KR20210108969A - 변형된 아민 지질 - Google Patents

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KR20210108969A
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alkyl
alkylene
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KR1020217020770A
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스티븐 에스. 스컬리
마이카 메이타니
램지 머줍
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인텔리아 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시 내용은 생물학적 활성제의 전달에 유용한, 예를 들어, 생물학적 활성제를 세포에 전달하여 조작된 세포를 제조하기 위한 이온화 가능한 아민 지질 및 이의 염 (예를 들어, 그의 약제학상 허용되는 염)을 제공한다. 본원에 개시된 이온화 가능한 아민 지질은 지질 나노 입자 기반 조성물의 제형에서 이온화 가능한 지질로서 유용하다.

Description

변형된 아민 지질
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 5일에 출원된 미국 가특허출원 제62/775,783호에 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
이온화 가능한 아민 함유 지질로 제형화된 지질 나노 입자는 생물학적 활성제, 특히 RNA, mRNA 및 가이드 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드를 세포로 전달하기 위한 카고 운반체 역할을 할 수 있다. 이온화 가능한 지질을 함유하는 LNP 조성물은 세포막을 통한 올리고뉴클레오타이드 제제의 전달을 용이하게 할 수 있으며, 유전자 편집을 위한 성분 및 조성물을 살아있는 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다. 특히 세포에 전달하기 어려운 생물학적 활성제는 단백질, 핵산 기반 약물 및 이의 유도체, 특히 mRNA와 같은 비교적 큰 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약물을 포함한다. CRISPR/Cas9 시스템 성분의 전달과 같이 유망한 유전자 편집 기술을 세포로 전달하기 위한 조성물이 특히 중요하다 (예를 들어, 뉴클레아제 및 관련 가이드 RNA (gRNA)를 인코딩하는 mRNA).
CRISPR/Cas의 단백질 및 핵산 성분을 환자의 세포와 같은 세포로 전달하기 위한 조성물이 필요하다. 특히, CRISPR 단백질 성분을 인코딩하는 mRNA를 전달하고 CRISPR 가이드 RNA를 전달하기 위한 조성물이 특히 중요하다. RNA 성분을 안정화하고 전달할 수 있는 시험관 내 및 생체 내 전달에 유용한 특성을 갖는 조성물도 특히 중요하다.
본 개시 내용은 지질 나노 입자 (LNP) 조성물의 제형화에 유용한 아민-함유 지질을 제공한다. 이러한 LNP 조성물은 CRISPR/Cas 유전자 편집 성분과 같은 핵산 카고를 세포로 전달하는데 유리한 특성을 가질 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 화학식 (IA)의 구조를 갖는 화합물:
Figure pct00001
여기서, 각각의 발생에 대해 독립적으로,
X1은 C1-3 알킬렌 또는
Figure pct00002
이고;
X2 는 O, NH, NMe, 및 결합으로부터 선택되고,
X3은 C2-4 알킬렌이고,
X4는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
X5는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
R1은 C1-3 알킬이고,
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 질소 원자 및 R1 또는 X3의 탄소 원자 중 어느 하나와 함께 취하여 4-원, 5-원, 또는 6-원 고리를 형성하고,
Y1은 결합, -CH=CH-, -(C=O)O-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되고,
Y2는 -CH2-CH=CH- 및 C3-C4 알킬렌으로부터 선택되고,
R3은 H, C5-7 사이클로알킬, C8-C10 알케닐, 및 C3-18 알킬로부터 선택되고,
R4는 C4-8 알킬인, 화합물,
또는 이의 염에 관한 것이고,
단, R2가 Me이고, R3이 선형 C12 알킬이고, X1이 C2 알킬렌이고, X2가 O이고, X3이 C3 알킬렌이고, X4가 결합이고, X5가 C1 알킬렌이고, Y1이 시스 -CH=CH-이고, -Y2-R4가 시스 -CH2-CH=CH-(C-5-알킬)일 때, R1은 C2-3 알킬이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 염에 관한 것이다:
Figure pct00003
여기서, 각각의 발생에 대해 독립적으로,
X1은 C2-3 알킬렌이고,
X2는 O, NH, NMe, 및 결합으로부터 선택되고,
X3은 C2-4 알킬렌이고,
X4는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
X5는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
R1은 C1-2 알킬이고,
R2는 C1-2 알킬이거나, 또는
R2는 질소 원자 및 R1 또는 X3의 탄소 원자 중 어느 하나와 함께 취하여 5-원 또는 6-원 고리를 형성하고,
Y1은 -CH=CH-, -(C=O)O-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되고,
R3은 H, C5-7 사이클로알킬, 및 C3-18 알킬로부터 선택되고,
R4는 C4-7 알킬이다.
단, R2가 Me이고, R3이 선형 C12 알킬이고, X1이 C2 알킬렌이고, X2가 O이고, X3이 C3 알킬렌이고, X4가 결합이고, X5가 C1 알킬렌이고, Y1이 시스 -CH=CH-이고, R4가 C5 알킬일 때, R1은 C2 알킬이며, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 같은 이의 염에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 단 R2가 Me이고, R3이 선형 C12 알킬이고, X1이 C2 알킬렌이고, X2가 O이고, X3이 C3 알킬렌이고, X4가 결합이고, X5가 C1 알킬렌이고, Y1이 시스 -CH=CH-일 때, R1은 C2 알킬이다.
특정 실시 양태에서, X1은 선형 C2 알킬렌이다. 다른 실시 양태에서, X1은 C1 알킬렌이다. 일부 실시 양태에서, X1은 선형 C3 알킬렌 또는 분지형 C3 알킬렌이다.
일부 다른 실시 양태에서, X2는 NH 또는 O이다. 특정한 바람직한 실시 양태에서, X2는 O이고, X3은 C3-4 알킬렌이다. 일부 실시 양태에서, X3은 C2-3 알킬렌이다. 특정 실시 양태에서, X2는 NMe이다.
특정 실시 양태에서, R2 및 X3의 탄소 원자는 함께 취하여 4-원 고리를 형성한다. 특정 실시 양태에서, R2 및 X3의 탄소 원자는 함께 취하여 5-원 고리를 형성한다. 일부 실시 양태에서, R2 및 X3의 탄소 원자는 함께 취하여 6-원 고리를 형성한다. 대안적으로, R2는 C2 알킬일 수 있다. 일부 예에서, R2는 C1 알킬이다. 일부 실시 양태에서, R2는 예를 들어, 하이드록시 기로 치환되고, R2의 예는 하이드록시 치환된 C2 알킬을 포함한다.
특정 실시 양태에서, R1은 C1 알킬이다. 대안적으로, R1은 C2 알킬일 수 있다. 일부 실시 양태에서, R1은 예를 들어, 하이드록시 기로 치환되고, R1의 예는 하이드록시 치환된 C2 알킬을 포함한다. 다른 실시 양태에서, R1 및 R2 는 함께 4-원 고리를 형성한다. 다른 실시 양태에서, R1 및 R2는 함께 5-원 고리를 형성한다. 또 다른 실시 양태에서, R1 및 R2는 함께 6-원 고리를 형성한다.
일부 실시 양태에서, R3은 선형 C8-16 알킬, 예를 들어, 선형 C7-12 알킬, 예컨대 선형 C7-9 알킬이다. 대안적으로, R3은 선형 C3-6 알킬일 수 있다. 일부 실시 양태에서, R3은 분지형 C6-10 알킬이다. 다른 실시 양태에서, R3은 C5-7 사이클로알킬, 예를 들어, C6 사이클로알킬이다. 일부 실시 양태에서, R3은 H이다. 일부 실시 양태에서, R3은 C8-10 알케닐이다.
특정 실시 양태에서, R4는 선형 C5-6 알킬이다.
일부 실시 양태에서, X4는 결합이다.
특정 실시 양태에서, X5는 C1 알킬렌이다.
일부 실시 양태에서, Y2-R4는 -CH2-CH=CH-R4이다.
다른 실시 양태에서, Y2는 선형 C3 알킬렌이다.
일부 실시 양태에서, Y1은 결합, -CH=CH-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되고, 예를 들어, -CH=CH- 및 -O(C=O)-이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 II의 화합물 또는 이의 염에 관한 것이다:
Figure pct00004
여기서 변수는 화학식 (IA)에서와 같이 정의된다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 III의 화합물이고;
Figure pct00005
여기서 변수는 화학식 (IA)에서와 같이 정의된다.
화학식 (IA) 또는 (I)의 대표적인 화합물은 다음을 포함한다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
또는 이의 염, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 화합물은
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
또는 이의 염으로부터 선택된다.
다른 실시 양태에서, 상기 화합물은
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
또는 이의 염으로부터 선택된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 화합물은
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
또는 이의 염으로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 화합물에 관한 것으로, 상기 화합물의 양성자화된 형태의 pKa는 약 5.1 내지 약 8.0, 예를 들어 약 5.6 내지 약 7.2, 약 5.7 내지 약 6.5, 또는 약 5.8 내지 약 6.2이다. 일부 실시 양태에서, 상기 상기 화합물의 양성자화된 형태의 pKa는 약 5.5 내지 약 6.0이다. 특정 실시 양태에서, 상기 상기 화합물의 양성자화된 형태의 pKa는 약 6.1 내지 약 6.3이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다,
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 화합물 및 지질 성분을 포함하는, 예를 들어 약 50 중량%의 본원에 기재된 화합물 및 지질 성분, 예컨대 아민 지질, 바람직하게는 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 조성물에 관한 것이며, 여기서 조성물은 LNP 조성물이다. 예를 들어, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 화합물 및 지질 성분을 포함하는 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 지질 성분이 헬퍼 지질 및 PEG 지질을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 지질 성분이 헬퍼 지질, PEG 지질, 및 중성 지질을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 동결 보호제를 추가로 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 완충제를 추가로 포함하는 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 핵산 성분을 추가로 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 RNA 또는 DNA 성분을 추가로 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것으로, 여기서 LNP 조성물은 약 3 내지 10의 N/P 비를 가지며, 예를 들어 N/P 비는 약 6 ± 1이거나, N/P 비는 약 6 ± 0.5이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것으로, 여기서 LNP 조성물은 N/P 비가 약 6이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 RNA 성분이 mRNA를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 RNA 성분이 RNA-유도 DNA 결합제, 예를 들어 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA, 또는 Cas9 뉴클레아제 mRNA와 같은 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 mRNA가 변형된 mRNA인 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 RNA 성분이 gRNA 핵산을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 gRNA 핵산이 gRNA인, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 RNA 성분이 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 gRNA를 포함하는, 본원에 기재된 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 gRNA 핵산이 이중-가이드 RNA (dgRNA)이거나 이를 인코딩하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 gRNA 핵산이 단일-가이드 RNA (sgRNA)이거나 이를 인코딩하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 gRNA가 변형된 gRNA인, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 변형된 gRNA가 5' 말단에서 처음 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 변형된 gRNA가 3' 말단에서 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 주형 핵산을 추가로 포함하는, 본원에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 세포를 LNP와 접촉시키는 단계를 포함하는 유전자 편집 방법에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 DNA 절단을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 세포를 LNP 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, DNA 절단 방법에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 DNA 절단 방법에 관한 것으로, 절단 단계는 단일 가닥 DNA 닉을 도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 DNA 절단 방법에 관한 것으로, 여기서 절단 단계는 이중 가닥 DNA 절단을 도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 LNP 조성물이 클래스 2 Cas mRNA 및 가이드 RNA 핵산을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 DNA 절단 방법에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 주형 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 본원에 기재된 임의의 DNA 절단 방법에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 세포를 주형 핵산을 포함하는 LNP 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 DNA 절단 방법에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 LNP 조성물을 동물, 예를 들어 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 LNP 조성물을 진핵 세포와 같은 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 mRNA, gRNA, gRNA 핵산, 및 주형 핵산 중 하나 이상을 포함하는 제1 LNP 조성물 및 제2 LNP 조성물로 제형화된 mRNA를 투여하는 단계를을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 제1 및 제2 LNP 조성물을 동시에 투여하는, 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 제1 및 제2 LNP 조성물을 순차적으로 투여하는, 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 관한 것으로, 여기서 방법은 단일 LNP 조성물로 제형화된 mRNA 및 가이드 RNA 핵산을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 관한 것이며, 여기서 유전자 편집은 유전자 녹아웃 (knockout)을 초래한다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 관한 것이며, 여기서 유전자 편집은 유전자 교정을 초래한다.
도 1a 내지 1c는 TTR 유전자좌에서의 생체 내 편집 및 검정에서 시험된 화합물을 보여준다. 도 1a는 시험된 화합물의 화학 구조를 예시한다. 도 1b는 전달 후 마우스 간 세포에서 TTR의 편집 백분율을 보여준다. 도 1c는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 2는 화학식 (IA)의 화합물 또는 대조군 화합물을 포함하는 LNP를 사용하여 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR 편집 백분율을 나타내는 그래프이다. 용량 반응 데이터도 표시된다.
도 3a 내지 3b는 화학식 (IA)의 화합물을 포함하는 LNP를 사용하여 전달한 후의 결과를 보여준다. 도 3a는 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR 편집 백분율을 보여주는 그래프이다. 도 3b는 전달 후 혈청 TTR (μg/mL)을 나타내는 그래프이다.
도 4a 내지 4c는 TTR 유전자좌에서의 생체 내 편집 및 검정에서 시험된 화합물을 보여준다. 도 4a는 시험 화합물의 화학 구조를 예시한다. 도 4b는 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 보여준다. 도 4c는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 5a 내지 5c는 화학식 (IA)의 화합물 및 그 화합물을 사용한 전달 결과를 나타낸다. 도 5a는 시험 화합물의 화학 구조를 예시한다. 도 5b는 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 보여준다. 도 5c는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 6a 내지 6c는 화학식 (IA)의 화합물 및 그 화합물을 사용한 전달의 결과를 나타낸다. 도 6a는 시험 화합물의 화학 구조를 예시한다. 도 6b는 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 보여준다. 도 6c는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 7a 내지 7c는 화학식 (IA)의 화합물 및 그 화합물을 사용한 전달 결과를 나타낸다. 도 7a는 시험 화합물의 화학 구조를 예시한다. 도 7b는 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 보여준다. 도 7c는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 8a 내지 8c는 화학식 (IA)의 화합물 및 그 화합물을 사용한 전달 결과를 나타낸다. 도 8a는 n = 1, 2 또는 3인 시험 화합물의 화학 구조를 나타낸다. 도 8b는 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 나타낸다. 도 8c는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 9a 내지 9c는 화학식 (IA)의 화합물 및 그 화합물을 사용한 전달 결과를 나타낸다. 도 9a는 시험 화합물의 화학 구조를 예시한다. 도 9b는 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR 편집 백분율을 보여준다. 도 9c는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 10a 내지 10c는 화학식 (IA)의 화합물 및 그 화합물을 사용한 전달 결과를 나타낸다. 도 10a는 시험 화합물의 화학 구조를 예시한다. 도 10b는 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 보여준다. 도 10c는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 11a 내지 11d는 화학식 (IA)의 화합물 및 그 화합물을 사용한 전달 결과를 나타낸다. 도 11a 및 도 11b는 시험 화합물의 화학 구조를 예시한다. 도 11c는 전달 후 마우스 간 세포에서의 TTR 편집 백분율을 보여준다. 도 11d는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 12a 내지 12b는 화학식 (IA)의 화합물 및 그 화합물을 사용한 전달 결과를 나타낸다. 도 12a는 전달 후 래트 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 보여준다. 도 12b는 전달 후 혈청 TTR 수준 (μg/mL)을 보여준다.
도 13a 내지 13b는 화학식 (IA)의 화합물 및 그 화합물을 사용한 전달 결과를 나타낸다. 도 13a는 시험 화합물의 화학 구조를 예시한다. 도 13b는 전달 후 HUH7 세포에서 TTR의 편집 백분율을 보여준다.
본 개시 내용은 CRISPR/Cas 성분 RNA ("카고(cargo)")와 같은 핵산을 포함하는 생물학적 활성제를 세포에 전달하는 데 유용한 지질, 특히 이온화 가능한 지질, 및 이러한 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 지질 및 이의 약제학적으로 허용되는 염은 임의로, LNP 조성물을 포함하는 지질을 포함하는 조성물로서 제공된다. 특정 실시 양태에서, LNP 조성물은 생물학적 활성제, 예를 들어, RNA 성분, 및 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물을 포함하는 지질 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, RNA 성분은 핵산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 지질은 간 세포와 같은 세포에 예를 들어, mRNA와 같은 핵산과 같은 생물학적 활성제를 전달하는데 사용된다. 특정 실시 양태에서, RNA 성분은 gRNA 및 임의로 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 임의로으로 gRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 유전자 편집 방법 및 이러한 조성물을 사용하여 조작된 세포를 만드는 방법도 제공된다.
지질 나노 입자 조성물
본원에는 CRISPR/Cas카고를 포함하는 핵산, 예를 들어 mRNA 및 gRNA와 같은 생물학적 활성제를 전달하기 위한 다양한 LNP 조성물이 개시된다. 이러한 LNP 조성물은 중성 지질, PEG 지질, 및 헬퍼 지질과 함께 "이온화 가능한 아민 지질"을 포함한다. "지질 나노 입자"또는 "LNP"는 의미를 제한하지 않고 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 회합된 복수의 (즉, 하나 이상의) LNP 성분을 포함하는 입자를 지칭한다.
지질
본 개시 내용은 LNP 조성물에 사용될 수 있는 지질을 제공한다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 화학식 (IA)의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 염에 관한 것이다:
Figure pct00043
여기서, 각각의 발생에 대해 독립적으로,
X1은 C1-3 알킬렌 또는
Figure pct00044
이고;
X2 는 O, NH, NMe, 및 결합으로부터 선택되고,
X3은 C2-4 알킬렌이고,
X4는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
X5는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
R1은 C1-3 알킬이고,
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 질소 원자 및 R1 또는 X3의 탄소 원자 중 어느 하나와 함께 취하여 4-원, 5-원, 또는 6-원 고리를 형성하고,
각각의 Y1은 독립적으로 결합, -CH=CH-, -(C=O)O-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되고,
각각의 Y2는 독립적으로 -CH2-CH=CH- 및 C3-C4 알킬렌으로부터 선택되고,
R3은 H, C5-7 사이클로알킬, C8-C10 알케닐, 및 C3-18 알킬로부터 선택되고,
각각의 R4는 독립적으로 C4-8 알킬이며,
단, R2가 Me이고, R3이 선형 C12 알킬이고, X1은 C2 알킬렌이고, X2가 O이고, X3이 C3 알킬렌이고, X4가 결합이고, X5가 C1 알킬렌이고, Y1이 시스-CH=CH-이고, -Y2-R4가 시스-CH2-CH=CH-(C5-알킬)일 때, R1은 C2-3 알킬이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 단 R2가 Me일 때, R1은 C2-3 알킬이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 R2는 Me가 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 R1은 Me가 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 R3은 선형 C12 알킬이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 X1은 C2 알킬렌이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 X2는 O가 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 X3은 C3 알킬렌이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 X4는 결합이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 X5는 C1 알킬렌이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 Y1은 시스 -CH=CH-이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IA)의 화합물이고, 여기서 -Y2-R4는 시스 -CH2-CH=CH-(C5-알킬)이 아니다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 화학식 (I)을 갖는 화합물 또는 이의 염에 관한 것이다:
Figure pct00045
여기서, 각각의 발생에 대해 독립적으로,
X1은 C2-3 알킬렌이고,
X2 는 O, NH, NMe, 및 결합으로부터 선택되고,
X3은 C2-4 알킬렌이고,
X4는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
X5는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
R1은 C1-2 알킬이고,
R2는 C1-2 알킬이거나, 또는
R2는 질소 원자 및 R1 또는 X3의 탄소 원자 중 어느 하나와 함께 취하여 5-원 또는 6-원 고리를 형성하고,
Y1은 -CH=CH-, -(C=O)O-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되고,
R3은 H, C5-7 사이클로알킬, 및 C3-18 알킬로부터 선택되고,
R4는 C4-7 알킬이며,
단, R2가 Me이고, R3이 선형 C12 알킬이고, X1이 C2 알킬렌, X2가 O이고, X3이 C3 알킬렌이고, X4가 결합이고, X5가 C1 알킬렌이고, Y1이 시스 -CH=CH-이고, R4가 C5 알킬일 때, R1은 C2 알킬이며, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 같은 이의 염에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 단 R2가 Me이고, R3이 선형 C12 알킬이고, X1이 C2 알킬렌이고, X2가 O이고, X3이 C3 알킬렌이고, X4가 결합이고, X5가 C1 알킬렌이고, Y1이 시스 -CH=CH-일 때, R1은 C2 알킬이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 단 R2가 Me일 때, R1은 C2 알킬이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 여기서 R2는Me가 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 여기서 R1은 Me가 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 여기서 R3은 선형 C12 알킬이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 여기서 X1은 C2 알킬렌이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 여기서 X2는 O가 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 여기서 X3은 C3 알킬렌이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 여기서 X4는 결합이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 여기서 X5는 C1 알킬렌이 아니다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물이고, 여기서 Y1은 시스 -CH=CH-가 아니다.
일부 실시 양태에서, 상기 화합물은 거울상 이성질체가 풍부하거나 부분 입체 이성질체가 풍부하고, 예를 들어, 상기 화합물은 거울상 이성질체가 풍부하다.
특정 실시 양태에서, X1은 선형 C2 알킬렌이다. 다른 실시 양태에서, X1은 C1 알킬렌이다. 일부 실시 양태에서, X1은 선형 C3 알킬렌 또는 분지형 C3 알킬렌이다.
일부 다른 실시 양태에서, X2는 NH 또는 O이다. 특정한 바람직한 실시 양태에서, X2는 O이고 X3은 C3-4 알킬렌이다. 일부 실시 양태에서, X3은 C2-3 알킬렌이다. 특정 실시 양태에서, X2는 NMe 또는 결합이다.
특정 실시 양태에서, R2 및 X3의 탄소 원자는 함께 취하여 4-원 고리를 형성한다. 특정 실시 양태에서, R2 및 X3의 탄소 원자는 함께 취하여 5-원 고리를 형성한다. 일부 실시 양태에서, R2 및 X3의 탄소 원자는 함께 취하여 6-원 고리를 형성한다. 대안적으로, R2는 C2 알킬일 수 있다. 일부 예에서, R2는 C1 알킬이다. 일부 실시 양태에서, R2는 예를 들어, 하이드록시기로 치환되고, R2의 예는 하이드록시 치환된 C2 알킬을 포함한다.
특정 실시 양태에서, R1은 C1 알킬이다. 대안적으로, R1은 C2 알킬일 수 있다. 일부 실시 양태에서, R1은 예를 들어, 하이드록시기로 치환되고, R1의 예는 하이드록시 치환된 C2 알킬을 포함한다. 일부 실시 양태에서, R1은 비치환된다. 일부 실시 양태에서, R2는 비치환된다. 바람직한 실시 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 비치환된다. 다른 실시 양태에서, R1 및 R2는 함께 4-원 고리를 형성한다. 다른 실시 양태에서, R1 및 R2는 함께 5-원 고리를 형성한다. 다른 실시 양태에서, R1 및 R2는 함께 6-원 고리를 형성한다.
일부 실시 양태에서, R3은 선형 C8-16 알킬, 예를 들어, 선형 C7-12 알킬, 예컨대 선형 C7-9 알킬이다. 대안적으로, R3은 선형 C3-6 알킬일 수 있다. 일부 실시 양태에서, R3은 분지형 C6-10 알킬이다. 다른 실시 양태에서, R3은 C5-7 사이클로알킬, 예를 들어, C6 사이클로알킬이다. 일부 실시 양태에서, R3은 H이다. 일부 실시 양태에서, R3은 C8-10 알케닐이다.
특정 실시 양태에서, R4는 선형 C5-6 알킬이다.
일부 실시 양태에서, X4는 결합이다.
특정 실시 양태에서, X5는 C1 알킬렌이다.
일부 실시 양태에서, Y2-R4는 -CH2-CH=CH-R4이다.
다른 실시 양태에서, Y2는 선형 C3 알킬렌이다.
일부 실시 양태에서, Y1은 결합, -CH=CH-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되고, 예를 들어, -CH=CH- 및 -O(C=O)-이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 II의 화합물이고:
Figure pct00046
여기서 변수는 화학식 (IA)에서와 같이 정의된다.
특정 실시 양태에서, X1은 선형 C2 알킬렌이다. 다른 실시 양태에서, X1은 C1 알킬렌이다. 일부 실시 양태에서, X1은 선형 C3 알킬렌 또는 분지형 C3 알킬렌이다.
일부 실시 양태에서, R3은 선형 C8-16 알킬, 예를 들어, 선형 C7-12 알킬, 예컨대 선형 C7-9 알킬이다. 대안적으로, R3은 선형 C3-6 알킬일 수 있다. 일부 실시 양태에서, R3은 분지형 C6-10 알킬이다. 다른 실시 양태에서, R3은 C5-7 사이클로알킬, 예를 들어, C6 사이클로알킬이다. 일부 실시 양태에서, R3은 H이다. 일부 실시 양태에서, R3은 C8-10 알케닐이다.
특정 실시 양태에서, R4는 선형 C5-6 알킬이다.
일부 실시 양태에서, X4는 결합이다.
특정 실시 양태에서, X5는 C1 알킬렌이다.
일부 실시 양태에서, Y2-R4는 -CH2-CH=CH-R4이다.
다른 실시 양태에서, Y2는 선형 C3 알킬렌이다.
일부 실시 양태에서, Y1은 결합, -CH=CH-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되고, 예를 들어, -CH=CH- 및 -O(C=O)-이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은
Figure pct00047
Figure pct00048
또는 이의 염으로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화학식 III의 화합물이고;
Figure pct00049
여기서 변수는 화학식 (IA)에서와 같이 정의된다.
특정 실시 양태에서, X1은 선형 C2 알킬렌이다. 다른 실시 양태에서, X1은 C1 알킬렌이다. 일부 실시 양태에서, X1은 선형 C3 알킬렌 또는 분지형 C3 알킬렌이다.
일부 다른 실시 양태에서, X2는 NH 또는 O이다. 특정한 바람직한 실시 양태에서, X2는 O이고 X3은 C3-4 알킬렌이다. 일부 실시 양태에서, X3은 C2-3 알킬렌이다. 특정 실시 양태에서, X2는 NMe 또는 결합이다.
특정 실시 양태에서, R2 및 X3의 탄소 원자는 함께 취하여 4-원 고리를 형성한다. 특정 실시 양태에서, R2 및 X3의 탄소 원자는 함께 취하여 5-원 고리를 형성한다. 일부 실시 양태에서, R2 및 X3의 탄소 원자는 함께 취하여 6-원 고리를 형성한다. 대안적으로, R2는 C2 알킬일 수 있다. 일부 예에서, R2는 C1 알킬이다. 일부 실시 양태에서, R2는 예를 들어, 하이드록시기로 치환되고, R2의 예는 하이드록시 치환된 C2 알킬을 포함한다.
특정 실시 양태에서, R1은 C1 알킬이다. 대안적으로, R1은 C2 알킬일 수 있다. 일부 실시 양태에서, R1은 예를 들어, 하이드록시 기로 치환되고, R1의 예는 하이드록시 치환된 C2 알킬을 포함한다. 일부 실시 양태에서, R1은 비치환된다. 일부 실시 양태에서, R2는 비치환된다. 바람직한 실시 양태에서, R1 및 R2는 둘 다 비치환된다. 다른 실시 양태에서, R1 및 R2는 함께 4-원 고리를 형성한다. 다른 실시 양태에서, R1 및 R2는 함께 5-원 고리를 형성한다. 다른 실시 양태에서, R1 및 R2는 함께 6-원 고리를 형성한다.
일부 실시 양태에서, R3은 선형 C8-16 알킬, 예를 들어, 선형 C7-12 알킬, 예컨대 선형 C7-9 알킬이다. 대안적으로, R3은 선형 C3-6 알킬일 수 있다. 일부 실시 양태에서, R3은 분지형 C6-10 알킬이다. 다른 실시 양태에서, R3은 C5-7 사이클로알킬, 예를 들어, C6 사이클로알킬이다. 일부 실시 양태에서, R3은 H이다. 일부 실시 양태에서, R3은 C8-10 알케닐이다.
일부 실시 양태에서, X4는 결합이다.
특정 실시 양태에서, X5는 C1 알킬렌이다.
화학식 (IA) 또는 (I)의 대표적인 화합물은:
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 같은 이의 염을 포함한다.
화학식 (IA) 또는 (I)의 대표적인 화합물은 다음을 포함한다:
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
일부 실시 양태에서, 상기 화합물은
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
또는 이의 염으로부터 선택된다.
다른 실시 양태에서, 상기 화합물은
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
또는 이의 염으로부터 선택된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 화합물은
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
또는 이의 염으로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 제형화된 지질 조성물의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 적어도 75%가 투여 후 8, 10, 12, 24, 또는 48 시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10일 이내에 대상체의 혈장으로부터 제거된다. 특정 실시 양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물을 포함하는 지질 조성물의 적어도 50%가 투여 후, 8, 10, 12, 24, 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 10일 이내에 대상체의 혈장으로부터 제거되는데, 이는 예를 들어 혈장 중의 지질 (예를 들어, 화학식 (IA), (I), (II), 또는 (III)의 화합물), RNA (예: mRNA), 또는 다른 성분을 측정함으로써 결정될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 지질 캡슐화된 지질 대 유리 지질, RNA, 또는 지질 조성물의 핵산 성분이 측정된다.
지질 제거율은 문헌에 설명된 대로 측정할 수 있다. Maier, M.A., et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 ("Maier") 참조. 예를 들어, Maier에서는 루시퍼라제-표적 siRNA를 함유하는 LNP-siRNA 시스템을 6 내지 8주령 수컷 C57Bl/6 마우스에게 0.3 mg/kg으로 측면 꼬리 정맥을 통한 정맥 내 볼루스 주사로 투여했다. 혈액, 간 및 비장 샘플은 투여 후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 및 168시간 째에 수집되었다. 마우스에 식염수를 주입한 후 조직을 수집하고 혈액 샘플을 처리하여 혈장을 얻었다. 모든 샘플은 처리하고 LC-MS로 분석되었다. 또한 Maier는 LNP-siRNA 조성물 투여 후 독성을 평가하는 절차를 설명한다. 예를 들어, 루시퍼라제-표적 siRNA는 수컷 Sprague-Dawley 래트에게 5 mL/kg의 용량으로 단일 정맥 내 볼루스 주사를 통해 0, 1, 3, 5 및 10 mg/kg (5마리 동물/그룹)으로 투여되었다. 24시간 후, 의식이 있는 동물의 경정맥에서 약 1 mL의 혈액을 채취하여 혈청을 분리했다. 투여 후 72 시간째에 모든 동물을 부검을 위해 안락사시켰다. 임상 징후, 체중, 혈청 화학, 장기 무게 및 조직 병리에 대한 평가가 수행되었다. Maier가 siRNA-LNP 조성물을 평가하는 방법을 설명하지만, 이들 방법은 본 개시 내용의 LNP 조성물과 같은 지질 조성물의 투여의 제거율, 약동학 및 독성을 평가하기 위해 적용될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물을 사용하는 지질 조성물은 대안적인 이온화 가능한 아민 지질에 비해 제거율의 증가를 나타낸다. 일부 이러한 실시 양태에서, 제거율은 지질 제거율, 예를 들어 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물이 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 실시 양태에서, 제거율은 카고 (예를 들어 생물학적 활성제) 제거율, 예를 들어 카고 성분이 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 실시 양태에서, 제거율은 RNA 제거율, 예를 들어 mRNA 또는 gRNA가 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 실시 양태에서, 제거율은 LNP가 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 속도이다. 일부 실시 양태에서, 제거율은 간 조직 또는 비장 조직과 같은 조직으로부터 LNP가 제거되는 속도이다. 바람직하게는, 높은 제거율은 실질적인 부작용이 없는 안전성 프로파일 및/또는 순환 및/또는 조직에서 LNP 축적의 감소를 가져올 수 있다.
본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물은 그들이 있는 매질의 pH에 따라 염을 형성할 수 있다. 예를 들어, 약산성 매질에서, 화합물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)은 양성자화되어 양전하를 가질 수 있다. 반대로, pH가 약 7.35인 혈액과 같은 약염기성 배지에서는 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물이 양성자화되지 않아 전하가 없을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물은 주로 적어도 약 9의 pH에서 양성자화될 수 있다. 본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물은 적어도 약 10의 pH에서 주로 양성자화될 수 있다.
화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물이 주로 양성자화되는 pH는 그것의 고유 pKa와 관련된다. 바람직한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 염은 약 5.1 내지 약 8.0, 더욱더 바람직하게는 약 5.5 내지 약 7.5, 예를 들어 약 6.1 내지 약 6.3 범위의 pKa를 갖는다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 염은 약 5.3 내지 약 8.0, 예를 들어 약 5.6 내지 약 7.2, 약 5.7 내지 약 6.5 범위의 pKa를 갖는다. 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 염은 약 5.7 내지 약 6.4, 예를 들어 약 5.8 내지 약 6.2 범위의 pKa를 갖는다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 염은 약 5.7 내지 약 6.5, 예를 들어 약 5.8 내지 약 6.4 범위의 pKa를 갖는다. 대안적으로, 본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 염은 약 5.8 내지 약 6.5 범위의 pKa를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 양성자화된 형태의 pKa는 약 5.5 내지 약 6.0이다. 본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 염은 약 6.0 내지 약 8.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.5 범위의 pKa를 가질 수 있다. 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 염의 pKa는 LNP를 제형화할 때 중요한 고려 사항이 될 수 있는데, 이는 약 5.5 내지 약 7.0 범위의 pKa를 갖는 특정 지질로 제형화된 LNP가 생체 내에서, 예를 들어 간으로 카고를 전달하는 데 효과적이라는 것이 밝혀졌기 때문이다. 또한, 약 5.3 내지 약 6.4 범위의 pKa를 갖는 특정 지질로 제형화된 LNP가 생체 내에서, 예를 들어 종양에 전달하는 데 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, WO 2014/136086 참조.
특정 실시 양태에서, 개시 내용은 거울상이 풍부한 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물에 관한 것이다. 화합물의 거울상 농축 수준은 거울상 이성질체 과잉 (ee)으로 표현될 수 있다. 화합물의 ee는 거울상 이성질체의 분획의 차이를 거울상 이성질체의 분획의 합으로 나눔으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 화합물이 98% (S)-거울상 이성질체 및 2% (R) 거울상 이성질체를 포함하는 것으로 밝혀지면, 상기 상기 화합물의 ee는 (98 - 2)/(98 + 2) 또는 96%이다. 특정한 실시 양태에서, 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물은 약 30% ee 이상, 40% ee 이상, 50% ee 이상, 60% ee 이상, 70% ee 이상, 약 80% ee, 약 85% ee, 약 88% ee, 약 90% ee, 약 91% ee, 약 92% ee, 약 93% ee, 약 94% ee, 약 95% ee, 약 96% ee, 약 97% ee, 약 98% ee, 약 99% ee 또는 약 99% ee 초과를 갖고, 이 % ee가 0% ee (라세미)와 같이 출발 물질의 % ee보다 큰 경우도 있다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물은 거울상 농축된다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물은 순수한 거울상을 갖는다. 화합물이 하나 이상의 입체 중심을 갖는 실시 양태에서, 입체 중심은 분자의 임의의 다른 입체 중심의 입체 화학적 배치/농축과 실질적으로 독립적으로 풍부할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 화합물은 특정 입체 중심에서 30% de 이상, 40% de 이상, 50% de 이상, 60% de 이상, 70% de 이상, 80% de 이상, 90% de 이상, 95% de 이상 또는 98% de 이상을 가질 수 있다.
추가 지질
본 개시 내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 "중성 지질"은 예를 들어 다양한 중성, 비-하전 또는 쯔비터 이온성 지질을 포함한다. 본 개시 내용에 사용하기에 적합한 중성 포스포리피드의 예는 디팔미토일포스파티딜클로린 (DPPC), 디스테아로일포스파티딜클로린 (DSPC), 포스포클로린 (DOPC), 디미리스토일포스파티딜클로린 (DMPC), 포스파티딜클로린 (PLPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포클로린 (DAPC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 에그 포스파티딜클로린 (EPC), 디라우릴로일포스파티딜클로린 (DLPC), 디미리스토일포스파티딜클로린 (DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜클로린 (MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜클로린 (PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜클로린 (PSPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포클로린 (DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜클로린 (SPPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포클로린 (DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜클로린 (POPC), 라이소포스파티딜 클로린, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 디리놀레오일포스파티딜클로린 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민 (POPE), 라이소포스파티딜에탄올아민 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시 양태에서, 중성 포스포리피드는 디스테아로일포스파티딜클로린 (DSPC) 및 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민 (DMPE)로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 디스테아로일포스파티딜클로린 (DSPC)이다.
"헬퍼 지질"에는 스테로이드, 스테롤, 그리고 알킬 레소르시놀이 포함된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레소르시놀, 및 콜레스테롤 헤미석시네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시 양태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 헤미석시네이트와 같은 그의 유도체일 수 있다.
PEG 지질은 나노 입자가 생체 내 (예: 혈액)에 존재할 수 있는 시간에 영향을 미칠 수 있다. PEG 지질은 예를 들어 입자 응집을 줄이고 입자 크기를 제어함으로써 제형화 과정을 도울 수 있다. 본원에 사용된 PEG 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 전형적으로, PEG 지질은 지질 모이어티 및 PEG (때때로 폴리(에틸렌 옥사이드)라고도 함) (PEG 모이어티)를 기반으로 하는 중합체 모이어티를 포함한다. 본 개시 내용의 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물을 갖는 지질 조성물에 사용하기에 적합한 PEG 지질 및 이러한 지질의 생화학에 대한 정보는 Romberg et al., Pharmaceutical Research 25(1), 2008, pp. 55-71 및 Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52에서 찾을 수 있다. 추가의 적합한 PEG 지질은 예를 들어 WO 2015/095340 (31쪽, 14행 내지 37쪽, 6행), WO 2006/007712 및 WO 2011/076807 ("스텔스 지질")에 개시되어 있다.
일부 실시 양태에서, 지질 모이어티는 디아실글리세롤 또는 디아실글리카미드로부터 유래될 수 있으며, 이는 약 C4 내지 약 C40의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 사슬 길이를 갖는 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드기를 포함하는 것을 포함하고, 여기서 사슬은 예를 들어 아미드 또는 에스테르와 같은 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 알킬 사슬 길이는 약 C10 내지 C20을 포함한다. 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기는 하나 이상의 치환된 알킬기를 추가로 포함할 수 있다. 사슬 길이는 대칭 또는 비대칭일 수 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "PEG"는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 폴리알킬렌 에테르 중합체, 예컨대 글리콜 또는 에틸렌 옥사이드의 임의로 치환된 선형 또는 분지형 중합체를 의미한다. 특정 실시 양태에서, PEG 모이어티는 비치환된다. 대안적으로, PEG 모이어티는 예를 들어, 하나 이상의 알킬, 알콕시, 아실, 하이드록시, 또는 아릴 기에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, PEG 모이어티는 PEG-폴리우렌탄 또는 PEG-폴리프로필렌과 같은 PEG 공중합체를 포함할 수 있다 (예를 들어, J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992) 참조); 대안적으로, PEG 모이어티는 PEG 단일 중합체일 수 있다. 특정 실시 양태에서, PEG 모이어티는 약 130 내지 약 50,000, 예컨대 약 150 내지 약 30,000, 또는 심지어 약 150 내지 약 20,000의 분자량을 갖는다. 유사하게, PEG 모이어티는 약 150 내지 약 15,000, 약 150 내지 약 10,000, 약 150 내지 약 6,000, 또는 심지어 약 150 내지 약 5,000의 분자량을 가질 수 있다. 특정 바람직한 실시 양태에서, PEG 모이어티는 약 150 내지 약 4,000, 약 150 내지 약 3,000, 약 300 내지 약 3,000, 약 1,000 내지 약 3,000, 또는 약 1,500 내지 약 2,500의 분자량을 갖는다.
특정 바람직한 실시 양태에서, PEG 모이어티는 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 "PEG 2000"으로도 지칭되는 "PEG-2K"이다. PEG-2K는 본원에서 하기 화학식 (II)로 표시되며, 여기서 n은 45이며, 이는 수 평균 중합도가 약 45개의 서브 유닛
Figure pct00099
을 포함함을 의미한다.
그러나, 예를 들어 수-평균 중합도가 약 23개의 서브 유닛 (n = 23) 및/또는 68개의 서브 유닛 (n = 68)을 포함하는 것을 포함하는 당 업계에 공지된 다른 PEG실시 양태가 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, n은 약 30 내지 약 60의 범위일 수 있다. 일부 실시 양태에서, n은 약 35 내지 약 55의 범위일 수 있다. 일부 실시 양태에서, n은 약 40 내지 약 50의 범위일 수 있다. 일부 실시 양태에서, n은 약 42 내지 약 48의 범위일 수 있다. 일부 실시 양태에서, n은 45일 수 있다. 일부 실시 양태에서, R은 H, 치환된 알킬, 및 비치환된 알킬로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 양태에서, R은 비치환된 알킬, 예컨대 메틸일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG-디라우로일글리세롤, PEG-디미리스토일글리세롤 (PEG-DMG) (catalog # GM-020, NOF 사로부터, 도쿄, 일본), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤 (PEG-DSPE) (catalog # DSPE-020CN, NOF, 도쿄, 일본), PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, 및 PEG-디스테아로일글리카미드, PEG-콜레스테롤 (1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복스아미도-3',6'-디옥사옥타닐]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB (3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DMG) (cat. #880150P, Avanti Polar Lipids, Alabaster 사로부터, Alabama, USA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSPE) (cat. #880120C, Avanti Polar Lipids 사로부터, Alabaster, Alabama, USA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (PEG2k-DSG; GS-020, NOF 도쿄, 일본), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-디메타크릴레이트 (PEG2k-DMA), 및 1,2-디스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2k-DSA)로부터 선택된다. 특정의 이러한 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSG일 수 있다. 다른 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSPE일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMA일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-C-DMA일 수 있다. 특정 실시 양태에서, PEG 지질은 WO2016/010840 (단락 [00240] 내지 [00244])에 기재된 화합물 S027일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSA일 수 있다. 다른 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-C11일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-C14일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-C16일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-C18일 수 있다.
본 개시 내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 양이온성 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC),N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 -프로판 (DODAP), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디올레오일카바밀-3-디메틸암모늄-프로판 (DOCDAP), 1,2-디리네오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DLINDAP), 디라우릴(C12:0) 트리메틸 암모늄 프로판 (DLTAP), 디옥타데실아미도글리실 스퍼민 (DOGS), DC-Choi, 디올레오일옥시-N-[2-(스퍼민카복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(cis,cis-9,12-옥타데카디에녹시)프로판 (CLinDMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민 (DODMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(cis,cis-9',1-2'-옥타데카디에녹시) 프로판 (CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 (DMOBA), 및 1,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판 (DOcarbDAP)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 실시 양태에서 양이온성 지질은 DOTAP 또는 DLTAP이다.
본 개시 내용에 사용하기에 적합한 음이온성 지질은 포스파티딜글리세롤, 카디올리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜 에탄올아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴 포스파티딜에탄올아민 콜레스테롤 헤미석시네이트 (CHEMS), 및 라이실포스파티딜글리세롤을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
지질 조성물
본 개시 내용은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III) 또는 이의 염 (예를 들어, 약제학적으로 허용되는 염) 중 적어도 하나의 화합물 및 적어도 하나의 다른 지질 성분을 포함하는 지질 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 또한 임의로 하나 이상의 다른 지질 성분과 조합하여 생물학적 활성제를 함유할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 지질 조성물은 생물학적 활성제를 포함하는 지질 성분 및 수성 성분을 포함한다.
일 실시 양태에서, 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 적어도 하나의 다른 지질 성분을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 지질 조성물은 임의로 하나 이상의 다른 지질 성분과 조합된 생물학적 활성제를 추가로 포함한다. 다른 실시 양태에서 지질 조성물은 리포좀 형태이다. 다른 실시 양태에서 지질 조성물은 지질 나노 입자 (LNP)의 형태이다. 다른 실시 양태에서 지질 조성물은 간에 전달하기에 적합하다.
일 실시 양태에서, 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 다른 지질 성분을 포함한다. 이러한 다른 지질 성분은 중성 지질, 헬퍼 지질, PEG 지질, 양이온성 지질 및 음이온성 지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시 양태에서, 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 중성 지질, 예를 들어, 임의로 하나 이상의 추가 지질 성분을 갖는 DSPC을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 헬퍼 지질, 예를 들어 임의로 하나 이상의 추가 지질 성분을 갖는 콜레스테롤을 포함한다. 추가 실시 양태에서, 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 임의로 하나 이상의 추가 지질 성분을 갖는 PEG 지질을 포함한다. 추가 실시 양태에서, 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 임의로 하나 이상의 추가 지질 성분을 갖는 양이온성 지질을 포함한다. 추가 실시 양태에서, 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II), 또는 (III)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 임의로 하나 이상의 추가 지질 성분과 함께 음이온성 지질을 포함한다. 하위 실시 양태에서, 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 헬퍼 지질, 및 임의로 중성 지질을 갖는 PEG 지질을 포함한다. 추가 하위 실시 양태에서, 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 헬퍼 지질, PEG 지질, 및 중성 지질을 포함한다.
화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 조성물, 또는 그의 지질 조성물은 다양한 분자를 세포에 전달하는데 유용한 마이크로 입자, 나노 입자 및 형질 감염제를 포함한 전달제를 형성하는 입자를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태일 수 있다. 특정 조성물은 생물학적 활성제를 형질 감염 또는 전달하는 데 효과적이다. 바람직한 생물학적 활성제는 RNA 및 DNA이다. 추가 실시 양태에서, 생물학적 활성제는 mRNA, gRNA 및 DNA로부터 선택된다. gRNA는 dgRNA 또는 sgRNA일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 카고는 RNA 유도 DNA 결합제를 인코딩하는 mRNA (예: Cas 뉴클레아제, 클래스 2 Cas 뉴클레아제 또는 Cas9), gRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 핵산, 또는 mRNA와 gRNA의 조합일 수 있다.
상기 지질 조성물에 사용하기 위한 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 예시적인 화합물은 실시예 2 내지 48, 50 내지 97, 99 내지 103, 및 105 내지 113에 제공된다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 2이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 3이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 4이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 5이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 6이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 7이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 8이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　9이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 10이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 11이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 12이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 13이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　14이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 15이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 16이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　17이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　18이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　19이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　20이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 21이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 22이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 23이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 24이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 25이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 26이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　27이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 28이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　29이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 30이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 31이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 32이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 33이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 34이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 35이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 36이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　37이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　38이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　39이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　40이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 41이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 42이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 43이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 44이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 45이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 46이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　47이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　48이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　50이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 51이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 52이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 53이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 54이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 55이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 56이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　57이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　58이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　59이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　60이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 61. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 62이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 63이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 64이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 65이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 66이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　67이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　68이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　69이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　70이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 71이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 72이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 73이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 74이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 75. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 76이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　77이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　78이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　79이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　80이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 81이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 82이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 83이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 84이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 85이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 86이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　87이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　88이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　89이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　90이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 91이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 92이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 93이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 94이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 95이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 96이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　97이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　99이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　100이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 101이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 102이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 103이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 105이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 106이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물　107이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 108이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 109이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 110이다.
특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 111이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 112이다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA)의 화합물은 화합물 113이다.
특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화합물 1이 아니다. 특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화합물 49가 아니다. 특정 실시 양태에서, 상기 화합물은 화합물 114가 아니다.
LNP 조성물
지질 조성물은 LNP 조성물로 제공될 수 있다. 지질 나노 입자는 예를 들어 마이크로스피어 (단일 라멜라 및 다중 라멜라 소포, 예를 들어 "리포좀" -일부 실시 양태에서 실질적으로 구형인 라멜라 상 지질 이중층- 포함, 보다 특정한 실시 양태에서는 예를 들어 RNA 분자의 상당 부분 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있음), 에멀젼의 분산 상, 미셀 또는 현탁액의 내부 상일 수 있다.
LNP는 약 1 내지 약 1,000 nm, 약 10 내지 약 500 nm, 약 20 내지 약 500 nm, 하위 실시 양태에서 약 50 내지 약 400 nm, 하위 실시 양태에서 약 50 내지 약 300 nm, 하위 실시 양태에서 약 50 내지 약 200 nm, 하위 실시 양태에서 약 50 내지 약 150 nm, 및 다른 하위 실시 양태에서 약 60 내지 약 120 nm의 크기를 갖는다. 바람직하게는, LNP는 약 60 nm 내지 약 100 nm의 크기를 갖는다. 완전히 형성된 LNP의 평균 크기 (직경)는 Malvern Zetasizer상에서 동적 광 산란에 의해 측정될 수 있다. LNP 샘플은 계수율이 약 200 내지 400 kcps가 되도록 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 희석된다. 데이터는 강도 측정의 가중 평균으로 표시된다.
본 개시 내용의 실시 양태는 조성물 중의 성분 지질의 각각의 몰비에 따라 기재된 지질 조성물을 제공한다. 모든 몰% 수는 지질 조성물, 또는 보다 구체적으로 LNP 조성물의 지질 성분의 분획으로 제공된다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 몰%는 약 30 몰% 내지 약 70 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 몰%는 적어도 30 몰%, 적어도 40 몰%, 적어도 50 몰%, 또는 적어도 60 몰%일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 중성 지질의 몰%는 약 0 몰% 내지 약 30 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 중성 지질의 몰%는 약 0 몰% 내지 약 20 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 중성 지질의 몰%는 약 10 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 중성 지질의 몰%는 약 9 몰%일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 헬퍼 지질의 몰%는 약 0 몰% 내지 약 80 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 헬퍼 지질의 몰%는 약 20 몰% 내지 약 60 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 헬퍼 지질의 몰%는 약 30 몰% 내지 약 50 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 헬퍼 지질의 몰%는 30 몰% 내지 약 40 몰% 또는 약 35% 몰% 내지 약 45 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 헬퍼 지질의 몰%는 지질 성분을 100 몰%이 되도록 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물, 중성 지질 및/또는 PEG 지질 농도를 기준으로 조정된다.
특정 실시 양태에서, PEG 지질의 몰%는 약 1 몰% 내지 약 10 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, PEG 지질의 몰%는 약 1 몰% 내지 약 4 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, PEG 지질의 몰%는 약 1 몰% 내지 약 2 몰%일 수 있다. 특정 실시 양태에서, PEG 지질의 몰%는 약 1.5 몰%일 수 있다.
다양한 실시 양태에서, LNP 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III) 또는 이의 염 (예컨대 이의 약제학적으로 허용되는 염 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같음))의 화합물, 중성 지질 (예: DSPC), 헬퍼 지질 (예: 콜레스테롤) 및 PEG 지질 (예: PEG2k-DMG)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, LNP 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같음), DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG 지질을 포함한다. 이러한 일부 실시 양태에서, LNP 조성물은 DMG, 예컨대 PEG2k-DMG를 포함하는 PEG 지질을 포함한다. 특정 바람직한 실시 양태에서, LNP 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 지질 조성물, 예를 들어 LNP 조성물은 지질 성분 및 핵산 성분, 예를 들어 RNA 성분을 포함하고, 및 핵산에 대한 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 몰비가 측정될 수 있다. 본 개시 내용의 실시 양태는 또한 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물의 약제학상 허용되는 염의 양으로 하전된 아민기 (N)와 캡슐화될 핵산의 음으로 하전된 인산염 기 (P) 사이에 정의된 몰비를 갖는 지질 조성물을 제공한다. 이것은 방정식 N/P로 수학적으로 표현될 수 있다. 일부 실시 양태에서, LNP 조성물과 같은 지질 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 핵산 성분을 포함하는 지질 성분을 포함할 수 있고, 여기서 N/P 비는 약 3 내지 10이다. 일부 실시 양태에서, LNP 조성물은 화학식 (IA), (I), (II), 또는 (III)의 화합물, 또는 약제학적으로 허용되는 염; 및 RNA 성분을 포함하는 지질 성분을 포함할 수 있고, 여기서 N/P 비는 약 3 내지 10이다. 예를 들어, N/P 비는 약 4 내지 7일 수 있다. 대안적으로, N/P 비는 약 6, 예를 들어 6 ± 1 또는 6 ± 0.5일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 수성 성분은 생물학적 활성제를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수성 성분은 임의로 핵산과 조합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수성 성분은 RNA와 같은 핵산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수성 성분은 핵산 성분이다. 일부 실시 양태에서, 핵산 성분은 DNA를 포함하며 이는 DNA 성분이라고 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 핵산 성분은 RNA를 포함하며 이는 RNA 성분이라고 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, RNA 성분과 같은 수성 성분은 RNA 유도 DNA 결합제를 인코딩하는 mRNA와 같은 mRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, RNA 유도 DNA 결합제는 Cas 뉴클레아제다. 특정 실시 양태에서, 수성 성분은 Cas9를 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 수성 성분은 gRNA를 포함할 수 있다. RNA 유도 DNA 결합제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 조성물은 gRNA와 같은 gRNA 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수성 성분은 RNA 유도 DNA 결합제 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수성 성분은 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수성 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 gRNA를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 지질 조성물, 예컨대 LNP 조성물은 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 같은 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA, 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 헬퍼 지질, 임의로 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 같은 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 특정 조성물에서 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 같은 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 다른 조성물에서 중성 지질은 DSPC이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 추가 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 같은 Cas 뉴클레아제를 코딩하는 mRNA, 및 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 특정 조성물에서. 특정 조성물에서, 조성물은 dgRNA 또는 sgRNA와 같은 gRNA를 추가로 포함한다.
일부 실시 양태에서, 지질 조성물, 예컨대 LNP 조성물은 gRNA를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 조성물은 화학식 (IA), (I), (II), 또는 (III)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, gRNA, 헬퍼 지질, 임의로 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. gRNA를 포함하는 특정 LNP 조성물에서 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. gRNA를 포함하는 일부 조성물에서 중성 지질은 DSPC이다. gRNA를 포함하는 추가 실시 양태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 특정 조성물에서 gRNA는 dgRNA 및 sgRNA로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 지질 조성물, 예를 들어 LNP 조성물은 수성 성분으로 RNA 유도 DNA 결합제를 인코딩하는 mRNA, 및 sgRNA일 수 있는 gRNA을, 또한 지질 성분으로 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물을 포함한다. 예를 들어, LNP 조성물은 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA, gRNA, 헬퍼 지질, 중성 지질 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 특정 조성물에서 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 일부 조성물에서 중성 지질은 DSPC이다. Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 추가 실시 양태에서 PEG 지질은 PEG2k-DMG이다.
특정 실시 양태에서, 지질 조성물, 예를 들어 LNP 조성물은 RNA 유도 DNA 결합제, 예를 들어 클래스 2 Cas mRNA 및 적어도 하나의 gRNA를 포함한다. 특정 실시 양태에서, LNP 조성물은 gRNA 대 RNA 유도 DNA 결합제 mRNA, 예를 들어 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 약 1:1 또는 약 1:2의 비로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비는 약 25:1 내지 약 1:25, 약 10:1 내지 약 1:10, 약 8:1 내지 약 1:8, 약 4:1 내지 약 1:4, 또는 약 2:1 내지 약 1:2이다.
LNP 조성물과 같은 본 명세서에 개시된 지질 조성물은 주형 핵산, 예를 들어 DNA 주형을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 LNP 조성물을 포함하여 화학식 (IA), (I), (II) 또는 (III)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 지질 조성물과 함께 또는 그와 별도로 전달될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 주형 핵산은 원하는 복구 메커니즘에 따라 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 주형은 표적 DNA에 대해 예를 들어, 표적 DNA 서열 내에서, 및/또는 표적 DNA에 인접한 서열에 대해 상동성 영역을 가질 수 있다.
일부 실시 양태에서, LNP는 RNA 수용액과 유기 용매계 지질 용액을 혼합하여 형성된다. 적합한 용액 또는 용매는 물, PBS, Tris 완충제, NaCl, 시트레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 에탄올, 클로로포름, 디에틸에테르, 사이클로헥산, 테트라하이드로푸란, 메탄올, 에테르이소프로판올을 포함하거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매는 100% 에탄올일 수 있다. 예를 들어, LNP의 생체 내 투여를 위한 약제학적으로 허용되는 완충제가 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 완충제는 LNP를 포함하는 조성물의 pH를 pH 6.5 이상으로 유지하기 위해 사용된다. 특정 실시 양태에서, 완충제는 LNP를 포함하는 조성물의 pH를 pH 7.0 이상으로 유지하는데 사용된다. 특정 실시 양태에서, 조성물은 약 7.2 내지 약 7.7 범위의 pH를 갖는다. 추가 실시 양태에서, 조성물은 약 7.3 내지 약 7.7 범위 또는 약 7.4 내지 약 7.6 범위의 pH를 갖는다. 추가 실시 양태에서, 조성물은 약 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6 또는 7.7의 pH를 갖는다. 조성물의 pH는 마이크로 pH 프로브로 측정할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 동결 방지제가 조성물에 포함된다. 동결 방지제의 비제한적인 예는 수크로스, 트레할로스, 글리세롤, DMSO 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 예시적인 조성물은 예를 들어 수크로스와 같은 동결 방지제를 최대 10% 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 조성물은 트리스 식염수 수크로스 (TSS)를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, LNP 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 동결 방지제를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, LNP 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10% 수크로스를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, LNP 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 완충제는 포스페이트 완충제 (PBS), Tris 완충제, 시트레이트 완충제 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 예시적 실시 양태에서, 완충제는 NaCl을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 완충제에는 NaCl이 없다. NaCl의 예시적인 양은 약 20 mM 내지 약 45 mM 범위일 수 있다. NaCl의 예시적인 양은 약 40 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 일부 실시 양태에서, NaCl의 양은 약 45 mM이다. 일부 실시 양태에서, 상기 완충제는 Tris 완충제이다. Tris의 예시적인 양은 약 20 mM 내지 약 60 mM 범위일 수 있다. Tris의 예시적인 양은 약 40 mM 내지 약 60 mM 범위일 수 있다. 일부 실시 양태에서, Tris의 양은 약 50 mM이다. 일부 실시 양태에서, 완충제는 NaCl 및 Tris를 포함한다. LNP 조성물의 특정 예시적 실시 양태는 Tris 완충제에 5% 수크로스 및 45 mM NaCl을 함유한다. 다른 예시적 실시 양태에서, 조성물은 pH 7.5에서 약 5% w/v 양의 수크로스, 약 45 mM NaCl 및 약 50 mM Tris를 함유한다. 염, 완충제 및 동결 보호제의 양은 전체 조성물의 삼투압이 유지되도록 다양하게 할 수 있다. 예를 들어, 최종 삼투압은 450 mOsm/L 미만으로 유지될 수 있다. 추가 실시 양태에서, 삼투압은 350 내지 250 mOsm/L이다. 특정 실시 양태는 300 +/- 20 mOsm/L 또는 310 +/- 40 mOsm/L의 최종 삼투압을 갖는다.
일부 실시 양태에서, RNA 수용액과 유기 용매 중 지질 용액의 미세 유체 혼합, T-혼합 또는 교차 혼합이 사용된다. 특정 측면에서, 유속, 접합 크기, 접합 기하학적 구조, 접합 모양, 튜브 직경, 용액 및/또는 RNA 및 지질 농도는 다양할 수 있다. LNP 또는 LNP 조성물은 예를 들어 투석, 원심 분리 필터, 접선 유동 여과, 또는 크로마토그래피를 통해 농축 또는 정제될 수 있다. LNP는 예를 들어 현탁액, 에멀젼 또는 동결 건조된 분말로 저장될 수 있다. 일부 실시 양태에서, LNP 조성물은 2 내지 8℃에서 저장되고, 특정 측면에서, LNP 조성물은 실온에서 저장된다. 추가 실시 양태에서, LNP 조성물은 예를 들어 -20℃ 또는 -80℃에서 냉동 저장된다. 다른 양태에서, LNP 조성물은 약 0℃ 내지 약 -80℃ 범위의 온도에서 저장된다. 동결된 LNP 조성물은 사용 전에, 예를 들어 얼음, 실온 또는 25℃에서 해동될 수 있다.
LNP는 예를 들어, 마이크로스피어 (단일 라멜라 및 다중 라멜라 소포, 예를 들어 "리포좀" -일부 실시 양태에서 실질적으로 구형인 라멜라 상 지질 이중층- 포함, 보다 특정한 실시 양태에서는 예를 들어 RNA 분자의 상당 부분 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있음), 에멀젼의 분산 상, 미셀 또는 현탁액의 내부상일 수 있다.
LNP 조성물과 같은 바람직한 지질 조성물은 생체 내에서 치료적 유효 용량에서 세포 독성 수준으로 축적되지 않는다는 점에서 생분해성이다. 일부 실시 양태에서, 조성물은 치료 용량 수준에서 실질적인 부작용을 초래하는 선천적 면역 반응을 유발하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 본원에 제공된 조성물은 치료 용량 수준에서 독성을 유발하지 않는다.
일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 LNP는 약 0.005 내지 약 0.75 범위일 수 있는 다분산 지수 (PDI)를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 0.01 내지 약 0.5 범위일 수 있는 PDI를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 0 내지 약 0.4 범위일 수 있는 PDI를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 0 내지 약 0.35 범위일 수 있는 PDI를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 0 내지 약 0.35 범위일 수 있는 PDI를 갖는다. 실시 양태에서, LNP PDI는 약 0 내지 약 0.3 범위일 수 있다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 0 내지 약 0.25 범위일 수 있는 PDI를 갖는다. 실시 양태에서, LNP PDI는 약 0 내지 약 0.2 범위일 수 있다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 0.08, 0.1, 0.15, 0.2 또는 0.4 미만일 수 있는 PDI를 갖는다.
본 명세서에 개시된 LNP는 약 1 내지 약 250 nm의 크기 (예: Z-평균 직경)를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 10 내지 약 200 nm의 크기를 갖는다. 추가 실시 양태에서, LNP는 약 20 내지 약 150 nm의 크기를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 50 내지 약 150 nm의 크기를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 50 내지 약 100 nm의 크기를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 50 내지 약 120 nm의 크기를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 60 내지 약 100 nm의 크기를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 75 내지 약 150 nm의 크기를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 75 내지 약 120 nm의 크기를 갖는다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 75 내지 약 100 nm의 크기를 갖는다. 달리 표시되지 않는 한, 여기에서 언급된 모든 크기는 Malvern Zetasizer 상에서 동적 광 산란에 의해 측정된 완전히 형성된 나노 입자의 평균 크기 (직경)이다. 나노 입자 샘플은 계수율이 약 200 내지 400 kcps가 되도록 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 희석된다. 데이터는 강도 측정의 가중 평균으로 표시된다 (Z-평균 직경).
일부 실시 양태에서, LNP는 약 50% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 50% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 70% 내지 약 90% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 90% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시 양태에서, LNP는 약 75% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다.
카고
LNP 조성물을 통해 전달되는 카고는 생물학적 활성제가 될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 카고는 mRNA, 가이드 RNA, 핵산, 발현 벡터, 주형 핵산, RNA-유도 DNA 결합제, 항체 (예를 들어, 단일 클론, 키메라, 인간화, 나노 바디 및 그 단편 등), 콜레스테롤, 호르몬, 펩타이드, 단백질, 화학 요법제 및 기타 항-종양제, 저 분자량 약물, 비타민, 보조 인자, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 효소 핵산, 안티센스 핵산, 삼중체 형성 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 DNA 또는 RNA 조성물, 키메라 DNA:RNA 조성물, 알로자임, 압타머, 리보자임, 디코이 및 이들의 유사체, 플라스미드 및 기타 유형의 벡터, 및 작은 핵산 분자, RNAi 작용제, 짧은 간섭 핵산 (siNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 "자가 복제 RNA" (복제 효소 활성을 인코딩하고 생체 내에서 자체 복제 또는 증폭을 지시할 수 있음) 분자, 펩타이드 핵산 (PNA), 잠긴 핵산 리보뉴클레오타이드 (LNA), 모르폴리노 뉴클레오타이드, 트레오스 핵산 (TNA), 글리콜 핵산 (GNA), sisiRNA (작은 내부 분할 간섭 RNA) 및 iRNA (비대칭 간섭 RNA)와 같은 하나 이상의 생물학적 활성제이거나 이를 포함한다. 상기 생물학적 활성제 목록은 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 이러한 화합물은 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있으며, 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있으며 화학적으로 변형될 수 있다.
LNP 조성물을 통해 전달되는 카고는 관심 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자와 같은 RNA일 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), RNA 유도 DNA 결합제, 또는 Cas 뉴클레아제와 같은 단백질을 발현하기 위한 mRNA가 포함된다. Cas 뉴클레아제 mRNA, 예를 들어 Cas9 또는 Cpf1 단백질과 같은 클래스 2 Cas 뉴클레아제의 세포에서 발현을 허용하는 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 LNP 조성물이 제공된다. 또한, 카고에는 하나 이상의 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산이 포함될 수 있다. 예를 들어, 복구 또는 재조합을 위한 주형 핵산이 또한 조성물에 포함될 수 있거나 주형 핵산이 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 하위 실시 양태에서, 카고는 임의로 화농연쇄구균 (Streptococcus pyogenes) Cas9를 인코딩하는 mRNA, 및 S. pyogenes gRNA를 포함한다. 추가 하위 실시 양태에서, 카고는 임의로 수막염균 (Neisseria meningitidis Cas)9를 인코딩하는 mRNA, 및 nme gRNA를 포함한다.
"mRNA"는 폴리뉴클레오타이드를 말하며 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (즉, 리보솜 및 아미노-아실화된 tRNA에 의한 번역을 위한 기질로서 작용할 수 있음). mRNA는 리보스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어 2'-메톡시 리보스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 골격을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, mRNA 포스페이트-당 골격의 당은 본질적으로 리보스 잔기, 2'-메톡시 리보스 잔기, 또는 이들의 조합으로 구성된다. 일반적으로 mRNA는 상당한 양의 티미딘 잔기를 함유하지 않는다 (예: 0개 잔기 또는 30개, 20개, 10개, 5개, 4개, 3개 또는 2개 미만의 티미딘 잔기, 또는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 티미딘 함량). mRNA는 우리딘 위치의 일부 또는 전부에 변형된 우리딘을 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas 카고
특정 실시 양태에서, 개시된 조성물은 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA 유도 DNA 결합제를 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 개시된 조성물은 S. pyogenes Cas9와 같은 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 포함한다.
본원에 사용된 "RNA 유도 DNA 결합제"는 RNA 및 DNA 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체, 또는 이러한 복합체의 DNA-결합 서브 유닛을 의미하며, 여기서 DNA 결합 활성은 서열 특이적이고 RNA의 서열에 의존한다. 예시적인 RNA 유도 DNA 결합제는 Cas 클리바제 (cleavases)/닉카제 (nickase) 및 이의 불활성화된 형태 ("dCas DNA 결합제")를 포함한다. 본원에 사용된 "Cas 뉴클레아제"는 Cas 클리바제, Cas 닉카제, 및 dCas DNA 결합제를 포함한다. Cas 클리바제/닉카제 및 dCas DNA 결합제는 III형 CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, 그의 Cas10, Csm1 또는 Cmr2 서브 유닛, I형 CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 그의 Cas3 서브 유닛, 및 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 본원에 사용된 "클래스 2 Cas 뉴클레아제"는 RNA 유도 DNA 결합 활성을 갖는 단일 사슬 폴리펩타이드이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제에는 RNA 유도 DNA 클리바제 또는 닉카제 활성을 추가로 갖는 클래스 2 Cas 클리바제/닉카제 (예: H840A, D10A 또는 N863A 변이체) 및 클리바제/닉카제 활성이 비활성화된 클래스 2 dCas DNA 결합제가 포함된다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 예를 들어 Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9 (예: N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9 (예: N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9 (1.0) (예: K810A, K1003A, R1060A 변이체) 및 eSPCas9 (1.1) (예: K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 이의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질, Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015)은 Cas9와 상동성이며 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 그 전체가 참고로 포함된다. 예를 들어 Zetsche, 표 S1 및 S3을 참조. 예를 들어, Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13 (11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60: 385-397 (2015).
본원에 사용된 "리보 핵단백질" (RNP) 또는 "RNP 복합체"는 Cas 뉴클레아제, 예를 들어 Cas 클리바제, Cas 닉카제 또는 dCas DNA 결합제 (예: Cas9)와 같은 RNA 유도 DNA 결합제와 함께 가이드 RNA를 의미한다. 일부 실시 양태에서, 가이드 RNA는 Cas9와 같은 RNA 유도 DNA 결합제를 표적 서열로 안내하고, 가이드 RNA는 혼성화하고 제제가 표적 서열과 결합한다; 제제가 클리바제 또는 닉카제인 경우 결합 후에 절단 또는 닉킹이 이어질 수 있다.
본 개시 내용의 일부 실시 양태에서, LNP 조성물을 위한 카고는 뉴클레아제 (예: Cas9와 같은 Cas 뉴클레아제)일 수 있는 RNA 유도 DNA 결합제를 표적 DNA로 유도하는 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함한다. gRNA는 Cas 뉴클레아제 또는 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 표적 핵산 분자상의 표적 서열로 안내할 수 있다. 일부 실시 양태에서, gRNA는 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 결합하여 절단 특이성을 제공한다. 일부 실시 양태에서, gRNA 및 Cas 뉴클레아제는 리보 핵 단백질 (RNP), 예를 들어 CRISPR/Cas9 복합체와 같은 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시 양태에서, CRISPR/Cas 복합체는 II형 CRISPR/Cas9 복합체일 수 있다. 일부 실시 양태에서, CRISPR/Cas 복합체는 Cpf1/guide RNA 복합체와 같은 V형 CRISPR/Cas 복합체일 수 있다. Cas 뉴클레아제 및 동족 gRNA는 쌍을 이룰 수 있다. 각 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 쌍을 이루는 gRNA 스캐폴드 구조는 특정 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다.
"가이드 RNA", "gRNA" 및 간단히 "가이드"는 RNA 유도 DNA 결합제에 대한 동족 가이드 핵산을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. gRNA는 crRNA (CRISPR RNA라고도 함)이거나 crRNA와 trRNA (tracrRNA라고도 함)의 조합일 수 있다. 가이드 RNA는 본원에 기재된 바와 같이 변형된 RNA를 포함할 수 있다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자 (단일 가이드 RNA, sgRNA)로서 또는 두 개의 개별 RNA 분자 (이중 가이드 RNA, dgRNA)로 결합될 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 각 유형을 참조한다. trRNA는 자연 발생 서열, 또는 자연 발생 서열과 비교하여 변형 또는 변이가 있는 trRNA 서열일 수 있다.
본원에 사용된 "가이드 서열"은 표적 서열에 상보적이고 RNA 유도 DNA 결합제에 의한 결합 또는 변형 (예를 들어, 절단)을 위해 가이드 RNA를 표적 서열로 안내하는 기능을 하는 가이드 RNA 내의 서열을 지칭한다. "가이드 서열"은 또한 "표적화 서열" 또는 "스페이서 서열"로 지칭될 수 있다. 가이드 서열은 예를 들어 화농연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes) (즉, Spy Cas9) 및 관련 Cas9 동족체/오르톨로그의 경우 길이가 20개 염기쌍일 수 있다. 더 짧거나 더 긴 서열, 예를 들어 길이 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24- 또는 25- 뉴클레오타이드가 가이드로 사용될 수도 있다. 일부 실시 양태에서, 표적 서열은 예를 들어 유전자 또는 염색체 상에 있고, 가이드 서열에 상보적이다. 일부 실시 양태에서, 가이드 서열과 그에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드의 영역에 대해 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 가이드 서열과 표적 영역은 적어도 하나의 불일치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열과 표적 서열은 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있으며, 여기서 표적 서열의 총 길이는 적어도 17, 18, 19, 20개 이상의 염기쌍이다. 일부 실시 양태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1 내지 4개의 불일치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 적어도 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 1, 2, 3 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열 및 표적 영역은 가이드 서열이 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
Cas 단백질과 같은 RNA 유도 DNA 결합 단백질에 대한 표적 서열은 Cas 단백질의 핵산 기질이 이중 가닥 핵산이기 때문에 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥 (즉, 주어진 서열과 서열의 역 상보체)을 모두 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열에 상보적"이라고 말하는 경우, 가이드 서열은 gRNA가 표적 서열의 역 상보체에 결합하도록 지시할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역 상보체에 결합하는 경우, 가이드 서열은 가이드 서열에서 T가 U로 치환된 것을 제외하고는 표적 서열 (예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 특정 뉴클레오타이드와 동일하다.
표적화 서열의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템 및 구성 요소에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 박테리아 종의 서로 다른 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 다양한 최적의 표적화 서열 길이를 가지고 있다. 따라서, 표적화 서열은 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 또는 50개 초과인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 표적 서열 길이는 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 서열보다 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오타이드가 더 길거나 더 짧다. 특정 실시 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA 스캐폴드는 동일한 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 것이다. 일부 실시 양태에서, 표적화 서열은 18 내지 24개 뉴클레오타이드를 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 표적화 서열은 19 내지 21개 뉴클레오타이드를 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 표적화 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 그로 구성될 수 있다.
일부 실시 양태에서, sgRNA는 Cas9 단백질에 의한 RNA 유도 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cas9 sgRNA"이다. 일부 실시 양태에서, sgRNA는 Cpf1 단백질에 의해 RNA 유도 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cpf1 sgRNA"이다. 특정 실시 양태에서, gRNA는 Cas9 단백질과 활성 복합체를 형성하고 RNA 유도 DNA 절단을 매개하기에 충분한 crRNA 및 tracr RNA를 포함한다. 특정 실시 양태에서, gRNA는 Cpf1 단백질과 활성 복합체를 형성하고 RNA 유도 DNA 절단을 매개하기에 충분한 crRNA를 포함한다. Zetsche 2015를 참조.
본 개시 내용의 특정 실시 양태는 또한 본원에 기재된 gRNA를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 발현 카세트를 제공한다. "가이드 RNA 핵산"은 가이드 RNA (예를 들어, sgRNA 또는 dgRNA) 및 가이드 RNA 발현 카세트를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 이는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산이다.
변형된 RNA
특정 실시 양태에서, 지질 조성물, 예컨대 LNP 조성물은 변형된 RNA를 포함하는 변형된 핵산을 포함한다.
변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 RNA, 예를 들어 gRNA 또는 mRNA에 존재할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA 또는 mRNA는 표준 A, G, C 및 U 잔기 대신 또는 그에 추가로 사용되는 하나 이상의 비-천연 및/또는 자연 발생 성분 또는 구성의 존재를 설명하기 위해 "변형된" RNA로 불린다. 일부 실시 양태에서, 변형된 RNA는 비표준 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 사용하여 합성되고, 여기서는 "변형"된다고 한다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 포스포디에스테르 골격 연결에서 비-연결 포스페이트 산소 및/또는 하나 이상의 연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다의 변경, 예컨대 대체 (예시적인 골격 변형); (ii) 리보스 당의 구성 성분, 예를 들어 리보스 당의 2' 하이드록실의 변경, 예컨대 대체 (예시적인 당 변형); (iii) "디포스포 (dephospho)" 링커로 포스페이트 모이어티의 전체 대체 (예시적인 골격 변형); (iv) 비표준 핵 염기를 포함하는 자연 발생 핵 염기의 변형 또는 대체 (예시적인 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형 (예시적인 골격 변형); (vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합 (이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체 (예시적인 당 변형).
특정 실시 양태는 mRNA, gRNA 또는 핵산에 대한 변형을 포함한다. 특정 실시 양태는 mRNA, gRNA 또는 핵산에 대한 5' 말단 변형을 포함한다. 특정 실시 양태는 mRNA, gRNA 또는 핵산에 대한 3' 말단 변형을 포함한다. 변형된 RNA는 5' 말단 및 3' 말단 변형을 함유할 수 있다. 변형된 RNA는 비-말단 위치에 하나 이상의 변형된 잔기를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, gRNA는 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 특정 실시 양태에서, mRNA는 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
변형되지 않은 핵산은 예를 들어, 세포 내 뉴클레아제 또는 혈청에서 발견되는 것들에 의해 분해되기 쉽다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수 분해할 수 있다. 따라서, 한 측면에서 본원에 기재된 RNA (예를 들어, mRNA, gRNA)는 예를 들어 세포 내 또는 혈청 기반 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 변형된 gRNA 분자는 생체 내 및 생체 외 모두에서 세포 집단으로 도입될 때 감소된 선천적 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론 및 세포 사멸의 유도를 포함하는 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함한다.
따라서, 일부 실시 양태에서, 개시된 LNP 조성물의 RNA 또는 핵산은 예를 들어 생체 내 뉴클레아제 소화에 대한 개선된 내성을 포함하여 핵산에 증가된 또는 향상된 안정성을 부여하는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "변형" 및 "변형된"은 본원에 제공된 핵산과 관련되며, 바람직하게는 RNA 또는 핵산의 야생형 또는 자연 발생 버전에 비해 안정성을 향상시키고 RNA 또는 핵산을 보다 안정하게 만드는 (예를 들어, 뉴클레아제 소화에 대한 내성) 적어도 하나의 변경을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "안정한" 및 "안정성"은 이러한 용어로서 본 개시 내용의 핵산과 관련되며, 특히 RNA와 관련하여, 예를 들어 일반적으로 이러한 RNA를 분해할 수 있는 뉴클레아제 (즉, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제)에 의해 소화에 대해 증가된 또는 향상된 내성을 지칭한다. 증가된 안정성은 예를 들어, 내인성 효소 (예: 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제) 또는 표적 세포 또는 조직 내의 조건에 의한 가수 분해 또는 기타 파괴에 대한 민감성이 더 적어, 표적 세포, 조직, 대상체 및/또는 세포질에서 그러한 RNA 또는 핵산의 체류를 증가시키거나 향상시킬 수 있다. 본원에 제공된 안정화된 RNA 또는 핵산 분자는 자연적으로 발생하는 변형되지 않은 대응체 (예: mRNA의 야생형 버전)에 비해 더 긴 반감기를 보여준다. 본원에 개시된 LNP 조성물의 mRNA와 관련된 용어로서 "변형" 및 "변형된"이라는 용어는 또한 예를 들어 단백질 번역 (예: Kozak 컨센서스 서열)의 개시에서 기능하는 서열의 포함을 포함하여 mRNA 핵산의 번역을 개선 또는 향상시키는 변경이다. (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).
일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 LNP 조성물의 RNA 또는 핵산은 보다 안정하게 만들기 위해 화학적 또는 생물학적 변형을 겪었다. mRNA와 같은 RNA에 대한 예시적인 변형은 염기의 고갈 (예를 들어, 결실 또는 하나의 뉴클레오타이드를 다른 것으로 치환함으로써) 또는 염기의 변형, 예를 들어 염기의 화학적 변형을 포함한다. 본원에 사용된 "화학적 변형"이라는 어구는 자연 발생 RNA 또는 핵산에서 보이는 것과 다른 화학을 도입하는 변형, 예를 들어 변형된 뉴클레오타이드의 도입과 같은 공유 변형 (예: 뉴클레오타이드 유사체 또는 이러한 RNA 또는 핵산 분자에서 자연적으로 발견되지 않는 펜던트 기의 포함)을 포함한다.
골격 변형의 일부 실시 양태에서, 변형된 잔기의 포스페이트 기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 잔기, 예를 들어 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 본원에 기재된 바와 같이 변형되지 않은 포스페이트 모이어티를 변형된 포스페이트 기로 전체 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 포스페이트 골격의 골격 변형은 비하전 링커 또는 비대칭 전하 분포를 갖는 하전 링커를 초래하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예에는, 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 인산화 수소, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르가 포함된다. 변형되지 않은 포스페이트 기의 인 원자는 비-키랄성이다. 그러나, 가교되지 않은 산소 중 하나를 위의 원자 또는 원자 그룹 중 하나로 대체하면 인 원자를 키랄로 만들 수 있다. 입체성 인 원자는 "R" 구성 (여기서는 Rp) 또는 "S" 구성 (여기서는 Sp)을 가질 수 있다. 골격은 또한 가교 산소 (즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결하는 산소)를, 질소 (가교 포스포로아미데이트), 황 (가교 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교 메틸렌포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 어느 하나의 연결 산소 또는 연결 산소 둘 다에서 발생할 수 있다. 포스페이트 기는 특정 골격 변형에서 인산염이 없는 커넥터로 대체될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 하전된 포스페이트 기는 중성 모이어티로 대체될 수 있다. 포스페이스 기를 대체할 수 있는 모이어티의 예로는 비제한적으로, 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
mRNA
일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제형은 Cas 뉴클레아제, 또는 본원에 기재된 바와 같은 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA 유도 DNA 결합제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시 양태에서, Cas 뉴클레아제 또는 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA 유도 DNA 결합제를 인코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공, 사용 또는 투여된다.
mRNA는 5' 캡, 5' 비-번역 영역 (UTR), 3' UTR, 및 폴리아데닌 꼬리 중 하나 이상을 포함할 수 있다. mRNA는 예를 들어 핵 국소화 서열을 인코딩하거나 단백질을 인코딩하기 위해 대체 코돈을 사용하기 위해 변형된 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다.
개시된 LNP 조성물의 mRNA는 예를 들어 분비된 호르몬, 효소, 수용체, 폴리펩타이드, 펩티드 또는 정상적으로 분비되는 기타 관심 단백질을 코딩할 수 있다. 일 실시 양태에서, mRNA는 예를 들어 이러한 mRNA의 안정성 및/또는 반감기를 개선하거나 단백질 생산을 개선하거나 달리 촉진하는 화학적 또는 생물학적 변형을 임의로 가질 수 있다.
추가로, 적합한 변형은 코돈이 동일한 아미노산을 인코딩하지만 mRNA의 야생형 버전에서 발견되는 코돈보다 더 안정하도록 코돈의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서의 변경을 포함한다. 예를 들어, RNA의 안정성과 더 많은 수의 시티딘 (C') 및/또는 우리딘 (U') 잔기 사이의 역 관계가 입증되었으며, C 및 U 잔기가 없는 RNA는 대부분의 RNase에 대해 안정적인 것으로 밝혀졌다 (Heidenreich , et al. J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). 일부 실시 양태에서, mRNA 서열에서 C 및/또는 U 잔기의 수가 감소된다. 또 다른 실시 양태에서, C 및/또는 U 잔기의 수는 특정 아미노산을 동일 또는 관련 아미노산을 인코딩하는 다른 코돈으로의 치환에 의해 감소된다. mRNA 핵산에 대한 고려되는 변형은 또한 슈도우리딘 (pseudouridines)의 혼입을 포함한다. mRNA 핵산에 슈도우리딘의 혼입은 안정성과 번역 능력을 향상시킬뿐만 아니라 생체 내 면역 원성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, Kariko, K., et al., Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008) 참조. mRNA에 대한 치환 및 변형은 당업자에게 이미 쉽게 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다.
서열에서 C 및 U 잔기의 수를 줄이는 데 대한 제약은 번역되지 않은 영역에 비해 mRNA의 코딩 영역 내에서 더 클 가능성이 높다 (즉, 원하는 아미노산 서열을 인코딩하는 메시지의 능력을 여전히 유지하면서, 메시지에 존재하는 모든 C 및 U 잔기를 제거하는 것은 불가능할 것이다). 그러나 유전 코드의 퇴행성은 동일한 코딩 능력을 유지하면서 서열에 존재하는 C 및/또는 U 잔기의 수를 감소시킬 수 있는 기회를 제공한다 (즉, 어떤 아미노산이 코돈에 의해 코딩되는지에 따라, RNA 서열의 변형에 대한 여러 가지 가능성이 있을 수 있다).
용어 변형은 또한, 예를 들어 비-뉴클레오타이드 연결 또는 변형된 뉴클레오타이드를 mRNA 서열에 혼입시키는 것을 포함한다 (예를 들어, 기능성 분비 단백질 또는 효소를 인코딩하는 mRNA 분자의 3' 및 5' 말단의 하나 또는 둘 모두에 대한 변형). 이러한 변형에는 mRNA 서열에 염기 추가 (예: 폴리 A 꼬리 또는 더 긴 폴리 A 꼬리 포함), 3' UTR 또는 5' UTR의 변경, mRNA와 제제 (예: 단백질 또는 상보적 핵산 분자)의 복합 및 mRNA 분자의 구조를 변경하는 요소의 포함 (예: 2차 구조를 형성)을 포함한다.
폴리 A 꼬리는 자연스러운 메신저를 안정시키는 것으로 생각된다. 따라서, 일 실시 양태에서, mRNA 분자에 긴 폴리 A 꼬리를 추가하여 mRNA를 보다 안정적으로 만들 수 있다. 폴리 A 꼬리는 당 업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 추가할 수 있다. 예를 들어, 긴 폴리 A 꼬리는 폴리 A 폴리머라제를 사용하여 합성 또는 시험관 내 전사된 mRNA에 추가될 수 있다 (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). 전사 벡터는 또한 긴 폴리 A 꼬리를 인코딩할 수 있다. 또한 PCR 산물에서 직접 전사하여 폴리 A 꼬리를 추가할 수 있다. 일 실시 양태에서, 폴리 A 꼬리의 길이는 적어도 약 90, 200, 300, 400, 적어도 500개의 뉴클레오타이드이다. 일 실시 양태에서, 폴리 A 꼬리의 길이를 조절하여 변형된 mRNA 분자의 안정성을 조절하여 단백질의 전사를 조절한다. 예를 들어, 폴리 A 꼬리의 길이가 mRNA 분자의 반감기에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 폴리 A 꼬리의 길이를 조정하여 mRNA의 뉴클레아제 내성 수준을 변형하여 세포에서 단백질 발현 시간 경과를 제어할 수 있다. 일 실시 양태에서, 안정화된 mRNA 분자는 생체 내 분해 (예를 들어, 뉴클레아제에 의한)에 대해 충분히 내성이 있어서 전달 비히클 없이 표적 세포로 전달될 수 있다.
일 실시 양태에서, mRNA는 야생형 mRNA에서 자연적으로 발견되지 않는 3' 및/또는 5' 미번역 (UTR) 서열을 혼입함으로써 변형될 수 있다. 일 실시 양태에서, 자연적으로 mRNA의 측면에 위치하고 제2의 무관한 단백질을 인코딩하는 3' 및/또는 5' 측면 서열은 이를 변형하기 위해 치료 또는 기능적 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 안정한 mRNA 분자 (예: 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤 또는 시트르산 순환 효소)로부터의 3' 또는 5' 서열은 센스 mRNA 핵산 분자의 3' 및/또는 5' 영역으로 혼입되어 센스 mRNA 분자의 안정성을 증가시킨다. 예를 들어, US2003/0083272 참조.
mRNA 변형에 대한 더 자세한 설명은 US2017/0210698A1, 57 내지 68쪽에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 여기에 포함된다.
주형 핵산
본원에 개시된 조성물 및 방법은 주형 핵산을 포함할 수 있다. 주형은 Cas 뉴클레아제, 예를 들어 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA 유도 DNA 결합 단백질에 대한 표적 부위 또는 그 근처에서 핵산 서열을 변경하거나 삽입하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 세포에 주형을 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나의 주형이 제공될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 둘 이상의 표적 부위에서 편집이 가능하도록 둘 이상의 주형이 제공될 수 있다. 예를 들어, 세포에서 단일 유전자를 편집하거나 세포에서 두 개의 다른 유전자를 편집하기 위해 다른 주형이 제공될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 주형은 상동성 재조합에 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상동성 재조합은 주형 서열 또는 주형 서열의 일부를 표적 핵산 분자로 통합시킬 수 있다. 다른 양태에서, 상기 주형은 핵산의 절단 부위에서 DNA 가닥 침입을 수반하는 상동성 유도 복구에 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상동성 유도 복구는 편집된 표적 핵산 분자에 주형 서열을 포함시킬 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 주형은 비상동 말단 결합에 의해 매개되는 유전자 편집에 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 주형 서열은 절단 부위 근처의 핵산 서열과 유사성이 없다. 일부 실시 양태에서, 주형 또는 주형 서열의 일부가 혼입된다. 일부 실시 양태에서, 주형은 측면 역 말단 반복 (ITR) 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 주형 서열은 표적 세포의 내인성 서열에 상응하거나,이를 포함하거나, 이로 구성될 수 있다. 이는 또한 또는 대안적으로 표적 세포의 외인성 서열에 상응하거나, 이를 포함하거나, 이로 구성될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "내인성 서열"은 세포에 고유한 서열을 지칭한다. 용어 "외인성 서열"은 세포에 고유하지 않은 서열 또는 세포 게놈의 고유 위치가 다른 위치에 있는 서열을 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 내인성 서열은 세포의 게놈 서열일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 내인성 서열은 염색체 또는 염색체외 서열일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 내인성 서열은 세포의 플라스미드 서열일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 주형은 측면 역 말단 반복 (ITR) 서열을 함유하는 ssDNA 또는 dsDNA를 함유한다. 일부 실시 양태에서, 주형은 벡터, 플라스미드, 미니서클, 나노서클 또는 PCR 산물로 제공된다.
일부 실시 양태에서, 핵산은 정제된다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 침전 방법 (예를 들어, LiCl 침전, 알코올 침전, 또는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 동등한 방법)을 사용하여 정제된다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 크로마토그래피 기반 방법, 예컨대 HPLC 기반 방법 또는 동등한 방법 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 사용하여 정제된다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 침전 방법 (예를 들어, LiCl 침전) 및 HPLC 기반 방법을 모두 사용하여 정제된다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 정제된다.
화합물 또는 조성물은 일반적으로, 그러나 반드시 그런 것은 아니지만 하나 이상의 약제학상 허용되는 부형제를 포함할 것이다. 용어 "부형제"는 본 개시 내용의 화합물(들), 다른 지질 성분(들) 및 생물학적 활성제 이외의 임의의 성분을 포함한다. 부형제는 기능적 (예: 약물 방출 속도 조절) 및/또는 비-기능적 (예: 가공 보조제 또는 희석제) 특성을 조성물에 부여할 수 있다. 부형제의 선택은 특정 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 투여 형태의 특성과 같은 요인에 따라 크게 달라진다.
비경구 제형은 일반적으로 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액이다. 제형이 수성인 경우, 당 (포도당, 만니톨, 소르비톨 등을 포함하되 이에 제한되지 않음) 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 pH 3 내지 9)와 같은 부형제, 그러나 일부 적용의 경우 멸균 비-수성 용액 또는 멸균, 발열인자가 없는 물 (WFI)과 같은 적합한 비히클과 함께 사용되는 건조 형태로 더 적합하게 제형화될 수 있다.
본 발명은 예시된 실시 양태와 관련하여 설명되지만, 본 발명을 이러한 실시 양태로 제한하려는 의도는 아님을 이해해야 한다. 반대로, 본 발명은 첨부된 청구 범위에 의해 정의된 발명에 포함될 수 있는 특정 특징의 등가물을 포함하여 모든 대안, 변형 및 등가물을 포함하도록 의도된다.
전술한 일반적인 설명과 상세한 설명, 그리고 다음의 예는 모두 예시적이고 설명적일 뿐이며 교시를 제한하지 않는다. 여기에 사용된 섹션 제목은 구성 목적으로만 사용되며 어떤 방식으로든 원하는 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참고로 포함된 문헌이 본 명세서에 정의된 용어와 모순되는 경우, 본 명세서가 우선한다. 달리 명시되지 않는 한 본 출원에 제공된 모든 범위는 종점을 포함한다.
정의
본 출원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "조성물"에 대한 언급은 복수의 조성물을 포함하고 "세포"에 대한 언급은 복수의 세포 등을 포함한다. "또는"의 사용은 포괄적이며 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.
상기 명세서에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 다양한 구성 요소를 "포함하는"을 언급하는 명세서의 실시 양태는 또한 인용된 구성 요소의 "구성된" 또는 "본질적으로 구성된"으로 고려된다; 다양한 구성 요소로 "구성된" 것으로 언급하는 명세서의 실시 양태는 또한 인용된 구성 요소를 "포함하는" 또는 "본질적으로 구성되는"으로 고려된다; 다양한 구성 요소의 "약"을 언급하는 명세서의 실시 양태는 또한 인용된 구성 요소 "에서"로 고려된다; 다양한 구성 요소로 "본질적으로 구성되는"을 언급하는 명세서의 실시 양태는 또한 인용된 구성 요소로 "구성된" 또는 "포함하는" 것으로 고려된다 (이 상호 교환성은 청구 범위에서 이들 용어의 사용에 적용되지 않음).
숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. 측정 및 측정 가능한 값은 유효 자릿수 및 측정과 관련된 오류를 고려하여 근사치로 이해된다. 본 출원에서 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 당업계에서 이해되는 의미를 갖는다; 하나와 다른 것의 사용이 반드시 다른 범위를 의미하지는 않는다. 달리 표시되지 않는 한, "약" 또는 "대략"과 같은 수정 용어를 포함하거나 포함하지 않고 본 출원에서 사용된 숫자는 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 인식될 수 있는 정상적인 발산 및/또는 변동을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 실시 양태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되지 않거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한 (해당 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외), 명시된 기준 값의 어느 방향 (크거나 작음)으로든 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하의 숫자 범위를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "접촉"은 둘 이상의 실체 간의 물리적 연결을 설정하는 것을 의미한다. 예를 들어, 포유류 세포를 나노 입자 조성물과 접촉시키는 것은 포유류 세포와 나노 입자가 물리적 연결을 공유하도록 만들어짐을 의미한다. 생체 내 및 생체 외 모두에서 세포를 외부 실체와 접촉시키는 방법은 생물학적 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 나노 입자 조성물과 포유 동물 내에 배치된 포유 동물 세포의 접촉은 다양한 투여 경로 (예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 피내 및 피하)에 의해 수행될 수 있고 다양한 양의 나노 입자 조성물을 포함할 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 포유류 세포가 나노 입자 조성물에 의해 접촉될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전달"은 실체를 목적지에 제공하는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료제 및/또는 예방제 대상체에게 전달하는 것은 치료제 및/또는 예방제를 포함하는 나노 입자 조성물을 대상체에 (예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 피내 또는 피하 경로에 의해) 투여하는 것을 포함할 수 있다. 나노 입자 조성물을 포유류 또는 포유류 세포에 투여하는 것은 하나 이상의 세포를 나노 입자 조성물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "캡슐화 효율"은 나노 입자 조성물의 제조에 사용된 치료제 및/또는 예방제의 초기 총량에 비해 나노 입자 조성물의 일부가 되는 치료제 및/또는 예방제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 조성물에 처음 제공된 치료제 및/또는 예방제 총 100 mg 중 97 mg의 치료제 및/또는 예방제가 나노 입자 조성물에 캡슐화되는 경우, 캡슐화 효율은 97%로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "캡슐화"는 완전한, 실질적 또는 부분적 담기 (enclosure), 제한, 둘러싸기 또는 담기 (encasement)를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생분해성"은 세포에 도입될 때 세포 기계 (예: 효소 분해)에 의해 또는 가수 분해에 의해 세포가 세포에 미치는 상당한 독성 효과(들) 없이 재사용하거나 처분할 수 있는 성분으로 분해되는 물질을 지칭하는 데 사용된다. 특정 실시 양태에서, 생분해성 물질의 분해에 의해 생성된 성분은 생체 내에서 염증 및/또는 다른 부작용을 유도하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 생분해성 물질은 효소적으로 분해된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시 양태에서, 생분해성 물질은 가수 분해에 의해 분해된다.
본원에 사용된 "N/P 비"은 지질 (예: 화학식 I의 화합물) 중 이온화 가능한 (생리학적 pH 범위에서) 질소 원자 대 RNA, 예를 들어 지질 성분과 RNA를 포함하는 나노 입자 조성물 중 포스페이트 기의 몰비이다.
조성물은 또한 하나 이상의 화합물의 염을 포함할 수 있다. 염은 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 염"은 개시된 화합물의 유도체를 지칭하며, 여기서 모 화합물은 기존 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환함으로써 (예를 들어, 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써) 변경된다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기 염 또는 유기산 염; 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염; 등을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니다. 대표적인 산부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글로코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼린 토금속염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 등 뿐만 아니라 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하나 이들로 제한되지 않는, 비-독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다. 본 개시 내용의 약제학상 허용되는 염은 예를 들어 비-독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 비-독성 염을 포함한다. 본 개시 내용의 약제학상 허용되는 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 이 둘의 혼합물 중에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조할 수 있으며; 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 에테르 이소프로판올, 또는 아세토니트릴과 같은 비-수성 매체가 바람직하다. 적합한 염의 목록은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, PH Stahl and CG Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, and Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)에서 찾아볼 수 있으며, 이들 문헌 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 "다분산 지수"는 시스템의 입자 크기 분포의 균질성을 설명하는 비율이다. 작은 값, 예를 들어 0.3 미만은 좁은 입자 크기 분포를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 다분산 지수는 0.1 미만일 수 있다.
본원에 사용된 "형질 감염"은 세포 내로 종 (예를 들어, RNA)의 도입을 지칭한다. 형질 감염은 예를 들어 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 발생할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 1 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소 기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, s-펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 에이코실, 테트라코실 등이다. 알킬기는 사이클릭 또는 비-사이클릭일 수 있다. 알킬기는 분지형 또는 비분지형 (즉, 선형)일 수 있다. 알킬기는 또한 치환되거나 비치환될 수 있다 (바람직하게는 비치환됨). 예를 들어, 알킬기는 본원에 기재된 바와 같이 알킬, 사이클로알킬, 알콕시, 아미노, 에테르, 할라이드, 하이드록시, 니트로, 실릴, 설폭소, 설포네이트, 카복실레이트, 또는 티올을 포함하되 이에 국한되지 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. "저급 알킬" 기는 1 내지 6개 (예를 들어, 1 내지 4개)의 탄소 원자를 함유하는 알킬기이다.
본 명세서에 사용된 용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 지방족 기를 지칭하며, "비치환된 알케닐" 및 "치환된 알케닐"을 모두 포함하는 것으로 의도되며, 후자는 알케닐기의 하나 이상의 탄소에서 수소를 대체하는 치환기를 갖는 알케닐 모이어티를 지칭한다. 이러한 치환기는 하나 이상의 이중 결합에 포함되거나 포함되지 않는 하나 이상의 탄소에서 발생할 수 있다. 더욱이, 이러한 치환기는 안정성에서 금지된 경우를 제외하고 하기 논의된 바와 같이 알킬기에 대해 고려되는 모든 것을 포함한다. 예를 들어, 알케닐기는 하나 이상의 알킬, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴, 또는 헤테로 아릴 기로 치환될 수 있는 것이 고려된다. 예시적인 알케닐 기는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2), 사이클로펜테닐 (-C5H7), 및 5-헥세닐 (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"알킬렌"기는 분지형 또는 비분지형 (즉, 선형)일 수 있는 2가 알킬 라디칼을 지칭한다. 위에서 언급한 임의의 1가의 알킬 기는 알킬로부터 두 번째 수소 원자를 추출하여 알킬렌으로 변환될 수 있다. 대표적인 알킬렌으로는 C2-4 알킬렌 및 C2-3 알킬렌이 있다. 전형적인 알킬렌기는 -CH(CH3)-, -C(CH3)2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)-, -CH2C(CH3)2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2- 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 알킬렌기 또한 치환되거나 비치환될 수 있다. 예를 들어, 이러한 알킬렌기는 본원에 기재된 바와 같이 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 알콕시, 아미노, 에테르, 할라이드, 하이드록시, 니트로, 실릴, 설폭소, 설포네이트, 설폰아미드, 우레아, 아미드, 카바메이트, 에스테르, 카복실레이트, 또는 티올을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
용어 "알케닐렌"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 2가, 직쇄 또는 분지형, 불포화 비-사이클릭 하이드로카빌 기를 포함하고, 일 실시 양태에서 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하지 않는다. 위에서 언급한 임의의 1가 알케닐 기는 알케닐로부터 두 번째 수소 원자를 추출하여 알케닐렌으로 변환할 수 있다. 대표적인 알케닐렌은 C2-6 알케닐렌을 포함한다.
"Cx-y"라는 용어는 알킬 또는 알킬렌과 같은 화학적 모이어티와 함께 사용될 때 사슬에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 기를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "Cx-y 알킬"이라는 용어는 사슬에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 직쇄 및 분지쇄 알킬 및 알킬렌 기를 포함하는 치환 또는 비치환 포화 탄화수소 기를 지칭한다.
언급에 의한 통합
여기에 언급되거나 인용된 기사, 특허 및 특허 출원의 내용과 기타 모든 문서 및 전자적으로 이용 가능한 정보는 각 개별 간행물이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 통합된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 참조로 통합된다. 출원인은 이러한 기사, 특허, 특허 출원 또는 기타 물리적 및 전자적 문서의 모든 자료 및 정보를 본 출원에 물리적으로 통합할 권리를 보유한다.
실시예
일반 정보
모든 시약과 용매는 상업적 공급 업체로부터 받은대로 구입하여 사용하거나 인용된 절차에 따라 합성했다. 모든 중간체 및 최종 화합물은 실리카겔상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. NMR 스펙트럼은 Bruker 또는 Varian 400 MHz 분광계에서 기록하고 NMR 데이터는 주변 온도에서 CDCl3 중에서 수집되었다. 화학적 이동은 CDCl3 (7.26)에 대한 상대적인 백만분율 (ppm)로 보고된다. 1H NMR에 대한 데이터는 다음과 같이 보고된다: 화학적 이동, 다중도 (br = 넓음, s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, dd = 이중선의 이중선, dt = 삼중선의 이중선, q = 사 중선, m = 다중선, ddd = 이중선의 이중선의 이중선, td = 이중선의 삼중선, tt = 삼중선의 삼중선, tdd = 이중선의 이중선의 삼중선, dddd = 이중선의 이중선의 이중선의 이중선), 결합 상수 및 적분. MS 데이터는 전기 분무 이온화 (ESI) 소스로 Waters SQD2 질량 분석계에 기록되었다. 최종 화합물의 순도는 포토 다이오드 어레이 (PDA) 및 증발 광 산란 (ELS) 검출기를 사용하여 SQD2 질량 분석기가 장착된 Waters Acquity H-Class 액체 크로마토그래피 기기를 사용하여 UPLC-MS-ELS에 의해 결정되었다.
각 아민 지질의 pKa는 Jayaraman 등 (Angewandte Chemie, 2012)의 방법에서 다음과 같이 수정하여 결정되었다. pKa는 제형화되지 않은 아민 지질에 대해 결정되었다. 지질 스톡 용액 (2.94 mM)을 pH (pH 범위: 4.5 내지 9.0)가 다른 나트륨 포스페이트 완충제 (0.1M, Boston Bioproducts)로 희석하여 최종 지질 농도가 약 100 μM가 되도록 하였다. 테스트 샘플에 TNS {6-(p-톨루이디노)-2-나프탈렌설폰산 나트륨 염}을 보충하고 배양한 후 각각 321 nm 및 448 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광 강도를 측정했다. 기록된 데이터를 정규화하였고 각각의 pKa 값은 시그모이드 피팅에서 유도되었다.
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Figure pct00127
실시예 1 - 비교 화합물 1
중간체 1a: 4-옥소헥사데칸산
Figure pct00128
THF (0.1 M) 중 석신산 무수물 (3.0 g, 1.0 당량)의 용액을 -78℃로 냉각시키고, 도데실 마그네슘 브로마이드 (헥산 중 1.0 M 용액, 0.5 당량)를 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응을 적어도 18시간 동안 -78℃에서 유지한 후 물과 1 M HCl을 첨가하여 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하고 생성된 수성층을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM 층을 2 M NaOH로 2회 추출하고, 합한 수성층을 진한 HCl을 사용하여 pH = 1로 산성화시켰다. 그 다음 혼합물을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM 층을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축하여 조 물질을 얻었다. 조 물질을 헥산으로 3회 분쇄하고, 생성된 침전물을 여과하여 생성물을 백색 고체 (1.31 g, 33%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.72 (ddd, J = 7.0, 5.8, 1.1　Hz, 2H), 2.67 - 2.60 (m, 2H), 2.44 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.59 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.26 (d, J = 2.7 Hz, 18H), 0.91 - 0.85 (m, 3H).
중간체 1b: 2-옥소프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00129
DCM (0.1 M) 중 디하이드록시아세톤 (1.55 g, 1.0 당량)의 용액에 리놀레산 (2.05 당량), DMAP (0.2 당량), DIPEA (2.4 당량), 및 EDCI (2.4　당량)를 첨가했다. 반응을 실온에서 적어도 18시간 동안 교반하였다. 완료 후, 물을 첨가하여 혼합물을 켄칭하고, 유기층을 1 M HCl로 1회, 5% NaHCO3로 1회 세척하였다. 이어서 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (8.0 g, 75%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.28 (m, 8H), 4.75 (s, 4H), 2.82 - 2.74 (m, 4H), 2.42 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.67 (q, J = 7.4 Hz, 4H), 1.40 - 1.24 (m, 28H), 0.95 - 0.86 (m, 6H).
중간체 1c: 2-하이드록시-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일옥시]프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트
Figure pct00130
4:2:1 THF/물/톨루엔 (0.05 내지 0.1　M) 중 중간체 1b (8.1 g, 1.0 당량)의 용액을 0 내지 5℃로 냉각한 다음 NaBH4 (1.7 당량)를 첨가하였다. 반응을 0 내지 25℃에서 적어도 1시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 물 및 EtOAc를 첨가하여 켄칭시키고 혼합물을 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (5.9 g, 73%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.26 (m, 8H), 4.23 - 4.10 (m, 4H), 2.81 - 2.73 (m, 4H), 2.42 (d, J = 4.8　Hz, 1H), 2.38 - 2.31 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.68 - 1.57 (m, 4H), 1.42 - 1.23 (m, 29H), 0.93 - 0.85 (m, 6H).
중간체 1d: 2-((4-옥소헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00131
DCM (0.2 M) 중 중간체 1c (1.0 당량)의 용액에 중간체 1a (1.0 내지 1.2 당량), Et3N 또는 DIPEA (1.5 내지 4.5 당량), DMAP (0.1 내지 0.2 당량), 및 EDCI (1 내지 2　당량)를 첨가했다. 반응을 실온에서 적어도 12시간 동안 교반한 후 물을 첨가하여 켄칭시켰다. 혼합물을 1 M HCl로 1회 및 5% NaHCO3로 1회 세척하였다. 이어서 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (780 mg, 79%)로 얻었다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.28 (m, 8H), 5.24 (tt, J = 5.9, 4.3 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.15 (dd, J = 11.9, 5.8 Hz, 2H), 2.84 - 2.74 (m, 4H), 2.71 (t, J = 6.8　Hz, 2H), 2.59 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.60 (dd, J = 14.7, 7.3 Hz, 6H), 1.44 - 1.20 (m, 49H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.3 Hz, 9H).
중간체 1e: 2-((4-옥소헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00132
4:2:1 THF/물/톨루엔 (0.05 내지 0.1　M) 중 중간체 1d (1.43 g, 1.0 당량)의 용액을 0 내지 5℃로 냉각한 다음 NaBH4 (5.0 당량)를 첨가했다. 반응을 0 내지 25℃에서 적어도 2시간 동안 유지하였다. 이어서 반응을 물 및 EtOAc로 희석하고, 생성된 2상 혼합물을 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 무색 오일로서 중간체 알코올을 얻었다.
생성된 알코올을 DCM (0.1M)에 즉시 재용해시킨 다음 피리딘 (2 내지 3 당량) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (1 내지 1.5 당량)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 1시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하여 혼합물을 켄칭시키고 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM 층을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (910 mg, 54%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.37 - 8.25 (m, 2H), 7.48 - 7.40 (m, 2H), 5.49 - 5.25 (m, 9H), 4.96 - 4.84 (m, 1H), 4.34 (dd, J = 12.0, 4.3 Hz, 2H), 4.18 (dd, J = 11.9, 5.7 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.49 (dd, J = 8.4, 6.7 Hz, 2H), 2.33 (tt, J = 7.6, 4.2　Hz, 4H), 2.16 - 1.95 (m, 10H), 1.81 - 1.71 (m, 1H), 1.65 (ddq, J = 15.2, 7.5, 4.8, 4.2　Hz, 6H), 1.50 - 1.13 (m, 50H), 0.90 (td, J = 6.8, 3.7 Hz, 9H).
화합물 1: 2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00133
MeCN (0.1 M) 중 중간체 1e (250 mg, 1.0 당량)의 용액에 피리딘 (3.0 당량), 3-(디메틸아미노)프로판-1-올 (1.5-3.0 당량), 및 DMAP (1.0 당량)을 첨가했다. 반응을 실온에서 적어도 2시간 동안 교반하였다. 이어서 헵탄 (0.1 M)을 반응 혼합물에 첨가하고, 헵탄층을 MeCN으로 3회 세척했다. 합한 MeCN 층은 헵탄으로 3회 역추출하였고, 합한 헵탄층을 MeCN으로 마지막으로 1회 세척했다. 그런 다음 헵탄을 진공에서 제거하고 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (100 mg, 41%)로 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.22 (m, 9H), 4.72 (tdd, J = 7.5, 5.3, 4.0 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 12.0, 4.4 Hz, 2H), 4.23 - 4.10 (m, 4H), 2.84 - 2.73 (m, 4H), 2.62 - 2.27 (m, 13H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 2.01 - 1.84 (m, 4H), 1.68 - 1.50 (m, 7H), 1.43 - 1.21 (m, 50H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.1 Hz, 9H). MS: 1001.2 m/z [M+H].
실시예 2 - 화합물 2
화합물 2: 2-((4-(((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00134
화합물 2는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 3-(디에틸아미노)프로판-1-올로부터 64% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.20 (m, 9H), 4.72 (tdd, J = 7.5, 5.3, 4.0 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.23 - 4.10 (m, 4H), 2.81 - 2.73 (m, 4H), 2.57 - 2.36 (m, 8H), 2.31 (td, J = 7.6, 1.3 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.97 - 1.77 (m, 4H), 1.61 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 1.40 - 1.21 (m, 49H), 1.01 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.1 Hz, 9H). MS: 1029.7 m/z [M+H].
실시예 3 - 화합물 3
화합물 3: 2-((4-(((3-(에틸(메틸)아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00135
화합물 3은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 3-((메틸)에틸아미노)프로판-1-올로부터 79% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.49 - 5.20 (m, 9H), 4.77 - 4.67 (m, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.16 (tdd, J = 11.9, 6.2, 2.5 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.70 - 2.37 (m, 7H), 2.37 - 2.25 (m, 7H), 2.13 - 1.82 (m, 12H), 1.69 - 1.48 (m, 7H), 1.42 - 1.20 (m, 46H), 1.14 (s, 2H), 0.88 (td, J = 6.8, 3.9 Hz, 7H). MS: 1015.7 m/z [M+H].
실시예 4 - 화합물 4
화합물 4: 2-((4-(((2-(디메틸아미노)에톡시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00136
화합물 4는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 2-디메틸아미노에탄-1-올로부터 93% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.31 (m, 8H), 5.25 (tt, J = 5.8, 4.3 Hz, 1H), 4.73 (tdd, J = 7.6, 5.5, 4.0 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 4H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.4 Hz, 2H), 2.77 (td, J = 6.0, 1.1 Hz, 4H), 2.70 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 2.49 - 2.29 (m, 11H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.99 - 1.81 (m, 2H), 1.67 - 1.50 (m, 8H), 1.40 - 1.21 (m, 48H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.2 Hz, 9H). MS: 987.6 m/z [M+H].
실시예 5 - 화합물 5
화합물 5: 2-((4-(((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00137
화합물 5는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 54% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.21 (m, 9H), 4.72 (tdd, J = 7.3, 5.5, 4.2 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.17 (dddd, J = 15.3, 9.1, 7.3, 3.7 Hz, 4H), 2.77 (td, J = 6.0, 1.1 Hz, 4H), 2.57 (d, J = 8.8 Hz, 6H), 2.40 (dt, J = 8.7, 6.5 Hz, 2H), 2.31 (td, J = 7.6, 1.2 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.98 - 1.83 (m, 5H), 1.80 (p, J = 3.2 Hz, 4H), 1.68 - 1.50 (m, 7H), 1.41 - 1.18 (m, 48H), 0.96 - 0.81 (m, 9H). MS: 1027.6 m/z [M+H].
실시예 6 - 화합물 6
실시예 6: 2-((4-((((1-에틸피페리딘-4-일)옥시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00138
화합물 6은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 1-에틸피페리딘-4-올로부터 53% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.21 (m, 9H), 4.72 (tdd, J = 7.6, 5.3, 4.0 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 4.1 Hz, 2H), 2.84 - 2.70 (m, 6H), 2.51 - 2.36 (m, 4H), 2.31 (td, J = 7.6, 1.4 Hz, 4H), 2.24 (d, J = 23.1 Hz, 2H), 2.11 - 1.93 (m, 11H), 1.92 - 1.73 (m, 4H), 1.70 - 1.52 (m, 8H), 1.43 - 1.21 (m, 48H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.2 Hz, 9H). MS: 1028.2 m/z [M+H].
실시예 7 - 화합물 7
화합물 7: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00139
화합물 7은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 66% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.47 - 5.08 (m, 10H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.4, 1.4　Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.9, 3.3 Hz, 2H), 3.24 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 2.82 - 2.74 (m, 4H), 2.53 - 2.26 (m, 10H), 2.21 (s, 3H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.98 - 1.74 (m, 2H), 1.68 - 1.41 (m, 8H), 1.41 - 1.19 (m, 49H), 1.04 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.95 - 0.82 (m, 9H). MS: 1001.1 m/z [M+H].
실시예 8 - 화합물 8
화합물 8: 2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로필)카바모일)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00140
화합물 8은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 N1,N1-디메틸프로판-1,3-디아민으로부터 55% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3) δ 5.46 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.43 - 5.28 (m, 8H), 5.24 (tt, J = 5.8, 4.4 Hz, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.5, 2.2 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 1.6 Hz, 2H), 3.23 (h, J = 6.4 Hz, 2H), 2.82 - 2.73 (m, 4H), 2.48 - 2.20 (m, 14H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.97 - 1.42 (m, 12H), 1.42 - 1.20 (m, 48H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.1 Hz, 9H). MS: 1000.6 m/z [M+H].
실시예 9 - 화합물 9
화합물 9: 2-((4-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)헥사데카노일)옥시) 프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00141
화합물 9는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 (1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 65% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 5.45 - 5.28 (m, 8H), 5.25 (ddd, J = 10.2, 5.8, 4.4 Hz, 1H), 5.19 - 5.11 (m, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.9, 3.0 Hz, 2H), 3.44 - 3.31 (m, 1H), 3.19 - 3.02 (m, 2H), 2.84 - 2.72 (m, 4H), 2.46 - 2.16 (m, 12H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.97 - 1.66 (m, 6H), 1.66 - 1.42 (m, 8H), 1.42 - 1.20 (m, 49H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.2 Hz, 9H). MS: 1013.1 m/z [M+H].
실시예 10 - 화합물 10
화합물 10: 2-((4-((1,4-디메틸피페리딘-4-카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00142
4:2:1 THF/물/톨루엔 (0.05 M) 중 중간체 1d (360 mg, 1.0 당량)의 용액을 0℃로 냉각한 다음 NaBH4 (5.0 당량)를 첨가했다. 반응을 0℃에서 18시간 동안 유지하였다. 이어서 반응을 물 및 EtOAc로 희석하고, 생성된 2상 혼합물을 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 무색 오일로서 중간체 알코올을 얻었다.
생성된 조질의 알코올을 DCM (0.1M)에 즉시 재용해시킨 다음 1,4-디메틸피페리딘-4-카복실산 (1.0 당량), DMAP (0.1 당량), DIPEA (4.0 당량), 및 EDCI (1.5 당량)를 첨가했다. 반응을 실온에서 교반하였다. 16 시간 후, 추가 1,4-디메틸피페리딘-4-카복실산 (1.0 당량), DMAP (0.05 당량), DIPEA (2.0 당량), 및 EDCI (1.5 당량)를 반응에 첨가하고 반응물을 40℃로 가열했다. 추가 2시간 후, 물 및 DCM을 첨가하여 반응을 켄칭하고, 유기층을 1 M HCl로 1회, 5% NaHCO3로 1회 및 염수로 1회 세척하였다. 생성된 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM)로 정제하여 생성물을 분홍색 오일 (94 mg, 22%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.22 (m, 9H), 4.92 (ddd, J = 11.6, 7.5, 4.7 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 12.0, 5.8, 1.9 Hz, 2H), 2.82 - 2.74 (m, 4H), 2.67 (s, 2H), 2.41 - 2.25 (m, 9H), 2.14 (d, J = 14.2 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.98 - 1.78 (m, 3H), 1.66 - 1.49 (m, 9H), 1.43 - 1.18 (m, 50H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.3 Hz, 9H).
실시예 11 - 화합물 11
화합물 11: 2-((4-((4-(디에틸아미노)부타노일)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00143
화합물 11은 실시예 10에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1d 및 3-(디에틸아미노)부탄산으로부터 17% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3) δ 5.46 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.43 - 5.28 (m, 8H), 5.24 (tt, J = 5.8, 4.4 Hz, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.5, 2.2 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 1.6　Hz, 2H), 3.23 (h, J = 6.4 Hz, 2H), 2.82 - 2.73 (m, 4H), 2.48 - 2.20 (m, 14H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.97 - 1.42 (m, 12H), 1.42 - 1.20 (m, 48H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.1　Hz, 9H). MS: 1013.9 m/z [M+H].
실시예 12 - 화합물 12
화합물 12: 2-((4-(((2-(디메틸아미노)에틸)카바모일)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00144
화합물 12는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 N1,N1-디메틸에탄-1,2-디아민으로부터 67% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.29 (m, 8H), 5.29 - 5.18 (m, 2H), 4.75 (s, 1H), 4.34 - 4.24 (m, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.6 Hz, 2H), 3.25 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 2.77 (td, J = 6.2, 1.2 Hz, 4H), 2.47 - 2.35 (m, 4H), 2.35 - 2.28 (m, 4H), 2.24 (s, 6H), 2.05 (q, J = 7.1 Hz, 8H), 1.98 - 1.73 (m, 4H), 1.65 - 1.42 (m, 7H), 1.40 - 1.20 (m, 48H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.3 Hz, 9H). MS: 987.2 m/z [M+H].
실시예 13 - 화합물 13
화합물 13: 2-((4-(((3-(디에틸아미노)프로필)카바모일)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00145
화합물 13은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 N1,N1-디에틸프로판-1,3-디아민으로부터 62% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3) δ 5.93 (s, 1H), 5.44 - 5.28 (m, 8H), 5.24 (ddd, J = 5.8, 4.5, 1.3 Hz, 1H), 4.74 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.5, 2.7 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 1.2 Hz, 2H), 3.24 (tt, J = 13.2, 6.6 Hz, 2H), 2.81 - 2.71 (m, 4H), 2.57 (d, J = 7.7 Hz, 6H), 2.38 (ddd, J = 8.9, 6.8, 3.2 Hz, 2H), 2.35 - 2.28 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.6 Hz, 8H), 1.94 - 1.85 (m, 2H), 1.79 (dq, J = 14.8, 8.1 Hz, 2H), 1.73 - 1.56 (m, 7H), 1.56 - 1.43 (m, 3H), 1.40 - 1.20 (m, 47H), 1.06 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.3 Hz, 9H). MS: 1029.2 m/z [M+H].
실시예 14 - 화합물 14
화합물 14: 2-((4-(((4-(디에틸아미노)부톡시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00146
화합물 14는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 N1,N1-디메틸에탄-1,2-디아민으로부터 60% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.30 (m, 9H), 5.28 (tt, J = 5.8, 4.3 Hz, 1H), 4.78 - 4.69 (m, 1H), 4.31 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.22 - 4.09 (m, 4H), 2.79 (td, J = 6.1, 1.1 Hz, 4H), 2.63 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.47 - 2.38 (m, 2H), 2.38 - 2.30 (m, 4H), 2.07 (q, J = 7.1 Hz, 8H), 2.02 - 1.85 (m, 2H), 1.76 - 1.51 (m, 11H), 1.45 - 1.21 (m, 49H), 1.08 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.95 - 0.82 (m, 9H). MS: 1044.1 m/z [M+H].
실시예 15 - 화합물 15
화합물 15: 2-((4-(((2-(디에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00147
화합물 15는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 N1,N1-디에틸에탄-1,2-디아민으로부터 75% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.29 (m, 9H), 5.25 (ddd, J = 5.8, 4.4, 1.4 Hz, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.4, 1.2 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.0 Hz, 2H), 3.23 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.80 - 2.73 (m, 4H), 2.57 (q, J = 7.0 Hz, 6H), 2.38 (ddd, J = 9.0, 6.6, 4.7 Hz, 2H), 2.34 - 2.28 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.90 (h, J = 9.0, 7.9 Hz, 1H), 1.80 (p, J = 7.3, 6.5 Hz, 1H), 1.66 - 1.44 (m, 7H), 1.40 - 1.20 (m, 53H), 1.03 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.3 Hz, 9H). MS: 1014.9 m/z [M+H].
실시예 16 - 화합물 16
화합물 16: 2-((4-(((2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에톡시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시) 프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00148
화합물 16은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄-1-올로부터 78% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 9H), 5.25 (tt, J = 5.8, 4.3 Hz, 1H), 4.72 (qd, J = 7.6, 4.6 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.26 - 4.09 (m, 4H), 3.14 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 2.82 - 2.74 (m, 4H), 2.45 - 2.28 (m, 9H), 2.22 (td, J = 11.5, 10.9, 6.0 Hz, 2H), 2.15 - 1.91 (m, 12H), 1.69 - 1.48 (m, 9H), 1.42 - 1.20 (m, 50H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.1 Hz, 9H). MS: 1027.9 m/z [M+H].
실시예 17 - 화합물 17
중간체 17a: 헥사데실마그네슘 브로마이드
Figure pct00149
THF (300 mL) 중 Mg (15.92 g, 2 당량)의 용액에 I2 (0.01 당량)를 첨가한 후, 여기에 THF (100 mL) 중 1-브로모헥사데칸 (1.0 당량)을 80℃에서 적가하였다. 혼합물을 80℃에서 6시간 동안 교반하였다. 생성물을 갈색 액체로서 정량적 수율로 얻었고 다음 단계에서 즉시 사용하였다.
중간체 17b: 4-옥소이코사노산
Figure pct00150
THF (1.2 M) 중 석신산 무수물 (54 g, 1.0 당량)의 용액을 -78℃로 냉각시킨 다음 중간체 17a를 첨가하였다. 반응을 12시간 동안 -78℃에서 유지한 후, 포화 NH4Cl에 붓고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체 (4 g, 2%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.11 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 2.80 - 2.62 (m, 4H), 2.46 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 1.63 (dq, J = 14.7, 7.1 Hz, 2H), 1.49 - 1.20 (m, 27H), 0.90 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 17c: 2-((4-옥소이코사노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00151
중간체 17c는 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 17b 및 중간체 1c로부터 53% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.21 (m, 9H), 4.29 (dt, J = 11.9, 4.1 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.73 (dt, J = 22.5, 6.5 Hz, 6H), 2.67 - 2.54 (m, 4H), 2.42 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 9H), 1.61 (q, J = 7.9, 7.3 Hz, 8H), 1.42 - 1.15 (m, 55H), 0.88 (td, J = 6.7, 4.0 Hz, 9H).
중간체 17d: 2-((4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)이코사노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00152
중간체 17d는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 17c로부터 29% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.33 - 8.24 (m, 2H), 7.43 - 7.34 (m, 2H), 5.45 - 5.23 (m, 8H), 4.92 - 4.82 (m, 1H), 4.31 (dd, J = 12.0, 4.3 Hz, 2H), 4.20 - 4.09 (m, 2H), 2.76 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 2.47 (dd, J = 8.3, 6.7 Hz, 2H), 2.30 (td, J = 7.6, 4.2 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 7.2 Hz, 9H), 1.61 (ddt, J = 11.5, 7.4, 3.7 Hz, 4H), 1.43 - 1.22 (m, 49H), 0.88 (td, J = 6.9, 3.8 Hz, 9H).
화합물 17: 2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)이코사노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00153
화합물 17은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 17d 및 3-(디메틸아미노)프로판-1-올로부터 74% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.22 (m, 10H), 4.72 (tdd, J = 7.5, 5.4, 4.0 Hz, 1H), 4.36 - 4.25 (m, 2H), 4.23 - 4.08 (m, 4H), 2.82 - 2.71 (m, 4H), 2.50 - 2.28 (m, 9H), 2.25 (s, 6H), 2.09 - 1.97 (m, 9H), 1.91 - 1.80 (m, 3H), 1.70 - 1.47 (m, 7H), 1.40 - 1.20 (m, 57H), 0.96 - 0.82 (m, 9H). MS: 1058.1 m/z [M+H].
실시예 18 - 화합물 18
화합물 18: 2-((4-(((3-(에틸(메틸)아미노)프로폭시)카보닐)옥시)이코사노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00154
화합물 18은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 17d 및 3-((메틸)에틸아미노)프로판-1-올로부터 77% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.22 (m, 10H), 4.72 (qd, J = 7.7, 4.7 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 12.0, 4.4 Hz, 2H), 4.20 - 4.10 (m, 4H), 2.83 - 2.73 (m, 4H), 2.51 - 2.36 (m, 6H), 2.35 - 2.28 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.10 - 1.99 (m, 9H), 1.91 - 1.82 (m, 3H), 1.66 - 1.52 (m, 6H), 1.42 - 1.19 (m, 60H), 1.06 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.1 Hz, 9H). MS: 1072.3 m/z [M+H].
실시예 19 - 화합물 19
화합물 19: 2-((4-(((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)이코사노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00155
화합물 19는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 17d 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 67% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.22 (m, 9H), 4.72 (tt, J = 7.5, 4.5 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.24 - 4.10 (m, 4H), 2.83 - 2.72 (m, 4H), 2.57 (d, J = 8.3 Hz, 6H), 2.40 (dt, J = 8.6, 6.7 Hz, 2H), 2.31 (td, J = 7.6, 1.2 Hz, 4H), 2.04 (dd, J = 8.5, 5.3 Hz, 8H), 2.00 - 1.86 (m, 4H), 1.86 - 1.78 (m, 4H), 1.53 (ddt, J = 14.1, 8.3, 4.7 Hz, 7H), 1.44 - 1.20 (m, 56H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.2 Hz, 9H). MS: 1084.2 m/z [M+H].
실시예 20 - 화합물 20
화합물 20: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)이코사노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00156
화합물 20은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 17d 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 73% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.17 (m, 10H), 4.75 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.4, 1.3 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.4 Hz, 2H), 3.25 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 2.81 - 2.73 (m, 4H), 2.50 - 2.36 (m, 6H), 2.36 - 2.28 (m, 4H), 2.22 (s, 3H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.94 - 1.71 (m, 4H), 1.66 - 1.20 (m, 63H), 1.05 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.2 Hz, 9H). MS: 1056.6 m/z [M+H].
실시예 21 - 화합물 21
화합물 21: 2-((4-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)이코사노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00157
화합물 21은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 17d (1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 85% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.30 (m, 8H), 5.29 - 5.18 (m, 2H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.21 - 4.07 (m, 2H), 3.46 - 3.30 (m, 1H), 3.11 (ddt, J = 22.3, 8.9, 4.3 Hz, 2H), 2.80 - 2.72 (m, 4H), 2.45 - 2.15 (m, 12H), 2.04 (dd, J = 8.5, 5.3 Hz, 9H), 1.96 - 1.77 (m, 4H), 1.71 (tq, J = 8.4, 5.1, 4.0 Hz, 2H), 1.65 - 1.45 (m, 8H), 1.39 - 1.20 (m, 60H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.4 Hz, 9H). MS: 1068.8 m/z [M+H].
실시예 22 - 화합물 22
중간체 22a: (Z)-9-(논-2-엔-1-일옥시)-9-옥소노난산
Figure pct00158
THF (100 mL) 중 노난디오산 (25 g, 1.3 당량)의 용액에 옥살릴클로라이드 (1.0 당량)를 0℃에서 1분에 걸쳐 적가했다. 다음으로 DMF (0.1 당량)를 1분에 걸쳐 적가했다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음, 반응을 0℃로 다시 냉각시킨 다음 THF (100 mL) 중 시스-2-노넨-1-올 (1.0 당량)을 첨가하였다. 반응을 0℃에서 5분 동안 교반한 다음 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응을 진공에서 농축하고 DCM으로 슬러리화하고 여과하였다. 여액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피 (80 g, MeOH/DCM)로 정제하여 생성물을 담황색 오일 (15 g, 47%)로 얻었으며, 이는 후속 단계에서 그대로 사용되었다.
중간체 22b: 9,9'-디((Z)-논-2-엔-1-일) O'1,O1-(2-옥소프로판-1,3-디일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00159
중간체 22b는 중간체 1b에 채용된 방법으로 디하이드록시아세톤 및 중간체 22a를 혼합하여 73%의 수율로 합성하였다.
중간체 22c: O'1,O1-(2-하이드록시프로판-1,3-디일) 9,9'-디((Z)-논-2-엔-1-일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00160
중간체 22c는 반응을 45분 후에 완료시킨 것을 제외하고는 중간체 1c에 채용된 방법을 사용하여 중간체 22b로부터 71% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.64 (dtt, J = 11.0, 7.3, 1.3 Hz, 2H), 5.52 (dtt, J = 10.9, 6.8, 1.5 Hz, 2H), 4.67 - 4.58 (m, 4H), 4.23 - 4.05 (m, 5H), 2.51 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 2.32 (dt, J = 18.1, 7.6 Hz, 8H), 2.15 - 2.00 (m, 4H), 1.61 (td, J = 10.0, 2.7 Hz, 8H), 1.42 - 1.20 (m, 28H), 0.93 - 0.83 (m, 6H).
중간체 22d: 9,9'-디((Z)-논-2-엔-1-일) O'1,O1-(2-((4-옥소헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00161
중간체 22d는 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 22c 및 중간체 1a로부터 38% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.66 (dtt, J = 11.0, 7.3, 1.3 Hz, 2H), 5.54 (dtt, J = 11.0, 6.9, 1.5 Hz, 2H), 5.26 (tt, J = 5.9, 4.3 Hz, 1H), 4.64 (dd, J = 6.9, 1.3 Hz, 4H), 4.31 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.17 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 2.74 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.68 - 2.56 (m, 2H), 2.45 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.33 (td, J = 7.6, 6.0 Hz, 8H), 2.19 - 2.07 (m, 4H), 1.70 - 1.57 (m, 12H), 1.43 - 1.23 (m, 46H), 0.98 - 0.84 (m, 9H).
중간체 22e: O'1,O1-(2-((4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일) 9,9'-디((Z)-논-2-엔-1-일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00162
중간체 22e는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 22d로부터 51% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.38 - 8.31 (m, 1H), 8.31 - 8.24 (m, 2H), 7.54 - 7.47 (m, 1H), 7.44 - 7.36 (m, 2H), 5.64 (dtt, J = 11.0, 7.3, 1.3 Hz, 2H), 5.51 (dtt, J = 11.0, 6.8, 1.5 Hz, 2H), 5.26 (tt, J = 5.8, 4.3 Hz, 1H), 4.86 (ddd, J = 11.8, 7.5, 4.8 Hz, 1H), 4.65 - 4.57 (m, 4H), 4.36 - 4.25 (m, 2H), 4.21 - 4.10 (m, 2H), 2.50 - 2.44 (m, 2H), 2.30 (td, J = 7.5, 4.5 Hz, 8H), 2.13 - 2.05 (m, 4H), 1.62 (d, J = 37.2 Hz, 9H), 1.46 - 1.18 (m, 49H), 0.94 - 0.80 (m, 9H).
화합물 22: O'1,O1-(2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시) 프로판-1,3-디일) 9,9'-디((Z)-논-2-엔-1-일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00163
화합물 22는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 22e 및 3-(디메틸아미노)프로판-1-올로부터 54% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.71 - 5.58 (m, 2H), 5.52 (dtt, J = 10.9, 6.8, 1.5 Hz, 2H), 5.25 (tt, J = 5.7, 4.4 Hz, 1H), 4.72 (ddd, J = 11.7, 7.4, 4.5 Hz, 1H), 4.62 (dd, J = 6.8, 1.3 Hz, 4H), 4.34 - 4.25 (m, 2H), 4.25 - 4.08 (m, 4H), 2.39 (ddd, J = 12.9, 8.4, 6.4 Hz, 4H), 2.34 - 2.21 (m, 13H), 2.09 (tdd, J = 7.4, 5.7, 1.5 Hz, 4H), 2.02 - 1.67 (m, 7H), 1.69 - 1.51 (m, 11H), 1.42 - 1.19 (m, 45H), 0.97 - 0.78 (m, 8H). MS: 1065.7 m/z [M+H].
실시예 23 - 화합물 23
화합물 23: O'1,O1-(2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)헥사데카노일)옥시) 프로판-1,3-디일) 9,9'-디((Z)-논-2-엔-1-일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00164
화합물 23은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 22e 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 59% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.72 - 5.59 (m, 2H), 5.52 (dtt, J = 11.0, 6.8, 1.5 Hz, 2H), 5.36 - 5.18 (m, 2H), 4.75 (s, 1H), 4.62 (dd, J = 6.9, 1.2 Hz, 4H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.5 Hz, 2H), 3.35 - 3.20 (m, 2H), 2.56 - 2.43 (m, 4H), 2.38 (ddd, J = 8.7, 6.6, 4.1 Hz, 2H), 2.34 - 2.19 (m, 11H), 2.10 (qd, J = 7.4, 1.5 Hz, 4H), 1.96 - 1.72 (m, 3H), 1.63 (d, J = 6.9 Hz, 11H), 1.41 - 1.18 (m, 48H), 1.07 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.93 - 0.81 (m, 9H). MS: 1065.2 m/z [M+H].
실시예 24 - 화합물 24
화합물 24: O'1,O1-(2-((4-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)헥사데카노일) 옥시)프로판-1,3-디일)9,9'-디((Z)-논-2-엔-1-일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00165
화합물 24은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 22e 및 (1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.71 - 5.59 (m, 2H), 5.52 (dtt, J = 10.9, 6.8, 1.5 Hz, 2H), 5.24 (ddd, J = 8.8, 5.8, 4.4 Hz, 2H), 4.76 (s, 1H), 4.62 (dd, J = 6.9, 1.3 Hz, 4H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.2 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 11.2, 10.1 Hz, 1H), 3.10 (t, J = 14.0 Hz, 2H), 2.50 - 2.20 (m, 15H), 2.10 (qd, J = 7.4, 1.5 Hz, 4H), 1.97 - 1.67 (m, 6H), 1.61 (d, J = 7.3 Hz, 12H), 1.41 - 1.18 (m, 47H), 0.97 - 0.79 (m, 9H). MS: 1076.7 m/z [M+H].
실시예 25 - 화합물 25
중간체 25a: 5-옥소헵탄데칸산
Figure pct00166
중간체 25a는 중간체 1a에 채용된 방법을 사용하여 글루타르산 무수물 및 도데실마그네슘 브로마이드 용액으로부터 64% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.75 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 2.49 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.44 - 2.35 (m, 4H), 1.90 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.56 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.26 (d, J = 4.0 Hz, 19H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 25b: 2-((5-옥소헵타데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00167
중간체 25b는 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 25a 및 중간체 1c로부터 55% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.19 (m, 9H), 4.30 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.12 (dd, J = 11.9, 5.8 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.46 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.42 - 2.24 (m, 8H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.88 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.57 (dp, J = 21.3, 7.2 Hz, 6H), 1.43 - 1.18 (m, 41H), 0.87 (td, J = 6.8, 4.1 Hz, 8H).
중간체 25c: 2-((5-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)헵타데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00168
중간체 25c는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 25b로부터 23% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.31 - 8.24 (m, 2H), 7.42 - 7.35 (m, 2H), 5.44 - 5.19 (m, 9H), 4.83 (q, J = 5.7 Hz, 1H), 4.31 (ddd, J = 12.0, 4.4, 2.9 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 2.1 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 2.34 (dt, J = 30.7, 7.0 Hz, 6H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.80 - 1.52 (m, 14H), 1.29 (dd, J = 19.3, 12.3 Hz, 44H), 0.88 (td, J = 6.8, 3.7 Hz, 9H).
화합물 25: 2-((5-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헵타데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00169
화합물 25는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 25c 및 3-(디메틸아미노)프로판-1-올로부터 94% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.19 (m, 9H), 4.74 - 4.65 (m, 1H), 4.29 (ddd, J = 11.9, 4.4, 1.7 Hz, 2H), 4.25 - 4.07 (m, 4H), 2.82 - 2.72 (m, 4H), 2.39 - 2.28 (m, 8H), 2.22 (s, 6H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.84 (dq, J = 8.2, 6.7 Hz, 2H), 1.73 - 1.50 (m, 14H), 1.41 - 1.18 (m, 50H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.2 Hz, 9H). MS: 1016.11 m/z [M+H].
실시예 26 - 화합물 26
화합물 26: 2-((5-(((3-(에틸(메틸)아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헵타데카노일)옥시) 프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00170
화합물 26은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 25c 및 3-((메틸)에틸아미노)프로판-1-올로부터 84% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.20 (m, 10H), 4.69 (dq, J = 7.5, 5.5 Hz, 1H), 4.29 (ddd, J = 11.9, 4.4, 1.6 Hz, 2H), 4.25 - 4.10 (m, 4H), 2.83 - 2.72 (m, 4H), 2.45 - 2.38 (m, 4H), 2.37 - 2.28 (m, 6H), 2.21 (s, 3H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.88 - 1.79 (m, 2H), 1.74 - 1.52 (m, 13H), 1.44 - 1.22 (m, 51H), 1.04 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.1 Hz, 9H). MS: 1030.1 m/z [M+H].
실시예 27 - 화합물 27
화합물 27: 2-((5-(((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)헵타데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00171
화합물 27은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 25c 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 79% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.21 (m, 10H), 4.69 (dt, J = 7.1, 5.3 Hz, 1H), 4.29 (ddd, J = 11.9, 4.3, 1.6 Hz, 2H), 4.25 - 4.10 (m, 4H), 2.81 - 2.73 (m, 4H), 2.52 (dd, J = 14.8, 7.1 Hz, 6H), 2.33 (dt, J = 13.4, 7.2 Hz, 6H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.89 (dq, J = 10.8, 6.8 Hz, 2H), 1.82 - 1.74 (m, J = 3.8, 3.3 Hz, 4H), 1.71 - 1.53 (m, 13H), 1.40 - 1.21 (m, 49H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.2 Hz, 9H). MS: 1041.8 m/z [M+H].
실시예 28 - 화합물 28
화합물 28 : 2-((5-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)헵타데카노일)옥시) 프로판- 1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00172
화합물 28은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 25c 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 87% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.21 (m, 10H), 5.12 (s, 1H), 4.80 - 4.65 (m, 1H), 4.29 (dt, J = 11.9, 4.5 Hz, 2H), 4.19 - 4.09 (m, 2H), 3.24 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 2.83 - 2.72 (m, 4H), 2.44 (dt, J = 14.6, 6.6 Hz, 4H), 2.38 - 2.27 (m, 6H), 2.20 (s, 3H), 2.04 (dd, J = 7.8, 5.7 Hz, 8H), 1.74 - 1.42 (m, 15H), 1.42 - 1.19 (m, 50H), 1.04 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.4 Hz, 9H). MS: 1014.1 m/z [M+H].
실시예 29 - 화합물 29
화합물 29: 2-((5-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)헵타데카노일)옥시) 프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00173
화합물 29는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 25c 및 (1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 93% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.21 (m, 11H), 5.08 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.74 (s, 1H), 4.29 (dt, J = 11.9, 4.6 Hz, 2H), 4.13 (ddd, J = 11.9, 5.8, 4.5 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 11.3, 10.6 Hz, 1H), 3.08 (d, J = 25.9 Hz, 2H), 2.82 - 2.73 (m, 4H), 2.39 - 2.18 (m, 12H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 9H), 1.91 - 1.82 (m, 1H), 1.62 (dddd, J = 27.4, 20.2, 13.2, 6.7 Hz, 18H), 1.42 - 1.20 (m, 52H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.4 Hz, 9H). MS: 1026.8 m/z [M+H].
실시예 30 - 화합물 30
중간체 30a: 3-하이드록시프로판-1,2-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00174
DCM (0.1 M) 중 글리세롤 (1.59 g, 1.0 당량)의 용액에 리놀레산 (2.05 당량), DMAP (0.2 당량), DIPEA (2.4 당량), EDCI (2.4 당량), 및 1 mL의 DMF를 순서대로 첨가했다. 반응을 실온에서 65시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 물을 첨가하여 켄칭하고, 유기층을 1 M HCl로 1회 및 5% NaHCO3로 1회 세척하였다. 이어서 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 무색 오일로 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 8H), 5.13 - 5.04 (m, 1H), 4.32 (dd, J = 11.9, 4.6 Hz, 1H), 4.23 (dd, J = 11.9, 5.6 Hz, 1H), 3.73 (ddd, J = 6.5, 5.0, 1.3 Hz, 2H), 2.82 - 2.73 (m, 4H), 2.33 (dt, J = 8.8, 7.5 Hz, 4H), 2.03 (dq, J = 13.1, 6.6 Hz, 9H), 1.69 - 1.57 (m, 4H), 1.44 - 1.23 (m, 29H), 0.96 - 0.83 (m, 6H).
중간체 30b: 3-((4-옥소헥사데카노일)옥시)프로판-1,2-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00175
중간체 30b는 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 30a 및 중간체 1a로부터 66% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.26 (m, 9H), 4.29 (ddd, J = 11.8, 4.3, 2.1 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 7.7, 6.0 Hz, 2H), 2.82 - 2.74 (m, 4H), 2.71 (td, J = 6.3, 5.6, 2.4 Hz, 2H), 2.62 - 2.55 (m, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.31 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.66 - 1.54 (m, 8H), 1.41 - 1.19 (m, 47H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.4 Hz, 9H).
중간체 30c: 3-((4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,2-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00176
중간체 30c는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 30b로부터 40% 수율로 합성하였다.
화합물 30: 9-도데실-2-메틸-7,12-디옥소-6,8,13-트리옥사-2-아자헥사데칸-15,16-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00177
화합물 30은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 30c 및 3-((메틸)에틸아미노)프로판-1-올로부터 84% 수율로 합성하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.20 (m, 8H), 4.76 - 4.67 (m, 1H), 4.29 (ddd, J = 11.9, 4.3, 1.7 Hz, 2H), 4.22 - 4.11 (m, 4H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 2.45 - 2.28 (m, 8H), 2.22 (s, 6H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 2.00 - 1.79 (m, 4H), 1.69 - 1.51 (m, 6H), 1.40 - 1.17 (m, 48H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.8 Hz, 8H). MS: 1002.2 m/z [M+H].
실시예 31 - 화합물 31
중간체 31a: 4-옥소도데칸산
Figure pct00178
중간체 31a는 중간체 1a에 채용된 방법을 사용하여 석신산 무수물 및 옥틸마그네슘 브로마이드 용액으로부터 9% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.71 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.57 (p, J = 7.1 Hz, 2H), 1.26 (d, J = 3.6 Hz, 10H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 31b: 2-((4-옥소도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00179
중간체 31b는 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31a 및 중간체 1c로부터 38% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.47 - 5.19 (m, 8H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.15 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.71 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.67 - 1.53 (m, 6H), 1.40 - 1.20 (m, 37H), 0.88 (td, J = 6.8, 5.0 Hz, 9H).
중간체 31c: 2-((4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00180
중간체 31c는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 68%의 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.26 - 8.16 (m, 2H), 7.40 - 7.30 (m, 2H), 5.39 - 5.05 (m, 9H), 4.80 (tdd, J = 7.5, 5.4, 4.0 Hz, 1H), 4.49 - 4.04 (m, 4H), 2.77 - 2.63 (m, 4H), 2.45 - 2.18 (m, 6H), 2.08 - 1.85 (m, 10H), 1.74 - 1.46 (m, 6H), 1.41 - 1.11 (m, 40H), 0.81 (td, J = 6.9, 2.4 Hz, 9H).
화합물 31: 2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00181
화합물 31은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31c 및 3-(디메틸아미노)프로판-1-올로부터 71% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.22 (m, 9H), 4.72 (tdd, J = 7.4, 5.3, 4.0 Hz, 1H), 4.34 - 4.26 (m, 2H), 4.23 - 4.10 (m, 4H), 2.82 - 2.72 (m, 4H), 2.45 - 2.36 (m, 4H), 2.31 (ddd, J = 8.0, 7.1, 1.2 Hz, 4H), 2.25 (s, 6H), 2.05 (q, J = 6.6 Hz, 8H), 1.99 - 1.91 (m, 1H), 1.91 - 1.82 (m, 3H), 1.67 - 1.53 (m, 6H), 1.40 - 1.21 (m, 41H), 0.94 - 0.82 (m, 9H). MS: 945.6 m/z [M+H].
실시예 32 - 화합물 32
화합물 32: 2-((4-(((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00182
화합물 32는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31c 및 3-(디에틸아미노)프로판-1-올로부터 71% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 9H), 5.25 (ddd, J = 5.8, 4.4, 1.5 Hz, 1H), 4.72 (tdd, J = 7.6, 5.4, 4.0 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.25 - 4.08 (m, 5H), 2.77 (td, J = 6.1, 1.1 Hz, 4H), 2.64 - 2.53 (m, 6H), 2.40 (dt, J = 8.7, 6.8 Hz, 2H), 2.31 (ddd, J = 8.0, 7.2, 1.1 Hz, 4H), 2.10 - 2.01 (m, 10H), 1.95 (dddd, J = 11.1, 9.2, 6.9, 3.5 Hz, 1H), 1.91 - 1.81 (m, 3H), 1.69 - 1.49 (m, 7H), 1.39 - 1.20 (m, 42H), 1.05 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.9 Hz, 9H). MS: 974.0 m/z [M+H].
실시예 33 - 화합물 33
화합물 33: 2-((4-(((3-(에틸(메틸)아미노)프로폭시)카보닐)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00183
화합물 33은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31c 및 3-((메틸)에틸아미노)프로판-1-올로부터 79% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.21 (m, 10H), 4.72 (tdd, J = 9.5, 6.7, 4.1 Hz, 1H), 4.38 - 4.25 (m, 2H), 4.25 - 4.10 (m, 4H), 2.77 (td, J = 6.2, 1.1 Hz, 4H), 2.51 - 2.38 (m, 6H), 2.37 - 2.27 (m, 5H), 2.24 (d, J = 2.4 Hz, 3H), 2.05 (q, J = 7.1 Hz, 8H), 1.97 - 1.83 (m, 4H), 1.70 - 1.50 (m, 7H), 1.39 - 1.21 (m, 41H), 1.06 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.94 - 0.84 (m, 9H). 960.1 m/z [M+H].
실시예 34 - 화합물 34
화합물 34: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00184
화합물 34는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31c 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 59% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.13 (m, 10H), 4.75 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.4, 1.4 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.3 Hz, 2H), 3.25 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.83 - 2.73 (m, 4H), 2.53 - 2.35 (m, 6H), 2.35 - 2.27 (m, 4H), 2.21 (d, J = 3.3 Hz, 3H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.96 - 1.74 (m, 3H), 1.66 - 1.43 (m, 7H), 1.41 - 1.21 (m, 41H), 1.05 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (td, J = 6.9, 5.6 Hz, 9H). 944.7 m/z [M+H].
실시예 35 - 화합물 35
화합물 35: 2-((4-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시) 프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00185
화합물 35는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31c 및 (1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 71% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.21 (m, 10H), 4.86 - 4.66 (m, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.1 Hz, 2H), 3.48 - 3.35 (m, 1H), 3.22 - 3.00 (m, 2H), 2.83 - 2.71 (m, 4H), 2.47 - 2.19 (m, 12H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.96 - 1.67 (m, 6H), 1.67 - 1.42 (m, 8H), 1.41 - 1.19 (m, 41H), 0.95 - 0.84 (m, 9H). 956.5 m/z [M+H].
실시예 36 - 화합물 36
화합물 36: 2-((4-(((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00186
화합물 36은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31c 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 34% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.22 (m, 9H), 4.72 (tdd, J = 7.4, 5.4, 4.0 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.25 - 4.08 (m, 4H), 2.82 - 2.72 (m, 4H), 2.67 (t, J = 7.6 Hz, 5H), 2.47 - 2.27 (m, 6H), 2.09 - 1.91 (m, 11H), 1.91 - 1.80 (m, 4H), 1.68 - 1.47 (m, 7H), 1.47 - 1.19 (m, 42H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.8 Hz, 9H). 971.3 m/z [M+H].
실시예 37 - 화합물 37
화합물 37: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)(메틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시) 프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00187
화합물 37은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31c 및 N1-에틸-N1,N2-디메틸에탄-1,2-디아민으로부터 67% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.18 (m, 8H), 4.78 (s, 1H), 4.28 (dt, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.9, 5.8 Hz, 2H), 3.44 - 3.24 (m, 2H), 2.91 (d, J = 8.1 Hz, 3H), 2.81 - 2.71 (m, 4H), 2.60 - 2.21 (m, 12H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 7H), 1.98 - 1.46 (m, 14H), 1.43 - 1.19 (m, 37H), 1.14 - 1.00 (m, 3H), 0.88 (td, J = 7.0, 5.3 Hz, 8H). 958.6 m/z [M+H].
실시예 38 - 화합물 38
화합물 38: 2-((4-(((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시) 프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00188
화합물 38은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31c 및 N1,N1,N2-트리메틸에탄-1,2-디아민으로부터 83% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.19 (m, 8H), 4.78 (s, 1H), 4.28 (dt, J = 11.9, 4.1 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.9, 5.8 Hz, 2H), 3.37 (d, J = 23.8 Hz, 2H), 2.91 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 2.82 - 2.72 (m, 4H), 2.54 - 2.21 (m, 13H), 2.04 (q, J = 6.7 Hz, 7H), 1.95 - 1.44 (m, 14H), 1.42 - 1.21 (m, 37H), 0.88 (td, J = 7.0, 5.3 Hz, 8H). 944.5 m/z [M+H].
실시예 39 - 화합물 39
중간체 39a: 데실마그네슘 브로마이드
Figure pct00189
THF (250 mL) 중 Mg (10.99 g, 2 당량) 및 I2 (0.0001 eq)의 용액에 1-브로모데칸 (1.0 당량)을 80℃에서 2시간에 걸쳐 적가하였다. 첨가 후, 혼합물을 이 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 조 생성물 데실마그네슘 브로마이드를 흑갈색 용액으로 얻었으며 추가 정제없이 즉시 다음 단계에 사용되었다.
중간체 39b: 4-옥소테트라데칸산
Figure pct00190
THF (1.1 M) 중 석신산 무수물 (45 g, 1.0 당량)의 용액을 -78℃로 냉각시킨 다음 중간체 39a를 첨가하였다. 반응을 -78℃에서 2시간 동안 유지한 후 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서 반응을 포화 NH4Cl를 첨가하여 켄칭하고, H2O로 희석하고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체 (7.8 g, 7%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.74 (dd, J = 6.9, 5.2 Hz, 2H), 2.70 - 2.63 (m, 2H), 2.46 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.67 - 1.54 (m, 2H), 1.29 (d, J = 5.2 Hz, 14H), 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
중간체 39c: 2-((4-옥소테트라데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00191
중간체 39c는 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 39b 및 중간체 1c로부터 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.18 (m, 9H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 2.74 (dt, J = 22.1, 6.8 Hz, 6H), 2.66 - 2.56 (m, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.59 (tq, J = 14.2, 7.5 Hz, 7H), 1.41 - 1.18 (m, 44H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.6 Hz, 9H).
중간체 39d: 2-((4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)테트라데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00192
MeOH (0.13 M) 중 중간체 39c의 용액에 NaBH4 (2.5 당량)를 5℃에서 천천히 첨가하였다. 혼합물을 이 온도에서 2시간 동안 교반하였다. H2O를 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭시킨 다음 EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일을 얻고 이는 DCM (1 M)에서 즉시 재구성한 다음, 0℃에서 4-니트로페닐클로포로메이트 (1.5 당량) 및 피리딘 (2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 31% 수율로 중간체 39d를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.33 - 8.22 (m, 2H), 7.46 - 7.33 (m, 2H), 5.43 - 5.23 (m, 9H), 4.31 (dd, J = 12.0, 4.3 Hz, 2H), 4.15 (dd, J = 12.0, 5.8 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 2.47 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30 (td, J = 7.6, 4.2 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 7.3 Hz, 10H), 1.67 (dt, J = 47.7, 6.1 Hz, 7H), 1.30 (tq, J = 14.3, 4.9, 3.0 Hz, 53H), 0.88 (td, J = 6.8, 3.5 Hz, 10H).
화합물 39: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)테트라데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00193
화합물 39는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 39d 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 78% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.49 - 5.17 (m, 9H), 4.75 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.9, 3.3 Hz, 2H), 3.26 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.52 - 2.27 (m, 10H), 2.23 (s, 3H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.95 - 1.42 (m, 14H), 1.42 - 1.18 (m, 40H), 1.05 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (td, J = 6.8, 4.5 Hz, 7H). 972.9 m/z [M+H].
실시예 40 - 화합물 40
중간체 40a: 4-하이드록시데칸산
Figure pct00194
EtOH (240 mL) 및 H2O (80 mL) 중 5-헥실테트라하이드로푸란-2-온 (15 g, 1.0 당량)의 용액에 NaOH (2.0 당량)를 첨가했다. 반응을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하여 EtOH를 제거하였다. 그런 다음 수성 1 N HCl로 pH를 5로 조정하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 백색 고체 (48%)로 얻었다.
중간체 40b: 4-옥소데칸산
Figure pct00195
H2O (1000 mL) 중 NaH2PO4 (17 당량) 및 Na2HPO4 (2.4 당량)의 용액에 중간체 40a (10 g, 1.0 당량)를 첨가하였다. 이어서 NaClO (200 mL, 6 내지 8% Cl)를 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 혼합물에 H3PO4 (200 mL, 85%) 및 실리카겔 (300 g)을 첨가하였다. 혼합물을 감압하에 건조시키고 EtOAc로 3회 세척하였다. 유기층을 감압하에 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피 (EtoAc/헥산)로 정제하여 생성물을 백색 고체 (80%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.70 (dd, J = 7.0, 5.3 Hz, 2H), 2.63 - 2.58 (m, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.58 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.33 - 1.19 (m, 6H), 0.90 - 0.83 (m, 3H).
중간체 40c: 2-((4-옥소데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00196
중간체 40c는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40b 및 중간체 1c로부터 40% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.28 (m, 8H), 5.24 (tt, J = 5.9, 4.3 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 2.73 (dt, J = 22.4, 6.7 Hz, 7H), 2.58 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.59 (q, J = 6.7 Hz, 7H), 1.40 - 1.22 (m, 35H), 0.88 (td, J = 6.8, 4.0 Hz, 9H).
중간체 40d: 2-((4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00197
중간체 40d는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40c로부터 31% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.37 - 8.27 (m, 2H), 7.43 (dd, J = 9.1, 5.9 Hz, 2H), 5.45 - 5.24 (m, 9H), 4.34 (dd, J = 12.0, 4.3 Hz, 2H), 4.18 (dd, J = 11.9, 6.0 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 2.49 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.41 - 2.30 (m, 4H), 2.07 (q, J = 6.9 Hz, 9H), 1.83 - 1.58 (m, 7H), 1.48 - 1.12 (m, 37H), 1.00 - 0.82 (m, 9H).
화합물 40: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00198
화합물 40은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 53% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.19 (m, 9H), 4.76 (s, 1H), 4.32 - 4.22 (m, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.9, 3.4 Hz, 2H), 3.26 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.57 - 2.36 (m, 6H), 2.36 - 2.27 (m, 4H), 2.23 (s, 3H), 2.05 (q, J = 6.6 Hz, 8H), 1.98 - 1.42 (m, 15H), 1.41 - 1.19 (m, 35H), 1.06 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.88 (td, J = 9.7, 8.2, 4.2 Hz, 9H). MS: 916.7 m/z [M+H].
실시예 41 - 화합물 41
중간체 41a: 4-사이클로헥실-4-옥소부탄산
Figure pct00199
Et2O (300 mL) 중 석신산 무수물 (30 g, 1.0 당량)의 용액에 CuI (0.1 당량)를 첨가했다. 혼합물을 -20℃로 냉각시켰다. 그 다음, 사이클로헥실 마그네슘 브로마이드 (1.0 당량)를 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 25℃로 가온하고 14시간 동안 교반하였다. 1 M 수성 HCl을 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 15분 동안 교반하였다. 그 다음 반응물을 여과하고 여액을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 옅은 분홍색 고체 (13%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.09 (s, 1H), 2.66 (dt, J = 55.4, 6.5 Hz, 4H), 2.35 (td, J = 10.8, 9.3, 5.2 Hz, 1H), 1.75 (ddd, J = 43.2, 36.6, 11.9 Hz, 5H), 1.46 - 1.09 (m, 5H).
중간체 41b: 2-((4-사이클로헥실-4-옥소부타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00200
중간체 41b는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 41a 및 중간체 1c로부터 34% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.28 (m, 8H), 5.24 (ddd, J = 10.2, 5.6, 4.2 Hz, 1H), 4.28 (dt, J = 11.9, 4.6 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 2.3 Hz, 2H), 2.81 - 2.70 (m, 6H), 2.64 - 2.54 (m, 3H), 2.38 - 2.27 (m, 5H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.89 - 1.55 (m, 11H), 1.40 - 1.20 (m, 34H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
중간체 41c: 2-((4-사이클로헥실-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)부타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00201
중간체 41c는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 41b로부터 14% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.33 - 8.21 (m, 2H), 7.45 - 7.34 (m, 2H), 5.44 - 5.13 (m, 9H), 4.70 (ddd, J = 9.3, 6.1, 3.4 Hz, 1H), 4.50 (dd, J = 12.3, 3.9 Hz, 1H), 4.35 - 4.10 (m, 4H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.50 - 2.40 (m, 2H), 2.38 - 2.22 (m, 4H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 10H), 1.85 - 1.52 (m, 10H), 1.49 - 1.00 (m, 31H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
화합물 41: 2-((4-사이클로헥실-4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)부타노일)옥시) 프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00202
화합물 41은 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 41d 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 60% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.09 (m, 9H), 4.60 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.5, 1.6 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 2.9 Hz, 2H), 3.25 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.54 - 2.15 (m, 12H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.99 - 0.95 (m, 50H), 0.93 - 0.80 (m, 6H). MS: 914.5 m/z [M+H].
실시예 42 - 화합물 42
중간체 42a: 4-하이드록시옥탄산
Figure pct00203
중간체 42a는 중간체 39b에 채용된 방법을 사용하여 5-부틸테트라하이드로푸란-2-온으로부터 53% 수율로 합성하였다.
중간체 42b: 4-옥소옥탄산
Figure pct00204
중간체 42b는 중간체 38b에 채용된 방법을 사용하여 중간체 42a로부터 61% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.65 (ddd, J = 7.0, 5.8, 1.1 Hz, 2H), 2.56 (ddd, J = 7.1, 6.0, 1.2 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.56 - 1.44 (m, 2H), 1.30 - 1.17 (m, 2H), 0.84 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
중간체 42c: 2-((4-옥소옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00205
중간체 42c는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 42b 및 중간체 1c로부터 29% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 (tq, J = 18.2, 9.4, 7.6 Hz, 8H), 5.24 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 12.0, 3.9 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 12.1, 5.8 Hz, 2H), 2.74 (dt, J = 20.9, 6.7 Hz, 6H), 2.59 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.7 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 7.0 Hz, 8H), 1.60 (t, J = 7.5 Hz, 8H), 1.31 (d, J = 14.1 Hz, 29H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H).
중간체 42d: 2-((4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00206
중간체 42d는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40c로부터 51% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.28 (dd, J = 7.8, 4.7 Hz, 2H), 7.47 - 7.36 (m, 2H), 5.32 (dp, J = 19.8, 9.2 Hz, 8H), 5.17 (s, 1H), 4.87 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.36 - 4.09 (m, 4H), 2.75 (d, J = 6.7 Hz, 4H), 2.49 (dt, J = 23.8, 7.9 Hz, 2H), 2.42 - 2.14 (m, 5H), 2.03 (q, J = 7.2 Hz, 10H), 1.73 (s, 1H), 1.61 (dd, J = 23.8, 11.9 Hz, 6H), 1.31 (d, J = 14.4 Hz, 30H), 0.89 (tt, J = 9.5, 7.0, 2.7 Hz, 9H).
화합물 42: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00207
화합물 42는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 42d 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 93% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.10 (m, 11H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.5, 1.3 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.8, 5.8, 3.3 Hz, 2H), 3.25 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.39 (ddd, J = 8.7, 6.6, 4.3 Hz, 6H), 2.35 - 2.28 (m, 4H), 2.22 (s, 3H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.96 - 1.74 (m, 3H), 1.61 (s, 11H), 1.42 - 1.22 (m, 34H), 1.10 - 0.99 (m, 3H), 0.95 - 0.83 (m, 9H).
실시예 43 - 화합물 43
중간체 43a: 나트륨 4-하이드록시부타노에이트
Figure pct00208
H2O (100 mL) 중 테트라하이드로푸란-2-온 (10 g, 1.0 당량)의 혼합물에 NaOH (4.0 당량)를 첨가하고, 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징했다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 24시간 동안 25℃에서 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 조 잔류물을 무색 오일로 수득하고 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다 (12 g, 조질).
중간체 43b: 벤질 4-하이드록시부타노에이트
Figure pct00209
아세톤 (100 mL) 중 중간체 43a (12 g, 1.0 당량)의 혼합물에 TBAB (0.05 당량)와 벤질 브로마이드 (1.2 당량)에 첨가하고, 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징하였다. 혼합물을 N2 분위기하에 60℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 감압하에 농축하고, 생성된 잔류물을 EtOAc로 희석하고 1 N NaHSO4, NaHCO3 및 H2O로 각각 1회씩 세척하였다. 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고 농축하고, 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (43%)로서 얻었다.
중간체 43c: 벤질 4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)부타노에이트
Figure pct00210
DCM (150 mL) 중 중간체 43b (5 g, 1.0 당량)의 혼합물에 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (1.0 당량)를 첨가하고 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징하였다. 반응을 0℃로 냉각한 다음 피리딘 (2.0 당량)을 첨가하였다. 반응을 N2 분위기 하에서 5시간 동안 25℃ 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 감압하에 농축하고, 횡령으로 희석하고 여과하였다. 여액을 H2O로 10회 세척하고, 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (32%)로 얻었다.
중간체 43d: 벤질 4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)부타노에이트
Figure pct00211
MeCN (50 mL) 중 중간체 43c (3 g, 1.0 당량)의 혼합물에 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민 (2.5 당량), 피리딘 (3.0 당량), 및 DMAP (1.0 당량)을 첨가했다. 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징하고, 혼합물을 N2하에 70℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 감압하에 농축하고 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (56%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33 - 7.23 (m, 4H), 5.24 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.04 (dt, J = 12.9, 6.7 Hz, 2H), 3.19 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 3.00 (s, 1H), 2.39 (dt, J = 10.4, 6.6 Hz, 6H), 2.13 (s, 3H), 1.89 (p, J = 6.9　Hz, 2H), 0.98 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
중간체 43e: 4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)부탄산
Figure pct00212
MeOH (30 mL) 중 중간체 43d (1.5 g, 1.0 당량)의 혼합물에 Pd/C (10% wt, 0.05 당량)를 첨가하고 혼합물을 탈기하고 H2로 3회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 H2 분위기 하에서 1시간 동안 25℃에서 교반하고, 그 후 여액을 농축하여 조 잔류물을 얻고 추가 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.11 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.49 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.29 - 3.21 (m, 5H), 2.89 (s, 3H), 2.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.92 (p, J = 6.7 Hz, 2H), 1.34 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
화합물 43: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)부타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00213
화합물 43은 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 43d 및 중간체 1c로부터 45% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.22 (m, 9H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.18 - 4.06 (m, 4H), 3.25 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.43 (dt, J = 10.5, 7.3 Hz, 6H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.20 (s, 3H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.95 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.59 (d, J = 7.1 Hz, 7H), 1.40 - 1.22 (m, 26H), 1.04 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 44 - 화합물 44
화합물 44: 2-((4-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00214
화합물 44는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 (1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 35% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.20 (m, 9H), 5.16 (s, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.0 Hz, 2H), 3.39 (s, 1H), 3.10 (d, J = 27.2 Hz, 2H), 2.81 - 2.73 (m, 4H), 2.43 - 2.18 (m, 11H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.96 - 1.42 (m, 17H), 1.30 (dqt, J = 12.8, 8.8, 5.4 Hz, 36H), 0.92 - 0.83 (m, 9H). MS: 928.9 m/z [M+H].
실시예 45 - 화합물 45
화합물 45: 2-((4-(((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00215
화합물 45는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 52% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.21 (m, 9H), 4.72 (ddd, J = 11.3, 8.8, 5.7 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.25 - 4.10 (m, 4H), 2.81 - 2.74 (m, 4H), 2.59 (s, 5H), 2.40 (dt, J = 8.6, 6.4 Hz, 2H), 2.36 - 2.27 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.98 - 1.78 (m, 9H), 1.67 - 1.51 (m, 7H), 1.41 - 1.21 (m, 36H), 0.88 (td, J = 7.0, 5.0 Hz, 9H). MS: 943.8 m/z [M+H].
실시예 46 - 화합물 46
화합물 46: 2-((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00216
화합물 46은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 1e 및 2-(피롤리딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 53% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.55 (s, 1H), 5.46 - 5.21 (m, 9H), 4.75 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.6 Hz, 2H), 3.35 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.81 - 2.60 (m, 9H), 2.39 (ddd, J = 8.6, 6.7, 3.8 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.84 (s, 7H), 1.66 - 1.19 (m, 55H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.3 Hz, 9H). MS: 1012.5 m/z [M+H].
실시예 47 - 화합물 47
화합물 47: 2-((4-((((1-메틸피페리딘-4-일)옥시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00217
MeCN (0.1 M) 중 중간체 1e (250 mg, 1.0 당량)의 용액에 피리딘 (3.0 당량), 1-메틸피페리딘-4-올 (1.5 당량), 및 DMAP (1.0 당량)를 첨가했다. 반응을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 추가 분량의 1-메틸피페리딘-4-올 (3.0 당량)을 첨가하고 혼합물을 50℃로 가열하였다. 2 시간 후, DMAP (1.0 당량)의 추가 분량을 첨가하고 반응을 추가 2시간 동안 유지했다. 완료 후, 헵탄 (0.1 M)을 반응 혼합물에 첨가하고 헵탄층을 MeCN으로 3회 세척하였다. 합한 MeCN 층은 헵탄으로 3회 역 추출하였고, 합한 헵탄층은 MeCN으로 마지막으로 1회 세척되었다. 이어서 헵탄을 진공에서 제거하고, 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (62 mg, 32%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.20 (m, 9H), 4.77 - 4.60 (m, 2H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.6 Hz, 2H), 2.83 - 2.66 (m, 6H), 2.46 - 2.26 (m, 11H), 2.08 - 1.71 (m, 18H), 1.71 - 1.47 (m, 8H), 1.40 - 1.21 (m, 47H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.2 Hz, 9H). MS: 1013.7 m/z [M+H].
실시예 48 - 화합물 48
화합물 48: 2-((4-(((3-(비스(2-하이드록시에틸)아미노)프로필)카바모일)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00218
MeCN (0.1 M) 중 중간체 1e (250 mg, 1.0 당량)의 용액에 피리딘 (3.0 당량) 및 2-[(3-아미노프로필)(2-하이드록시에틸)아미노]에탄-1-올 (1.5 당량)을 첨가했다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 후 헵탄 (0.1 M)을 반응 혼합물에 첨가하고 헵탄층을 MeCN으로 3회 세척하였다. 합한 MeCN 층은 헵탄으로 3회 역 추출되었고, 합한 헵탄층은 MeCN으로 마지막으로 1회 세척하였다. 이어서 헵탄을 진공에서 제거하고, 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (97 mg, 48%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.20 (m, 9H), 4.76 (s, 1H), 4.29 (ddd, J = 11.9, 4.6, 1.8 Hz, 2H), 4.16 (dd, J = 11.9, 5.8 Hz, 2H), 3.72 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 3.35 - 3.22 (m, 2H), 2.98 - 2.46 (m, 14H), 2.41 - 2.28 (m, 6H), 2.09 - 1.86 (m, 9H), 1.80 (dd, J = 14.2, 7.2 Hz, 3H), 1.67 - 1.42 (m, 7H), 1.42 - 1.18 (m, 46H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.3 Hz, 9H). MS: 1060.6 m/z [M+H].
실시예 49 - 비교 화합물 49
화합물 49: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트
Figure pct00219
화합물 49는 WO 2015/095340 A1 (실시예 13)에 기재된 방법에 따라 합성되었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 5.35 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.17 (m, 8H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.55 (q, J = 7.2 Hz, 6H), 2.40 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.30 (m, 34H), 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 853 m/z [M+H].
실시예 50 - 화합물 50
화합물 50: 2-((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00220
화합물 50은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 2-(피롤리딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 36% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.49 - 5.29 (m, 8H), 5.27 - 5.20 (m, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.8 Hz, 2H), 3.35 (s, 2H), 2.83 - 2.44 (m, 10H), 2.39 (ddd, J = 8.4, 6.7, 3.3 Hz, 2H), 2.36 - 2.25 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.98 - 1.43 (m, 15H), 1.42 - 1.20 (m, 33H), 0.89 (td, J = 6.1, 5.4, 0.9 Hz, 9H). MS: 928.6 m/z [M+H].
실시예 51 - 화합물 51
화합물 51: 2-((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00221
화합물 51은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 31c 및 2-(피롤리딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 27% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.55 (s, 1H), 5.44 - 5.28 (m, 8H), 5.28 - 5.22 (m, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.9 Hz, 2H), 3.37 (s, 2H), 2.83 - 2.51 (m, 10H), 2.39 (ddd, J = 8.4, 6.8, 3.1 Hz, 2H), 2.35 - 2.27 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.97 - 1.41 (m, 17H), 1.41 - 1.20 (m, 40H), 0.94 - 0.84 (m, 9H). MS: 957.0 m/z [M+H].
실시예 52 - 화합물 52
중간체 52a: 벤질 3-하이드록시운데카노에이트
Figure pct00222
THF (150 mL)의 용액에 N2 하에 66℃에서 Zn (22.99 g, 1.0 당량) 및 노난알 (25 g, 1.0 당량)을 적가하였다. 다음으로 벤질 2-브로모아세테이트 (50.00 g, 1.24 eq)를 반응 혼합물에 천천히 조심스럽게 적가하였다. 벤질 2-브로모아세테이트를 완전히 첨가한 후, 혼합물을 냉각시키고 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 THF를 제거하고 생성된 잔류물을 물로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (25 g, 49%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33 - 7.24 (m, 5H), 5.09 (s, 2H), 3.95 (tt, J = 7.7, 3.8 Hz, 1H), 2.75 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 2.56 - 2.35 (m, 2H), 1.54 - 1.11 (m, 18H), 0.81 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 52b: 벤질 3-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)운데카노에이트
Figure pct00223
DCM (250 mL) 중 중간체 52a (25 g, 1.0 당량)의 용액에 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (17.23 g, 1.0 당량) 및 피리딘 (13.80 mL, 2.0 당량)를 N2 분위기 하에서 첨가했다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DCM을 제거하고 생성된 잔류물을 물로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (12 g, 31%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.31 - 8.01 (m, 4H), 7.28 (s, 5H), 5.22 - 5.14 (m, 2H), 5.13 - 5.01 (m, 4H), 2.68 (dd, J = 14.8, 6.4 Hz, 3H), 1.75 - 1.64 (m, 2H), 1.30 - 1.19 (m, 18H), 0.80 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
중간체 52c: 벤질 3-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)운데카노에이트
Figure pct00224
MeCN (400 mL) 중 중간체 52b (14 g, 1.0 당량) 및 N'-에틸-N'-메틸-에탄-1,2-디아민 (6.25 g, 2.0 당량)의 용액에 피리딘 (7.41 mL, 3.0 당량) 및 DMAP (3.74 g, 1.0 당량)을 첨가했다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하여 MeCN을 제거하고 생성된 잔류물을 물로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압 하에서 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일 (6g, 47%)의 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.39 - 7.28 (m, 5H), 5.11 (s, 4H), 3.21 (h, J = 6.8 Hz, 2H), 2.62 (td, J = 14.4, 13.6, 6.4 Hz, 2H), 2.50 - 2.39 (m, 4H), 1.59 (h, J = 8.2 Hz, 2H), 1.25 (d, J = 16.1 Hz, 14H), 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.86 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 52d: 3-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)운데칸산
Figure pct00225
MeOH (60 mL) 중 중간체 52c (6 g, 1.0 당량)의 용액에 Pd/C (2 g, 10% w/w)를 첨가하였다. 혼합물을 H2하에 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 갈색 오일로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.76 (s, 1H), 6.28 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.01 (p, J = 6.1, 5.6 Hz, 1H), 3.30 (qq, J = 13.8, 6.0 Hz, 2H), 2.70 (hd, J = 12.1, 11.0, 5.4 Hz, 3H), 2.37 (d, J = 14.1 Hz, 4H), 1.51 (ddq, J = 21.6, 14.2, 6.7 Hz, 2H), 1.34 - 1.14 (m, 11H), 1.10 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.80 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
화합물 52: 2-((3-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00226
DCM (0.1 내지 0.25 당량) 중 중간체 52d (1.0 내지 1.1 당량) 및 중간체 1c (1.0 내지 1.1 당량)의 용액에 DMAP (0.25 당량), DIPEA (3.5 당량), 및 EDCI (1.5 당량)를 차례로 첨가했다. 반응을 23℃에서 적어도 16시간 동안 교반하였다. 추가 DMAP (0.25 당량)를 반응에 첨가하고 반응을 23℃에서 추가 6시간 동안 교반하였다. 이어서 물을 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 1 M HCl로 1회 및 5% NaHCO3로 1회 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (28%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.53 - 5.28 (m, 8H), 5.24 (s, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 15.9, 11.9, 4.5 Hz, 2H), 4.15 (dt, J = 13.4, 6.8 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.59 (tt, J = 15.9, 9.0 Hz, 6H), 2.37 - 2.14 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 7H), 1.59 (d, J = 14.2 Hz, 12H), 1.46 - 0.97 (m, 42H), 0.96 - 0.81 (m, 9H). MS: 930.8 m/z [M+H].
실시예 53 - 화합물 53
중간체 53a: 2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00227
DCM (200 mL) 중 리놀레산 (20 g, 1.0 당량) 및 2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-디올 (7.57 g, 1.0 당량)의 용액에 EDCI (13.67 g, 1.0 당량), DMAP (1.39 g, 0.16 당량) 및 DIPEA (37.27 mL, 3.0 당량)를 첨가했다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DCM을 제거하고 생성된 잔류물을 물로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (6.3 g, 11%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.44 - 5.30 (m, 8H), 4.17 (qd, J = 11.1, 6.0 Hz, 4H), 3.63 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.80 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.35 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.21 (h, J = 6.0 Hz, 1H), 2.14 - 2.03 (m, 8H), 1.64 (p, J = 7.4 Hz, 4H), 1.46 - 1.28 (m, 27H), 0.93 (t, J = 6.7 Hz, 6H).
화합물 53: 2-(11-메틸-5-옥틸-3,7-디옥소-2,6-디옥사-8,11-디아자트리데실)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00228
화합물 53은 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 52d 및 중간체 53a로부터 45% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.48 - 5.24 (m, 8H), 5.07 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.20 - 4.07 (m, 6H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.62 - 2.46 (m, 4H), 2.45 - 2.37 (m, 2H), 2.34 - 2.15 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.43 - 0.97 (m, 43H), 0.95 - 0.83 (m, 9H). MS: 944.8 m/z [M+H].
실시예 54 - 화합물 54
중간체 54a: 벤질 4-하이드록시도데카노에이트
Figure pct00229
물 (200-250 mL) 중 5-옥틸테트라하이드로푸란-2-온 (20 g, 1.0 당량)의 용액에 NaOH (1.1 당량)을 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 24시간 동안 20℃에서 교반하였다. 다음으로 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매인 물을 제거하였다. 생성된 조 물질을 아세톤 (200 mL)에서 재구성한 다음 TBAB (0.05 당량) 및 BnBr (1.2 내지 1.5 당량)을 첨가했다. 혼합물을 60℃로 가열하고 N2 대기하에 12시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 감압하에 농축하고 생성된 잔류물을 포화 NaHCO3 용액에 부었다. 생성물을 EtOAc로 3회 추출하고, 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 무색 오일 (20 g, 39%)로 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.45 - 7.29 (m, 5H), 5.12 (s, 2H), 3.65 - 3.57 (m, 1H), 2.51 (td, J = 7.2, 2.7 Hz, 2H), 1.86 (dtd, J = 14.6, 7.4, 3.5 Hz, 1H), 1.71 (ddd, J = 14.2, 8.6, 7.1 Hz, 1H), 1.61 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 1.52 - 1.17 (m, 17H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 54b: 벤질 4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)도데카노에이트
Figure pct00230
DCM (80 내지 100 mL) 중 중간체 54a (10 g, 1.0 당량)의 용액에 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (1.5 당량)를 첨가하였다. 반응을 탈기시키고 N2로 3회 퍼징하고 0℃로 냉각시킨 후, 피리딘 (2.0 당량)을 첨가했다. 반응 혼합물을 N2 분위기 하에서 5시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 감압하에 농축하고 생성된 잔류물을 헥산에 재구성시키고 여과하였다. 생성된 여액을 물로 3회 세척하고, 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 무색 오일 (9 g, 29%)로서 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.27 (dd, J = 9.8, 7.8 Hz, 2H), 7.50 - 7.30 (m, 8H), 5.12 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.87 (ddt, J = 12.2, 7.3, 4.1 Hz, 1H), 2.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.16 - 2.06 (m, 1H), 1.99 (dq, J = 14.8, 7.5 Hz, 1H), 1.73 (ddd, J = 14.0, 12.0, 7.0 Hz, 1H), 1.63 (tt, J = 8.6, 4.5 Hz, 1H), 1.45 - 1.19 (m, 12H), 0.94 - 0.84 (m, 3H).
중간체 54c: 벤질 4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노에이트
Figure pct00231
MeCN (45 내지 90 mL) 중 중간체 54b (9 g, 1.0 당량)의 용액에 N'-에틸-N'-메틸-에탄-1,2-디아민 (1.5 내지 2.5 당량), 피리딘 (3 내지 4 당량), 및 DMAP (2.33 g, 1.0 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징하였다. 반응을 70℃로 가열하고 N2 분위기 하에서 2시간 동안 교반했다. 완료 후, 혼합물을 농축하여 용매를 제거하고 생성된 잔류물을 EtOAc로 희석하고 포화 NaHCO3로 3회 및 물로 3회 세척했다. 이어서 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 담황색 오일 (5 g, 60%)로 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 - 7.22 (m, 5H), 5.04 (s, 2H), 4.69 (s, 1H), 3.16 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 2.45 - 2.27 (m, 6H), 2.13 (s, 3H), 1.95 - 1.71 (m, 2H), 1.40 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 1.34 - 1.09 (m, 13H), 0.96 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.80 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 54d: 4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)도데칸산
Figure pct00232
MeOH (60 mL) 중 중간체 54c (6 g, 1.0 당량)의 용액에 Pd/C (1.8 g, 10% w/w)를 첨가하였다. 혼합물을 H2 에 20℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 여과하고 여액을 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 갈색 오일 (3.2 g, 67%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.76 (dp, J = 8.1, 4.1 Hz, 1H), 3.65 (dt, J = 14.0, 7.0 Hz, 1H), 3.28 - 3.10 (m, 4H), 3.07 (ddd, J = 11.3, 7.5, 2.1 Hz, 1H), 2.79 (s, 3H), 2.27 (ddd, J = 14.0, 8.2, 4.4 Hz, 1H), 2.20 - 1.99 (m, 2H), 1.86 - 1.74 (m, 1H), 1.71 - 1.56 (m, 1H), 1.48 (dq, J = 13.7, 7.6, 6.8 Hz, 1H), 1.31 (dd, J = 14.1, 7.0 Hz, 14H), 0.94 - 0.83 (m, 3H).
화합물 54: 2-(12-메틸-6-옥틸-3,8-디옥소-2,7-디옥사-9,12-디아자테트라데실)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00233
화합물 54는 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 54d 및 중간체 53a로부터 47% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.26 (m, 8H), 4.75 (s, 1H), 4.12 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.55 - 2.34 (m, 6H), 2.34 - 2.19 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.97 - 1.70 (m, 4H), 1.61 (t, J = 7.2 Hz, 10H), 1.41 - 1.00 (m, 43H), 0.94 - 0.82 (m, 9H). MS: 959.1 m/z [M+H].
실시예 55 - 화합물 55
중간체 55a: 벤질 5-하이드록시트리데카노에이트
Figure pct00234
중간체 55a는 중간체 54a에 채용된 방법을 사용하여 6-옥틸테트라하이드로피란-2-온으로부터 25% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.34 (qt, J = 9.5, 4.5 Hz, 5H), 5.11 (s, 2H), 3.57 (s, 1H), 2.39 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.85 - 1.65 (m, 2H), 1.60 - 1.11 (m, 18H), 0.98 - 0.80 (m, 3H).
중간체 55b: 벤질 5-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)트리데카노에이트
Figure pct00235
중간체 55b는 중간체 54b에 채용된 방법을 사용하여 중간체 55a로부터 37% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.32 - 8.24 (m, 3H), 7.39 (dddd, J = 20.3, 9.9, 5.7, 1.9 Hz, 8H), 5.12 (s, 2H), 4.87 - 4.75 (m, 1H), 2.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.69 (dddt, J = 33.5, 23.3, 14.2, 6.0 Hz, 6H), 1.51 - 1.01 (m, 13H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
중간체 55c: 벤질 5-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)트리데카노에이트
Figure pct00236
중간체 55c는 중간체 54c에 채용된 방법을 사용하여 중간체 55b로부터 53% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.41 - 7.18 (m, 5H), 5.04 (s, 2H), 4.65 (p, J = 6.5 Hz, 1H), 3.19 (q, J = 6.4, 5.9 Hz, 2H), 2.49 - 2.23 (m, 6H), 2.16 (d, J = 29.0 Hz, 3H), 1.69 - 1.54 (m, J = 6.7 Hz, 2H), 1.44 (tt, J = 13.6, 7.1 Hz, 4H), 1.37 - 1.05 (m, 14H), 0.98 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.80 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
중간체 55d: 5-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)트리데칸산
Figure pct00237
THF (20 mL) 중 중간체 55c (2.2 g, 1.0 당량)의 용액에 Pd/C (2.5 g, 10% w/w)를 첨가하였다. 혼합물을 H2 하에 20℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 갈색 오일 (1 g, 58%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.81 (s, 1H), 5.93 - 5.72 (m, 1H), 4.61 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.68 - 3.47 (m, 1H), 3.29 - 3.04 (m, 1H), 2.76 (tt, J = 17.2, 9.1 Hz, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.34 - 2.06 (m, 2H), 1.85 - 0.87 (m, 22H), 0.80 (t, J = 6.4 Hz, 3H).
화합물 55: 2-(13-메틸-7-옥틸-3,9-디옥소-2,8-디옥사-10,13-디아자펜타데실)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00238
화합물 55는 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 53a 및 중간체 55d로부터 58% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 8H), 4.73 (s, 1H), 4.12 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 3.32 (s, 2H), 2.81 - 2.73 (m, 4H), 2.49 (d, J = 45.9 Hz, 4H), 2.43 - 2.22 (m, 10H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.75 - 1.42 (m, 13H), 1.42 - 1.21 (m, 40H), 1.11 (s, 3H), 0.95 - 0.82 (m, 9H). MS: 972.8 m/z [M+H].
실시예 56 - 화합물 56
중간체 56a: 9-(데실옥시)-9-옥소노난산
Figure pct00239
THF (300-900 mL) 중 노난디오산 (90 g, 1.0 당량)의 혼합물에 DMF (0.1 내지 0.2 당량) 및 (COCl)2 (1.0 당량)을 0℃에서 적가했다. 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징한 다음 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 데칸-1-올 (1.0 당량)을 0℃에서 반응 혼합물에 적가하고 N2 분위기 하에 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매를 제거하고 생성된 용액을 물에 붓고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척한 다음 Na2SO4로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하였다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 백색 고체 (20 g, 6%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.62 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 1.41 - 1.15 (m, 19H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 56b: 9,9'-디데실 O'1,O1-(2-옥소프로판-1,3-디일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00240
DCM (100 내지 200 mL) 중 1,3-디하이드록시프로판-2-온 (1.37 g, 0.5 당량), EDCI (1.0 당량) 및 DMAP (1.0 당량)의 혼합물에 중간체 56a (1.0 당량)를 0℃에서 분할하여 첨가하고 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매를 제거하고 생성된 용액을 물에 붓고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척한 다음 Na2SO4로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하였다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 백색 고체 (10 g, 46%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.74 (d, J = 2.1 Hz, 4H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.62 (d, J = 8.8 Hz, 12H), 1.39 - 1.19 (m, 39H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 6H).
중간체 56c: 9,9'-디데실 O'1,O1-(2-하이드록시프로판-1,3-디일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00241
THF/톨루엔/물 (4:1:2, 0.4 M) 중 중간체 56b (13.4 g, 1.0 당량)의 용액에 N2하에 0℃에서 NaBH4 (1.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2하에 15 내지 20℃에서 5시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 물로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척한 다음 Na2SO4로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하였다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 백색 고체 (5.1 g, 38%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.15 - 4.03 (m, 5H), 3.98 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.44 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 2.25 (dt, J = 24.2, 7.5 Hz, 8H), 1.55 (q, J = 7.1 Hz, 12H), 1.22 (d, J = 22.7 Hz, 38H), 0.81 (t, J = 6.7 Hz, 6H).
화합물 56: 9,9'-디데실 O'1,O1-(2-((3-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00242
화합물 56은 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 52d 및 중간체 56c로부터 36% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.24 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.13 - 5.04 (m, 1H), 4.28 (ddd, J = 14.5, 11.9, 4.5 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 8.3, 5.8 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.31 (s, 2H), 2.58 (qd, J = 15.3, 6.4 Hz, 6H), 2.30 (dt, J = 10.3, 7.6 Hz, 10H), 1.61 (dd, J = 10.1, 4.1 Hz, 16H), 1.29 (dt, J = 17.6, 3.3 Hz, 54H), 0.88 (td, J = 6.9, 1.9 Hz, 9H). MS: 1027.2 m/z [M+H].
실시예 57 - 화합물 57
화합물 57: 9,9'-디데실 O'1,O1-(2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일) 디(노난디오에이트)
Figure pct00243
화합물 57은 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 54d 및 중간체 56c로부터 55% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.28 - 5.21 (m, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.8, 4.4, 1.2 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.9, 4.6 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.29 (s, 2H), 2.38 (ddd, J = 8.6, 6.9, 2.7 Hz, 5H), 2.35 - 2.12 (m, 10H), 1.98 - 1.73 (m, 3H), 1.68 - 1.37 (m, 17H), 1.29 (dt, J = 19.5, 4.1 Hz, 54H), 0.88 (td, J = 6.9, 1.9 Hz, 9H). MS: 1040.8 m/z [M+H].
실시예 58 - 화합물 58
화합물 58: 9,9'-디데실 O'1,O1-(2-((5-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)트리데카노일)옥시)프로판-1,3-디일) 디(노난디오에이트))
Figure pct00244
화합물 58은 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 55d 및 중간체 56c로부터 60% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.27 - 5.20 (m, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.4, 2.8 Hz, 2H), 4.13 (ddd, J = 11.9, 5.9, 2.6 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 3.31 (s, 2H), 2.39 - 2.09 (m, 12H), 1.62 (dq, J = 13.8, 7.2, 6.5 Hz, 22H), 1.41 - 0.99 (m, 54H), 0.88 (td, J = 6.9, 2.0 Hz, 9H). MS: 1055.0 m/z [M+H].
실시예 59 - 화합물 59
중간체 59a: 9-옥소-9-(운데실옥시)노난산
Figure pct00245
중간체 59a는 중간체 56a에 채용된 방법을 사용하여 노난디오산 및 운데칸-1-올로부터 41% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.31 (dt, J = 22.6, 7.5 Hz, 4H), 1.62 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 1.40 - 1.18 (m, 23H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 59b: O'1,O1-(2-옥소프로판-1,3-디일) 9,9'-디운데실 디(노난디오에이트)
Figure pct00246
중간체 59b는 중간체 56b에 채용된 방법을 사용하여 1,3-디하이드록시프로판-2-온 및 중간체 59a로부터 23% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.98 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.57 (dt, J = 18.6, 6.9 Hz, 6H), 1.36 - 1.12 (m, 23H), 0.89 - 0.76 (m, 3H).
중간체 59c: O'1,O1-(2-하이드록시프로판-1,3-디일) 9,9'-디운데실 디(노난디오에이트)
Figure pct00247
중간체 59c는 중간체 56c에 채용된 방법을 사용하여 중간체 59b로부터 47% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.23 - 4.00 (m, 9H), 2.52 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 2.31 (dt, J = 24.2, 7.5 Hz, 8H), 1.62 (q, J = 7.0 Hz, 13H), 1.29 (d, J = 23.9 Hz, 43H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H).
화합물 59: O'1,O1-(2-((3-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일) 9,9'-디운데실 디(노난디오에이트)
Figure pct00248
화합물 59는 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 52d 및 중간체 59c로부터 35% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.23 (s, 1H), 5.08 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.28 (ddd, J = 15.0, 11.9, 4.5 Hz, 2H), 4.14 (dt, J = 13.1, 6.7 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.58 (qd, J = 15.4, 6.6 Hz, 4H), 2.30 (dt, J = 10.4, 7.5 Hz, 10H), 1.60 (q, J = 7.7, 6.9 Hz, 20H), 1.43 - 0.97 (m, 58H), 0.88 (td, J = 6.9, 1.9 Hz, 9H). MS: 1054.9 m/z [M+H].
실시예 60 - 화합물 60
화합물 60: O'1,O1-(2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일) 9,9'-디운데실 디(노난디오에이트)
Figure pct00249
화합물 60은 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 54d 및 중간체 59c로부터 79% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.25 (p, J = 5.1 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.5, 2.7 Hz, 2H), 4.15 (dt, J = 11.7, 5.6 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 5H), 2.35 - 2.11 (m, 10H), 1.98 - 1.41 (m, 23H), 1.41 - 0.96 (m, 57H), 0.88 (td, J = 6.9, 1.8 Hz, 9H). MS: 1068.9 m/z [M+H].
실시예 61 - 화합물 61
화합물 61: O'1,O1-(2-((5-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)트리데카노일)옥시)프로판-1,3-디일) 9,9'-디운데실 디(노난디오에이트)
Figure pct00250
화합물 61은 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 55d 및 중간체 59c로부터 61% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.29 - 5.20 (m, 1H), 4.72 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.4, 2.3 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.9, 2.0 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.82 - 2.13 (m, 15H), 1.82 - 1.39 (m, 21H), 1.39 - 0.97 (m, 56H), 0.88 (td, J = 6.9, 1.9 Hz, 9H). MS: 1083.0 m/z [M+H].
실시예 62 - 화합물 62
중간체 62a: 1-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-3-하이드록시프로판-2-온
Figure pct00251
THF (40 mL) 중 1,3-디하이드록시프로판-2-온 (50 g, 1.0 당량), 이미다졸 (37.79 g, 1.0 당량)의 혼합물에 TBSCl (83.66 g, 1.0 당량)을 0℃에서 첨가하고, 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 감압 농축하여 잔류물을 얻었고,이를 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hex)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (15 g, 13%)로 얻었다.
중간체 62b: 1-(3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-2-옥소프로필) 9-운데실 노난디오에이트
Figure pct00252
DCM (300 mL) 중 중간체 62a (10 g, 1.0 당량), EDCI (9.38 g, 1.0 당량), 및 DMAP (5.98 g, 1.0 당량)의 혼합물에 중간체 59a (16.76 g, 1.0 당량)을 0℃에서 첨가하고, 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DCM을 제거하고 생성된 잔류물을 물로 희석하였다. 조 물질을 EtOAc로 3회 추출하고, 합한 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (11 g, 43%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.84 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 3.95 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.18 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.61 - 1.48 (m, 6H), 1.30 - 1.12 (m, 22H), 0.82 (s, 9H), 0.78 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
중간체 62c: 1-(3-하이드록시-2-옥소프로필) 9-운데실 노난디오에이트
Figure pct00253
THF (50 mL) 중 중간체 62b (11 g, 1.0 당량)의 혼합물에 HF·피리딘 (3.75 mL, 8.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 5시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 물로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 생성물을 백색 고체 (6 g, 70%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.70 (s, 2H), 4.30 (s, 2H), 3.98 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.95 (s, 1H), 2.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.57 (dt, J = 20.3, 7.1 Hz, 6H), 1.37 - 1.10 (m, 22H), 0.81 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 62d: 1-(3-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일)옥시)-2-옥소프로필) 9-운데실 노난디오에이트
Figure pct00254
DCM (100 mL) 중 중간체(Intermeidate) 62c (6 g, 1.0 당량)의 용액에 EDCI (1.0 당량), DMAP (1.0 당량)을 0℃에서 첨가하였다. 용액을 탈기하고 N2로 3회 퍼징한 다음 리놀레산 (4 mL, 1.0 당량)을 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DCM을 제거하고 생성된 잔류물을 물로 희석하였다. 조 물질을 EtOAc로 3회 추출하고, 합한 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 무색 오일 (7.5 g, 55%)로서 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.70 (s, 2H), 4.30 (s, 2H), 3.98 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.95 (s, 1H), 2.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.57 (dt, J = 20.3, 7.1 Hz, 6H), 1.37 - 1.10 (m, 22H), 0.81 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 62e: 1-(2-하이드록시-3-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일)옥시)프로필) 9-운데실 노난디오에이트
Figure pct00255
THF/톨루엔/물 (4:1:2, 0.04 M) 중 중간체 62d (7 g, 1.0 당량)의 용액에 NaBH4 (5 당량)을 0℃에서 첨가하고 혼합물을 20℃에서 N2 분위기에서 5시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 포화 NH4Cl을 사용하여 5℃에서 켄칭시키고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 2회 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 잔류물을 얻었다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hex)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (6 g, 85%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.25 (m, 4H), 4.25 - 3.90 (m, 8H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.55 (s, 1H), 2.30 (dt, J = 24.5, 7.6 Hz, 6H), 2.03 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.61 (q, J = 7.0 Hz, 8H), 1.48 - 1.06 (m, 35H), 0.87 (td, J = 6.8, 3.8 Hz, 6H).
화합물 62: 1-(3-메틸-13-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일)옥시)메틸)-9-옥틸-7,11-디옥소-8,12-디옥사-3,6-디아자테트라데칸-14-일) 9-운데실 노난디오에이트
Figure pct00256
화합물 62는 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 52d 및 중간체 62e로부터 36% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.47 - 5.28 (m, 4H), 5.23 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.14 - 5.04 (m, 1H), 4.28 (ddd, J = 15.3, 11.9, 4.6 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.8, 7.5, 5.8 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.38 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.58 (qd, J = 15.2, 6.3 Hz, 5H), 2.37 - 2.22 (m, 7H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 4H), 1.62 (d, J = 6.8 Hz, 14H), 1.48 - 0.97 (m, 50H), 0.97 - 0.79 (m, 9H). MS: 992.3 m/z [M+H].
실시예 63 - 화합물 63
화합물 63: 1-(3-메틸-14-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일)옥시)메틸)-9-옥틸-7,12-디옥소-8,13-디옥사-3,6-디아자펜타데칸-15-일) 9-운데실 노난디오에이트
Figure pct00257
화합물 63은 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 54d 및 중간체 62e로부터 79% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.28 (m, 4H), 5.25 (ddd, J = 5.8, 4.5, 1.4 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 4.2 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.70 - 2.12 (m, 15H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.97 - 1.72 (m, 3H), 1.61 (h, J = 6.5 Hz, 12H), 1.40 - 1.19 (m, 47H), 1.11 (s, 3H), 0.96 - 0.81 (m, 9H). MS: 1006.9 m/z [M+H].
실시예 64 - 화합물 64
화합물 64: 1-(3-메틸-15-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일)옥시)메틸)-9-옥틸-7,13-디옥소-8,14-디옥사-3,6-디아자헥사데칸-16-일) 9-운데실 노난디오에이트
Figure pct00258
화합물 64는 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 55d 및 중간체 62e로부터 79% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.48 - 5.28 (m, 4H), 5.24 (h, J = 4.9, 4.4 Hz, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.29 (ddd, J = 11.9, 4.4, 3.3 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.9, 3.1 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.67 - 2.11 (m, 14H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.73 - 1.41 (m, 17H), 1.41 - 0.95 (m, 50H), 0.94 - 0.82 (m, 9H). MS: 1021.0 m/z [M+H].
실시예 65 - 화합물 65
화합물 65: 2-((4-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)테트라데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00259
화합물 65는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 39d 및 1-(1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 75% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.28 (m, 8H), 5.25 (ddd, J = 10.2, 5.7, 4.4 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.20 - 4.11 (m, 2H), 3.45 (s, 1H), 3.21 (s, 2H), 2.82 - 2.74 (m, 4H), 2.46 - 2.24 (m, 9H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 2.01 - 1.42 (m, 16H), 1.41 - 1.20 (m, 45H), 0.88 (td, J = 7.0, 4.7 Hz, 9H). MS: 984.9 m/z [M+H].
실시예 66 - 화합물 66
화합물 66: 2-((4-(((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)테트라데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00260
화합물 66은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 39d 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 65% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.57 - 5.21 (m, 9H), 4.72 (dt, J = 12.2, 5.2 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.24 - 4.07 (m, 4H), 2.82 - 2.74 (m, 4H), 2.60 (d, J = 102.7 Hz, 5H), 2.45 - 2.38 (m, 2H), 2.38 - 2.26 (m, 4H), 2.13 - 1.73 (m, 16H), 1.73 - 1.43 (m, 9H), 1.41 - 1.16 (m, 42H), 1.04 - 0.74 (m, 9H). MS: 999.4 m/z [M+H].
실시예 67 - 화합물 67
화합물 67: 2-((4-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00261
화합물 67은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 42d 및 1-(1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 50% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.08 (m, 9H), 4.77 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.8, 4.5, 1.8 Hz, 2H), 4.20 - 4.12 (m, 2H), 3.48 (s, 1H), 3.33 (s, 2H), 2.77 (td, J = 6.1, 1.2 Hz, 4H), 2.63 - 2.23 (m, 11H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 9H), 1.98 - 1.42 (m, 14H), 1.42 - 1.22 (m, 32H), 0.96 - 0.81 (m, 9H). MS: 900.0 m/z [M+H].
실시예 68 - 화합물 68
화합물 68: 2-((4-(((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00262
화합물 68은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 42d 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 43% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.04 (m, 9H), 4.72 (tt, J = 7.4, 5.1 Hz, 1H), 4.40 - 4.10 (m, 6H), 2.81 - 2.74 (m, 4H), 2.54 (d, J = 58.1 Hz, 5H), 2.40 (ddd, J = 8.4, 6.8, 4.4 Hz, 2H), 2.36 - 2.27 (m, 4H), 2.11 - 1.73 (m, 16H), 1.73 - 1.43 (m, 8H), 1.43 - 1.21 (m, 31H), 0.99 - 0.77 (m, 9H). MS: 915.7 m/z [M+H].
실시예 69 - 화합물 69
중간체 69a: 4-옥소노난산
Figure pct00263
3:1 EtOH/H2O (500 mL) 중 5-펜틸테트라하이드로푸란-2-온 (50 g, 1.0 당량)의 혼합물에 NaOH (2.0 당량)을 N2하에 15℃에서 한 번에 첨가했다. 혼합물을 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 감압 농축하고 생성된 잔류물을 DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축하여 조 잔류물을 얻었다.
이어서 조 잔류물을 DCM (1 L)에서 재구성한 다음, N2하에 15℃에서 한 번에 DMP (3 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응을 감압하에 농축하고 용액을 1 M HCl로 pH = 3으로 조정하였다. 슬러리를 여과하고 H2O로 세척하였다. 생성된 필터 케이크를 EtOAc에 용해시키고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 생성물을 백색 고체 (22 g, 45%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.72 (dd, J = 7.0, 5.4 Hz, 2H), 2.63 (ddd, J = 7.2, 5.9, 1.2 Hz, 2H), 2.44 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.64 - 1.54 (m, 2H), 1.36 - 1.20 (m, 4H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H).
중간체 69b: 2-((4-옥소노나노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00264
중간체 69b는 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 69a 및 중간체 1c로부터 74% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.16 (m, 9H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.14 (dt, J = 11.8, 6.0 Hz, 2H), 2.74 (dt, J = 21.5, 6.5 Hz, 6H), 2.59 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (dd, J = 8.6, 5.3 Hz, 8H), 1.60 (ddd, J = 14.2, 8.4, 4.8 Hz, 6H), 1.50 - 1.06 (m, 32H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 9H).
중간체 69c: 2-((4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)노나노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00265
THF (300 mL), 톨루엔 (150 mL) 및 H2O (75 mL) 중 중간체 69b (10 g, 1.0 당량)의 용액에 NaBH4 (5.0 당량)를 5℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 3시간 동안 15℃에서 교반하였다. 완료 후 Na2SO4를 0℃에서 반응 혼합물에 첨가하고 생성된 혼합물을 여과하고 감압 하에서 농축하였다. 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 알코올 중간체를 얻었다.
중간체를 즉시 DCM (80 mL)에서 재구성한 후 0℃에서 피리딘 (1.67 당량) 및 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 0℃에서 5시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 감압 농축하여 잔류물을 수득하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (4.05 g, 33%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.26 - 8.19 (m, 2H), 7.40 - 7.28 (m, 2H), 5.43 - 5.11 (m, 9H), 4.80 (tt, J = 7.5, 4.4 Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.09 (dd, J = 11.9, 5.8 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.33 - 2.16 (m, 4H), 1.97 (q, J = 6.8 Hz, 10H), 1.67 (ddt, J = 13.4, 9.9, 4.7 Hz, 1H), 1.55 (dtd, J = 15.7, 8.4, 7.4, 4.8 Hz, 5H), 1.43 - 1.16 (m, 36H), 0.83 (q, J = 6.8 Hz, 9H).
화합물 69: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)노나노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00266
화합물 69는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 69c 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 77% 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.35 (pt, J = 8.8, 4.4 Hz, 8H), 5.25 (p, J = 5.1 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 12.3, 6.7 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.5 Hz, 2H), 4.15 (dh, J = 11.4, 5.9 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.62 - 2.45 (m, 4H), 2.38 (dt, J = 9.0, 6.2 Hz, 2H), 2.30 (q, J = 13.0, 10.4 Hz, 8H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 9H), 1.91 (tt, J = 9.5, 4.5 Hz, 1H), 1.81 (dt, J = 14.7, 7.8 Hz, 1H), 1.65 - 1.43 (m, 7H), 1.40 - 1.17 (m, 36H), 1.09 (q, J = 8.8, 8.2 Hz, 3H), 0.88 (q, J = 6.5 Hz, 9H). MS: 902.6 m/z [M+H].
실시예 70 - 화합물 70
화합물 70: 2-((4-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)노나노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00267
화합물 70은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 69c 및 1-(1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 62% 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.29 (m, 8H), 5.25 (p, J = 5.2 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.5 Hz, 2H), 4.15 (dq, J = 11.7, 5.8 Hz, 2H), 3.46 (d, J = 25.9 Hz, 1H), 3.19 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.34 (dt, J = 31.1, 8.3 Hz, 12H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 8H), 1.99 - 1.42 (m, 16H), 1.42 - 1.19 (m, 35H), 0.88 (q, J = 6.8 Hz, 9H). MS: 914.4 m/z [M+H].
실시예 71 - 화합물 71
화합물 71: 2-((4-(((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)노나노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00268
화합물 71은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 69c 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 78% 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) δ 5.50 - 5.28 (m, 8H), 5.25 (p, J = 5.1 Hz, 1H), 4.72 (tt, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 4.36 - 4.26 (m, 2H), 4.23 - 4.11 (m, 4H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 2.41 (dt, J = 15.0, 9.0 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.5 Hz, 5H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 2.00 - 1.75 (m, 9H), 1.72 - 1.48 (m, 8H), 1.43 - 1.20 (m, 35H), 1.00 - 0.75 (m, 9H). MS: 929.4 m/z [M+H].
실시예 72 - 화합물 72
화합물 72: 2-((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)노나노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00269
화합물 72는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 69c 및 2-(피롤리딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 72% 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.49 (s, 1H), 5.34 (dtt, J = 18.0, 6.9, 3.9 Hz, 8H), 5.25 (p, J = 5.1 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (dt, J = 11.6, 5.4 Hz, 2H), 3.40 - 3.27 (m, 2H), 2.80 - 2.50 (m, 11H), 2.45 - 2.35 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 5H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 9H), 1.97 - 1.67 (m, 8H), 1.60 (q, J = 7.3 Hz, 8H), 1.33 (d, J = 26.5 Hz, 36H), 0.88 (q, J = 6.5 Hz, 9H). MS: 914.7 m/z [M+H].
실시예 73 - 화합물 73
중간체 73a: 4-옥소운데칸산
Figure pct00270
2:1 EtOH/H2O (400 mL) 중 5-헵틸테트라하이드로푸란-2-온 (20 g, 1.0 당량)의 용액에 NaOH (1.1 당량)를 첨가했다. 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징한 다음 혼합물을 N2 분위기 하에서 12시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하여 용매를 제거하고 pH = 3이 될 때까지 생성된 잔류물에 1 N HCl을 첨가하였다. 생성된 슬러리를 여과하고 여과된 케이크를 감압 하에서 농축하여 잔류물을 얻었다.
생성된 잔류물을 DCM (200 mL)에서 재구성한 다음 DMP (3 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 5시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 감압하에 농축하고 생성된 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체 (10 g, 46%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.65 (dd, J = 7.0, 5.3 Hz, 2H), 2.56 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.51 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.27 - 1.13 (m, 8H), 0.86 - 0.76 (m, 3H).
중간체 73b: 2-((4-옥소운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00271
중간체 73b는 중간체 73a 및 중간체 1c로부터 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 42% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.28 (dddd, J = 12.3, 10.7, 8.7, 5.5 Hz, 8H), 5.21 - 5.15 (m, 1H), 4.22 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.13 - 4.05 (m, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.52 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.02 - 1.95 (m, 8H), 1.53 (h, J = 7.0 Hz, 6H), 1.33 - 1.16 (m, 37H), 0.81 (td, J = 6.8, 4.7 Hz, 9H).
중간체 73c: 2-((4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00272
THF (500 mL), 톨루엔 (125 mL), 및 H2O (250 mL) 중 중간체 73b (25 g, 1.0 당량)의 용액에 N2하에 0℃에서 NaBH4 (5.0 당량)를 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 5℃에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 후 잔류물을 포화 NH4Cl 용액에 붓고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 잔류물로서 중간체 알코올을 얻었다.
중간체를 즉시 DCM (100 mL)에서 재구성한 후 0℃에서 피리딘 (2 당량) 및 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 5시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 헥산으로 희석하고 여과하였다. 여액을 물로 3회 및 염수로 1회 세척한 후 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (5.2 g, 40%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.28 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.41 (dd, J = 8.6, 6.1 Hz, 2H), 5.33 (tdd, J = 23.5, 11.3, 6.1 Hz, 9H), 4.87 (tt, J = 7.7, 4.6 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 12.0, 4.4 Hz, 2H), 4.16 (dd, J = 12.0, 5.8 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.47 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.39 - 2.25 (m, 4H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 10H), 1.79 - 1.55 (m, 7H), 1.48 - 1.15 (m, 36H), 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 9H).
화합물 73: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00273
화합물 73은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 73c 및 (2-아미노에틸)(에틸)메틸아민으로부터 53% 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.47 - 5.27 (m, 8H), 5.24 (q, J = 5.1 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (dt, J = 11.6, 5.4 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 2.61 - 2.35 (m, 6H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 7H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 8H), 1.90 (q, J = 11.5, 9.0 Hz, 1H), 1.81 (dt, J = 14.5, 7.6 Hz, 1H), 1.65 - 1.41 (m, 9H), 1.39 - 1.19 (m, 38H), 1.10 (s, 3H), 0.88 (q, J = 7.0 Hz, 9H). MS: 930.3 m/z [M+H].
실시예 74 - 화합물 74
화합물 74: 2-((4-((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00274
화합물 74는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 73c 및 1-(1-메틸피롤리딘-2-일)메탄아민으로부터 55% 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.34 (dtt, J = 18.0, 6.9, 3.8 Hz, 8H), 5.25 (p, J = 5.2 Hz, 1H), 4.81 - 4.72 (m, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (dt, J = 11.7, 5.2 Hz, 2H), 3.43 (s, 1H), 3.17 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.34 (dt, J = 31.2, 8.3 Hz, 11H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 8H), 1.99 - 1.43 (m, 16H), 1.43 - 1.13 (m, 39H), 0.88 (q, J = 7.7, 7.2 Hz, 9H). MS: 942.8 m/z [M+H].
실시예 75 - 화합물 75
화합물 75: 2-((4-(((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00275
화합물 75는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 73c 및 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올로부터 73% 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.28 (m, 8H), 5.25 (p, J = 5.1 Hz, 1H), 4.72 (tt, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.22 - 4.11 (m, 4H), 2.77 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.45 - 2.37 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 8H), 2.01 - 1.91 (m, 3H), 1.91 - 1.78 (m, 5H), 1.67 - 1.50 (m, 9H), 1.39 - 1.22 (m, 39H), 0.88 (q, J = 6.6 Hz, 9H). MS: 957.4 m/z [M+H].
실시예 76 - 화합물 76
화합물 76: 2-((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00276
화합물 76은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 73c 및 2-(피롤리딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 81% 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.56 (s, 1H), 5.46 - 5.28 (m, 8H), 5.25 (p, J = 5.2 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (dt, J = 11.7, 5.5 Hz, 2H), 3.43 - 3.31 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 11H), 2.45 - 2.35 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 8H), 1.97 - 1.74 (m, 7H), 1.69 - 1.43 (m, 8H), 1.43 - 1.09 (m, 39H), 0.88 (q, J = 7.0 Hz, 9H). MS: 943.2 m/z [M+H].
실시예 77 - 화합물 77
화합물 77: 2-((4-(((2-(아제티딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00277
화합물 77은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 2-(아제티딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 36% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.29 (m, 8H), 5.25 (h, J = 4.6, 4.1 Hz, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.5, 1.9 Hz, 2H), 4.15 (ddt, J = 11.9, 5.8, 3.6 Hz, 2H), 3.74 - 3.54 (m, 3H), 3.48 - 3.38 (m, 1H), 3.31 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 2.86 (s, 1H), 2.81 - 2.73 (m, 4H), 2.41 - 2.26 (m, 7H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.97 - 1.87 (m, 2H), 1.87 - 1.77 (m, 2H), 1.60 (d, J = 7.2 Hz, 8H), 1.44 - 1.15 (m, 37H), 0.96 - 0.84 (m, 9H). MS: 914.7 m/z [M+H].
실시예 78 - 화합물 78
화합물 78: 2-((4-(((2-(피페리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00278
화합물 78은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 2-(피페리딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 60% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.47 - 5.28 (m, 8H), 5.25 (h, J = 4.8 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.4, 1.3 Hz, 2H), 4.15 (dt, J = 11.8, 5.7 Hz, 2H), 3.42 (s, 2H), 2.80 - 2.72 (m, 4H), 2.44 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 2.39 (ddd, J = 8.6, 6.9, 2.5 Hz, 2H), 2.36 - 2.27 (m, 5H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.95 - 1.41 (m, 18H), 1.41 - 1.20 (m, 37H), 0.96 - 0.81 (m, 9H). MS: 942.4 m/z [M+H].
실시예 79 - 화합물 79
화합물 79: 2-((4-(((2-메틸-1-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00279
화합물 79는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 2-메틸-1-(피롤리딘-1-일)프로판-2-아민으로부터 48% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.21 (m, 9H), 4.72 (s, 1H), 4.28 (ddt, J = 11.9, 4.4, 2.2 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 4.6 Hz, 2H), 2.86 - 2.49 (m, 8H), 2.39 (td, J = 8.2, 7.4, 2.2 Hz, 1H), 2.31 (td, J = 7.6, 1.8 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 2.00 - 1.45 (m, 17H), 1.45 - 1.03 (m, 41H), 0.98 - 0.77 (m, 9H). MS: 956.5 m/z [M+H].
실시예 80 - 화합물 80
중간체 80a: (5-메틸헥실)마그네슘 브로마이드
Figure pct00280
THF (100 mL) 중 Mg (1.63 g, 1.2 당량) 및 I2 (0.1 당량)의 용액에 1-브로모-5-메틸-헥산 (1.0 당량)를 15℃에서 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 2시간 동안 40℃에서 교반하였다. 추가 작업은 하지 않았다. 반응 혼합물은 다음 단계에서 그대로 사용하였다. THF 중의 브로모(5-메틸헥실)마그네슘을 회색 용액으로 얻었다.
중간체 80b: 에틸 9-메틸-4-옥소데카노에이트
Figure pct00281
THF (150 mL) 중 에틸 4-클로로-4-옥소-부타노에이트 (16 g, 1.0 당량)의 용액에 CuI (1.0 당량) 및 중간체 80a (2.0 당량)를 -78℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 -78℃에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 물로 켄칭하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 2회 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 생성물 (10 g, 45% 수율)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.06 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.64 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.50 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.55 - 1.45 (m, 3H), 1.28 - 1.15 (m, 6H), 1.15 - 1.06 (m, 2H), 0.79 (d, J = 6.6 Hz, 6H).
중간체 80c: 9-메틸-4-옥소데칸산
Figure pct00282
EtOH (100 mL) 중 중간체 80b (10 g, 1.0 당량)의 용액에 20℃에서 KOH (3.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 50℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서 반응을 농축하여 EtOH를 제거하고 HCl (1 M)을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 생성된 혼합물을 물로 희석하고 EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 2회 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물 (4.4 g, 50%)을 백색 고체로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.71 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.63 (ddd, J = 7.0, 5.8, 1.1 Hz, 2H), 2.44 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.53 (dq, J = 19.8, 7.0, 6.6 Hz, 3H), 1.31 - 1.24 (m, 2H), 1.16 (dt, J = 8.6, 6.7 Hz, 2H), 0.85 (d, J = 6.6 Hz, 6H).
중간체 80d: 2-((9-메틸-4-옥소데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00283
중간체 80d는 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 80c 및 중간체 1c로부터 40% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.28 (m, 8H), 5.24 (p, J = 5.1 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.71 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.67 - 1.50 (m, 8H), 1.39 - 1.21 (m, 29H), 1.22 - 1.12 (m, 3H), 0.93 - 0.82 (m, 12H).
중간체 80e: 2-((9-메틸-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00284
THF (30 mL), 톨루엔 (15 mL) 및 H2O (7.5 mL) 중 중간체 80d (1.5 g, 1.0 당량)의 NaBH4 (5.0 당량)를 용액에 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 5℃에서 5시간 동안 교반하였다. 환원이 완료되면 반응 혼합물을 THF와 H2O 사이에 분배하고 생성된 유기상을 분리하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 중간체 알코올이 황색 오일을 얻었다.
생성된 중간체를 즉시 DCM (10 mL)에서 재구성한 후 0℃에서 피리딘 (2.0 당량) 및 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (2.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축하여 조 잔류물을 수득하고 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.25 - 8.18 (m, 2H), 7.38 - 7.28 (m, 2H), 5.39 - 5.15 (m, 9H), 4.80 (tt, J = 7.1, 4.3 Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 12.0, 4.3 Hz, 2H), 4.13 - 4.04 (m, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.40 (dd, J = 8.3, 6.6 Hz, 2H), 2.33 - 2.19 (m, 4H), 2.05 - 1.85 (m, 10H), 1.67 (ddt, J = 14.6, 9.4, 4.8 Hz, 1H), 1.52 (dddq, J = 32.6, 26.2, 13.2, 6.6, 6.1 Hz, 8H), 1.37 - 1.17 (m, 30H), 1.11 (dt, J = 9.0, 6.5 Hz, 2H), 0.94 - 0.66 (m, 12H).
화합물 80: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)-9-메틸데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00285
화합물 80은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 80e 및 (2-아미노에틸)(에틸)메틸아민으로부터 68% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.22 (m, 9H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 12.0, 4.5, 1.5 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 4.7 Hz, 2H), 3.37 (s, 3H), 2.77 (td, J = 6.0, 1.3 Hz, 4H), 2.39 (ddd, J = 8.4, 6.9, 2.4 Hz, 2H), 2.35 - 2.28 (m, 5H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.86 (ddt, J = 37.3, 14.4, 7.1 Hz, 3H), 1.77 - 1.38 (m, 12H), 1.39 - 1.19 (m, 34H), 1.15 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.94 - 0.79 (m, 12H). MS: 929.9 m/z [M+H].
실시예 81 - 화합물 81
중간체 81a: 1-브로모-6-메틸헵탄
Figure pct00286
DCM (300 mL) 중 PPh3 (66.97 g, 1.33 당량)의 용액에 Br2 (1.33 당량) 을 0℃에서 첨가했다. 그 다음, 6-메틸헵탄-1-올 (1.0 당량)을 한 번에 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 H2O로 희석하고 유기상을 분리하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 잔류물을 얻었다. 펜탄을 첨가하고 침전된 트리페닐포스핀 옥사이드를 여과하였다. 유기상을 감압 농축하여 잔류물을 얻었고, 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (30 g, 81%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.41 (td, J = 6.9, 1.1 Hz, 2H), 1.91 - 1.79 (m, 2H), 1.59 - 1.49 (m, 1H), 1.45 - 1.35 (m, 2H), 1.34 - 1.25 (m, 3H), 1.21 - 1.12 (m, 2H), 0.86 (dd, J = 6.6, 1.1 Hz, 6H).
중간체 81b: (6-메틸헵틸)마그네슘 브로마이드
Figure pct00287
THF (300 mL) 중 Mg (4.53 g, 1.2 당량) 및 I2 (0.1 당량)의 용액에 중간체 81a (1.0 당량)를 15℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 2시간 동안 40℃에서 교반하였다. 추가 작업을 하지 않았다. 반응 혼합물은 다음 단계에서 그대로 사용되었다. THF 중 브로모 (6-메틸헵틸) 마그네슘을 회색 용액으로 얻었다.
중간체 81c: 에틸 10-메틸-4-옥소운데카노에이트
Figure pct00288
THF (200 mL) 중 에틸 4-클로로-4-옥소-부타노에이트 (25 g, 1.0 당량) 및 CuI (1.0 당량)의 용액에 중간체 81b (1.0 당량)를 -78℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 -78℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 물로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 분리하고, 염수로 2회 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (10 g, 27%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.06 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.64 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.50 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.51 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.43 (dq, J = 13.2, 6.6 Hz, 1H), 1.26 - 1.15 (m, 7H), 1.14 - 1.04 (m, 2H), 0.79 (d, J = 6.6 Hz, 6H).
중간체 81d: 10-메틸-4-옥소운데칸산
Figure pct00289
EtOH (50 mL) 중 중간체 81c (10 g, 1.0 당량) 및 KOH (3.0 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징한 다음 혼합물을 N2 분위기 하에서 12시간 동안 50℃에서 교반하였다. 혼합물을 농축하여 EtOH를 제거한 다음 HCl (1 M)로 pH 5.5로 조정하였다. 이어서 반응 혼합물을 물로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 분리하고, 염수로 2회 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체 (4 g, 45%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.65 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.56 (ddd, J = 7.1, 5.9, 1.2 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.51 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 1.42 (dt, J = 13.2, 6.6 Hz, 1H), 1.20 (tt, J = 4.9, 2.5 Hz, 4H), 1.14 - 1.05 (m, 2H), 0.79 (d, J = 6.6 Hz, 6H).
중간체 81e: 2-((10-메틸-4-옥소운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00290
중간체 81e는 중간체 1d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 81d 및 중간체 1c로부터 40% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.39 - 5.20 (m, 8H), 5.17 (ddd, J = 10.1, 5.8, 4.3 Hz, 1H), 4.21 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.07 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 2.69 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.52 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.24 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.97 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.66 - 1.46 (m, 7H), 1.33 - 1.13 (m, 35H), 1.08 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 0.84 - 0.77 (m, 12H).
중간체 81f: 2-((10-메틸-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00291
THF (120 mL), 톨루엔 (30 mL) 및 H2O (60 mL) 중 중간체 81e (6 g, 1.0 당량)의 용액에 NaBH4 (5.0 당량)를 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 5℃에서 5시간 동안 교반하였다. 환원이 완료되면 반응 혼합물을 THF와 H2O 사이에 분배하고 생성된 유기상을 분리하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 중간체 알코올인 황색 오일을 얻었다.
생성된 중간체를 DCM (10 mL)에서 즉시 재구성한 다음 0℃에서 피리딘 (2.0 당량) 및 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (2.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축하여 조 잔류물을 수득하고 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (4.3 g, 59%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.27 - 8.16 (m, 2H), 7.37 - 7.29 (m, 2H), 5.43 - 5.12 (m, 9H), 4.80 (s, 1H), 4.25 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 - 4.06 (m, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.24 (td, J = 7.5, 4.1 Hz, 4H), 2.05 - 1.88 (m, 9H), 1.71 - 1.62 (m, 1H), 1.62 - 1.47 (m, 6H), 1.45 - 0.97 (m, 35H), 0.89 - 0.66 (m, 12H).
화합물 81: 2-((4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)-10-메틸운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00292
화합물 81은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 81f 및 (2-아미노에틸)(에틸)메틸아민으로부터 85% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.21 (m, 9H), 4.76 (s, 1H), 4.33 - 4.23 (m, 2H), 4.15 (dt, J = 11.8, 5.7 Hz, 2H), 3.38 (d, J = 40.4 Hz, 3H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.38 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.32 (td, J = 7.6, 1.1 Hz, 5H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.96 - 1.78 (m, 3H), 1.68 - 1.43 (m, 12H), 1.43 - 1.20 (m, 36H), 1.14 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.93 - 0.80 (m, 12H). MS: 944.5 m/z [M+H].
실시예 82 - 화합물 82
화합물 82: 2-((9-메틸-4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00293
화합물 82는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 80e 및 2-(피롤리딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 86% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.87 (s, 1H), 5.43 - 5.23 (m, 9H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 12.0, 4.5, 2.6 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 4.6 Hz, 2H), 3.52 - 3.42 (m, 2H), 2.94 (s, 5H), 2.82 - 2.75 (m, 4H), 2.39 (ddd, J = 8.4, 6.9, 2.0 Hz, 2H), 2.36 - 2.29 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 2.01 - 1.76 (m, 7H), 1.67 - 1.45 (m, 8H), 1.40 - 1.21 (m, 33H), 1.15 (s, 2H), 0.93 - 0.81 (m, 12H). MS: 942.3 m/z [M+H].
실시예 83 - 화합물 83
화합물 83: 2-((10-메틸-4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)운데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00294
화합물 83은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 81f 및 2-(피롤리딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 87% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.99 (s, 1H), 5.45 - 5.19 (m, 9H), 4.76 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.5, 3.2 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 4.7 Hz, 2H), 3.50 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 2.99 (s, 5H), 2.81 - 2.73 (m, 4H), 2.39 (ddd, J = 8.2, 6.9, 1.8 Hz, 2H), 2.35 - 2.28 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 2.02 - 1.77 (m, 7H), 1.66 - 1.43 (m, 8H), 1.41 - 1.20 (m, 35H), 1.14 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 0.95 - 0.81 (m, 12H). MS: 956.5 m/z [M+H].
실시예 84 - 화합물 84
화합물 84: 2-((4-(((1-메틸아제티딘-3-일)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00295
화합물 84는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 1-메틸아제티딘-3-아민으로부터 87% 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.28 (m, 8H), 5.23 (p, J = 5.2 Hz, 1H), 4.77 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.46 (s, 1H), 4.28 (dt, J = 10.9, 5.2 Hz, 2H), 4.16 (ddd, J = 8.7, 5.6, 2.8 Hz, 2H), 3.99 (s, 2H), 3.81 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 2.65 (s, 2H), 2.40 - 2.29 (m, 6H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 8H), 1.93 (dtd, J = 15.1, 7.6, 3.8 Hz, 1H), 1.83 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 1.66 - 1.44 (m, 7H), 1.40 - 1.17 (m, 37H), 0.88 (q, J = 7.0 Hz, 9H). MS: 900.4 m/z [M+H].
실시예 85 - 화합물 85
중간체 85a: 벤질 4-하이드록시옥타노에이트
Figure pct00296
H2O (50 mL) 중 5-부틸테트라하이드로푸란-2-온 (20 g, 1.0 당량)의 용액에 NaOH (5.63 g, 1.0 당량)을 첨가했다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 감압 농축하여 H2O를 제거하였다.
생성된 잔류물을 DMF (100 mL)에서 재구성한 다음 BnBr (14.08 g, 1.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DMF를 제거하였다. 잔류물을 H2O (150 mL)로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 여액을 감압 하에서 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (15 g, 43%)로 얻었다.
중간체 85b: 벤질 4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)옥타노에이트
Figure pct00297
DCM (150 mL) 중 중간체 85a (15 g, 1.0 당량)의 혼합물에 N2하에 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (32.21 g, 5.0 당량)를 첨가한 다음, 피리딘 (5.16 mL, 2.0 당량)을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 헥산으로 희석하고 여과하였다. 여액을 H2O로 3회 세척하였다. 유기층을 염수로 1회 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과한 후 여액을 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (12 g, 48%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.31 - 8.17 (m, 2H), 7.42 - 7.30 (m, 6H), 5.13 (s, 2H), 4.87 (qd, J = 7.6, 4.8 Hz, 1H), 2.50 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.11 (dtd, J = 15.3, 7.8, 4.0 Hz, 1H), 2.00 (dt, J = 14.7, 7.6 Hz, 1H), 1.82 - 1.69 (m, 1H), 1.63 (ddt, J = 14.3, 8.5, 5.0 Hz, 1H), 1.45 - 1.27 (m, 4H), 1.01 - 0.83 (m, 3H).
중간체 85c: 벤질 4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)옥타노에이트
Figure pct00298
MeCN (20 mL) 중 중간체 85b (4 g, 2.0 당량) 및 2-피롤리딘-1-일에탄아민 (550 mg, 1.0 당량)의 용액에 DMAP (59 mg, 0.1 당량)에 이어 피리딘 (1.17 mL, 3.0 당량)을 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 MeCN (20 mL)을 제거하였다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (1.8 g, 48%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.32 - 7.23 (m, 5H), 5.03 (d, J = 10.2 Hz, 3H), 4.69 (s, 1H), 3.23 (dq, J = 18.7, 5.9 Hz, 3H), 2.70 (s, 2H), 2.60 - 2.40 (m, 7H), 2.34 (td, J = 8.3, 7.6, 2.7 Hz, 2H), 1.87 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 1.70 (t, J = 3.8 Hz, 6H), 1.44 (d, J = 24.4 Hz, 2H), 1.22 (q, J = 11.9 Hz, 4H), 0.80 (t, J = 4.2 Hz, 3H).
화합물 85: 2-((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00299
THF (9 mL) 중 중간체 85c (1.8 g, 1.0 당량)의 용액에 Ar 분위기 하에서 Pd/C (0.5 g, 10% w/w)를 첨가하였다. 혼합물을 H2로 3회 퍼징한 다음 혼합물을 H2 분위기 (15 Psi) 하에서 5시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 감압하에 농축하여 THF를 제거하였다.
생성된 조 물질을 DCM (10 mL)에 용해시킨 다음 DMAP (65 mg, 0.16 당량), DIPEA (1.74 mL, 3.0 당량) 및 EDCI (638 mg, 1.0 당량)를 첨가하였다. 이어서 중간체 1c (2.05 g, 1.0 당량)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 16시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DCM을 제거하였다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일 (1.1 g, 50%)의 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.39 - 5.21 (m, 7H), 5.18 (p, J = 5.0 Hz, 1H), 5.09 (s, 1H), 4.76 - 4.65 (m, 1H), 4.22 (dd, J = 12.0, 4.4 Hz, 2H), 4.08 (ddd, J = 11.9, 5.9, 3.4 Hz, 2H), 3.21 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.51 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.43 (d, J = 5.8 Hz, 4H), 2.32 (ddd, J = 8.9, 6.6, 3.9 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.9 Hz, 7H), 1.91 - 1.66 (m, 6H), 1.63 - 1.35 (m, 8H), 1.25 (tq, J = 7.2, 4.6, 3.6 Hz, 30H), 0.82 (t, J = 6.7 Hz, 9H). MS: 900.4 m/z [M+H].
실시예 86 - 화합물 86
중간체 86a: 에틸 1-노나노일사이클로프로판-1-카복실레이트
Figure pct00300
THF (200 mL) 중 디에틸 사이클로프로판-1,1-디카복실레이트 (15 g, 1.0 당량)의 용액에 브로모(옥틸)마그네슘 (2 M, 40.28 mL, 1.0 당량)의 용액을 N2하에 -78℃에서 적가했다. 반응 혼합물을 N2 분위기 하에 -78℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 NH4Cl에 부었다. 수성상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피에 의해 다른 배치로 정제하여 무색 오일 (20 g, 48%)의 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.13 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.57 - 1.49 (m, 2H), 1.35 (s, 4H), 1.21 (dd, J = 8.7, 5.5 Hz, 16H), 0.81 (t, J = 6.9 Hz, 6H).
중간체 86b: 1-노나노일사이클로프로판-1-카복실산
Figure pct00301
EtOH (60 mL) 및 H2O (30 mL) 중 중간체 86a (10 g, 1.0 당량)의 용액에 N2하에 NaOH (2.36 g, 1.5 당량) 및 LiOH (1.41 g, 1.5 당량)를 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 2 N HCl을 첨가하여 잔류물을 pH = 3으로 조정하였다. 그 다음 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공에서 농축시켰다. 생성물을 무색 오일 (5 g, 28%)로 수집하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.25 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.96 (q, J = 4.4 Hz, 2H), 1.71 (q, J = 4.4 Hz, 2H), 1.64 - 1.55 (m, 2H), 1.26 (d, J = 3.7 Hz, 11H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
중간체 86c: 2-((1-노나노일사이클로프로판-1-카보닐)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00302
DCM (60 mL) 중 중간체 86b (6 g, 1.0 당량), Int. 1C (16.36 g, 1.0 당량), EDCI (6.10 g, 1.5 당량), 및 DMAP (324 mg, 0.1 당량)의 용액에 0℃에서 Et3N (5.54 mL, 1.5 당량)을 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 그 후 물에 붓고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공에서 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일 (8 g, 37%)의 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.28 (dtt, J = 15.4, 10.8, 5.8 Hz, 8H), 4.26 (dd, J = 12.1, 4.1 Hz, 2H), 4.08 (dd, J = 12.0, 6.1 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.24 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.54 (p, J = 7.0 Hz, 9H), 1.43 - 1.33 (m, 4H), 1.33 - 1.15 (m, 40H), 0.85 - 0.79 (m, 9H).
중간체 86d: 2-((1-(1-하이드록시노닐)사이클로프로판-1-카보닐)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00303
4:2:1 THF/물/톨루엔 (0.05 내지 0.1 M) 중 중간체 86c (8 g, 1.0 당량)의 용액을0 내지 5℃로 냉각시킨 다음 NaBH4 (5.0 당량)를 첨가하였다. 반응을 0 내지 25℃에서 적어도 2시간 동안 유지하였다. 이어서 반응을 물 및 EtOAc로 희석하고, 생성된 2상 혼합물을 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 무색 오일 (4 g, 50%)의 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.33 (tdq, J = 20.3, 10.0, 5.6, 4.9 Hz, 9H), 4.28 (dt, J = 12.0, 4.0 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 12.1, 8.0, 6.0 Hz, 2H), 3.18 - 3.12 (m, 1H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.68 (s, 1H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.68 - 1.48 (m, 9H), 1.40 - 1.16 (m, 43H), 0.98 (ddd, J = 10.7, 6.7, 4.1 Hz, 1H), 0.93 - 0.84 (m, 9H), 0.81 (ddd, J = 9.7, 6.8, 4.2 Hz, 1H).
중간체 86e: 2-((1-(1-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)노닐)사이클로프로판-1-카보닐)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00304
DCM (40 mL) 중 중간체 86d (4 g, 1.0 당량)의 용액에 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (1.95 g, 2.0 당량), 피리딘 (781 uL, 2.0 당량)을 0℃에서 첨가했다. 그 다음 반응 혼합물을 N2 분위기 하에서 5시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 석유 에테르에 재구성하고 여과하였다. 여액을 H2O로 세척하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일의 생성물 (2.8 g, 59%)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.25 - 8.16 (m, 2H), 7.36 - 7.26 (m, 2H), 5.27 (tdd, J = 17.5, 8.5, 4.0 Hz, 9H), 4.84 (dd, J = 9.1, 4.4 Hz, 1H), 4.24 (dt, J = 11.9, 3.8 Hz, 2H), 4.08 (dd, J = 11.8, 5.8 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 2.23 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.02 - 1.93 (m, 8H), 1.82 (qd, J = 9.4, 4.9 Hz, 1H), 1.69 (ddt, J = 14.4, 10.0, 5.1 Hz, 1H), 1.53 (t, J = 7.2 Hz, 5H), 1.35 - 1.16 (m, 41H), 1.07 - 1.01 (m, 1H), 0.95 - 0.89 (m, 1H), 0.81 (td, J = 6.8, 3.8 Hz, 9H).
화합물 86: 2-((1-(1-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)노닐)사이클로프로판-1-카보닐)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00305
화합물 86은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 86e 및 N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민으로부터 90% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.53 - 5.22 (m, 9H), 4.75 (dd, J = 8.7, 4.5 Hz, 1H), 4.29 (ddd, J = 22.5, 11.8, 4.3 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 3.30 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.54 (d, J = 13.7 Hz, 4H), 2.38 - 2.21 (m, 7H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.60 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.40 - 1.17 (m, 40H), 1.12 - 1.00 (m, 4H), 0.91 - 0.85 (m, 9H). MS: 956.1 m/z [M+H].
실시예 87 - 화합물 87
중간체 87a: 5-하이드록시-1-메틸-5-옥틸피롤리딘-2-온
Figure pct00306
THF (150 mL) 중 1-메틸피롤리딘-2,5-디온 (20 g, 1.0 당량)의 용액에 브로모(옥틸)마그네슘 (1 M, 265 mL, 1.5 당량)을 N2 하에서 15℃에서 적가했다. 혼합물을 N2하에 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 NH4Cl을 첨가하여 켄칭시켰다. 그런 다음 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출했다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체 (20 g, 50%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.75 (s, 1H), 2.68 (s, 3H), 2.43 (ddd, J = 16.4, 10.0, 6.4 Hz, 1H), 2.24 (ddd, J = 16.7, 10.0, 4.5 Hz, 1H), 2.13 (ddd, J = 13.6, 10.0, 6.4 Hz, 1H), 1.93 (ddd, J = 14.0, 10.0, 4.7 Hz, 1H), 1.73 (td, J = 13.4, 3.7 Hz, 1H), 1.65 - 1.53 (m, 1H), 1.35 - 1.07 (m, 12H), 0.88 - 0.76 (m, 3H).
중간체 87b: 4-하이드록시-N-메틸도데칸아미드
Figure pct00307
MeOH (150 mL) 중 중간체 87a (15 g, 1.0 당량)의 용액에 NaBH4 (4.99 g, 2.0 당량)를 분할하여 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 NH4Cl을 첨가하여 켄칭시킨 다음 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체 (8 g, 53%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.93 (s, 1H), 3.60 - 3.50 (m, 1H), 3.11 (s, 1H), 2.73 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.36 - 2.20 (m, 2H), 1.78 (dddd, J = 14.3, 7.7, 6.5, 3.1 Hz, 1H), 1.58 (ddt, J = 13.8, 8.9, 6.7 Hz, 1H), 1.46 - 1.09 (m, 14H), 0.87 - 0.77 (m, 3H).
중간체 87c: (R)-4-하이드록시-N-메틸도데칸아미드
Figure pct00308
Et2O (0.2 내지 1 M) 중 중간체 87b (1.0 당량)의 용액에 Novozym 435 (0.89 당량) 및 비닐 아세테이트 (2.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 96시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 잔류물을 얻고 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 컬럼으로부터 수집된 물질을 상기 반응 조건에 추가 3회 적용하여 (R)-88c를 황색 고체 (24% 수율)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.57 (s, 1H), 3.54 (tt, J = 7.7, 3.6 Hz, 1H), 2.74 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.64 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 2.28 (td, J = 6.9, 3.2 Hz, 2H), 1.79 (dtd, J = 14.3, 7.0, 3.1 Hz, 1H), 1.60 (ddd, J = 14.3, 8.8, 6.8 Hz, 2H), 1.47 - 1.12 (m, 14H), 0.87 - 0.74 (m, 3H).
중간체 87d: (R)-5-옥틸디하이드로푸란-2(3H)-온
Figure pct00309
MeOH (0.1 내지 1.0 M) 중 중간체 87d (1.0 당량)의 용액에 NaOH (10 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 적어도 2시간 동안 교반하고, 그 후 HCl (1 내지 2 M, 10.0 당량)을 첨가하고 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.41 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 2.46 (dd, J = 9.5, 6.8 Hz, 2H), 2.25 (dq, J = 13.4, 6.7 Hz, 1H), 1.78 (dq, J = 12.7, 9.3 Hz, 1H), 1.72 - 1.62 (m, 1H), 1.60 - 1.47 (m, 1H), 1.45 - 1.10 (m, 14H), 0.81 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
중간체 87e: (R)-4-하이드록시도데칸산
Figure pct00310
H2O (0.1 내지 0.5 M) 중 중간체 87d (1.0 당량)의 용액에 NaOH (1.0 내지 1.5 당량)을 첨가했다. 혼합물을 20℃에서 적어도 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물은 추가 정제없이 다음 단계에서 그대로 사용되었다.
중간체 88f: 벤질 (R)-4-하이드록시도데카노에이트
Figure pct00311
아세톤 (0.3 M) 중 중간체 87e (1.0 당량)의 용액에 BnBr (1.0 내지 1.5 당량) 및 TBAB (0.05 당량)를 첨가했다. 혼합물을 60℃에서 적어도 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 (1) 컬럼 크로마토그래피로 정제하거나 (2) 포화 NaHCO3로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축한 후 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 두 방법 모두 생성물을 황색 오일 (54% 수율)로 얻었다.
중간체 87g: 벤질 (R)-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)도데카노에이트
Figure pct00312
DCM (0.3 내지 1.2 M) 중 중간체 87f (1.0 당량) 및 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (3.0 당량)의 용액에 0 내지 20℃에서 피리딘 (3.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 적어도 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 (1) 컬럼 크로마토그래피로 정제하거나 (2) 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다. 생성물은 담황색 오일 (36%)로 수집되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 - 8.13 (m, 2H), 7.29 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 5.06 (s, 2H), 4.80 (tt, J = 7.6, 4.5 Hz, 1H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04 (ddt, J = 15.3, 7.8, 3.9 Hz, 1H), 1.92 (dq, J = 14.8, 7.4 Hz, 1H), 1.71 - 1.61 (m, 1H), 1.55 (ddd, J = 14.3, 9.1, 5.2 Hz, 1H), 1.36 - 1.13 (m, 11H), 0.81 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
중간체 87h: 벤질 (R)-4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노에이트
Figure pct00313
MeCN (0.1 내지 0.2 M) 중 중간체 87g (1.0 당량) 및 N'-에틸-N'-메틸-에탄-1,2-디아민 (3.0 당량)의 용액에 피리딘 (3.0 당량) 및 DMAP (1.0 당량)을 첨가했다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (88%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.60 - 7.23 (m, 5H), 5.04 (s, 2H), 4.77 - 4.64 (m, 1H), 3.15 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.36 (ddt, J = 12.3, 8.2, 4.3 Hz, 5H), 2.13 (s, 3H), 1.96 - 1.70 (m, 3H), 1.55 - 1.33 (m, 2H), 1.29 - 1.10 (m, 13H), 0.96 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.80 (t, J = 6.7 Hz, 4H).
화합물 87: 2-(((R)-4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00314
THF (0.1 내지 0.3 M) 중 중간체 87h (1.0 당량)의 용액에 Pd/C (10% w/w, 1.0 당량)을 첨가했다. 혼합물을 H2 (15 Psi)하에 5시간 동안 15 내지 20℃에서 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 여과하고 감압 농축하여 잔류물을 얻었다.
DCM (10 mL) 중 잔류물 및 중간체 1c (1.0 당량)의 용액에 EDCI (1.0 당량), DMAP (0.1 당량) 및 Et3N (1.05 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 15 내지 20℃에서 적어도 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DCM을 제거하였다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 담황색 오일 (61%)로 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40 - 5.14 (m, 8H), 5.08 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.21 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.08 (ddd, J = 12.0, 5.9, 3.3 Hz, 2H), 3.17 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.43 - 2.28 (m, 5H), 2.24 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.14 (s, 3H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 7H), 1.79 (ddd, J = 42.6, 15.1, 7.5 Hz, 3H), 1.53 (q, J = 7.6 Hz, 8H), 1.33 - 1.06 (m, 37H), 0.97 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.81 (q, J = 6.3 Hz, 9H). MS: 944.1 m/z [M+H].
실시예 88 - 화합물 88
중간체 88a: (S)-1-(메틸아미노)-1-옥소도데칸-4-일 아세테이트
Figure pct00315
중간체 88a는 중간체 87c에 채용된 방법을 사용하여 중간체 87b로부터 23% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.81 (s, 1H), 4.79 (tq, J = 8.5, 3.8 Hz, 1H), 2.73 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.17 - 2.03 (m, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.95 - 1.63 (m, 3H), 1.56 - 1.36 (m, 2H), 1.19 (d, J = 8.4 Hz, 11H), 0.81 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
중간체 88b: (S)-5-옥틸디하이드로푸란-2(3H)-온
Figure pct00316
중간체 88b는 중간체 87d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 88a로부터 제조하였다.
중간체 88c: 벤질 (S)-4-하이드록시도데카노에이트
Figure pct00317
중간체 88c는 중간체 87e 및 87f에 채용된 방법을 사용하여 중간체 88b로부터 제조하였다.
중간체 88d: 벤질 (S)-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)도데카노에이트
Figure pct00318
중간체 88d는 중간체 88g에 채용된 방법을 사용하여 중간체 88c로부터 제조하였다.
중간체 88e: 벤질 (S)-4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노에이트
Figure pct00319
중간체 88e는 중간체 87h에 채용된 방법을 사용하여 중간체 88e로부터 47% 수율로 합성하였다.
화합물 88: 2-(((S)-4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00320
화합물 88은 화합물 87에 채용된 방법을 사용하여 중간체 88d로부터 42% 수율로 합성하였다.
실시예 89 - 화합물 89
중간체 89a: 4-하이드록시-N-메틸데칸아미드
Figure pct00321
DCM (250 mL) 중 메탄아민 하이드로클로라이드 (19.83 g, 2.0 당량)의 혼합물에 AlMe3 (2 M, 152.72 mL, 2.08 당량)를 N2하에 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 이 용액을 N2하에 DCM (100 ml) 중 5-헥실테트라하이드로푸란-2-온 (25 g, 1.0 당량)의 용액에 적가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 HCl (1 N)을 첨가하여 켄칭시켰다. 유기층을 분리하고 수성층을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 3회 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체 (67%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 3.50 (td, J = 7.7, 3.8 Hz, 1H), 2.70 (s, 3H), 2.29 (ddt, J = 25.9, 16.6, 6.8 Hz, 2H), 1.77 (dddd, J = 13.3, 9.2, 6.8, 3.9 Hz, 1H), 1.66 - 1.55 (m, 1H), 1.42 (h, J = 4.0 Hz, 3H), 1.39 - 1.25 (m, 8H), 0.95 - 0.87 (m, 3H).
중간체 89b: (S)-1-(메틸아미노)-1-옥소데칸-4-일 아세테이트
Figure pct00322
중간체 89b는 중간체 87c에 채용된 방법을 사용하여 23% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.70 (s, 1H), 4.79 (tt, J = 8.4, 4.4 Hz, 1H), 2.74 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.11 (dp, J = 21.3, 7.7, 7.2 Hz, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.86 (tdd, J = 13.6, 6.7, 3.2 Hz, 1H), 1.81 - 1.70 (m, 1H), 1.45 (ddp, J = 19.0, 13.6, 6.6, 6.1 Hz, 2H), 1.27 - 1.12 (m, 8H), 0.80 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 89c: (S)-5-헥실디하이드로푸란-2(3H)-온
Figure pct00323
중간체 89c는 중간체 89b로부터 중간체 87d에 채용된 방법을 사용하여 78% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.48 (ddd, J = 13.7, 7.5, 5.6 Hz, 1H), 2.52 (dd, J = 9.5, 6.9 Hz, 2H), 2.31 (dq, J = 13.4, 6.7 Hz, 1H), 1.91 - 1.80 (m, 1H), 1.80 - 1.68 (m, 1H), 1.58 (dq, J = 13.8, 5.2 Hz, 1H), 1.51 - 1.21 (m, 8H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
중간체 89d: 벤질 (S)-4-하이드록시데카노에이트
Figure pct00324
EtOH (25 mL) 및 H2O (5 mL) 중 중간체 89c (3 g, 1.0 당량)의 용액에 N2하에 NaOH (1.1 당량)를 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매를 제거하였다.
생성된 잔류물을 중간체 87f에 채용된 방법에 적용하여 생성물을 무색 오일 (3 g, 50%)로 얻었다.
중간체 89e: 벤질 (S)-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)데카노에이트
Figure pct00325
DCM (30 mL) 중 중간체 89d (3 g, 1.0 당량)의 용액에 N2하에 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (3.26 g, 1.5 당량)를 첨가하였다. 이어서 피리딘 (1.74 mL, 2.0 당량)을 0℃에서 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매를 제거하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 헥산으로 희석하고 여과하였다. 여액을 H2O로 3회 세척하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일 (2 g, 42%)의 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.23 - 8.13 (m, 2H), 7.37 - 7.18 (m, 7H), 5.39 (s, 1H), 5.03 (s, 2H), 4.47 (s, 1H), 4.00 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.00 (ddt, J = 15.0, 7.6, 3.8 Hz, 1H), 1.85 (dt, J = 14.7, 7.3 Hz, 1H), 1.57 (ddt, J = 21.1, 14.0, 6.8 Hz, 2H), 1.35 - 1.16 (m, 8H), 0.91 - 0.75 (m, 3H).
중간체 89f: 벤질 (S)-4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)데카노에이트
Figure pct00326
MeCN (15 mL) 중 중간체 89e (1.5 g, 1.0 당량)의 용액에 2-피롤리딘-1-일에탄아민 (1.16 g, 3.0 당량), 피리딘 (819 uL, 3.0 당량), DMAP (413 mg, 1.0 당량)을 N2 하에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 5시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 EtOAc로 희석하고 1 N NaHCO3로 5회 및 H2O로 3회 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 여액을 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 담황색 오일 (0.65 g, 41%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.41 - 7.26 (m, 5H), 5.11 (d, J = 1.1 Hz, 2H), 4.73 (dd, J = 10.9, 5.7 Hz, 1H), 3.26 (dd, J = 6.7, 1.7 Hz, 2H), 2.79 - 2.57 (m, 7H), 2.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.99 - 1.74 (m, 7H), 1.53 (s, 3H), 1.36 - 1.24 (m, 9H), 0.92 - 0.86 (m, 3H).
화합물 89: 2-(((S)-4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00327
THF (0.2 내지 0.5 M) 중 Pd/C (10% w/w, 1.0 내지 3.0 당량)의 현탁액에 중간체 89f (1.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 H2 분위기 하에서 15 내지 25℃에서 적어도 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 진한 갈색 오일로서 생성물을 얻었다.
갈색 오일을 즉시 DCM (0.2 내지 0.5 M)에서 재구성한 다음 중간체 1c (1.0 당량), EDCI (1.2 당량), DMAP (0.1 내지 0.2 당량) 및 Et3N (1.5 당량)을 N2 하에 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 적어도 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일 (23%)의 생성물을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.49 - 5.22 (m, 8H), 5.18 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.22 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.12 - 4.04 (m, 2H), 3.28 - 3.15 (m, 2H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.50 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.44 (s, 3H), 2.32 (s, 2H), 2.25 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.83 (s, 1H), 1.70 (s, 5H), 1.38 - 0.94 (m, 37H), 0.81 (q, J = 6.6 Hz, 9H). MS: 928.4 m/z [M+H].
실시예 90 - 화합물 90
중간체 90a: 벤질 (R)-4-하이드록시데카노에이트
Figure pct00328
중간체 90a는 중간체 89d에 채용된 방법을 사용하여 (5R)-5-헥실테트라하이드로푸란-2-온으로부터 27% 수율로 합성하였다.
중간체 90b: 벤질 (R)-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)데카노에이트
Figure pct00329
중간체 90b는 중간체 89e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 90a로부터 57% 수율로 합성하였다.
중간체 90c: 벤질 (R)-4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)데카노에이트
Figure pct00330
중간체 90c는 중간체 89f에 채용된 방법을 사용하여 중간체 90b로부터 47% 수율로 합성하였다.
화합물 90: 2-(((R)-4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00331
화합물 90은 화합물 89에 채용된 방법을 사용하여 중간체 90c로부터 27% 수율로 합성하였다.
실시예 91 - 화합물 91
중간체 91a: 4-하이드록시도데칸산
Figure pct00332
H2O (200 mL) 중 5-옥틸테트라하이드로푸란-2-온 (20 g, 1.0e quiv.)의 용액에 NaOH (4.03 g, 1.0 당량)을 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 H2O를 제거하였다. 이렇게 하여 조 생성물을 백색 고체 (14 g, 65%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 3.55 (ddd, J = 9.5, 7.5, 4.6 Hz, 1H), 2.19 (qdd, J = 15.0, 9.3, 6.3 Hz, 2H), 1.69 (dddd, J = 13.9, 9.4, 6.4, 4.4 Hz, 1H), 1.59 (dddd, J = 14.0, 9.2, 7.7, 6.4 Hz, 1H), 1.46 - 1.30 (m, 3H), 1.23 (d, J = 6.6 Hz, 11H), 0.86 - 0.77 (m, 3H).
중간체 91b: 벤질 4-하이드록시도데카노에이트
Figure pct00333
DMF (100 mL) 중 중간체 91a (10 g, 1.0 당량)의 용액에 BnBr (7.91 g, 1.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (5.7 g, 40%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.46 - 7.28 (m, 5H), 5.12 (s, 2H), 3.61 (h, J = 4.6 Hz, 1H), 2.51 (td, J = 7.3, 2.9 Hz, 2H), 1.86 (dtd, J = 14.6, 7.4, 3.5 Hz, 1H), 1.76 - 1.59 (m, 3H), 1.42 (q, J = 12.1, 9.1 Hz, 4H), 1.28 (d, J = 11.9 Hz, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
중간체 91c: 벤질 4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)도데카노에이트
Figure pct00334
DCM (100 mL) 중 중간체 91b (10 g, 1.0 당량) 및 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (9.87 g, 1.05 당량)의 용액에 피리딘 (3.95 mL, 1.5 당량)을 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DCM을 제거하였다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (7.5 g, 49%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.30 - 8.21 (m, 2H), 7.48 - 7.26 (m, 7H), 5.22 (d, J = 69.6 Hz, 2H), 4.87 (tt, J = 7.5, 4.5 Hz, 1H), 2.59 - 2.42 (m, 2H), 1.80 - 1.57 (m, 2H), 1.52 - 1.16 (m, 13H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
중간체 91d: 벤질 4-(((2-(디메틸아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노에이트
Figure pct00335
MeCN (0.1 내지 0.5 M) 중 중간체 91c (1.0 당량)의 용액에 디아민 또는 아미노 알코올 (N',N'-디메틸에탄-1,2-디아민 (2.0 내지 3.0 당량)), 피리딘 (3.0 당량), 및 DMAP (0.1 당량)을 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 15 내지 25℃에서 적어도 2시간 동안 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 감압 농축하고 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 농축하여 잔류물을 얻었고,이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (79%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.46 - 7.28 (m, 5H), 5.08 (s, 1H), 4.76 (s, 1H), 3.23 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.40 (ddt, J = 12.0, 8.9, 4.5 Hz, 4H), 2.21 (s, 7H), 1.94 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 1.82 (p, J = 7.6 Hz, 1H), 1.61 - 1.40 (m, 3H), 1.39 - 1.16 (m, 14H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
화합물 91: 2-((4-(((2-(디메틸아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00336
THF (0.1 내지 0.5 M) 중 중간체 91d의 용액에 Pd/C (10% w/w)를 첨가했다. 혼합물을 15 Psi의 H2 분위기 하에 25℃에서 적어도 5시간 동안 교반하였다. 생성된 생성물을 THF에 희석하고 여과하여 고체를 제거하였다. 여액을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 카복실산 중간체를 갈색 오일로 얻었다.
이어서, 생성된 오일로부터, 화합물 91을 중간체 90f에 채용된 방법을 사용하여 15% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.26 (m, 8H), 5.27 - 5.20 (m, 1H), 5.12 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.28 (ddd, J = 11.9, 4.5, 1.3 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.4 Hz, 2H), 3.24 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 2.44 - 2.35 (m, 4H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.22 (s, 6H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.97 - 1.84 (m, 2H), 1.80 (dt, J = 14.9, 7.7 Hz, 1H), 1.67 - 1.42 (m, 8H), 1.42 - 1.14 (m, 39H), 0.88 (td, J = 6.8, 5.2 Hz, 9H). MS: 930.4 m/z [M+H].
실시예 92 - 화합물 92
중간체 92a: 벤질 4-((((1-메틸피페리딘-4-일)옥시)카보닐)옥시)도데카노에이트
Figure pct00337
중간체 92a는 중간체 91d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 91c 및 1-메틸피페리딘-4-올로부터 94% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.39 - 7.28 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 4.73 (dtd, J = 11.8, 5.4, 4.6, 2.7 Hz, 1H), 4.62 (tt, J = 8.6, 4.2 Hz, 1H), 2.68 (s, 2H), 2.48 - 2.37 (m, 2H), 2.29 (s, 5H), 2.01 - 1.84 (m, 4H), 1.78 (dtt, J = 12.5, 8.2, 3.5 Hz, 2H), 1.67 - 1.58 (m, 1H), 1.58 - 1.46 (m, 1H), 1.27 (d, J = 15.6 Hz, 13H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
화합물 92: 2-((4-((((1-메틸피페리딘-4-일)옥시)카보닐)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00338
화합물 92는 화합물 91에 채용된 방법을 사용하여 중간체 92a로부터 28% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.39 - 5.21 (m, 8H), 5.21 - 5.16 (m, 1H), 4.65 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.57 - 4.52 (m, 1H), 4.22 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.08 (ddd, J = 11.9, 5.8, 4.1 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.61 (s, 2H), 2.36 - 2.29 (m, 2H), 2.29 - 2.18 (m, 7H), 2.14 (s, 2H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.93 - 1.84 (m, 4H), 1.83 - 1.77 (m, 1H), 1.77 - 1.65 (m, 3H), 1.54 (t, J = 7.3 Hz, 13H), 1.33 - 1.12 (m, 41H), 0.81 (td, J = 6.9, 5.3 Hz, 9H). MS: 957.4 m/z [M+H].
실시예 93 - 화합물 93
중간체 93a: 벤질 4-(((2-(아제티딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)도데카노에이트
Figure pct00339
중간체 93a는 중간체 92d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 91c 및 2-(아제티딘-1-일)에탄아민으로부터 80% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.49 - 7.26 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 5.04 (s, 1H), 4.74 (s, 1H), 3.20 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 3.11 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 2.50 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.41 (ddd, J = 8.6, 6.7, 3.2 Hz, 2H), 2.10 - 2.00 (m, 2H), 1.96 - 1.88 (m, 1H), 1.82 (d, J = 15.4 Hz, 4H), 1.46 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.34 - 1.18 (m, 14H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
화합물 93: 2-((4-(((2-(아제티딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00340
화합물 93은 화합물 91에 채용된 방법을 사용하여 중간체 93a로부터 18% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.36 - 5.22 (m, 8H), 5.18 (p, J = 5.0 Hz, 1H), 4.98 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.68 (s, 1H), 4.22 (ddd, J = 11.9, 4.5, 1.6 Hz, 2H), 4.08 (ddq, J = 11.7, 5.8, 2.8 Hz, 2H), 3.12 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 3.05 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.43 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.31 (ddd, J = 8.8, 6.6, 4.2 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.99 (dq, J = 10.0, 6.9 Hz, 10H), 1.88 - 1.68 (m, 3H), 1.59 - 1.36 (m, 7H), 1.34 - 1.11 (m, 42H), 0.86 - 0.77 (m, 9H). MS: 942.1 m/z [M+H].
실시예 94 - 화합물 94
중간체 94a: 벤질 4-(((2-(피페리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)도데카노에이트
Figure pct00341
중간체 94a는 중간체 91d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 91c 및 2-(피페리딘-1-일)에탄-1-아민으로부터 68% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 - 7.28 (m, 5H), 5.10 (s, 3H), 4.75 (s, 1H), 3.22 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.64 (s, 1H), 2.45 - 2.29 (m, 8H), 1.99 - 1.88 (m, 1H), 1.82 (dq, J = 15.0, 8.0 Hz, 1H), 1.48 (dt, J = 53.9, 5.8 Hz, 9H), 1.34 - 1.17 (m, 12H), 0.86 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
화합물 94: 2-((4-(((2-(피페리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00342
화합물 94는 화합물 91에 채용된 방법을 사용하여 중간체 94a로부터 22% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.29 (qq, J = 11.7, 6.7 Hz, 8H), 5.18 (p, J = 5.1 Hz, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.22 (ddd, J = 11.9, 4.5, 2.2 Hz, 2H), 4.08 (ddd, J = 11.9, 5.9, 3.6 Hz, 2H), 3.18 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.39 - 2.18 (m, 12H), 1.98 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.91 - 1.79 (m, 1H), 1.79 - 1.68 (m, 1H), 1.61 - 1.33 (m, 15H), 1.33 - 1.10 (m, 42H), 0.81 (q, J = 6.4 Hz, 9H). MS: 970.2 m/z [M+H].
실시예 95 - 화합물 95
중간체 95a: 벤질 4-(((4-(디에틸아미노)부톡시)카보닐)옥시)도데카노에이트
Figure pct00343
중간체 95a는 중간체 92d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 91c 및 4-(디에틸아미노)부탄-1-올로부터 83% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.44 - 7.28 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 4.72 (tdd, J = 7.6, 5.4, 4.0 Hz, 1H), 4.11 (td, J = 6.7, 3.8 Hz, 2H), 2.49 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 2.42 (dtd, J = 7.7, 5.1, 4.4, 2.5 Hz, 4H), 1.99 (dddd, J = 14.4, 8.9, 7.0, 4.1 Hz, 1H), 1.89 (dtd, J = 14.7, 8.4, 6.5 Hz, 1H), 1.64 (ddt, J = 17.4, 10.5, 6.2 Hz, 3H), 1.56 - 1.46 (m, 3H), 1.34 - 1.21 (m, 13H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
화합물 95: 2-((4-(((4-(디에틸아미노)부톡시)카보닐)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00344
화합물 95는 화합물 91에 채용된 방법을 사용하여 중간체 95a로부터 27% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 (qdd, J = 10.6, 4.4, 1.7 Hz, 8H), 5.27 - 5.22 (m, 1H), 4.71 (tt, J = 7.6, 2.7 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.13 (dtt, J = 10.4, 6.6, 3.7 Hz, 4H), 2.76 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 2.50 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 2.41 (ddd, J = 15.2, 8.0, 6.4 Hz, 4H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.98 - 1.82 (m, 3H), 1.72 - 1.47 (m, 12H), 1.39 - 1.21 (m, 42H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (td, J = 6.8, 4.8 Hz, 9H). MS: 987.5 m/z [M+H].
실시예 96 - 화합물 96
중간체 96a: 벤질 4-(((2-(디에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노에이트
Figure pct00345
중간체 96a는 중간체 91d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 91c 및 N',N'-디에틸에탄-1,2-디아민으로부터 58% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.39 - 7.28 (m, 5H), 5.19 (s, 1H), 5.11 (s, 2H), 4.76 (s, 1H), 3.51 (s, 2H), 3.27 - 3.15 (m, 2H), 2.54 (dd, J = 8.7, 5.9 Hz, 6H), 2.41 (ddd, J = 9.0, 6.9, 2.6 Hz, 2H), 1.94 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 1.83 (p, J = 7.3 Hz, 1H), 1.63 - 1.40 (m, 3H), 1.35 - 1.17 (m, 13H), 1.01 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
화합물 96: 2-((4-(((2-(디에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00346
화합물 96은 화합물 91에 채용된 방법을 사용하여 중간체 96a로부터 42% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.29 (qq, J = 11.4, 6.5 Hz, 8H), 5.18 (p, J = 5.2 Hz, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.21 (ddd, J = 11.8, 4.5, 2.0 Hz, 2H), 4.08 (ddd, J = 12.0, 5.9, 2.7 Hz, 2H), 3.12 (dt, J = 13.0, 6.3 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.45 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 2.28 (dt, J = 27.2, 8.0 Hz, 6H), 1.98 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.83 (s, 1H), 1.78 - 1.68 (m, 1H), 1.54 (t, J = 7.2 Hz, 9H), 1.35 - 1.11 (m, 42H), 0.81 (q, J = 6.3 Hz, 9H). MS: 958.4 m/z [M+H].
실시예 97 - 화합물 97
화합물 97: 2-((5-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)트리데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00347
화합물 96은 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 55d 및 중간체 1c로부터 75% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.28 (m, 8H), 5.27 - 5.22 (m, 1H), 5.12 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.76 - 4.67 (m, 1H), 4.28 (dt, J = 11.9, 4.5 Hz, 2H), 4.13 (ddd, J = 12.0, 5.9, 4.5 Hz, 2H), 3.23 (h, J = 7.2, 6.2 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 2.43 (dt, J = 14.5, 6.6 Hz, 4H), 2.35 - 2.27 (m, 6H), 2.19 (s, 3H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.71 - 1.46 (m, 13H), 1.40 - 1.19 (m, 42H), 1.03 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.92 - 0.83 (m, 9H). MS: 958.5 m/z [M+H].
실시예 98
중간체 98a: 에틸 2,2-디메틸-3-옥소운데카노에이트
Figure pct00348
THF (1-3 M) 중 N-이소프로필프로판-2-아민 (20.0 mL, 1.0 당량)의 용액에 n-BuLi (2.5 M, 56.60 mL, 1.0 당량)를 -78℃에서 N2 하에 첨가했다. 혼합물을 -78℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서 에틸 2-메틸프로파노에이트 (18.96 mL, 1.0 당량)를 -78℃에서 첨가하였다. 혼합물을 -78℃에서 추가로 20분 동안 교반하였다. 상기 용액에 THF (200 mL) 중 노나노일 클로라이드 (26.60 mL, 1.0 당량)를 적가하였다. 혼합물을 15℃로 가온하고 N2 분위기하에 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 물을 첨가하여 켄칭시키고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 유기상을 분리하고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (15 g, 41%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.11 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.56 - 1.46 (m, 2H), 1.28 (s, 6H), 1.25 - 1.13 (m, 13H), 0.80 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 98b: 2,2-디메틸-3-옥소운데칸산
Figure pct00349
EtOH (120 mL) 및 H2O (40 mL) 중 중간체 98a (15 g, 1.0 당량), LiOH (2.10 g, 1.5 당량), KOH (4.92 g, 1.5 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징한 후, 혼합물을 40℃에서 3시간 동안 N2 분위기 하에서 교반하였다. 혼합물을 농축하여 EtOH를 제거하였다. 그런 다음, HCl (1 M)을 사용하여 pH를 5 내지 6으로 조정했다. 혼합물을 H2O와 EtOAc 사이에 분배하였다. 유기상을 분리하고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (5 g, 37%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 2.46 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.58 - 1.47 (m, 2H), 1.33 (s, 6H), 1.20 (s, 10H), 0.81 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
실시예 99 - 화합물 99
중간체 99a: 2-(((2,2-디메틸-3-옥소운데카노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00350
THF (20 mL) 중 중간체 53a (12.16 g, 1.1 당량)의 용액에 중간체 98b (4 g, 1.0 당량), DBAD (8.07 g, 2.0 당량) 및 PPh3 (9.19 g, 2.0 당량)를 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 그 다음 혼합물을 N2 분위기 하에 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 유기상을 분리하고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (3 g, 20%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.27 (dtt, J = 10.8, 8.7, 6.1 Hz, 8H), 4.10 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.03 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.37 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.23 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.52 (tt, J = 14.2, 7.4 Hz, 8H), 1.31 - 1.17 (m, 46H), 0.85 - 0.77 (m, 12H).
중간체 99b: 2-(((3-하이드록시-2,2-디메틸운데카노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00351
4:2:1 THF:H2O:톨루엔 (0.025 내지 0.1 중 중간체 99a (1.0 당량)의 용액에 NaBH4 (5.0 당량)을 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 15℃에서 5시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 THF와 H2O 사이에 분배하고 유기상을 감압 하에서 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (33%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.41 - 5.25 (m, 8H), 4.20 - 4.07 (m, 7H), 3.63 (dd, J = 10.2, 6.7 Hz, 1H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.40 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.59 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 1.40 - 1.22 (m, 40H), 1.16 (d, J = 4.5 Hz, 6H), 0.88 (td, J = 6.8, 4.0 Hz, 9H).
중간체 99c: 2-(((2,2-디메틸-3-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)운데카노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00352
DCM (10 mL) 중 중간체 99b (1 g, 1.0 당량) 및 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (478 mg, 2.0 당량)의 용액에 피리딘 (191 uL, 2.0 당량)을 N2 하에 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 5시간 동안 15 내지 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (0.8 g, 67%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.20 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 5.29 (dq, J = 13.1, 7.1, 6.1 Hz, 8H), 5.03 (dd, J = 10.4, 2.3 Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 6.0, 2.5 Hz, 6H), 2.69 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.35 (p, J = 6.0 Hz, 1H), 2.23 (q, J = 8.4, 7.7 Hz, 4H), 1.97 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.53 (h, J = 7.1, 5.9 Hz, 8H), 1.36 - 1.12 (m, 56H), 0.85 - 0.77 (m, 12H).
화합물 99: 2-(4,4,11-트리메틸-5-옥틸-3,7-디옥소-2,6-디옥사-8,11-디아자트리데실)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00353
MeCN (0.1 M) 중 중간체 99c (1.0 당량)의 용액에 디아민 (N'-에틸-N'-메틸-에탄-1,2-디아민 (3.0 당량)), DMAP (1.0 당량), 및 피리딘 (3.0 당량)을 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기하에 15℃에서 적어도 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 유기상을 분리하고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (66%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.28 (pt, J = 11.5, 5.8 Hz, 8H), 4.90 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.11 - 4.02 (m, 5H), 3.17 (dt, J = 13.4, 7.3 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.37 (dq, J = 12.3, 6.2 Hz, 5H), 2.23 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.14 (s, 3H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 7H), 1.54 (p, J = 6.8 Hz, 4H), 1.37 - 1.06 (m, 49H), 0.97 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.81 (q, J = 6.9 Hz, 9H). MS: 973.5 m/z [M+H].
실시예 100 - 화합물 100
중간체 100a: 에틸 2,2-디메틸-3-옥소노나노에이트
Figure pct00354
중간체 100a는 중간체 99a에 채용된 방법을 사용하여 N-이소프로필프로판-2-아민, 에틸 2-메틸프로파노에이트, 및 헵타노일 클로라이드로부터 26% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.60 - 1.47 (m, 2H), 1.36 - 1.14 (m, 13H), 0.84 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
중간체 100b: 2,2-디메틸-3-옥소노난산
Figure pct00355
EtOH (6mL) 및 H2O (2mL) 중 중간체 100a (20g, 1.0 당량), LiOH (3.15g, 1.5 당량), KOH (7.37g, 1.5 당량)의 혼합물을 N2 분위기에서 4시간 동안 40℃에서 교반했다. 혼합물을 농축하여 EtOH를 제거하였다. 그런 다음, HCl (1 M)을 사용하여 pH를 5 내지 6으로 조정했다. 혼합물을 H2O 및 EtOAc 사이에 분배하고 EtOAc로 2회 추출하였다. 유기상을 분리하고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (6 g, 34%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.53 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.58 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.40 (s, 6H), 1.34 - 1.23 (m, 6H), 0.92 - 0.81 (m, 3H).
중간체 100c: 2-(((2,2-디메틸-3-옥소노나노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00356
THF (50 mL) 중 중간체 1c (19.06 g, 1.1 당량)의 용액에 PPh3 (14.41 g, 2.0 당량) 및 DBAD (12.65 g, 2.0 당량), 및 중간체 100b (5.5 g, 1.0 당량)를 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반하고, 혼합물을 15℃로 가온하고 N2 분위기 하에서 16시간 동안 15℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 유기상을 분리하고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (4 g, 18%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.28 (tt, J = 11.1, 5.4 Hz, 8H), 4.10 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.05 (dd, J = 10.4, 6.0 Hz, 4H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.34 (dt, J = 17.5, 6.6 Hz, 3H), 2.23 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.61 - 1.44 (m, 8H), 1.39 (d, J = 14.2 Hz, 3H), 1.35 - 1.14 (m, 41H), 0.85 - 0.76 (m, 9H).
중간체 100d: 2-(((3-하이드록시-2,2-디메틸노나노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00357
4:2:1 THF:H2O:톨루엔 (0.025 내지 0.1 중 중간체 100c (1.0 당량)의 용액에 0℃에서 NaBH4 (5.0 당량)를 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에서 5℃에서 5시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 THF와 H2O 사이에 분배시키고 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일 (20%)로 얻었다.
중간체 100e: 2-(((2,2-디메틸-3-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)노나노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00358
DCM (5 mL) 중 중간체 100d (0.4 g, 1.0 당량) 및 (4-니트로페닐)카보노클로리데이트 (890 mg, 9.0 당량)의 용액에 피리딘 (119 uL, 3.0 당량)을 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 3시간 동안 15℃에서 교반하였다. 그 다음 혼합물을 N2 분위기 하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (0.2 g, 42%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (dd, J = 9.3, 2.5 Hz, 2H), 7.31 (dd, J = 9.4, 2.8 Hz, 2H), 5.43 - 5.16 (m, 8H), 5.03 (dd, J = 10.3, 2.3 Hz, 1H), 4.12 - 3.99 (m, 6H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.35 (h, J = 6.0 Hz, 1H), 2.22 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.97 (t, J = 6.9 Hz, 7H), 1.63 - 1.47 (m, 6H), 1.40 - 1.12 (m, 41H), 0.82 (t, J = 6.7 Hz, 9H).
화합물 100: 2-(((2,2-디메틸-3-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)노나노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00359
화합물 100은 화합물 99에 채용된 방법을 사용하여 중간체 100e 및 2-피롤리딘-1-일에탄아민으로부터 90% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.28 (tdq, J = 17.2, 12.4, 5.8, 5.3 Hz, 8H), 4.90 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.13 - 4.00 (m, 6H), 3.22 (ddq, J = 19.5, 12.8, 6.3, 5.8 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.51 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.44 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 2.34 (p, J = 6.0 Hz, 1H), 2.23 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.70 (h, J = 7.5 Hz, 4H), 1.54 (p, J = 7.0 Hz, 4H), 1.41 - 1.06 (m, 44H), 0.81 (dt, J = 9.6, 6.7 Hz, 9H). MS: 956.4 m/z [M+H].
실시예 101 - 화합물 101
화합물 101: 2-((4-(((3-(아제티딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00360
화합물 101은 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 3-(아제티딘-1-일)프로판-1-올로부터 65% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.28 (m, 8H), 5.25 (tt, J = 5.8, 4.3 Hz, 1H), 4.71 (ddd, J = 11.5, 7.6, 4.7 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.3 Hz, 2H), 4.15 (dddd, J = 13.3, 7.2, 5.5, 3.2 Hz, 4H), 3.18 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 2.82 - 2.72 (m, 4H), 2.48 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.40 (dt, J = 8.8, 6.8 Hz, 2H), 2.31 (td, J = 7.6, 1.2 Hz, 4H), 2.10 - 1.99 (m, 10H), 1.99 - 1.84 (m, 2H), 1.77 - 1.50 (m, 15H), 1.42 - 1.21 (m, 37H), 0.88 (td, J = 6.9, 5.4 Hz, 9H). MS: 929.3 m/z [M+H].
실시예 102 - 화합물 102
화합물 102: 2-((4-(((3-(피페리딘-1-일)프로폭시)카보닐)옥시)데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00361
화합물 102는 실시예 1에 채용된 방법을 사용하여 중간체 40d 및 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-올로부터 72% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.28 (m, 8H), 5.25 (ddd, J = 5.8, 4.3, 1.5 Hz, 1H), 4.76 - 4.69 (m, 1H), 4.37 - 4.24 (m, 2H), 4.24 - 4.10 (m, 4H), 2.82 - 2.71 (m, 4H), 2.48 - 2.26 (m, 12H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 2.01 - 1.81 (m, 4H), 1.71 - 1.49 (m, 17H), 1.43 (s, 2H), 1.40 - 1.24 (m, 37H), 0.88 (td, J = 6.9, 5.0 Hz, 9H). MS: 957.1 m/z [M+H].
실시예 103 - 화합물 103
중간체 103a: (2-에틸부틸)마그네슘 브로마이드
Figure pct00362
THF (0.4 내지 0.5 M) 중 Mg (1.1 당량) 및 I2 (0.1 당량)의 용액에 3-(브로모메틸)펜탄 (1.0 당량)을 적가하였다. 혼합물을 40℃에서 적어도 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 추가 정제없이 다음 단계에서 그대로 사용하였다.
중간체 103b: 에틸 6-에틸-4-옥소옥타노에이트
Figure pct00363
THF (0.3 M) 중 에틸 4-클로로-4-옥소-부타노에이트 (1.0 당량)의 용액에 CuI (1-2 당량) 및 중간체 103a (1 내지 2 당량 당량)를 -78℃에서 적가했다. 혼합물을 -78℃에서 적어도 1.5시간 동안 교반하였다. 완료 후 포화 NH4Cl을 첨가하고 반응을 EtOAc로 3회 추출하였다. 유기층을 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 갈색 오일 (82%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.05 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.65 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.49 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 2.30 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 1.82 - 1.71 (m, J = 6.5 Hz, 1H), 1.33 - 1.13 (m, 7H), 0.78 (t, J = 7.4 Hz, 6H).
중간체 103c: 6-에틸-4-옥소옥탄산
Figure pct00364
3:1 EtOH/H2O (0.2 M) 중 중간체 103c (1.0 당량)의 용액에 NaOH (1.5 당량), LiOH (1.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 적어도 1시간 동안 교반하였다. 완료 후 1 M HCl을 사용하여 반응의 pH를 3으로 조정하고 반응물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (46%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.69 - 2.60 (m, 2H), 2.56 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.30 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 1.75 (hept, J = 6.4 Hz, 1H), 1.22 (qp, J = 13.8, 6.6 Hz, 4H), 0.78 (t, J = 7.4 Hz, 6H).
중간체 103d: 2-((6-에틸-4-옥소옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00365
DCM (0.2 내지 0.5 M) 중 중간체 103c (1.0 당량)의 용액에 중간체 1c (1.0 당량), EDCI (1.2 당량), DMAP (0.1 내지 0.2 당량) 및 Et3N (1.5 당량)를 N2 하에서 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20 내지 25℃에서 적어도 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 오일 (40%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40 - 5.21 (m, 8H), 5.18 (p, J = 5.0 Hz, 1H), 4.23 (dt, J = 11.9, 5.0 Hz, 2H), 4.08 (dd, J = 11.9, 5.9 Hz, 2H), 2.67 (dt, J = 20.4, 6.5 Hz, 6H), 2.51 (td, J = 6.5, 2.9 Hz, 2H), 2.32 - 2.22 (m, 5H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.75 (p, J = 6.4 Hz, 1H), 1.53 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.35 - 1.09 (m, 31H), 0.80 (dt, J = 16.7, 6.9 Hz, 12H).
중간체 103e: 2-((6-에틸-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00366
중간체 103e는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 103d로부터 46% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.27 (tt, J = 14.1, 7.8 Hz, 8H), 4.89 (p, J = 7.4 Hz, 1H), 4.32 - 4.02 (m, 4H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.32 - 2.19 (m, 4H), 1.98 (q, J = 7.2 Hz, 10H), 1.69 - 1.40 (m, 7H), 1.39 - 1.16 (m, 36H), 0.82 (t, J = 6.9 Hz, 12H).
화합물 103: 2-((6-에틸-4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00367
화합물 103은 중간체 91d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 103e 및 및 N'-에틸-N'-메틸-에탄-1,2-디아민으로부터 98% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.21 (m, 8H), 5.18 (q, J = 5.0 Hz, 1H), 5.07 (s, 1H), 4.79 (s, 1H), 4.21 (ddd, J = 11.8, 4.4, 1.8 Hz, 2H), 4.08 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.4 Hz, 2H), 3.17 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.44 - 2.27 (m, 6H), 2.24 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.13 (s, 3H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.84 (dq, J = 8.4, 4.4 Hz, 1H), 1.71 (dd, J = 14.8, 7.5 Hz, 1H), 1.58 - 1.43 (m, 8H), 1.29 - 1.16 (m, 38H), 0.96 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 0.80 (ddd, J = 13.4, 6.7, 3.7 Hz, 13H). MS: 916.3 m/z [M+H].
실시예 104
중간체 104a: (3,7-디메틸옥틸)마그네슘 브로마이드
Figure pct00368
중간체 104a는 중간체 104a에 채용된 방법을 사용하여 1-브로모-3,7-디메틸-옥탄으로부터 합성되었다.
중간체 104b: 에틸 7,11-디메틸-4-옥소도데카노에이트
Figure pct00369
중간체 104b는 중간체 103b에 채용된 방법을 사용하여 중간체 104a로부터 66% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.11 (qd, J = 7.1, 2.5 Hz, 2H), 2.71 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.56 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.49 - 2.35 (m, 2H), 1.68 - 1.54 (m, 1H), 1.49 (dq, J = 13.2, 6.6 Hz, 1H), 1.43 - 1.31 (m, 2H), 1.24 (td, J = 8.0, 7.1, 3.6 Hz, 6H), 1.10 (dddd, J = 16.9, 9.9, 4.7, 2.0 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 6.5 Hz, 9H).
중간체 104c: 7,11-디메틸-4-옥소도데칸산
Figure pct00370
중간체 104c는 중간체 103c에 채용된 방법을 사용하여 중간체 104b로부터 51% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.72 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.50 - 2.36 (m, 2H), 1.61 (ddt, J = 11.8, 9.0, 4.3 Hz, 1H), 1.51 (hept, J = 6.6 Hz, 1H), 1.45 - 1.34 (m, 2H), 1.24 (ddt, J = 16.2, 13.5, 4.2 Hz, 4H), 1.11 (ddt, J = 16.0, 9.6, 5.9 Hz, 3H), 0.91 - 0.81 (m, 9H).
중간체 104d: 2-((7,11-디메틸-4-옥소도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00371
중간체 104d는 중간체 103d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 104c로부터 58% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.41 - 5.28 (m, 8H), 5.24 (ddd, J = 10.2, 5.8, 4.3 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.9, 5.8 Hz, 2H), 2.74 (dt, J = 17.5, 6.5 Hz, 6H), 2.58 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.48 - 2.37 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.60 (ddd, J = 10.0, 5.6, 2.6 Hz, 6H), 1.54 - 1.47 (m, 1H), 1.42 - 1.19 (m, 34H), 1.10 (ddt, J = 19.6, 10.0, 6.9 Hz, 4H), 0.93 - 0.80 (m, 15H).
중간체 104e: 2-((7,11-디메틸-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00372
중간체 104e는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 104d로부터 58% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.27 - 8.11 (m, 2H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 5.36 - 5.16 (m, 9H), 4.78 (ddq, J = 12.5, 7.0, 3.4 Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 12.0, 4.3 Hz, 2H), 4.12 - 4.05 (m, 2H), 2.70 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.24 (tt, J = 7.7, 4.0 Hz, 4H), 2.07 - 1.88 (m, 10H), 1.72 - 1.48 (m, 7H), 1.44 (ddd, J = 13.3, 6.6, 1.3 Hz, 1H), 1.39 - 1.14 (m, 34H), 1.06 (dtd, J = 8.6, 6.7, 4.7 Hz, 3H), 0.86 - 0.76 (m, 15H).
실시예 105 - 화합물 105
화합물 105: 2-((7,11-디메틸-4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)도데카노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00373
화합물 105는 중간체 91d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 104e 및 2-피롤리딘-1- 일에탄아민으로부터 62% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.38 - 5.22 (m, 8H), 5.22 - 5.15 (m, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.67 (s, 1H), 4.22 (dd, J = 12.0, 4.4 Hz, 2H), 4.08 (ddd, J = 11.9, 5.9, 3.5 Hz, 2H), 3.20 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.51 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.43 (d, J = 5.9 Hz, 4H), 2.32 (ddd, J = 9.2, 6.7, 3.7 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.84 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 1.77 - 1.66 (m, 5H), 1.54 (p, J = 7.1 Hz, 7H), 1.44 (p, J = 6.6 Hz, 3H), 1.35 - 1.10 (m, 34H), 1.10 - 0.96 (m, 5H), 0.86 - 0.74 (m, 15H). MS: 984.2 m/z [M+H].
실시예 106 - 화합물 106
화합물 106: 2-((6-에틸-4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00374
화합물 106은 중간체 91d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 103e 및 2-피롤리딘-1-일에탄아민으로부터 78% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.28 (qt, J = 11.5, 6.0 Hz, 8H), 5.19 (q, J = 5.0 Hz, 1H), 4.79 (s, 1H), 4.22 (dd, J = 12.2, 4.5 Hz, 2H), 4.08 (ddd, J = 11.8, 5.8, 3.5 Hz, 2H), 3.22 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.53 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.46 (s, 3H), 2.33 (dd, J = 9.6, 7.0 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 7H), 1.89 - 1.80 (m, 2H), 1.76 - 1.61 (m, 7H), 1.60 - 1.45 (m, 6H), 1.34 - 1.16 (m, 33H), 0.87 - 0.72 (m, 12H). MS: 928.4 m/z [M+H].
실시예 107 - 화합물 107
중간체 107a: (Z)-1-브로모논-3-엔
Figure pct00375
DCM (1 M) 중 PPh3 (36.79 g, 1.33 당량)의 용액에 Br2 (7.23 mL, 1.33 당량)를 0℃에서 첨가하였다. (Z)-논-3-엔-1-올 (15 g, 1.0 당량)을 반응 혼합물에 첨가하고 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 H2O를 첨가하여 켄칭시키고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (15 g, 69%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.47 - 5.30 (m, 2H), 3.64 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.18 - 2.06 (m, 2H), 2.02 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 1.77 (s, 1H), 1.62 (p, J = 6.9 Hz, 2H), 1.38 - 1.20 (m, 6H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
중간체 107b: (Z)-논-3-엔-1-일마그네슘 브로마이드
Figure pct00376
THF (150 mL) 중 Mg (2.13 g, 1.2 당량)의 현탁액에 I2 (1.86 g, 0.1 당량)를 첨가하였다. 이어서 중간체 107a (15 g, 1.0 당량)를 혼합물에 첨가하고 혼합물을 45℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 추가 정제없이 그대로 다음 단계에 사용하였다.
중간체 107c: 에틸 (Z)-4-옥소트리데크-7-에노에이트
Figure pct00377
중간체 107c는 중간체 103b에 채용된 방법을 사용하여 중간체 107b로부터 75% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.23 (m, 2H), 4.10 (qd, J = 7.1, 3.2 Hz, 3H), 2.69 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.30 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 2.01 - 1.95 (m, 2H), 1.34 - 1.18 (m, 11H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
중간체 107d: (Z)-4-옥소트리데크-7-엔산
Figure pct00378
중간체 107d는 중간체 103c에 채용된 방법을 사용하여 중간체 107c로부터 80% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.23 (ddt, J = 34.8, 17.4, 7.8 Hz, 2H), 4.27 - 3.96 (m, 2H), 2.58 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.31 - 2.08 (m, 4H), 1.92 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.75 (s, 2H), 1.21 (dq, J = 15.0, 9.2, 8.0 Hz, 6H), 0.80 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 107e: 2-(((Z)-4-옥소트리데크-7-에노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00379
중간체 107e는 중간체 104c 에 채용된 방법을 사용하여 중간체 107d 및 중간체 1c로부터 80% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 - 5.22 (m, 9H), 5.21 - 5.15 (m, 1H), 4.23 (dt, J = 11.9, 4.8 Hz, 2H), 4.12 - 4.01 (m, 4H), 2.76 - 2.67 (m, 4H), 2.65 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.55 - 2.49 (m, 2H), 2.42 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 1.98 (q, J = 7.2 Hz, 13H), 1.54 (p, J = 7.6 Hz, 4H), 1.32 - 1.18 (m, 37H), 0.82 (td, J = 7.0, 1.7 Hz, 9H).
중간체 107f: 2-(((Z)-4-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)트리데크-7-에노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00380
중간체 107f는 중간체 1e에 채용된 방법을 사용하여 중간체 107e로부터 21% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.48 - 8.20 (m, 2H), 7.56 - 7.32 (m, 2H), 5.45 - 5.20 (m, 10H), 4.88 (tt, J = 7.9, 4.6 Hz, 1H), 4.30 (ddd, J = 12.1, 10.3, 4.5 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 2.1 Hz, 2H), 2.74 (dt, J = 19.6, 6.5 Hz, 5H), 2.59 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.48 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.41 - 2.24 (m, 5H), 2.15 (q, J = 7.7 Hz, 1H), 2.09 - 1.96 (m, 10H), 1.61 (q, J = 12.7, 9.4 Hz, 5H), 1.39 - 1.20 (m, 30H), 0.99 - 0.69 (m, 9H).
화합물 107: 2-(((Z)-4-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)트리데크-7-에노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00381
화합물 107은 중간체 91d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 107f 및 N'-에틸-N'-메틸-에탄-1,2-디아민으로부터 56% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.41 - 5.29 (m, 9H), 5.24 (p, J = 5.0 Hz, 1H), 5.16 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.81 - 4.74 (m, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.3 Hz, 2H), 3.23 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.48 - 2.36 (m, 6H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.20 (s, 3H), 2.02 (dq, J = 20.4, 7.0 Hz, 12H), 1.96 - 1.87 (m, 2H), 1.81 (dd, J = 14.7, 7.3 Hz, 1H), 1.65 - 1.55 (m, 7H), 1.39 - 1.22 (m, 35H), 1.03 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (td, J = 7.0, 2.3 Hz, 9H). MS: 955.3 m/z [M+H].
실시예 108 - 화합물 108
화합물 108: 2-(((Z)-4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)트리데크-7-에노일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00382
화합물 108은 중간체 91d에 채용된 방법을 사용하여 중간체 107f 및 2-피롤리딘-1-일에탄아민으로부터 51% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.26 (m, 9H), 5.24 (q, J = 5.1 Hz, 1H), 4.78 (tt, J = 8.6, 4.6 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.14 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.5 Hz, 2H), 3.29 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.66 - 2.50 (m, 5H), 2.39 (ddd, J = 9.6, 6.7, 3.6 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.01 (dq, J = 20.4, 7.1 Hz, 12H), 1.87 - 1.72 (m, 5H), 1.59 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 1.40 - 1.15 (m, 31H), 0.88 (td, J = 6.9, 2.2 Hz, 9H). MS: 967.3 m/z [M+H].
실시예 109 - 화합물 109
중간체 109a: 3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-2-옥소프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트
Figure pct00383
중간체 109a는 중간체 62b에 채용된 방법을 사용하여 중간체 62a 및 리놀레산으로부터 63% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.31 - 5.19 (m, 4H), 4.84 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 2.67 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.94 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.57 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.31 - 1.13 (m, 15H), 0.80 (d, J = 15.1 Hz, 12H).
중간체 109b: 3-하이드록시-2-옥소프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트
Figure pct00384
THF (180 mL) 중 중간체 109a (1.0 당량)의 용액에 HF-피리딘 (5.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 THF를 제거하였다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (66%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.33 (dtd, J = 12.5, 10.3, 9.5, 5.6 Hz, 4H), 4.74 (s, 1H), 4.36 (s, 1H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 2.37 - 2.27 (m, 1H), 2.03 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.65 (p, J = 7.1 Hz, 2H), 1.41 - 1.24 (m, 14H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 109c: 3-(올레오일옥시)-2-옥소프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트
Figure pct00385
중간체 109c는 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 109b 및 올레산로부터 50% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.37 - 5.22 (m, 6H), 4.68 (s, 4H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.02 - 1.91 (m, 8H), 1.60 (q, J = 7.3 Hz, 4H), 1.33 - 1.17 (m, 33H), 0.81 (dt, J = 7.0, 3.3 Hz, 6H).
중간체 109d: 2-하이드록시-3-(올레오일옥시)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트
Figure pct00386
중간체 109d는 중간체 1c에 채용된 방법을 사용하여 중간체 109c로부터 50% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.37 - 5.21 (m, 6H), 4.15 - 4.00 (m, 4H), 2.70 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 - 1.89 (m, 8H), 1.56 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.23 (dt, J = 13.9, 7.0 Hz, 34H), 0.82 (td, J = 6.8, 3.8 Hz, 6H).
화합물 109: 3-(올레오일옥시)-2-((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)옥타노일)옥시)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트
Figure pct00387
화합물 109는 화합물 85에 채용된 방법을 사용하여 중간체 109d 및 중간체 85c로부터 합성되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 (tdd, J = 8.8, 6.5, 3.6 Hz, 5H), 5.28 - 5.22 (m, 1H), 5.16 (s, 1H), 4.29 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 2H), 4.15 (ddd, J = 11.9, 5.8, 3.3 Hz, 2H), 3.34 - 3.22 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.55 (d, J = 30.6 Hz, 5H), 2.39 (ddd, J = 8.8, 6.6, 3.8 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.09 - 1.97 (m, 7H), 1.91 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 1.78 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 1.61 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 1.30 (td, J = 10.5, 9.4, 4.7 Hz, 30H), 0.91 - 0.87 (m, 6H). MS: 902.3 m/z [M+H].
실시예 110 -화합물 110
중간체 110a: 2-옥소프로판-1,3-디일 디올레에이트
Figure pct00388
DCM (300 mL) 중 1,3-디하이드록시프로판-2-온 (5 g, 0.5 당량)의 용액에 DMAP (1.1 당량) 및 EDCI (1.0 당량)를 첨가했다. 그런 다음 상기 혼합물에 올레산 (1.0 당량)을 첨가하고 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DCM을 제거하였다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (8 g, 12%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.34 - 5.21 (m, 4H), 4.68 (s, 4H), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.94 (q, J = 6.4 Hz, 8H), 1.60 (q, J = 7.4 Hz, 4H), 1.31 - 1.14 (m, 38H), 0.89 - 0.75 (m, 6H).
중간체 110b: 2-하이드록시프로판-1,3-디일 디올레에이트
Figure pct00389
중간체 110b는 중간체 1c에 채용된 방법을 사용하여 중간체 110a로부터 47% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.41 - 5.26 (m, 4H), 4.22 - 4.06 (m, 4H), 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.01 (q, J = 6.4 Hz, 7H), 1.63 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 1.28 (d, J = 14.2 Hz, 33H), 0.90 - 0.81 (m, 6H).
화합물 110: 2-((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,3-디일 디올레에이트
Figure pct00390
화합물 110은 화합물 85에 채용된 방법을 사용하여 중간체 110b 및 중간체 85c로부터 합성되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.33 - 5.22 (m, 4H), 5.22 - 5.15 (m, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.28 - 4.17 (m, 2H), 4.08 (ddq, J = 12.2, 6.4, 2.9 Hz, 2H), 3.21 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.51 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.43 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 2.32 (ddd, J = 8.6, 6.6, 3.7 Hz, 2H), 2.24 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.94 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 1.87 - 1.78 (m, 1H), 1.70 (p, J = 3.1 Hz, 5H), 1.61 - 1.36 (m, 9H), 1.22 (d, J = 13.2 Hz, 45H), 0.82 (td, J = 6.9, 3.7 Hz, 9H). MS: 904.2 m/z [M+H].
실시예 111 - 화합물 111
화합물 111 - 3-((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)옥타노일)옥시)프로판-1,2-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00391
화합물 111은 화합물 85에 채용된 방법을 사용하여 중간체 85c 및 중간체 30a로부터 합성되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 8H), 5.24 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.14 (s, 1H), 4.74 (s, 1H), 4.27 (ddd, J = 12.2, 8.2, 4.2 Hz, 2H), 4.18 - 4.09 (m, 2H), 3.27 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.57 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.50 (s, 4H), 2.37 (td, J = 8.9, 7.8, 3.5 Hz, 2H), 2.30 (td, J = 7.5, 4.4 Hz, 4H), 2.03 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.98 - 1.86 (m, 2H), 1.76 (h, J = 3.1 Hz, 5H), 1.59 (tt, J = 9.8, 5.1 Hz, 7H), 1.38 - 1.21 (m, 30H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 9H). MS: 900.1 m/z [M+H].
실시예 112 - 화합물 112
화합물 112: 2-(((4-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)옥타노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00392
화합물 112는 화합물 84에 채용된 방법을 사용하여 중간체 86c 및 중간체 53a로부터 합성되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44 - 5.28 (m, 8H), 5.19 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.12 (d, J = 5.9 Hz, 6H), 3.29 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 2.64 - 2.49 (m, 6H), 2.38 (ddd, J = 10.1, 8.5, 4.8 Hz, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 8H), 1.90 (s, 2H), 1.86 - 1.72 (m, 6H), 1.61 (t, J = 7.3 Hz, 7H), 1.32 (tq, J = 7.6, 4.9, 3.7 Hz, 33H), 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 9H). MS: 914.1 m/z [M+H].
실시예 113 - 화합물 113
중간체 113a: 벤질 3-하이드록시헵타노에이트
Figure pct00393
Zn을 HCl (1 M)에 붓고 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고 침전물을 EtOH로 세척하였다. 고체를 감압하에 건조시켜 새로 제조된 Zn을 얻었다. THF (50 mL) 중 Zn (15.18 g, 2.0 당량)의 현탁액에 펜타날 (1.0 당량) 및 벤질 2-브로모아세테이트 (1.5 당량)를 66℃에서 0.5시간 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (10 g, 36%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.34 (d, J = 4.1 Hz, 5H), 5.14 (s, 2H), 4.01 (tt, J = 8.4, 3.6 Hz, 1H), 2.87 (s, 1H), 2.59 - 2.41 (m, 2H), 1.57 - 1.47 (m, 1H), 1.43 (qd, J = 9.6, 8.9, 4.6 Hz, 2H), 1.37 - 1.24 (m, 4H), 0.93 - 0.87 (m, 3H).
중간체 113b: 벤질 3-(((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)헵타노에이트
Figure pct00394
DCM (10 mL) 중 중간체 113a (8 g, 1.0 당량) 및 (4-니트로페닐) 카보노클로리데이트 (2.0 당량)의 용액에 0℃에서 피리딘 (3.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 DCM을 제거하였다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (8 g, 59% 수율)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.30 - 8.21 (m, 2H), 7.39 - 7.28 (m, 7H), 5.16 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 2.82 - 2.69 (m, 2H), 1.81 - 1.68 (m, 2H), 1.43 - 1.30 (m, 5H), 0.94 - 0.89 (m, 3H).
중간체 113c: 벤질 3-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)헵타노에이트
Figure pct00395
MeCN (10 mL) 중 중간체 113b (0.5 g, 1.0 당량) 및 2-피롤리딘-1-일에탄아민 (3.0 당량)의 용액에 DMAP (0.1 당량) 및 피리딘 (3.0 당량)을 0℃에서 첨가했다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 MeCN을 제거하였다. 잔류물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (0.4 g, 85%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 - 7.20 (m, 5H), 5.05 (s, 2H), 3.17 (dt, J = 13.3, 6.4 Hz, 2H), 2.56 (td, J = 13.2, 11.4, 6.3 Hz, 2H), 2.50 - 2.37 (m, 6H), 1.72 - 1.63 (m, J = 4.0, 3.5 Hz, 4H), 1.49 (s, 2H), 1.28 - 1.20 (m, 4H), 0.81 (q, J = 4.2, 3.2 Hz, 3H).
중간체 113d: 3-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)헵탄산
Figure pct00396
THF (10 mL) 중 중간체 113c (3.5 g, 1.0 당량)의 용액에 Pd/C (10% w/w)를 첨가하였다. 혼합물을 H2로 3회 퍼징한 다음 혼합물을 H2 분위기하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 감압 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일 (2 g, 75%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.00 (s, 1H), 6.46 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.02 (dt, J = 10.0, 5.2 Hz, 1H), 3.43 - 3.25 (m, 3H), 2.92 (dt, J = 21.7, 6.5 Hz, 6H), 2.37 (qd, J = 14.9, 6.4 Hz, 2H), 1.87 (q, J = 4.4, 2.9 Hz, 4H), 1.64 - 1.45 (m, 2H), 1.24 (h, J = 7.7, 6.7 Hz, 4H), 0.88 - 0.75 (m, 3H).
화합물 113: 2-(((3-(((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)헵타노일)옥시)메틸)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00397
화합물 113은 화합물 52에 채용된 방법을 사용하여 중간체 113c 및 중간체 53a 로부터 합성되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.37 - 5.18 (m, 8H), 5.00 (q, J = 6.4 Hz, 1H), 4.06 (p, J = 6.5, 6.1 Hz, 6H), 3.21 (p, J = 7.3, 6.8 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.55 - 2.39 (m, 7H), 2.32 (p, J = 6.0 Hz, 1H), 2.23 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 7H), 1.76 - 1.63 (m, 5H), 1.54 (t, J = 7.3 Hz, 6H), 1.33 - 1.15 (m, 30H), 0.82 (t, J = 6.7 Hz, 9H). MS: 900.1 m/z [M+H].
실시예 114 - 비교 화합물 114
화합물 114: 2-(((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)프로판-1,3-디일 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)
Figure pct00398
DCM (2 mL) 중 중간체 1c (250 mg, 1.0 당량)의 용액에 피리딘 (3.0 당량) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (1.1 당량)를 첨가하였다. 반응을 25℃에서 2시간 동안 교반하고, 그 후 물을 첨가하여 반응을 켄칭하고 DCM으로 3회 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성된 조 잔류물을 MeCN (2 mL)에서 재구성한 다음 피리딘 (3.0 당량), N1-에틸-N1-메틸에탄-1,2-디아민 (1.5 당량), 및 DMAP (1.0 당량)를 첨가했다. 반응을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서 헵탄을 반응 혼합물에 첨가하고, 헵탄층을 MeCN으로 3회 세척하였다. 합한 MeCN 층은 헵탄으로 3회 역 추출하였고, 합한 헵탄층은 MeCN으로 마지막으로 1회 세척하였다. 이어서 헵탄을 진공에서 제거하고, 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (138 mg, 46%)로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.49 - 5.27 (m, 8H), 5.14 (p, J = 5.0 Hz, 1H), 4.33 - 4.12 (m, 4H), 3.29 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.83 - 2.71 (m, 4H), 2.60 - 2.38 (m, 5H), 2.38 - 2.16 (m, 7H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.69 - 1.56 (m, 4H), 1.42 - 1.22 (m, 28H), 1.07 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.96 - 0.85 (m, 6H).
실시예 115 - 재료 및 방법
LNP 조성물
LNP는 이온화 가능한 지질 (예: 아민 지질), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-2k-DMG로 구성된 4성분 지질 시스템에서 다양한 아민 지질을 사용하여 제조되었다. 마우스의 간 편집 비율 검정에서 Cas9 mRNA 및 마우스 서열을 표적으로 하는 화학적으로 변형된 sgRNA는 1:1 w/w 비율 또는 1:2 w/w 비율로 LNP로 제형화되었다.
LNP 제형화 - 교차 흐름
지질 성분은 하기 기재된 지질 성분 몰비로 100% 에탄올에 용해되었다. 화학적으로 변형된 sgRNA 및 Cas9 mRNA를 합하고 25 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 5.0에 용해하여 약 0.45 mg/mL의 총 RNA 카고 농도를 얻었다. LNP는 화학적으로 변형된 sgRNA: Cas9 mRNA의 비율을 아래에 설명된 바와 같이 1:1 또는 1:2 w/w 비율로 하여 약 6의 N/P 비로 제형화되었다.
LNP는 지질을 2 부피의 RNA 용액 및 1 부피의 물과 충돌 제트 혼합하여 형성하였다. 에탄올 중의 지질은 RNA 용액 2 부피와 혼합 크로스를 통해 혼합된다. 물의 네 번째 흐름은 인라인 티 (inline tee)를 통해 크로스의 출구 흐름과 혼합된다. (예를 들어, WO2016010840, 도 2 참조) LNP를 실온에서 1시간 동안 유지하고 물로 추가로 희석했다 (약 1:1 v/v). 희석된 LNP를 평평한 시트 카트리지 (Sartorius, 100kD MWCO)에서 접선 흐름 여과를 사용하여 농축한 다음 정용 여과에 의해 50 mM 트리스, 45 mM NaCl, 5% (w/v) 수크로스, pH 7.5 (TSS)로 완충제 교환하였다. 대안적으로 PD-10 탈염 컬럼 (GE)을 사용하여 TSS로의 최종 완충제 교환을 완료했다. 필요한 경우, Amicon 100kDa 원심 분리 필터 (Millipore)를 사용하여 원심 분리하여 조성물을 농축했다. 이어서 생성된 혼합물을 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 최종 LNP는 추가로 사용할 때까지 4℃ 또는 -80℃에서 보관했다.
LNP 조성물 분석
동적 광 산란 ("DLS")은 본 기재 내용의 LNP의 다분산 지수 ("pdi") 및 크기를 특성화하는 데 사용된다. DLS는 샘플을 광원에 노출시켜 발생하는 빛의 산란을 측정한다. DLS 측정에서 결정된 PDI는 완벽하게 균일한 집단의 PDI를 0으로 하여, 집단에서 입자 크기 (평균 입자 크기 주변)의 분포를 나타낸다.
전기영동 광 산란은 지정된 pH에서 LNP의 표면 전하를 특성화하는 데 사용된다. 표면 전하 또는 제타 전위는 LNP 현탁액 중 입자 사이의 정전기 반발/흡인의 크기를 측정한 것이다.
비대칭 장흐름 분획 (Asymmetric-Flow Field Flow Fractionation) - 다중 각도 광 산란 (AF4-MALS)은 유체 역학적 반경에 따라 조성물의 입자를 분리한 다음 분획된 입자의 분자량, 유체 역학적 반경 및 제곱근 평균 반경을 측정하는 데 사용된다. 이를 통해 Burchard-Stockmeyer Plot (입자의 내부 코어 밀도를 제시하는 시간에 따른 유체 역학 반경에 대한 평균 제곱근 ("rms") 반경의 비율) 및 rms 형태 플롯 (rms 반경의 로그 대 분자량 로그, 여기서 얻어진 선형 맞춤의 기울기가 압축률 대 연신율의 정도를 제공함)과 같은 2차 특성뿐만 아니라 분자량 및 크기 분포를 평가할 수 있다.
나노 입자 추적 분석 (NTA, Malvern Nanosight)은 입자 크기 분포와 입자 농도를 결정하는 데 사용할 수 있다. LNP 샘플은 적절하게 희석되고 현미경 슬라이드에 주입된다. 카메라는 입자가 시야를 통해 천천히 주입됨에 따라 산란된 빛을 기록한다. 영상이 캡처된 후 나노 입자 추적 분석은 픽셀을 추적하고 확산 계수를 계산하여 영상을 처리한다. 이 확산 계수는 입자의 유체 역학 반경으로 번역될 수 있다. 기기는 또한 입자 농도를 제공하기 위해 분석에서 계산된 개별 입자의 수를 계수한다.
극저온 전자 현미경 ("cryo-EM")은 LNP의 입자 크기, 형태 및 구조적 특성을 결정하는 데 사용할 수 있다.
LNP의 지질 조성 분석은 액체 크로마토그래피에 이어 하전 에어로졸 검출 (LC-CAD)로 결정할 수 있다. 이 분석은 실제 지질 함량과 이론적 지질 함량의 비교를 제공할 수 있다.
LNP 조성물은 평균 입자 크기, 다분산 지수 (pdi), 총 RNA 함량, RNA 캡슐화 효율 및 제타 전위에 대해 분석된다. LNP 조성물은 지질 분석, AF4-MALS, NTA 및/또는 cryo-EM에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 평균 입자 크기 및 다분산도는 Malvern Zetasizer DLS 기기를 사용하여 동적 광 산란 (DLS)으로 측정된다. LNP 샘플은 DLS로 측정하기 전에 PBS 완충제로 희석되었다. 평균 입자 크기의 강도 기반 측정인 Z-평균 직경이 수 평균 직경 및 pdi와 함께 보고되었다. Malvern Zetasizer 기기는 LNP의 제타 전위를 측정하는 데에도 사용된다. 샘플은 측정 전에 0.1X PBS, pH 7.4에서 1:17 (50 μL에서 800 μL로) 희석된다.
형광 기반 검정 (Ribogreen®, ThermoFisher Scientific)은 총 RNA 농도와 유리 RNA를 결정하는 데 사용된다. 캡슐화 효율은 (총 RNA - 유리 RNA)/총 RNA로 계산된다. LNP 샘플은 0.2% 트리톤-X 100을 함유하는 1x TE 완충제로 적절하게 희석하여 총 RNA를 결정하거나 1x TE 완충제를 사용하여 유리 RNA를 결정한다. 표준 곡선은 조성물을 만드는 데 사용된 시작 RNA 용액을 사용하여 준비하고 1x TE 완충제 +/- 0.2% 트리톤-X 100으로 희석한다. 희석된 RiboGreen® 염료 (제조업체의 지침에 따름)를 각 표준 및 시료에 추가하고, 빛이 없는 상태에서 실온에서 약 10분 동안 배양되도록 한다. SpectraMax M5 Microplate Reader (Molecular Devices)는 여기, 자동 차단 및 방출 파장이 각각 488 nm, 515 nm 및 525 nm로 설정하여 샘플을 읽는 데 사용된다. 총 RNA 및 유리 RNA는 적절한 표준 곡선에서 결정된다.
캡슐화 효율은 (총 RNA - 유리 RNA)/총 RNA로 계산된다. DNA 기반 카고 성분의 캡슐화 효율을 결정하는 데 동일한 절차를 사용할 수 있다. 단일 가닥 DNA의 경우 올리그린 염료 (Oligreen Dye)를 사용하고 이중 가닥 DNA의 경우 피코그린 염료 (Picogreen Dye)를 사용할 수 있다.
AF4-MALS는 분자량 및 크기 분포뿐만 아니라 이러한 계산에서 2차 통계를 보는 데 사용된다. LNP는 적절하게 희석되고 HPLC 자동 시료 주입기를 사용하여 AF4 분리 채널에 주입되어 초점을 맞춘 다음 채널을 가로 지르는 교차 흐름에서 지수 구배로 용출된다. 모든 유체는 HPLC 펌프 및 Wyatt Eclipse Instrument에 의해 구동된다. AF4 채널에서 용출되는 입자는 UV 검출기, 다중 각도 광 산란 검출기, 준 탄성 광 산란 검출기 및 시차 굴절률 검출기를 통과한다. 원 데이터는 Debeye 모델을 사용하여 처리되어 검출기 신호에서 분자량과 rms 반경을 결정한다.
LNP의 지질 성분은 하전 에어로졸 검출기 (CAD)에 연결된 HPLC에 의해 정량적으로 분석된다. 4가지 지질 성분의 크로마토그래피 분리는 역상 HPLC에 의해 달성된다. CAD는 모든 비휘발성 화합물을 검출하는 파괴적인 질량 기반 검출기이며 분석물 구조에 관계없이 신호가 일관된다.
Cas9 mRNA 및 gRNA 카고
Cas9 mRNA 카고는 시험관 내 전사에 의해 제조되었다. 1X NLS (서열 번호 3) 또는 PCT/US2019/053423 (본 명세서에 참조로 포함됨)의 표 24의 서열을 포함하는, 캡핑되고 폴리아데닐화된 Cas9 mRNA는 선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관 내 전사에 의해 생성되었다. 예를 들어, T7 프로모터 및 100 nt 폴리 (A/T) 영역을 함유하는 플라스미드 DNA는 다음 조건에서 XbaI와 함께 37℃에서 2시간 동안 배양하여 선형화할 수 있다: 200 ng/μL 플라스미드, 2 U/μL XbaI (NEB) 및 1x 반응 완충제. XbaI는 반응물을 65℃에서 20분 동안 가열하여 비활성화할 수 있다. 선형화된 플라스미드는 실리카 맥시 스핀 컬럼 (Epoch Life Sciences)을 사용하여 효소 및 완충 염으로부터 정제하고 아가로스 겔로 분석하여 선형화를 확인할 수 있다. Cas9 변형된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응은 다음 조건에서 37℃에서 4시간 동안 배양하여 수행할 수 있다: 50 ng/μL 선형화된 플라스미드; GTP, ATP, CTP 및 N1-메틸 유사-UTP (Trilink) 각각 2 mM; 10 mM ARCA (Trilink); 5 U/μL T7 RNA 폴리머라제 (NEB); 1 U/μL 뮤린 RNase 억제제 (NEB); 0.004 U/μL 무기 대장균 피로포스파타제 (NEB); 및 1x 반응 완충제. 4시간 배양 후 TURBO DNase (ThermoFisher)를 최종 농도 0.01 U/μL이 되도록 첨가하고, 반응물을 추가로 30분 동안 배양하여 DNA 주형을 제거했다. Cas9 mRNA는 LiCl 침전 함유 방법으로 정제되었다.
하기 실시예에서 sgRNA를 화학적으로 합성하였다.
생체 내 LNP 전달
6 내지 10주령의 CD-1 암컷 마우스를 각 연구에 사용했다. 그룹 평균 체중을 기준으로 투여 용액을 제조하기 위해 동물의 체중을 측정하고 체중에 따라 그룹화하였다. LNP는 동물 당 0.2 mL의 부피 (체중 킬로그램 당 약 10mL)로 측면 꼬리 정맥을 통해 투여되었다. 동물들은 투여 후 적어도 24시간 동안 주기적으로 부작용을 관찰했다.
간에서 생체 내 편집을 측정하는 연구를 위해, 달리 언급하지 않는 한 CD-1 암컷 마우스에 0.1 mpk를 투여했다. 동물은 이소플로우란 마취하에 심장 천자를 통한 외혈에 의해 6 또는 7일째에 안락사시켰다. DNA 추출 및 분석을 위해 각 동물에서 간 조직을 수집했다. 혈액을 혈청 분리기 튜브 또는 본원에 기재된 바와 같이 혈장용 완충 나트륨 시트레이트를 함유하는 튜브에 수집하였다. 차세대 염기서열 분석 (Next-Generation Sequencing; NGS)에 의한 편집을 위해 마우스 코호트를 측정했다.
NGS 시퀀싱
간단히 말해서, 게놈의 표적 위치에서 편집의 효율성을 정량적으로 결정하기 위해 게놈 DNA를 단리시키고 딥 시퀀싱 (deep sequencing)을 사용하여 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 유무를 확인했다.
PCR 프라이머는 표적 부위 (예: B2M) 주변에서 설계되었으며 관심 대상 게놈 영역이 증폭되었다. 시퀀싱에 필요한 화학을 추가하기 위해 제조업체의 프로토콜 (Illumina)에 따라 추가 PCR을 수행했다. 앰플리콘은 Illumina MiSeq 기기에서 시퀀싱되었다. 판독값은 품질 점수가 낮은 항목을 제거한 후 관련 참조 게놈 (예: GRCm38)에 정렬되었다. 판독값을 포함하는 결과 파일은 참조 게놈 (BAM 파일)에 매핑되었으며, 여기서 관심 대상 영역과 겹치는 판독값을 선택하고 삽입, 대체 또는 결실을 포함하는 판독의 수에 대한 야생형 판독의 수를 계산했다.
편집 백분율 (예: "편집 효율성"또는 "편집 백분율")은 야생형을 포함하여 총 서열 판독 수에 대한 삽입 또는 삭제가 있는 서열 판독의 총 수로 정의된다.
트랜스티레틴 (TTR) ELISA 분석
혈액을 수집하고 표시된 대로 혈청을 단리시켰다. 마우스 프리알부민 (트랜스티레틴) ELISA 키트 (Aviva Systems Biology, Cat. OKIA00111)를 사용하여 전체 마우스 TTR 혈청 수준을 결정했다. 간단히 말해, 혈청은 키트 샘플 희석제로, 예를 들어 최종 희석이 10,000배 및/또는 2,500배가 되도록 연속 희석하였다. 희석된 샘플을 ELISA 플레이트에 첨가한 다음 지시에 따라 검정을 수행했다. 치료 그룹의 혈청 TTR 데이터는 비히클 대조군 수준의 백분율로 표시된다.
실시예 116 - 생체 내 편집을 통한 지질 효능 평가
다양한 아민 지질 화합물을 포함하는 제형으로 전달된 물질에 대한 생체 내 편집 효율을 평가했다. 편집은 마우스 TTR 유전자를 표적으로 하는 G282 (서열 번호 1) 또는 마우스 B2M 유전자를 표적으로 하는 G650 (서열 번호 2)을 사용하여 측정하였다. 위에서 설명한 지질은 생체 내 편집 실험을 통해 효능에 대해 평가되었다. LNP는 sgRNA 대 Cas9 mRNA의 1:1 w/w 비율로, 약 6의 N/P 비로 제형화되었다. LNP의 지질 성분 중 지질의 몰 농도는 몰% 아민 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-2k-DMG, 예를 들어 50/10/38.5/1.5로 표시되었다. 최종 LNP는 상기 제공된 분석 방법에 따라 특성화하여 캡슐화 효율, 다분산 지수 및 평균 입자 크기를 결정하였다. 평균 입자 크기, 다분산도 (PDI), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율의 분석은 표 2에 나와 있다. 하기 이온화 가능한 지질의 pKa 값도 측정되었으며 표 1에 제공된다.
하기 실험 9에서, 화합물 7을 기반으로 하되, 도 1a에 예시된 바와 같이 화학식 (1A)의 R3 위치에 C6 사이클로알킬 또는 C4-12 알킬의 포함에 따라 달라지는 일련의 화합물을 시험하였다. 표 3 및 도 1b 및 1c에 나타낸 바와 같이, 시험한 6개의 화합물 모두 생체 내 편집에 효과적이었다. 화합물 7을 기반으로 한 화합물 시리즈의 추가 R3 기도 하기 실시예 119에서 시험한다.
Figure pct00399
Figure pct00400
Figure pct00401
표 3은 NGS로 측정한 마우스 간에서의 편집 백분율을 보여준다.
Figure pct00402
Figure pct00403
Figure pct00404
실시예 117 - 간에서의 편집의 용량 반응성
편집이 용량 반응성인지 평가하기 위해 다양한 LNP 용량 수준에서 생체 내 실험을 수행했다. 실시예 115의 Cas9 mRNA는 TTR을 표적으로 하는 sgRNA (G00282; 서열 1)와 함께 LNP로 제형화되었다. 이러한 LNP는 sgRNA 및 Cas9 mRNA의 1:1 w/w 비율로 제형화되었다. LNP는 6.0의 N/P 비로 표 4에 기재된 지질 몰 조성으로 교차 흐름 절차를 사용하여 제형화되었다.
LNP 조성물은 실시예 115에 기재된 바와 같이 RNA의 평균 입자 크기, 다분산도 (pdi), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율에 대해 분석되었다.
RNA의 평균 입자 크기, 다분산도 (PDI), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율 분석은 표 4에 나와 있다.
Figure pct00405
CD-1 암컷 마우스에게 0.1 mpk 또는 0.3 mpk로 정맥내 투여하고 간에서의 편집에 대해 평가되었다. 결과는 도 2 및 표 5에 나와 있다.
Figure pct00406
실시예 118
용량 확장성을 평가하기 위해 용량 반응 실험을 생체 내에서 수행했다. 실시예 115의 Cas9 mRNA는 TTR을 표적으로 하는 gRNA (G00282; 서열 번호 1)와 함께 LNP로 제형화되었다. 이들 LNP는 sgRNA 및 Cas9 mRNA의 1:1 w/w 비율을 사용하여 실시예 115에 기재된 바와 같이 제형화, 제조 및 분석되었다. 이러한 LNP에 대한 조성물 분석은 표 6에 설명되어 있다.
Figure pct00407
CD-1 암컷 마우스에게 0.1 mpk 또는 0.3 mpk로 정맥 내 투여하고, 간에서의 편집에 대해 평가되었다. 결과는 도 3a 및 도 3b 및 표 7에 나와 있다.
Figure pct00408
실시예 119 - 생체 내 편집을 통한 지질 전달 효능 평가
우리는 생체 내 편집 실험을 통해 가변 꼬리 길이를 가진 제형으로 전달된 물질에 대한 생체 내 편집 효율성을 평가했다. LNP는 마우스 TTR 유전자를 표적으로 하는 G502 (서열 번호 4)를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 제형화되었으며, 이는 편집을 측정하기 위해 사용되었다. 제형은 sgRNA 대 Cas9 mRNA를 1:2 w/w 비율로 함유했다. 최종 LNP의 특성은 표 8에 나와 있다. 이온화 가능한 지질의 pKa 값을 측정하고 표 1에 나타낸다.
실험 4에서, 도 4a에 도시된 바와 같이 화학식 (1A)의 R3 위치에 C5-12 알킬의 포함에 따라 달라지는 화합물 7에 기초한 일련의 화합물을 시험하였다. 표 9 및 도 4b 및 4c에서, 시험된 5개의 화합물은 모두 생체 내 편집에 효과적이었다.
실험 8에서, 도 5a에 예시된 바와 같이 화학식 (1A)의 R3 위치에 C5-12 알킬의 포함에 따라 달라지는 화합물 9에 기초한 일련의 화합물을 시험하였다. 실험 2는 R3 위치에 C4 알킬을 포함하는 이 일련의 화합물 287을 시험했다. 표 9 및 도 5b 및 5c에서, 시험된 이 일련의 모든 화합물은 생체 내 편집에 효과적이었다.
실험 3에서, 도 6a에 예시된 바와 같이 화학식 (1A)의 R3 위치에 C5-8 알킬의 포함에 따라 달라지는 화합물 46에 기초한 일련의 화합물을 시험하였다. 화합물 46은 R3 위치에 C12 알킬을 포함하고 있으며, 꼬리 길이를 달리한 화합물을 시험하였다. 표 9 및 도 6b 및 6c에 나타낸 바와 같이, C5 (화합물 72), C6 (화합물 50), C7 (화합물 76) 및 C8 (화합물 51) R3 기를 갖는 화합물은 생체 내 편집에 효과적이었다.
실험 7에서는 도 7a에 도시된 바와 같이 화학식 (1A)의 R3 위치에 C5-10 알킬의 포함에 따라 달라지는 화합물 5에 기초한 일련의 화합물을 시험하였다. 실험 2는 R3 위치에 C4 알킬을 포함하는 이 일련의 화합물 66을 테스트했다. 화합물 5는 R3 위치에 C12알킬을 포함하며, 실시예 116 및 118에서 생체 내 편집에 효과적인 것으로 나타났다. 표 9 및 도 7b 및 7c에 나타낸 바와 같이, 이 시리즈에서 시험된 모든 추가 화합물은 생체 내 편집에 효과적이었다.
실험 1에서, 도 8a에 도시된 바와 같이 화학식 (1A)의 위치 X1 및 Y1에서 변화하는 화합물 34에 기초한 일련의 화합물을 시험하였다. 화합물 52 및 화합물 34는 위치 Y1에서 디리놀레산기를 공유하고 위치 X1에 C0-1 알킬렌기의 포함에 따라 달라진다. 화합물 53, 화합물 54, 및 화합물 55는 위치 Y1에서 트리올기를 공유하고 위치 X1에 C0-2 알킬렌기의 포함에 따라 달라진다. 화합물 56, 화합물 57 및 화합물 58은 위치 Y1에서 20개의 원자 기를 공유하고 위치 X1에 C0-1 알킬렌기의 포함에 따라 달라진다. 화합물 59, 화합물 60 및 화합물 61은 위치 Y1에서 21개의 원자 기를 공유하고 위치 X1에 C0-2 알킬렌기의 포함에 따라 달라진다. 화합물 62, 화합물 63 및 화합물 64는 위치 Y1에서 이종 리놀레산 및 21개의 원자 기를 공유하고 위치 X1에 C0-2 알킬렌기의 포함에 따라 달라진다. 표 9 및 도 8b 및 8c에서, 시험된 모든 화합물은 생체 내 편집에 효과적이었다.
실험 5에서, 도 9a에 도시된 바와 같이 화학식 (1A)의 위치 X2에서 변화하는 화합물 50에 기초한 일련의 화합물을 시험하였다. 표 9 및 도 9b 및 9c에서, 시험된 모든 화합물은 0.1mpk 용량에서 생체 내 편집에 효과적이었다.
실험 6에서, 화합물 34에 기초한 일련의 화합물을 도 10a에 도시된 바와 같이 시험하였다. 화합물 86 및 화합물 99는 화합물 34와 화학식 (1A)의 X1 위치에서 상이하다. 화합물 103은 화학식 (1A)의 화합물 34와 R3 위치에서 상이하다. 화합물 87 및 화합물 88은 라세미 화합물 34의 R3 및 X1 위치 사이의 탄소에서 R- 및 S-에탄티오머 (etantiomer)를 나타낸다. 데이터는 표 9 및 도 10b 및 10c에 나타낸다. 마우스에서 시험된 이 시리즈의 모든 화합물은 생체 내 편집에 효과적이었다.
실험 9에서, 화합물 50에 기초한 일련의 화합물을 도 11a에 도시된 바와 같이 시험하였다. 화합물 90 및 화합물 89는 라세미 화합물 50의 R3 및 X1 위치 사이의 탄소에서 R- 및 S- 거울상 이성질체를 나타낸다. 화합물 100 및 화합물 107은 R3 및 X1 위치 모두에서 화합물 50와 다르다. 화합물 105, 화합물 106 및 화합물 108은 화합물 50과 R3 위치에서 상이하다. 데이터는 표 9 및 도 11b 및 11c에 나와 있다. 마우스에서 시험된 이 시리즈의 모든 화합물은 생체 내 편집에 효과적이었다.
Figure pct00409
Figure pct00410
Figure pct00411
표 9는 NGS로 측정한 마우스 간에서의 편집 백분율을 보여준다.
Figure pct00412
Figure pct00413
Figure pct00414
Figure pct00415
Figure pct00416
실시예 120. 생체 내 지질의 편집 효능 및 내약성
지질 효능을 평가하기 위해 용량 반응 실험을 생체 내에서 수행했다. 실시예 115의 Cas9 mRNA는 TTR을 표적으로 하는 gRNA (G00534; 서열 번호 5)를 사용하여 LNP로 제형화되었다. 이들 LNP는 sgRNA 및 Cas9 mRNA의 1:2 w/w 비율을 사용하여 실시예 115에 기재된 바와 같이 제형화, 제조 및 분석되었다. 이러한 LNP에 대한 조성 분석은 표 10에 설명되어 있다.
Figure pct00417
효능을 위해 Sprague Dawley 암컷 래트에게 0.1 mpk 또는 0.03 mpk로 정맥 내 투여하였다. 투여 6 내지 7일 후, 래트를 CO2 질식으로 안락사시켰다. 혈액은 혈청 분리기 튜브에 수집되었다. gDNA을 위해 간 생검이 처리되고 실시예 115에 기재된 NGS 방법에 의해 편집에 대해 평가하였다. 결과는 표 11 및 도 12a 및 12b에 제시되어 있다. 내약성을 위해, Sprague Dawley 암컷 래트를 6mpk로 투여하고 투여 후 24시간 째에 동물을 CO2 질식으로 안락사시켰다. 혈액을 혈청 분리기 튜브에 수집하고 간 효소 패널을 통해 간 효소 정량을 위해 외부 CRO로 보냈다. 결과는 표 12에 나와 있다.
Figure pct00418
Figure pct00419
실시예 121 - R 3 알킬 시리즈 화합물을 이용한 시험관 내 편집
화학식 (1A)의 R3 위치에 C4-12 알킬의 포함에 따라 달라지는 화합물 46에 기초한 일련의 화합물 (도 13a에 도시된 바와 같음)을 시험관 내 편집에 대해 시험하였다. 인간 간세포 암종 세포주 HUH7 (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank, Cat. JCRB0403)을 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양했다. 형질 감염 24시간 전에 세포를 96-웰 플레이트에 20,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다 (형질 감염시 ~ 80% 합류 (confluent)). LNP는 6.0의 N/P 비로 표 13에 기재된 지질 몰 조성으로 교차 흐름 절차를 사용하여 sgRNA 및 Cas9 mRNA의 1:2 w/w 비율로 제형화되었다. LNP 조성물은 실시예 115에 기술된 바와 같이 RNA의 평균 입자 크기, 다분산도 (pdi), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율에 대해 분석되었다. RNA의 평균 입자 크기, 다분산도 (PDI), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율의 분석이 표 13에 나타나 있다. LNP를 배지에 희석하고 37C에서 5분 동안 배양하고 웰당 2000 ng RNA의 용량으로 세포에 피펫팅했다. 각 조건은 생물학적 중복으로 검정하였다. 형질 감염 후 6시간 째에 세포를 수확하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 50 μL/웰 BuccalAmp DNA 추출 용액 (Epicentre, Cat. QE09050)을 사용하여 게놈 DNA를 추출했다. 모든 DNA 샘플은 위에서 설명한 바와 같이 G000502 표적 유전자좌에서 편집에 대해 PCR 및 후속 NGS 분석을 받았다. 표 14 및 도 13b에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 화합물은 시험관 내 편집에 효과적이었다.
Figure pct00420
Figure pct00421
Figure pct00422
Figure pct00423
Figure pct00424
Figure pct00425
SEQUENCE LISTING <110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC. <120> MODIFIED AMINE LIPIDS <130> ILH-00525 <140> PCT/US2019/064663 <141> 2019-12-05 <150> 62/775,783 <151> 2018-12-05 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 gacaagcacc agaaagacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 3 <211> 4516 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3 gggucccgca gucggcgucc agcggcucug cuuguucgug ugugugucgu ugcaggccuu 60 auucggaucc gccaccaugg acaagaagua cagcaucgga cuggacaucg gaacaaacag 120 cgucggaugg gcagucauca cagacgaaua caaggucccg agcaagaagu ucaagguccu 180 gggaaacaca gacagacaca gcaucaagaa gaaccugauc ggagcacugc uguucgacag 240 cggagaaaca gcagaagcaa caagacugaa gagaacagca agaagaagau acacaagaag 300 aaagaacaga aucugcuacc ugcaggaaau cuucagcaac gaaauggcaa aggucgacga 360 cagcuucuuc cacagacugg aagaaagcuu ccuggucgaa gaagacaaga agcacgaaag 420 acacccgauc uucggaaaca ucgucgacga agucgcauac cacgaaaagu acccgacaau 480 cuaccaccug agaaagaagc uggucgacag cacagacaag gcagaccuga gacugaucua 540 ccuggcacug gcacacauga ucaaguucag aggacacuuc cugaucgaag gagaccugaa 600 cccggacaac agcgacgucg acaagcuguu cauccagcug guccagacau acaaccagcu 660 guucgaagaa aacccgauca acgcaagcgg agucgacgca aaggcaaucc ugagcgcaag 720 acugagcaag agcagaagac uggaaaaccu gaucgcacag cugccgggag aaaagaagaa 780 cggacuguuc ggaaaccuga ucgcacugag ccugggacug acaccgaacu ucaagagcaa 840 cuucgaccug gcagaagacg caaagcugca gcugagcaag gacacauacg acgacgaccu 900 ggacaaccug cuggcacaga ucggagacca guacgcagac cuguuccugg cagcaaagaa 960 ccugagcgac gcaauccugc ugagcgacau ccugagaguc aacacagaaa ucacaaaggc 1020 accgcugagc gcaagcauga ucaagagaua cgacgaacac caccaggacc ugacacugcu 1080 gaaggcacug gucagacagc agcugccgga aaaguacaag gaaaucuucu ucgaccagag 1140 caagaacgga uacgcaggau acaucgacgg aggagcaagc caggaagaau ucuacaaguu 1200 caucaagccg auccuggaaa agauggacgg aacagaagaa cugcugguca agcugaacag 1260 agaagaccug cugagaaagc agagaacauu cgacaacgga agcaucccgc accagaucca 1320 ccugggagaa cugcacgcaa uccugagaag acaggaagac uucuacccgu uccugaagga 1380 caacagagaa aagaucgaaa agauccugac auucagaauc ccguacuacg ucggaccgcu 1440 ggcaagagga aacagcagau ucgcauggau gacaagaaag agcgaagaaa caaucacacc 1500 guggaacuuc gaagaagucg ucgacaaggg agcaagcgca cagagcuuca ucgaaagaau 1560 gacaaacuuc gacaagaacc ugccgaacga aaagguccug ccgaagcaca gccugcugua 1620 cgaauacuuc acagucuaca acgaacugac aaaggucaag uacgucacag aaggaaugag 1680 aaagccggca uuccugagcg gagaacagaa gaaggcaauc gucgaccugc uguucaagac 1740 aaacagaaag gucacaguca agcagcugaa ggaagacuac uucaagaaga ucgaaugcuu 1800 cgacagcguc gaaaucagcg gagucgaaga cagauucaac gcaagccugg gaacauacca 1860 cgaccugcug aagaucauca aggacaagga cuuccuggac aacgaagaaa acgaagacau 1920 ccuggaagac aucguccuga cacugacacu guucgaagac agagaaauga ucgaagaaag 1980 acugaagaca uacgcacacc uguucgacga caaggucaug aagcagcuga agagaagaag 2040 auacacagga uggggaagac ugagcagaaa gcugaucaac ggaaucagag acaagcagag 2100 cggaaagaca auccuggacu uccugaagag cgacggauuc gcaaacagaa acuucaugca 2160 gcugauccac gacgacagcc ugacauucaa ggaagacauc cagaaggcac aggucagcgg 2220 acagggagac agccugcacg aacacaucgc aaaccuggca ggaagcccgg caaucaagaa 2280 gggaauccug cagacaguca aggucgucga cgaacugguc aaggucaugg gaagacacaa 2340 gccggaaaac aucgucaucg aaauggcaag agaaaaccag acaacacaga agggacagaa 2400 gaacagcaga gaaagaauga agagaaucga agaaggaauc aaggaacugg gaagccagau 2460 ccugaaggaa cacccggucg aaaacacaca gcugcagaac gaaaagcugu accuguacua 2520 ccugcagaac ggaagagaca uguacgucga ccaggaacug gacaucaaca gacugagcga 2580 cuacgacguc gaccacaucg ucccgcagag cuuccugaag gacgacagca ucgacaacaa 2640 gguccugaca agaagcgaca agaacagagg aaagagcgac aacgucccga gcgaagaagu 2700 cgucaagaag augaagaacu acuggagaca gcugcugaac gcaaagcuga ucacacagag 2760 aaaguucgac aaccugacaa aggcagagag aggaggacug agcgaacugg acaaggcagg 2820 auucaucaag agacagcugg ucgaaacaag acagaucaca aagcacgucg cacagauccu 2880 ggacagcaga augaacacaa aguacgacga aaacgacaag cugaucagag aagucaaggu 2940 caucacacug aagagcaagc uggucagcga cuucagaaag gacuuccagu ucuacaaggu 3000 cagagaaauc aacaacuacc accacgcaca cgacgcauac cugaacgcag ucgucggaac 3060 agcacugauc aagaaguacc cgaagcugga aagcgaauuc gucuacggag acuacaaggu 3120 cuacgacguc agaaagauga ucgcaaagag cgaacaggaa aucggaaagg caacagcaaa 3180 guacuucuuc uacagcaaca ucaugaacuu cuucaagaca gaaaucacac uggcaaacgg 3240 agaaaucaga aagagaccgc ugaucgaaac aaacggagaa acaggagaaa ucgucuggga 3300 caagggaaga gacuucgcaa cagucagaaa gguccugagc augccgcagg ucaacaucgu 3360 caagaagaca gaaguccaga caggaggauu cagcaaggaa agcauccugc cgaagagaaa 3420 cagcgacaag cugaucgcaa gaaagaagga cugggacccg aagaaguacg gaggauucga 3480 cagcccgaca gucgcauaca gcguccuggu cgucgcaaag gucgaaaagg gaaagagcaa 3540 gaagcugaag agcgucaagg aacugcuggg aaucacaauc auggaaagaa gcagcuucga 3600 aaagaacccg aucgacuucc uggaagcaaa gggauacaag gaagucaaga aggaccugau 3660 caucaagcug ccgaaguaca gccuguucga acuggaaaac ggaagaaaga gaaugcuggc 3720 aagcgcagga gaacugcaga agggaaacga acuggcacug ccgagcaagu acgucaacuu 3780 ccuguaccug gcaagccacu acgaaaagcu gaagggaagc ccggaagaca acgaacagaa 3840 gcagcuguuc gucgaacagc acaagcacua ccuggacgaa aucaucgaac agaucagcga 3900 auucagcaag agagucaucc uggcagacgc aaaccuggac aagguccuga gcgcauacaa 3960 caagcacaga gacaagccga ucagagaaca ggcagaaaac aucauccacc uguucacacu 4020 gacaaaccug ggagcaccgg cagcauucaa guacuucgac acaacaaucg acagaaagag 4080 auacacaagc acaaaggaag uccuggacgc aacacugauc caccagagca ucacaggacu 4140 guacgaaaca agaaucgacc ugagccagcu gggaggagac ggaggaggaa gcccgaagaa 4200 gaagagaaag gucuagcuag ccaucacauu uaaaagcauc ucagccuacc augagaauaa 4260 gagaaagaaa augaagauca auagcuuauu caucucuuuu ucuuuuucgu ugguguaaag 4320 ccaacacccu gucuaaaaaa cauaaauuuc uuuaaucauu uugccucuuu ucucugugcu 4380 ucaauuaaua aaaaauggaa agaaccucga gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aucuag 4516 <210> 4 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4 acacaaauac caguccagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 5 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5 acgcaaauau caguccagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 6 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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Claims (96)

  1. 하기 화학식 IA의 화합물 또는 이의 염;
    Figure pct00426

    여기서, 각각의 발생에 대해 독립적으로,
    X1은 C1-3 알킬렌 또는
    Figure pct00427
    이고;
    X2 는 O, NH, NMe, 및 결합으로부터 선택되고,
    X3은 C2-4 알킬렌이고,
    X4는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
    X5는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
    R1은 C1-3 알킬이고,
    R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
    R2는 질소 원자 및 R1 또는 X3의 탄소 원자 중 어느 하나와 함께 취하여 4-원, 5-원, 또는 6-원 고리를 형성하고,
    Y1은 결합, -CH=CH-, -(C=O)O-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되고,
    Y2는 -CH2-CH=CH- 및 C3-C4 알킬렌으로부터 선택되고,
    R3은 H, C5-7 사이클로알킬, C8-C10 알케닐, 및 C3-18 알킬로부터 선택되고,
    R4는 C4-8 알킬이며,
    단, R2가 Me이고, R3이 선형 C12 알킬이고, X1이 C2 알킬렌이고, X2가 O이고, X3이 C3 알킬렌이고, X4가 결합이고, X5가 C1 알킬렌이고, Y1이 시스 -CH=CH-이고, -Y2-R4가 시스 -CH2-CH=CH-(C-5-알킬)일 때, R1은 C2-3 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 염이되:
    Figure pct00428

    여기서, 각각의 발생에 대해 독립적으로,
    X1은 C2-3 알킬렌이고,
    X2는 O, NH, NMe, 및 결합으로부터 선택되고,
    X3은 C2-4 알킬렌이고,
    X4는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
    X5는 C1 알킬렌 또는 결합이고,
    R1은 C1-2 알킬이고,
    R2는 C1-2 알킬이거나, 또는
    R2는 질소 원자 및 R1 또는 X3의 탄소 원자 중 어느 하나와 함께 취하여 5-원 또는 6-원 고리를 형성하고,
    Y1은 -CH=CH-, -(C=O)O-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되고,
    R3은 H, C5-7 사이클로알킬, 및 C3-18 알킬로부터 선택되고,
    R4는 C4-7 알킬이며,
    단, R2가 Me이고, R3이 선형 C12 알킬이고, X1이 C2 알킬렌이고, X2가 O이고, X3이 C3 알킬렌이고, X4가 결합이고, X5가 C1 알킬렌이고, Y1이 시스 -CH=CH-이고, R4가 C5 알킬일 때, R1은 C2 알킬인, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화합물은 거울상 이성질체적으로 풍부하거나 부분 입체 이성질체적으로 풍부한, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 C2 알킬렌인, 화합물.
  5. 제1항에 있어서, X1이 C1 알킬렌인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 선형 C3 알킬렌인, 화합물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 분지형 C3 알킬렌인, 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 NH인, 화합물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 O인, 화합물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 NMe인, 화합물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 결합인, 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 C2-3 알킬렌인, 화합물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 C3-4 알킬렌인, 화합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R2 및 X3의 탄소 원자가 함께 취하여 4-원 고리를 형성하는, 화합물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R2 및 X3의 탄소 원자가 함께 취하여 5-원 고리를 형성하는, 화합물.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R2 및 X3의 탄소 원자가 함께 취하여 6-원 고리를 형성하는, 화합물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C1 알킬인, 화합물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C2 알킬인, 화합물.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2가 함께 4-원 고리를 형성하는, 화합물.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2가 함께 5-원 고리를 형성하는, 화합물.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2가 함께 6-원 고리를 형성하는, 화합물.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 C1 알킬인, 화합물.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 C2 알킬인, 화합물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 선형 C8-16 알킬인, 화합물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 선형 C7-12 알킬인, 화합물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 선형 C7-9 알킬인, 화합물.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 선형 C3-6 알킬인, 화합물.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 분지형 C6-10 알킬인, 화합물.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 C5-7 사이클로알킬인, 화합물.
  30. 제29항에 있어서, R3이 C6 사이클로알킬인, 화합물.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 C8-10 알케닐인, 화합물.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 H인, 화합물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 선형 C5-6 알킬인, 화합물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, X4가 결합인, 화합물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, X5가 C1 알킬렌인, 화합물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 (IA)의 화합물이고; Y2-R4가 -CH2-CH=CH-R4인, 화합물.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 (IA)의 화합물이고; Y2가 선형 C3 알킬렌인, 화합물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, Y1이 결합, -CH=CH-, 및 -O(C=O)-로부터 선택되는, 화합물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, Y1이 -CH=CH- 및 -O(C=O)-로부터 선택되는, 화합물.
  40. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 II의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00429
  41. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 III의 화합물인, 화합물;
    Figure pct00430
  42. 화합물 제1항에 있어서, 상기 화합물이:
    Figure pct00431

    Figure pct00432

    Figure pct00433

    Figure pct00434

    Figure pct00435

    Figure pct00436

    Figure pct00437

    Figure pct00438

    Figure pct00439

    Figure pct00440

    Figure pct00441

    Figure pct00442

    Figure pct00443

    Figure pct00444

    Figure pct00445

    Figure pct00446

    Figure pct00447

    Figure pct00448

    Figure pct00449

    Figure pct00450

    Figure pct00451

    Figure pct00452

    Figure pct00453

    Figure pct00454

    Figure pct00455

    Figure pct00456

    Figure pct00457

    Figure pct00458

    또는 이의 염으로부터 선택되는, 화합물.
  43. 제1항에 있어서, 상기 화합물이:
    Figure pct00459

    또는 이의 염으로부터 선택되는, 화합물.



  44. 제1항에 있어서, 상기 화합물이
    Figure pct00460

    Figure pct00461

    Figure pct00462

    Figure pct00463

    또는 이의 염으로부터 선택되는, 화합물.
  45. 제1항에 있어서, 상기 화합물이
    Figure pct00464

    Figure pct00465

    Figure pct00466
    또는 이의 염으로부터 선택되는, 화합물.
  46. 제1항에 있어서, 상기 화합물이
    Figure pct00467

    Figure pct00468

    Figure pct00469
    또는 이의 염으로부터 선택되는, 화합물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염이 약제학적으로 허용되는 염인, 화합물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상기 화합물의 양성자화된 형태의 pKa가 약 5.1 내지 약 8.0인, 화합물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상기 화합물의 양성자화된 형태의 pKa가 약 5.6 내지 약 7.2인, 화합물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상기 화합물의 pKa가 약 5.7 내지 약 6.5인, 화합물.
  51. 지질 성분에 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 지질 성분이 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 화합물을 약 50 중량% 포함하는, 조성물.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 조성물이 LNP 조성물인, 조성물.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 성분이 헬퍼 지질 및 PEG 지질을 포함하는, 조성물.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 성분이 헬퍼 지질, PEG 지질, 및 중성 지질을 포함하는, 조성물.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 보호제를 추가로 포함하는, 조성물.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제를 추가로 포함하는, 조성물.
  58. 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 생물학적 활성제를 포함하는 수성 성분을 추가로 포함하는, 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 폴리펩타이드를 포함하는, 조성물.
  60. 제58항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 핵산을 포함하는, 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 핵산이 RNA를 포함하는, 조성물.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 조성물이 약 3 내지 10의 N/P 비를 갖는, 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 N/P 비가 약 6 ± 1인, 조성물.
  64. 제62항에 있어서, 상기 N/P 비가 약 6 ± 0.5인, 조성물.
  65. 제62항에 있어서, 상기 N/P 비가 약 6인, 조성물.
  66. 제51항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분을 포함하고, 상기 RNA 성분이 mRNA를 포함하는, 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 RNA 성분이 Cas 뉴클레아제 mRNA와 같은 RNA 유도 DNA 결합제를 인코딩하는 서열을 포함하는, 조성물.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 RNA 성분이 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는, 조성물.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 성분이 Cas9 뉴클레아제 mRNA를 포함하는, 조성물.
  70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 성분이 변형된 RNA를 포함하는, 조성물.
  71. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 성분이 gRNA 핵산을 포함하는, 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 상기 gRNA 핵산이 gRNA인, 조성물.
  73. 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 성분이 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 gRNA를 포함하는, 조성물.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA 핵산이 이중-가이드 RNA (dgRNA)이거나 이를 인코딩하는, 조성물.
  75. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA 핵산이 단일-가이드 RNA (sgRNA)이거나 이를 코딩하는, 조성물.
  76. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA가 변형된 gRNA인, 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 변형된 gRNA가 5' 말단에서 처음 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 조성물.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 변형된 gRNA가 3' 말단에서 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 조성물.
  79. 제58항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 주형 핵산을 추가로 포함하는, 조성물.
  80. 세포를 제51항 내지 제79항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 유전자 편집 방법.
  81. 세포를 제51항 내지 제80항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 DNA 절단 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 접촉 단계가 단일 가닥 DNA 닉을 초래하는, 방법.
  83. 제81항에 있어서, 상기 접촉 단계가 이중 가닥 DNA 절단을 초래하는, 방법.
  84. 제81항에 있어서, 상기 조성물이 클래스 2 Cas mRNA 및 gRNA 핵산을 포함하는, 방법.
  85. 제80항 또는 제84항에 있어서, 적어도 하나의 주형 핵산을 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 세포를 주형 핵산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  88. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  89. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인, 방법.
  91. 제80항에 있어서, 상기 방법이 mRNA, gRNA, gRNA 핵산 및 주형 핵산 중 하나 이상을 포함하는 제1 LNP 조성물 및 제2 LNP 조성물로 제형화된 mRNA를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 제1 및 제2 LNP 조성물을 동시에 투여하는, 방법.
  93. 제91항에 있어서, 제1 및 제2 LNP 조성물을 순차적으로 투여하는, 방법.
  94. 제91항에 있어서, 단일 LNP 조성물로 제형화된 mRNA 및 gRNA 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  95. 제80항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집이 유전자 녹아웃을 초래하는, 방법.
  96. 제80항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집이 유전자 교정을 초래하는, 방법.








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