TWI801477B

TWI801477B - 陽離子性脂質

Info

Publication number: TWI801477B
Application number: TW107146930A
Authority: TW
Inventors: 鈴木裕太; 高橋良典
Original assignee: 日商衛材R&D企管股份有限公司
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2018-12-25
Publication date: 2023-05-11
Also published as: ES2926075T3; JPWO2019131580A1; JP7164547B2; EP3733647B1; US20200308111A1; EP3733647A4; US10947193B2; CA3084657A1; TW201927749A; EP3733647A1; CN111417621A; WO2019131580A1

Abstract

本發明提供一種能夠用於向細胞質傳遞核酸的陽離子性脂質。本發明的陽離子性脂質例如是下述式（1）所表示之化合物或其藥學上所容許之鹽。 [化56]

[式中，L₁ 及L₂ 分別獨立地表示碳數3～10之伸烷基、R₁ 及R₂ 分別獨立地表示碳數4～24之烷基或碳數4～24之烯基，R₃ 表示碳數1～3之烷基，X₁ 表示單鍵或-CO-O-]。

Description

陽離子性脂質

本發明涉及一種新穎的陽離子性脂質。

siRNA（small interfering RNA，小干擾RNA）、miRNA（micro RNA，微RNA）、shRNA（短髮夾RNA（short hairpin RNA）、或小髮夾RNA（small hairpin RNA））表現載體、反義寡核苷酸等核酸係在活體內誘發序列特異性基因表現抑制的核酸，並作為核酸醫藥為人所知。

該等核酸醫藥中，siRNA尤為引人關注。siRNA係包含19～23個鹼基對的雙股RNA，並誘發稱為RNA干擾（RNA interference、RNAi）的序列特異性基因表現抑制。

siRNA雖然化學性穩定，但在易被血漿中的RNase（核糖核酸酶，ribonuclease）分解、及單獨的話不易透過細胞膜等方面，具有治療用途上的問題（例如，參照專利文獻1）。

對於所述問題，已知藉由將siRNA封入至含有陽離子性脂質的微粒子內，可保護所封入的siRNA，避免其在血漿中分解，且使其透過脂溶性的細胞膜（例如，參照專利文獻1）。

另外，在專利文獻2～6中記載了一種陽離子性脂質，其用於傳遞siRNA等核酸醫藥，提昇了生物降解能力。

另外，含有陽離子性脂質的微粒子有在保管期間容易凝集的穩定性問題，已知有使該微粒子含有聚乙二醇修飾脂質（PEG脂質）來抑制凝集之方法。此外，在專利文獻7中記載了如下方法：藉由將作為特定PEG脂質的PEG-DPG作為微粒子的構成成分，或製成包含該微粒子及經去離子化之溶劑的製劑，來改善凝集抑制及核酸的傳遞效率。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2010/144740號說明書 [專利文獻2]國際公開第2011/153493號說明書 [專利文獻3]國際公開第2013/086354號說明書 [專利文獻4]國際公開第2013/158579號說明書 [專利文獻5]國際公開第2015/095346號說明書 [專利文獻6]國際公開第2016/104580號說明書 [專利文獻7]國際公開第2014/089239號說明書

然而，儘管最近有進展，但依然在尋求一種能夠用於向細胞質傳遞核酸的陽離子性脂質。

本發明涉及以下[1]至[14]。

[1]一種化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（1）表示。 [化1]

[式中，L₁ 及L₂ 分別獨立地表示碳數3～10之伸烷基，R₁ 及R₂ 分別獨立地表示碳數4～24之烷基或碳數4～24之烯基，R₃ 表示碳數1～3之烷基，X₁ 表示單鍵或-CO-O-]。

[2]根據[1]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物選自由下述式（A1）至（A9）所表示之化合物所組成之群。 [化2]

[2a]根據[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物選自由所述式（A1）、（A2）、（A3）、（A4）、（A5）、（A6）、（A8）、或（A9）所表示之化合物所組成之群。 [2b]根據[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物選自由所述式（A1）、（A2）、（A3）、（A4）、（A5）、（A6）、或（A9）所表示之化合物所組成之群。 [2c]根據[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物選自由所述式（A1）、（A2）、（A4）、或（A6）所表示之化合物所組成之群。 [2d]根據[1]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（2）或（3）表示。 [化3]

[式中，L₁ 及L₂ 、R₁ ～R₃ 、以及X₁ 係與所述式（1）含義相同]。 [2e]根據[1]或[2d]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中R₃ 為甲基。

[3]根據[1]或[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（A1）表示。 [化4]

[4]根據[1]或[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（A2）表示。 [化5]

[5]根據[1]或[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（A3）表示。 [化6]

[6]根據[1]或[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（A4）表示。 [化7]

[7]根據[1]或[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（A5）表示。 [化8]

[8]根據[1]或[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（A6）表示。 [化9]

[9]根據[1]或[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（A7）表示。 [化10]

[10]根據[1]或[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（A8）表示。 [化11]

[11]根據[1]或[2]所述之化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以下述式（A9）表示。 [化12]

[12]一種脂質複合體，其含有：（I）根據[1]至[11]、[2a]至[2e]項中任一項所述之化合物或其藥學上所容許之鹽、與（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之群中之至少一種脂質。

[13]一種組成物，其含有：（I）根據[1]至[11]、[2a]至[2e]項中任一項所述之化合物或其藥學上所容許之鹽、（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之群中之至少一種脂質、以及（III）核酸。

[14]一種組成物之製造方法，其包括：將含有（I）根據[1]至[11]、[2a]至[2e]項中任一項所述之化合物或其藥學上所容許之鹽、及（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之群中之至少一種脂質的含極性有機溶劑之水溶液、與含有（III）核酸之水溶液進行混合而獲得混合液的步驟；以及使混合液中之之性有機溶劑之含有率減少的步驟。 [發明的效果]

本發明的陽離子性脂質具有以下的一種以上的效果。（1）根據本發明的陽離子性脂質，能夠高效率地將核酸釋放至細胞質。（2）根據本發明的陽離子性脂質，能夠在保管了一定期間的情況下抑制脂質複合體的粒徑增大。因此，本發明的陽離子性脂質具有作為向細胞質傳遞核酸用的脂質的可利用性。

以下，表示實施方式及例示物等，對本發明詳細地進行說明，但本發明並不限定於以下所示的實施方式及例示物等，在不偏離本發明的主旨的範圍內可任意地變更並實施。此外，關於本說明書中所記載的所有文獻及刊物，不管其目的如何，均藉由參照將其整體併入至本說明書中。

＜陽離子性脂質＞在一個實施方式中，本發明係下述式（1）所表示之化合物或其藥學上所容許之鹽，可用作陽離子性脂質。陽離子性脂質也可以是所述鹽之水合物或所述鹽之溶劑合物。

[化13]

式（1）中，L₁ 及L₂ 分別獨立地表示碳數3～10之伸烷基，R₁ 及R₂ 分別獨立地表示碳數4～24之烷基或碳數4～24之烯基，R₃ 表示碳數1～3之烷基，X₁ 表示單鍵或-CO-O-。

本說明書中，所謂“烷基”係指具有指定數量的碳原子的直鏈狀、環狀或支鏈狀的飽和脂肪族烴基。本說明書中，所謂“烯基”係指具有指定數量的碳原子及至少一個碳-碳雙鍵的直鏈或分支的烴基。例如可列舉：單烯、二烯、三烯及四烯等，但並不限定於該等。本說明書中，所謂“伸烷基”係指具有指定數量的碳原子的直鏈狀、環狀或支鏈狀的二價飽和脂肪族烴基。本說明書中，“鹵素”係指F、Cl、Br、I。

本發明的化合物中的不對稱原子（例如碳等）可以外消旋體或鏡像異構物富集的形態、例如(R)-、(S)-或(R,S)-立體組態存在。本發明的一個實施方式係下述式（2）或（3）所表示的化合物或其藥學上所容許之鹽。 [化14]

式（2）或（3）中，L₁ 及L₂ 、R₁ ～R₃ 、以及X₁ 係與所述式（1）含義相同。本實施方式的化合物可用作陽離子性脂質。陽離子性脂質也可以是所述鹽之水合物或所述鹽之溶劑合物。

本發明的一個實施方式係所述式（1）至（3）中，L₁ 及L₂ 分別獨立地表示碳數3～10（例如碳數3～8）之伸烷基，R₁ 及R₂ 分別獨立地表示碳數4～24之烷基或碳數4～24之烯基，R₃ 表示碳數1～3之烷基，X₁ 表示單鍵或-CO-O-之化合物或其藥學上所容許之鹽，可用作陽離子性脂質。陽離子性脂質也可以是所述鹽之水合物或所述鹽之溶劑合物。

本發明的一個實施方式係所述式（1）至（3）中，L₁ 及L₂ 分別獨立地表示碳數3～10（例如碳數3～8）的直鏈狀伸烷基，R₁ 及R₂ 分別獨立地表示碳數4～24之直鏈狀或支鏈狀烷基或者碳數4～24之直鏈狀烯基，R₃ 為碳數1～3之烷基，X₁ 為-CO-O-之化合物或其藥學上所容許之鹽，可用作陽離子性脂質。陽離子性脂質也可以是所述鹽之水合物或所述鹽之溶劑合物。本發明的特定的一個實施方式係下述式（1a）所表示之化合物或其藥學上所容許之鹽。 [化15]

式（1a）中，R₁ 及R₂ 分別獨立地為碳數4～24之烷基或碳數4～24之烯基，R₃ 為碳數1～3之烷基，n1及n2分別獨立地表示3～10（例如，3～8）之整數。

在本發明的一個實施方式中，本發明係所述式（1）至（3）中，X₁ 為-CO-O-，L₁ 與L₂ 相同，R₁ 與R₂ 相同的化合物或其藥學上所容許之鹽，可用作陽離子性脂質。陽離子性脂質也可以是所述鹽之水合物或所述鹽之溶劑合物。

在本發明的一個實施方式中，本發明係所述式（1）至（3）中，L₁ 及L₂ 分別獨立地為碳數3～10（例如，碳數3～8）之直鏈狀伸烷基，R₁ 為碳數4～24之直鏈狀或支鏈狀烷基或者碳數4～24之直鏈狀烯基，R₂ 為碳數4～24之直鏈狀烷基，R₃ 為碳數1～3之烷基，X₁ 為單鍵之化合物或其藥學上所容許之鹽。在本實施方式中，較佳的是L₂ 及R₂ 的合計碳數為9～12。本實施方式之化合物可用作陽離子性脂質。陽離子性脂質也可以是所述鹽之水合物或所述鹽之溶劑合物。本發明的特定的一個實施方式係下述式（1b）所表示之化合物或其藥學上所容許之鹽。 [化16]

式（1b）中，R₁ 為碳數4～24之烷基或碳數4～24之烯基，R₃ 為碳數1～3之烷基，n1表示3～10（例如，3～8）之整數，n2表示6～33、較佳的是8～11的整數。

在以下表示實施方式之化合物的一例。 [化17]

本發明的一個實施方式係所述式（A1）、（A2）、（A3）、（A4）、（A5）、（A6）、（A8）、或（A9）的任一式所表示之化合物或其藥學上所容許之鹽，可用作陽離子性脂質。陽離子性脂質也可以是所述鹽之水合物或所述鹽之溶劑合物。本發明的一個實施方式係所述式（A1）、（A2）、（A3）、（A4）、（A5）、（A6）、或（A9）的任一式所表示之化合物或其藥學上所容許之鹽，可用作陽離子性脂質。陽離子性脂質也可以是所述鹽之水合物或所述鹽之溶劑合物。本發明的一個實施方式係所述式（A1）、（A2）、（A4）、或（A6）的任一式所表示之化合物或其藥學上所容許之鹽，可用作陽離子性脂質。陽離子性脂質也可以是所述鹽之水合物或所述鹽之溶劑合物。

在本說明書中，陽離子性脂質係具有含有一個以上之烴基的脂質親和性區域、及含有在生理pH值下為中性或供質子化之之性基的親水性區域之兩親分子。即，本發明的陽離子性脂質可質子化而形成陽離子。例如，所述式（1）所表示之化合物包含如下述式（1）'所示般在吡咯啶環的氮原子上的孤電子對配位有氫離子之化合物（陽離子性化合物）。該陽離子性化合物可與陰離子一起形成下述式（1）'所示之鹽、及該鹽之水合物或溶劑合物。 [化18]

式（1）'中，L₁ 及L₂ 、R₁ ～R₃ 、以及X₁ 係與所述式（1）含義相同。Z為陰離子（抗衡離子）。本實施方式的化合物可用作陽離子性脂質。作為與所述陽離子性化合物成對，本實施方式的陽離子性脂質可含有的陰離子（所述式（1）'中的Z），只要為藥學上可接受的陰離子，則沒有特別限定，例如可列舉：氯化物離子、溴化物離子、硝酸根離子、硫酸根離子、磷酸根離子等無機離子；乙酸根離子、草酸根離子、馬來酸根離子、富馬酸根離子、檸檬酸根離子、苯甲酸根離子、甲磺酸根離子等有機酸根離子等。關於本發明的陽離子性脂質，可存在幾何異構物、光學異構物等立體異構物、互變異構物等，但本發明的陽離子性脂質包含包括該等在內的所有可能的異構物及該等異構物的混合物。

＜陽離子性脂質之製造方法＞對本發明的陽離子性脂質之製造方法進行說明。於以下表示陽離子性脂質的合成方案的一個實施方式。本說明書中所記載的化合物全部作為化合物包含於本發明中。本發明的化合物可依據以下方案中所記載的方法的至少一個方法進行合成。本發明的陽離子性脂質由於可具備一個或兩個以上的不對稱中心，所以所合成的化合物可以(R)-或(S)-立體異構物或該等的混合物(R,S)的形式生成。只要沒有特別記載，則本說明書中的特定化合物的記載表示包括各自的鏡像異構物與該等的外消旋混合物兩種。關於用以立體化學的確定及立體異構物的分離的方法，熟悉該項技術者眾所周知。

[化19]

（式中，L₁ 及R₁ 分別與所述式（1）含義相同，X及Y分別為鹵素原子，R為式（1）中的-L₂ -X₁ -R₂ （L₂ 、X₁ 及R₂ 分別與所述式（1）含義相同））。

式（1）的陽離子性脂質（X₁ 為單鍵的化合物）例如可依據所述方案1進行合成。（步驟1-1：酯化）首先，使醇（a1）與鹵素取代羧酸X-L₁ -COOH（X為鹵素原子，L₁ 與所述含義相同）（較佳的是溴取代羧酸）在縮合劑的存在下反應而獲得酯的鹵化物（a2）。作為縮合劑，例如可列舉：1-[3-(二甲胺基)丙基]-3-乙基碳二亞胺（EDC）鹽酸鹽、N,N'-二環己基碳二亞胺（DCC）等。還可視情況添加鹼。作為鹼，例如可列舉：N-甲基𠰌啉（NMM）、三乙胺（TEA）、N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）、4-(二甲胺基)吡啶（DMAP）、吡啶、甲基吡啶、二甲吡啶等。作為溶劑，例如可列舉：四氫呋喃（THF）、二氯甲烷、氯仿、甲苯、己烷、乙酸乙酯等。或者，視情況，使鹵素取代羧酸X-L₁ -COOH（X為鹵素原子，L₁ 與所述含義相同）（較佳的是溴取代羧酸）在二甲基甲醯胺的存在下與草醯氯等親電性鹵化劑反應而轉化為羧酸醯氯，進而，使羧酸醯氯與醇反應而可獲得酯的鹵化物（a2）。作為溶劑，例如可列舉：四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿、甲苯、己烷等。（步驟1-2：烷鏈導入）繼而，使酯的鹵化物（a2）與丙二酸二三級丁酯在鹼的存在下反應。由此，奪取丙二酸二酯的活性亞甲基的氫原子，導入烷基酯鏈，獲得化合物（a3）。作為鹼，例如可列舉氫化鈉（NaH)。作為溶劑，例如可列舉：二㗁𠮿、四氫呋喃、環戊基甲醚、1,2-二甲氧基乙烷、DMF、N-甲基吡咯啶酮等。（步驟1-3：烷鏈導入）繼而，使化合物（a3）與鹵代烷（R-Y）（較佳的是碘化物）在鹼的存在下反應，導入烷鏈，獲得化合物（a4）。鹼及溶劑可使用與所述步驟1-2相同的鹼及溶劑。（步驟1-4：去保護）繼而，在酸水解條件下對化合物（a4）的三級丁基（tBu）進行去保護，獲得化合物（a5）。作為去保護所使用的酸，例如可列舉：三氟乙酸（TFA）、鹽酸等。作為溶劑，例如可列舉二氯甲烷等。（步驟1-5：脫碳酸）繼而，藉由化合物（a5）的脫碳酸而獲得單羧酸（a6）。脫碳酸反應例如可藉由在溶劑中進行加熱而進行。作為溶劑，例如可使用甲苯、二甲苯等芳香族烴類等。（步驟1-6：還原步驟）使化合物（a6）的羧基在還原劑的存在下向羥基還原，獲得化合物（a7）。作為還原劑，例如可列舉：硼烷（BH₃ ）-四氫呋喃錯合物、硼烷-二甲硫醚錯合物等硼烷錯合物等。作為溶劑，例如可使用二乙醚、四氫呋喃、二㗁𠮿等醚類；氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷等鹵代烴類；己烷、甲苯等烴類；及該等的混合溶劑等。（步驟1-7：酯化）使所獲得的醇（a7）與1-甲基-吡咯啶-3-羧酸或其衍生物（氫鹵酸鹽等）在縮合劑、鹼的存在下反應，獲得作為最終物的化合物（a8）（R＝L₂ -X₁ -R₂ ）（相當於式（1）的陽離子性脂質的化合物）。作為縮合劑及鹼，可使用與步驟1-1相同的縮合劑及鹼。

此外，在合成X₁ 為-CO-O-的化合物時，在所述方案1的步驟1-3中，依照下述步驟2-1製備羧基得到保護的化合物（酯的鹵化物），使其與化合物（a3）反應，進而，對所獲得的化合物進行步驟1-4～步驟1-7，最後進行羧基的去保護及酯化（與R₂ -OH的反應）即可。

[化20]

（式中，L₁ 及R₁ 分別與所述式（1）含義相同，X及Y分別為鹵素原子，R為式（1）中的-L₂ -X₁ -R₂ （L₂ 、X₁ 及R₂ 分別與所述式（1）含義相同））。所述方案2顯示出熟悉該項技術者藉由不同方法來合成式（1）的陽離子性脂質（X₁ 為單鍵的化合物）的方法。

（步驟2-1：酯化）首先，藉由使苯甲醇與鹵素取代羧酸X-L₁ -COOH（X為鹵素原子，L₁ 與所述含義相同）進行酯化反應而獲得酯的鹵化物（b1）。酯化條件與步驟1-1相同。（步驟2-2：烷鏈導入）繼而，與步驟1-2同樣地，使酯的鹵化物（b1）與丙二酸二三級丁酯在鹼的存在下反應，獲得化合物（b2）。（步驟2-3：烷鏈導入）繼而，與步驟1-3同樣地，使化合物（b2）與鹵代烷（R-Y）在鹼的存在下反應，獲得化合物（b3）。（步驟2-4：去保護）繼而，與步驟1-4同樣地，在酸水解條件下對化合物（b3）的三級丁基（tBu）進行去保護，獲得化合物（b4）。（步驟2-5：脫碳酸）繼而，與步驟1-5同樣地，獲得單羧酸（b5）。（步驟2-6：還原步驟）進而，使其與步驟1-6同樣地在還原劑的存在下進行還原，獲得化合物（b6）。（步驟2-7：酯化）使所獲得的化合物（b6）與1-甲基-吡咯啶-3-羧酸或其衍生物（氫鹵酸鹽等）在縮合劑、鹼的存在下進行酯化反應，獲得化合物（b7）。作為縮合劑及鹼，可使用與步驟1-1相同的縮合劑及鹼。（步驟2-8：去保護）繼而，在還原條件下，對苄基保護基進行去保護而獲得化合物（b8）。去保護例如只要藉由在鈀/碳等金屬觸媒存在下進行接觸氫化反應來進行即可。（步驟2-9：酯化）最後，藉由使化合物（b8）在縮合劑、鹼的存在下與醇（R₁ -OH)反應，可獲得化合物（b9）（R＝L₂ -X₁ -R₂ ）（相當於式（1）的陽離子性脂質的化合物）。作為縮合劑及鹼，可使用與步驟1-1相同者。

在所述方案2中，利用1-甲基-吡咯啶-3-羧酸或其衍生物使在步驟2-6中所獲得的化合物（b6）酯化（步驟2-7）後，進行與醇（R₁ -OH)的酯化反應（步驟2-9），但例如還可如下述方案2'所示，對在步驟2-6中所獲得的化合物（b6）的羥基進行保護，對苄基進行去保護，進行與醇（R₁ -OH)的酯化反應後，進行與1-甲基-吡咯啶-3-羧酸或其衍生物的酯化反應。

[化21]

（式中，L₁ 及R₁ 分別與所述式（1）含義相同，R為式（1）中的-L₂ -X₁ -R₂ （L₂ 、X₁ 及R₂ 分別與所述式（1）含義相同））

（步驟2-7'：保護）對步驟2-6中所獲得的化合物（b6）的羥基進行保護。例如在N,N-二甲基甲醯胺等溶劑中且在咪唑等鹼的存在下，使三級丁基二甲基氯矽烷（TBDMS-Cl）發揮作用，獲得羥基由三級丁基二甲基矽基（TBDMS）保護的化合物（b10）。（步驟2-8'：去保護）繼而，於還原條件下，對苄基保護基進行去保護而獲得化合物（b11）。去保護例如只要藉由在鈀/碳等金屬觸媒存在下進行接觸氫化反應來進行即可。（步驟2-9'：酯化）藉由使所獲得的化合物（b11）在縮合劑、鹼的存在下與醇（R₁ -OH)反應而獲得化合物（b12）。作為縮合劑及鹼，可使用與步驟1-1相同的縮合劑及鹼。（步驟2-10'：去保護）繼而，對TBDMS基進行去保護而獲得化合物（b13）。去保護例如只要藉由在四氫呋喃等有機溶劑中使四正丁基氟化銨（TBAF）等氟化物鹽發揮作用來進行即可。（步驟2-11'：酯化）最後，與步驟1-7同樣地，使所獲得的醇（b13）與1-甲基-吡咯啶-3-羧酸或其衍生物（氫鹵酸鹽等）在縮合劑、鹼的存在下反應，由此獲得作為最終物的化合物（b14）（R=L₂ -X₁ -R₂ ）（相當於式（1）的陽離子性脂質的化合物）。

[化22]

（步驟2-11''：酯化）或者，也可由步驟2-11'來代替，使用吡咯啶環的氮原子經保護基（例如，三級丁氧基羰基（tBu-O-CO-；Boc））保護的化合物作為羧酸或其衍生物，與步驟1-7同樣地，使其與醇（b13）在縮合劑、鹼的存在下反應，而獲得化合物（b15）。（步驟2-12''：去保護、還原性胺基化）繼而，對化合物（b15）的三級丁氧基羰基（Boc）進行去保護，藉由還原性胺基化而甲基化。具體來說，藉由使三氟乙酸（TFA）等強酸對化合物（b15）的Boc基進行作用而去保護，成為NH，使甲醛對該NH發揮作用而生成亞胺（亞胺陽離子），進而使NaBH（OAc）₃ 或NaBH₃ CN等還原劑發揮作用，獲得作為最終物的胺化合物（b14）（R＝L₂ -X₁ -R₂ ）（相當於式（1）的陽離子性脂質的化合物）。

在所述步驟2-11'或步驟2-11''中，藉由使用吡咯啶環的3位碳原子的立體組態得到控制的原料、例如、(3S)-1-甲基-吡咯啶-3-羧酸或(3R)-1-甲基-吡咯啶-3-羧酸或該等的衍生物作為羧酸或其衍生物，可控制式（1）的化合物中的吡咯啶環的立體組態。

此外，在合成X₁ 為-CO-O-的化合物（例如式（1a）的化合物等）時，只要在所述方案2中，依照步驟2-1製備羧基得到保護的化合物（酯的化合物），在步驟2-3中使其與化合物（b2）反應，進而使用所獲得的化合物進行接下來的步驟，在步驟2-8及步驟2-9或步驟2-8'及步驟2-9'中進行去保護而酯化即可。此時，將兩個羧基的保護基的種類設為在不同的去保護條件下可進行去保護的種類，由此也可獲得R₁ 及R₂ 不同的化合物。

在所述方案中，以式（1）中的R₃ 為甲基的情形為例並表示合成方法，但關於R₃ 為甲基以外的化合物，也可依照所述方案，在所述步驟1-7或步驟2-7中，藉由使用1-烷基-吡咯啶-3-羧酸代替1-甲基-吡咯啶-3-羧酸而進行合成。

在本發明的化合物的合成中，只要起始原料之製造沒有特別記載，則該等化合物為公知，或者可藉由該技術領域中公知的類似方法，或者如以下的實施例中所記載般進行製備。如果為熟悉該項技術者，則理解所述方案只不過是本發明的化合物的代表性製備法，可同樣地使用其它眾所周知的方法。

在本發明的化合物的製備中，有時必須且/或期望保護分子的官能基。其可由熟悉該項技術者藉由眾所周知的現有保護基來進行。保護基可在之後的合適階段，使用該技術領域中眾所周知的方法而去除。此外，所述方案中所示的保護基（三級丁基保護基、三級丁氧基羰基保護基、苄基保護基、三級丁基二甲基矽基保護基）也可由熟悉該項技術者取代為眾所周知的其它保護基。

＜脂質複合體＞本發明提供一種脂質複合體，其含有（I）所述陽離子性脂質、與（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之之至少一種脂質。作為本發明的一個實施方式，脂質複合體含有（I）所述陽離子性脂質、（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之之至少一種脂質、及（III）核酸。因此，本發明的脂質複合體可含有核酸也可不含有核酸。本實施方式的脂質複合體可將核酸高效率地釋放至細胞質。另外，本實施方式的脂質複合體在保管了一定期間（例如1個月、1.5個月或3個月）的情況下粒徑的增大得到抑制，可顯示出優異的物理穩定性。

作為由含有陽離子性脂質的脂質與核酸所形成的複合體的形態，例如可列舉：核酸與包含脂質單(一分子)層的膜(逆微胞)的複合體、核酸與脂質體的複合體、核酸與微胞的複合體等。在本發明的一個實施方式的脂質複合體中，核酸係封入至由含有陽離子性脂質的脂質所構成的微粒子內。

本實施方式的脂質複合體以脂質複合體所含有的全部脂質為基準，含有例如10～100莫耳%、例如20～90莫耳%、例如40～80莫耳%的所述陽離子性脂質。陽離子性脂質可單獨使用一種，或混合兩種以上使用。

作為核酸，可列舉：siRNA、miRNA、shRNA表現載體、反義寡核苷酸、mRNA、核酶等。在一個實施方式中，核酸也可以是siRNA、miRNA、mRNA。

本實施方式的脂質複合體相對於脂質複合體的總重量，含有例如0.01～50重量%、例如0.1～30重量%、例如1～10重量%的核酸。

本實施方式的脂質複合體含有（I）所述陽離子性脂質、及（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之之至少一種脂質作為脂質成分。本實施方式的脂質複合體相對於脂質複合體的總重量，含有例如50～100重量%、例如70～99.99重量%、例如90～99重量%的脂質成分。

中性脂質係指在生理pH值下以非電荷或中性的兩性離子的形態中的任一形態存在的脂質。作為中性脂質，可列舉：二油醯磷脂醯乙醇胺（DOPE）、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼（POPC）、蛋黃磷脂醯膽鹼（EPC）、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼（DMPC）、二軟脂醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、二花生醯磷脂醯膽鹼（DAPC）、二山崳醯磷脂醯膽鹼（DBPC）、二(二十四醯)磷脂醯膽鹼（DLPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPC）、神經鞘磷脂、腦醯胺、二油醯磷脂醯甘油（DOPG）、二軟脂醯磷脂醯甘油（DPPG）、磷脂醯乙醇胺（POPE）、二油醯磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸酯（DOPE-mal）等。中性脂質可單獨使用一種，或混合兩種以上使用。

本實施方式的脂質複合體以脂質複合體所含有的全部脂質為基準，也可含有例如0～50莫耳%、例如0～40莫耳%、例如0～30莫耳%的中性脂質。

作為聚乙二醇修飾脂質，可列舉：PEG2000-DMG（PEG2000-二肉豆蔻基甘油）、PEG2000-DPG（PEG2000-二軟脂醯基甘油）、PEG2000-DSG（PEG2000-二硬脂醯基甘油）、PEG5000-DMG（PEG5000-二肉豆蔻基甘油）、PEG5000-DPG（PEG5000-二軟脂醯基甘油）、PEG5000-DSG（PEG5000-二硬脂醯基甘油）、PEG-cDMA（N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺）、PEG-C-DOMG（R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)胺甲醯基)]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺）、聚乙二醇（PEG）-二醯基甘油（DAG）、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂質、PEG-腦醯胺（Cer）等。

作為PEG-二烷氧基丙基，可列舉：PEG-二月桂氧基丙基、PEG-二肉豆蔻氧基丙基、PEG-二棕櫚氧基丙基、PEG-二硬脂氧基丙基等。聚乙二醇修飾脂質可單獨使用一種，或混合兩種以上使用。另外，所述聚乙二醇修飾脂質也可將PEG（聚乙二醇）的末端甲氧基化（MPEG；甲氧基(聚乙二醇)）。

本實施方式的脂質複合體以脂質複合體所含有的全部脂質為基準，也可含有例如0～30莫耳%、例如0～20莫耳%、例如0～10莫耳%的聚乙二醇修飾脂質。

固醇係具有類固醇骨架的醇。作為固醇，可列舉：膽固醇、二氫膽固醇、羊毛固醇、β-穀固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、麥角固醇、海藻固醇、3β-[N-(N',N'-二甲胺基乙基)胺甲醯基]膽固醇（DC-Chol）等。固醇可單獨使用一種，或組合兩種以上使用。

本實施方式的脂質複合體以脂質複合體所含有的全部脂質為基準，也可含有例如0～90莫耳%、例如10～80莫耳%、例如20～50莫耳%的固醇。

本實施方式的脂質複合體中的脂質成分的組合沒有特別限定，例如可列舉：所述陽離子性脂質、中性脂質及固醇的組合；所述陽離子性脂質、中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇的組合等。

本實施方式的脂質複合體的“平均粒徑”可藉由體積平均、數量平均、Z-平均的任一種方法算出。本實施方式的脂質複合體的平均粒徑（Z-平均）宜為例如10～1000 nm、例如30～500 nm、例如30～200 nm。本實施方式的脂質複合體較佳的是在保管期間，粒徑與保管前相比沒有極大的增大。例如，較佳的是在4℃下保管了1.5個月的情況下的平均粒徑（Z-平均）的大小相對於保管前的粒徑的大小，為1.25倍以下的脂質複合體，更較佳的是1.2倍以下的脂質複合體，尤其較佳的是1.1倍以下的脂質複合體。

就抑制非特異性吸附或免疫反應的觀點而言，本實施方式的脂質複合體較佳的是例如在血液中等pH值約為7.4的環境下表面幾乎不帶電。另外，藉由內噬作用而被吸收至細胞內時，就提高與內體膜的融合效率的觀點而言，較佳的是在低pH值（例如3.5～7.0）環境下帶正電。

＜組成物＞本發明提供一種組成物，其含有（I）所述陽離子性脂質、（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之之至少一種脂質、及（III）核酸。作為本發明的一個實施方式，組成物含有包含所述核酸的脂質複合體。本實施方式的組成物可將核酸高效率地釋放至細胞質。本實施方式的組成物也可含有所述脂質複合體、藥學上可接受的介質、及視情形的其它添加劑。關於藥學上可接受的介質、其它添加劑，在下文進行說明。

本發明的組成物以組成物所含有的全部脂質為基準，含有例如10～100莫耳%、例如20～90莫耳%、例如40～70莫耳%的所述陽離子性脂質。陽離子性脂質可單獨使用一種，或混合兩種以上使用。

作為核酸，可列舉與所述核酸相同的核酸。本發明的組成物含有相對於組成物的總重量例如0.01～50重量%、例如0.1～30重量%、例如1～10重量%的核酸。

本發明的組成物含有（I）所述陽離子性脂質、及（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之之至少一種脂質作為脂質成分。

作為中性脂質，可列舉與所述中性脂質相同的中性脂質。本發明的組成物以組成物所含有的全部脂質為基準，也可含有例如0～50莫耳%、例如0～40莫耳%、例如0～30莫耳%的中性脂質。

作為聚乙二醇修飾脂質，可列舉與所述聚乙二醇修飾脂質相同的聚乙二醇修飾脂質。本發明的組成物以組成物所含有的全部脂質為基準，也可含有例如0～30莫耳%、例如0～20莫耳%、例如0～10莫耳%的聚乙二醇修飾脂質。

作為固醇，可列舉與所述固醇相同的固醇。本發明的組成物以組成物所含有的全部脂質為基準，也可含有例如0～90莫耳%、例如10～80莫耳%、例如20～50莫耳%的固醇。

本發明的組成物中的脂質成分的組合沒有特別限定，例如可列舉：所述陽離子性脂質、中性脂質及固醇的組合；所述陽離子性脂質、中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇的組合等。

本發明的組成物除所述的成分以外，還可含有蔗糖、葡萄糖、山梨醇、乳糖等糖；谷醯胺、穀胺酸、穀醯胺鈉、組胺酸等胺基酸；檸檬酸、磷酸、乙酸、乳酸、碳酸、酒石酸等酸的鹽等作為其它添加劑。

本發明的組成物也可以醫藥組成物的形式進行製劑化。作為醫藥組成物的劑型，例如可列舉注射劑。

本發明的組成物例如可以是藉由冷凍乾燥等去除了溶劑的粉末狀態，也可以是液體狀態。本發明的一個實施方式的組成物係含有所述實施方式的脂質複合體的粉末組成物。粉末組成物可例如藉由過濾、離心分離等從液體狀態的組成物（分散液）中去除溶劑而製備，也可對該分散液進行冷凍乾燥而製備。在組成物為粉末狀態的情況下，可在使用前使組成物懸浮或溶解於藥學上可接受的介質中而用作注射劑。本發明的一個實施方式的組成物係含有所述的實施方式的脂質複合體及藥學上可接受的介質的液體組成物。在組成物為液體狀態的情況下，可直接用作注射劑或者懸浮或溶解於藥學上可接受的介質中而用作注射劑。

作為藥學上可接受的介質，可列舉：殺菌水；生理鹽水；含有葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉等輔助藥的等滲液；磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、乙酸緩衝液等緩衝液等。本實施方式的組成物還可進而含有乙醇、丙二醇、聚乙二醇等醇等溶解助劑、穩定劑、抗氧化劑、防腐劑、藥劑製造上通常使用的賦形劑、填充劑、增量劑、結合劑、濕潤劑、崩散劑、潤滑劑、表面活性劑、分散劑、保存劑、矯味矯臭劑、鎮痛劑等添加劑。

組成物向患者的給予例如可藉由動脈內注射、靜脈內注射、皮下注射等非經口用法來進行。組成物的給予量根據給予物件、目標器官、症狀、給予方法也有所不同。組成物的給予物件沒有限定，可應用於各種動物，但尤其是可應用於哺乳動物、較佳的是人類及臨床試驗、篩選、實驗中的實驗動物。

＜組成物之製造方法＞在一個實施方式中，本發明提供一種組成物之製造方法，其包括：步驟（a），該步驟係將（I）含有所述陽離子性脂質、及（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之之至少一種脂質的含極性有機溶劑之水溶液、與含有（III）核酸之水溶液進行混合而獲得混合液；及步驟（b），該步驟係使混合液中之之性有機溶劑之含有率減少。根據本實施方式之製造方法，可製造能夠將核酸高效率地釋放至細胞質的組成物。

藉由水溶性的核酸與所述陽離子性脂質的靜電相互作用、及脂質間的疏水相互作用，可形成在由脂質構成的微粒子內封入有核酸的脂質複合體。例如藉由減少混合液中之之性有機溶劑之含有率，使含有（I）所述陽離子性脂質、與（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之之至少一種脂質的脂質成分對於含極性有機溶劑之水溶液的溶解度產生變化，由此可形成脂質複合體。作為極性有機溶劑，可列舉乙醇等醇。

首先，在步驟（a）中，將溶解有（I）所述陽離子性脂質、與（II）選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之之至少一種脂質的含極性有機溶劑之水溶液、與含有（III）核酸之水溶液進行混合而獲得混合液。關於含極性有機溶劑的水溶液中之之性有機溶劑的濃度，只要在與核酸之水溶液混合後還滿足脂質分子會溶解的條件，則沒有特別限定。列舉一例，步驟（a）的含極性有機溶劑之水溶液中之之性有機溶劑的濃度可為0～60重量%。

繼而，在步驟（b）中，藉由向所述混合液添加水等而減少極性有機溶劑的含有率。由此，可形成脂質複合體。為了高效率地形成脂質複合體，較佳的是使極性有機溶劑的含有率急劇地降低。列舉一例，步驟（b）中的最終含極性有機溶劑之水溶液中之之性有機溶劑的濃度可為0～5重量%。

另外，針對步驟（a）中所獲得的所述混合液，藉由透析將極性有機溶劑去除，將溶劑置換為藥學上可接受的介質。由於在透析過程中溶液中之之性有機溶劑之含有率減少，所以由此可形成脂質複合體。

根據本實施方式的組成物之製造方法，可獲得在微粒子內部高效率地封入有核酸的脂質複合體。該脂質複合體可具有優異的物理穩定性。例如能夠在保管了一定期間（例如1個月、例如3個月）的情況下抑制粒徑的增大。

在供封入至組成物的核酸為核酸醫藥的情況下，可將組成物作為醫藥組成物來應用。例如，本發明的組成物可用於在活體內（in vivo）或在活體外（in vitro）中向成為靶的細胞質（例如成為各種疾病的原因的細胞質）導入所需的核酸的治療（例如基因治療）。所以，本發明的一個實施方式提供一種使用含有所述脂質複合體的醫藥組成物的各種疾病之治療方法（尤其是基因治療方法）。此外，給予的物件、給予的方法及條件與所述相同。

本發明的一個實施方式可以是含有所述陽離子性脂質的核酸醫藥傳遞用套組（kit）。另外，該套組可較佳的是用於對於各種靶細胞的治療（例如基因治療）等。在本實施方式的套組中，陽離子性脂質的保存狀態沒有特別限定，考慮各自的穩定性（保存性）及使用容易性等，可設定為溶液狀或粉末狀等任意的狀態。本實施方式的套組除含有所述陽離子性脂質以外，例如還可含有各種核酸、各種介質（藥學上可接受的介質、緩衝液）、及使用說明書（使用指南）等。本實施方式的套組用於製備包含供向靶細胞內導入的所需核酸及含有所述陽離子性脂質的脂質的組成物或脂質複合體。所製備的組成物或脂質複合體可有效地用於向靶細胞傳遞核酸傳遞。進而，本發明的一個實施方式可以是含有包含所述陽離子性脂質的醫藥組成物的核酸醫藥傳遞用套組。本實施方式的套組除含有所述醫藥組成物以外，例如還可含有各種介質（藥學上可接受的介質）、及使用說明書（使用指南）等。 [實施例]

以下，列舉實施例、製造例及試驗例對本發明進一步詳述，但本發明並不限定於該等實施例。實施例、製造例中之化合物名係使用軟體（商品名“ChemDraw Plugin 15.1版”，珀金埃爾默公司製造）來命名。為了合成本發明的化合物而應用的起始原料、試劑、酸、鹼、脫水劑、溶劑、及觸媒可全部被市售，或者可藉由熟悉該項技術者所公知的有機合成法而生成。此外，本發明的化合物如以下的實施例所示，可藉由熟悉該項技術者所公知的有機合成法進行製造。

實施例中所使用的縮寫係熟悉該項技術者眾所周知的慣用縮寫。將若干縮寫示於以下。 DIPEA：N,N-二異丙基乙胺 DMAP：4-(二甲胺基)吡啶 DMSO：二甲基亞碸 DMF：N,N-二甲基甲醯胺 EDC・HCl：1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 n-：正 tert-：三級 TFA：三氟乙酸 THF：四氫呋喃 LAH：氫化鋁鋰 TBAF：四正丁基氟化銨¹ H-NMR：質子核磁共振譜儀

以下的實施例及製造例中的“室溫”通常表示約10℃至約35℃。%只要沒有特別記載，則表示重量百分比。

質子核磁共振譜的化學位移係以相對於四甲基矽烷的δ單位（ppm）來記錄。圖案的縮寫所下所示。 s：單峰、d：雙峰、t：三重峰、q：四重峰、quin：五重峰、m：多重峰、br：寬峰。關於層析法，使用山善公司製造的Parallel Prep｛柱：山善公司製造的Hi-Flash Column（Silicagel）、尺寸；S（16×60 mm）、M（20×75 mm）、L（26×100 mm）、2L（26×150 mm）｝、或者拜泰齊公司製造的快速自動純化系統Isolera｛柱：SNAP Cartridge KP-Sil（10 g、25 g、50 g、100 g、340 g）｝。

A.陽離子性脂質的合成 [製造例1] 9-溴壬酸苄酯的合成 [化23]

使苯甲醇（1.3 mL，12.6 mmol）、9-溴壬酸（3.0 g，12.65 mmol）及DMAP（155 mg，1.27 mmol）溶解於二氯甲烷（25mL）中，在冰浴冷卻下添加EDC・HCl（2.67 g，13.92 mmol），在室溫下攪拌2小時。向反應混合物添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，而獲得標題化合物（3.7 g，11.31 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.22 - 1.48 (m, 8H), 1.58 - 1.71 (m, 2H), 1.78 - 1.90 (m, 2H), 2.30 - 2.40 (m, 2H), 3.35 - 3.44 (m, 2H), 5.12 (s, 2H), 7.26 - 7.45 (m, 5H)。

[製造例2] 4-戊基壬烷-1-醇的合成 [化24]

（1）2-戊基庚烷-1-醇合成使2-戊基庚酸（2.0 g，9.98 mmol）溶解於THF（50 mL）中，在-78℃下滴加硼烷-THF錯合物（1.0 M，25.0 mL，25.0 mmol）。升溫至室溫後徹夜攪拌。再次冷卻至-78℃，追加硼烷-THF錯合物（1.0 M，10.0 mL，10.0 mmol）後，在室溫下徹夜攪拌。添加飽和氯化銨水溶液，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，而獲得標題化合物（1.40 g，7.49 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 1.24 - 1.35 (m, 19H), 1.45 - 1.47 (m, 1H, 1.62 - 1.71 (m, 1H), 3.54 (br d, J = 5.5 Hz, 2H)。

（2）2-戊基庚醇的合成在-78℃下將DMSO（2.1 mL，30.0 mmol）的二氯甲烷（1.0 mL）溶液滴加至草醯氯（1.3 mL，15.0 mmol）的二氯甲烷（1.0 mL）溶液中。攪拌30分鐘後，添加製造例2-（1）中所獲得的化合物（1.40 g，7.49 mmol）的二氯甲烷（2.0 mL）溶液。攪拌1小時後，添加三乙胺（5.2 mL，37.5 mmol）。升溫至室溫並攪拌2小時後，添加水，分離有機相。利用水及飽和食鹽水將有機相洗淨，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（1.26 g，6.82 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 7H), 1.19 - 1.34 (m, 13H), 1.40 - 1.47 (m, 4H), 1.57 (s, 1H), 1.58 - 1.66 (m, 2H), 2.15 - 2.28 (m, 1H), 2.66 (s, 1H), 9.56 (d, J = 3.3 Hz, 1H)。

（3）4-戊基壬烷-2-烯酸乙酯的合成在-78℃下將六甲基二矽氮烷鈉-THF溶液（1 M，5.2 mL，5.19 mmol）滴加至乙氧基羰基甲基(三苯基)溴化鏻（2.23 g，5.19 mmol）的THF（14 mL）溶液中。以2小時升溫至0℃後，利用套管滴加至製造例2-（2）中所獲得的化合物（0.48 g，2.59 mmol）的THF（4.0 mL）溶液中。在室溫下徹夜攪拌後，進行4小時加熱回流。添加水，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（0.28 g，1.09 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (br t, J = 7.2 Hz, 5H), 0.87 (br t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.18 - 1.35 (m, 26H), 1.38 - 1.46 (m, 3H), 1.53 - 1.64 (m, 4H), 2.09 - 2.24 (m, 1H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 4.19 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 5.76 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 6.74 (dd, J = 15.6, 9.4 Hz, 1H)。

（4）4-戊基壬烷-1-醇的合成在氮氣氛圍下，在0℃下將LAH-THF溶液（1 M，2.2 mL，2.2 mmol）滴加至製造例2-（3）中所獲得的化合物（0.28 g，1.10 mmol）的THF溶液（2.2 mL）中。升溫至室溫後，進行18小時加熱回流。在0℃下，利用三級丁基甲醚（4.6 mL）進行稀釋後，依序添加水（0.078 mL）、氫氧化鈉水溶液（15%，0.078 mL）及水（0.234 mL）。將反應混合物攪拌15分鐘後，利用矽藻土進行過濾，並利用二乙醚洗淨。將濾液進行濃縮，藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標記化合物（0.048 g，0.22 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 1.19 - 1.33 (m, 21H), 1.43 (s, 1H), 1.47 (br s, 1H), 1.50 - 1.58 (m, 2H), 3.62 (t, J = 6.8 Hz, 2H)。

[製造例3] 9-溴壬酸3-戊基辛酯的合成 [化25]

在冰浴冷卻下，向9-溴壬酸（1.61 g，6.77 mmol）的二氯甲烷溶液（35 mL）添加草醯氯（0.95 mL，10.8 mmol）後，歷時40分鐘添加DMF（0.050 mL，0.68 mmol）。在室溫下攪拌40分鐘後，在減壓下進行濃縮，在甲苯中共沸。使殘渣溶解於二氯甲烷（35 mL）中，添加3-戊基辛烷-1-醇（1.36 g，6.77 mmol），在室溫下攪拌1小時。向反應混合物添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（2.22 g，5.28 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.3 Hz, 6H), 1.22 - 1.35 (m, 22H), 1.37 - 1.47 (m, 3H), 1.53 - 1.66 (m, 5H), 1.86 (quin, J = 7.2 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

[製造例4] 3-辛基十一烷-1-醇的合成 [化26]

（1）(E)-2-十一烯酸乙酯的合成在冰浴冷卻下，向2-(二乙氧基磷酸基)乙酸乙酯（5.0 mL，25.3 mmol）的THF（40 mL）懸浮液緩慢地添加60%氫化鈉（0.93 g，23.2 mmol）。在30分鐘後，滴加壬基醛（3.6 mL，21.1 mmol）的THF（40 mL）溶液，攪拌30分鐘。在室溫下攪拌2小時後，添加水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用無水硫酸鎂對有機相進行乾燥，過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。在冰浴冷卻下，向2-(二乙氧基磷酸基)乙酸乙酯（2.5 mL，12.7 mmol）的THF（20 mL）懸浮液緩慢地添加60%氫化鈉（1.0 g，25.0 mmol）後，滴加先前所獲得的粗產物的THF溶液（20 mL）。攪拌1小時後，添加水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用無水硫酸鎂對有機相進行乾燥，過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（3.07 g，14.6 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.22 - 1.35 (m, 14H), 1.41 - 1.50 (m, 2H), 2.15 - 2.23 (m, 2H), 4.14 - 4.22 (m, 2H), 5.81 (dt, J = 15.6, 1.5 Hz, 1H), 6.96 (dt, J = 15.6, 7.0 Hz, 1H)。

（2）3-辛基十一酸乙酯的合成使溴化銅（I）（0.21 g，1.45 mmol）與氯化鋰（0.12 g，2.89 mmol）在THF（40 mL）中懸浮，在室溫下攪拌10分鐘。在冰浴冷卻下，依序添加製造例4-（1）中所獲得的化合物（3.07 g，14.46 mmol）及氯化三甲基矽烷（2.2 mL，17.4 mmol），攪拌20分鐘。滴加辛基溴化鎂-THF溶液（2.0 M，8.7 mL，17.4 mmol），進而攪拌1.5小時。添加飽和氯化銨水溶液，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（4.43 g，13.58 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.19 - 1.33 (m, 34H), 1.35 - 1.35 (m, 1H), 1.84 (br d, J = 5.0 Hz, 1H), 2.21 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.12 (q, J = 7.2 Hz, 2H)。

（3）3-辛基十一烷-1-醇的合成在氮氣氛圍下，在室溫下將LAH-THF溶液（2 M，13.6 mL，27.1 mmol）滴加至製造例4-（2）中所獲得的化合物（4.43 g，13.56 mmol）的THF溶液（30 mL）中。在65℃下加熱5小時後，在冰浴冷卻下，依序添加水（1 mL）、氫氧化鈉水溶液（2 M，1 mL）及水（2 mL）。將反應混合物攪拌10分鐘後，利用矽藻土進行過濾，利用二乙醚進行洗淨。將濾液在減壓下進行濃縮，藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（4.43 g，quant）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.12 (br s, 1H), 1.19 - 1.33 (m, 30H), 1.39 - 1.44 (m, 2H), 1.49 - 1.54 (m, 2H), 3.62 - 3.71 (m, 2H)。

[製造例5] 6-溴己酸3-辛基十一烷基酯的合成 [化27]

使製造例4中所獲得的化合物（3.46 g，12.16 mmol）、6-溴己酸（2.61 g，13.38 mmol）及DMAP（0.15 g，1.22 mmol）溶解於二氯甲烷（22 mL）中，在冰浴冷卻下添加EDC・HCl（2.91 g，15.20 mmol），在室溫下攪拌3天。將反應混合物在減壓下進行濃縮，利用二乙醚進行稀釋。利用飽和碳酸氫鈉水溶液、水及10%檸檬酸水溶液進行洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。利用矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（4.67 g，10.09 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.21 - 1.32 (m, 30H), 1.39 (br s, 1H), 1.44 - 1.51 (m, 2H), 1.57 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.66 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.84 - 1.91 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

[製造例6] 4-溴丁酸苄酯的合成 [化28]

在室溫下，將草醯氯（1.6 mL，18.5 mmol）及DMF（0.40 mL，1.8 mmol）依序添加至4-溴丁酸（2.94 g，17.61 mmol）的二氯甲烷溶液（88 mL）中。在室溫下攪拌30分鐘後，添加苯甲醇（1.90 g，17.61 mmol），攪拌15分鐘。將反應混合物在減壓下進行濃縮，藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（3.64 g，14.09 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.61 (s, 1H), 2.21 (quin, J = 6.8 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.47 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 5.15 (s, 2H), 7.33 - 7.40 (m, 5H)。

[製造例7] 4-壬基十三烷-1-醇的合成 [化29]

（1）(E)-2-十二烯酸乙酯的合成在冰浴冷卻下，將2-(二乙氧基磷酸基)乙酸乙酯（6.4 mL，32.0 mmol）滴加至60%氫化鈉（1.28 g，32.0 mmol）的1,2-二甲氧基乙烷（70 mL）懸浮液中。20分鐘後，添加癸醛（5.0 mL，32.0 mmol）的1,2-二甲氧基乙烷（30 mL）溶液，在室溫下徹夜攪拌。添加飽和氯化銨水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取。利用無水硫酸鎂對有機相進行乾燥，過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。利用無水硫酸鎂對有機相進行乾燥，過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正戊烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（5.18 g，23.0 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.06 Hz, 4H), 1.25 - 1.32 (m, 18H), 1.45 (dt, J = 14.5, 7.3 Hz, 2H), 2.15 - 2.22 (m, 2H), 4.15 - 4.26 (m, 2H), 5.72 - 5.90 (m, 1H), 6.96 (dt, J = 15.6, 7.0 Hz, 1H)。

（2）3-壬基十二酸乙酯的合成依據製造例4-（2）的方法，從製造例7-（1）中所獲得的化合物（2.22 g，9.80 mmol）、溴化銅（I）（0.141 g，0.98 mmol）、氯化鋰（0.083 g，1.96 mmol）、氯化三甲基矽烷（1.4 mL，10.8 mmol）、壬基溴化鎂-THF溶液（1.0 M，10.8 mL，10.8 mmol）及THF（53 mL）獲得標題化合物（2.76 g，7.84 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.77 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.04 (br d, J = 7.3 Hz, 1H), 1.11 - 1.26 (m, 48H), 1.29 - 1.39 (m, 1H), 1.44 (s, 1H), 1.68 - 1.84 (m, 1H), 2.05 - 2.09 (m, 1H), 2.09 - 2.16 (m, 2H), 3.46 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.42 - 3.49 (m, 1H), 4.01 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 4.07 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 5.70 (dt, J = 15.7, 1.5 Hz, 1H), 6.85 (dt, J = 15.8, 7.0 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H)。

（3）3-壬基十二烷-1-醇的合成依據製造例4-（3）的方法，從製造例7-（2）中所獲得的化合物（2.76 g，7.80 mmol）、LAH-THF溶液（1 M，10.1 mL，10.1 mmol）及THF（15 mL）獲得標題化合物（1.34 g，4.29 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.18 (br s, 2H), 1.23 - 1.33 (m, 33H), 1.43 (br d, J = 9.9 Hz, 1H), 1.53 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.59 (br s, 1H), 3.67 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

（4）3-壬基十二醛的合成依據製造例2-（2）的方法，從製造例7-（3）中所獲得的化合物（0.30 g，0.97 mmol）、草醯氯（0.17 mL，1.94 mmol）、DMSO（0.27 mL，3.88 mmol）及三乙胺（0.68 mL，4.85 mmol）獲得標題化合物（0.30 g，quant）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.15 - 1.38 (m, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.55 (s, 1H), 1.95 (br s, 1H), 2.33 (dd, J = 6.6, 2.6 Hz, 2H), 9.77 (t, J = 2.4 Hz, 1H)。

（5）10-(3-甲氧基烯丙基)十九烷的合成在-78℃下將六甲基二矽氮烷鈉-THF溶液（1 M，3.2 mL，3.2 mmol）滴加至(甲氧基甲基)三苯基氯化鏻（1.10 g，3.21 mmol）的THF（5.0mL）溶液中。15分鐘後，在冰浴冷卻下，利用套管滴加至製造例7-（4）中所獲得的化合物（0.50 g，1.60 mmol）的THF（2.0mL）溶液中。攪拌1.5小時後，添加水，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（0.33 g，0.98 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.20 - 1.35 (m, 2H), 1.41 - 1.48 (m, 1H), 1.55 (s, 1H), 1.88 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 1.96 - 2.11 (m 1H), 3.52 (s, 1H), 3.57 (s, 1H), 4.32 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 4.69 (dt, J = 12.7, 7.4 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 6.25 (d, J = 12.8 Hz, 1H)。

（6）4-壬基三癸醛的合成使製造例7-（5）中所獲得的化合物（0.33 g，0.97 mmol）溶解於THF（2.0 mL）中，在室溫下添加1 N鹽酸（2.95 mL，2.95 mmol），在70℃下加熱。36小時後，添加水，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除，獲得標題化合物（0.28 g，0.87 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 7H), 1.20 - 1.34 (m, 39H), 1.44 (s, 1H), 1.54 - 1.62 (m, 3H), 2.37 - 2.43 (m, 2H), 9.78 (t, J = 1.8 Hz, 1H)。

（7）4-壬基十三烷-1-醇的合成使製造例7-（6）中所獲得的化合物（0.28 g，0.88 mmol）溶解於乙醇（13 mL）中，在0℃下添加硼氫化鈉（0.13 g，3.50 mmol）。1.5小時後，添加飽和氯化銨水溶液，利用二氯甲烷進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。利用無水硫酸鎂對有機相進行乾燥，過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除，獲得標題化合物（0.28 g，0.86 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.20 - 1.33 (m, 37H), 1.44 (s, 1H), 1.49 - 1.65 (m, 3H), 3.63 (t, J = 6.8 Hz, 2H)。

[製造例8] 5-溴庚酸苄酯的合成 [化30]

依據製造例6的方法，從5-溴戊酸（4.0 g，22.1 mmol）、苯甲醇（2.3 mL，22.1 mmol）、二氯甲烷（110 mL）、草醯氯（2.0 mL，23.2 mmol）及DMF（0.17 mL，2.21 mmol）獲得標題化合物（5.39 g，19.89 mmol）¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.62 (s, 1H), 1.79 - 1.85 (m, 2H), 1.88 - 1.93 (m, 2H), 2.41 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 5.14 (s, 2H), 7.33 - 7.40 (m, 5H)。

[製造例9] 3-己基壬烷-1-醇的合成 [化31]

（1）3-己基壬酸甲酯的合成依據製造例4-（2）的方法，從(E)-2-壬酸甲酯（3.6 mL，18.92 mmol）、溴化銅（I）（0.275 g，1.92 mmol）、氯化鋰（0.160 g，3.76 mmol）、氯化三甲基矽烷（2.7 mL，21.27 mmol）、己基溴化鎂-THF溶液（2.0 M，10.5 mL，21.0 mmol）及THF（50 mL）獲得標題化合物（4.18 g，16.27 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.86 - 0.91 (m, 7H), 1.12 - 1.37 (m, 25H), 1.79 - 1.87 (m, 1H), 2.23 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H)。

（2）3-己基壬烷-1-醇的合成依據製造例4-（3）的方法，從製造例9-（1）中所獲得的化合物（4.0 g，15.6 mmol）、LAH-THF溶液（2.4 M，13.0 mL，31.2 mmol）、THF（60 mL）獲得標題化合物（2.33 g，10.14 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.13 (br s, 1H), 1.19 - 1.34 (m, 20H), 1.41 (br s, 1H), 1.49 - 1.57 (m, 4H), 3.66 (br d, J = 5.5 Hz, 2H)。

[製造例10] 8-溴辛酸苄酯的合成 [化32]

依據製造例1的方法，使苯甲醇（1.3 mL，12.5 mmol）、8-溴辛酸（3.06 g，12.73 mmol）及DMAP（0.15 g，1.25 mmol）溶解於二氯甲烷（60 mL）中，在冰浴冷卻下添加EDC・HCl（2.99 g，15.61 mmol），在室溫下攪拌2小時。向反應混合物添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用二乙醚進行萃取抽。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（3.91 g，12.5 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.22 - 1.48 (m, 6H), 1.58 - 1.71 (m, 2H), 1.78 - 1.90 (m, 2H), 2.30 - 2.38 (m, 2H), 3.33 - 3.45 (m, 2H), 5.12 (s, 2H), 7.28 - 7.44 (m, 5H)。

＜陽離子性脂質的合成（1）＞ [實施例A-1] (3S)-1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯的合成（陽離子性脂質1） [化33]

（1）壬烷-1,1,9-三羧酸9-苄酯1,1-二三級丁酯的合成使60%氫化鈉（0.43 g，10.85 mmol）在DMF（40 mL）中懸浮，在冰浴冷卻下，緩慢地添加丙二酸二三級丁酯（2.2 mL，9.87 mmol）並攪拌5分鐘後，拆除冷卻浴，攪拌20分鐘。在冰浴冷卻下，依序添加碘化鈉（0.44 g，2.96 mmol）及製造例1中所獲得的化合物（3.39 g，10.36 mmol）後，在室溫下攪拌15小時。利用冰水浴將反應混合物進行冷卻，添加水，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（3.6 g，7.78 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.25 - 1.33 (m, 9H), 1.36 (s, 1H), 1.39 (s, 1H), 1.44 - 1.49 (m, 16H), 1.56 - 1.67 (m, 3H), 1.79 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.11 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 7.32 - 7.39 (m, 5H)。

（2）十九烷-1,9,9-三羧酸1-苄酯9,9-二三級丁酯的合成使實施例A-1-（1）中所獲得的化合物（3.6 g，7.78 mmol）溶解於DMF（36 mL）中，在水冷下添加60%氫化鈉（0.47 g，11.67 mmol）並攪拌10分鐘後，在室溫下攪拌20分鐘。添加1-碘癸烷（3.3 mL，15.56 mmol），在室溫下攪拌4小時。利用冰水浴將反應混合物進行冷卻，添加飽和氯化銨水溶液，利用正庚烷進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（3.4 g，5.64 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.83 - 0.93 (m, 3H), 1.05 - 1.36 (m, 26H), 1.44 (s, 18H), 1.57 - 1.68 (m, 2H), 1.71 - 1.82 (m, 4H), 2.29 - 2.39 (m, 2H), 5.11 (s, 2H), 7.28 - 7.42 (m, 5H)。

（3）2-[9-(苄氧基)-9-側氧基壬基]十二酸的合成使實施例A-1-（2）中所獲得的化合物（3.4 g，5.64 mmol）溶解於二氯甲烷（11.2 mL）中，在冰浴冷卻下滴加TFA（5.6 mL），在室溫下攪拌1.5小時。向反應混合物添加甲苯，在減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由將甲苯的添加及蒸餾去除反覆2次來進行乾燥，獲得2-{9-[(2-丁基辛基)氧基]-9-側氧基壬基}-2-癸基丙二酸的粗產物。使所獲得的粗產物溶解於二甲苯（12 mL）中，在150℃下攪拌8小時。使反應混合物恢復至室溫，在減壓下進行濃縮。藉由柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對所獲得的殘渣進行純化，獲得標題化合物（2.26 g，5.06 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.81 - 0.95 (m, 3H), 1.18 - 1.37 (m, 26H), 1.39 - 1.52 (m, 2H), 1.54 - 1.69 (m, 4H), 2.28 - 2.41 (m, 3H), 5.11 (s, 2H), 7.28 - 7.40 (m, 5H)。

（4）10-(羥甲基)二十酸苄酯的合成使實施例A-1-（3）中所獲得的化合物（2.2 g，4.93 mmol）溶解於THF（25 mL）中，在-15℃下滴加M硼烷-THF錯合物（0.92，8.0 mL，7.39 mmol），在0℃下攪拌2小時。添加飽和碳酸氫鈉水溶液，在室溫下攪拌5分鐘，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（1.86 g，4.30 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.81 - 0.95 (m, 3H), 1.12 - 1.38 (m, 31H), 1.39 - 1.50 (m, 1H), 1.58 - 1.72 (m, 2H), 2.23 - 2.36 (m, 2H), 3.48 - 3.59 (m, 2H), 5.11 (s, 2H), 7.28 - 7.41 (m, 5H)。

（5）10-{[(三級丁基二甲基矽基)氧基]甲基}二十酸苄酯的合成使實施例A-1-（4）中所獲得的化合物（700 mg，1.62 mmol）溶解於DMF（3.2 mL）中，在室溫下添加咪唑（165 mg，2.43 mmol）並使其溶解。在冰浴冷卻下添加三級丁基二甲基氯矽烷（293 mg，1.94 mmol），在室溫下攪拌3小時。向反應液添加水後，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（810 mg，1.48 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.02 (s, 6H), 0.77 - 0.97 (m, 12H), 1.06 - 1.47 (m, 31H), 1.64 (br. s, 2H), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.45 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 5.11 (s, 2H), 7.27 - 7.42 (m, 5H)。

（6）10-{[(三級丁基二甲基矽基)氧基]甲基}二十酸3-戊基辛酯的合成使實施例A-1-（5）中所獲得的化合物（810 mg，1.48 mmol）溶解於乙酸乙酯（10 mL）中，在室溫下添加10%鈀-碳（158 mg，50%含水），在氫氣氛圍下，在常壓下攪拌4.5小時。將反應液進行過濾，利用乙酸乙酯洗淨。將濾液在減壓下進行濃縮，獲得羧酸的粗產物（680 mg）。使所獲得的羧酸、3-戊基辛烷-1-醇（CAS 1443519-63-8）（416 mg，2.08 mmol）、DMAP（36 mg，0.30 mmol）溶解於二氯甲烷（7.4 mL）中，在冰浴冷卻下添加EDC・HCl（341 mg，1.78 mmol），在室溫下攪拌16小時。向反應混合物添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（926 mg，1.45 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.02 (s, 5H), 0.88 (s, 17H), 1.12 - 1.46 (m, 46H), 1.55 (s, 8H), 2.21 - 2.34 (m, 2H), 3.39 - 3.52 (m, 2H), 4.00 - 4.13 (m, 2H)。

（7）10-(羥甲基)二十酸3-戊基辛酯的合成使實施例A-1-（6）中所獲得的化合物（925 mg，1.45 mmol）溶解於THF（4.5 mL）中，在冰浴冷卻下緩慢地添加TBAF/THF溶液（1 M，3.6 mL）後，在室溫下攪拌1小時。向反應混合物添加水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（584 mg，1.11 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.78 - 0.99 (m, 9H), 1.26 (d, J = 2.9 Hz, 55H), 1.50 - 1.75 (m, 8H), 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.53 (s, 2H), 4.08 (t, J = 7.0 Hz, 2H)。

（8）(3S)-1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯的合成使實施例A-1-（7）中所獲得的化合物（50 mg，0.095 mmol）、DIPEA（0.036 mL，0.21 mmol）、(3S)-1-甲基吡咯啶-3-羧酸鹽酸鹽（32 mg，0.19 mmol）及DMAP（2.3 mg，0.019 mmol）溶解於二氯甲烷（0.8 mL）中，在冰浴冷卻下添加EDC・HCl（40 mg，0.21 mmol），在室溫下攪拌15小時。向反應混合物添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（正庚烷/乙酸乙酯/甲醇）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（47 mg，0.074 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.82 - 0.96 (m, 9H), 1.14 -1.48 (m, 49H), 1.51 - 1.73 (m, 4H), 2.03 - 2.16 (m, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.49 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 2.58 - 2.71 (m, 2H), 2.76 - 2.92 (m, 1H), 2.97 - 3.12 (m, 1H), 3.98 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.08 (s, 2H)。

＜陽離子性脂質的合成（2）＞ [實施例A-2] (3R)-1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯的合成（陽離子性脂質2） [化34]

（1）(3R)-3-(2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基)吡咯啶-1,3-二羧酸1-三級丁酯的合成依據實施例A-1-（8）的方法，從實施例A-1-（7）中所獲得的化合物（60 mg，0.11 mmol）、(R)-1-(三級丁氧基羰基)吡咯啶-3-羧酸（49 mg，0.23 mmol）、EDC・HCl（48 mg，0.25 mmol）、DIPEA（0.039 mL，0.23 mmol）、DMAP（2.8 mg，0.023 mmol）及二氯甲烷（0.80 mL）獲得標題化合物（80 mg，0.11 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.10 - 1.38 (m, 53H), 1.46 (s, 9H), 1.50 - 1.72 (m, 4H), 1.99 - 2.19 (m, 2H), 2.28 (s, 2H), 2.90 - 3.17 (m, 1H), 3.24 - 3.75 (m, 4H), 3.97 - 4.03 (m, 2H), 4.05 - 4.12 (m, 2H)。

（2）(3R)-1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯的合成使實施例A-2-（1）中所獲得的化合物（80 mg，0.11 mmol）溶解於二氯甲烷（2.2 mL）中，在室溫下滴加TFA（1.1 mL）並攪拌0.5小時。向反應混合物添加甲苯，在減壓下將溶劑蒸餾去除。使殘渣溶解於二氯甲烷（1 mL）中，在室溫下添加甲醛溶液（37%，0.25 mL，3.3 mmol）及硫酸鈉（0.79 g，5.54 mmol）並攪拌10分鐘。添加三(乙醯氧基)硼氫化鈉（117 mg，0.55 mmol），在室溫下攪拌16小時。向反應混合物添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用氯仿進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（乙酸乙酯/甲醇）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（20 mg，0.031 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.82 - 0.96 (m, 9H), 1.14 - 1.48 (m, 49H), 1.51 - 1.73 (m, 4H), 2.03 - 2.16 (m, 2H), 2.23 - 2.32 (m, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.49 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 2.58 - 2.71 (m, 2H), 2.76 - 2.92 (m, 1H), 2.97 - 3.12 (m, 1H), 3.98 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.04 - 4.12 (m, 2H)。

＜陽離子性脂質的合成（3）＞ [實施例A-3] 1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯的合成（陽離子性脂質3） [化35]

（1）1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-[9-(苄氧基)-9-側氧基壬基]十二烷基酯的合成使實施例A-1-（4）中所獲得的化合物（0.20 g，0.46 mmol）、DIPEA（0.161 mL，0.92 mmol）、1-甲基吡咯啶-3-羧酸鹽酸鹽（0.15 g，0.92 mmol）溶解於二氯甲烷（2.0 mL）中，添加EDC・HCl（0.19 g，1.02 mmol），在室溫下攪拌18小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，藉由矽膠柱層析法（乙酸乙酯/甲醇）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（0.15 g，0.28 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.27 (s, 40H), 1.61 - 1.67 (m, 3H), 1.74 - 1.86 (m, 1H), 2.07 - 2.13 (m, 2H), 2.34 - 2.38 (m, 6H), 2.47 - 2.52 (m, 1H), 2.61 - 2.66 (m, 2H), 2.85 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.02 - 3.07 (m, 1H), 3.99 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 5.08 (s, 1H), 5.12 (s, 2H), 7.31 - 7.38 (m, 5H)。

（2）1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{9-側氧基-9-[(4-戊基壬基)氧基]壬基}十二烷基酯的合成依據實施例A-1-（6），從實施例A-3-（1）中所獲得的化合物（0.15 g，0.28 mmol）、10%鈀/碳（0.30 g，50%含水）、乙酸乙酯（5 mL）獲得羧酸的粗產物。從所獲得的羧酸、製造例2-（4）中所獲得的化合物（0.048 g，0.23 mmol）、EDC・HCl（0.086 g，0.45 mmol）、DMAP（0.005 g，0.05 mmol）及二氯甲烷（1.0 mL）獲得標題化合物（0.081 g，0.14 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.86 - 0.91 (m, 9H), 1.20 - 1.33 (m, 54H), 1.56 - 1.65 (m, 5H), 2.05 - 2.14 (m, 2H), 2.29 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H), 2.50 (q, J = 7.7 Hz, 1H), 2.60 - 2.67 (m, 2H), 2.86 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.01 - 3.07 (m, 1H), 3.99 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 4.52 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.30 (s, 1H), 5.40 (br d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.47 - 5.53 (m, 1H)。

＜陽離子性脂質的合成（4）＞ [實施例A-4] 1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-壬基-11-側氧基-11-[(3-戊基辛基)氧基]十一烷基酯的合成（陽離子性脂質4） [化36]

（1）9-(3-戊基辛基)壬烷-1,1,9-三羧酸1,1-二三級丁酯的合成使丙二酸二三級丁酯（1.20 g，5.56 mmol）溶解於THF（26 mL）中，在冰浴冷卻下添加60%氫化鈉（0.22 g，5.56 mmol）並攪拌15分鐘。在室溫下攪拌10分鐘後，添加製造例3中所獲得的化合物（2.22 g，5.29 mmol）的THF（3 mL）溶液。在室溫下攪拌18小時後，添加水，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（1.79 g，3.39 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 1.26 (br s, 12H), 1.27 - 1.34 (m, 13H), 1.46 (s, 13H), 1.48 (s, 8H), 1.54 - 1.64 (m, 5H), 1.79 (br d, J = 7.0 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.11 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 3.19 (s, 1H), 3.41 (s, 1H), 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

（2）1-(3-戊基辛基)十八烷-1,9,9-三羧酸9,9-二三級丁酯的合成使實施例A-4-（1）中所獲得的化合物（0.96 g，1.72 mmol）溶解於THF（7.6 mL）中，在冰浴冷卻下添加60%氫化鈉（0.076 g，1.89 mmol）並攪拌20分鐘。在室溫下攪拌20分鐘後，添加1-碘壬烷（0.44 g，1.72 mmol）的THF（2 mL）溶液。進行6小時加熱回流後，添加水，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（0.59 g，0.86 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.83 - 0.94(m, 12H), 1.13 (br s, 6H), 1.27 (br d, J = 16.5 Hz, 43H), 1.31 - 1.36 (m, 4H), 1.41 - 1.48 (m, 28H), 1.51 - 1.65 (m, 5H), 1.70 - 1.85 (m, 6H), 2.22 - 2.34 (m, 2H), 4.02 - 4.15 (m, 2H)。

（3）2-壬基-11-側氧基-11-[(3-戊基辛基)氧基]十一酸的合成依據實施例A-1-（3）的方法，從實施例A-4-（2）中所獲得的化合物（0.59 g，0.86 mmol）、二氯甲烷（2 mL）、TFA（1 mL）及二甲苯（2 mL）獲得標題化合物（0.18 g，0.35 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.84 - 0.92 (m, 9H), 1.17 - 1.33 (m, 42H), 1.36 - 1.51 (m, 4H), 1.54 - 1.66 (m, 6H), 2.24 - 2.37 (m, 3H), 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

（4）10-(羥甲基)十九酸3-戊基辛酯的合成依據製造例2-（1）的方法，從實施例A-4-（3）中所獲得的化合物（0.093 g，0.18 mmol）、硼烷-THF錯合物（1 M，0.35 mL，0.35 mmol）、硼烷-THF錯合物（1 M，0.53 mL，0.53 mmol）及THF（2.0 mL）獲得標題化合物（0.068 g，0.14 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.87 - 0.90 (m, 10H), 1.27 (br dd, J = 11.4, 7.3 Hz, 52H), 1.40 - 1.46 (m, 7H), 1.56 - 1.63 (m, 4H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.53 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

（5）1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-壬基-11-側氧基-11-[(3-戊基辛基)氧基]十一烷基酯的合成使實施例A-4-（4）中所獲得的化合物（0.069 g，0.13 mmol）、DIPEA（0.047 mL，0.27 mmol）、1-甲基吡咯啶-3-羧酸鹽酸鹽（0.044 g，0.27 mmol）及DMAP（3 mg，0.03 mmol）溶解於二氯甲烷（1 mL）及THF（1 mL）中，添加EDC・HCl（0.057 g，0.30 mmol），並在室溫下攪拌18小時。將反應混合物在減壓下進行濃縮，藉由矽膠柱層析法（乙酸乙酯/甲醇）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（0.046 g，0.072 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 1.19 - 1.33 (m, 46H), 1.41 (br s, 1H), 1.58 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.60 - 1.66 (m, 3H), 1.70 (br s, 1H), 2.07 - 2.17 (m, 2H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H), 2.50 (q,J = 8.0 Hz, 1H), 2.58 - 2.69 (m, 2H), 2.85 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.05 (tt, J = 8.8, 6.7 Hz, 1H), 3.99 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

＜陽離子性脂質的合成（5）＞ [實施例A-5] 1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{6-[(3-辛基十一烷基)氧基]-6-側氧基己基}十二烷基酯的合成（陽離子性脂質5） [化37]

（1）6-(3-辛基十一烷基)己烷-1,1,6-三羧酸1,1-二三級丁酯的合成使60%氫化鈉（0.43 g，10.62 mmol）在THF（21 mL）中懸浮，在冰浴冷卻下滴加丙二酸二三級丁酯（2.4 mL，10.6 mmol）。歷時30分鐘升溫至室溫後，在冰浴冷卻下添加製造例5中所獲得的化合物（4.67 g，10.12 mmol）及碘化鈉（0.15 g，1.01 mmol），在室溫下攪拌18小時。向反應混合物添加水，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（2.9 g，5.10 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.19 - 1.31 (m, 31H), 1.31 - 1.36 (m, 5H), 1.41 - 1.51 (m, 26H), 1.55 - 1.58 (m, 2H), 1.59 - 1.67 (m, 2H), 1.79 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.10 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.07 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

（2）1-(3-辛基十一烷基)十六烷-1,6,6-三羧酸6,6-二三級丁酯的合成依據實施例A-4-（2）的方法，從實施例A-5-（1）中所獲得的化合物（2.25 g，3.78 mmol）、1-碘癸烷（1.0 g，3.78 mmol）、60%氫化鈉（0.17 g，4.15 mmol）及THF（16.7 mL）獲得標題化合物（0.99 g，1.32 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.01 (s, 1H), 0.89 (td, J = 7.1, 2.8 Hz, 9H), 1.06 - 1.23 (m, 6H), 1.26 (br d, J = 7.0 Hz, 34H), 1.30 - 1.37 (m, 5H), 1.40 (br s, 1H), 1.42 - 1.49 (m, 18H), 1.52 - 1.65 (m, 6H), 1.71 - 1.85 (m, 4H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

（3）2-{6-[(3-辛基十一烷基)氧基]-6-側氧基己基}十二酸的合成依據實施例A-1-（3）的方法，從實施例A-5-（2）中所獲得的化合物（0.99 g，1.34 mmol）、二氯甲烷（3 mL）、TFA（1.4 mL）獲得二羧酸的粗產物（1.01 g）。從所獲得的粗產物（0.84 g）及二甲苯（3 mL）獲得標題化合物（0.31 g，0.55 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 11H), 1.23 - 1.36 (m, 60H), 1.40 (br s, 1H), 1.48 (br dd, J = 13.8, 6.1 Hz, 2H), 1.56 - 1.66 (m, 7H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.33 - 2.36 (m, 1H), 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

（4）7-(羥甲基)十七酸3-辛基十一烷基酯的合成依據製造例2-（1）的方法，從實施例A-5-（3）中所獲得的化合物（0.31 g，0.54 mmol）、硼烷-THF錯合物（1 M，1.1 mL，1.1 mmol）及THF（6.0 mL）獲得標題化合物（0.19 g，0.33 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 10H), 1.22 - 1.37 (m, 55H), 1.40 (br s, 1H), 1.43 - 1.47 (m, 1H), 1.57 (q, J = 6.6 Hz, 3H), 1.61 - 1.70 (m, 2H), 2.29 (t, J = 7.5 H, 2H), 3.54 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

（5）1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{6-[(3-辛基十一烷基)氧基]-6-側氧基己基}十二烷基酯的合成依據實施例A-4-（5）的方法，從實施例A-5-（4）中所獲得的化合物（0.19 g，0.33 mmol）、1-甲基吡咯啶-3-羧酸鹽酸鹽（0.11 g，0.67 mmol）、EDC・HCl（0.14 g，0.73 mmol）、DIPEA（0.116 mL，0.67 mmol）、DMAP（8 mg，0.07 mmol）及二氯甲烷（1.5 mL）獲得標題化合物（0.055 g，0.083 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.20 - 1.34 (m, 53H), 1.40 (br s, 1H), 1.57 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.61 - 1.66 (m, 3H), 2.05 - 2.17 (m, 2H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.45 - 2.56 (m, 1H), 2.64 (dd, J = 9.5, 7.0 Hz, 1H), 2.68 (dt, J = 9.1, 6.5 Hz, 1H), 2.90 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.06 (quin, J = 7.8 Hz, 1H), 3.99 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。

＜陽離子性脂質的合成（6）＞ [實施例A-6] 1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{4-[(4-壬基十三烷基)氧基]-4-側氧基丁基}十二烷基酯的合成（陽離子性脂質6） [化38]

（1）丁烷-1,1,4-三羧酸4-苄酯1,1-二三級丁酯的合成依據實施例A-4-（1）的方法，從丙二酸二三級丁酯（2.65 g，12.25 mmol）、THF（58 mL）、60%氫化鈉（0.49 g，12.25 mmol）及製造例6中所獲得的化合物（3.00 g，11.67 mmol）獲得標題化合物（2.93 g，7.46 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.43 - 1.48 (m, 20H), 1.66 - 1.72 (m, 2H), 1.82 - 1.86 (m, 2H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.13 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 7.31 - 7.38 (m, 5H)。

（2）十四烷-1,4,4-三羧酸1-苄酯4,4-二三級丁酯的合成使實施例A-6-（1）中所獲得的化合物（2.93 g，7.46 mmol）溶解於THF（38 mL）中，在冰浴冷卻下添加60%氫化鈉（0.31 g，7.83 mmol）並攪拌1小時。添加1-碘癸烷（2.10 g，7.83 mmol）的THF（5 mL）溶液，進行徹夜加熱回流。添加水，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（環己烷/二乙醚）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（2.59 g，4.85 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.09 - 1.20 (m, 2H), 1.22 - 1.33 (m, 15H), 1.45 (s, 18H), 1.48 - 1.56 (m, 2H), 1.59 (s, 1H), 1.76 - 1.84 (m, 4H), 2.37 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 5.12 (s, 2H), 7.32 - 7.38 (m, 5H)。

（3）2-[4-(苄氧基)-4-側氧基丁基]十二酸的合成依據實施例A-1-（3）的方法，從實施例A-6-（2）中所獲得的化合物（2.59 g，4.87 mmol）、二氯甲烷（11 mL）及TFA（5 mL）獲得二羧酸的粗產物（2.34 g）。從所獲得的粗產物（2.05 g）及二甲苯（11 mL）獲得標題化合物（1.58 g，4.21 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.07 - 1.22 (m, 1H), 1.24 - 1.32 (m, 16H), 1.41 - 1.57 (m, 2H), 1.60 - 1.74 (m, 4H), 2.34 - 2.41 (m, 3H), 5.10 - 5.15 (m, 2H), 7.31 - 7.40 (m, 5H)。

（4）1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{4-[(4-壬基十三烷基)氧基]-4-側氧基丁基}十二烷基酯的合成依據製造例2-（1）的方法，從實施例A-6-（3）中所獲得的化合物（1.58 g，4.21 mmol）、硼烷-THF錯合物（1 M，8.4 mL，8.4 mmol）及THF（48 mL）獲得標題化合物（1.29 g，3.54 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.24 - 1.34 (m, 22H), 1.35 - 1.42 (m, 2H), 1.46 - 1.50 (m, 1H), 1.67 (quin, J = 7.7 Hz, 3H), 2.36 - 2.39 (m, 2H), 3.51 - 3.58 (m, 2H), 5.13 (s, 2H), 7.32 - 7.39 (m, 5H)。

（5）1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-[4-(苄氧基)-4-側氧基丁基]十二烷基酯的合成依據實施例A-4-（5）的方法，從實施例A-6-（4）中所獲得的化合物（0.50 g，1.4 mmol）、1-甲基吡咯啶-3-羧酸鹽酸鹽（0.46 g，2.76 mmol）、EDC・HCl（0.58 g，3.03 mmol）、DIPEA（0.48 mL，2.76 mmol）、DMAP（34 mg，0.28 mmol）及二氯甲烷（2 mL）獲得標題化合物（0.33 g，0.71 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.23 - 1.36 (m, 23H), 1.42 (s, 5H), 1.63 - 1.69 (m, 3H), 1.85 (dt, J = 6.3, 3.3 Hz, 1H), 2.06 - 2.11 (m, 2H), 2.33 - 2.36 (m, 6H), 2.49 (q, J = 7.7 Hz, 1H), 2.59 - 2.64 (m, 2H), 2.82 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 2.94 (s, 1H), 3.02 (br t, J = 8.3 Hz, 1H), 3.74 (br t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.96 - 4.00 (m, 2H), 5.11 (s, 2H), 7.31 - 7.37 (m, 5H)。

（6）1-甲基吡咯啶-3-羧酸2-{4-[(4-壬基十三烷基)氧基]-4-側氧基丁基}十二烷基酯的合成依據實施例A-1-（6），從實施例A-6-（5）中所獲得的化合物（0.18 g，0.37 mmol）、10%鈀/碳（0.20 g，50%含水）及乙酸乙酯（9 mL）獲得羧酸的粗產物（0.15 g）。從所獲得的羧酸（0.086 g，0.23 mmol）、製造例7-（7）中所獲得的化合物（0.050 g，0.16 mmol）、EDC・HCl（0.086 g，0.45 mmol）、DIPEA（0.074 mL，0.45 mmol）及二氯甲烷（1.0 mL）獲得標題化合物（9 mg，0.014 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.21 - 1.37 (m, 57H), 1.57 - 1.70 (m, 7H), 2.06 - 2.15 (m, 2H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H), 2.45 - 2.57 (m, 1H), 2.64 (ddd, J = 9.4, 6.8, 2.9 Hz, 2H), 2.85 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.00 - 3.08 (m, 1H), 3.97 - 4.07 (m, 4H)。

＜陽離子性脂質的合成（7）＞ [實施例A-7] 6-{[(1-甲基吡咯啶-3-羰基)氧基]甲基}十一烷二酸雙(3-壬基十二烷基)酯的合成（陽離子性脂質7） [化39]

（1）戊烷-1,1,5-三羧酸5-苄酯1,1-二三級丁酯的合成依據實施例A-4-（1）的方法，從丙二酸二三級丁酯（2.34 g，10.84 mmol）、THF（52 mL）、60%氫化鈉（0.26 g，10.8 mmol）及製造例8中所獲得的化合物（2.8 g，10.3 mmol）獲得標題化合物（2.09 g，5.77 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.26 - 1.41 (m, 3H), 1.43 - 1.49 (m, 20H), 1.55 - 1.60 (m, 1H), 1.69 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.78 - 1.86 (m, 2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.11 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 5.11 (s, 2H), 7.31 - 7.40 (m, 5H)。

（2）壬烷-1,5,5,9-四羧酸1,9-二苄酯5,5-二三級丁酯的合成使實施例A-7-（1）中所獲得的化合物（2.09 g，5.14 mmol）溶解於THF（23 mL）中，在室溫下依序添加60%氫化鈉（0.23 g，5.66 mmol）及碘化鈉（0.077 g，0.51 mmol）並攪拌30分鐘。向反應混合物添加製造例8中所獲得的化合物（1.39 g，5.14 mmol）的THF（2 mL）溶液，並在65℃下進行加熱。3天後，添加冰水，利用二乙醚進行萃取。利用飽和食鹽水將有機相洗淨，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾後，將溶劑在減壓下蒸餾去除。藉由矽膠柱層析法（二乙醚/正戊烷）對殘渣進行純化，獲得標題化合物（2.27 g，3.80 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.13 - 1.20 (m, 4H), 1.42 (s, 17H), 1.58 - 1.70 (m, 4H), 1.74 - 1.80 (m, 4H), 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 5.10 (s, 4H), 7.29 - 7.39 (m, 10H)。

（3）7-(苄氧基)-2-[5-(苄氧基)-5-側氧基戊基]-7-側氧基戊酸的合成依據實施例A-1-（3）的方法，從實施例A-7-（2）中所獲得的化合物（2.27 g，3.80 mmol）、二氯甲烷（9 mL）及TFA（4.1 mL）獲得二羧酸的粗產物（2.02 g）。從所獲得的粗產物及二甲苯（10 mL）獲得標題化合物（1.47 g，3.34 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.27 - 1.41 (m, 5H), 1.42 - 1.50 (m, 6H), 1.59 - 1.70 (m, 7H), 2.31 - 2.40 (m, 5H), 5.12 (s, 4H), 7.31 - 7.38 (m, 10H)。

（4）6-(羥甲基)十一烷二酸二苄酯的合成依據製造例2-（1）的方法，從實施例A-7-（3）中所獲得的化合物（1.47 g，3.33 mmol）、硼烷-THF錯合物（1 M，6.7 mL，6.7 mmol）及THF（38 mL）獲得標題化合物（1.14 g，2.70 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.24 - 1.38 (m, 10H), 1.42 - 1.47 (m, 3H), 1.65 (quin, J = 7.2 Hz, 4H), 1.71 (br s, 1H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 3.50 (br d, J = 4.0 Hz, 2H), 5.12 (s, 4H), 7.31 - 7.39 (m, 7H)。

（5）6-{[(1-甲基吡咯啶-3-羰基)氧基)甲基]十一烷二酸二苄酯的合成依據實施例A-4-（5）的方法，從實施例A-7-（4）中所獲得的化合物（1.14 g，2.68 mmol）、1-甲基吡咯啶-3-羧酸鹽酸鹽（0.89 g，5.36 mmol）、EDC・HCl（1.13 g，5.90 mmol）、DIPEA（0.93 mL，5.36 mmol）、DMAP（0.066 g，0.54 mmol）及二氯甲烷（12 mL）獲得標題化合物（0.56 g，1.05 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.26 - 1.38 (m, 9H), 1.59 - 1.70 (m, 5H), 1.81 (br s, 1H), 2.06 - 2.14 (m, 2H), 2.34 - 2.40 (m, 7H), 2.47 - 2.55 (m, 1H), 2.58 - 2.68 (m, 2H), 2.84 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.04 (quin, J = 7.7 Hz, 1H), 3.98 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 5.13 (s, 4H), 5.32 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.32 - 7.40 (m, 10H)。

（6）6-{[(1-甲基吡咯啶-3-羰基)氧基)甲基]十一烷二酸雙(3-壬基十二烷基)酯的合成依據實施例A-1-（6），從實施例A-7-（5）中所獲得的化合物（0.56 g，1.03 mmol）、10%鈀/碳（0.55 g，50%含水）及乙酸乙酯（27 mL）獲得二羧酸的粗產物（0.24 g）。從所獲得的羧酸（0.055 g，0.15 mmol）、製造例7-（3）中所獲得的化合物（0.096 g，0.31 mmol）、EDC・HCl（0.118 g，0.62 mmol）、DIPEA（0.11 mL，0.62 mmol）、DMAP（4 mg，0.031 mmol）及二氯甲烷（0.7 mL）獲得標題化合物（0.029 g，0.030 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 13H), 1.12 - 1.45 (m, 84H), 1.48 - 1.70 (m, 12H), 2.09 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.36 (s, 3H), 2.45 - 2.57 (m, 1H), 2.63 (br dd, J = 8.9, 6.9 Hz, 2H), 2.83 (br t, J = 8.6 Hz, 1H), 3.03 (quin, J = 7.7 Hz, 1H), 3.94 - 4.02 (m, 2H), 4.07 (t, J = 7.2 Hz, 4H)。

＜陽離子性脂質的合成（8）＞ [實施例A-8] 9-{[(1-甲基吡咯啶-4-羰基)氧基]甲基}十七烷二酸雙(3-戊基辛基)酯的合成（陽離子性脂質8） [化40]

（1）辛烷-1,1,8-三羧酸8-苄酯1,1-二三級丁酯的合成依據實施例A-5-（1）的方法，從丙二酸二三級丁酯（1.5 mL，6.70 mmol）、製造例10中所獲得的化合物（2.0 g，6.39 mmol）、60%氫化鈉（0.27 g，6.70 mmol）、碘化鈉（0.096 g，0.64 mmol）及THF（60 mL）獲得標題化合物（1.60 g，3.57 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.23 - 1.36 (m, 8H), 1.45 (s, 18H), 1.58 - 1.69 (m, 2H), 1.72 - 1.84 (m, 2H), 2.30 - 2.40 (m, 2H), 3.05 - 3.15 (m, 1H), 5.11 (s, 2H), 7.28 - 7.41 (m, 5H)。

（2）十五烷-1,8,8,15-四羧酸1,15-二苄酯8,8-二三級丁酯的合成依據實施例A-7-（2）的方法，從實施例A-8-（1）中所獲得的化合物（1.6 g，3.57 mmol）、製造例10中所獲得的化合物（1.17 g，3.75 mmol）、碘化鈉（0.053 g，0.36 mmol）、60%氫化鈉（0.16 g，4.0 mmol）及THF（15 mL）獲得標題化合物（1.4 g，2.07 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.03 - 1.17 (m, 4H), 1.23 - 1.36 (m, 12H), 1.43 (s, 18H), 1.56 - 1.68 (m, 4H), 1.70 - 1.80 (m, 4H), 2.29 - 2.38 (m, 4H), 5.11 (s, 4H), 7.27 - 7.41 (m, 10H)。

（3）10-(苄氧基)-2-[8-(苄氧基)-8-側氧基辛基]-10-側氧基癸酸的合成依據實施例A-1-（3）的方法，從實施例A-8-（2）中所獲得的化合物（1.40 g，2.06 mmol）、二氯甲烷（10 mL）及TFA（2.4 mL）獲得二羧酸的粗產物（1.17 g）。從所獲得的粗產物及二甲苯（25 mL）獲得標題化合物（0.83 g，1.61 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.18 - 1.37 (m, 16H), 1.38 - 1.71 (m, 8H), 2.26 - 2.41 (m, 5H), 5.11 (s, 4H), 7.28 - 7.43 (m, 10H)。

（4）9-(羥甲基)十七烷二酸二苄酯的合成依據製造例2-（1）的方法，從實施例A-8-（3）中所獲得的化合物（0.83 g，1.59 mmol）、硼烷-THF錯合物（1 M，4.0 mL，4.0 mmol）及THF（6.0 mL）獲得標題化合物（0.72 g，1.43 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.12 - 1.51 (m, 22H), 1.56 - 1.72 (m, 4H), 2.29 - 2.41 (m, 4H), 3.47 - 3.58 (m, 2H), 5.11 (s, 4H), 7.28 - 7.44 (m, 10H)。

（5）9-{[(1-甲基吡咯啶-3-羰基)氧基]甲基}十七烷二酸二苄酯的合成依據實施例A-4-（5）的方法，從實施例A-8-（4）中所獲得的化合物（0.73 g，1.43 mmol）、1-甲基吡咯啶-3-羧酸鹽酸鹽（0.36 g，2.14 mmol）、EDC・HCl（0.438 g，2.29 mmol）、DIPEA（0.37 mL，2.14 mmol）、DMAP（0.035 g，0.29 mmol）及二氯甲烷（6 mL）獲得標題化合物（0.81 g，1.30 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 1.13 - 1.35 (m, 22H), 1.58 - 1.69 (m, 5H), 2.04 - 2.14 (m, 2H), 2.29 - 2.39 (m, 7H), 2.43 - 2.54 (m, 1H), 2.57 - 2.67 (m, 2H), 2.84 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 2.99 - 3.08 (m, 1H), 3.97 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 5.11 (s, 4H), 7.29 - 7.40 (m, 9H)。

（6）9-{[(1-甲基吡咯啶-3-羰基)氧基]甲基}十七烷二酸雙(3-己基壬基)酯的合成依據實施例A-1-（6），從實施例A-8-（5）中所獲得的化合物（0.81 g，1.30 mmol）、10%鈀/碳（0.028 g，50%含水）及乙酸乙酯（15 mL）獲得二羧酸的粗產物（0.66 g）。從所獲得的二羧酸（0.10 g，0.23 mmol）、製造例9-（2）中所獲得的化合物（0.124 g，0.54 mmol）、EDC・HCl（0.113 g，0.59 mmol）、DIPEA（0.10 mL，0.59 mmol）、DMAP（6 mg，0.050 mmol）及二氯甲烷（5 mL）獲得標題化合物（0.077 g，0.090 mmol）。¹ H-NMR(600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 13H), 1.18 - 1.35 (m, 64H), 1.37 - 1.42 (m, 2H), 1.52 - 1.66 (m, 9H), 2.06 - 2.13 (m, 2H), 2.25 - 2.32 (m, 4H), 2.36 (s, 3H), 2.45 - 2.53 (m, 1H), 2.59 - 2.66 (m, 2H), 2.85 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.00 - 3.08 (m, 1H), 3.98 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 7.1 Hz, 4H)。

＜陽離子性脂質的合成（9）＞ [實施例A-9] 9-{[(1-甲基吡咯啶-3-羰基)氧基]甲基}十七烷二酸雙(3-戊基辛基)酯的合成（陽離子性脂質9） [化41]

依據實施例A-1-（6），從實施例A-8-（6）中所獲得的二羧酸（0.10 g，0.23 mmol）、3-戊基辛烷-1-醇（CAS 1443519-63-8）（0.11 g，0.54 mmol）、EDC・HCl（0.11 g，0.59 mmol）、DIPEA（0.10 mL，0.59 mmol）、DMAP（6 mg，0.050 mmol）及二氯甲烷（5 mL）獲得標題化合物（0.089 g，0.11 mmol）。¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 13H), 1.17 - 1.34 (m, 56H), 1.37 - 1.43 (m, 2H), 1.53 - 1.69 (m, 10H), 2.06 - 2.14 (m, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.36 (s, 3H), 2.45 - 2.53 (m, 1H), 2.58 - 2.66 (m, 2H), 2.84 (t, J = 8.9 Hz, 1H), 3.00 - 3.08 (m, 1H), 3.98 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 7.1 Hz, 4H)。

＜陽離子性脂質的合成（10）＞ [比較例A'-1] 1-甲基氮雜環庚烷-4-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯的合成（陽離子性脂質10） [化42]

（1）氮雜環庚烷-1,4-二羧酸1-三級丁酯4-(2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基)酯的合成依據實施例A-1-（8）的方法，從實施例A-1-（7）中所獲得的化合物（60 mg，0.11 mmol）、1-(三級丁氧基羰基)氮雜環庚烷-4-羧酸（56 mg，0.23 mmol）、EDC・HCl（48 mg，0.25 mmol）、DIPEA（0.039 mL，0.23 mmol）、DMAP（2.8 mg，0.023 mmol）及二氯甲烷（0.80 mL）獲得標題化合物（81 mg，0.11 mmol）。

（2）1-甲基氮雜環庚烷-4-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯的合成依據實施例A-2-（2）的方法，從比較例A'-1（1）中所獲得的化合物（81 mg，0.11 mmol）、TFA（1.1 mL）、THF（1 mL）、甲醛溶液（37%，0.080 mL，1.1 mmol）、硫酸鈉（460 mg，3.23 mmol）及三(乙醯氧基)硼氫化鈉（69 mg，0.32 mmol）獲得標題化合物（51 mg，0.077 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.14 - 1.49 (m, 49H), 1.51 - 1.71 (s, 4H), 1.73 - 2.10 (m, 5H), 2.23 - 2.31 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.45 - 2.76 (m, 5H), 3.92 - 3.98 (m, 2H), 4.03 - 4.12 (m, 2H)。

＜陽離子性脂質的合成（11）＞ [比較例A'-2] 9-溴壬酸2-丁基辛酯的合成（陽離子性脂質11） [化43]

依據實施例A-1-（8）的方法，從實施例A-1-（7）中所獲得的化合物（50 mg，0.095 mmol）、1-甲基-3-吖丁啶羧酸（22 mg，0.19 mmol）、EDC・HCl（40 mg，0.21 mmol）、DIPEA（0.033 mL，0.19 mmol）、DMAP（2.3 mg，0.019 mmol）及二氯甲烷（0.80 mL）獲得標題化合物（30 mg，0.048 mmol）。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ (ppm) : 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.14 - 1.47 (m, 44H), 1.61 (s, 8H), 2.30 (s, 5H), 3.26 (s, 3H), 3.46 - 3.64 (m, 2H), 3.99 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 7.1 Hz, 2H)。

將所合成的陽離子性脂質1～11示於下述表A。 [表A] 表A：所合成的陽離子性脂質1～11

B.組成物的製備及分析＜組成物的製備（1）＞ [實施例B-1] 使用實施例A-1的陽離子性脂質1而製備組成物。作為核酸，使用包含正義鏈5'-GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCT*T-3'（T：DNA、fU，fC=2'-Fluoro RNA、*=硫代磷酸酯鍵）（序列編號1）、反義股5'-GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCT*T-3'（T：DNA、fU，fC=2'-Fluoro RNA、*=硫代磷酸酯鍵）（序列編號2）的鹼基序列的抑制凝血因子VII（Factor VII）基因表現的siRNA，且該siRNA經過退火（Gene Design股份有限公司，以下有時稱為“凝血因子VII siRNA”）。

利用25 mM乙酸鈉水溶液（pH值4.0）使凝血因子VII siRNA以80 μg/mL溶解，製成siRNA稀釋液。另外，將陽離子性脂質1、DSPC（日本精化股份有限公司）、Cholesterol（日本精化股份有限公司）、MPEG2000-DMG（日油股份有限公司，甲氧基(聚乙二醇，分子量=2000)-二肉豆蔻基甘油）以60/8.5/30/1.5（莫耳比）的比例並以總脂質濃度成為7.2 mM的方式溶解於乙醇中，製成脂質溶液。將siRN稀釋液與脂質溶液分別以3 mL/min、1 mL/min的流速投入並混合，由此獲得脂質複合體水溶液。將所獲得的脂質複合體水溶液供於使用透析膜（商品名“Float-A-Lyzer G2”，SPECTRΜM公司，100K MWCO）的透析，將外液置換為磷酸緩衝液（PBS，pH值7.4）。透析後，進行濃縮及過濾殺菌，而獲得實施例B-1的液體組成物。

[實施例B-2] 使用實施例A-2的陽離子性脂質2代替陽離子性脂質1以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-1相同的方式獲得實施例B-2的組成物。

[比較例B'-1] 使用比較例A'-1的陽離子性脂質10代替陽離子性脂質1以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-1相同的方式獲得比較例B'-1的組成物。

[比較例B'-2] 使用比較例A'-2的陽離子性脂質11代替陽離子性脂質1以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-1相同的方式獲得比較例B'-2的組成物。

＜組成物的分析（1）＞對於實施例B-1、實施例B-2、比較例B'-1及比較例B'-2的組成物，測定siRNA向脂質複合體的封入率。

具體來說，將利用無核糖核酸酶水稀釋組成物並使用Quant-iT RiboGreen RNA試劑（Invitrogen公司）所測得的siRNA濃度（A）設為存在於脂質複合體外液中的siRNA。另外，將利用1% Triton X-100稀釋組成物後所測得的siRNA濃度（B）設為組成物中的總siRNA濃度。繼而，藉由下式（F1）算出核酸的封入率。封入率（%）＝100－（A/B）×100 （F1）

另外，藉由粒徑測定裝置（商品名“Zetasizer Nano ZS”，Malvern公司製造）測定脂質複合體的平均粒徑。

在表1中表示siRNA的封入率以及脂質複合體的平均粒徑（Z-平均）及多分散指數。

[表1] 表1

確認到實施例B-1及實施例B-2的組成物顯示出與比較例B'-1及比較例B'-2的組成物同等的較高的siRNA的封入率。

＜組成物的製備（2）＞ [實施例B-3] 使用實施例A-3的陽離子性脂質3代替陽離子性脂質1以作為陽離子性脂質，除此以外，以與組成物的製備（1）中的實施例B-1相同的方式獲得實施例B-3的組成物。

[實施例B-4] 使用實施例A-4的陽離子性脂質4代替陽離子性脂質3以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-3相同的方式獲得實施例B-4之組成物。

[實施例B-5] 使用實施例A-5的陽離子性脂質5代替陽離子性脂質3以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-3相同的方式獲得實施例B-5之組成物。

[實施例B-6] 使用實施例A-6的陽離子性脂質6代替陽離子性脂質3以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-3相同的方式獲得實施例B-6之組成物。

[實施例B-7] 使用實施例A-7的陽離子性脂質7代替陽離子性脂質3以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-3相同的方式獲得實施例B-7之組成物。

[實施例B-8] 使用實施例A-8的陽離子性脂質8代替陽離子性脂質3以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-3相同的方式獲得實施例B-8之組成物。

[實施例B-9] 使用實施例A-9的陽離子性脂質9代替陽離子性脂質3以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-3相同的方式獲得實施例B-9之組成物。

[實施例B-10] 使用實施例A-1的陽離子性脂質1代替陽離子性脂質3以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-3相同的方式獲得實施例B-10之組成物。

[比較例B'-3] 代替陽離子性脂質3，依據專利文獻2所記載的方法合成專利文獻2所記載的下述式（i）所表示的9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬烷-2-烯-1-基)酯（以下，有時稱為“ALN-319”）並使用以作為陽離子性脂質，除此以外，以與實施例B-3相同的方式獲得比較例B'-3之組成物。

[化44]

＜組成物的分析（2）＞以與組成物的分析（1）相同的方式，對於實施例B-3～實施例B-10及比較例B'-3之組成物，測定siRNA向脂質複合體的封入率、及脂質複合體的平均粒徑。於表2中表示siRNA的封入率、脂質複合體的平均粒徑（Z-平均）、及多分散指數。 [表2] 表2

＜組成物的分析（4）＞進而，將實施例B-3～實施例B-9及比較例B'-3之組成物在密閉的小玻璃瓶中在4℃下保管1.5個月，以與組成物的分析（1）相同的方式測定脂質複合體的平均粒徑（保管後平均粒徑）。在表3中表示脂質複合體的平均粒徑（Z-平均）的變化。表中，平均粒徑的變化（%）係藉由保管後平均粒徑/保管前平均粒徑×100來算出。

[表3] 表3

實施例B-3～實施例B-9之組成物即便在保管1.5個月後，平均粒徑也基本上不產生變化，且與比較例B'-3的組成物相比，物理上也穩定。該等結果表示本發明的陽離子性脂質能夠在保管了一定期間的情況下抑制脂質複合體的粒徑增大。

C.試驗例 [試驗例1] 利用PBS，將實施例B-1、實施例B-2、比較例B'-1及比較例B'-2的組成物以封入至脂質複合體中的凝血因子VII siRNA濃度成為3 μg/mL或30 μg/mL的方式進行稀釋。將各組成物以10 mL/kg的給予容量尾靜脈內給予至ICR小鼠（n＝3）中，在給予1天後在麻醉下實施採血。藉由離心而從血液中分離血漿，藉由市售的套組（商品名“BIOPHEN FVII”，HYPHEN BioMed公司）對血漿中的凝血因子VII蛋白質濃度進行定量。作為陰性對照，對於給予了PBS的群進行同樣的處理。

將PBS給予群（陰性對照）的凝血因子VII蛋白質濃度設為100%，將組成物給予群的凝血因子VII蛋白質濃度作為相對值而算出。將結果示於圖1及表4。

[表4] 表4

確認到實施例B-1及實施例B-2的組成物與比較例B'-1及比較例B'-2的組成物相比，凝血因子VII蛋白質的表現抑制効果也較高。該結果表示實施例的組成物將核酸高效率地釋放至細胞質。

[試驗例2] 以與試驗例1相同的方式，將實施例B-3～實施例B-10及比較例B'-3的組成物給予至ICR小鼠（n = 3），將PBS給予群（陰性對照）的凝血因子VII蛋白質濃度設為100%，算出給予1天後的血漿中的凝血因子VII蛋白質濃度的相對值。將結果示於圖2及表5。

[表5] 表5

所述試驗例1～2的結果表示實施例的組成物能夠將核酸釋放至細胞質。另外，所述試驗1～2的結果表示，實施例B-1、實施例B-2、實施例B-3、實施例B-4、實施例B-5、實施例B-6、實施例B-8、實施例B-9及實施例B-10的組成物（陽離子性脂質1、2、3、4、5、6、8、9）的凝血因子VII蛋白質的表現抑制效果（尤其是siRNA給予量相對高的情況）優異。根據該等結果確認到，該等組成物高效率地將核酸釋放至細胞質。另外，所述試驗1～2的結果表示，實施例B-1、實施例B-2、實施例B-3、實施例B-4、實施例B-5、實施例B-6、實施例B-9及實施例B-10的組成物（陽離子性脂質1、2、3、4、5、6、9）即便在siRNA給予量較少的情況下，也抑制了凝血因子VII蛋白質的表現。根據該等結果確認到，該等組成物高效率地將核酸釋放至細胞質。尤其是實施例B-1、實施例B-2、實施例B-4、實施例B-6及實施例B-10的組成物（陽離子性脂質1、2、4、6）與比較例B'-3的組成物相比，凝血因子VII蛋白質的表現抑制效果高。提示該等組成物能夠將核酸更有效率地釋放至細胞質。

根據以上的結果，藉由本發明的一個形態的陽離子性脂質，能夠將核酸高效率地釋放至細胞質。另外，藉由本發明的一個形態的陽離子性脂質，能夠在保管了一定期間時抑制脂質複合體的粒徑增大。 [工業上的可利用性]

根據本發明，可提供一種能夠將核酸釋放至細胞質的陽離子性脂質。

[圖1]係表示試驗例1的結果的圖表。 [圖2]係表示試驗例2的結果的圖表。

Claims

一種化合物或其藥學上所容許之鹽，該化合物以式(1)表示，
[式中，L₁及L₂分別獨立地表示碳數3~10之伸烷基，R₁及R₂分別獨立地表示碳數4~24之烷基或碳數4~24之烯基，R₃表示碳數1~3之烷基，X₁表示單鍵或-CO-O-]。
如請求項1之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物係選自由下述式(A1)至(A9)所表示之化合物所組成之群，
如請求項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物以下述式(A1)表示，
如請求項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物以下述式(A2)表示，
如請求項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物以下述式(A3)表示，
如請求項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物以下述式(A4)表示，
如請求項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物以下述式(A5)表示，
如請求項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物以下述式(A6)表示，
如請求項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物以下述式(A7)表示，
如請求項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物以下述式(A8)表示，
如請求項1或2之化合物或其藥學上所容許之鹽，其中該化合物以下述式(A9)表示，
一種脂質複合體，其含有(I)如請求項1至11中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽、以及(II)選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之群中之至少一種脂質。
一種組成物，其含有(I)如請求項1至11中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽、(II)選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之群中之至少一種脂質、以及(III)核酸。
一種組成物之製造方法，其包括：將含有(I)如請求項1至11中任一項之化合物或其藥學上所容許之鹽、以及(II)選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之群中之至少一種脂質的含極性有機溶劑之水溶液、與含有(III)核酸之水溶液進行混合而獲得混合液的步驟；以及使混合液中之極性有機溶劑之含有率減少的步驟。