CN114213347B - 一种双价可电离脂质化合物、组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及核酸药物递送技术领域，特别是关于一种双价可电离脂质化合物、组合物及其应用。本发明提供多种可以递送核酸药物的可电离阳离子脂质，具备较强的可设计性、可生物降解性及高效的体内外转染效率，由其组成的脂质纳米递送系统用于递送mRNA，在细胞水平上，优于目前上市的产品，并且在动物水平也具有良好的递送效率，可以作为核酸药物的递送新的方法，促进核酸药物的发展。

Description

一种双价可电离脂质化合物、组合物及其应用
技术领域
本发明涉及核酸药物递送技术领域，特别是关于一种双价可电离脂质化合物、组合物及其应用。
背景技术
核酸药物作为一大类新兴的药物领域，具有设计快、应用广、安全性高等特点，是未来药物发展的主要方向之一。然而，由于核酸药物自身的细胞穿透性差并且容易降解，导致核酸药物的体内应用面临巨大的挑战。因此，需要开发特定的化合物及递送系统来改善这一现状，以促进核酸药物可以作为疾病预防和治疗的重要手段。目前，可电离的阳离子脂质制备的脂质体是递送核酸药物比较安全和有效的手段，但是已上市的可用的可电离脂质还很少，还需要大量设计和筛选，而且更优的递送效率还在不断探索阶段。
核酸药物递送作为核酸药物发展的主要挑战之一，目前上市产品非常少，已上市应用的可电离阳离子脂质只有3个，包括Dlin-MC3、SM-102、ALC-0315。其中Dlin-MC3制备的脂质纳米主要用于递送siRNA，而SM-102或ALC-0315组成的脂质纳米粒都是用于mRNA的递送。虽然还有几个国内药企已经公布他们的申请专利，但是还没有转染效果很好的可电离阳离子脂质可以高效递送mRNA等核酸药物。
上述背景技术旨在辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日前已公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请技术方案的新创性。
发明内容
为解决上述背景技术中提及的至少一种技术问题，本发明的目的旨在开发多种可以递送核酸药物的可电离阳离子脂质，具备较强的可设计性、可生物降解性及高效的体内外转染效率，由其组成的脂质纳米递送系统用于递送mRNA，在细胞水平上，优于目前上市的产品，并且在动物水平也具有良好的递送效率，可以作为核酸药物的递送新方法，促进核酸药物的发展。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案。
一种双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐，所述双价可电离脂质化合物具有如式(010301)、(030301)或(040301)所示结构，
Figure 156445DEST_PATH_IMAGE002
Figure 11268DEST_PATH_IMAGE004
Figure 56585DEST_PATH_IMAGE005
。
所述其药物可用的盐是指酸加成盐和/或碱加成盐。
组合物，包括
治疗和/或预防剂；和
用于递送所述治疗和/或预防剂的载体；
所述载体包括阳离子脂质，
所述阳离子脂质包括上述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐。
所述治疗和/或预防剂是核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质的至少一种。
所述载体还包括磷脂、结构性脂质或聚乙二醇化脂质的至少一种。
所述载体还包括磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质。
所述载体与治疗和/或预防剂的质量比是0.01-1000:1。
一种阳离子脂质体，
1)由前述所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐制得；或
2)由前述所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐与辅脂制得；
所述辅脂包括磷脂、结构性脂质或聚乙二醇化脂质的至少一种。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
本发明的有益效果为：
开发了多种双价可电离脂质化合物，具有可生物降解、可设计、可转染的特性，由其组成的脂质纳米递送系统用于递送mRNA，在细胞水平上，优于目前上市的产品(由SM-102组成的以及由Dlin-MC3组成的)，并且在动物水平也具有良好的递送效率，可以作为核酸药物的递送新的方法，促进核酸药物的发展。
本发明为实现上述目的而采用了上述技术方案，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
为让本发明的上述和/或其他目的、特征、优点与实例能更明显易懂，所附附图的说明如下：
图1是Mon-01合成步骤中a1的氢谱图；
图2是Mon-01合成步骤中a2的氢谱图；
图3是Mon-01合成步骤中a3的氢谱图；
图4是Mon-01合成步骤中a4的氢谱图；
图5是Mon-01合成步骤中a5的氢谱图；
图6是Mon-01合成步骤中a7的氢谱图；
图7是Mon-01的氢谱图；
图8是疏水脂肪链尾部T-4-7合成步骤中T-2-3的氢谱图；
图9是疏水脂肪链尾部T-4-7合成步骤中T-2-4的氢谱图；
图10是疏水脂肪链尾部T-4-7合成步骤中T-2-5的氢谱图；
图11是疏水脂肪链尾部T-4-7合成步骤中T-2-6的氢谱图；
图12是疏水脂肪链尾部T-4-7的氢谱图；
图13是双价阳离子脂质化合物010301合成步骤中0103的氢谱图；
图14是双价阳离子脂质化合物010301的氢谱图；
图15是双价阳离子脂质化合物030301的氢谱图；
图16是双价阳离子脂质化合物040301的氢谱图；
图17是可电离阳离子脂质纳米复合物(N/P=4:1)转染细胞的荧光图；
图18是可电离阳离子脂质(N/P=8:1)纳米复合物转染细胞的荧光图；
图19是可电离阳离子脂质纳米复合物(N/P=6:1)转染不同细胞的荧光图；
图20是可电离阳离子脂质纳米复合物(N/P=8:1)转染不同细胞的荧光图；
图21是双价可电离阳离子脂质纳米复合物体内递送mRNA的小动物荧光成像图；
图22是不同双价可电离阳离子脂质纳米复合物递送S mRNA疫苗的表达量示意图。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当替换和/或改动工艺参数实现，然而特别需要指出的是，所有类似的替换和/或改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和制备方法已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非具体说明，本文所描述的材料、方法和实例仅是示例性的，而非限制性的。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试，但本文仍描述了合适的方法和材料。
一种双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐，所述双价可电离脂质化合物具有如式(010301)、(030301)或(040301)所示结构，
Figure 920635DEST_PATH_IMAGE007
Figure 436805DEST_PATH_IMAGE008
Figure 728109DEST_PATH_IMAGE009
。
所述其药物可用的盐是指酸加成盐和/或碱加成盐。
所述酸加成盐选自盐酸盐、醋酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对苯磺酸盐、萘磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、乙酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、水杨酸盐、樟脑酸盐、草酸盐、苯基乙酸盐或杏仁酸盐的至少一种。
所述碱加成盐选自钠盐、钾盐、锂盐、铍盐、镁盐、钙盐、锶盐、钡盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐或铵盐的至少一种。
组合物，包括
治疗和/或预防剂；和
用于递送所述治疗和/或预防剂的载体；
所述载体包括阳离子脂质，
所述阳离子脂质包括上述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐。
所述治疗和/或预防剂是核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质的至少一种。
所述载体还包括磷脂、结构性脂质或聚乙二醇化脂质的至少一种。
所述载体还包括磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质。
所述载体与治疗和/或预防剂的质量比是0.01-1000:1，优选质量比是0.3-100:1。
所述载体中的阳离子脂质与治疗和/或预防剂具有2-100:1的氮磷比(N/P)。
所述载体中，阳离子脂质的摩尔含量是10-100%。
所述载体中，磷脂的摩尔含量是0-50%。
所述载体中，结构性脂质的摩尔含量是0-50%。
所述载体中，聚乙二醇化脂质的摩尔含量是0-50%。
磷脂选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐、二棕榈酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱或溶血磷脂酰乙醇胺中的至少一种。
结构性脂质选自胆固醇、β谷甾醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、番茄素、熊果酸或α-生育酚中的至少一种。
聚乙二醇化脂质选自PEG改性的二肉豆蔻酰甘油、PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油或PEG改性的二烷基甘油的至少一种。
所述磷脂优选1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
所述结构性脂质优选胆固醇。
所述聚乙二醇化脂质优选PEG改性的二肉豆蔻酰甘油(DMG-PEG) 或PEG改性的磷脂酰乙醇胺(PE-PEG)的至少一种。
所述聚乙二醇化脂质更优选DMG-PEG2000。
阳离子脂质、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比是10-100:0-50:0-50:0-50，优选10-60:0-30:25-50:0.5-15，更优选30-60:5-25:30-45:0.5-5，最优选50:10:38.5:1.5。
所述组合物具体是脂质纳米复合物。
所述脂质纳米复合物的粒径是40-400nm，Zeta电位是-30至30mV。
一种阳离子脂质体，其
1)由前述所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐制得；或
2)由前述所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐与辅脂制得；
所述辅脂包括磷脂、结构性脂质或聚乙二醇化脂质的至少一种。
一种试剂，包括前述所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐、组合物或阳离子脂质体。
一种试剂盒，包括前述所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐、组合物或阳离子脂质体。
一种制剂，包括前述所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐、组合物或阳离子脂质体。
一种药物组合物，包括前述所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐、组合物或阳离子脂质体。
前述所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐，或所述组合物，或所述试剂，或所述试剂盒，或所述制剂，或所述药物组合物的应用，包括：
1)制备核酸药物、疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物；和/或
2)包封活性物质；和/或
3)将活性物质递送至所需细胞、组织或器官；和/或
4)使活性物质在细胞、组织或器官中发挥出活性。
应当明确的是，本申请所述各基团、盐及其他生物化学物质均为本领域常规，应当按照本领域常规进行理解，再次不予赘述。
需要说明的是，本申请010301、030301及040301所示的脂质化合物均具有下式所示的核心结构：
Figure 260722DEST_PATH_IMAGE011
。
本发明具体实施例中，所使用的原料均可通过市售获得。
以下详细描述本发明。
实施例1：
Mon-01合成：
Mon-01的合成路线是：
Figure 928463DEST_PATH_IMAGE012
。
步骤1：a1的合成：
在250mL的烧瓶中，称取a0(10.00g)、NBS(1.1eq)溶于100mL的DMF，升温至100℃，反应40min；点板监测反应进度，反应完全进行后处理；冷却至室温，反应液倒入300mL冰水，搅拌，抽滤，水洗，干燥，烘干得亮黄色固体(13.4g，96.7%收率)。化合物氢谱见附图1。1HNMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 13.30 (s, 2H), 8.06 (s, 2H)。
步骤2：a2的合成：
称取a1(10.00g)溶于100mL的THF，冰浴搅拌15min；冰浴下，滴加BH3/THF(1.0M，6eq)，滴加完毕后恢复室温，搅拌过夜；点板监测反应进度，反应完全进行后处理；饱和NH4Cl淬灭，EA萃取(500mL*2)，饱和NaHCO3洗涤，水洗，盐水洗，干燥，浓缩(8.21g，92.1%收率)。化合物氢谱见附图2。1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.17 (s, 2H), 5.18 (t, J =5.5 Hz, 2H), 4.89 (s, 2H), 4.39 (d, J = 5.4 Hz, 4H)。
步骤3：a3的合成：
称取NaH(2.5eq)溶于100mL的THF，冰浴搅拌15min；称取a2(10.00g)溶于50mL的THF，冰浴下加入反应液；称取TBSCl(2.5eq)溶于50mL的THF，冰浴下滴加至反应液，升至室温反应3h；点板监测反应进度，反应完全进行后处理；冰浴下，加200mL冰水淬灭，EA萃取(500mL)，水洗，盐水洗，干燥，浓缩；过柱纯化(16.53g，83.2%收率)。化合物氢谱见附图3。1HNMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.03 (s, 2H), 4.73 (d, J = 14.3 Hz, 2H), 4.57(s, 4H), 0.82 (s, 18H), 0.08 (s, 12H)。
步骤4：a4的合成：
称取a3(10.00g)，PdCl2(PPh3)2(5%eq)，PPh3(12%eq)，CuI(5%eq)于史莱克反应瓶中，抽氮气置换三次；称取TMS炔(1.5eq)和100mL的无水TEA加入反应瓶，升温至60oC反应过夜；点板监测反应进度，反应完全进行后处理；抽滤，EA洗涤(300mL)，水洗，盐水洗，干燥，浓缩；过柱纯化(7.09g，68.3%收率)。化合物氢谱见附图4。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d)δ 7.05 (s, 2H), 5.03 (s, 2H), 4.60 (s, 4H), 0.83 (s, 18H), 0.18 (s, 9H), 0.00(s, 12H)。
步骤5：a5的合成：
在250mL的反应瓶中，称取a4(8.00g)和K2CO3(0.55eq)加入200mL的MeOH于反应瓶，搅拌2h；点板监测反应进度，反应完全进行后处理；浓缩，EA重新溶解后，过柱纯化(6.67g，98.2%收率)。化合物氢谱见附图5。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.07 (s, 2H),4.99 (s, 2H), 4.61 (s, 4H), 2.88 (s, 1H), 0.83 (s, 18H), 0.00 (s, 12H)。
步骤6：a7的合成：
称取a5(3.00g)和DMAP(2.5eq)溶于70mL的无水DCM；冰浴下，称取三光气(0.35eq)溶于20mL的无水DCM滴加入反应液；滴加完毕，升至室温搅拌过夜，直接进行下一步反应；称取邻硝基苄醇(2.0eq)溶于20mL的无水DCM滴加入反应；点板监测反应进度，反应完全进行后处理；旋干溶剂，过柱纯化(3.46g，80.0%收率)。化合物氢谱见附图6。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 8.06 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.58 (s, 2H), 7.39(s, 3H), 5.52 (s, 2H), 4.59 (s, 4H), 2.98 (s, 1H), 0.83 (s, 18H), 0.00 (s,12H)。
步骤7：Mon-01的合成：
称取a7(3.00g)和等质量的树脂溶于100mL的DCM/MeOH=4/3；室温搅拌过夜；点板监测反应进度，反应完全进行后处理；过滤，旋干溶剂，a8直接进行下一步反应。称取NPCl(3.0eq)溶于30mL的无水DCM，冰浴搅拌5min冰浴下，称取吡啶(3.0eq)溶于15mL的无水DCM滴加入反应液，冰浴10min，有白色沉淀生成，将a8溶于15mL的无水DCM，滴加于反应液，点板检测反应进度，反应完全后处理；旋干溶剂，拌样，过柱纯化(2.85g，80.1%收率)即得Mon-01。化合物氢谱见附图7(即Mon-UV)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.71 (s, 1H), 8.37– 8.26 (m, 4H), 8.12 (dd, J = 8.9, 2.9 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 18.5 Hz, 4H),7.55 (d, J = 8.8 Hz, 5H), 5.47 (d, J = 15.0 Hz, 2H), 5.33 (s, 4H), 4.38 (s,1H)。
合成获得Mon-03、Mon-04的合成路线与Mon-01的合成路线相近，将“步骤6：a7的合成”步骤中的邻硝基苄醇分别替换为对硝基苄醇、苄醇并依据相应步骤即可得到Mon-03、Mon-04。
实施例2：
疏水脂肪链尾部T-4-7的合成：
T-4-7的合成路线：
Figure 66184DEST_PATH_IMAGE014
步骤1：T-2-2的合成：
在250mL的单口瓶中，称取T-2-1(2.22g，10mmol)溶于30mL的无水DMSO，10oC搅拌5min，加入TosMIC(195.03，0.98g，5mmol)，搅拌5min，分批加入NaH(0.48g，12mmol),最后加入TBAI(369.37，0.37g，1mmol)，缓慢升至室温搅拌过夜，点板监测反应进度(PE：EA=49：1)，反应完全，将反应液在冰水浴中冷却，缓慢加入80mL冰水淬灭，用DCM萃取(60mL*3)，合并有机相，80mL的水洗，饱和碳酸氢钠洗(80mL*2)，盐水洗，干燥，浓缩得T-2-2粗产物，直接进行下一步反应。
步骤2：T-2-3的合成：
在100mL的单口瓶中，T-2-2溶于30mL的DCM，搅拌5min，加入5mL的浓盐酸，室温搅拌30min，点板监测反应进度(PE：EA=9：1)，反应完全进行后处理，向反应液中加入30mL的水，分层，水层再用30mL的DCM萃取，合并有机相，有机相用30mL饱和碳酸氢钠洗，盐水洗，干燥，浓缩，过柱纯化(1.25g，两步80.0%收率)。化合物氢谱见附图8。1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6) δ 4.04 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 2.39 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 2.26 (t, J =7.4 Hz, 4H), 1.47 (dp, J = 22.5, 7.4 Hz, 8H), 1.26 – 1.19 (m, 4H), 1.17 (t, J= 7.1 Hz, 6H)。
步骤3：T-2-4的合成：
在100mL的单口瓶中，称取T-2-3(1.57g，5mmol)和KOH(56.11，1.12g，20mmol)溶于50mL的乙醇/水=4:1，加热回流5h，点板监测反应进度反应完全，旋干乙醇，剩余反应液用2M的HCl酸化至pH~2，用DCM萃取(60mL*3)，合并有机相，饱和盐水洗，干燥，浓缩，过柱纯化(1.12g，87%收率)。化合物氢谱见附图9。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 2.39 (t, J = 7.3Hz, 4H), 2.19 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.53 – 1.39 (m, 8H), 1.28 – 1.16 (m, 4H)。
步骤4：T-2-5的合成：
在100mL的单口瓶中，称取T-2-4(1.29g，5mmol)，DMAP(122.17，1.84g，15mmol)和辛醇(298.32，5.22g，17.5mmol)溶于40mL的DCM，搅拌5min，加入EDCI(191.7，2.88g，15mmol)，室温搅拌过夜，点板监测反应进度(PE：EA=4：1)，反应完全，进行后处理，水洗(40mL*3)，饱和盐水洗，干燥，浓缩，过柱纯化(3.07g，75.0%收率)。化合物氢谱见附图10。1HNMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 3.96 (d, J = 5.8 Hz, 4H), 2.39 (t, J = 7.4 Hz,4H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.60 (ddt, J = 15.7, 8.1, 4.3 Hz, 10H), 1.27(d, J = 4.7 Hz, 68H), 0.90 – 0.86 (m, 12H)。
步骤5：T-2-6的合成：
在100mL的单口瓶中，称取T-2-5(1.64g，2mmol)溶于30mL的甲醇，0oC搅拌5min，分批加入NaBH4(37.83，0.076 g，2mmol)，0oC下反应4小时，点板监测反应进度(PE：EA=19：1)，反应完全进行后处理，反应瓶中加入50mL的冰水，DCM萃取(50mL*3)，合并有机相用饱和盐水洗，干燥，浓缩，过柱纯化(1.54g，94.0%收率)。化合物氢谱见附图11。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 3.96 (dd, J = 5.7, 1.6 Hz, 4H), 3.57 (dq, J = 14.5, 5.3 Hz,1H), 2.30 (td, J = 7.5, 2.6 Hz, 4H), 1.62 (dtt, J = 10.7, 7.6, 3.6 Hz, 8H),1.47 – 1.42 (m, 4H), 1.34 – 1.23 (m, 70H), 0.91 – 0.85 (m, 12H)。
步骤6：T-4-7的合成：
在100mL的单口瓶中，称取叠氮戊酸(143.07，0.14g，1mmol)，T-2-6(1.0g，1.2mmol)，DMAP(122.17，0.15g，1.2mmol)溶于40mL的DCM，搅拌5min，加入EDCI(191.7，0.23g，1.2mmol)，室温搅拌过夜，点板监测反应进度(PE：EA=9：1)，反应完全，进行后处理，水洗(30mL*3)，饱和盐水洗，干燥，浓缩，过柱纯化(0.86g，92.0%收率)。化合物氢谱见附图12。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.87 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 3.96 (d, J =5.8 Hz, 4H), 3.30 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.31 (dt, J = 15.9, 7.3 Hz, 6H), 1.77– 1.67 (m, 2H), 1.66 – 1.56 (m, 8H), 1.54 – 1.47 (m, 4H), 1.35 – 1.22 (m,72H), 0.89 (d, J = 6.7 Hz, 12H)。
实施例3：
二价阳离子脂质化合物010301合成：
010301合成路线：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
步骤一：0103的合成：
称取阳离子基团化合物(6.0eq)和DIEA(340mg，6.0eq)溶于35mL的DCM，室温搅拌；称取Mon-01(300mg，0.43mmol)溶于15mL的DCM加入反应液，点板检测反应进度，反应完全后处理；水洗、盐水洗，干燥、浓缩，拌样过柱纯化。0103化合物氢谱见附图13。1H NMR (400MHz, Chloroform-d) δ 8.51 (s, 1H), 8.13 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.73 (s, 2H),7.52 (d, J = 3.6 Hz, 3H), 5.91 (s, 1H), 5.62 (s, 2H), 5.08 (s, 4H), 3.74 (t,J = 4.6 Hz, 8H), 3.18 (q, J = 6.3 Hz, 4H), 3.09 (s, 1H), 2.42 (d, J = 34.5Hz, 12H), 1.57 (d, J = 7.3 Hz, 8H)。
步骤二：010301的合成：
在10mL的单口瓶中，称取0103(0.028mmol)和T-4-7(110mg，4eq)溶于2mL的DCM，加入碘化亚铜(5mg，1.0eq)和DIEA(4mg，1.0eq)于反应液；搅拌过夜，反应完全就行后处理，旋干溶剂，过柱纯化。010301化合物氢谱见附图14。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ8.05 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.74 – 7.56 (m, 2H), 7.43(q, J = 10.6, 7.8 Hz, 1H), 5.90 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 5.55 (s, 2H), 5.07 (s,3H), 4.79 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 4.35 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.89 (d, J = 5.7 Hz,4H), 3.64 (t, J = 4.6 Hz, 6H), 3.57 (s, 1H), 3.10 (q, J = 6.2 Hz, 3H), 2.43 –2.32 (m, 7H), 2.32 – 2.25 (m, 5H), 2.22 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.94 (dq, J =12.4, 7.3 Hz, 2H), 1.62 (tt, J = 8.2, 4.5 Hz, 3H), 1.57 – 1.38 (m, 17H), 1.19(d, J = 6.5 Hz, 68H), 0.85 – 0.74 (m, 12H)。
实施例4：二价阳离子脂质化合物030301合成：
030301合成路线：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
030301合成步骤与010301合成步骤相同，仅需将相应反应物进行替换即可。
030301化合物氢谱见附图15。1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 8.37 (s, 1H),8.28 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.92 (s, 2H), 7.69 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 5.34 (s,2H), 5.13 (s, 4H), 4.49 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.97 (d, J = 5.6 Hz, 4H), 3.66(dt, J = 9.4, 4.6 Hz, 10H), 3.13 (s, 5H), 2.50 – 2.23 (m, 20H), 2.01 (p, J =7.0 Hz, 2H), 1.72 – 1.44 (m, 22H), 1.29 (d, J = 3.6 Hz, 70H), 0.95 – 0.82 (m,12H)。
实施例5：二价阳离子脂质040301合成：
040301合成路线：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
040301合成步骤与010301合成步骤相同，仅需将相应反应物进行替换即可。
040301化合物氢谱见附图16。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.53 (s,1H), 8.12 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.00 – 7.61 (m, 5H), 7.48 (q, J = 8.1 Hz, 1H),6.19 (s, 1H), 5.62 (s, 2H), 5.12 (s, 4H), 4.84 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 4.42 (q,J = 7.5 Hz, 2H), 3.94 (d, J = 5.8 Hz, 4H), 3.15 (s, 4H), 2.76 – 2.52 (m, 8H),2.51 – 2.39 (m, 4H), 2.31 (dt, J = 30.1, 7.4 Hz, 6H), 2.00 (p, J = 7.3 Hz,2H), 1.71 – 1.44 (m, 36H), 1.25 (d, J = 10.1 Hz, 70H), 0.86 (t, J = 6.7 Hz,12H)。
实施例6：脂质纳米复合物(LNP制剂)的制备和检测：
由本专利合成的双价可电离阳离子脂质化合物提供的可电离的氮基团摩尔量，以及核酸药物含有的磷酸基团摩尔量，根据所需的不同氮磷比(N/P)，取适宜量的双价可电离阳离子脂质化合物和mRNA，将脂质化合物分别与DSPC(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、胆固醇(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)和DMG-PEG2000(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)以50:10:38.5:1.5的摩尔比溶于乙醇制备乙醇相溶液；然后将EGFP(或Luciferase、或SARS-CoV2 Spike)mRNA加到10-50mM柠檬酸盐缓冲液(pH=4)中得到mRNA水相溶液，通过将乙醇相溶液与水相溶液快速混合均匀来制备mRNA脂质纳米复合物，并通过多次DPBS超滤洗涤以除去乙醇和游离分子，通过0.2μm无菌过滤器过滤，即得到包封EGFP(或Luciferase、或SARS-CoV2 Spike)mRNA的脂质纳米复合物LNP制剂。
根据可电离阳离子脂质与核酸药物的不同N/P制得不同的脂质纳米复合物，并使用Malvern Zetasizer Nano ZS ZEN3600(Malvern UK)通过动态光散射测定mRNA脂质纳米复合物的大小及多分散指数，测试结果见表1-3。
表1、不同可电离脂质的EGFP mRNA脂质纳米复合物的理化性质
Figure DEST_PATH_IMAGE021
表2、不同可电离脂质的Luciferase mRNA脂质纳米复合物的理化性质
Figure DEST_PATH_IMAGE022
表3、不同可电离脂质的SARS-CoV2 Spike mRNA脂质纳米复合物的理化性质
Figure DEST_PATH_IMAGE023
表1、表2和表3示出了由可电离脂质制得的不同mRNA脂质纳米复合物的理化性质，可知本申请的双价可电离脂质化合物的理化性质能够达到甚至超过现有商用脂质，本申请开拓了数种全新的核酸药物递送用阳离子脂质方向。
实施例7：EGFP mRNA脂质纳米复合物在细胞水平的转染效果：
在96孔板中，每孔铺2×104个293T或者Hela细胞，培养24小时后，待细胞汇合度为70-90%，以每孔0.2μg的mRNA剂量(N/P=4:1，或者可电离脂质摩尔比相同)的脂质纳米复合物孵育细胞，24小时后，通过奥林巴斯CKX53荧光显微镜拍摄EGFP的20X荧光图像，结果详见图17、图18。结果表明，合成的双价可电离的阳离子脂质无论是以N/P=4:1为递送标准，还是以可电离脂质摩尔比为递送标准，在细胞水平上，均可以有效递送mRNA，并优于已上市的Dlin-MC3的脂质纳米复合物。
实施例8：双价可电离的阳离子脂质的选择性转染效果：
在汇合度为70-90%的不同细胞(Hela、293T、Huh7)的96孔板中，以每孔0.2μg的mRNA剂量转染细胞，24小时后通过奥林巴斯CKX53荧光显微镜拍摄荧光图像，结果详见图19、图20。结果表明，合成的双价可电离的阳离子脂质纳米复合物对不同细胞可以实现不一样的mRNA递送效率，从而实现更智能的递送方案。
实施例9：动物研究：
以2μg/只的剂量对6-8周龄雌性Babl/c小鼠通过皮下注射的方式，递送包裹Luciferase mRNA的双价可电离阳离子脂质(N/P=8:1)的脂质纳米复合物，并分别在给药后4小时、8小时和24小时通过IVIS Lumina III(PE公司)进行小动物荧光成像。结果如图21所示，实验证明双价可电离的阳离子脂质010301可以在动物体内有效递送mRNA，并表达高水平的相关蛋白。
实施例10：双价可电离阳离子脂质制备新型冠状病毒mRNA纳米疫苗：
在汇合度为70-90%的293T细胞的12孔板中，以每孔1μg的SARS-CoV2 Spike蛋白(S蛋白)的mRNA剂量转染细胞，24小时后，收集细胞上清，并根据商品化的SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike ELISA试剂盒(义翘神州，KIT40591)的步骤进行S蛋白的表达分析。结果如图22所示，多种合成的双价可电离的阳离子脂质纳米复合物都可以有效递送S mRNA疫苗，递送效果达到甚至超出现有技术，因此可基于其开发新的新型冠状病毒疫苗。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
本发明未尽事宜均为公知技术。

Claims (10)

1.一种双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐，其特征在于所述双价可电离脂质化合物具有如式010301、030301或040301所示结构，
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
2.根据权利要求1所述的双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐，其特征在于所述其药物可用的盐是指酸加成盐和/或碱加成盐。
3. 组合物，其特征在于包括：
治疗和/或预防剂；和
用于递送所述治疗和/或预防剂的载体；
所述载体包括阳离子脂质，
所述阳离子脂质包括权利要求1或2所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述载体还包括磷脂、结构性脂质或聚乙二醇化脂质的至少一种。
5. 一种阳离子脂质体，其特征在于：
1)由权利要求1或2所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐制得；或
2)由权利要求1或2所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐与辅脂制得；
所述辅脂包括磷脂、结构性脂质或聚乙二醇化脂质的至少一种。
6.一种试剂，其特征在于：包括权利要求1或2所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐、权利要求3或4所述组合物或权利要求5所述阳离子脂质体。
7.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐、权利要求3或4所述组合物或权利要求5所述阳离子脂质体。
8.一种制剂，其特征在于：包括权利要求1或2所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐、权利要求3或4所述组合物或权利要求5所述阳离子脂质体。
9.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1或2所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐、权利要求3或4所述组合物或权利要求5所述阳离子脂质体。
10. 权利要求1或2所述双价可电离脂质化合物和/或其药物可用的盐，或权利要求3或4所述组合物，或权利要求5所述阳离子脂质体，或权利要求6所述试剂，或权利要求8所述制剂，或权利要求9所述药物组合物的应用，其特征在于包括：
1)制备核酸药物、疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物；和/或
2)包封活性物质。
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