),2.82–2.72(m,4H),2.39–2.28(m,8H),2.22(s,6H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.84(dq,J＝8.2,6.7Hz,2H),1.73–1.50(m,14H),1.41–1.18(m,50H),0.88(td,J＝7.0,4.2Hz,9H)。MS：1016.11m/z[M+H]。
实施例26–化合物26
化合物26：2-((5-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十七酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001921
使用实施例1所采用的方法，由中间体25c和3-((甲基)乙基氨基)丙-1-醇合成化合物26，产率为84％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46–5.20(m,10H),4.69(dq,J＝7.5,5.5Hz,1H),4.29(ddd,J＝11.9,4.4,1.6Hz,2H),4.25–4.10(m,4H),2.83–2.72(m,4H),2.45–2.38(m,4H),2.37–2.28(m,6H),2.21(s,3H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.88–1.79(m,2H),1.74–1.52(m,13H),1.44–1.22(m,51H),1.04(t,J＝7.2Hz,3H),0.88(td,J＝6.9,4.1Hz,9H)。MS：1030.1m/z[M+H]。
实施例27–化合物27
化合物27：2-((5-(((3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十七酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001922
使用实施例1所采用的方法，由中间体25c和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇合成化合物27，产率为79％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.21(m,10H),4.69(dt,J＝7.1,5.3Hz,1H),4.29(ddd,J＝11.9,4.3,1.6Hz,2H),4.25–4.10(m,4H),2.81–2.73(m,4H),2.52(dd,J＝14.8,7.1Hz,6H),2.33(dt,J＝13.4,7.2Hz,6H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.89(dq,J＝10.8,6.8Hz,2H),1.82–1.74(m,J＝3.8,3.3Hz,4H),1.71–1.53(m,13H),1.40–1.21(m,49H),0.88(td,J＝6.9,4.2Hz,9H)。MS：1041.8m/z[M+H]。
实施例28–化合物28
化合物28：2-((5-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十七酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001931
使用实施例1所采用的方法，由中间体25c和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物28，产率为87％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.21(m,10H),5.12(s,1H),4.80–4.65(m,1H),4.29(dt,J＝11.9,4.5Hz,2H),4.19–4.09(m,2H),3.24(d,J＝4.8Hz,2H),2.83–2.72(m,4H),2.44(dt,J＝14.6,6.6Hz,4H),2.38–2.27(m,6H),2.20(s,3H),2.04(dd,J＝7.8,5.7Hz,8H),1.74–1.42(m,15H),1.42–1.19(m,50H),1.04(t,J＝7.1Hz,3H),0.88(td,J＝7.0,4.4Hz,9H)。MS：1014.1m/z[M+H]。
实施例29–化合物29
化合物29：2-((5-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)十七酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001941
使用实施例1所采用的方法，由中间体25c和(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺合成化合物29，产率为93％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.21(m,11H),5.08(d,J＝8.8Hz,1H),4.74(s,1H),4.29(dt,J＝11.9,4.6Hz,2H),4.13(ddd,J＝11.9,5.8,4.5Hz,2H),3.39(q,J＝11.3,10.6Hz,1H),3.08(d,J＝25.9Hz,2H),2.82–2.73(m,4H),2.39–2.18(m,12H),2.05(q,J＝6.8Hz,9H),1.91–1.82(m,1H),1.62(dddd,J＝27.4,20.2,13.2,6.7Hz,18H),1.42–1.20(m,52H),0.88(td,J＝6.9,4.4Hz,9H)。MS：1026.8m/z[M+H]。
实施例30–化合物30
中间体30a：3-羟基丙烷-1,2-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001942
向甘油(1.59g，1.0当量)在DCM(0.1M)中的溶液中按顺序加入亚油酸(2.05当量)、DMAP(0.2当量)、DIPEA(2.4当量)、EDCI(2.4当量)和1mL DMF。将反应在室温下搅拌65h。完成后，通过加入水将混合物淬灭，并将有机层用1M HCl洗涤1次，且用5％NaHCO3洗涤1次。然后将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制材料通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化为呈无色油状物的产物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.28(m,8H),5.13–5.04(m,1H),4.32(dd,J＝11.9,4.6Hz,1H),4.23(dd,J＝11.9,5.6Hz,1H),3.73(ddd,J＝6.5,5.0,1.3Hz,2H),2.82–2.73(m,4H),2.33(dt,J＝8.8,7.5Hz,4H),2.03(dq,J＝13.1,6.6Hz,9H),1.69–1.57(m,4H),1.44–1.23(m,29H),0.96–0.83(m,6H)。
中间体30b：3-((4-氧代十六酰基)氧基)丙烷-1,2-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001951
使用中间体1d中采用的方法，由中间体30a和中间体1a合成中间体30b，产率为66％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.26(m,9H),4.29(ddd,J＝11.8,4.3,2.1Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,7.7,6.0Hz,2H),2.82–2.74(m,4H),2.71(td,J＝6.3,5.6,2.4Hz,2H),2.62–2.55(m,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),2.31(td,J＝7.6,5.4Hz,4H),2.05(q,J＝6.9Hz,8H),1.66–1.54(m,8H),1.41–1.19(m,47H),0.88(td,J＝7.0,4.4Hz,9H)。
中间体30c：3-((4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,2-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001961
使用中间体1e中采用的方法，由中间体30b合成中间体30c，产率为40％。
化合物30：9-十二烷基-2-甲基-7,12-二氧代-6,8,13-三氧杂-2-氮杂十六烷-15,16-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001962
使用实施例1中采用的方法，由中间体30c和3-((甲基)乙基氨基)丙-1-醇合成化合物30，产率为84％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.44–5.20(m,8H),4.76–4.67(m,1H),4.29(ddd,J＝11.9,4.3,1.7Hz,2H),4.22–4.11(m,4H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),2.45–2.28(m,8H),2.22(s,6H),2.05(q,J＝6.9Hz,8H),2.00–1.79(m,4H),1.69–1.51(m,6H),1.40–1.17(m,48H),0.88(td,J＝6.9,4.8Hz,8H)。MS：1002.2m/z[M+H]。
实施例31–化合物31
中间体31a：4-氧代十二酸
Figure BDA0003132577440001971
使用中间体1a中采用的方法，由琥珀酸酐和辛基溴化镁溶液合成中间体31a，产率为9％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.71(t,J＝6.4Hz,2H),2.62(t,J＝6.7Hz,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),1.57(p,J＝7.1Hz,2H),1.26(d,J＝3.6Hz,10H),0.87(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体31b：2-((4-氧代十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001972
使用中间体1d中采用的方法，由中间体31a和中间体1c合成中间体31b，产率为38％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.47–5.19(m,8H),4.28(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.15(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),2.77(t,J＝6.4Hz,4H),2.71(t,J＝6.5Hz,2H),2.59(t,J＝6.5Hz,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),2.32(t,J＝7.6Hz,4H),2.04(q,J＝6.9Hz,8H),1.67–1.53(m,6H),1.40–1.20(m,37H),0.88(td,J＝6.8,5.0Hz,9H)。
中间体31c：2-((4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001981
使用中间体1e中采用的方法合成中间体31c，产率为68％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26–8.16(m,2H),7.40–7.30(m,2H),5.39–5.05(m,9H),4.80(tdd,J＝7.5,5.4,4.0Hz,1H),4.49–4.04(m,4H),2.77–2.63(m,4H),2.45–2.18(m,6H),2.08–1.85(m,10H),1.74–1.46(m,6H),1.41–1.11(m,40H),0.81(td,J＝6.9,2.4Hz,9H)。
化合物31：2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001982
使用实施例1中采用的方法，由中间体31c和3-(二甲基氨基)丙-1-醇合成化合物31，产率为71％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.22(m,9H),4.72(tdd,J＝7.4,5.3,4.0Hz,1H),4.34–4.26(m,2H),4.23–4.10(m,4H),2.82–2.72(m,4H),2.45–2.36(m,4H),2.31(ddd,J＝8.0,7.1,1.2Hz,4H),2.25(s,6H),2.05(q,J＝6.6Hz,8H),1.99–1.91(m,1H),1.91–1.82(m,3H),1.67–1.53(m,6H),1.40–1.21(m,41H),0.94–0.82(m,9H)。MS：945.6m/z[M+H]。
实施例32–化合物32
化合物32：2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440001991
使用实施例1中采用的方法，由中间体31c和3-(二乙基氨基)丙-1-醇合成化合物32，产率为71％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.28(m,9H),5.25(ddd,J＝5.8,4.4,1.5Hz,1H),4.72(tdd,J＝7.6,5.4,4.0Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.25–4.08(m,5H),2.77(td,J＝6.1,1.1Hz,4H),2.64–2.53(m,6H),2.40(dt,J＝8.7,6.8Hz,2H),2.31(ddd,J＝8.0,7.2,1.1Hz,4H),2.10–2.01(m,10H),1.95(dddd,J＝11.1,9.2,6.9,3.5Hz,1H),1.91–1.81(m,3H),1.69–1.49(m,7H),1.39–1.20(m,42H),1.05(t,J＝7.2Hz,6H),0.88(td,J＝7.0,4.9Hz,9H)。MS：974.0m/z[M+H]。
实施例33–化合物33
化合物33：2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002001
使用实施例1中采用的方法，由中间体31c和3-((甲基)乙基氨基)丙-1-醇合成化合物33，产率为79％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.21(m,10H),4.72(tdd,J＝9.5,6.7,4.1Hz,1H),4.38–4.25(m,2H),4.25–4.10(m,4H),2.77(td,J＝6.2,1.1Hz,4H),2.51–2.38(m,6H),2.37–2.27(m,5H),2.24(d,J＝2.4Hz,3H),2.05(q,J＝7.1Hz,8H),1.97–1.83(m,4H),1.70–1.50(m,7H),1.39–1.21(m,41H),1.06(t,J＝7.2Hz,3H),0.94–0.84(m,9H)。960.1m/z[M+H]。
实施例34–化合物34
化合物34：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002002
使用实施例1中采用的方法，由中间体31c和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物34，产率为59％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.13(m,10H),4.75(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.4,1.4Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,3.3Hz,2H),3.25(q,J＝5.7Hz,2H),2.83–2.73(m,4H),2.53–2.35(m,6H),2.35–2.27(m,4H),2.21(d,J＝3.3Hz,3H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.96–1.74(m,3H),1.66–1.43(m,7H),1.41–1.21(m,41H),1.05(t,J＝7.1Hz,3H),0.88(td,J＝6.9,5.6Hz,9H)。944.7m/z[M+H]。
实施例35–化合物35
化合物35：2-((4-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002011
使用实施例1中采用的方法，由中间体31c和(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺合成化合物35，产率为71％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.21(m,10H),4.86–4.66(m,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,3.1Hz,2H),3.48–3.35(m,1H),3.22–3.00(m,2H),2.83–2.71(m,4H),2.47–2.19(m,12H),2.04(q,J＝6.9Hz,8H),1.96–1.67(m,6H),1.67–1.42(m,8H),1.41–1.19(m,41H),0.95–0.84(m,9H)。956.5m/z[M+H]。
实施例36–化合物36
化合物36：2-((4-(((3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002021
使用实施例1中采用的方法，由中间体31c和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇合成化合物36，产率为34％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.22(m,9H),4.72(tdd,J＝7.4,5.4,4.0Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.25–4.08(m,4H),2.82–2.72(m,4H),2.67(t,J＝7.6Hz,5H),2.47–2.27(m,6H),2.09–1.91(m,11H),1.91–1.80(m,4H),1.68–1.47(m,7H),1.47–1.19(m,42H),0.88(td,J＝7.0,4.8Hz,9H)。971.3m/z[M+H]。
实施例37–化合物37
化合物37：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002022
使用实施例1中采用的方法，由中间体31c和N1-乙基-N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物37，产率为67％。1H NMR (400MHz,CDCl3)δ5.44–5.18(m,8H),4.78(s,1H),4.28(dt,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.14(dd,J＝11.9,5.8Hz,2H),3.44–3.24(m,2H),2.91(d,J＝8.1Hz,3H),2.81–2.71(m,4H),2.60–2.21(m,12H),2.05(q,J＝6.9Hz,7H),1.98–1.46(m,14H),1.43–1.19(m,37H),1.14–1.00(m,3H),0.88(td,J＝7.0,5.3Hz,8H)。958.6m/z[M+H]。
实施例38–化合物38
化合物38：2-((4-(((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002031
使用实施例1中采用的方法，由中间体31c和N1,N1,N2-三甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物38，产率为83％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.19(m,8H),4.78(s,1H),4.28(dt,J＝11.9,4.1Hz,2H),4.14(dd,J＝11.9,5.8Hz,2H),3.37(d,J＝23.8Hz,2H),2.91(d,J＝6.8Hz,3H),2.82–2.72(m,4H),2.54–2.21(m,13H),2.04(q,J＝6.7Hz,7H),1.95–1.44(m,14H),1.42–1.21(m,37H),0.88(td,J＝7.0,5.3Hz,8H)。944.5m/z[M+H]。
实施例39–化合物39
中间体39a：癸基溴化镁
Figure BDA0003132577440002032
在80℃下在2h内，向Mg(10.99g，2当量)和I2(0.0001当量)在THF(250mL)中的溶液中逐滴加入1-溴癸烷(1.0当量)。添加后，将混合物在此温度下搅拌2h。获得呈黑棕色溶液的粗制产物癸基溴化镁，其无需进一步纯化即可立即用于下一步。
中间体39b：4-氧代十四酸
Figure BDA0003132577440002041
将琥珀酸酐(45g，1.0当量)在THF(1.1M)中的溶液冷却至-78℃，然后加入中间体39a。将反应在-78℃下保持2h，然后在15℃下搅拌16h。然后通过加入饱和NH4Cl将反应淬灭，用H2O稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过柱色谱进行纯化，得到呈白色固体的产物(7.8g，7％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.74(dd,J＝6.9,5.2Hz,2H),2.70–2.63(m,2H),2.46(t,J＝7.5Hz,2H),1.67–1.54(m,2H),1.29(d,J＝5.2Hz,14H),0.90(t,J＝6.8Hz,3H)。
中间体39c：2-((4-氧代十四酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002042
使用中间体1d所采用的方法，由中间体39b和中间体1c合成中间体39c。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.18(m,9H),4.28(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.14(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),2.74(dt,J＝22.1,6.8Hz,6H),2.66–2.56(m,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.04(q,J＝6.8Hz,8H),1.59(tq,J＝14.2,7.5Hz,7H),1.41–1.18(m,44H),0.88(td,J＝6.9,4.6Hz,9H)。
中间体39d：2-((4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十四酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002051
在5℃下，向中间体39c在MeOH(0.13M)中的溶液中缓慢加入NaBH4(2.5当量)。将混合物在此温度下搅拌2h。通过加入H2O将反应混合物淬灭并且然后用EtOAc萃取2次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化以得到无色油状物，将所述无色油状物立即在DCM(1M)中重构，然后在0℃下加入氯甲酸4-硝基苯酯(1.5当量)和吡啶(2当量)。将混合物在20℃下搅拌12h，此后将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到中间体39d，产率为31％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.33–8.22(m,2H),7.46–7.33(m,2H),5.43–5.23(m,9H),4.31(dd,J＝12.0,4.3Hz,2H),4.15(dd,J＝12.0,5.8Hz,2H),2.76(t,J＝6.3Hz,4H),2.47(t,J＝7.5Hz,2H),2.30(td,J＝7.6,4.2Hz,4H),2.04(q,J＝7.3Hz,10H),1.67(dt,J＝47.7,6.1Hz,7H),1.30(tq,J＝14.3,4.9,3.0Hz,53H),0.88(td,J＝6.8,3.5Hz,10H)。
化合物39：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十四酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002061
使用实施例1所采用的方法，由中间体39d和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物39，产率为78％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.49–5.17(m,9H),4.75(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.9,3.3Hz,2H),3.26(q,J＝6.0Hz,2H),2.77(t,J＝6.4Hz,4H),2.52–2.27(m,10H),2.23(s,3H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.95–1.42(m,14H),1.42–1.18(m,40H),1.05(t,J＝7.1Hz,3H),0.88(td,J＝6.8,4.5Hz,7H)。972.9m/z[M+H]。
实施例40–化合物40
中间体40a：4-羟基癸酸
Figure BDA0003132577440002062
向5-己基四氢呋喃-2-酮(15g，1.0当量)在EtOH(240mL)和H2O(80mL)中的溶液中加入NaOH(2.0当量)。将反应在25℃下搅拌12h。浓缩混合物以去除EtOH。然后，通过1N HCl水溶液将pH调节至5，并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过硅胶色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈白色固体的产物(48％)。
中间体40b：4-氧代癸酸
Figure BDA0003132577440002071
向NaH2PO4(17当量)和Na2HPO4(2.4当量)在H2O(1000mL)中的溶液中加入中间体40a(10g，1.0当量)。然后将NaClO(200mL，6～8％Cl)加入到溶液中。将反应混合物在25℃下搅拌12h。然后向混合物中加入H3PO4(200mL，85％)和硅胶(300g)。将混合物在减压下干燥，并用EtOAc洗涤3次。将有机层在减压下浓缩以得到粗制产物。将粗制产物通过硅胶色谱(EtoAc/己烷)纯化，以得到呈白色固体的产物(80％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.70(dd,J＝7.0,5.3Hz,2H),2.63–2.58(m,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),1.58(q,J＝7.4Hz,2H),1.33–1.19(m,6H),0.90–0.83(m,3H)。
中间体40c：2-((4-氧代癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002072
使用实施例1所采用的方法，由中间体40b和中间体1c合成中间体40c，产率为40％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.28(m,8H),5.24(tt,J＝5.9,4.3Hz,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.14(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),2.73(dt,J＝22.4,6.7Hz,7H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.04(q,J＝6.9Hz,8H),1.59(q,J＝6.7Hz,7H),1.40–1.22(m,35H),0.88(td,J＝6.8,4.0Hz,9H)。
中间体40d：2-((4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002081
使用中间体1e所采用的方法，由中间体40c合成中间体40d，产率为31％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37–8.27(m,2H),7.43(dd,J＝9.1,5.9Hz,2H),5.45–5.24(m,9H),4.34(dd,J＝12.0,4.3Hz,2H),4.18(dd,J＝11.9,6.0Hz,2H),2.79(t,J＝6.3Hz,4H),2.49(t,J＝7.5Hz,2H),2.41–2.30(m,4H),2.07(q,J＝6.9Hz,9H),1.83–1.58(m,7H),1.48–1.12(m,37H),1.00–0.82(m,9H)。
化合物40：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002082
使用实施例1所采用的方法，由中间体40d和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物40，产率为53％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.19(m,9H),4.76(s,1H),4.32–4.22(m,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.9,3.4Hz,2H),3.26(s,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.57–2.36(m,6H),2.36–2.27(m,4H),2.23(s,3H),2.05(q,J＝6.6Hz,8H),1.98–1.42(m,15H),1.41–1.19(m,35H),1.06(t,J＝7.2Hz,3H),0.88(td,J＝9.7,8.2,4.2Hz,9H)。MS：916.7m/z[M+H]。
实施例41–化合物41
中间体41a：4-环己基-4-氧代丁酸
Figure BDA0003132577440002091
向琥珀酸酐(30g，1.0当量)在Et2O(300mL)中的溶液中加入CuI(0.1当量)。将混合物冷却至-20℃。然后，将环己基溴化镁(1.0当量)加入到混合物中。将反应温热至25℃并搅拌14h。通过加入1M HCl水溶液将反应淬灭，并搅拌15min。然后将反应过滤，并将滤液用DCM萃取3次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈淡粉红色固体的产物(13％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.09(s,1H),2.66(dt,J＝55.4,6.5Hz,4H),2.35(td,J＝10.8,9.3,5.2Hz,1H),1.75(ddd,J＝43.2,36.6,11.9Hz,5H),1.46–1.09(m,5H)。
中间体41b：2-((4-环己基-4-氧代丁酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002092
使用实施例1所采用的方法，由中间体41a和中间体1c合成中间体41b，产率为34％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.28(m,8H),5.24(ddd,J＝10.2,5.6,4.2Hz,1H),4.28(dt,J＝11.9,4.6Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,2.3Hz,2H),2.81–2.70(m,6H),2.64–2.54(m,3H),2.38–2.27(m,5H),2.04(q,J＝6.8Hz,8H),1.89–1.55(m,11H),1.40–1.20(m,34H),0.88(t,J＝6.8Hz,6H)。
中间体41c：2-((4-环己基-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丁酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002101
使用实施例1所采用的方法，由中间体41b合成中间体41c，产率为14％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.33–8.21(m,2H),7.45–7.34(m,2H),5.44–5.13(m,9H),4.70(ddd,J＝9.3,6.1,3.4Hz,1H),4.50(dd,J＝12.3,3.9Hz,1H),4.35–4.10(m,4H),2.76(t,J＝6.4Hz,4H),2.50–2.40(m,2H),2.38–2.22(m,4H),2.04(q,J＝6.9Hz,10H),1.85–1.52(m,10H),1.49–1.00(m,31H),0.88(t,J＝6.8Hz,6H)。
化合物41：2-((4-环己基-4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)丁酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002111
使用中间体1e所采用的方法，由中间体41d和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物41，产率为60％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.09(m,9H),4.60(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.5,1.6Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,2.9Hz,2H),3.25(s,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.54–2.15(m,12H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),1.99–0.95(m,50H),0.93–0.80(m,6H)。MS：914.5m/z[M+H]。
实施例42–化合物42
中间体42a：4-羟基辛酸
Figure BDA0003132577440002112
使用中间体39b所采用的方法，由5-丁基四氢呋喃-2-酮合成中间体42a，产率为53％。
中间体42b：4-氧代辛酸
Figure BDA0003132577440002113
使用中间体38b所采用的方法，由中间体42a合成中间体42b，产率为61％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.65(ddd,J＝7.0,5.8,1.1Hz,2H),2.56(ddd,J＝7.1,6.0,1.2Hz,2H),2.38(t,J＝7.5Hz,2H),1.56–1.44(m,2H),1.30–1.17(m,2H),0.84(t,J＝7.3Hz,3H)。
中间体42c：2-((4-氧代辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002121
使用实施例1所采用的方法，由中间体42b和中间体1c合成中间体42c，产率为29％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(tq,J＝18.2,9.4,7.6Hz,8H),5.24(t,J＝5.3Hz,1H),4.28(dd,J＝12.0,3.9Hz,2H),4.14(dd,J＝12.1,5.8Hz,2H),2.74(dt,J＝20.9,6.7Hz,6H),2.59(d,J＝6.6Hz,2H),2.43(t,J＝7.6Hz,2H),2.31(t,J＝7.7Hz,4H),2.04(q,J＝7.0Hz,8H),1.60(t,J＝7.5Hz,8H),1.31(d,J＝14.1Hz,29H),0.88(t,J＝6.9Hz,9H)。
中间体42d：2-((4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002122
使用中间体1e所采用的方法，由中间体40c合成中间体42d，产率为51％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28(dd,J＝7.8,4.7Hz,2H),7.47–7.36(m,2H),5.32(dp,J＝19.8,9.2Hz,8H),5.17(s,1H),4.87(d,J＝7.3Hz,1H),4.49(d,J＝12.2Hz,1H),4.36–4.09(m,4H),2.75(d,J＝6.7Hz,4H),2.49(dt,J＝23.8,7.9Hz,2H),2.42–2.14(m,5H),2.03(q,J＝7.2Hz,10H),1.73(s,1H),1.61(dd,J＝23.8,11.9Hz,6H),1.31(d,J＝14.4Hz,30H),0.89(tt,J＝9.5,7.0,2.7Hz,9H)。
化合物42：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002131
使用实施例1所采用的方法，由中间体42d和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物42，产率为93％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.10(m,11H),4.76(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.5,1.3Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.8,5.8,3.3Hz,2H),3.25(s,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.39(ddd,J＝8.7,6.6,4.3Hz,6H),2.35–2.28(m,4H),2.22(s,3H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),1.96–1.74(m,3H),1.61(s,11H),1.42–1.22(m,34H),1.10–0.99(m,3H),0.95–0.83(m,9H)。
实施例43–化合物43
中间体43a：4-羟基丁酸钠
Figure BDA0003132577440002132
向四氢呋喃-2-酮(10g，1.0当量)在H2O(100mL)中的混合物中加入NaOH(4.0当量)，并将混合物脱气且用N2吹扫3次。将混合物在25℃、N2气氛下搅拌24小时。然后将反应混合物在减压下浓缩，以得到为无色油状物的粗制残余物，其无需进一步纯化即可用于下一步(12g，粗制)。
中间体43b：4-羟基丁酸苄酯
Figure BDA0003132577440002141
向中间体43a(12g，1.0当量)在丙酮(100mL)中的混合物中加入TBAB(0.05当量)和苄基溴(1.2当量)，并将混合物脱气且用N2吹扫3次。将混合物在60℃、N2气氛下搅拌12小时。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将所得残余物用EtOAc稀释，且用1N NaHSO4、NaHCO3和H2O各洗涤1次。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，并将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(43％)。
中间体43c：4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丁酸苄酯
Figure BDA0003132577440002142
向中间体43b(5g，1.0当量)在DCM(150mL)中的混合物中加入氯甲酸4-硝基苯酯(1.0当量)，并将混合物脱气且用N2吹扫3次。将反应冷却至0℃，然后加入吡啶(2.0当量)。将反应在25℃、N2气氛下搅拌5h。然后将反应混合物在减压下浓缩，用己烷稀释，并过滤。将滤液用H2O洗涤10次，并将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。将粗制材料通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(32％)。
中间体43d：4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)丁酸苄酯
Figure BDA0003132577440002151
向中间体43c(3g，1.0当量)在MeCN(50mL)中的混合物中加入N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺(2.5当量)、吡啶(3.0当量)和DMAP(1.0当量)。将混合物脱气且用N2吹扫3次，并将混合物在70℃、N2下搅拌12h。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将粗制残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(56％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33–7.23(m,4H),5.24(d,J＝12.8Hz,1H),5.05(s,2H),4.04(dt,J＝12.9,6.7Hz,2H),3.19(q,J＝5.8Hz,2H),3.00(s,1H),2.39(dt,J＝10.4,6.6Hz,6H),2.13(s,3H),1.89(p,J＝6.9Hz,2H),0.98(t,J＝7.1Hz,3H)。
中间体43e：4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)丁酸
Figure BDA0003132577440002152
将中间体43d(1.5g，1.0当量)在MeOH(30mL)中的混合物加入到Pd/C(10％重量，0.05当量)中，并将混合物脱气且用H2吹扫3次。将反应混合物在25℃、H2气氛下搅拌1h，此后浓缩滤液，以得到粗制残余物，其无需进一步纯化即可用于下一步。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.11(t,J＝6.3Hz,2H),3.49(t,J＝6.0Hz,2H),3.29–3.21(m,5H),2.89(s,3H),2.38(t,J＝7.2Hz,2H),1.92(p,J＝6.7Hz,2H),1.34(t,J＝7.3Hz,3H)。
化合物43：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)丁酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002161
使用中间体1d所采用的方法，由中间体43d和中间体1c合成化合物43，产率为45％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.22(m,9H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.18–4.06(m,4H),3.25(q,J＝5.8Hz,2H),2.76(t,J＝6.4Hz,4H),2.43(dt,J＝10.5,7.3Hz,6H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.20(s,3H),2.04(q,J＝6.9Hz,8H),1.95(q,J＝6.9Hz,2H),1.59(d,J＝7.1Hz,7H),1.40–1.22(m,26H),1.04(t,J＝7.1Hz,3H),0.88(t,J＝6.8Hz,6H)。
实施例44–化合物44
化合物44：2-((4-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002162
使用中间体1e所采用的方法，由中间体40d和(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺合成化合物44，产率为35％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.20(m,9H),5.16(s,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,3.0Hz,2H),3.39(s,1H),3.10(d,J＝27.2Hz,2H),2.81–2.73(m,4H),2.43–2.18(m,11H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),1.96–1.42(m,17H),1.30(dqt,J＝12.8,8.8,5.4Hz,36H),0.92–0.83(m,9H)。MS：928.9m/z[M+H]。
实施例45–化合物45
化合物45：2-((4-(((3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002171
使用实施例1所采用的方法，由中间体40d和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇合成化合物45，产率为52％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.21(m,9H),4.72(ddd,J＝11.3,8.8,5.7Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.25–4.10(m,4H),2.81–2.74(m,4H),2.59(s,5H),2.40(dt,J＝8.6,6.4Hz,2H),2.36–2.27(m,4H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),1.98–1.78(m,9H),1.67–1.51(m,7H),1.41–1.21(m,36H),0.88(td,J＝7.0,5.0Hz,9H)。MS：943.8m/z[M+H]。
实施例46–化合物46
化合物46：2-((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002181
使用实施例1所采用的方法，由中间体1e和2-(吡咯烷-1-基)乙-1-胺合成化合物46，产率为53％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.55(s,1H),5.46–5.21(m,9H),4.75(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,3.6Hz,2H),3.35(d,J＝6.0Hz,2H),2.81–2.60(m,9H),2.39(ddd,J＝8.6,6.7,3.8Hz,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.84(s,7H),1.66–1.19(m,55H),0.88(td,J＝7.0,4.3Hz,9H)。MS：1012.5m/z[M+H]。
实施例47–化合物47
化合物47：2-((4-((((1-甲基哌啶-4-基)氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002182
向中间体1e(250mg，1.0当量)在MeCN(0.1M)中的溶液中加入吡啶(3.0当量)、1-甲基哌啶-4-醇(1.5当量)和DMAP(1.0当量)。将反应在室温下搅拌18h。加入另一部分的1-甲基哌啶-4-醇(3.0当量)，并将混合物加热至50℃。2h后，加入另一部分的DMAP(1.0当量)，并将反应再保持2h。完成后，然后将庚烷(0.1M)加入到反应混合物中，并将庚烷层用MeCN洗涤3次。将合并的MeCN层用庚烷反萃取三次，并将合并的庚烷层最后用MeCN洗涤一次。然后在真空中去除庚烷，并将粗制材料通过柱色谱(MeOH/DCM)纯化，以得到呈无色油状物的产物(62mg，32％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.20(m,9H),4.77–4.60(m,2H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,3.6Hz,2H),2.83–2.66(m,6H),2.46–2.26(m,11H),2.08–1.71(m,18H),1.71–1.47(m,8H),1.40–1.21(m,47H),0.88(td,J＝7.0,4.2Hz,9H)。MS：1013.7m/z[M+H]。
实施例48–化合物48
化合物48：2-((4-(((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氨基甲酰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002191
向中间体1e(250mg，1.0当量)在MeCN(0.1M)中的溶液中加入吡啶(3.0当量)和2-[(3-氨基丙基)(2-羟乙基)氨基]乙-1-醇(1.5当量)。将反应在室温下搅拌2h。完成后，然后将庚烷(0.1M)加入到反应混合物中，并将庚烷层用MeCN洗涤3次。将合并的MeCN层用庚烷反萃取三次，并将合并的庚烷层最后用MeCN洗涤一次。然后在真空中去除庚烷，并将粗制材料通过柱色谱(MeOH/DCM)纯化，以得到呈无色油状物的产物(97mg，48％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.20(m,9H),4.76(s,1H),4.29(ddd,J＝11.9,4.6,1.8Hz,2H),4.16(dd,J＝11.9,5.8Hz,2H),3.72(t,J＝5.0Hz,4H),3.35–3.22(m,2H),2.98–2.46(m,14H),2.41–2.28(m,6H),2.09–1.86(m,9H),1.80(dd,J＝14.2,7.2Hz,3H),1.67–1.42(m,7H),1.42–1.18(m,46H),0.88(td,J＝7.0,4.3Hz,9H)。MS：1060.6m/z[M+H]。
实施例49–比较化合物49
化合物49：3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
Figure BDA0003132577440002201
根据WO 2015/095340 Al(实施例13)中所述的方法合成化合物49。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.35(m,4H),4.48(t,J＝5.6Hz,1H),4.17(m,8H),3.56(m,2H),3.40(m,2H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),2.55(q,J＝7.2Hz,6H),2.40(m,3H),2.30(t,J＝7.6Hz,2H),2.05(q,J＝6.8Hz,4H),1.92(m,2H),1.84(m,2H),1.57(m,6H),1.30(m,34H),1.03(t,J＝7.2Hz,6H),0.88(m,9H)ppm；MS：853m/z[M+H]。
实施例50–化合物50
化合物50：2-((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002211
使用实施例1所采用的方法，由中间体40d和2-(吡咯烷-1-基)乙-1-胺合成化合物50，产率为36％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.49–5.29(m,8H),5.27–5.20(m,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,3.8Hz,2H),3.35(s,2H),2.83–2.44(m,10H),2.39(ddd,J＝8.4,6.7,3.3Hz,2H),2.36–2.25(m,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.98–1.43(m,15H),1.42–1.20(m,33H),0.89(td,J＝6.1,5.4,0.9Hz,9H)。MS：928.6m/z[M+H]。
实施例51–化合物51
化合物51：2-((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002212
使用实施例1所采用的方法，由中间体31c和2-(吡咯烷-1-基)乙-1-胺合成化合物51，产率为27％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.55(s,1H),5.44–5.28(m,8H),5.28–5.22(m,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,3.9Hz,2H),3.37(s,2H),2.83–2.51(m,10H),2.39(ddd,J＝8.4,6.8,3.1Hz,2H),2.35–2.27(m,4H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),1.97–1.41(m,17H),1.41–1.20(m,40H),0.94–0.84(m,9H)。MS：957.0m/z[M+H]。
实施例52–化合物52
中间体52a：3-羟基十一酸苄酯
Figure BDA0003132577440002221
在66℃、N2下向THF(150mL)溶液中逐滴加入Zn(22.99g，1.0当量)和壬醛(25g，1.0当量)。接下来，将2-溴乙酸苄酯(50.00g，1.24当量)缓慢且小心地逐滴加入到反应混合物中。完成2-溴乙酸苄酯加入后，将混合物冷却并在20℃下搅拌2h。然后将反应混合物在减压下浓缩以去除THF，并将所得残余物用水稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩并通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(25g，49％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33–7.24(m,5H),5.09(s,2H),3.95(tt,J＝7.7,3.8Hz,1H),2.75(d,J＝3.9Hz,1H),2.56–2.35(m,2H),1.54–1.11(m,18H),0.81(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体52b：3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十一酸苄酯
Figure BDA0003132577440002222
在N2气氛下，向中间体52a(25g，1.0当量)在DCM(250mL)中的溶液中加入(4-硝基苯基)氯甲酸酯((4-nitrophenyl)carbonochloridate)(17.23g，1.0当量)和吡啶(13.80mL，2.0当量)。将混合物在20℃下搅拌2h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩以去除DCM，并将所得残余物用水稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩并通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(12g，31％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.31–8.01(m,4H),7.28(s,5H),5.22–5.14(m,2H),5.13–5.01(m,4H),2.68(dd,J＝14.8,6.4Hz,3H),1.75–1.64(m,2H),1.30–1.19(m,18H),0.80(t,J＝6.6Hz,3H)。
中间体52c：3-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十一酸苄酯
Figure BDA0003132577440002231
向中间体52b(14g，1.0当量)和N'-乙基-N'-甲基-乙烷-1,2-二胺(6.25g，2.0当量)在MeCN(400mL)中的溶液中加入吡啶(7.41mL，3.0当量)和DMAP(3.74g，1.0当量)。将混合物在20℃下搅拌12h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩以去除MeCN，并将所得残余物用水稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩并通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(6g，47％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39–7.28(m,5H),5.11(s,4H),3.21(h,J＝6.8Hz,2H),2.62(td,J＝14.4,13.6,6.4Hz,2H),2.50–2.39(m,4H),1.59(h,J＝8.2Hz,2H),1.25(d,J＝16.1Hz,14H),1.03(t,J＝7.2Hz,3H),0.86(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体52d：3-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十一酸
Figure BDA0003132577440002232
向中间体52c(6g，1.0当量)在MeOH(60mL)中的溶液中加入Pd/C(2g，10％w/w)。将混合物在20℃、H2下搅拌2h。然后将反应混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈棕色油状物的产物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.76(s,1H),6.28(t,J＝5.8Hz,1H),5.01(p,J＝6.1,5.6Hz,1H),3.30(qq,J＝13.8,6.0Hz,2H),2.70(hd,J＝12.1,11.0,5.4Hz,3H),2.37(d,J＝14.1Hz,4H),1.51(ddq,J＝21.6,14.2,6.7Hz,2H),1.34–1.14(m,11H),1.10(t,J＝7.1Hz,3H),0.80(t,J＝6.7Hz,3H)。
化合物52：2-((3-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002241
向中间体52d(1.0-1.1当量)和中间体1c(1.0-1.1当量)在DCM(0.1-0.25当量)中的溶液中按顺序加入DMAP(0.25当量)、DIPEA(3.5当量)和EDCI(1.5当量)。将反应在23℃下搅拌至少16h。将额外的DMAP(0.25当量)加入到反应中，并将反应在23℃下再搅拌6h。然后通过加入水将反应淬灭，用1M HCl洗涤1次，且用5％NaHCO3洗涤1次。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱进行纯化，得到呈无色油状物的产物(28％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.53–5.28(m,8H),5.24(s,1H),5.08(s,1H),4.28(ddd,J＝15.9,11.9,4.5Hz,2H),4.15(dt,J＝13.4,6.8Hz,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.59(tt,J＝15.9,9.0Hz,6H),2.37–2.14(m,6H),2.05(q,J＝6.8Hz,7H),1.59(d,J＝14.2Hz,12H),1.46–0.97(m,42H),0.96–0.81(m,9H)。MS：930.8m/z[M+H]。
实施例53–化合物53
中间体53a：2-(羟甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002251
向亚油酸(20g，1.0当量)和2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(7.57g，1.0当量)在DCM(200mL)中的溶液中加入EDCI(13.67g，1.0当量)、DMAP(1.39g，0.16当量)和DIPEA(37.27mL，3.0当量)。将混合物在20℃下搅拌2小时。完成后，将反应混合物在减压下浓缩以去除DCM，并将所得残余物用水稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(6.3g，11％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.44–5.30(m,8H),4.17(qd,J＝11.1,6.0Hz,4H),3.63(d,J＝6.0Hz,2H),2.80(t,J＝6.1Hz,4H),2.35(t,J＝7.4Hz,4H),2.21(h,J＝6.0Hz,1H),2.14–2.03(m,8H),1.64(p,J＝7.4Hz,4H),1.46–1.28(m,27H),0.93(t,J＝6.7Hz,6H)。
化合物53：2-(11-甲基-5-辛基-3,7-二氧代-2,6-二氧杂-8,11-二氮杂十三烷基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002261
使用化合物52所采用的方法，由中间体52d和中间体53a合成化合物53，产率为45％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.48–5.24(m,8H),5.07(t,J＝6.5Hz,1H),4.20–4.07(m,6H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.62–2.46(m,4H),2.45–2.37(m,2H),2.34–2.15(m,6H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.43–0.97(m,43H),0.95–0.83(m,9H)。MS：944.8m/z[M+H]。
实施例54–化合物54
中间体54a：4-羟基十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002262
向5-辛基四氢呋喃-2-酮(20g，1.0当量)在水(200-250mL)中的溶液中加入NaOH(1.1当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌24小时。接下来，将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂水。将所得粗制材料在丙酮(200mL)中重构，然后加入TBAB(0.05当量)和BnBr(1.2-1.5当量)。将混合物加热至60℃并在N2气氛下搅拌12h。完成后，将混合物在减压下浓缩并将所得残余物倒入饱和NaHCO3溶液中。将产物用EtOAc萃取3次，并将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(20g，39％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.29(m,5H),5.12(s,2H),3.65–3.57(m,1H),2.51(td,J＝7.2,2.7Hz,2H),1.86(dtd,J＝14.6,7.4,3.5Hz,1H),1.71(ddd,J＝14.2,8.6,7.1Hz,1H),1.61(d,J＝5.0Hz,1H),1.52–1.17(m,17H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体54b：4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002271
向中间体54a(10g，1.0当量)在DCM(80-100mL)中的溶液中加入(4-硝基苯基)氯甲酸酯(1.5当量)。将反应脱气且用N2吹扫3次，并冷却至0℃，然后加入吡啶(2.0当量)。将反应混合物在20℃、N2气氛下搅拌5h。完成后，将混合物在减压下浓缩并将所得残余物在己烷中重构并过滤。将所得滤液用水洗涤3次，并将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(9g，29％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.27(dd,J＝9.8,7.8Hz,2H),7.50–7.30(m,8H),5.12(d,J＝8.3Hz,2H),4.87(ddt,J＝12.2,7.3,4.1Hz,1H),2.50(t,J＝7.5Hz,2H),2.16–2.06(m,1H),1.99(dq,J＝14.8,7.5Hz,1H),1.73(ddd,J＝14.0,12.0,7.0Hz,1H),1.63(tt,J＝8.6,4.5Hz,1H),1.45–1.19(m,12H),0.94–0.84(m,3H)。
中间体54c：4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002281
向中间体54b(9g，1.0当量)在MeCN(45-90mL)中的溶液中加入N'-乙基-N'-甲基-乙烷-1,2-二胺(1.5-2.5当量)、吡啶(3-4当量)和DMAP(2.33g，1.0当量)，并将所得混合物脱气且用N2吹扫3次。将反应加热至70℃，并在N2气氛下搅拌2h。完成后，将混合物浓缩以去除溶剂，并将所得残余物用EtOAc稀释，用饱和NaHCO3洗涤3次，且用水洗涤3次。然后将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈淡黄色油状物的产物(5g，60％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38–7.22(m,5H),5.04(s,2H),4.69(s,1H),3.16(q,J＝6.0Hz,2H),2.45–2.27(m,6H),2.13(s,3H),1.95–1.71(m,2H),1.40(d,J＝7.3Hz,2H),1.34–1.09(m,13H),0.96(t,J＝7.1Hz,3H),0.80(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体54d：4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酸
Figure BDA0003132577440002282
向中间体54c(6g，1.0当量)在MeOH(60mL)中的溶液中加入Pd/C(1.8g，10％w/w)。将混合物在20℃、H2下搅拌5h。然后将反应混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈棕色油状物的产物(3.2g，67％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.76(dp,J＝8.1,4.1Hz,1H),3.65(dt,J＝14.0,7.0Hz,1H),3.28–3.10(m,4H),3.07(ddd,J＝11.3,7.5,2.1Hz,1H),2.79(s,3H),2.27(ddd,J＝14.0,8.2,4.4Hz,1H),2.20–1.99(m,2H),1.86–1.74(m,1H),1.71–1.56(m,1H),1.48(dq,J＝13.7,7.6,6.8Hz,1H),1.31(dd,J＝14.1,7.0Hz,14H),0.94–0.83(m,3H)。
化合物54：2-(12-甲基-6-辛基-3,8-二氧代-2,7-二氧杂-9,12-二氮杂十四烷基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002291
使用化合物52所采用的方法，由中间体54d和中间体53a合成化合物54，产率为47％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.26(m,8H),4.75(s,1H),4.12(d,J＝6.0Hz,6H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.55–2.34(m,6H),2.34–2.19(m,6H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.97–1.70(m,4H),1.61(t,J＝7.2Hz,10H),1.41–1.00(m,43H),0.94–0.82(m,9H)。MS：959.1m/z[M+H]。
实施例55–化合物55
中间体55a：5-羟基十三酸苄酯
Figure BDA0003132577440002292
使用中间体54a所采用的方法，由6-辛基四氢吡喃-2-酮制备中间体55a，产率为25％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(qt,J＝9.5,4.5Hz,5H),5.11(s,2H),3.57(s,1H),2.39(t,J＝7.3Hz,2H),1.85–1.65(m,2H),1.60–1.11(m,18H),0.98–0.80(m,3H)。
中间体55b：5-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十三酸苄酯
Figure BDA0003132577440002301
使用中间体54b所采用的方法，由中间体55a制备中间体55b，产率为37％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32–8.24(m,3H),7.39(dddd,J＝20.3,9.9,5.7,1.9Hz,8H),5.12(s,2H),4.87–4.75(m,1H),2.41(t,J＝6.8Hz,2H),1.69(dddt,J＝33.5,23.3,14.2,6.0Hz,6H),1.51–1.01(m,13H),0.87(t,J＝6.6Hz,3H)。
中间体55c：5-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十三酸苄酯
Figure BDA0003132577440002302
使用中间体54c所采用的方法，由中间体55b制备中间体55c，产率为53％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41–7.18(m,5H),5.04(s,2H),4.65(p,J＝6.5Hz,1H),3.19(q,J＝6.4,5.9Hz,2H),2.49–2.23(m,6H),2.16(d,J＝29.0Hz,3H),1.69–1.54(m,J＝6.7Hz,2H),1.44(tt,J＝13.6,7.1Hz,4H),1.37–1.05(m,14H),0.98(t,J＝7.1Hz,3H),0.80(t,J＝6.6Hz,3H)。
中间体55d：5-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十三酸
Figure BDA0003132577440002311
向中间体55c(2.2g，1.0当量)在THF(20mL)中的溶液中加入Pd/C(2.5g，10％w/w)。将混合物在20℃、H2下搅拌5h。然后将反应混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈棕色油状物的产物(1g，58％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.81(s,1H),5.93–5.72(m,1H),4.61(q,J＝7.1Hz,1H),3.68–3.47(m,1H),3.29–3.04(m,1H),2.76(tt,J＝17.2,9.1Hz,3H),2.40(s,3H),2.34–2.06(m,2H),1.85–0.87(m,22H),0.80(t,J＝6.4Hz,3H)。
化合物55：2-(13-甲基-7-辛基-3,9-二氧代-2,8-二氧杂-10,13-二氮杂十五烷基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002312
使用化合物52所采用的方法，由中间体53a和中间体55d制备化合物55，产率为58％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.27(m,8H),4.73(s,1H),4.12(d,J＝6.0Hz,6H),3.32(s,2H),2.81–2.73(m,4H),2.49(d,J＝45.9Hz,4H),2.43–2.22(m,10H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.75–1.42(m,13H),1.42–1.21(m,40H),1.11(s,3H),0.95–0.82(m,9H)。MS：972.8m/z[M+H]。
实施例56–化合物56
中间体56a：9-(癸氧基)-9-氧代壬酸
Figure BDA0003132577440002321
在0℃下向壬二酸(90g，1.0当量)在THF(300-900mL)中的混合物中逐滴加入DMF(0.1-0.2当量)和(COCl)2(1.0当量)。将混合物脱气且用N2吹扫3次，并且然后将混合物在20℃、N2气氛下搅拌2h。在0℃下将癸-1-醇(1.0当量)逐滴加入到反应混合物中，并在20℃、N2气氛下搅拌2h。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂，并将所得溶液倒入水中且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈白色固体的产物(20g，6％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.05(t,J＝6.7Hz,2H),2.34(t,J＝7.5Hz,2H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.62(q,J＝7.3Hz,6H),1.41–1.15(m,19H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体56b：9,9'-二癸基O'1,O1-(2-氧代丙烷-1,3-二基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440002322
在0℃下，向1,3-二羟基丙-2-酮(1.37g，0.5当量)、EDCI(1.0当量)和DMAP(1.0当量)在DCM(100-200mL)中的混合物中分批加入中间体56a(1.0当量)，并将混合物脱气且用N2吹扫3次。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌5小时。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂，并将所得溶液倒入水中且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈白色固体的产物(10g，46％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.74(d,J＝2.1Hz,4H),4.05(t,J＝6.8Hz,4H),2.41(t,J＝7.5Hz,4H),2.28(t,J＝7.5Hz,4H),1.62(d,J＝8.8Hz,12H),1.39–1.19(m,39H),0.87(t,J＝6.7Hz,6H)。
中间体56c：9,9'-二癸基O'1,O1-(2-羟基丙烷-1,3-二基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440002331
在0℃、N2下，向中间体56b(13.4g，1.0当量)在THF/甲苯/水(4:1:2，0.4M)中的溶液中加入NaBH4(1.5当量)。将混合物在15-20℃、N2下搅拌5h。完成后，将反应混合物用水稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈白色固体的产物(5.1g，38％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.15–4.03(m,5H),3.98(t,J＝6.8Hz,4H),2.44(d,J＝4.8Hz,1H),2.25(dt,J＝24.2,7.5Hz,8H),1.55(q,J＝7.1Hz,12H),1.22(d,J＝22.7Hz,38H),0.81(t,J＝6.7Hz,6H)。
化合物56：9,9'-二癸基O'1,O1-(2-((3-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440002341
使用化合物52所采用的方法，由中间体52d和中间体56c制备化合物56，产率为36％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.24(t,J＝5.2Hz,1H),5.13–5.04(m,1H),4.28(ddd,J＝14.5,11.9,4.5Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,8.3,5.8Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,4H),3.31(s,2H),2.58(qd,J＝15.3,6.4Hz,6H),2.30(dt,J＝10.3,7.6Hz,10H),1.61(dd,J＝10.1,4.1Hz,16H),1.29(dt,J＝17.6,3.3Hz,54H),0.88(td,J＝6.9,1.9Hz,9H)。MS：1027.2m/z[M+H]。
实施例57–化合物57
化合物57：9,9'-二癸基O'1,O1-(2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440002342
使用化合物52所采用的方法，由中间体54d和中间体56c制备化合物57，产率为55％。1H NMR (400MHz,CDCl3)δ5.28–5.21(m,1H),4.76(s,1H),4.28(ddd,J＝11.8,4.4,1.2Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.9,4.6Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,4H),3.29(s,2H),2.38(ddd,J＝8.6,6.9,2.7Hz,5H),2.35–2.12(m,10H),1.98–1.73(m,3H),1.68–1.37(m,17H),1.29(dt,J＝19.5,4.1Hz,54H),0.88(td,J＝6.9,1.9Hz,9H)。MS：1040.8m/z[M+H]。
实施例58–化合物58
化合物58：9,9'-二癸基O'1,O1-(2-((5-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十三酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)二(壬二酸酯))
Figure BDA0003132577440002351
使用化合物52所采用的方法，由中间体55d和中间体56c制备化合物58，产率为60％。1H NMR (400MHz,CDCl3)δ5.27–5.20(m,1H),4.73(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.4,2.8Hz,2H),4.13(ddd,J＝11.9,5.9,2.6Hz,2H),4.05(t,J＝6.7Hz,4H),3.31(s,2H),2.39–2.09(m,12H),1.62(dq,J＝13.8,7.2,6.5Hz,22H),1.41–0.99(m,54H),0.88(td,J＝6.9,2.0Hz,9H)。MS：1055.0m/z[M+H]。
实施例59–化合物59
中间体59a：9-氧代-9-(十一烷氧基)壬酸
Figure BDA0003132577440002352
使用中间体56a所采用的方法，由壬二酸和十一烷-1-醇制备中间体59a，产率为41％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.05(t,J＝6.7Hz,2H),2.31(dt,J＝22.6,7.5Hz,4H),1.62(q,J＝7.1Hz,6H),1.40–1.18(m,23H),0.87(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体59b：O'1,O1-(2-氧代丙烷-1,3-二基)9,9'-二(十一烷基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440002361
使用中间体56b所采用的方法，由1,3-二羟基丙-2-酮和中间体59a制备中间体59b，产率为23％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.98(t,J＝6.7Hz,2H),2.35(t,J＝7.5Hz,2H),2.22(t,J＝7.5Hz,2H),1.57(dt,J＝18.6,6.9Hz,6H),1.36–1.12(m,23H),0.89–0.76(m,3H)。
中间体59c：O'1,O1-(2-羟基丙烷-1,3-二基)9,9'-二(十一烷基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440002362
使用中间体56c所采用的方法，由中间体59b制备中间体59c，产率为47％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.23–4.00(m,9H),2.52(d,J＝4.7Hz,1H),2.31(dt,J＝24.2,7.5Hz,8H),1.62(q,J＝7.0Hz,13H),1.29(d,J＝23.9Hz,43H),0.88(t,J＝6.7Hz,6H)。
化合物59：O'1,O1-(2-((3-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)9,9'-二(十一烷基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440002363
使用化合物52所采用的方法，由中间体52d和中间体59c制备化合物59，产率为35％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.23(s,1H),5.08(d,J＝6.5Hz,1H),4.28(ddd,J＝15.0,11.9,4.5Hz,2H),4.14(dt,J＝13.1,6.7Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,4H),2.58(qd,J＝15.4,6.6Hz,4H),2.30(dt,J＝10.4,7.5Hz,10H),1.60(q,J＝7.7,6.9Hz,20H),1.43–0.97(m,58H),0.88(td,J＝6.9,1.9Hz,9H)。MS：1054.9m/z[M+H]。
实施例60–化合物60
化合物60：O'1,O1-(2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)9,9'-二(十一烷基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440002371
使用化合物52所采用的方法，由中间体54d和中间体59c制备化合物60，产率为79％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.25(p,J＝5.1Hz,1H),4.76(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.5,2.7Hz,2H),4.15(dt,J＝11.7,5.6Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,4H),2.38(t,J＝7.5Hz,5H),2.35–2.11(m,10H),1.98–1.41(m,23H),1.41–0.96(m,57H),0.88(td,J＝6.9,1.8Hz,9H)。MS：1068.9m/z[M+H]。
实施例61–化合物61
化合物61：O'1,O1-(2-((5-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十三酰基)氧基)丙烷-1,3-二基)9,9'-二(十一烷基)二(壬二酸酯)
Figure BDA0003132577440002381
使用化合物52所采用的方法，由中间体55d和中间体59c制备化合物61，产率为61％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.29–5.20(m,1H),4.72(d,J＝7.4Hz,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.4,2.3Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.9,2.0Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,4H),2.82–2.13(m,15H),1.82–1.39(m,21H),1.39–0.97(m,56H),0.88(td,J＝6.9,1.9Hz,9H)。MS：1083.0m/z[M+H]。
实施例62–化合物62
中间体62a：1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3-羟基丙-2-酮
Figure BDA0003132577440002382
在0℃下，向1,3-二羟基丙-2-酮(50g，1.0当量)、咪唑(37.79g，1.0当量)在THF(40mL)中的混合物中加入TBSCl(83.66g，1.0当量)，并将混合物在20℃、N2气氛下搅拌2h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物，将所述残余物通过柱色谱(EtOAc/hex)纯化以得到呈无色油状物的产物(15g，13％)。
中间体62b：1-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氧代丙基)9-十一烷基壬二酸酯
Figure BDA0003132577440002383
在0℃下，向中间体62a(10g，1.0当量)、EDCI(9.38g，1.0当量)和DMAP(5.98g，1.0当量)在DCM(300mL)中的混合物中加入中间体59a(16.76g，1.0当量)，并将混合物在20℃、N2气氛下搅拌12h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩以去除DCM，并将所得残余物用水稀释。将粗制材料用EtOAc萃取3次，并将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(11g，43％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.84(s,2H),4.16(s,2H),3.95(t,J＝6.8Hz,2H),2.32(t,J＝7.5Hz,2H),2.18(t,J＝7.5Hz,2H),1.61–1.48(m,6H),1.30–1.12(m,22H),0.82(s,9H),0.78(t,J＝6.8Hz,3H)。
中间体62c：1-(3-羟基-2-氧代丙基)9-十一烷基壬二酸酯
Figure BDA0003132577440002391
向中间体62b(11g，1.0当量)在THF(50mL)中的混合物中加入HF·吡啶(3.75mL，8.0当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌5h。完成后，将反应混合物用水稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈白色固体的产物(6g，70％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.70(s,2H),4.30(s,2H),3.98(t,J＝6.8Hz,2H),2.95(s,1H),2.36(t,J＝7.5Hz,2H),2.22(t,J＝7.6Hz,2H),1.57(dt,J＝20.3,7.1Hz,6H),1.37–1.10(m,22H),0.81(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体62d：1-(3-(((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰)氧基)-2-氧代丙基)9-十一烷基壬二酸酯
Figure BDA0003132577440002392
在0℃下向中间体62c(6g，1.0当量)在DCM(100mL)中的溶液中加入EDCI(1.0当量)、DMAP(1.0当量)。将溶液脱气并用N2吹扫3次，然后加入亚油酸(4mL，1.0当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌12h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩以去除DCM，并将所得残余物用水稀释。将粗制材料用EtOAc萃取3次，并将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(7.5g，55％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.70(s,2H),4.30(s,2H),3.98(t,J＝6.8Hz,2H),2.95(s,1H),2.36(t,J＝7.5Hz,2H),2.22(t,J＝7.6Hz,2H),1.57(dt,J＝20.3,7.1Hz,6H),1.37–1.10(m,22H),0.81(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体62e：1-(2-羟基-3-(((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰)氧基)丙基)9-十一烷基壬二酸酯
Figure BDA0003132577440002401
在0℃下，向中间体62d(7g，1.0当量)在THF/甲苯/水(4:1:2，0.04M)中的溶液中加入NaBH4(5当量)，并将混合物在20℃、N2气氛下搅拌5h。完成后，在5℃下用饱和NH4Cl将混合物淬灭，并用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤2次，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩以得到残余物。将粗制残余物通过柱色谱(EtOAc/hex)纯化，以得到呈无色油状物的产物(6g，85％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.25(m,4H),4.25–3.90(m,8H),2.76(t,J＝6.4Hz,2H),2.55(s,1H),2.30(dt,J＝24.5,7.6Hz,6H),2.03(q,J＝6.8Hz,4H),1.61(q,J＝7.0Hz,8H),1.48–1.06(m,35H),0.87(td,J＝6.8,3.8Hz,6H)。
化合物62：1-(3-甲基-13-((((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰)氧基)甲基)-9-辛基-7,11-二氧代-8,12-二氧杂-3,6-二氮杂十四烷-14-基)9-十一烷基壬二酸酯
Figure BDA0003132577440002411
使用化合物52所采用的方法，由中间体52d和中间体62e制备化合物62，产率为36％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.47–5.28(m,4H),5.23(t,J＝5.2Hz,1H),5.14–5.04(m,1H),4.28(ddd,J＝15.3,11.9,4.6Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.8,7.5,5.8Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.38(s,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,2H),2.58(qd,J＝15.2,6.3Hz,5H),2.37–2.22(m,7H),2.05(q,J＝6.7Hz,4H),1.62(d,J＝6.8Hz,14H),1.48–0.97(m,50H),0.97–0.79(m,9H)。MS：992.3m/z[M+H]。
实施例63–化合物63
化合物63：1-(3-甲基-14-((((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰)氧基)甲基)-9-辛基-7,12-二氧代-8,13-二氧杂-3,6-二氮杂十五烷-15-基)9-十一烷基壬二酸酯
Figure BDA0003132577440002412
使用化合物52所采用的方法，由中间体54d和中间体62e制备化合物63，产率为79％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.28(m,4H),5.25(ddd,J＝5.8,4.5,1.4Hz,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,4.2Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.31(s,2H),2.77(t,J＝6.7Hz,2H),2.70–2.12(m,15H),2.05(q,J＝6.9Hz,4H),1.97–1.72(m,3H),1.61(h,J＝6.5Hz,12H),1.40–1.19(m,47H),1.11(s,3H),0.96–0.81(m,9H)。MS：1006.9m/z[M+H]。
实施例64–化合物64
化合物64：1-(3-甲基-15-((((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰)氧基)甲基)-9-辛基-7,13-二氧代-8,14-二氧杂-3,6-二氮杂十六烷-16-基)9-十一烷基壬二酸酯
Figure BDA0003132577440002421
使用化合物52所采用的方法，由中间体55d和中间体62e制备化合物64，产率为79％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.48–5.28(m,4H),5.24(h,J＝4.9,4.4Hz,1H),4.73(s,1H),4.29(ddd,J＝11.9,4.4,3.3Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.9,3.1Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.31(s,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,2H),2.67–2.11(m,14H),2.05(q,J＝6.8Hz,4H),1.73–1.41(m,17H),1.41–0.95(m,50H),0.94–0.82(m,9H)。MS：1021.0m/z[M+H]。
实施例65–化合物65
化合物65：2-((4-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)十四酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002431
使用实施例1所采用的方法，由中间体39d和1-(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺制备化合物65，产率为75％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.28(m,8H),5.25(ddd,J＝10.2,5.7,4.4Hz,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.20–4.11(m,2H),3.45(s,1H),3.21(s,2H),2.82–2.74(m,4H),2.46–2.24(m,9H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),2.01–1.42(m,16H),1.41–1.20(m,45H),0.88(td,J＝7.0,4.7Hz,9H)。MS：984.9m/z[M+H]。
实施例66–化合物66
化合物66：2-((4-(((3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十四酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002432
使用实施例1所采用的方法，由中间体39d和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇制备化合物66，产率为65％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.57–5.21(m,9H),4.72(dt,J＝12.2,5.2Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.24–4.07(m,4H),2.82–2.74(m,4H),2.60(d,J＝102.7Hz,5H),2.45–2.38(m,2H),2.38–2.26(m,4H),2.13–1.73(m,16H),1.73–1.43(m,9H),1.41–1.16(m,42H),1.04–0.74(m,9H)。MS：999.4m/z[M+H]。
实施例67–化合物67
化合物67：2-((4-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002441
使用实施例1所采用的方法，由中间体42d和1-(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺制备化合物67，产率为50％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.08(m,9H),4.77(s,1H),4.28(ddd,J＝11.8,4.5,1.8Hz,2H),4.20–4.12(m,2H),3.48(s,1H),3.33(s,2H),2.77(td,J＝6.1,1.2Hz,4H),2.63–2.23(m,11H),2.05(q,J＝6.8Hz,9H),1.98–1.42(m,14H),1.42–1.22(m,32H),0.96–0.81(m,9H)。MS：900.0m/z[M+H]。
实施例68–化合物68
化合物68：2-((4-(((3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002451
使用实施例1所采用的方法，由中间体42d和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇制备化合物68，产率为43％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.04(m,9H),4.72(tt,J＝7.4,5.1Hz,1H),4.40–4.10(m,6H),2.81–2.74(m,4H),2.54(d,J＝58.1Hz,5H),2.40(ddd,J＝8.4,6.8,4.4Hz,2H),2.36–2.27(m,4H),2.11–1.73(m,16H),1.73–1.43(m,8H),1.43–1.21(m,31H),0.99–0.77(m,9H)。MS：915.7m/z[M+H]。
实施例69–化合物69
中间体69a：4-氧代壬酸
Figure BDA0003132577440002452
在15℃、N2下，向5-戊基四氢呋喃-2-酮(50g，1.0当量)在3:1EtOH/H2O(500mL)中的混合物中一次性加入NaOH(2.0当量)。将混合物在15℃下搅拌12h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩，并将所得残余物用DCM萃取两次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，并浓缩以得到粗制残余物。
随后将粗制残余物在DCM(1L)中重构，然后在15℃、N2下一次性加入DMP(3当量)。将混合物在15℃下搅拌4h。完成后，将反应在减压下浓缩并将溶液用1M HCl调节至pH＝3。将浆液过滤并用H2O洗涤。将所得滤饼溶解在EtOAc中，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈白色固体的产物(22g，45％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.72(dd,J＝7.0,5.4Hz,2H),2.63(ddd,J＝7.2,5.9,1.2Hz,2H),2.44(t,J＝7.4Hz,2H),1.64–1.54(m,2H),1.36–1.20(m,4H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H)。
中间体69b：2-((4-氧代壬酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002461
使用中间体1d所采用的方法，由中间体69a和中间体1c合成中间体69b，产率为74％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46–5.16(m,9H),4.29(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.14(dt,J＝11.8,6.0Hz,2H),2.74(dt,J＝21.5,6.5Hz,6H),2.59(t,J＝6.6Hz,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),2.32(t,J＝7.6Hz,4H),2.04(dd,J＝8.6,5.3Hz,8H),1.60(ddd,J＝14.2,8.4,4.8Hz,6H),1.50–1.06(m,32H),0.89(t,J＝6.8Hz,9H)。
中间体69c：2-((4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)壬酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002462
在5℃下向中间体69b(10g，1.0当量)在THF(300mL)、甲苯(150mL)和H2O(75mL)中的溶液中加入NaBH4(5.0当量)。将混合物在15℃、N2气氛下搅拌3h。完成后，在0℃下将Na2SO4加入到反应混合物中，并将所得混合物过滤且在减压下浓缩。将所得残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的醇中间体。
立即将中间体在DCM(80mL)中重构，然后在0℃下加入吡啶(1.67当量)和(4-硝基苯基)氯甲酸酯(2当量)。将混合物在0℃、N2气氛下搅拌5h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩，以得到残余物，将所述残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(4.05g，33％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26–8.19(m,2H),7.40–7.28(m,2H),5.43–5.11(m,9H),4.80(tt,J＝7.5,4.4Hz,1H),4.25(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.09(dd,J＝11.9,5.8Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.40(t,J＝7.4Hz,2H),2.33–2.16(m,4H),1.97(q,J＝6.8Hz,10H),1.67(ddt,J＝13.4,9.9,4.7Hz,1H),1.55(dtd,J＝15.7,8.4,7.4,4.8Hz,5H),1.43–1.16(m,36H),0.83(q,J＝6.8Hz,9H)。
化合物69：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)壬酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002471
使用实施例1所采用的方法，由中间体69c和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺制备化合物69，产率为77％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.35(pt,J＝8.8,4.4Hz,8H),5.25(p,J＝5.1Hz,1H),4.76(dt,J＝12.3,6.7Hz,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.5Hz,2H),4.15(dh,J＝11.4,5.9Hz,2H),3.31(s,2H),2.77(t,J＝6.8Hz,4H),2.62–2.45(m,4H),2.38(dt,J＝9.0,6.2Hz,2H),2.30(q,J＝13.0,10.4Hz,8H),2.05(q,J＝7.0Hz,9H),1.91(tt,J＝9.5,4.5Hz,1H),1.81(dt,J＝14.7,7.8Hz,1H),1.65–1.43(m,7H),1.40–1.17(m,36H),1.09(q,J＝8.8,8.2Hz,3H),0.88(q,J＝6.5Hz,9H)。MS：902.6m/z[M+H]。
实施例70–化合物70
化合物70：2-((4-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)壬酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002481
使用实施例1所采用的方法，由中间体69c和1-(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺制备化合物70，产率为62％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.45–5.29(m,8H),5.25(p,J＝5.2Hz,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.5Hz,2H),4.15(dq,J＝11.7,5.8Hz,2H),3.46(d,J＝25.9Hz,1H),3.19(s,2H),2.77(t,J＝6.8Hz,4H),2.34(dt,J＝31.1,8.3Hz,12H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),1.99–1.42(m,16H),1.42–1.19(m,35H),0.88(q,J＝6.8Hz,9H)。MS：914.4m/z[M+H]。
实施例71–化合物71
化合物71：2-((4-(((3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)壬酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002491
使用实施例1所采用的方法，由中间体69c和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇制备化合物71，产率为78％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.50–5.28(m,8H),5.25(p,J＝5.1Hz,1H),4.72(tt,J＝7.8,4.5Hz,1H),4.36–4.26(m,2H),4.23–4.11(m,4H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),2.41(dt,J＝15.0,9.0Hz,2H),2.31(t,J＝7.5Hz,5H),2.05(q,J＝6.9Hz,8H),2.00–1.75(m,9H),1.72–1.48(m,8H),1.43–1.20(m,35H),1.00–0.75(m,9H)。MS：929.4m/z[M+H]。
实施例72–化合物72
化合物72：2-((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)壬酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002492
使用实施例1所采用的方法，由中间体69c和2-(吡咯烷-1-基)乙-1-胺制备化合物72，产率为72％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.49(s,1H),5.34(dtt,J＝18.0,6.9,3.9Hz,8H),5.25(p,J＝5.1Hz,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(dt,J＝11.6,5.4Hz,2H),3.40–3.27(m,2H),2.80–2.50(m,11H),2.45–2.35(m,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,5H),2.05(q,J＝7.0Hz,9H),1.97–1.67(m,8H),1.60(q,J＝7.3Hz,8H),1.33(d,J＝26.5Hz,36H),0.88(q,J＝6.5Hz,9H)。MS：914.7m/z[M+H]。
实施例73–化合物73
中间体73a：4-氧代十一酸
Figure BDA0003132577440002501
向5-庚基四氢呋喃-2-酮(20g，1.0当量)在2:1EtOH/H2O(400mL)中的溶液中加入NaOH(1.1当量)。将混合物脱气且用N2吹扫3次，并且然后将混合物在20℃、N2气氛下搅拌12h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂，并将1N HCl加入到所得残余物中直到pH＝3。将所得浆液过滤，并将滤饼在减压下浓缩，得到残余物。
将所得残余物在DCM(200mL)中重构，然后加入DMP(3当量)。将混合物在20℃下搅拌5h。完成后，将混合物在减压下浓缩，并将所得残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。将粗制材料通过柱色谱纯化，以得到呈白色固体的产物(10g，46％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.65(dd,J＝7.0,5.3Hz,2H),2.56(t,J＝6.8Hz,2H),2.37(t,J＝7.5Hz,2H),1.51(q,J＝7.2Hz,2H),1.27–1.13(m,8H),0.86–0.76(m,3H)。
中间体73b：2-((4-氧代十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002511
使用中间体1d所采用的方法，由中间体73a和中间体1c合成中间体73b，产率为42％。1H NMR (400MHz,CDCl3)δ5.28(dddd,J＝12.3,10.7,8.7,5.5Hz,8H),5.21–5.15(m,1H),4.22(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.13–4.05(m,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.64(t,J＝6.5Hz,2H),2.52(t,J＝6.5Hz,2H),2.36(t,J＝7.5Hz,2H),2.25(t,J＝7.6Hz,4H),2.02–1.95(m,8H),1.53(h,J＝7.0Hz,6H),1.33–1.16(m,37H),0.81(td,J＝6.8,4.7Hz,9H)。
中间体73c：2-((4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002512
在0℃、N2下向中间体73b(25g，1.0当量)在THF(500mL)、甲苯(125mL)和H2O(250mL)中的溶液中加入NaBH4(5.0当量)。将混合物在5℃、N2气氛下搅拌1h。完成后，将残余物倒入饱和NH4Cl溶液中，并用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色残余物的中间体醇。
立即将中间体在DCM(100mL)中重构，然后在0℃下加入吡啶(2当量)和(4-硝基苯基)氯甲酸酯(2当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌5h，此后将反应混合物在减压下浓缩。将所得残余物用己烷稀释并过滤。将滤液用水洗涤3次，且用盐水洗涤1次，然后经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱进行纯化，得到呈无色油状物的产物(5.2g，40％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.28(d,J＝8.8Hz,2H),7.41(dd,J＝8.6,6.1Hz,2H),5.33(tdd,J＝23.5,11.3,6.1Hz,9H),4.87(tt,J＝7.7,4.6Hz,1H),4.32(dd,J＝12.0,4.4Hz,2H),4.16(dd,J＝12.0,5.8Hz,2H),2.77(t,J＝6.4Hz,4H),2.47(t,J＝7.5Hz,2H),2.39–2.25(m,4H),2.04(q,J＝6.9Hz,10H),1.79–1.55(m,7H),1.48–1.15(m,36H),0.89(t,J＝6.7Hz,9H)。
化合物73：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002521
使用实施例1所采用的方法，由中间体73c和(2-氨基乙基)(乙基)甲胺制备化合物73，产率为53％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.47–5.27(m,8H),5.24(q,J＝5.1Hz,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(dt,J＝11.6,5.4Hz,2H),3.31(s,2H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),2.61–2.35(m,6H),2.31(t,J＝7.6Hz,7H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),1.90(q,J＝11.5,9.0Hz,1H),1.81(dt,J＝14.5,7.6Hz,1H),1.65–1.41(m,9H),1.39–1.19(m,38H),1.10(s,3H),0.88(q,J＝7.0Hz,9H)。MS：930.3m/z[M+H]。
实施例74–化合物74
化合物74：2-((4-((((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)氨基甲酰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002531
使用实施例1所采用的方法，由中间体73c和1-(1-甲基吡咯烷-2-基)甲胺制备化合物74，产率为55％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.34(dtt,J＝18.0,6.9,3.8Hz,8H),5.25(p,J＝5.2Hz,1H),4.81–4.72(m,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(dt,J＝11.7,5.2Hz,2H),3.43(s,1H),3.17(s,2H),2.77(t,J＝6.8Hz,4H),2.34(dt,J＝31.2,8.3Hz,11H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),1.99–1.43(m,16H),1.43–1.13(m,39H),0.88(q,J＝7.7,7.2Hz,9H)。MS：942.8m/z[M+H]。
实施例75–化合物75
化合物75：2-((4-(((3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002532
使用实施例1所采用的方法，由中间体73c和3-(吡咯烷-1-基)丙-1-醇制备化合物75，产率为73％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.46–5.28(m,8H),5.25(p,J＝5.1Hz,1H),4.72(tt,J＝7.8,4.5Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.22–4.11(m,4H),2.77(t,J＝6.8Hz,4H),2.45–2.37(m,2H),2.31(t,J＝7.5Hz,4H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),2.01–1.91(m,3H),1.91–1.78(m,5H),1.67–1.50(m,9H),1.39–1.22(m,39H),0.88(q,J＝6.6Hz,9H)。MS：957.4m/z[M+H]。
实施例76–化合物76
化合物76：2-((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002541
使用实施例1所采用的方法，由中间体73c和2-(吡咯烷-1-基)乙-1-胺制备化合物76，产率为81％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.56(s,1H),5.46–5.28(m,8H),5.25(p,J＝5.2Hz,1H),4.76(s,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(dt,J＝11.7,5.5Hz,2H),3.43–3.31(m,2H),2.77(t,J＝6.7Hz,11H),2.45–2.35(m,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),1.97–1.74(m,7H),1.69–1.43(m,8H),1.43–1.09(m,39H),0.88(q,J＝7.0Hz,9H)。MS：943.2m/z[M+H]。
实施例77–化合物77
化合物77：2-((4-(((2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002551
使用实施例1所采用的方法，由中间体40d和2-(氮杂环丁烷-1-基)乙-1-胺制备化合物77，产率为36％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.29(m,8H),5.25(h,J＝4.6,4.1Hz,1H),4.75(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.5,1.9Hz,2H),4.15(ddt,J＝11.9,5.8,3.6Hz,2H),3.74–3.54(m,3H),3.48–3.38(m,1H),3.31(d,J＝6.3Hz,1H),2.86(s,1H),2.81–2.73(m,4H),2.41–2.26(m,7H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.97–1.87(m,2H),1.87–1.77(m,2H),1.60(d,J＝7.2Hz,8H),1.44–1.15(m,37H),0.96–0.84(m,9H)。MS：914.7m/z[M+H]。
实施例78–化合物78
化合物78：2-((4-(((2-(哌啶-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002552
使用实施例1所采用的方法，由中间体40d和2-(哌啶-1-基)乙-1-胺制备化合物78，产率为60％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.47–5.28(m,8H),5.25(h,J＝4.8Hz,1H),4.76(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.4,1.3Hz,2H),4.15(dt,J＝11.8,5.7Hz,2H),3.42(s,2H),2.80–2.72(m,4H),2.44(d,J＝6.7Hz,2H),2.39(ddd,J＝8.6,6.9,2.5Hz,2H),2.36–2.27(m,5H),2.05(q,J＝6.9Hz,8H),1.95–1.41(m,18H),1.41–1.20(m,37H),0.96–0.81(m,9H)。MS：942.4m/z[M+H]。
实施例79–化合物79
化合物79：2-((4-(((2-甲基-1-(吡咯烷-1-基)丙-2-基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002561
使用实施例1所采用的方法，由中间体40d和2-甲基-1-(吡咯烷-1-基)丙-2-胺制备化合物79，产率为48％。1H NMR (400MHz,CDCl3)δ5.42–5.21(m,9H),4.72(s,1H),4.28(ddt,J＝11.9,4.4,2.2Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,4.6Hz,2H),2.86–2.49(m,8H),2.39(td,J＝8.2,7.4,2.2Hz,1H),2.31(td,J＝7.6,1.8Hz,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),2.00–1.45(m,17H),1.45–1.03(m,41H),0.98–0.77(m,9H)。MS：956.5m/z[M+H]。
实施例80–化合物80
中间体80a：(5-甲基己基)溴化镁
Figure BDA0003132577440002562
在15℃下向Mg(1.63g，1.2当量)和I2(0.1当量)在THF(100mL)中的溶液中加入1-溴-5-甲基-己烷(1.0当量)。将混合物在40℃、N2气氛下搅拌2h。没有进一步的后处理(work-up)。将反应混合物直接用于下一步。在THF中获得作为灰色溶液的溴(5-甲基己基)镁。
中间体80b：9-甲基-4-氧代癸酸乙酯
Figure BDA0003132577440002571
在-78℃下，向4-氯-4-氧代丁酸乙酯(16g，1.0当量)在THF(150mL)中的溶液中加入CuI(1.0当量)和中间体80a(2.0当量)。将混合物在-78℃、N2气氛下搅拌2h。完成后，用水将反应混合物淬灭且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤2次，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗制残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(10g，45％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.06(q,J＝7.1Hz,2H),2.64(t,J＝6.6Hz,2H),2.50(t,J＝6.8Hz,2H),2.38(t,J＝7.5Hz,2H),1.55–1.45(m,3H),1.28–1.15(m,6H),1.15–1.06(m,2H),0.79(d,J＝6.6Hz,6H)。
中间体80c：9-甲基-4-氧代癸酸
Figure BDA0003132577440002572
在20℃下，向中间体80b(10g，1.0当量)在EtOH(100mL)中的溶液中加入KOH(3.0当量)。将混合物在50℃、N2气氛下搅拌12h。然后将反应浓缩以去除EtOH，并用HCl(1M)将pH调节至5.5。将所得混合物用水稀释且用EtOAc萃取2次。将合并的有机层用盐水洗涤2次，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗制材料通过柱色谱纯化，以得到呈白色固体的产物(4.4g，50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.71(t,J＝6.8Hz,2H),2.63(ddd,J＝7.0,5.8,1.1Hz,2H),2.44(t,J＝7.5Hz,2H),1.53(dq,J＝19.8,7.0,6.6Hz,3H),1.31–1.24(m,2H),1.16(dt,J＝8.6,6.7Hz,2H),0.85(d,J＝6.6Hz,6H)。
中间体80d：2-((9-甲基-4-氧代癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002581
使用中间体1d所采用的方法，由中间体80c和中间体1c合成中间体80d，产率为40％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.28(m,8H),5.24(p,J＝5.1Hz,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.14(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),2.76(t,J＝6.4Hz,4H),2.71(t,J＝6.5Hz,2H),2.59(t,J＝6.5Hz,2H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.04(q,J＝6.8Hz,8H),1.67–1.50(m,8H),1.39–1.21(m,29H),1.22–1.12(m,3H),0.93–0.82(m,12H)。
中间体80e：2-((9-甲基-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002582
在0℃下向中间体80d(1.5g，1.0当量)在THF(30mL)、甲苯(15mL)和H2O(7.5mL)中的溶液中加入NaBH4(5.0当量)。将混合物在5℃下搅拌5h。完全还原后，将反应混合物在THF与H2O之间进行分配，并将所得的有机相分离，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的中间体醇。
立即将所得中间体在DCM(10mL)中重构，然后在0℃下加入吡啶(2.0当量)和(4-硝基苯基)氯甲酸酯(2.0当量)。将混合物在0℃下搅拌5h。然后将反应混合物过滤并在减压下浓缩，得到粗制残余物，将所述粗制残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25–8.18(m,2H),7.38–7.28(m,2H),5.39–5.15(m,9H),4.80(tt,J＝7.1,4.3Hz,1H),4.25(dd,J＝12.0,4.3Hz,2H),4.13–4.04(m,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.40(dd,J＝8.3,6.6Hz,2H),2.33–2.19(m,4H),2.05–1.85(m,10H),1.67(ddt,J＝14.6,9.4,4.8Hz,1H),1.52(dddq,J＝32.6,26.2,13.2,6.6,6.1Hz,8H),1.37–1.17(m,30H),1.11(dt,J＝9.0,6.5Hz,2H),0.94–0.66(m,12H)。
化合物80：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)-9-甲基癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002591
使用实施例1所采用的方法，由中间体80e和(2-氨基乙基)(乙基)甲胺制备化合物80，产率为68％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.22(m,9H),4.76(s,1H),4.28(ddd,J＝12.0,4.5,1.5Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,4.7Hz,2H),3.37(s,3H),2.77(td,J＝6.0,1.3Hz,4H),2.39(ddd,J＝8.4,6.9,2.4Hz,2H),2.35–2.28(m,5H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.86(ddt,J＝37.3,14.4,7.1Hz,3H),1.77–1.38(m,12H),1.39–1.19(m,34H),1.15(d,J＝6.7Hz,3H),0.94–0.79(m,12H)。MS：929.9m/z[M+H]。
实施例81–化合物81
中间体81a：1-溴-6-甲基庚烷
Figure BDA0003132577440002601
在0℃下，向PPh3(66.97g，1.33当量)在DCM(300mL)中的溶液中加入Br2(1.33当量)。然后，一次性加入6-甲基庚-1-醇(1.0当量)。将混合物在0℃、N2气氛下搅拌2h。完成后，将反应混合物用H2O稀释，并将有机相分离。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。加入戊烷，并滤出沉淀的三苯基膦氧化物。将有机相在减压下浓缩，得到残余物，将所述残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(30g，81％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.41(td,J＝6.9,1.1Hz,2H),1.91–1.79(m,2H),1.59–1.49(m,1H),1.45–1.35(m,2H),1.34–1.25(m,3H),1.21–1.12(m,2H),0.86(dd,J＝6.6,1.1Hz,6H)。
中间体81b：(6-甲基庚基)溴化镁
Figure BDA0003132577440002602
在15℃下向Mg(4.53g，1.2当量)和I2(0.1当量)在THF(300mL)中的溶液中加入中间体81a(1.0当量)。将混合物在40℃、N2气氛下搅拌2h。没有进一步的后处理。将反应混合物直接用于下一步。在THF中获得作为灰色溶液的溴(6-甲基庚基)镁。
中间体81c：10-甲基-4-氧代癸酸乙酯
Figure BDA0003132577440002611
在-78℃下，向4-氯-4-氧代丁酸乙酯(25g，1.0当量)和CuI(1.0当量)在THF(200mL)中的溶液中加入中间体81b(1.0当量)。将混合物在-78℃、N2气氛下搅拌5h。然后将反应混合物用水稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层分离，用盐水洗涤2次，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(10g，27％)。1H NMR (400MHz,CDCl3)δ4.06(q,J＝7.1Hz,2H),2.64(t,J＝6.6Hz,2H),2.50(t,J＝6.7Hz,2H),2.37(t,J＝7.5Hz,2H),1.51(q,J＝7.5Hz,2H),1.43(dq,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.26–1.15(m,7H),1.14–1.04(m,2H),0.79(d,J＝6.6Hz,6H)。
中间体81d：10-甲基-4-氧代十一酸
Figure BDA0003132577440002612
将中间体81c(10g，1.0当量)和KOH(3.0当量)在EtOH(50mL)中的混合物脱气且用N2吹扫3次，并且然后将混合物在50℃、N2气氛下搅拌12h。将混合物浓缩以去除EtOH，然后用HCl(1M)调节至pH 5.5。然后将反应混合物用水稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层分离，用盐水洗涤2次，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈白色固体的产物(4g，45％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.65(t,J＝6.1Hz,2H),2.56(ddd,J＝7.1,5.9,1.2Hz,2H),2.37(t,J＝7.5Hz,2H),1.51(q,J＝7.3Hz,2H),1.42(dt,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.20(tt,J＝4.9,2.5Hz,4H),1.14–1.05(m,2H),0.79(d,J＝6.6Hz,6H)。
中间体81e：2-((10-甲基-4-氧代十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002621
使用中间体1d所采用的方法，由中间体81d和中间体1c合成中间体81e，产率为40％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.39–5.20(m,8H),5.17(ddd,J＝10.1,5.8,4.3Hz,1H),4.21(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.07(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),2.69(t,J＝6.4Hz,4H),2.64(t,J＝6.5Hz,2H),2.52(t,J＝6.5Hz,2H),2.36(t,J＝7.5Hz,2H),2.24(t,J＝7.5Hz,4H),1.97(q,J＝6.8Hz,8H),1.66–1.46(m,7H),1.33–1.13(m,35H),1.08(q,J＝6.9Hz,2H),0.84–0.77(m,12H)。
中间体81f：2-((10-甲基-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002622
在0℃下向中间体81e(6g，1.0当量)在THF(120mL)、甲苯(30mL)和H2O(60mL)中的溶液中加入NaBH4(5.0当量)。将混合物在5℃下搅拌5h。完全还原后，将反应混合物在THF与H2O之间进行分配，并将所得的有机相分离，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的中间体醇。
立即将所得中间体在DCM(10mL)中重构，然后在0℃下加入吡啶(2.0当量)和(4-硝基苯基)氯甲酸酯(2.0当量)。将混合物在0℃下搅拌1h。然后将反应混合物过滤并在减压下浓缩，得到粗制残余物，将所述粗制残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(4.3g，59％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.27–8.16(m,2H),7.37–7.29(m,2H),5.43–5.12(m,9H),4.80(s,1H),4.25(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14–4.06(m,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.40(t,J＝7.5Hz,2H),2.24(td,J＝7.5,4.1Hz,4H),2.05–1.88(m,9H),1.71–1.62(m,1H),1.62–1.47(m,6H),1.45–0.97(m,35H),0.89–0.66(m,12H)。
化合物81：2-((4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)-10-甲基十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002631
使用实施例1所采用的方法，由中间体81f和(2-氨基乙基)(乙基)甲胺制备化合物81，产率为85％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.21(m,9H),4.76(s,1H),4.33–4.23(m,2H),4.15(dt,J＝11.8,5.7Hz,2H),3.38(d,J＝40.4Hz,3H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.38(t,J＝7.7Hz,2H),2.32(td,J＝7.6,1.1Hz,5H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),1.96–1.78(m,3H),1.68–1.43(m,12H),1.43–1.20(m,36H),1.14(d,J＝6.6Hz,3H),0.93–0.80(m,12H)。MS：944.5m/z[M+H]。
实施例82–化合物82
化合物82：2-((9-甲基-4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002641
使用实施例1所采用的方法，由中间体80e和2-(吡咯烷-1-基)乙-1-胺合成化合物82，产率为86％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.87(s,1H),5.43–5.23(m,9H),4.76(s,1H),4.28(ddd,J＝12.0,4.5,2.6Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,4.6Hz,2H),3.52–3.42(m,2H),2.94(s,5H),2.82–2.75(m,4H),2.39(ddd,J＝8.4,6.9,2.0Hz,2H),2.36–2.29(m,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),2.01–1.76(m,7H),1.67–1.45(m,8H),1.40–1.21(m,33H),1.15(s,2H),0.93–0.81(m,12H)。MS：942.3m/z[M+H]。
实施例83–化合物83
化合物83：2-((10-甲基-4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十一酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002651
使用实施例1所采用的方法，由中间体81f和2-(吡咯烷-1-基)乙-1-胺合成化合物83，产率为87％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.99(s,1H),5.45–5.19(m,9H),4.76(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.5,3.2Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,4.7Hz,2H),3.50(d,J＝6.3Hz,2H),2.99(s,5H),2.81–2.73(m,4H),2.39(ddd,J＝8.2,6.9,1.8Hz,2H),2.35–2.28(m,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),2.02–1.77(m,7H),1.66–1.43(m,8H),1.41–1.20(m,35H),1.14(d,J＝6.7Hz,2H),0.95–0.81(m,12H)。MS：956.5m/z[M+H]。
实施例84–化合物84
化合物84：2-((4-(((1-甲基氮杂环丁烷-3-基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002652
使用实施例1所采用的方法，由中间体40d和1-甲基氮杂环丁烷-3-胺制备化合物84，产率为87％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.44–5.28(m,8H),5.23(p,J＝5.2Hz,1H),4.77(d,J＝7.0Hz,1H),4.46(s,1H),4.28(dt,J＝10.9,5.2Hz,2H),4.16(ddd,J＝8.7,5.6,2.8Hz,2H),3.99(s,2H),3.81(s,2H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),2.65(s,2H),2.40–2.29(m,6H),2.05(q,J＝7.0Hz,8H),1.93(dtd,J＝15.1,7.6,3.8Hz,1H),1.83(q,J＝7.4Hz,1H),1.66–1.44(m,7H),1.40–1.17(m,37H),0.88(q,J＝7.0Hz,9H)。MS：900.4m/z[M+H]。
实施例85–化合物85
中间体85a：4-羟基辛酸苄酯
Figure BDA0003132577440002661
向5-丁基四氢呋喃-2-酮(20g，1.0当量)在H2O(50mL)中的溶液中加入NaOH(5.63g，1.0当量)。将混合物在25℃下搅拌12h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩以去除H2O。
将所得残余物在DMF(100mL)中重构，然后加入BnBr(14.08g，1.0当量)。将混合物在25℃下搅拌2h。然后将反应混合物在减压下浓缩以去除DMF。将残余物用H2O(150mL)稀释，且用EtOAc萃取3次，经Na2SO4干燥并过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(15g，43％)。
中间体85b：4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)辛酸苄酯
Figure BDA0003132577440002662
在N2下，向中间体85a(15g，1.0当量)在DCM(150mL)中的混合物中加入(4-硝基苯基)氯甲酸酯(32.21g，5.0当量)，并且然后将吡啶(5.16mL，2.0当量)加入到混合物中。将反应混合物在20℃、N2气氛下搅拌1h。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。将残余物用己烷稀释并过滤。将滤液用H2O洗涤3次。将有机层用盐水洗涤1次，经Na2SO4干燥并过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(12g，48％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.31–8.17(m,2H),7.42–7.30(m,6H),5.13(s,2H),4.87(qd,J＝7.6,4.8Hz,1H),2.50(t,J＝7.4Hz,2H),2.11(dtd,J＝15.3,7.8,4.0Hz,1H),2.00(dt,J＝14.7,7.6Hz,1H),1.82–1.69(m,1H),1.63(ddt,J＝14.3,8.5,5.0Hz,1H),1.45–1.27(m,4H),1.01–0.83(m,3H)。
中间体85c：4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)辛酸苄酯
Figure BDA0003132577440002671
在0℃下，向中间体85b(4g，2.0当量)和2-吡咯烷-1-基乙胺(550mg，1.0当量)在MeCN(20mL)中的溶液中加入DMAP(59mg，0.1当量)，然后加入吡啶(1.17mL，3.0当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌12h。将反应混合物在减压下浓缩以去除MeCN(20mL)。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(1.8g，48％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32–7.23(m,5H),5.03(d,J＝10.2Hz,3H),4.69(s,1H),3.23(dq,J＝18.7,5.9Hz,3H),2.70(s,2H),2.60–2.40(m,7H),2.34(td,J＝8.3,7.6,2.7Hz,2H),1.87(d,J＝10.5Hz,1H),1.70(t,J＝3.8Hz,6H),1.44(d,J＝24.4Hz,2H),1.22(q,J＝11.9Hz,4H),0.80(t,J＝4.2Hz,3H)。
化合物85：2-((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002681
在Ar气氛下，向中间体85c(1.8g，1.0当量)在THF(9mL)中的溶液中加入Pd/C(0.5g，10％w/w)。将混合物用H2吹扫3次，并且然后将混合物在20℃、H2气氛(15Psi)下搅拌5h。将反应混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩以去除THF。
将所得粗制材料溶解在DCM(10mL)中，然后加入DMAP(65mg，0.16当量)、DIPEA(1.74mL，3.0当量)和EDCI(638mg，1.0当量)。然后，在0℃下加入中间体1c(2.05g，1.0当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌16h。将反应混合物在减压下浓缩以去除DCM。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取2次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(1.1g，50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.39–5.21(m,7H),5.18(p,J＝5.0Hz,1H),5.09(s,1H),4.76–4.65(m,1H),4.22(dd,J＝12.0,4.4Hz,2H),4.08(ddd,J＝11.9,5.9,3.4Hz,2H),3.21(q,J＝5.9Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.51(t,J＝6.1Hz,2H),2.43(d,J＝5.8Hz,4H),2.32(ddd,J＝8.9,6.6,3.9Hz,2H),2.25(t,J＝7.6Hz,4H),1.98(q,J＝6.9Hz,7H),1.91–1.66(m,6H),1.63–1.35(m,8H),1.25(tq,J＝7.2,4.6,3.6Hz,30H),0.82(t,J＝6.7Hz,9H)。MS：900.4m/z[M+H]。
实施例86–化合物86
中间体86a：1-壬酰基环丙烷-1-羧酸乙酯
Figure BDA0003132577440002691
在-78℃、N2下，向环丙烷-1,1-二羧酸二乙酯(15g，1.0当量)在THF(200mL)中的溶液中逐滴加入溴(辛基)镁(2M，40.28mL，1.0当量)的溶液。将反应混合物在-78℃、N2气氛下搅拌5h。将反应混合物倒入NH4Cl水溶液中。将水相用乙酸乙酯萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在真空中浓缩。将残余物用另一批通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(20g，48％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.13(q,J＝7.1Hz,2H),2.75(t,J＝7.4Hz,2H),1.57–1.49(m,2H),1.35(s,4H),1.21(dd,J＝8.7,5.5Hz,16H),0.81(t,J＝6.9Hz,6H)。
中间体86b：1-壬酰基环丙烷-1-羧酸
Figure BDA0003132577440002692
在N2下，向中间体86a(10g，1.0当量)在EtOH(60mL)和H2O(30mL)中的溶液中加入NaOH(2.36g，1.5当量)和LiOH(1.41g，1.5当量)。然后将混合物在20℃、N2气氛下搅拌12h。将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物。通过加入2N HCl来将残余物调节至pH＝3。然后将混合物在20℃、N2气氛下搅拌1h。将混合物用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在真空中浓缩。收集呈无色油状物的产物(5g，28％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.25(t,J＝7.3Hz,2H),1.96(q,J＝4.4Hz,2H),1.71(q,J＝4.4Hz,2H),1.64–1.55(m,2H),1.26(d,J＝3.7Hz,11H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。
中间体86c：2-((1-壬酰基环丙烷-1-羰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002701
在0℃下，向中间体86b(6g，1.0当量)、Int.1C(16.36g，1.0当量)、EDCI(6.10g，1.5当量)和DMAP(324mg，0.1当量)在DCM(60mL)中的溶液中加入Et3N(5.54mL，1.5当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌12h。然后将其倒入水中并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在真空中浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(8g，37％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.28(dtt,J＝15.4,10.8,5.8Hz,8H),4.26(dd,J＝12.1,4.1Hz,2H),4.08(dd,J＝12.0,6.1Hz,2H),2.76(t,J＝7.4Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.24(t,J＝7.6Hz,4H),1.98(q,J＝6.9Hz,8H),1.54(p,J＝7.0Hz,9H),1.43–1.33(m,4H),1.33–1.15(m,40H),0.85–0.79(m,9H)。
中间体86d：2-((1-(1-羟基壬基)环丙烷-1-羰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002702
将中间体86c(8g，1.0当量)在4:2:1THF/水/甲苯(0.05-0.1M)中的溶液冷却至0-5℃，然后加入NaBH4(5.0当量)。将反应在0-25℃下保持至少2h。然后将反应用水和EtOAc稀释，并将所得两相混合物用EtOAc萃取3次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗制材料通过柱色谱(EtOAc/己烷)纯化，以得到呈无色油状物的产物(4g，50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.33(tdq,J＝20.3,10.0,5.6,4.9Hz,9H),4.28(dt,J＝12.0,4.0Hz,2H),4.15(ddd,J＝12.1,8.0,6.0Hz,2H),3.18–3.12(m,1H),2.77(t,J＝6.4Hz,4H),2.68(s,1H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.05(q,J＝6.9Hz,8H),1.68–1.48(m,9H),1.40–1.16(m,43H),0.98(ddd,J＝10.7,6.7,4.1Hz,1H),0.93–0.84(m,9H),0.81(ddd,J＝9.7,6.8,4.2Hz,1H)。
中间体86e：2-((1-(1-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)壬基)环丙烷-1-羰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002711
在0℃下，向中间体86d(4g，1.0当量)在DCM(40mL)中的溶液中加入(4-硝基苯基)氯甲酸酯(1.95g，2.0当量)、吡啶(781uL，2.0当量)。然后将反应混合物在20℃、N2气氛下搅拌5h。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。将残余物在石油醚中重构并过滤。将滤液用H2O洗涤。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(2.8g，59％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25–8.16(m,2H),7.36–7.26(m,2H),5.27(tdd,J＝17.5,8.5,4.0Hz,9H),4.84(dd,J＝9.1,4.4Hz,1H),4.24(dt,J＝11.9,3.8Hz,2H),4.08(dd,J＝11.8,5.8Hz,2H),2.70(t,J＝6.3Hz,4H),2.23(t,J＝7.6Hz,4H),2.02–1.93(m,8H),1.82(qd,J＝9.4,4.9Hz,1H),1.69(ddt,J＝14.4,10.0,5.1Hz,1H),1.53(t,J＝7.2Hz,5H),1.35–1.16(m,41H),1.07–1.01(m,1H),0.95–0.89(m,1H),0.81(td,J＝6.8,3.8Hz,9H)。
化合物86：2-((1-(1-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)壬基)环丙烷-1-羰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002721
使用实施例1中采用的方法，由中间体86e和N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺合成化合物86，产率为90％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.53–5.22(m,9H),4.75(dd,J＝8.7,4.5Hz,1H),4.29(ddd,J＝22.5,11.8,4.3Hz,2H),4.14(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),3.30(s,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.54(d,J＝13.7Hz,4H),2.38–2.21(m,7H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),1.60(t,J＝7.4Hz,4H),1.40–1.17(m,40H),1.12–1.00(m,4H),0.91–0.85(m,9H)。MS：956.1m/z[M+H]。
实施例87–化合物87
中间体87a：5-羟基-1-甲基-5-辛基吡咯烷-2-酮
Figure BDA0003132577440002722
在15℃、N2下，向1-甲基吡咯烷-2,5-二酮(20g，1.0当量)在THF(150mL)中的溶液中逐滴加入溴(辛基)镁(1M，265mL，1.5当量)。将混合物在15℃、N2下搅拌12h。在0℃下通过加入NH4Cl将反应混合物淬灭。然后将其用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈白色固体的产物(20g，50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.75(s,1H),2.68(s,3H),2.43(ddd,J＝16.4,10.0,6.4Hz,1H),2.24(ddd,J＝16.7,10.0,4.5Hz,1H),2.13(ddd,J＝13.6,10.0,6.4Hz,1H),1.93(ddd,J＝14.0,10.0,4.7Hz,1H),1.73(td,J＝13.4,3.7Hz,1H),1.65–1.53(m,1H),1.35–1.07(m,12H),0.88–0.76(m,3H)。
中间体87b：4-羟基-N-甲基十二酰胺
Figure BDA0003132577440002731
向中间体87a(15g，1.0当量)在MeOH(150mL)中的溶液中分批加入NaBH4(4.99g，2.0当量)。将混合物在15℃下搅拌1h。在0℃下通过加入NH4Cl将反应混合物淬灭，并且然后将其用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈白色固体的产物(8g，53％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.93(s,1H),3.60–3.50(m,1H),3.11(s,1H),2.73(d,J＝4.8Hz,3H),2.36–2.20(m,2H),1.78(dddd,J＝14.3,7.7,6.5,3.1Hz,1H),1.58(ddt,J＝13.8,8.9,6.7Hz,1H),1.46–1.09(m,14H),0.87–0.77(m,3H)。
中间体87c：(R)-4-羟基-N-甲基十二酰胺
Figure BDA0003132577440002732
向中间体87b(1.0当量)在Et2O(0.2-1M)中的溶液中加入Novozym 435(0.89当量)和乙酸乙烯酯(2.0当量)。将混合物在40℃下搅拌96h。将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物，将所述残余物通过柱色谱纯化。使从柱中收集的材料再经受三次以上的反应条件，以得到呈黄色固体的(R)-88c(24％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.57(s,1H),3.54(tt,J＝7.7,3.6Hz,1H),2.74(d,J＝4.8Hz,3H),2.64(d,J＝4.6Hz,1H),2.28(td,J＝6.9,3.2Hz,2H),1.79(dtd,J＝14.3,7.0,3.1Hz,1H),1.60(ddd,J＝14.3,8.8,6.8Hz,2H),1.47–1.12(m,14H),0.87–0.74(m,3H)。
中间体87d：(R)-5-辛基二氢呋喃-2(3H)-酮
Figure BDA0003132577440002741
向中间体87d(1.0当量)在MeOH(0.1-1.0M)中的溶液中加入NaOH(10当量)。将混合物在80℃下搅拌至少2h，此后加入HCl(1-2M，10.0当量)，并将混合物在25℃下搅拌1h。然后将反应混合物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.41(p,J＝6.9Hz,1H),2.46(dd,J＝9.5,6.8Hz,2H),2.25(dq,J＝13.4,6.7Hz,1H),1.78(dq,J＝12.7,9.3Hz,1H),1.72–1.62(m,1H),1.60–1.47(m,1H),1.45–1.10(m,14H),0.81(t,J＝6.6Hz,3H)。
中间体87e：(R)-4-羟基十二酸
Figure BDA0003132577440002742
向中间体87d(1.0当量)在H2O(0.1–0.5M)中的溶液中加入NaOH(1.0–1.5当量)。将混合物在20℃下搅拌至少12h。将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物。残余物无需额外纯化即可直接用于下一步。
中间体88f：(R)-4-羟基十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002743
向中间体87e(1.0当量)在丙酮(0.3M)中的溶液中加入BnBr(1.0–1.5当量)和TBAB(0.05当量)。将混合物在60℃下搅拌至少12h。将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物。将残余物(1)通过柱色谱纯化，或(2)用饱和NaHCO3稀释，用EtOAc萃取3次，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，然后通过柱色谱纯化。两种方法均获得呈黄色油状物的产物(54％产率)。
中间体87g：(R)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002751
在0-20℃下，向中间体87f(1.0当量)和(4-硝基苯基)氯甲酸酯(3.0当量)在DCM(0.3–1.2M)中的溶液中加入吡啶(3.0当量)。将混合物在20℃下搅拌至少1h。将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物。将残余物(1)通过柱色谱纯化，或(2)无需额外纯化即可用于下一步。收集呈淡黄色油状物的产物(36％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.22–8.13(m,2H),7.29(d,J＝2.0Hz,2H),5.06(s,2H),4.80(tt,J＝7.6,4.5Hz,1H),2.43(t,J＝7.5Hz,2H),2.04(ddt,J＝15.3,7.8,3.9Hz,1H),1.92(dq,J＝14.8,7.4Hz,1H),1.71–1.61(m,1H),1.55(ddd,J＝14.3,9.1,5.2Hz,1H),1.36–1.13(m,11H),0.81(t,J＝6.6Hz,3H)。
中间体87h：(R)-4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002752
向中间体87g(1.0当量)和N'-乙基-N'-甲基-乙烷-1,2-二胺(3.0当量)在MeCN(0.1–0.2M)中的溶液中加入吡啶(3.0当量)和DMAP(1.0当量)。将混合物在20℃下搅拌12h。然后将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.60–7.23(m,5H),5.04(s,2H),4.77–4.64(m,1H),3.15(t,J＝6.0Hz,2H),2.36(ddt,J＝12.3,8.2,4.3Hz,5H),2.13(s,3H),1.96–1.70(m,3H),1.55–1.33(m,2H),1.29–1.10(m,13H),0.96(t,J＝7.1Hz,3H),0.80(t,J＝6.7Hz,4H)。
化合物87：2-(((R)-4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002761
向中间体87h(1.0当量)在THF(0.1–0.3M)中的溶液中加入Pd/C(10％w/w，1.0当量)。将混合物在15-20℃、H2(15Psi)下搅拌5h。完成后，将反应混合物过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
向残余物和中间体1c(1.0当量)在DCM(10mL)中的溶液中加入EDCI(1.0当量)、DMAP(0.1当量)和Et3N(1.05当量)。将混合物在15-20℃下搅拌至少12h。将反应混合物在减压下浓缩以去除DCM。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈淡黄色油状物的产物(61％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.40–5.14(m,8H),5.08(s,1H),4.69(s,1H),4.21(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.08(ddd,J＝12.0,5.9,3.3Hz,2H),3.17(q,J＝6.0Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.43–2.28(m,5H),2.24(t,J＝7.6Hz,4H),2.14(s,3H),1.98(q,J＝6.8Hz,7H),1.79(ddd,J＝42.6,15.1,7.5Hz,3H),1.53(q,J＝7.6Hz,8H),1.33–1.06(m,37H),0.97(t,J＝7.1Hz,3H),0.81(q,J＝6.3Hz,9H)。MS：944.1m/z[M+H]。
实施例88–化合物88
中间体88a：(S)-1-(甲基氨基)-1-氧代十二烷-4-基乙酸酯
Figure BDA0003132577440002771
使用中间体87c所采用的方法，由中间体87b合成中间体88a，产率为23％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.81(s,1H),4.79(tq,J＝8.5,3.8Hz,1H),2.73(d,J＝4.8Hz,3H),2.17–2.03(m,2H),1.98(s,3H),1.95–1.63(m,3H),1.56–1.36(m,2H),1.19(d,J＝8.4Hz,11H),0.81(t,J＝6.8Hz,3H)。
中间体88b：(S)-5-辛基二氢呋喃-2(3H)-酮
Figure BDA0003132577440002772
使用中间体87d所采用的方法，由中间体88a制备中间体88b。
中间体88c：(S)-4-羟基十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002773
使用中间体87e和87f所采用的方法，由中间体88b制备中间体88c。
中间体88d：(S)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002781
使用中间体88g所采用的方法，由中间体88c制备中间体88d。
中间体88e：(S)-4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002782
使用中间体87h所采用的方法，由中间体88e合成中间体88e，产率为47％。
化合物88：2-(((S)-4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002783
使用化合物87中采用的方法，由中间体88d合成化合物88，产率为42％。
实施例89–化合物89
中间体89a：4-羟基-N-甲基癸酰胺
Figure BDA0003132577440002791
在0℃、N2下，向甲胺盐酸盐(19.83g，2.0当量)在DCM(250mL)中的混合物中逐滴加入AlMe3(2M，152.72mL，2.08当量)。将混合物在0℃、N2气氛下搅拌2h。然后在N2下将此溶液逐滴加入到5-己基四氢呋喃-2-酮(25g，1.0当量)在DCM(100ml)中的溶液中。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌12h。在0℃下通过加入HCl(1N)将反应混合物淬灭。将有机层分离并将水层用DCM萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤3次，用无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈白色固体的产物(67％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.50(td,J＝7.7,3.8Hz,1H),2.70(s,3H),2.29(ddt,J＝25.9,16.6,6.8Hz,2H),1.77(dddd,J＝13.3,9.2,6.8,3.9Hz,1H),1.66–1.55(m,1H),1.42(h,J＝4.0Hz,3H),1.39–1.25(m,8H),0.95–0.87(m,3H)。
中间体89b：(S)-1-(甲基氨基)-1-氧代癸烷-4-基乙酸酯
Figure BDA0003132577440002792
使用中间体87c中采用的方法合成中间体89b，产率为23％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.70(s,1H),4.79(tt,J＝8.4,4.4Hz,1H),2.74(d,J＝4.8Hz,3H),2.11(dp,J＝21.3,7.7,7.2Hz,2H),1.98(s,3H),1.86(tdd,J＝13.6,6.7,3.2Hz,1H),1.81–1.70(m,1H),1.45(ddp,J＝19.0,13.6,6.6,6.1Hz,2H),1.27–1.12(m,8H),0.80(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体89c：(S)-5-己基二氢呋喃-2(3H)-酮
Figure BDA0003132577440002801
使用中间体87d中采用的方法，由中间体89b合成中间体89c，产率为78％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.48(ddd,J＝13.7,7.5,5.6Hz,1H),2.52(dd,J＝9.5,6.9Hz,2H),2.31(dq,J＝13.4,6.7Hz,1H),1.91–1.80(m,1H),1.80–1.68(m,1H),1.58(dq,J＝13.8,5.2Hz,1H),1.51–1.21(m,8H),0.87(t,J＝6.6Hz,3H)。
中间体89d：(S)-4-羟基癸酸苄酯
Figure BDA0003132577440002802
在N2下，向中间体89c(3g，1.0当量)在EtOH(25mL)和H2O(5mL)中的溶液中加入NaOH(1.1当量)。然后将混合物在20℃、N2气氛下搅拌12h。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。
使所得残余物按照中间体87f中采用的方法，以得到呈无色油状物的产物(3g，50％)。
中间体89e：(S)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)癸酸苄酯
Figure BDA0003132577440002803
在N2下，向中间体89d(3g，1.0当量)在DCM(30mL)中的溶液中加入(4-硝基苯基)氯甲酸酯(3.26g，1.5当量)。然后在0℃下将吡啶(1.74mL，2.0当量)加入到混合物中。将反应混合物在20℃、N2气氛下搅拌1h。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂，得到残余物。将残余物用己烷稀释并过滤。将滤液用H2O洗涤3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(2g，42％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.23–8.13(m,2H),7.37–7.18(m,7H),5.39(s,1H),5.03(s,2H),4.47(s,1H),4.00(q,J＝7.1Hz,2H),2.42(t,J＝7.1Hz,2H),2.00(ddt,J＝15.0,7.6,3.8Hz,1H),1.85(dt,J＝14.7,7.3Hz,1H),1.57(ddt,J＝21.1,14.0,6.8Hz,2H),1.35–1.16(m,8H),0.91–0.75(m,3H)。
中间体89f：(S)-4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)癸酸苄酯
Figure BDA0003132577440002811
在N2下，向中间体89e(1.5g，1.0当量)在MeCN(15mL)中的溶液中加入2-吡咯烷-1-基乙胺(1.16g，3.0当量)、吡啶(819uL，3.0当量)、DMAP(413mg，1.0当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌5h。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。将残余物用EtOAc稀释，并用1NNaHCO3洗涤5次，且用H2O洗涤3次。将有机层经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈淡黄色油状物的产物(0.65g，41％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41–7.26(m,5H),5.11(d,J＝1.1Hz,2H),4.73(dd,J＝10.9,5.7Hz,1H),3.26(dd,J＝6.7,1.7Hz,2H),2.79–2.57(m,7H),2.41(t,J＝7.4Hz,2H),1.99–1.74(m,7H),1.53(s,3H),1.36–1.24(m,9H),0.92–0.86(m,3H)。
化合物89：2-(((S)-4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002821
向Pd/C(10％w/w，1.0–3.0当量)在THF(0.2–0.5M)中的悬浮液中加入中间体89f(1.0当量)。将混合物在15-25℃、H2气氛下搅拌至少5h。将反应混合物过滤并将滤液浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈粘稠棕色油状物的产物。
在0℃、N2下，立即将棕色油状物在DCM(0.2–0.5M)中重构，然后加入中间体1c(1.0当量)、EDCI(1.2当量)、DMAP(0.1–0.2当量)和Et3N(1.5当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌至少12h。将混合物用H2O稀释，且用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(23％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.49–5.22(m,8H),5.18(t,J＝5.0Hz,1H),5.08(s,1H),4.69(s,1H),4.22(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.12–4.04(m,2H),3.28–3.15(m,2H),2.70(t,J＝6.5Hz,4H),2.50(d,J＝6.4Hz,2H),2.44(s,3H),2.32(s,2H),2.25(t,J＝7.6Hz,4H),1.98(q,J＝6.9Hz,8H),1.83(s,1H),1.70(s,5H),1.38–0.94(m,37H),0.81(q,J＝6.6Hz,9H)。MS：928.4m/z[M+H]。
实施例90–化合物90
中间体90a：(R)-4-羟基癸酸苄酯
Figure BDA0003132577440002831
使用中间体89d中采用的方法，由(5R)-5-己基四氢呋喃-2-酮合成中间体90a，产率为27％。
中间体90b：(R)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)癸酸苄酯
Figure BDA0003132577440002832
使用中间体89e中采用的方法，由中间体90a合成中间体90b，产率为57％。
中间体90c：(R)-4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)癸酸苄酯
Figure BDA0003132577440002833
使用中间体89f中采用的方法，由中间体90b合成中间体90c，产率为47％。
化合物90：2-(((R)-4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002841
使用化合物89中采用的方法，由中间体90c合成化合物90，产率为27％。
实施例91–化合物91
中间体91a：4-羟基十二酸
Figure BDA0003132577440002842
向5-辛基四氢呋喃-2-酮(20g，1.0当量)在H2O(200mL)中的溶液中加入NaOH(4.03g，1.0当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌12h。将反应混合物在减压下浓缩，以去除H2O。这样得到呈白色固体的粗制产物(14g，65％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ3.55(ddd,J＝9.5,7.5,4.6Hz,1H),2.19(qdd,J＝15.0,9.3,6.3Hz,2H),1.69(dddd,J＝13.9,9.4,6.4,4.4Hz,1H),1.59(dddd,J＝14.0,9.2,7.7,6.4Hz,1H),1.46–1.30(m,3H),1.23(d,J＝6.6Hz,11H),0.86–0.77(m,3H)。
中间体91b：4-羟基十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002843
向中间体91a(10g，1.0当量)在DMF(100mL)中的溶液中加入BnBr(7.91g，1.0当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌2h。将混合物用H2O稀释，且用EtOAc萃取2次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(5.7g，40％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46–7.28(m,5H),5.12(s,2H),3.61(h,J＝4.6Hz,1H),2.51(td,J＝7.3,2.9Hz,2H),1.86(dtd,J＝14.6,7.4,3.5Hz,1H),1.76–1.59(m,3H),1.42(q,J＝12.1,9.1Hz,4H),1.28(d,J＝11.9Hz,12H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H)。
中间体91c：4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002851
在0℃下，向中间体91b(10g，1.0当量)和(4-硝基苯基)氯甲酸酯(9.87g，1.05当量)在DCM(100mL)中的溶液中加入吡啶(3.95mL，1.5当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌1h。将反应混合物在减压下浓缩以去除DCM。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(7.5g，49％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.30–8.21(m,2H),7.48–7.26(m,7H),5.22(d,J＝69.6Hz,2H),4.87(tt,J＝7.5,4.5Hz,1H),2.59–2.42(m,2H),1.80–1.57(m,2H),1.52–1.16(m,13H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H)。
中间体91d：4-(((2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002861
在0℃下，向中间体91c(1.0当量)在MeCN(0.1–0.5M)中的溶液中加入二胺或氨基醇(N',N'-二甲基乙烷-1,2-二胺(2.0-3.0当量))、吡啶(3.0当量)和DMAP(0.1当量)。将混合物在15-25℃下搅拌至少2h。完成后，将反应混合物在减压下浓缩，用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层浓缩，得到残余物，将所述残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(79％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46–7.28(m,5H),5.08(s,1H),4.76(s,1H),3.23(q,J＝5.9Hz,2H),2.40(ddt,J＝12.0,8.9,4.5Hz,4H),2.21(s,7H),1.94(d,J＝9.9Hz,1H),1.82(p,J＝7.6Hz,1H),1.61–1.40(m,3H),1.39–1.16(m,14H),0.87(t,J＝6.7Hz,3H)。
化合物91：2-((4-(((2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002862
向中间体91d在THF(0.1–0.5M)中的溶液中加入Pd/C(10％w/w)。将混合物在25℃、15Psi的H2气氛下搅拌至少5h。将所得产物在THF中稀释并过滤以去除固体。将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈棕色油状物的羧酸中间体。
随后使用中间体90f中采用的方法，由所得油状物合成化合物91，产率为15％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.26(m,8H),5.27–5.20(m,1H),5.12(s,1H),4.75(s,1H),4.28(ddd,J＝11.9,4.5,1.3Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,3.4Hz,2H),3.24(q,J＝5.7Hz,2H),2.77(t,J＝6.7Hz,4H),2.44–2.35(m,4H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.22(s,6H),2.04(q,J＝6.9Hz,8H),1.97–1.84(m,2H),1.80(dt,J＝14.9,7.7Hz,1H),1.67–1.42(m,8H),1.42–1.14(m,39H),0.88(td,J＝6.8,5.2Hz,9H)。MS：930.4m/z[M+H]。
实施例92–化合物92
中间体92a：4-((((1-甲基哌啶-4-基)氧基)羰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002871
使用中间体91d中采用的方法，由中间体91c和1-甲基哌啶-4-醇合成中间体92a，产率为94％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39–7.28(m,5H),5.11(s,2H),4.73(dtd,J＝11.8,5.4,4.6,2.7Hz,1H),4.62(tt,J＝8.6,4.2Hz,1H),2.68(s,2H),2.48–2.37(m,2H),2.29(s,5H),2.01–1.84(m,4H),1.78(dtt,J＝12.5,8.2,3.5Hz,2H),1.67–1.58(m,1H),1.58–1.46(m,1H),1.27(d,J＝15.6Hz,13H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物92：2-((4-((((1-甲基哌啶-4-基)氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002881
使用化合物91中采用的方法，由中间体92a合成化合物92，产率为28％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.39–5.21(m,8H),5.21–5.16(m,1H),4.65(d,J＝6.9Hz,1H),4.57–4.52(m,1H),4.22(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.08(ddd,J＝11.9,5.8,4.1Hz,2H),2.70(t,J＝6.5Hz,4H),2.61(s,2H),2.36–2.29(m,2H),2.29–2.18(m,7H),2.14(s,2H),1.98(q,J＝6.8Hz,8H),1.93–1.84(m,4H),1.83–1.77(m,1H),1.77–1.65(m,3H),1.54(t,J＝7.3Hz,13H),1.33–1.12(m,41H),0.81(td,J＝6.9,5.3Hz,9H)。MS：957.4m/z[M+H]。
实施例93–化合物93
中间体93a：4-(((2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002882
使用中间体92d中采用的方法，由中间体91c和2-(氮杂环丁烷-1-基)乙胺合成中间体93a，产率为80％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49–7.26(m,5H),5.11(s,2H),5.04(s,1H),4.74(s,1H),3.20(t,J＝7.0Hz,4H),3.11(q,J＝5.8Hz,2H),2.50(t,J＝5.9Hz,2H),2.41(ddd,J＝8.6,6.7,3.2Hz,2H),2.10–2.00(m,2H),1.96–1.88(m,1H),1.82(d,J＝15.4Hz,4H),1.46(d,J＝6.9Hz,3H),1.34–1.18(m,14H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物93：2-((4-(((2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002891
使用化合物91中采用的方法，由中间体93a合成化合物93，产率为18％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.36–5.22(m,8H),5.18(p,J＝5.0Hz,1H),4.98(t,J＝5.6Hz,1H),4.68(s,1H),4.22(ddd,J＝11.9,4.5,1.6Hz,2H),4.08(ddq,J＝11.7,5.8,2.8Hz,2H),3.12(t,J＝7.0Hz,4H),3.05(q,J＝5.9Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.43(t,J＝5.9Hz,2H),2.31(ddd,J＝8.8,6.6,4.2Hz,2H),2.25(t,J＝7.6Hz,4H),1.99(dq,J＝10.0,6.9Hz,10H),1.88–1.68(m,3H),1.59–1.36(m,7H),1.34–1.11(m,42H),0.86–0.77(m,9H)。MS：942.1m/z[M+H]。
实施例94–化合物94
中间体94a：4-(((2-(哌啶-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002892
使用中间体91d中采用的方法，由中间体91c和2-(哌啶-1-基)乙-1-胺合成中间体94a，产率为68％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38–7.28(m,5H),5.10(s,3H),4.75(s,1H),3.22(t,J＝6.0Hz,2H),2.64(s,1H),2.45–2.29(m,8H),1.99–1.88(m,1H),1.82(dq,J＝15.0,8.0Hz,1H),1.48(dt,J＝53.9,5.8Hz,9H),1.34–1.17(m,12H),0.86(t,J＝6.7Hz,3H)。
化合物94：2-((4-(((2-(哌啶-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002901
使用化合物91中采用的方法，由中间体94a合成化合物94，产率为22％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.29(qq,J＝11.7,6.7Hz,8H),5.18(p,J＝5.1Hz,1H),5.08(s,1H),4.69(s,1H),4.22(ddd,J＝11.9,4.5,2.2Hz,2H),4.08(ddd,J＝11.9,5.9,3.6Hz,2H),3.18(q,J＝5.9Hz,2H),2.70(t,J＝6.5Hz,4H),2.39–2.18(m,12H),1.98(q,J＝6.9Hz,8H),1.91–1.79(m,1H),1.79–1.68(m,1H),1.61–1.33(m,15H),1.33–1.10(m,42H),0.81(q,J＝6.4Hz,9H)。MS：970.2m/z[M+H]。
实施例95–化合物95
中间体95a：4-(((4-(二乙基氨基)丁氧基)羰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002911
使用中间体92d中采用的方法，由中间体91c和4-(二乙基氨基)丁-1-醇合成中间体95a，产率为83％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44–7.28(m,5H),5.11(s,2H),4.72(tdd,J＝7.6,5.4,4.0Hz,1H),4.11(td,J＝6.7,3.8Hz,2H),2.49(q,J＝7.1Hz,4H),2.42(dtd,J＝7.7,5.1,4.4,2.5Hz,4H),1.99(dddd,J＝14.4,8.9,7.0,4.1Hz,1H),1.89(dtd,J＝14.7,8.4,6.5Hz,1H),1.64(ddt,J＝17.4,10.5,6.2Hz,3H),1.56–1.46(m,3H),1.34–1.21(m,13H),1.00(t,J＝7.1Hz,6H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物95：2-((4-(((4-(二乙基氨基)丁氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002912
使用化合物91中采用的方法，由中间体95a制备化合物95，产率为27％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(qdd,J＝10.6,4.4,1.7Hz,8H),5.27–5.22(m,1H),4.71(tt,J＝7.6,2.7Hz,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.13(dtt,J＝10.4,6.6,3.7Hz,4H),2.76(t,J＝6.6Hz,4H),2.50(q,J＝7.2Hz,4H),2.41(ddd,J＝15.2,8.0,6.4Hz,4H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.04(q,J＝6.8Hz,8H),1.98–1.82(m,3H),1.72–1.47(m,12H),1.39–1.21(m,42H),1.00(t,J＝7.1Hz,6H),0.88(td,J＝6.8,4.8Hz,9H)。MS：987.5m/z[M+H]。
实施例96–化合物96
中间体96a：4-(((2-(二乙基氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酸苄酯
Figure BDA0003132577440002921
使用中间体91d中采用的方法，由中间体91c和N',N'-二乙基乙烷-1,2-二胺合成中间体96a，产率为58％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39–7.28(m,5H),5.19(s,1H),5.11(s,2H),4.76(s,1H),3.51(s,2H),3.27–3.15(m,2H),2.54(dd,J＝8.7,5.9Hz,6H),2.41(ddd,J＝9.0,6.9,2.6Hz,2H),1.94(d,J＝7.5Hz,1H),1.83(p,J＝7.3Hz,1H),1.63–1.40(m,3H),1.35–1.17(m,13H),1.01(t,J＝7.1Hz,6H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物96：2-((4-(((2-(二乙基氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002922
使用化合物91中采用的方法，由中间体96a制备化合物96，产率为42％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.29(qq,J＝11.4,6.5Hz,8H),5.18(p,J＝5.2Hz,1H),5.08(s,1H),4.69(s,1H),4.21(ddd,J＝11.8,4.5,2.0Hz,2H),4.08(ddd,J＝12.0,5.9,2.7Hz,2H),3.12(dt,J＝13.0,6.3Hz,2H),2.70(t,J＝6.5Hz,4H),2.45(q,J＝7.3Hz,6H),2.28(dt,J＝27.2,8.0Hz,6H),1.98(q,J＝6.9Hz,8H),1.83(s,1H),1.78–1.68(m,1H),1.54(t,J＝7.2Hz,9H),1.35–1.11(m,42H),0.81(q,J＝6.3Hz,9H)。MS：958.4m/z[M+H]。
实施例97–化合物97
化合物97：2-((5-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十三酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002931
使用化合物52所采用的方法，由中间体55d和中间体1c制备化合物96，产率为75％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.28(m,8H),5.27–5.22(m,1H),5.12(d,J＝5.7Hz,1H),4.76–4.67(m,1H),4.28(dt,J＝11.9,4.5Hz,2H),4.13(ddd,J＝12.0,5.9,4.5Hz,2H),3.23(h,J＝7.2,6.2Hz,2H),2.76(t,J＝6.6Hz,4H),2.43(dt,J＝14.5,6.6Hz,4H),2.35–2.27(m,6H),2.19(s,3H),2.04(q,J＝6.8Hz,8H),1.71–1.46(m,13H),1.40–1.19(m,42H),1.03(t,J＝7.1Hz,3H),0.92–0.83(m,9H)。MS：958.5m/z[M+H]。
实施例98
中间体98a：2,2-二甲基-3-氧代癸酸乙酯
Figure BDA0003132577440002941
在-78℃、N2下，向N-异丙基丙-2-胺(20.0mL，1.0当量)在THF(1-3M)中的溶液中加入n-BuLi(2.5M，56.60mL，1.0当量)。将混合物在-78℃下搅拌20min。然后在-78℃下加入2-甲基丙酸乙酯(18.96mL，1.0当量)。将混合物在-78℃下再搅拌20min。将THF(200mL)中的壬酰氯(26.60mL，1.0当量)逐滴加入到上述溶液中。使混合物温热至15℃，并在15℃、N2气氛下搅拌12h。通过加入冰水将反应混合物淬灭，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将有机相分离，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(15g，41％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.11(q,J＝7.2Hz,2H),2.36(t,J＝7.3Hz,2H),1.56–1.46(m,2H),1.28(s,6H),1.25–1.13(m,13H),0.80(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体98b：2,2-二甲基-3-氧代十一酸
Figure BDA0003132577440002942
将中间体98a(15g，1.0当量)、LiOH(2.10g，1.5当量)、KOH(4.92g，1.5当量)在EtOH(120mL)和H2O(40mL)中的混合物脱气且用N2吹扫3次，并且然后将混合物在40℃、N2气氛下搅拌3h。将混合物浓缩以去除EtOH。然后，用HCl(1M)将pH调节至5-6。将混合物在H2O与EtOAc之间进行分配。将有机相分离，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(5g，37％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ2.46(t,J＝7.3Hz,2H),1.58–1.47(m,2H),1.33(s,6H),1.20(s,10H),0.81(t,J＝6.6Hz,3H)。
实施例99–化合物99
中间体99a：2-(((2,2-二甲基-3-氧代十一酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002951
在0℃下，向中间体53a(12.16g，1.1当量)在THF(20mL)中的溶液中加入中间体98b(4g，1.0当量)、DBAD(8.07g，2.0当量)和PPh3(9.19g，2.0当量)。将混合物在0℃下搅拌15min。然后将混合物在15℃、N2气氛下搅拌16h。将反应混合物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将有机相分离，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(3g，20％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.27(dtt,J＝10.8,8.7,6.1Hz,8H),4.10(d,J＝6.0Hz,2H),4.03(d,J＝6.0Hz,4H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.37(t,J＝7.3Hz,2H),2.23(t,J＝7.6Hz,4H),1.98(q,J＝6.8Hz,8H),1.52(tt,J＝14.2,7.4Hz,8H),1.31–1.17(m,46H),0.85–0.77(m,12H)。
中间体99b：2-(((3-羟基-2,2-二甲基十一酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002952
在0℃下，向中间体99a(1.0当量)在4:2:1THF:H2O:甲苯(0.025–0.1中的溶液中加入NaBH4(5.0当量)。将混合物在15℃、N2气氛下搅拌5h。将反应混合物在THF与H2O之间进行分配，并将有机相在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(33％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.41–5.25(m,8H),4.20–4.07(m,7H),3.63(dd,J＝10.2,6.7Hz,1H),2.76(t,J＝6.4Hz,4H),2.40(t,J＝6.0Hz,2H),2.30(t,J＝7.6Hz,4H),2.04(q,J＝6.8Hz,8H),1.59(q,J＝7.3Hz,6H),1.40–1.22(m,40H),1.16(d,J＝4.5Hz,6H),0.88(td,J＝6.8,4.0Hz,9H)。
中间体99c：2-(((2,2-二甲基-3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十一酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002961
在0℃、N2下，向中间体99b(1g，1.0当量)和(4-硝基苯基)氯甲酸酯(478mg，2.0当量)在DCM(10mL)中的溶液中加入吡啶(191uL，2.0当量)。将混合物在15-25℃、N2气氛下搅拌5h。将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(0.8g，67％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.20(d,J＝8.8Hz,2H),7.30(d,J＝8.9Hz,2H),5.29(dq,J＝13.1,7.1,6.1Hz,8H),5.03(dd,J＝10.4,2.3Hz,1H),4.08(dd,J＝6.0,2.5Hz,6H),2.69(t,J＝6.4Hz,4H),2.35(p,J＝6.0Hz,1H),2.23(q,J＝8.4,7.7Hz,4H),1.97(q,J＝6.9Hz,8H),1.53(h,J＝7.1,5.9Hz,8H),1.36–1.12(m,56H),0.85–0.77(m,12H)。
化合物99：2-(4,4,11-三甲基-5-辛基-3,7-二氧代-2,6-二氧杂-8,11-二氮杂十三烷基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002971
在0℃下，向中间体99c(1.0当量)在MeCN(0.1M)中的溶液中加入二胺(N'-乙基-N'-甲基-乙烷-1,2-二胺(3.0当量))、DMAP(1.0当量)和吡啶(3.0当量)。将混合物在15℃、N2气氛下搅拌至少2h。将反应混合物在减压下浓缩，得到残余物。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将有机相分离，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(66％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.28(pt,J＝11.5,5.8Hz,8H),4.90(t,J＝6.4Hz,1H),4.11–4.02(m,5H),3.17(dt,J＝13.4,7.3Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.37(dq,J＝12.3,6.2Hz,5H),2.23(t,J＝7.6Hz,4H),2.14(s,3H),1.98(q,J＝6.8Hz,7H),1.54(p,J＝6.8Hz,4H),1.37–1.06(m,49H),0.97(t,J＝7.1Hz,3H),0.81(q,J＝6.9Hz,9H)。MS：973.5m/z[M+H]。
实施例100–化合物100
中间体100a：2,2-二甲基-3-氧代壬酸乙酯
Figure BDA0003132577440002972
使用中间体99a中采用的方法，由N-异丙基丙-2-胺、2-甲基丙酸乙酯和庚酰氯合成中间体100a，产率为26％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.14(q,J＝7.1Hz,2H),2.40(t,J＝7.3Hz,2H),1.60–1.47(m,2H),1.36–1.14(m,13H),0.84(t,J＝6.8Hz,3H)。
中间体100b：2,2-二甲基-3-氧代壬酸
Figure BDA0003132577440002981
在40℃、N2气氛下，将中间体100a(20g，1.0当量)、LiOH(3.15g，1.5当量)、KOH(7.37g，1.5当量)在EtOH(6mL)和H2O(2mL)中的混合物搅拌4h。将混合物浓缩以去除EtOH。然后，用HCl(1M)将pH调节至5-6。将混合物在H2O与EtOAc之间进行分配，并用EtOAc萃取2次。将有机相分离，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(6g，34％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.53(t,J＝7.3Hz,2H),1.58(p,J＝7.2Hz,2H),1.40(s,6H),1.34–1.23(m,6H),0.92–0.81(m,3H)。
中间体100c：2-(((2,2-二甲基-3-氧代壬酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002982
在0℃下，向中间体1c(19.06g，1.1当量)在THF(50mL)中的溶液中加入PPh3(14.41g，2.0当量)和DBAD(12.65g，2.0当量)以及中间体100b(5.5g，1.0当量)。将混合物在0℃下搅拌20min，并使混合物温热至15℃，并在15℃、N2气氛下搅拌16小时。将反应混合物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将有机相分离，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(4g，18％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.28(tt,J＝11.1,5.4Hz,8H),4.10(d,J＝6.0Hz,2H),4.05(dd,J＝10.4,6.0Hz,4H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.34(dt,J＝17.5,6.6Hz,3H),2.23(t,J＝7.6Hz,4H),1.98(q,J＝6.8Hz,8H),1.61–1.44(m,8H),1.39(d,J＝14.2Hz,3H),1.35–1.14(m,41H),0.85–0.76(m,9H)。
中间体100d：2-(((3-羟基-2,2-二甲基壬酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440002991
在0℃下，向中间体100c(1.0当量)在4:2:1THF:H2O:甲苯(0.025–0.1中的溶液中加入NaBH4(5.0当量)。将混合物在5℃、N2气氛下搅拌5h。将反应混合物在THF与H2O之间进行分配，并将有机相经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(20％)。
中间体100e：2-(((2,2-二甲基-3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)壬酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003001
在0℃下，向中间体100d(0.4g，1.0当量)和(4-硝基苯基)氯甲酸酯(890mg，9.0当量)在DCM(5mL)中的溶液中加入吡啶(119uL，3.0当量)。将混合物在15℃、N2气氛下搅拌3h。然后将混合物在25℃、N2气氛下搅拌2h。将反应混合物过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(0.2g，42％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.21(dd,J＝9.3,2.5Hz,2H),7.31(dd,J＝9.4,2.8Hz,2H),5.43–5.16(m,8H),5.03(dd,J＝10.3,2.3Hz,1H),4.12–3.99(m,6H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.35(h,J＝6.0Hz,1H),2.22(t,J＝7.6Hz,4H),1.97(t,J＝6.9Hz,7H),1.63–1.47(m,6H),1.40–1.12(m,41H),0.82(t,J＝6.7Hz,9H)。
化合物100：2-(((2,2-二甲基-3-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)壬酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003002
使用化合物99中采用的方法，由中间体100e和2-吡咯烷-1-基乙胺合成化合物100，产率为90％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.28(tdq,J＝17.2,12.4,5.8,5.3Hz,8H),4.90(t,J＝6.4Hz,1H),4.13–4.00(m,6H),3.22(ddq,J＝19.5,12.8,6.3,5.8Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.51(t,J＝6.3Hz,2H),2.44(d,J＝6.0Hz,4H),2.34(p,J＝6.0Hz,1H),2.23(t,J＝7.6Hz,4H),1.98(q,J＝6.8Hz,8H),1.70(h,J＝7.5Hz,4H),1.54(p,J＝7.0Hz,4H),1.41–1.06(m,44H),0.81(dt,J＝9.6,6.7Hz,9H)。MS：956.4m/z[M+H]。
实施例101–化合物101
化合物101：2-((4-(((3-(氮杂环丁烷-1-基)丙氧基)羰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003011
使用实施例1所采用的方法，由中间体40d和3-(氮杂环丁烷-1-基)丙-1-醇合成化合物101，产率为65％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.28(m,8H),5.25(tt,J＝5.8,4.3Hz,1H),4.71(ddd,J＝11.5,7.6,4.7Hz,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.3Hz,2H),4.15(dddd,J＝13.3,7.2,5.5,3.2Hz,4H),3.18(t,J＝7.0Hz,4H),2.82–2.72(m,4H),2.48(t,J＝7.3Hz,2H),2.40(dt,J＝8.8,6.8Hz,2H),2.31(td,J＝7.6,1.2Hz,4H),2.10–1.99(m,10H),1.99–1.84(m,2H),1.77–1.50(m,15H),1.42–1.21(m,37H),0.88(td,J＝6.9,5.4Hz,9H)。MS：929.3m/z[M+H]。
实施例102–化合物102
化合物102：2-((4-(((3-(哌啶-1-基)丙氧基)羰基)氧基)癸酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003021
使用实施例1所采用的方法，由中间体40d和3-(哌啶-1-基)丙-1-醇合成化合物102，产率为72％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.28(m,8H),5.25(ddd,J＝5.8,4.3,1.5Hz,1H),4.76–4.69(m,1H),4.37–4.24(m,2H),4.24–4.10(m,4H),2.82–2.71(m,4H),2.48–2.26(m,12H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),2.01–1.81(m,4H),1.71–1.49(m,17H),1.43(s,2H),1.40–1.24(m,37H),0.88(td,J＝6.9,5.0Hz,9H)。MS：957.1m/z[M+H]。
实施例103–化合物103
中间体103a：(2-乙基丁基)溴化镁
Figure BDA0003132577440003022
向Mg(1.1当量)和I2(0.1当量)在THF(0.4–0.5M)中的溶液中逐滴加入3-(溴甲基)戊烷(1.0当量)。将混合物在40℃下搅拌至少1h。反应混合物无需额外纯化即可直接用于下一步。
中间体103b：6-乙基-4-氧代辛酸乙酯
Figure BDA0003132577440003023
在-78℃下，向4-氯-4-氧代丁酸乙酯(1.0当量)在THF(0.3M)中的溶液中逐滴加入CuI(1-2当量)和中间体103a(1-2当量)。将混合物在-78℃下搅拌至少1.5h。完成后，加入饱和NH4Cl，并将反应用EtOAc萃取3次。将有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈棕色油状物的产物(82％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.05(q,J＝7.1Hz,2H),2.65(t,J＝6.6Hz,2H),2.49(d,J＝13.1Hz,2H),2.30(d,J＝6.8Hz,2H),1.82–1.71(m,J＝6.5Hz,1H),1.33–1.13(m,7H),0.78(t,J＝7.4Hz,6H)。
中间体103c：6-乙基-4-氧代辛酸
Figure BDA0003132577440003031
向中间体103c(1.0当量)在3:1EtOH/H2O(0.2M)中的溶液中加入NaOH(1.5当量)、LiOH(1.5当量)。将混合物在40℃下搅拌至少1h。完成后，使用1M HCl将反应的pH调节至3，并将反应用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(46％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.69–2.60(m,2H),2.56(t,J＝6.6Hz,2H),2.30(d,J＝6.7Hz,2H),1.75(hept,J＝6.4Hz,1H),1.22(qp,J＝13.8,6.6Hz,4H),0.78(t,J＝7.4Hz,6H)。
中间体103d：2-((6-乙基-4-氧代辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003032
在0℃、N2下，向中间体103c(1.0当量)在DCM(0.2–0.5M)中的溶液中加入中间体1c(1.0当量)、EDCI(1.2当量)、DMAP(0.1–0.2当量)和Et3N(1.5当量)。将混合物在20-25℃、N2气氛下搅拌至少12h。将混合物用H2O稀释，且用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈黄色油状物的产物(40％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.40–5.21(m,8H),5.18(p,J＝5.0Hz,1H),4.23(dt,J＝11.9,5.0Hz,2H),4.08(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),2.67(dt,J＝20.4,6.5Hz,6H),2.51(td,J＝6.5,2.9Hz,2H),2.32–2.22(m,5H),1.98(q,J＝6.8Hz,8H),1.75(p,J＝6.4Hz,1H),1.53(q,J＝7.2Hz,4H),1.35–1.09(m,31H),0.80(dt,J＝16.7,6.9Hz,12H)。
中间体103e：2-((6-乙基-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003041
使用中间体1e中采用的方法，由中间体103d合成中间体103e，产率为46％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.21(d,J＝8.1Hz,2H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),5.27(tt,J＝14.1,7.8Hz,8H),4.89(p,J＝7.4Hz,1H),4.32–4.02(m,4H),2.70(t,J＝6.5Hz,4H),2.41(t,J＝7.5Hz,2H),2.32–2.19(m,4H),1.98(q,J＝7.2Hz,10H),1.69–1.40(m,7H),1.39–1.16(m,36H),0.82(t,J＝6.9Hz,12H)。
化合物103：2-((6-乙基-4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003051
使用中间体91d中采用的方法，由中间体103e和N'-乙基-N'-甲基-乙烷-1,2-二胺合成化合物103，产率为98％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.21(m,8H),5.18(q,J＝5.0Hz,1H),5.07(s,1H),4.79(s,1H),4.21(ddd,J＝11.8,4.4,1.8Hz,2H),4.08(ddd,J＝11.9,5.8,3.4Hz,2H),3.17(d,J＝6.2Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.44–2.27(m,6H),2.24(t,J＝7.6Hz,4H),2.13(s,3H),1.98(q,J＝6.8Hz,8H),1.84(dq,J＝8.4,4.4Hz,1H),1.71(dd,J＝14.8,7.5Hz,1H),1.58–1.43(m,8H),1.29–1.16(m,38H),0.96(d,J＝7.2Hz,3H),0.80(ddd,J＝13.4,6.7,3.7Hz,13H)。MS：916.3m/z[M+H]。
实施例104
中间体104a：(3,7-二甲基辛基)溴化镁
Figure BDA0003132577440003052
使用中间体104a中采用的方法，由1-溴-3,7-二甲基-辛烷合成中间体104a。
中间体104b：7,11-二甲基-4-氧代十二酸乙酯
Figure BDA0003132577440003053
使用中间体103b中采用的方法，由中间体104a合成中间体104b，产率为66％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.11(qd,J＝7.1,2.5Hz,2H),2.71(t,J＝6.6Hz,2H),2.56(t,J＝6.6Hz,2H),2.49–2.35(m,2H),1.68–1.54(m,1H),1.49(dq,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.43–1.31(m,2H),1.24(td,J＝8.0,7.1,3.6Hz,6H),1.10(dddd,J＝16.9,9.9,4.7,2.0Hz,3H),0.84(d,J＝6.5Hz,9H)。
中间体104c：7,11-二甲基-4-氧代十二酸
Figure BDA0003132577440003061
使用中间体103c中采用的方法，由中间体104b合成中间体104c，产率为51％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ2.72(t,J＝6.1Hz,2H),2.63(t,J＝6.5Hz,2H),2.50–2.36(m,2H),1.61(ddt,J＝11.8,9.0,4.3Hz,1H),1.51(hept,J＝6.6Hz,1H),1.45–1.34(m,2H),1.24(ddt,J＝16.2,13.5,4.2Hz,4H),1.11(ddt,J＝16.0,9.6,5.9Hz,3H),0.91–0.81(m,9H)。
中间体104d：2-((7,11-二甲基-4-氧代十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003062
使用中间体103d中采用的方法，由中间体104c合成中间体104d，产率为58％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.41–5.28(m,8H),5.24(ddd,J＝10.2,5.8,4.3Hz,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(dd,J＝11.9,5.8Hz,2H),2.74(dt,J＝17.5,6.5Hz,6H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),2.48–2.37(m,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.04(q,J＝6.9Hz,8H),1.60(ddd,J＝10.0,5.6,2.6Hz,6H),1.54–1.47(m,1H),1.42–1.19(m,34H),1.10(ddt,J＝19.6,10.0,6.9Hz,4H),0.93–0.80(m,15H)。
中间体104e：2-((7,11-二甲基-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003071
使用中间体1e中采用的方法，由中间体104d合成中间体104e，产率为58％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.27–8.11(m,2H),7.36–7.29(m,2H),5.36–5.16(m,9H),4.78(ddq,J＝12.5,7.0,3.4Hz,1H),4.25(dd,J＝12.0,4.3Hz,2H),4.12–4.05(m,2H),2.70(t,J＝6.3Hz,4H),2.40(t,J＝7.5Hz,2H),2.24(tt,J＝7.7,4.0Hz,4H),2.07–1.88(m,10H),1.72–1.48(m,7H),1.44(ddd,J＝13.3,6.6,1.3Hz,1H),1.39–1.14(m,34H),1.06(dtd,J＝8.6,6.7,4.7Hz,3H),0.86–0.76(m,15H)。
实施例105–化合物105
化合物105：2-((7,11-二甲基-4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十二酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003081
使用中间体91d中采用的方法，由中间体104e和2-吡咯烷-1-基乙胺合成化合物105，产率为62％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.38–5.22(m,8H),5.22–5.15(m,1H),5.08(s,1H),4.67(s,1H),4.22(dd,J＝12.0,4.4Hz,2H),4.08(ddd,J＝11.9,5.9,3.5Hz,2H),3.20(t,J＝6.0Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.51(t,J＝6.1Hz,2H),2.43(d,J＝5.9Hz,4H),2.32(ddd,J＝9.2,6.7,3.7Hz,2H),2.25(t,J＝7.6Hz,4H),1.98(q,J＝6.8Hz,8H),1.84(d,J＝7.5Hz,1H),1.77–1.66(m,5H),1.54(p,J＝7.1Hz,7H),1.44(p,J＝6.6Hz,3H),1.35–1.10(m,34H),1.10–0.96(m,5H),0.86–0.74(m,15H)。MS：984.2m/z[M+H]。
实施例106–化合物106
化合物106：2-((6-乙基-4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003082
使用中间体91d中采用的方法，由中间体103e和2-吡咯烷-1-基乙胺合成化合物106，产率为78％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.28(qt,J＝11.5,6.0Hz,8H),5.19(q,J＝5.0Hz,1H),4.79(s,1H),4.22(dd,J＝12.2,4.5Hz,2H),4.08(ddd,J＝11.8,5.8,3.5Hz,2H),3.22(q,J＝5.9Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,4H),2.53(t,J＝6.2Hz,2H),2.46(s,3H),2.33(dd,J＝9.6,7.0Hz,2H),2.25(t,J＝7.6Hz,4H),1.98(q,J＝6.8Hz,7H),1.89–1.80(m,2H),1.76–1.61(m,7H),1.60–1.45(m,6H),1.34–1.16(m,33H),0.87–0.72(m,12H)。MS：928.4m/z[M+H]。
实施例107–化合物107
中间体107a：(Z)-1-溴-3-壬烯
Figure BDA0003132577440003091
在0℃下，向PPh3(36.79g，1.33当量)在DCM(1M)中的溶液中加入Br2(7.23mL，1.33当量)。将(Z)-壬-3-烯-1-醇(15g，1.0当量)加入到反应混合物中，并将混合物在0℃下搅拌2h。通过在0℃下加入H2O将反应混合物淬灭并用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(15g，69％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.47–5.30(m,2H),3.64(t,J＝6.7Hz,2H),2.18–2.06(m,2H),2.02(q,J＝6.7Hz,2H),1.77(s,1H),1.62(p,J＝6.9Hz,2H),1.38–1.20(m,6H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。
中间体107b：(Z)-壬-3-烯-1-基溴化镁
Figure BDA0003132577440003092
向Mg(2.13g，1.2当量)在THF(150mL)中的悬浮液中加入I2(1.86g，0.1当量)。然后将中间体107a(15g，1.0当量)加入到混合物中，并将混合物在45℃下搅拌2h。反应混合物无需额外纯化即可直接用于下一步。
中间体107c：(Z)-4-氧代十三碳-7-烯酸乙酯
Figure BDA0003132577440003101
使用中间体103b中采用的方法，由中间体107b合成中间体107c，产率为75％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.23(m,2H),4.10(qd,J＝7.1,3.2Hz,3H),2.69(t,J＝6.6Hz,2H),2.55(t,J＝6.6Hz,2H),2.47(t,J＝7.4Hz,2H),2.30(q,J＝7.3Hz,2H),2.01–1.95(m,2H),1.34–1.18(m,11H),0.86(t,J＝6.8Hz,3H)。
中间体107d：(Z)-4-氧代十三碳-7-烯酸
Figure BDA0003132577440003102
使用中间体103c中采用的方法，由中间体107c合成中间体107d，产率为80％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.23(ddt,J＝34.8,17.4,7.8Hz,2H),4.27–3.96(m,2H),2.58(t,J＝6.1Hz,2H),2.38(t,J＝7.4Hz,2H),2.31–2.08(m,4H),1.92(q,J＝6.9Hz,2H),1.75(s,2H),1.21(dq,J＝15.0,9.2,8.0Hz,6H),0.80(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体107e：2-(((Z)-4-氧代十三碳-7-烯酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003103
使用中间体104c中采用的方法，由中间体107d和中间体1c合成中间体107e，产率为80％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35–5.22(m,9H),5.21–5.15(m,1H),4.23(dt,J＝11.9,4.8Hz,2H),4.12–4.01(m,4H),2.76–2.67(m,4H),2.65(t,J＝6.5Hz,2H),2.55–2.49(m,2H),2.42(t,J＝7.5Hz,2H),2.25(t,J＝7.6Hz,6H),1.98(q,J＝7.2Hz,13H),1.54(p,J＝7.6Hz,4H),1.32–1.18(m,37H),0.82(td,J＝7.0,1.7Hz,9H)。
中间体107f：2-(((Z)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)十三碳-7-烯酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003111
使用中间体1e中采用的方法，由中间体107e合成中间体107f，产率为21％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.48–8.20(m,2H),7.56–7.32(m,2H),5.45–5.20(m,10H),4.88(tt,J＝7.9,4.6Hz,1H),4.30(ddd,J＝12.1,10.3,4.5Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,2.1Hz,2H),2.74(dt,J＝19.6,6.5Hz,5H),2.59(t,J＝6.5Hz,1H),2.48(q,J＝7.1Hz,2H),2.41–2.24(m,5H),2.15(q,J＝7.7Hz,1H),2.09–1.96(m,10H),1.61(q,J＝12.7,9.4Hz,5H),1.39–1.20(m,30H),0.99–0.69(m,9H)。
化合物107：2-(((Z)-4-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十三碳-7-烯酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003121
使用中间体91d中采用的方法，由中间体107f和N'-乙基-N'-甲基-乙烷-1,2-二胺合成化合物107，产率为56％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.41–5.29(m,9H),5.24(p,J＝5.0Hz,1H),5.16(d,J＝5.3Hz,1H),4.81–4.74(m,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,3.3Hz,2H),3.23(q,J＝5.9Hz,2H),2.76(t,J＝6.4Hz,4H),2.48–2.36(m,6H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.20(s,3H),2.02(dq,J＝20.4,7.0Hz,12H),1.96–1.87(m,2H),1.81(dd,J＝14.7,7.3Hz,1H),1.65–1.55(m,7H),1.39–1.22(m,35H),1.03(t,J＝7.1Hz,3H),0.88(td,J＝7.0,2.3Hz,9H)。MS：955.3m/z[M+H]。
实施例108–化合物108
化合物108：2-(((Z)-4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)十三碳-7-烯酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003122
使用中间体91d中采用的方法，由中间体107f和2-吡咯烷-1-基乙胺合成化合物108，产率为51％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.26(m,9H),5.24(q,J＝5.1Hz,1H),4.78(tt,J＝8.6,4.6Hz,1H),4.28(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.14(ddd,J＝11.9,5.8,3.5Hz,2H),3.29(q,J＝5.9Hz,2H),2.76(t,J＝6.4Hz,4H),2.66–2.50(m,5H),2.39(ddd,J＝9.6,6.7,3.6Hz,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.01(dq,J＝20.4,7.1Hz,12H),1.87–1.72(m,5H),1.59(q,J＝7.3Hz,6H),1.40–1.15(m,31H),0.88(td,J＝6.9,2.2Hz,9H)。MS：967.3m/z[M+H]。
实施例109–化合物109
中间体109a：3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氧代丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
Figure BDA0003132577440003131
使用中间体62b中采用的方法，由中间体62a和亚油酸合成中间体109a，产率为63％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.31–5.19(m,4H),4.84(s,2H),4.16(s,2H),2.67(t,J＝6.7Hz,2H),2.32(t,J＝7.5Hz,2H),1.94(q,J＝6.9Hz,4H),1.57(q,J＝7.4Hz,2H),1.31–1.13(m,15H),0.80(d,J＝15.1Hz,12H)。
中间体109b：3-羟基-2-氧代丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
Figure BDA0003132577440003132
向中间体109a(1.0当量)在THF(180mL)中的溶液中加入HF-吡啶(5.0当量)。将混合物在25℃下搅拌1h。将反应混合物在减压下浓缩以去除THF。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(66％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.33(dtd,J＝12.5,10.3,9.5,5.6Hz,4H),4.74(s,1H),4.36(s,1H),2.76(t,J＝6.4Hz,2H),2.41(t,J＝7.5Hz,1H),2.37–2.27(m,1H),2.03(q,J＝6.9Hz,4H),1.65(p,J＝7.1Hz,2H),1.41–1.24(m,14H),0.87(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体109c：3-(油酰氧基)-2-氧代丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
Figure BDA0003132577440003141
使用化合物52中采用的方法，由中间体109b和油酸合成中间体109c，产率为50％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.37–5.22(m,6H),4.68(s,4H),2.70(t,J＝6.4Hz,2H),2.35(t,J＝7.5Hz,4H),2.02–1.91(m,8H),1.60(q,J＝7.3Hz,4H),1.33–1.17(m,33H),0.81(dt,J＝7.0,3.3Hz,6H)。
中间体109d：2-羟基-3-(油酰氧基)丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
Figure BDA0003132577440003142
使用中间体1c中采用的方法，由中间体109c合成中间体109d，产率为50％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.37–5.21(m,6H),4.15–4.00(m,4H),2.70(t,J＝6.3Hz,2H),2.28(t,J＝7.6Hz,4H),2.04–1.89(m,8H),1.56(t,J＝7.4Hz,4H),1.23(dt,J＝13.9,7.0Hz,34H),0.82(td,J＝6.8,3.8Hz,6H)。
化合物109：3-(油酰氧基)-2-((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)辛酰基)氧基)丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
Figure BDA0003132577440003151
使用化合物85中采用的方法，由中间体109d和中间体85c合成化合物109。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(tdd,J＝8.8,6.5,3.6Hz,5H),5.28–5.22(m,1H),5.16(s,1H),4.29(dd,J＝11.9,4.4Hz,2H),4.15(ddd,J＝11.9,5.8,3.3Hz,2H),3.34–3.22(m,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,2H),2.55(d,J＝30.6Hz,5H),2.39(ddd,J＝8.8,6.6,3.8Hz,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.09–1.97(m,7H),1.91(d,J＝7.2Hz,1H),1.78(d,J＝6.0Hz,4H),1.61(t,J＝7.2Hz,6H),1.30(td,J＝10.5,9.4,4.7Hz,30H),0.91–0.87(m,6H)。MS：902.3m/z[M+H]。
实施例110–化合物110
中间体110a：2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯
Figure BDA0003132577440003152
向1,3-二羟基丙-2-酮(5g，0.5当量)在DCM(300mL)中的溶液中加入DMAP(1.1当量)和EDCI(1.0当量)。然后向上述混合物中加入油酸(1.0当量)，并在25℃下搅拌12h。将反应混合物在减压下浓缩以去除DCM。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(8g，12％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.34–5.21(m,4H),4.68(s,4H),2.35(t,J＝7.5Hz,4H),1.94(q,J＝6.4Hz,8H),1.60(q,J＝7.4Hz,4H),1.31–1.14(m,38H),0.89–0.75(m,6H)。
中间体110b：2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯
Figure BDA0003132577440003161
使用中间体1c中采用的方法，由中间体110a合成中间体110b，产率为47％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.41–5.26(m,4H),4.22–4.06(m,4H),2.34(t,J＝7.6Hz,4H),2.01(q,J＝6.4Hz,7H),1.63(p,J＝7.2Hz,4H),1.28(d,J＝14.2Hz,33H),0.90–0.81(m,6H)。
化合物110：2-((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,3-二基二油酸酯
Figure BDA0003132577440003162
使用化合物85中采用的方法，由中间体110b和中间体85c合成化合物110。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.33–5.22(m,4H),5.22–5.15(m,1H),5.08(s,1H),4.69(s,1H),4.28–4.17(m,2H),4.08(ddq,J＝12.2,6.4,2.9Hz,2H),3.21(d,J＝6.8Hz,2H),2.51(t,J＝6.2Hz,2H),2.43(d,J＝6.0Hz,4H),2.32(ddd,J＝8.6,6.6,3.7Hz,2H),2.24(t,J＝7.6Hz,4H),1.94(q,J＝6.7Hz,8H),1.87–1.78(m,1H),1.70(p,J＝3.1Hz,5H),1.61–1.36(m,9H),1.22(d,J＝13.2Hz,45H),0.82(td,J＝6.9,3.7Hz,9H)。MS：904.2m/z[M+H]。
实施例111–化合物111
化合物111-3-((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)辛酰基)氧基)丙烷-1,2-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003171
使用化合物85中采用的方法，由中间体85c和中间体30a合成化合物111。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.27(m,8H),5.24(t,J＝5.2Hz,1H),5.14(s,1H),4.74(s,1H),4.27(ddd,J＝12.2,8.2,4.2Hz,2H),4.18–4.09(m,2H),3.27(q,J＝5.9Hz,2H),2.75(t,J＝6.4Hz,4H),2.57(t,J＝6.2Hz,2H),2.50(s,4H),2.37(td,J＝8.9,7.8,3.5Hz,2H),2.30(td,J＝7.5,4.4Hz,4H),2.03(q,J＝6.9Hz,8H),1.98–1.86(m,2H),1.76(h,J＝3.1Hz,5H),1.59(tt,J＝9.8,5.1Hz,7H),1.38–1.21(m,30H),0.87(t,J＝6.7Hz,9H)。MS：900.1m/z[M+H]。
实施例112–化合物112
化合物112：2-(((4-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)辛酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003181
使用化合物84中采用的方法，由中间体86c和中间体53a合成化合物112。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44–5.28(m,8H),5.19(s,1H),4.75(s,1H),4.12(d,J＝5.9Hz,6H),3.29(q,J＝6.1Hz,2H),2.77(t,J＝6.4Hz,4H),2.64–2.49(m,6H),2.38(ddd,J＝10.1,8.5,4.8Hz,3H),2.30(t,J＝7.6Hz,4H),2.05(q,J＝6.8Hz,8H),1.90(s,2H),1.86–1.72(m,6H),1.61(t,J＝7.3Hz,7H),1.32(tq,J＝7.6,4.9,3.7Hz,33H),0.89(t,J＝6.7Hz,9H)。MS：914.1m/z[M+H]。
实施例113–化合物113
中间体113a：3-羟基庚酸苄酯
Figure BDA0003132577440003182
将Zn倒入HCl(1M)中并搅拌30min。将混合物过滤，并将沉淀物用EtOH洗涤。将固体在减压下干燥以得到新鲜制备的Zn。在66℃下，向Zn(15.18g，2.0当量)在THF(50mL)中的悬浮液中逐滴加入戊醛(1.0当量)和2-溴乙酸苄酯(1.5当量)，持续0.5h。将反应混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(10g，36％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(d,J＝4.1Hz,5H),5.14(s,2H),4.01(tt,J＝8.4,3.6Hz,1H),2.87(s,1H),2.59–2.41(m,2H),1.57–1.47(m,1H),1.43(qd,J＝9.6,8.9,4.6Hz,2H),1.37–1.24(m,4H),0.93–0.87(m,3H)。
中间体113b：3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)庚酸苄酯
Figure BDA0003132577440003191
在0℃下，向中间体113a(8g，1.0当量)和(4-硝基苯基)氯甲酸酯(2.0当量)在DCM(10mL)中的溶液中加入吡啶(3.0当量)。将混合物在20℃、N2气氛下搅拌2h。将反应混合物在减压下浓缩以去除DCM。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(8g，59％产率)。1H NMR (400MHz,CDCl3)δ8.30–8.21(m,2H),7.39–7.28(m,7H),5.16(d,J＝3.3Hz,2H),2.82–2.69(m,2H),1.81–1.68(m,2H),1.43–1.30(m,5H),0.94–0.89(m,3H)。
中间体113c：3-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)庚酸苄酯
Figure BDA0003132577440003192
在0℃下，向中间体113b(0.5g，1.0当量)和2-吡咯烷-1-基乙胺(3.0当量)在MeCN(10mL)中的溶液中加入DMAP(0.1当量)和吡啶(3.0当量)。将混合物在20℃下搅拌2h。将反应混合物在减压下浓缩以去除MeCN。将残余物用H2O稀释且用EtOAc萃取3次。将合并的有机层在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(0.4g，85％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36–7.20(m,5H),5.05(s,2H),3.17(dt,J＝13.3,6.4Hz,2H),2.56(td,J＝13.2,11.4,6.3Hz,2H),2.50–2.37(m,6H),1.72–1.63(m,J＝4.0,3.5Hz,4H),1.49(s,2H),1.28–1.20(m,4H),0.81(q,J＝4.2,3.2Hz,3H)。
中间体113d：3-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)庚酸
Figure BDA0003132577440003201
向中间体113c(3.5g，1.0当量)在THF(10mL)中的溶液中加入Pd/C(10％w/w)。将混合物用H2吹扫3次，并且然后将混合物在20℃、H2气氛下搅拌12h。将反应混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱纯化，以得到呈无色油状物的产物(2g，75％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.00(s,1H),6.46(t,J＝6.0Hz,1H),5.02(dt,J＝10.0,5.2Hz,1H),3.43–3.25(m,3H),2.92(dt,J＝21.7,6.5Hz,6H),2.37(qd,J＝14.9,6.4Hz,2H),1.87(q,J＝4.4,2.9Hz,4H),1.64–1.45(m,2H),1.24(h,J＝7.7,6.7Hz,4H),0.88–0.75(m,3H)。
化合物113：2-(((3-(((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)庚酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003211
使用化合物52中采用的方法，由中间体113c和中间体53a合成化合物113。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.37–5.18(m,8H),5.00(q,J＝6.4Hz,1H),4.06(p,J＝6.5,6.1Hz,6H),3.21(p,J＝7.3,6.8Hz,2H),2.70(t,J＝6.5Hz,4H),2.55–2.39(m,7H),2.32(p,J＝6.0Hz,1H),2.23(t,J＝7.6Hz,4H),1.98(q,J＝6.8Hz,7H),1.76–1.63(m,5H),1.54(t,J＝7.3Hz,6H),1.33–1.15(m,30H),0.82(t,J＝6.7Hz,9H)。MS：900.1m/z[M+H]。
实施例114–比较化合物114
化合物114：2-(((2-(乙基(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)
Figure BDA0003132577440003212
向中间体1c(250mg，1.0当量)在DCM(2mL)中的溶液中加入吡啶(3.0当量)和氯甲酸4-硝基苯酯(1.1当量)。将反应在25℃下搅拌2h，此后通过加入水将反应淬灭，并用DCM萃取3次。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将所得的粗制残余物在MeCN(2mL)中重构，然后加入吡啶(3.0当量)、N1-乙基-N1-甲基乙烷-1,2-二胺(1.5当量)和DMAP(1.0当量)。将反应在25℃下搅拌16h。然后将庚烷加入到反应混合物中，并将庚烷层用MeCN洗涤3次。将合并的MeCN层用庚烷反萃取三次，并将合并的庚烷层最后用MeCN洗涤一次。然后在真空中去除庚烷，并将粗制材料通过柱色谱(MeOH/DCM)纯化，以得到呈无色油状物的产物(138mg，46％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.49–5.27(m,8H),5.14(p,J＝5.0Hz,1H),4.33–4.12(m,4H),3.29(q,J＝5.7Hz,2H),2.83–2.71(m,4H),2.60–2.38(m,5H),2.38–2.16(m,7H),2.04(q,J＝6.9Hz,8H),1.69–1.56(m,4H),1.42–1.22(m,28H),1.07(t,J＝7.2Hz,3H),0.96–0.85(m,6H)。
实施例115–材料和方法
LNP组合物
在由可电离脂质(例如胺脂质)、DSPC、胆固醇和PEG-2k-DMG组成的4组分脂质系统中，使用各种胺脂质制备LNP。在小鼠中的肝脏编辑百分比测定中，Cas9 mRNA和靶向小鼠序列的化学修饰的sgRNA均以1:1w/w比或1:2w/w比在LNP中进行配制。
LNP制剂-交叉流动
将脂质组分用下文描述的脂质组分摩尔比溶于100％乙醇中。将化学修饰的sgRNA和Cas9 mRNA合并，并溶解在25mM柠檬酸盐、100mM NaCl，pH 5.0中，产生的总RNA货物浓度为大约0.45mg/mL。LNP用约6的N/P比，以1:1或1:2w/w比的化学修饰的sgRNA:Cas9 mRNA的比率来配制，如下所述。
通过将乙醇中的脂质与两体积的RNA溶液和一体积的水撞击射流混合来形成LNP。通过混合交叉将乙醇中的脂质与两体积的RNA溶液混合。第四水流通过直列三通与十字管的出口流混合。(参见例如WO2016010840，图2)。将LNP在室温下保持1小时，并用水(大约1:1v/v)进一步稀释。使用在平板滤筒(Sartorius，100kD MWCO)上的切向流过滤浓缩稀释的LNP，并且然后通过渗滤将缓冲液交换到50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(TSS)中。可替代地，用PD-10脱盐柱(GE)完成最终缓冲液交换为TSS。如果需要，通过用Amicon 100kDa离心过滤器(Millipore)离心来浓缩组合物。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。最终LNP在4℃或-80℃下储存，直到进一步使用。
LNP组成分析
使用动态光散射(“DLS”)表征本公开的LNP的多分散性指数(“pdi”)和大小。DLS测量由将样品置于光源下而产生的光散射。如根据DLS测量所测定，PDI表示群体中粒度的分布(平均粒度周围)，其中完全均匀群体的PDI为零。
使用电泳光散射表征指定pH下LNP的表面电荷。表面电荷或ζ电位是LNP悬浮液中的颗粒之间的静电斥力/引力的量值的量度。
非对称流场流分离-多角度光散射(AF4-MALS)用于根据流体动力学半径分离组合物中的颗粒，并且然后测量分离颗粒的分子量、流体动力学半径和均方根半径。这允许评估分子量和大小分布以及二级特征，诸如Burchard-Stockmeyer曲线图(表明颗粒的内部核心密度的随时间推移的均方根(“rms”)半径与流体动力学半径的比率)和rms构造图(rms半径的对数相对于分子量的对数，其中所得线性拟合的斜率给出相对于伸长率的紧密度)的能力。
纳米颗粒追踪分析(NTA，Malvern Nanosight)可用于测定粒度分布以及颗粒浓度。将LNP样品适当地稀释并且注射到显微镜载片上。相机在颗粒缓慢输注通过视场时记录散射光。在捕获影片之后，纳米颗粒追踪分析通过追踪像素并计算扩散系数来处理影片。此扩散系数可转译成颗粒的流体动力学半径。仪器还对分析中计数的单个颗粒的数量计数以得到颗粒浓度。
低温电子显微镜法(“cryo-EM”)可用于测定LNP的粒度、形态和结构特征。
可根据液相色谱继之以电雾式检测(LC-CAD)测定LNP的脂质组成分析。此分析可提供实际脂质含量相对于理论脂质含量的比较。
分析LNP组合物的平均粒度、多分散性指数(pdi)、总RNA含量、RNA包封效率和ζ电位。可进一步通过脂质分析、AF4-MALS、NTA和/或cryo-EM表征LNP组合物。通过动态光散射(DLS)使用Malvern Zetasizer仪器测量平均粒度和多分散性。在通过DLS进行测量之前，将LNP样品用PBS缓冲液稀释。连同数均直径和pdi一起报告Z-平均直径，所述Z-平均直径为平均粒度的基于强度的测量。还使用Malvern Zetasizer仪器来测量LNP的ζ电位。在测量之前，将样品在0.1X PBS，pH 7.4中以1:17(50μL于800μL中)稀释。
使用基于荧光的测定(
Figure BDA0003132577440003241
ThermoFisher Scientific)来测定总RNA浓度和游离RNA。包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。用含有0.2％Triton-X 100的1xTE缓冲液适当地稀释LNP样品以测定总RNA或用1x TE缓冲液稀释以测定游离RNA。通过利用用于制备组合物并且在1x TE缓冲液+/-0.2％Triton-X 100中稀释的起始RNA溶液来制备标准曲线。然后将稀释的
Figure BDA0003132577440003242
染料(根据制造商的说明书)加入到标准品和样品中的每一种中，并且使它们在不存在光的情况下在室温下孵育大约10分钟。使用SpectraMaxM5酶标仪(Molecular Devices)，以分别在设定成488nm、515nm和525nm的激发波长、自动截止波长和发射波长下读取样品。由适当标准曲线测定总RNA和游离RNA。
包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。可使用相同工序来测定基于DNA的货物组分的包封效率。对于单链DNA，可使用Oligreen染料，并且对于双链DNA，可使用Picogreen染料。
使用AF4-MALS以由那些计算查看分子量和大小分布以及二次统计。将LNP适当地稀释并且使用HPLC自动进样器注射至AF4分离通道中，LNP在所述自动进样器中集中，并且然后跨越通道在交叉流中以指数梯度洗脱。所有流体通过HPLC泵和Wyatt Eclipse仪器驱动。自AF4通道洗脱的颗粒流经UV检测器、多角度光散射检测器、准弹性光散射检测器和差示折光率检测器。通过使用Debeye模型处理原始数据以根据检测器信号测定分子量和rms半径。
通过耦合至电雾式检测器(CAD)的HPLC来定量分析LNP中的脂质组分。通过反相HPLC来实现4种脂质组分的色谱分离。CAD是破坏性的基于质量的检测器，其检测所有非挥发性化合物并且不管分析物结构如何，信号都是一致的。
Cas9 mRNA和gRNA货物
通过体外转录制备Cas9 mRNA货物。包含1X NLS(SEQ ID NO:3)或PCT/US2019/053423的表24的序列(其在此以引用的方式并入)的加帽和聚腺苷酸化的Cas9 mRNA通过使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶体外转录而产生。例如，通过在以下条件下与XbaI一起在37℃下孵育2小时来线性化包含T7启动子和100nt poly(A/T)区域的质粒DNA：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)和1x反应缓冲液。可通过在65℃下加热反应20min来使XbaI灭活。可使用二氧化硅最大旋转柱(Epoch Life Sciences)自酶和缓冲盐纯化线性化质粒并且通过琼脂糖凝胶加以分析以证实线性化。产生Cas9修饰的mRNA的IVT反应通过在以下条件下在37℃下孵育4小时来进行：50ng/μL线性化质粒；2mM GTP、ATP、CTP和N1-甲基假UTP(Trilink)中的每一种；10mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠类RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌(E.coli)焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。在4h孵育后，加入TURBO DNA酶(ThermoFisher)至最终浓度为0.01U/μL，并且将反应再孵育30分钟以去除DNA模板。用含LiCl沉淀的方法纯化Cas9 mRNA。
以下实施例中的sgRNA是化学合成的。
LNP的体内递送
在每个研究中使用6-10周龄的CD-1雌性小鼠。将动物称重并根据体重分组，以基于组平均重量制备给药溶液。LNP经由侧尾静脉以每只动物0.2mL的体积(大约10mL/千克体重)给药。给药后至少24小时定期观察动物的副作用。
对于测量肝脏中体内编辑的研究，除非另外说明，否则将CD-1雌性小鼠以0.1mpk给药。在异氟烷(isoflourane)麻醉下，在第6天或第7天经由心脏穿刺放血对动物进行安乐死。从每只动物中收集肝组织用于DNA萃取和分析。将血液收集到血清分离器管中或收集到包含如本文所述的用于血浆的缓冲柠檬酸钠的管中。通过下一代测序(NGS)测量小鼠群组的编辑。
NGS测序
简而言之，为了定量测定基因组中靶位置处的编辑效率，分离基因组DNA且利用深度测序来鉴定由基因编辑引入的插入和缺失的存在。
在靶位点(例如B2M)周围设计PCR引物，并且扩增目标基因组区。根据制造商的协定(Illumina)进行额外PCR以为测序添加必要的化学品。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量得分的那些读数之后，将读数与相关的参考基因组(例如GRCm38)进行比对。将所得包含读数的文件映射至参考基因组(BAM文件)，其中选择与目标靶区域重叠的读数，且计算野生型读数的数量相对于包含插入、取代或缺失的读数的数量。
编辑百分比(例如“编辑效率”或“百分比编辑”)定义为具有插入或缺失的序列读数总数除以包括野生型的序列读数总数。
运甲状腺素蛋白(TTR)ELISA分析
如所示收集血液并分离血清。使用小鼠前白蛋白(运甲状腺素蛋白)ELISA试剂盒(Aviva Systems Biology，目录OKIA00111)测定总小鼠TTR血清水平。简而言之，用试剂盒样品稀释剂将血清系列稀释到例如10,000倍和/或2,500倍的最终稀释度。然后将稀释的样品加入到ELISA板中，并且然后根据说明书进行测定。来自治疗组的血清TTR数据表示为媒介物对照水平的百分比。
实施例116–通过体内编辑评估脂质功效
我们评估了用包括各种胺脂质化合物的制剂递送的材料的体内编辑效率。使用靶向小鼠TTR基因的G282(SEQ ID No:1)或靶向小鼠B2M基因的G650(SEQ ID No.2)来测量编辑。通过体内编辑实验评估上述脂质的功效。LNP以1:1w/w比的sgRNA比Cas9 mRNA和约6的N/P比配制。LNP的脂质组分中脂质的摩尔浓度表示为mol％胺脂质/DSPC/胆固醇/PEG-2k-DMG，例如50/10/38.5/1.5。根据以上提供的分析方法表征最终的LNP以确定包封效率、多分散性指数和平均粒度。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA包封效率的分析示于表2中。还测量了以下可电离脂质的pKa值，并在表1中提供。
在下文实验9中，测试了基于化合物7的一系列化合物，并且所述一系列化合物通过在式(1A)的R3位置处包含C6环烷基或C4-12烷基而变化，如图1A所示。如表3和图1B以及图1C中所示，测试的所有六种化合物均对体内编辑有效。在下文实施例119中还测试了基于化合物7的化合物系列中额外的R3基团。
表2–组成分析。
Figure BDA0003132577440003271
Figure BDA0003132577440003281
Figure BDA0003132577440003291
表3示出了如通过NGS测量的小鼠肝脏中的编辑百分比。
表3.小鼠肝脏中的编辑效率(提供了G282和G650实验的％插入缺失形成)以及G282实验的血清TTR水平。
Figure BDA0003132577440003292
Figure BDA0003132577440003301
实施例117–肝脏中编辑的剂量反应性
为了评估编辑是否具有剂量反应性，在体内以各种LNP剂量水平进行实验。将实施例115的Cas9 mRNA与靶向TTR的sgRNA(G00282；SEQ ID NO:1)一起配制成LNP。这些LNP以1:1w/w比的sgRNA和Cas9 mRNA配制。用如表4中所述的脂质摩尔组成使用交叉流动工序以6.0的N/P比配制LNP。
如实施例115中所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA包封效率。
平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA包封效率的分析示于表4中。
表4：组成分析
Figure BDA0003132577440003311
将CD-1雌性小鼠以0.1mpk或0.3mpk静脉内给药，并评估肝脏中的编辑。结果示于图2和表5中。
表5用于剂量反应的TTR肝脏编辑和血清TTR水平
化合物编号 剂量(mpk) 平均％插入缺失 SD N
TSS n/a 0.4 0.1 5
7 0.1 49.1 8.9 5
7 0.3 69.4 0.8 5
9 0.1 50.6 6.5 5
9 0.3 64.5 3.8 5
49 0.1 26.8 5.7 5
49 0.3 60.6 5.9 5
实施例118
为了评估给药的可扩展性，在体内进行剂量反应实验。将实施例115的Cas9 mRNA与靶向TTR的gRNA(G00282；SEQ ID NO:1)一起配制成LNP。使用1:1w/w比的sgRNA和Cas9mRNA，如实施例115中所述配制、制备和分析这些LNP。这些LNP的组成分析描述于表6中。
表6：组成分析
Figure BDA0003132577440003321
将CD-1雌性小鼠以0.1mpk或0.3mpk静脉内给药，并评估肝脏中的编辑。结果示于图3A和图3B以及表7中。
表7：编辑和血清TTR水平
Figure BDA0003132577440003322
实施例119–通过体内编辑评估脂质递送功效
我们通过体内编辑实验评估了用具有可变尾长的制剂递送的材料的体内编辑效率。如上所述，用靶向小鼠TTR基因的G502(SEQ ID No:4)配制LNP，用于测量编辑。制剂包含1:2w/w比的sgRNA比Cas9 mRNA。最终LNP的表征示于表8中。测量可电离脂质的pKa值，并且示于表1中。
在实验4中，测试了基于化合物7的一系列化合物，所述一系列化合物通过在式(1A)的R3位置处包含C5-12烷基而变化，如图4A所示。如表9和图4B以及图4C中所示，测试的所有五种化合物均对体内编辑有效。
在实验8中，测试了基于化合物9的一系列化合物，所述一系列化合物通过在式(1A)的R3位置处包含C5-12烷基而变化，如图5A所示。实验2测试了此系列的化合物287，所述化合物在R3位置处包含C4烷基。如表9和图5B以及图5C中所示，测试的此系列中所有化合物均对体内编辑有效。
在实验3中，测试了基于化合物46的一系列化合物，所述一系列化合物通过在式(1A)的R3位置处包含C5-8烷基而变化，如图6A所示。化合物46在R3位置处包含C12烷基，并且测试了改变尾长的化合物。如表9和图6B以及图6C中所示，具有C5(化合物72)、C6(化合物50)、C7(化合物76)和C8(化合物51)R3基团的化合物对体内编辑有效。
在实验7中，测试了基于化合物5的一系列化合物，所述一系列化合物通过在式(1A)的R3位置处包含C5-10烷基而变化，如图7A所示。实验2测试了此系列的化合物66，所述化合物在R3位置处包含C4烷基。化合物5在R3位置处包含C12烷基，并且在实施例116和118中被证明对体内编辑有效。如表9和图7B以及图7C中所示，此系列中测试的所有额外的化合物均对体内编辑有效。
在实验1中，测试了基于化合物34的一系列化合物，所述一系列化合物在式(1A)的位置X1和Y1处变化，如图8A所示。化合物52和化合物34在位置Y1处共享二亚油酸基(dilinoleic group)，并通过在位置X1处包含C0-1亚烷基而变化。化合物53、化合物54和化合物55在位置Y1处共享三醇基，并通过在位置X1处包含C0-2亚烷基而变化。化合物56、化合物57和化合物58在位置Y1处共享20个原子基团，并通过在位置X1处包含C0-1亚烷基而变化。化合物59、化合物60和化合物61在位置Y1处共享21个原子基团，并通过在位置X1处包含C0-2亚烷基而变化。化合物62、化合物63和化合物64在位置Y1处共享异质亚油基和21个原子基团，并通过在位置X1处包含C0-2亚烷基而变化。如表9和图8B以及图8C中所示，测试的所有化合物均对体内编辑有效。
在实验5中，测试了基于化合物50的一系列化合物，所述一系列化合物在式(1A)的位置X2处变化，如图9A所示。如表9和图9B以及图9C中所示，测试的所有化合物在0.1mpk剂量下均对体内编辑有效。
在实验6中，测试了基于化合物34的一系列化合物，如图10A所示。化合物86和化合物99在式(1A)的X1位置处与化合物34不同。化合物103在式(1A)的R3位置处与化合物34不同。化合物87和化合物88表示外消旋化合物34的R3与X1位置之间的碳处的R-对映体(etantiomer)和S-对映体。数据示于表9和图10B以及图10C中。小鼠中测试的此系列中所有化合物均对体内编辑有效。
在实验9中，测试了基于化合物50的一系列化合物，如图11A所示。化合物90和化合物89表示外消旋化合物50的R3与X1位置之间的碳处的R-对映体和S-对映体。化合物100和化合物107在R3和X1位置处均不同于化合物50。化合物105、化合物106和化合物108在R3位置处不同于化合物50。数据示于表9和图11B以及图11C中。小鼠中测试的此系列中所有化合物均对体内编辑有效。
表8–组成分析
Figure BDA0003132577440003341
Figure BDA0003132577440003351
Figure BDA0003132577440003361
表9示出了如通过NGS测量的小鼠肝脏中的编辑百分比。
表9.小鼠肝脏中的编辑效率(提供了G502实验的％插入缺失形成)和血清TTR水平。
Figure BDA0003132577440003362
Figure BDA0003132577440003371
Figure BDA0003132577440003381
Figure BDA0003132577440003391
实施例120.体内脂质的编辑功效和耐受性
为了评估脂质功效，在体内进行剂量反应实验。将实施例115的Cas9 mRNA与靶向TTR的gRNA(G00534；SEQ ID NO:5)一起配制成LNP。使用1:2w/w比的sgRNA和Cas9 mRNA，如实施例115中所述配制、制备和分析这些LNP。这些LNP的组成分析描述于表10中。
表10.组成分析
Figure BDA0003132577440003392
对于功效，将Sprague Dawley雌性大鼠以0.1mpk或0.03mpk静脉内给药。给药后6-7天，通过CO2窒息将大鼠安乐死。将血液收集到血清分离器管中。对肝活检进行gDNA处理，并通过实施例115中描述的NGS方法来评估编辑。结果示于表11和图12A以及图12B中。对于耐受性，将Sprague Dawley雌性大鼠以6mpk给药，并在给药后24小时通过CO2窒息将动物安乐死。将血液收集到血清分离器管中，并且发送到外部CRO以经由肝酶套组进行肝酶定量。结果示于表12中。
表11.大鼠中的编辑效率(提供了G534实验的％插入缺失形成)和血清TTR水平。
Figure BDA0003132577440003401
表12.大鼠肝脏的肝酶检查结果
Figure BDA0003132577440003402
实施例121–用R3烷基系列化合物进行体外编辑
测试了基于化合物46的一系列化合物用于体外编辑，所述一系列化合物通过在式(1A)的R3位置处包含C4-12烷基而发生变化(如图13A所示)。将人肝细胞癌细胞系HUH7(日本生物资源研究中心细胞库，目录JCRB0403)在DMEM培养基中培养，所述培养基补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素。转染前24小时(转染时约80％汇合)，将细胞以20,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。用如表13中所述的脂质摩尔组成使用交叉流动工序以6.0的N/P比，以1:2w/w比的sgRNA和Cas9 mRNA配制LNP。如实施例115中所述，分析LNP组合物的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA包封效率。平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA包封效率的分析示于表13中。将LNP稀释到培养基中，在37℃下孵育5分钟，并且以每孔2000ng RNA的剂量移液到细胞上。每种条件均以生物学重复进行测定。转染后6小时收获细胞。根据制造商的协定，使用50μL/孔BuccalAmp DNA萃取溶液(Epicentre，目录QE09050)萃取基因组DNA。如上所述，对所有DNA样品进行PCR和随后的NGS分析，以在G000502靶基因座处进行编辑。如表14和图13B中所示，测试的所有化合物均对体外编辑有效。
表13–组成分析
Figure BDA0003132577440003411
表14–体外编辑
Figure BDA0003132577440003412
Figure BDA0003132577440003421
序列表
Figure BDA0003132577440003422
Figure BDA0003132577440003431
Figure BDA0003132577440003441
Figure BDA0003132577440003451
2′-O-甲基修饰和如下所示的硫代磷酸酯键(m＝2’-OMe；*＝硫代磷酸酯)。

Claims (96)

1.一种式IA的化合物；
Figure FDA0003132577430000011
其中，在每次出现时独立地，
X1为C1-3亚烷基或
Figure FDA0003132577430000012
X2选自O、NH、NMe和键，
X3为C2-4亚烷基，
X4为C1亚烷基或键，
X5为C1亚烷基或键，
R1为C1-3烷基，
R2为C1-3烷基，或者
R2与氮原子和R1或X3的碳原子一起形成4元、5元或6元环，
Y1选自键、-CH＝CH-、-(C＝O)O-和-O(C＝O)-，
Y2选自-CH2-CH＝CH-和C3-C4亚烷基，
R3选自H、C5-7环烷基、C8-C10烯基和C3-18烷基，
R4为C4-8烷基，
或其盐，
其条件是当R2为Me，R3为直链C12烷基，X1为C2亚烷基，X2为O，X3为C3亚烷基，X4为键，X5为C1亚烷基，Y1为顺式-CH＝CH-，并且-Y2–R4为顺式-CH2-CH＝CH-(C5-烷基)时，则R1为C2-3烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是式I的化合物：
Figure FDA0003132577430000021
其中，在每次出现时独立地，
X1为C2-3亚烷基，
X2选自O、NH、NMe和键，
X3为C2-4亚烷基，
X4为C1亚烷基或键，
X5为C1亚烷基或键，
R1为C1-2烷基，
R2为C1-2烷基，或者
R2与氮原子和R1或X3的碳原子一起形成5元或6元环，
Y1选自-CH＝CH-、-(C＝O)O-和-O(C＝O)-，
R3选自H、C5-7环烷基和C3-18烷基，
R4为C4-7烷基，
或其盐，
其条件是当R2为Me，R3为直链C12烷基，X1为C2亚烷基，X2为O，X3为C3亚烷基，X4为键，X5为C1亚烷基，Y1为顺式-CH＝CH-，并且R4为C5烷基时，则R1为C2烷基。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述化合物是对映体富集的或非对映体富集的。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X1为C2亚烷基。
5.如权利要求1所述的化合物，其中X1为C1亚烷基。
6.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中X1为直链C3亚烷基。
7.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中X1为支链C3亚烷基。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X2为NH。
9.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中X2为O。
10.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中X2为NMe。
11.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中X2为键。
12.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X3为C2-3亚烷基。
13.如权利要求1-11中任一项所述的化合物，其中X3为C3-4亚烷基。
14.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2与X3的碳原子一起形成4元环。
15.如权利要求1-13中任一项所述的化合物，其中R2与X3的碳原子一起形成5元环。
16.如权利要求1-13中任一项所述的化合物，其中R2与X3的碳原子一起形成6元环。
17.如权利要求1-15中任一项所述的化合物，其中R2为C1烷基。
18.如权利要求1-16中任一项所述的化合物，其中R2为C2烷基。
19.如权利要求1-13中任一项所述的化合物，其中R1与R2一起形成4元环。
20.如权利要求1-13中任一项所述的化合物，其中R1与R2一起形成5元环。
21.如权利要求1-13中任一项所述的化合物，其中R1与R2一起形成6元环。
22.如权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中R1为C1烷基。
23.如权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中R1为C2烷基。
24.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3为直链C8-16烷基。
25.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3为直链C7-12烷基。
26.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3为直链C7-9烷基。
27.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中R3为直链C3-6烷基。
28.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中R3为支链C6-10烷基。
29.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中R3为C5-7环烷基。
30.如权利要求29所述的化合物，其中R3为C6环烷基。
31.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中R3为C8-10烯基。
32.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中R3为H。
33.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4为直链C5-6烷基。
34.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X4为键。
35.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X5为C1亚烷基。
36.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IA)的化合物；并且Y2–R4为–CH2-CH＝CH-R4。
37.如权利要求1-35中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IA)的化合物；并且Y2为直链C3亚烷基。
38.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Y1选自键、-CH＝CH-和-O(C＝O)-。
39.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Y1选自-CH＝CH-和-O(C＝O)-。
40.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是式II的化合物：
Figure FDA0003132577430000061
41.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是式III的化合物；
Figure FDA0003132577430000062
42.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
Figure FDA0003132577430000071
Figure FDA0003132577430000081
Figure FDA0003132577430000091
Figure FDA0003132577430000101
Figure FDA0003132577430000111
Figure FDA0003132577430000121
Figure FDA0003132577430000131
Figure FDA0003132577430000141
Figure FDA0003132577430000151
Figure FDA0003132577430000161
Figure FDA0003132577430000171
Figure FDA0003132577430000181
Figure FDA0003132577430000191
Figure FDA0003132577430000201
Figure FDA0003132577430000211
Figure FDA0003132577430000221
Figure FDA0003132577430000231
Figure FDA0003132577430000241
Figure FDA0003132577430000251
Figure FDA0003132577430000261
Figure FDA0003132577430000271
Figure FDA0003132577430000281
Figure FDA0003132577430000291
Figure FDA0003132577430000301
Figure FDA0003132577430000311
Figure FDA0003132577430000321
Figure FDA0003132577430000331
Figure FDA0003132577430000341
或其盐。
43.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
Figure FDA0003132577430000342
Figure FDA0003132577430000351
或其盐。
44.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自
Figure FDA0003132577430000352
Figure FDA0003132577430000361
Figure FDA0003132577430000371
Figure FDA0003132577430000372
或其盐。
45.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自
Figure FDA0003132577430000373
Figure FDA0003132577430000381
Figure FDA0003132577430000391
Figure FDA0003132577430000392
或其盐。
46.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自
Figure FDA0003132577430000393
Figure FDA0003132577430000401
Figure FDA0003132577430000411
Figure FDA0003132577430000412
或其盐。
47.如权利要求1-46中任一项所述的化合物，其中所述盐是药学上可接受的盐。
48.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物的质子化形式的pKa为约5.1至约8.0。
49.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物的质子化形式的pKa为约5.6至约7.2。
50.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物的pKa为约5.7至约6.5。
51.一种组合物，其包含脂质组分中的如前述权利要求中任一项所述的化合物。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述脂质组分包含约50重量％的如权利要求1-50中任一项所述的化合物。
53.如权利要求51或52所述的组合物，其中所述组合物是LNP组合物。
54.如权利要求51-53中任一项所述的组合物，其中所述脂质组分包含辅助脂质和PEG脂质。
55.如权利要求51-54中任一项所述的组合物，其中所述脂质组分包含辅助脂质、PEG脂质和中性脂质。
56.如权利要求51-55中任一项所述的组合物，其还包含冷冻保护剂。
57.如权利要求51-56中任一项所述的组合物，其还包含缓冲液。
58.如权利要求51-57中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含含有生物活性剂的水性组分。
59.如权利要求58所述的组合物，其中所述生物活性剂包含多肽。
60.如权利要求58所述的组合物，其中所述生物活性剂包含核酸。
61.如权利要求60所述的组合物，其中所述核酸包含RNA。
62.如权利要求60或61所述的组合物，其中所述组合物的N/P比为约3-10。
63.如权利要求62所述的组合物，其中所述N/P比为约6±1。
64.如权利要求62所述的组合物，其中所述N/P比为约6±0.5。
65.如权利要求62所述的组合物，其中所述N/P比为约6。
66.如权利要求51-65中任一项所述的组合物，其包含RNA组分，其中所述RNA组分包含mRNA。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述RNA组分包含编码RNA导向的DNA结合剂的序列，诸如Cas核酸酶mRNA。
68.如权利要求66或67所述的组合物，其中所述RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA。
69.如权利要求66-68中任一项所述的组合物，其中所述RNA组分包含Cas9核酸酶mRNA。
70.如权利要求66-69中任一项所述的组合物，其中所述RNA组分包含修饰的RNA。
71.如权利要求66-70中任一项所述的组合物，其中所述RNA组分包含gRNA核酸。
72.如权利要求71所述的组合物，其中所述gRNA核酸为gRNA。
73.如权利要求66-72中任一项所述的组合物，其中所述RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。
74.如权利要求71-73中任一项所述的组合物，其中所述gRNA核酸为或编码双向导RNA(dgRNA)。
75.如权利要求71-73中任一项所述的组合物，其中所述gRNA核酸为或编码单向导RNA(sgRNA)。
76.如权利要求71-75中任一项所述的组合物，其中所述gRNA为修饰的gRNA。
77.如权利要求76所述的组合物，其中所述修饰的gRNA在5'端的前五个核苷酸中的一个或多个处包含修饰。
78.如权利要求76或77所述的组合物，其中所述修饰的gRNA在3'端的最后五个核苷酸中的一个或多个处包含修饰。
79.如权利要求58-78中任一项所述的组合物，其还包含至少一种模板核酸。
80.一种基因编辑的方法，其包括使细胞与如权利要求51-79中任一项所述的组合物接触。
81.一种裂解DNA的方法，其包括使细胞与如权利要求51-80中任一项所述的组合物接触。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述接触步骤产生单链DNA切口。
83.如权利要求81所述的方法，其中所述接触步骤产生双链DNA断裂。
84.如权利要求81所述的方法，其中所述组合物包含2类Cas mRNA和gRNA核酸。
85.如权利要求80或84所述的方法，其还包括将至少一种模板核酸引入到所述细胞中。
86.如权利要求85所述的方法，其包括使所述细胞与包含模板核酸的组合物接触。
87.如权利要求80-86中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述组合物施用到动物。
88.如权利要求80-86中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述组合物施用到人。
89.如权利要求80-86中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述组合物施用到细胞。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
91.如权利要求80所述的方法，其中所述方法包括施用配制在第一LNP组合物和第二LNP组合物中的mRNA，所述第二LNP组合物包含mRNA、gRNA、gRNA核酸和模板核酸中的一种或多种。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物同时施用。
93.如权利要求91所述的方法，其中所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物依序施用。
94.如权利要求91所述的方法，其中所述方法包括施用配制在单一LNP组合物中的所述mRNA和所述gRNA核酸。
95.如权利要求80-94中任一项所述的方法，其中所述基因编辑产生基因敲除。
96.如权利要求80-94中任一项所述的方法，其中所述基因编辑产生基因校正。
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