KR102358341B1 - 양이온성 지질 - Google Patents

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유타 스즈키
요시노리 다카하시
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에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 세포질에의 핵산 전달에 사용될 수 있는 양이온성 지질을 제공한다. 본 발명에 따른 양이온성 지질은, 예를 들어 화학식 (1a)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. (화학식 (1a)에서, 각각의 L1 및 L2는 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 기를 나타내고; 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 또는 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기를 나타내고; X1은 단일 결합 또는 -CO-O-를 나타내고; 고리 P는 화학식 (P-1) 내지 화학식 (P-5) 중 하나를 나타낸다.)(화학식 (P-1) 내지 화학식 (P-5)에서, R3은 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타낸다.)

Description

양이온성 지질
본 발명은 신규한 양이온성 지질에 관한 것이다.
핵산, 예컨대 siRNA(작은 간섭 RNA), miRNA(마이크로 RNA) 및 shRNA(짧은 헤어핀 RNA 또는 작은 헤어핀 RNA) 발현 벡터 및 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생체내(in vivo)에서 서열-특이적 유전자 침묵을 유도하며 올리고뉴클레오티드 치료제로 알려져 있다.
올리고뉴클레오티드 치료제 중에서, siRNA가 특히 주목을 받고 있다. siRNA는 19 내지 23개의 염기쌍으로 이루어진 이중-가닥 RNA이며, RNA 간섭(RNAi)으로 불리는 서열-특이적 유전자 침묵을 유도한다.
siRNA는 화학적으로 안정하지만, siRNA는 치료적 응용에 있어서 문제를 갖는데, 예컨대 혈장 중에서 RNase(리보뉴클레아제)에 분해되기 쉽다는 것과, 단독으로 세포막을 통과할 가능성이 낮다는 것이다(예를 들어, 특허문헌 1 참조).
상기 문제에 대처하기 위하여, 양이온성 지질을 함유하는 미세 입자 중에 siRNA를 봉입함으로써, 봉입된 siRNA가 혈장 중에서의 분해로부터 보호되고 친유성 세포막을 침투할 수 있는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 특허문헌 1 참조).
특허문헌 2 내지 특허문헌 5는 siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드 치료제의 전달에 사용되고, 개선된 생분해성을 갖는 양이온성 지질을 개시한다.
양이온성 지질을 함유하는 미세 입자는 저장 동안 입자가 응집될 가능성이 높은 그러한 안정성 문제를 가지며, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질(PEG 지질)을 미세 입자에 첨가함으로써 응집을 방지하기 위한 방법이 알려져 있다. 또한, 특허문헌 6은 PEG-DPG인 특정 PEG 지질을 포함하는 미세 입자, 및 미세 입자 및 탈이온화된 용매를 포함하는 제제를 구성함으로써 응집을 방지하고 핵산의 전달 효율을 개선하기 위한 방법을 개시한다.
WO 2010/144740 WO 2011/153493 WO 2013/086354 WO 2013/158579 WO 2015/095346 WO 2014/089239
그러나, 최근의 발전에도 불구하고, 세포질에의 핵산 전달에 사용될 수 있는 양이온성 지질에 대한 필요성이 여전히 있다.
본 발명은 하기에 나타낸 [1] 내지 [15]에 관한 것이다.
[1] 하기 화학식 (1a)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
Figure 112018118131233-pct00001
(상기 식에서, L1 및 L2는 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 기를 나타내고; R1 및 R2는 독립적으로 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 또는 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기를 나타내고; X1은 단일 결합 또는 -CO-O-를 나타내고; 고리 P는 하기 화학식 (P-1) 내지 화학식 (P-5) 중 어느 하나를 나타내고:
Figure 112018118131233-pct00002
상기 식에서, R3은 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타냄).
[2] [1]에 있어서, 하기 화학식 (1)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
Figure 112018118131233-pct00003
(상기 식에서, L1 및 L2는 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 기를 나타내고; R1 및 R2는 독립적으로 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 또는 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기를 나타내고; X1은 단일 결합 또는 -CO-O-를 나타냄).
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 하기 화학식 (A1) 내지 화학식 (A22)로 나타낸 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00004
Figure 112018118131233-pct00005
Figure 112018118131233-pct00006
[3a] [3]에 있어서, 상기 화학식 (A1), 화학식 (A2), 화학식 (A3), 화학식 (A4), 화학식 (A5), 화학식 (A9), 화학식 (A12), 화학식 (A15), 화학식 (A16), 화학식 (A17), 화학식 (A19), 화학식 (A20) 및 화학식 (A22)로 나타낸 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
[3b] [3]에 있어서, 상기 화학식 화학식 (A1), 화학식 (A2), 화학식 (A3), 화학식 (A4), 화학식 (A5), 화학식 (A9), 화학식 (A12), 화학식 (A15) 및 화학식 (A20)으로 나타낸 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
[3c] [3]에 있어서, 상기 화학식 (A1) 내지 화학식 (A5)로 나타낸 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
[3d] [3]에 있어서, 상기 화학식 (A6) 내지 화학식 (A8)로 나타낸 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (A1)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00007
[5] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (A2)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00008
[6] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (A3)으로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00009
[7] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (A4)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00010
[8] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (A5)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00011
[9] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (A9)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00012
[10] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (A12)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00013
[11] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (A15)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00014
[12] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (A20)으로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
Figure 112018118131233-pct00015
[13] (I) [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 포함하는 지질 복합체.
[14] (I) [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질; 및 (III) 핵산을 함유하는 조성물.
[15] (I) [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 함유하는 극성 유기 용매-함유 수용액을 (III) 핵산을 함유하는 수용액과 혼합하여 혼합 용액을 수득하는 단계; 및 혼합 용액 중의 극성 유기 용매의 함량 백분율을 감소시키는 단계를 포함하는, 조성물의 생성 방법.
본 발명의 양이온성 지질은 하기에 나타낸 하나 이상의 효과를 갖는다:
(1) 본 발명의 양이온성 지질은 세포질로의 핵산의 효과적인 방출을 가능하게 하고;
(2) 본 발명의 양이온성 지질은 소정 기간에 걸친 저장 동안 지질 복합체의 입자 직경의 증가를 방지할 수 있다.
따라서, 본 발명의 양이온성 지질은 핵산을 세포질 내로 전달하는 데 사용되는 지질로서 적용될 수 있다.
[도 1] 도 1은 시험예 1의 결과를 예시하는 그래프이다.
[도 2] 도 2는 시험예 2의 결과를 예시하는 그래프이다.
본 발명은 이하에서 구현예 및 실시예를 제시함으로써 상세히 설명된다. 그러나, 본 발명은 하기에 기재된 구현예 및 실시예로 제한되지 않으며, 본 발명의 개념을 벗어나지 않는 범주 내에서 임의대로 변경 및 실시될 수 있다. 본 명세서에 인용된 모든 문헌 및 간행물은 이들의 목적에 관계 없이 참조에 의해 전체적으로 본 명세서에 포함된다.
(양이온성 지질)
일 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 (1a)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
Figure 112018118131233-pct00016
화학식 (1a)에서, 고리 P는 하기 화학식 (P-1) 내지 화학식 (P-5) 중 어느 하나를 나타낸다.
Figure 112018118131233-pct00017
상기 화학식 (P-1) 내지 (P-5)에서, R3은 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타낸다.
일 구현예에서, 고리 P는 화학식 (P-1), 화학식 (P-2), 화학식 (P-4) 및 화학식 (P-5) 중 어느 하나를 나타낸다.
일 구현예에서, 고리 P는 화학식 (P-1)을 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 (1)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
Figure 112018118131233-pct00018
화학식 (1a) 및 화학식 (1)에서, L1 및 L2는 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 기를 나타내고; R1 및 R2는 독립적으로 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 또는 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기를 나타내고; X1은 단일 결합 또는 -CO-O-를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알킬"은 지정된 수의 탄소 원자를 선형, 사이클릭 또는 분지형 포화 지방족 탄화수소 기를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알케닐"은 지정된 수의 탄소 원자 및 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 선형 또는 분지형 탄화수소 기를 의미한다. 이의 예에는 모노엔, 디엔, 트리엔 및 테트라엔이 포함되지만, 이 용어는 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알킬렌"은 지정된 수의 탄소 원자를 선형, 사이클릭 또는 분지형 2가 포화 지방족 탄화수소 기를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "할로겐"은 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.
본 발명의 일 구현예는 상기 화학식 (1a) 또는 화학식 (1)로 나타낸 화합물(여기서, L1 및 L2는 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자(예를 들어, 5 내지 10개의 탄소 원자 또는 3 내지 8개의 탄소 원자)를 갖는 알킬렌 기를 나타내고; R1 및 R2는 독립적으로 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 또는 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기를 나타내고; X1은 단일 결합 또는 -CO-O-를 나타냄), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 상기 화학식 (1a) 또는 화학식 (1)로 나타낸 화합물(여기서, L1 및 L2는 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자(예를 들어, 5 내지 10개의 탄소 원자 또는 3 내지 8개의 탄소 원자)를 갖는 선형 알킬렌 기를 나타내고; R1 및 R2는 독립적으로 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 기 또는 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선형 알케닐 기를 나타내고; X1은 -CO-O-임), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구현예는 하기 화학식 (1b)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure 112018118131233-pct00019
화학식 (1b)에서, R1 및 R2는 독립적으로 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 또는 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기, 바람직하게는 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 기 또는 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선형 알케닐 기를 나타내고; n1 및 n2는 독립적으로 3 내지 10(예를 들어, 5 내지 10 또는 3 내지 8)의 정수를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명은 상기 화학식 (1a) 또는 화학식 (1)의 화합물(여기서, X1은 -CO-O-이고; L1은 L2와 동일하고; R1은 R2와 동일함) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명은 상기 화학식 (1a) 또는 화학식 (1)의 화합물(여기서, L1 및 L2는 독립적으로 5 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬렌 기를 나타내고; R1은 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 기 또는 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선형 알케닐 기이고; R2는 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬 기이고; X1은 단일 결합임), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 바람직한 구현예에서, L2 및 R2의 탄소 원자의 총수는 바람직하게는 9 내지 12이다. 본 구현예의 화합물은 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구현예는 하기 화학식 (1c)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure 112018118131233-pct00020
화학식 (1c)에서, R1은 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 또는 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기, 바람직하게는 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 기 또는 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선형 알케닐 기를 나타내고; n1은 3 내지 10(예를 들어, 5 내지 10 또는 3 내지 8)의 정수를 나타내고; n2는 8 내지 25, 바람직하게는 8 내지 11의 정수를 나타낸다.
본 구현예에 따른 화합물의 예가 하기에 나타나 있다.
Figure 112018118131233-pct00021
Figure 112018118131233-pct00022
Figure 112018118131233-pct00023
본 발명의 일 구현예는 상기 화학식 (A1) 내지 화학식 (A22) 중 어느 하나로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 상기 화학식 (A1) 내지 화학식 (A5) 및 화학식 (A9) 내지 화학식 (A22) 중 어느 하나로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 상기 화학식 (A1), 화학식 (A2), 화학식 (A3), 화학식 (A4), 화학식 (A5), 화학식 (A9), 화학식 (A12), 화학식 (A15), 화학식 (A16), 화학식 (A17), 화학식 (A19), 화학식 (A20) 및 화학식 (A22) 중 어느 하나로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 상기 화학식 (A1), 화학식 (A2), 화학식 (A3), 화학식 (A4), 화학식 (A5), 화학식 (A9), 화학식 (A12), 화학식 (A15) 및 화학식 (A20) 중 어느 하나로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 상기 화학식 (A1), 화학식 (A2), 화학식 (A3), 화학식 (A4) 및 화학식 (A5) 중 어느 하나로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 상기 화학식 (A6), 화학식 (A7) 및 화학식 (A8) 중 어느 하나로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 양이온성 지질로서 사용될 수 있다. 양이온성 지질은 염의 수화물 또는 염의 용매화물일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "양이온성 지질"은 하나 이상의 탄화수소 기를 함유하는 친유성 영역 및 생리학적 pH에서 양성자화를 겪는 극성 기를 함유하는 친수성 영역을 갖는 양친매성 분자이다. 즉, 본 발명의 양이온성 지질은 양성자화되어 양이온을 형성할 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식 (1)로 나타낸 화합물은 하기 화학식 (1)'으로 나타낸 화합물(양이온)을 포함하는데, 여기서는 수소 이온이 피페리딘 고리 상의 질소 원자 상의 고립 전자쌍에 배위되어 있다.
Figure 112018118131233-pct00024
양이온과 쌍을 형성함으로써 본 구현예의 양이온성 지질 내에 포함될 수 있는 음이온은 그러한 음이온이 약제학적으로 허용되는 한 특별히 제한되지 않는다. 이의 예에는 무기 이온, 예컨대 클로라이드 이온, 요오다이드 이온, 니트레이트 이온, 설페이트 이온 및 포스페이트 이온; 유기 산 이온, 예컨대 아세테이트 이온, 옥살레이트 이온, 말레에이트 이온, 푸마레이트 이온, 시트레이트 이온, 벤조에이트 이온 및 메탄설포네이트 이온 등이 포함된다.
본 발명의 양이온성 지질은 입체이성체, 예컨대 기하 이성체 및 광학 이성체 또는 호변이성체를 가질 수 있다. 본 발명의 양이온성 지질은 상기를 포함한 모든 가능한 이성체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
(양이온성 지질의 생성 방법)
본 발명의 양이온성 지질의 생성 방법이 이제 설명된다. 양이온성 지질의 합성 반응도식의 구현예가 하기 화학식 (10) 및 화학식 (11)에 나타나 있다. 본 명세서에 기재된 모든 화합물은 본 발명에 의해 화합물로서 포함된다. 본 발명의 화합물은 하기에 나타낸 반응도식들에 예시된 적어도 하나의 방법에 따라 합성될 수 있다.
Figure 112018118131233-pct00025
상기 식에서, L1 및 R1은 각각 상기에서와 같이 정의되며; R은 화학식 (1)에서의 -L2-X1-R2이다(여기서, L2, X1 및 R2는 각각 상기에서와 같이 정의됨).
화학식 (1)의 양이온성 지질(X1이 단일 결합인 화합물)은, 예를 들어 상기 화학식 (10)에 예시된 반응도식 1에 따라 합성될 수 있다.
(단계 1-1: 에스테르화)
먼저, 알코올(a1)과 할로겐화 알킬카르복실산 X-L1-COOH(X는 할로겐 원자이고, L1은 상기에서와 같이 정의됨)(바람직하게는, 브롬화 알킬카르복실산)을 축합제의 존재 하에서 반응시켜 할로겐화 에스테르(a2)를 수득한다. 축합제의 예에는 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드(EDC) 하이드로클로라이드, N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 등이 포함된다. 선택적으로, 염기가 첨가될 수 있다. 염기의 예에는 NMM, TEA, DIPEA, DMAP, 피리딘, 피콜린, 루티딘 등이 포함된다. 용매의 예에는 테트라하이드로푸란(THF), 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 에틸 아세테이트 등이 포함된다.
(단계 1-2: 알킬 사슬의 도입)
다음으로, 할로겐화 에스테르(a2)와 디-tert-부틸 말로네이트를 염기의 존재 하에서 반응시킨다. 반응에 의해, 말론산 디에스테르 내의 활성 메틸렌의 수소 원자를 추출하여 알킬에스테르 사슬을 도입하고, 그럼으로써 화합물 (a3)을 수득한다. 염기의 예에는 NaH가 포함된다. 용매의 예에는 에테르, 예컨대 디옥산, 테트라하이드로푸란, 사이클로펜틸 메틸 에테르 및 1,2-디메톡시에탄이 포함된다.
(단계 1-3: 알킬 사슬의 도입)
다음으로, 화합물 (a3)과 알킬 할라이드(바람직하게는, 요오다이드)를 염기의 존재 하에서 반응시켜 알킬 사슬을 도입하고, 그럼으로써 화합물 (a4)를 수득한다. 염기 및 용매는 상기 단계 1-2에서의 것들과 유사할 수 있다.
(단계 1-4: 탈보호)
다음으로, 화합물 (a4)의 tert-부틸 기를 산 가수분해 조건 하에서 탈보호하여 화합물 (a5)를 수득한다. 탈보호에 사용되는 산의 예에는 트리플루오로아세트산(TFA), 염산 등이 포함된다. 용매의 예에는 메틸렌 클로라이드 등이 포함된다.
(단계 1-5: 탈탄산)
다음으로, 카르복실산(a6)을 화합물 (a5)의 탈탄산에 의해 수득한다. 탈탄산 반응은, 예를 들어 용매 중에서 가열함으로써 수행될 수 있다. 용매의 예에는 방향족 탄화수소, 예컨대 벤젠, 톨루엔 및 자일렌이 포함된다.
(단계 1-6: 환원 단계)
화합물 (a6)의 카르복실 기를 환원제의 존재 하에서 하이드록실 기로 환원시켜 화합물 (a7)을 수득한다. 환원제의 예에는 보란 착물, 예컨대 보란(BH3)-테트라하이드로푸란 착물 및 보란-디메틸 설파이드 착물이 포함된다. 용매의 예에는 에테르, 예컨대 디에틸 에테르, 테트라하이드로푸란 및 디옥산; 할로겐화 탄화수소, 예컨대 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 및 디클로로에탄; 탄화수소, 예컨대 헥산, 벤젠 및 톨루엔; 및 이들의 혼합된 용매가 포함된다.
(단계 1-7: 에스테르화)
수득된 알코올(a7)과 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 또는 이들의 유도체(할로겐화수소 등)를 축합제 및 염기의 존재 하에서 반응시켜 최종 생성물, 화합물 (a8) (R = L2-X1-R2)(화학식 (1)의 양이온성 지질에 상응하는 화합물)을 수득한다. 사용된 축합제 및 염기는 단계 1-1에서의 것들과 유사할 수 있다.
X1이 -CO-O-인 화합물이 합성될 때에는, 카르복실 기가 하기에 기재된 단계 2-1에 따라 보호된 화합물이 상기 반응도식 1에서의 단계 1-3에서 제조될 수 있고, 이 화합물이 화합물 (a3)과 반응될 수 있고, 탈보호 및 에스테르화가 마지막으로 수행될 수 있다.
Figure 112018118131233-pct00026
상기 식에서, L1 및 R1은 각각 상기에서와 같이 정의되며; R은 화학식 (1)에서의 -L2-X1-R2이다(L2, X1 및 R2는 각각 상기에서와 같이 정의됨).
상기 반응도식 2는 당업자에 의해 사용되는 화학식 (1)의 양이온성 지질(X1이 단일 결합인 화합물)을 합성하기 위한 또 다른 방법을 예시한다.
(단계 2-1: 에스테르화)
먼저, 벤질 알코올과 할로겐화 알킬카르복실산을 축합하여 할로겐화 에스테르(b1)를 수득한다. 에스테르화 조건은 단계 1-1에서와 동일하다.
(단계 2-2: 알킬 사슬의 도입)
다음으로, 단계 1-2와 유사하게, 할로겐화 에스테르(b1)와 디-tert-부틸 말로네이트를 염기의 존재 하에서 반응시켜 화합물 (b2)를 수득한다.
(단계 2-3: 알킬 사슬의 도입)
다음으로, 단계 1-3과 유사하게, 화합물 (b2)와 알킬 할라이드를 염기의 존재 하에서 반응시켜 화합물 (b3)을 수득한다.
(단계 2-4: 탈보호)
다음으로, 단계 1-4와 유사하게, 화합물 (b3)의 tert-부톡시카르보닐 기를 산 가수분해 조건 하에서 탈보호하여 화합물 (b4)를 수득한다.
(단계 2-5: 탈탄산)
다음으로, 단계 1-5와 유사하게, 카르복실산(b5)을 수득한다.
(단계 2-6: 환원 단계)
추가로, 단계 1-6과 유사하게, 이전 단계의 생성물을 환원제의 존재 하에서 환원시켜 화합물 (b6)을 수득한다.
(단계 2-7: 에스테르화)
수득된 화합물 (b6)과 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 또는 이들의 유도체(할로겐화수소 등)를 축합제 및 염기의 존재 하에서 에스테르화하여 화합물 (b7)을 수득한다.
(단계 2-8: 탈보호)
다음으로, 환원 조건 하에서, 벤질 보호기를 탈보호하여 화합물 (b8)을 수득한다. 탈보호는, 예를 들어, 금속 촉매, 예컨대 팔라듐/탄소의 존재 하에서 촉매 수소화 반응에 의해 수행될 수 있다.
(단계 2-9: 에스테르화)
마지막으로, 화합물 (b8)은 알코올(R1OH)과 반응되어 화합물 (b9) (R = L2-X1-R2)(화학식 (1)의 양이온성 지질에 상응하는 화합물)를 수득할 수 있다.
X1이 -CO-O-인 화합물이 합성될 때에는, 카르복실 기가 단계 2-1에 따라 보호된 화합물이 상기 반응도식 2의 단계 2-3에서의 화합물 (b2)와 반응될 수 있고, 생성물은 단계 2-8에서 탈보호될 수 있다.
상기 화학식 (1a)의 화합물은 또한 상기 반응도식 1 또는 반응도식 2에 따라 합성될 수 있다. 구체적으로는, 고리 P가 화학식 (P-1), 화학식 (P-4) 또는 화학식 (P-5)의 구조를 갖는 경우, 화학식 (P-1), 화학식 (P-4) 또는 화학식 (P-5)의 구조에 상응하는 카르복실산이, 예를 들어 단계 1-7 또는 단계 2-7에서 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 대신에, 에스테르화 반응에 사용될 수 있다. 고리 P가 화학식 (P-2) 또는 화학식 (P-3)의 구조를 갖는 경우, 화학식 (1a)로 나타낸 화합물은, 단계 1-7 대신에, 염기의 존재 하에서, 단계 1-6에서 수득된 화합물 (a7), 카르보닐화 시약(예를 들어, 클로로포르메이트 에스테르, 예컨대 4-니트로페닐 클로로포르메이트), 및 N-알킬피페라진 또는 N-알킬호모피페라진(화학식 (P-2) 또는 화학식 (P-3)의 구조를 갖는 화합물)을 반응시킴으로써 수득될 수 있다(하기 실시예 A-8 참조).
본 발명의 화합물의 합성 시에, 출발 재료의 생성이 특별히 제한되지 않는 한, 화합물은 알려진 것이거나, 당업계에 잘 알려져 있거나 하기 실시예에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 제조될 수 있다. 당업자는 상기 반응도식들이 단지 본 발명의 화합물의 전형적인 제조 방법임을 이해하며, 다른 잘 알려진 방법을 적용할 수 있다.
본 발명의 화합물의 제조에서는, 분자의 작용기의 보호가 필요하고/하거나 바람직할 수 있다. 이것은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 보호기를 사용하여 수행될 수 있다. 보호기는 임의의 하기의 적절한 단계에서 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 제거될 수 있다. 상기 반응도식들에서 나타낸 보호기(예컨대, tert-부틸 보호기 및 벤질 보호기)는 당업자에게 잘 알려진 다른 보호기에 의해 대체될 수 있다.
(지질 복합체)
본 발명은 (I) 전술된 양이온성 지질 및 (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 함유하는 지질 복합체를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따른 지질 복합체는 (I) 전술된 양이온성 지질, (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질 및 (III) 핵산을 함유한다. 따라서, 본 발명의 지질 복합체는 핵산을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 본 구현예의 지질 복합체는 세포질 내로의 핵산의 효과적인 방출을 가능하게 한다. 본 구현예의 지질 복합체는 소정 기간(예를 들어, 1개월 또는 3개월)에 걸친 저장 후에의 입자 직경의 증가로부터 방지되며, 탁월한 물리적 안정성을 나타낼 수 있다.
양이온성 지질을 함유하는 지질 및 핵산으로부터 형성되는 복합체의 형태의 예에는 핵산과 지질 단층(단일 분자층)으로부터 형성된 막(역미셀)의 복합체, 핵산과 리포좀의 복합체, 핵산과 미셀의 복합체 등이 포함된다. 본 발명의 일 구현예에 따른 지질 복합체에서, 핵산은 양이온성 지질을 함유하는 지질로 형성된 미세 입자 내에 봉입된다.
본 구현예의 지질 복합체는 지질 복합체의 총 지질 함량을 기준으로, 예를 들어 10 몰% 내지 100 몰%, 예컨대 20 몰% 내지 90 몰%, 예컨대 40 몰% 내지 80 몰%의 양이온성 지질을 함유한다. 사용되는 양이온성 지질은 단독으로 또는 둘 이상의 혼합물로서 사용될 수 있다.
핵산의 예에는 siRNA, miRNA, shRNA 발현 벡터, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, 리보자임 등이 포함된다. 일 구현예에서, 핵산은 siRNA, miRNA 또는 mRNA일 수 있다.
본 구현예의 지질 복합체는 지질 복합체의 총 중량에 대해, 예를 들어 0.01 중량% 내지 50 중량%, 예컨대 0.1 중량% 내지 30 중량%, 예컨대 1 중량% 내지 10 중량%의 핵산을 함유한다.
본 구현예의 지질 복합체는 지질 성분, (I) 양이온성 지질 및 (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 함유한다. 본 구현예의 지질 복합체는 지질 복합체의 총 중량에 대해, 예를 들어 50 중량% 내지 100 중량%, 예컨대 70 중량% 내지 99.99 중량%, 예컨대 90 중량% 내지 99 중량%의 지질 성분을 함유한다.
"중성 지질"은 생리학적 pH에서 비하전 형태로 또는 중성 양쪽성 이온으로 존재하는 지질을 의미한다. 중성 지질의 예에는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일 올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC), 디아라키도일 포스파티딜콜린(DAPC), 디베헤노일 포스파티딜콜린(DBPC), 디리그노세로일 포스파티딜콜린(DLPC), 디올레오일 포스파티딜콜린(DOPC), 스핑고미엘린, 세라미드, 디올레오일 포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일 포스파티딜글리세롤(DPPG), 포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal) 등이 포함된다. 중성 지질은 단독으로 또는 둘 이상의 혼합물로서 사용될 수 있다.
본 구현예의 지질 복합체는 지질 복합체 내의 총 지질 함량을 기준으로, 예를 들어 0 몰% 내지 50 몰%, 예컨대 0 몰% 내지 40 몰%, 예컨대 0 몰% 내지 30 몰%의 중성 지질을 함유할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질의 예에는 PEG2000-DMG(PEG2000-디미리스틸 글리세롤), PEG2000-DPG(PEG2000-디팔미토일 글리세롤), PEG2000-DSG(PEG2000-디스테아로일 글리세롤), PEG5000-DMG(PEG5000-디미리스틸 글리세롤), PEG5000-DPG(PEG5000-디팔미토일 글리세롤), PEG5000-DSG(PEG5000-디스테아로일 글리세롤), PEG-cDMA(N-[(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)2000) 카르바밀]-1,2-디미리스틸옥실프로필-3-아민), PEG-C-DOMG(R-3-[(ω-메톡시 -폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바모일]-1,2-디미리스틸옥실프로필-3-아민), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-디아실 글리세롤(DAG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer) 등이 포함된다.
PEG-디알킬옥시프로필의 예에는 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필, PEG-디스테아릴옥시프로필 등이 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질은 단독으로 또는 둘 이상의 혼합물로서 사용될 수 있다.
본 구현예의 지질 복합체는 지질 복합체 내의 총 지질 함량을 기준으로, 예를 들어 0 몰% 내지 30 몰%, 예컨대 0 몰% 내지 20 몰%, 예컨대 0 몰% 내지 10 몰%의 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질을 함유할 수 있다.
스테롤은 스테로이드 골격을 갖는 알코올이다. 스테롤의 예에는 콜레스테롤, 디하이드로콜레스테롤, 라노스테롤, β-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고카스테롤, 푸코스테롤, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol) 등이 포함된다. 스테롤은 단독으로 또는 둘 이상의 혼합물로서 사용될 수 있다.
본 구현예의 지질 복합체는 지질 복합체 내의 총 지질 함량을 기준으로, 예를 들어 0 몰% 내지 90 몰%, 예컨대 10 몰% 내지 80 몰%, 예컨대 20 몰% 내지 50 몰%의 스테롤을 함유할 수 있다.
본 구현예의 지질 복합체 내의 지질 성분은 임의의 제한 없이 조합될 수 있으며, 조합의 예에는 전술된 양이온성 지질, 중성 지질 및 스테롤의 조합, 전술된 양이온성 지질, 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤의 조합 등이 포함된다.
(조성물)
일 구현예에서, 본 발명은 (I) 양이온성 지질, (II) 전술된 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질, 및 (III) 핵산을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 구현예의 조성물은 세포질 내로의 핵산의 효율적인 방출을 가능하게 한다. 본 구현예의 조성물은 전술된 지질 복합체, 약제학적으로 허용되는 매체 및 선택적으로 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 매체 및 다른 첨가제는 이후에 기재되어 있다.
본 구현예의 조성물은 조성물 내의 총 지질 함량을 기준으로, 예를 들어 10 몰% 내지 100 몰%, 예컨대 20 몰% 내지 90 몰%, 예컨대 40 몰% 내지 70 몰%의 양이온성 지질을 함유한다. 양이온성 지질은 단독으로 또는 둘 이상의 혼합물로서 사용될 수 있다.
핵산의 예에는 전술된 것들이 포함된다. 본 구현예의 조성물은 조성물의 총 중량에 대해, 예를 들어 0.01 중량% 내지 50 중량%, 예컨대 0.1 중량% 내지 30 중량%, 예컨대 1 중량% 내지 10 중량%의 핵산을 함유한다.
본 구현예의 조성물은 지질 성분, (I) 전술된 양이온성 지질 및 (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 함유한다.
중성 지질의 예에는 전술된 것들이 포함된다. 본 구현예의 조성물은 조성물 내의 총 지질 함량을 기준으로, 예를 들어 0 몰% 내지 50 몰%, 예컨대 0 몰% 내지 40 몰%, 예컨대 0 몰% 내지 30 몰%의 중성 지질을 함유할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질의 예에는 전술된 것들이 포함된다. 본 구현예의 조성물은 조성물 내의 총 지질 함량을 기준으로, 예를 들어 0 몰% 내지 30 몰%, 예컨대 0 몰% 내지 20 몰%, 예컨대 0 몰% 내지 10 몰%의 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질을 함유할 수 있다.
스테롤의 예에는 전술된 것들이 포함된다. 본 구현예의 조성물은 조성물 내의 총 지질 함량을 기준으로, 예를 들어 0 몰% 내지 90 몰%, 예컨대 10 몰% 내지 80 몰%, 예컨대 20 몰% 내지 50 몰%의 스테롤을 함유할 수 있다.
본 구현예의 조성물 내의 지질 성분은 임의의 제한 없이 조합될 수 있으며, 이의 예에는 전술된 양이온성 지질, 중성 지질 및 스테롤의 조합, 전술된 양이온성 지질, 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤의 조합 등이 포함된다.
본 구현예의 조성물은 다른 첨가제로서 당류, 예컨대 수크로스, 글루코스, 소르비톨 및 락토스; 아미노산, 예컨대 글루타민, 글루탐산, 소듐 글루타메이트 및 히스티딘; 시트르산, 인산, 아세트산, 락트산, 탄산 및 타르타르산과 같은 산의 염 등을 함유할 수 있다.
본 구현예의 조성물은 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물의 투여 형태의 예에는 주사제가 포함된다.
본 구현예의 조성물은, 예를 들어 냉동-건조 등에 의해 용매를 제거함으로써 수득된 분말 상태이거나 액체 상태일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물은 전술된 구현예에 따른 지질 복합체를 함유하는 분말 조성물이다. 분말 조성물은 액체 상태의 조성물(분산물)로부터 용매를, 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 제거함으로써 제조될 수 있거나, 분산물을 냉동-건조시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물이 분말 상태인 경우, 조성물은 주사제로서 사용하기 전에 약제학적으로 허용되는 매체 중에 현탁 또는 용해될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물은 전술된 구현예에 따른 지질 복합체 및 약제학적으로 허용되는 매체를 함유하는 액체 조성물이다. 조성물이 액체 상태인 경우, 조성물은 직접 사용될 수 있거나 조성물을 약제학적으로 허용되는 매체 중에 용해시킨 후에 주사제로서 사용될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 매체의 예에는 멸균수; 식염수; 글루코스, D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨 및 염화나트륨과 같은 애쥬번트(adjuvant)를 함유하는 등장 용액; 완충액, 예컨대 인산염 완충액, 시트르산염 완충액 및 아세트산염 완충액 등이 포함된다. 본 구현예의 조성물은 첨가제를 추가로 함유할 수 있으며, 이에는 용해 애쥬번트, 예컨대 알코올(에탄올, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함함), 안정제, 산화방지제, 소독제, 약물의 제조 시에 일반적으로 사용되는 비히클, 충전제, 벌킹제(bulking agent), 결합제, 습윤제, 붕해제, 윤활제, 계면활성제, 분산제, 방부제, 향미제, 진정제(soothing agent) 등이 포함된다.
조성물은 동맥내 주사, 정맥내 주사 및 피하 주사와 같은 비경구 방식으로 환자에게 투여될 수 있다. 조성물의 용량은 투여되는 대상체, 표적 기관, 증상 또는 투여 방식에 따라 변동될 수 있다. 조성물이 투여되는 대상체는 제한되지 않으며, 조성물은 다양한 동물에 적용될 수 있다. 상세하게는, 조성물은 포유동물, 바람직하게는 임상 시험, 스크리닝 및 실험실 실험에서 실험용 동물 및 인간에게 투여될 수 있다.
본 구현예의 조성물은 양이온성 지질을 함유하는 지질로 형성된 미세 입자 중에 봉입된 핵산을 함유하는 지질 복합체를 형성한다. 지질 복합체의 "평균 입자 직경"은 부피 평균, 수평균 및 Z-평균 중 어느 하나에 따라 계산될 수 있다. 본 구현예의 조성물에서, 지질 복합체는 평균 입자 직경(Z-평균)이, 예를 들어 10 내지 1000 nm, 예컨대 30 내지 500 nm, 예컨대 30 내지 200 nm일 수 있다.
본 구현예의 조성물은 바람직하게는 지질 복합체의 입자 직경이 저장 전의 입자 직경과 대비하여 저장 기간 동안 거의 증가되지 않도록 한다. 예를 들어, 3개월 동안 4℃에서 저장 후의 평균 입자 직경(Z-평균)은 바람직하게는 저장 전의 입자 직경의 1.3배 이하, 더 바람직하게는 1.2배 이하, 특히 바람직하게는 1.1배 이하인 것이 바람직하다.
비특이적 흡착 및 면역 반응을 억제한다는 관점에서, 본 구현예의 조성물은 바람직하게는 혈액 중에서와 같은 pH 약 7.4의 환경에서 표면 전하를 거의 갖지 않는다. 세포내이입에 의해 세포 내로 도입되는 동안 엔도솜 막과의 융합 효율을 개선한다는 관점에서, 조성물은 낮은 pH(예를 들어, 3.5 내지 7.0) 환경에서 양으로 하전되는 것이 바람직하다.
(조성물의 생성 방법)
일 구현예에서, 본 발명은 조성물의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 (I) 전술된 양이온성 지질, 및 (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 함유하는 극성 유기 용매-함유 수용액을 (III) 핵산을 함유하는 수용액과 혼합하여 혼합 용액을 수득하는 단계 (a); 및 혼합 용액 중의 극성 유기 용매의 함량 백분율을 감소시키는 단계 (b)를 포함한다. 본 구현예에 따른 생성 방법은 핵산을 세포질 내로 효과적으로 방출할 수 있는 조성물의 생성을 가능하게 한다.
지질로 형성된 미세 입자 내에 봉입된 핵산을 함유하는 지질 복합체는 수용성 핵산과 양이온성 지질 사이의 정전기 상호작용 및 지질들 사이의 소수성 상호작용에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 혼합 용액 중의 극성 유기 용매의 함량 백분율을 감소시킴으로써, 극성 유기 용매-함유 수용액 중에서의 (I) 전술된 양이온성 지질 및 (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 포함하는 지질 성분의 용해도가 변화될 수 있으며, 그럼으로써 지질 복합체를 형성할 수 있다. 극성 유기 용매의 예에는 알코올, 예컨대 에탄올이 포함된다.
먼저, 단계 (a)에서는, 용해된 (I) 양이온성 지질, 및 (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 함유하는 극성 유기 용매-함유 수용액 및 (III) 핵산을 함유하는 수용액을 혼합하여 혼합 용액을 수득한다. 극성 유기 용매-함유 수용액 중 극성 유기 용매의 농도는, 지질 분자가 핵산의 수용액과 혼합된 후에도 가용화될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 단계 (a)에서의 극성 유기 용매-함유 수용액 중 극성 유기 용매의 농도는 0 중량% 내지 60 중량%일 수 있다.
다음으로, 단계 (b)에서는, 물 등을 혼합 용액에 첨가하여 극성 유기 용매의 함량 백분율을 감소시킨다. 결과로서, 지질 복합체가 형성될 수 있다. 지질 복합체를 효과적으로 형성하기 위하여, 극성 유기 용매의 함량 백분율은 신속히 감소되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 단계 (b)에서의 최종 극성 유기 용매-함유 수용액 중 극성 유기 용매의 농도는 0 중량% 내지 5 중량%일 수 있다.
대안적으로, 단계 (a)에서 수득된 혼합 용액은 투석을 거쳐서 극성 유기 용매를 제거하고 용매를 약제학적으로 허용되는 매체로 대체할 수 있다. 용액 중의 극성 유기 용매의 함량 백분율이 투석 과정 동안 감소하기 때문에, 결과로서 지질 복합체가 형성될 수 있다.
본 구현예의 조성물의 생성 방법에 따르면, 미세 입자 내에 효율적으로 봉입된 핵산을 함유하는 지질 복합체가 수득될 수 있다. 지질 복합체는 탁월한 물리적 안정성을 가질 수 있다. 예를 들어, 소정 기간(예를 들어, 1개월 또는 3개월)에 걸친 저장 후에, 입자 직경의 증가가 억제될 수 있다.
조성물 내에 봉입된 핵산이 올리고뉴클레오티드 치료제인 경우, 조성물은 약제학적 조성물로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 생체내에서 또는 시험관내에서 원하는 핵산을 표적 세포질(예컨대, 질병을 일으키는 세포질)에 도입하기 위한 요법(예컨대, 유전자 요법)에 사용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에 따른 본 발명은 지질 복합체를 함유하는 약제학적 조성물을 사용함으로써 다양한 질병을 치료하는 방법(특히, 유전자 요법 방법)을 제공한다. 투여되는 대상체, 투여 방법 및 투여 조건은 상기에서와 같다.
일 구현예에 따른 본 발명은 상기 음이온성 지질을 포함하는, 올리고뉴클레오티드 치료제를 전달하기 위한 키트일 수 있다. 키트는 또한 바람직하게는 다양한 표적 세포의 요법(예컨대, 유전자 요법)에 사용될 수 있다. 본 구현예의 키트에서, 음이온성 지질의 저장 상태는 특별히 제한되지 않으며, 안정성(저장 특성), 사용 편의성 등을 고려함으로써 용액 또는 분말과 같은 임의의 상태일 수 있다. 본 구현예의 키트는, 상기 음이온성 지질에 더하여, 예를 들어 다양한 핵산, 다양한 매체(약제학적으로 허용되는 매체, 완충액), 사용설명서(사용 매뉴얼) 등을 포함할 수 있다. 본 구현예의 키트는 표적 세포 내로 도입하고자 하는 원하는 핵산 및 및 상기 음이온성 지질을 함유하는 지질을 함유하는 조성물 또는 지질 복합체를 조제하는 데 사용된다. 조제된 조성물 또는 지질 복합체는 표적 세포에의 핵산의 전달에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 일 구현예에 따른 본 발명은 음이온성 지질을 함유하는 약제학적 조성물을 포함하는, 올리고뉴클레오티드 치료제를 전달하기 위한 키트일 수 있다. 본 구현예의 키트는, 약제학적 조성물에 더하여, 예를 들어 다양한 매체(약제학적으로 허용되는 매체), 사용설명서(사용 매뉴얼) 등을 포함할 수 있다.
실시예
본 발명은 실시예, 제조예 및 시험예에 의해 이하에서 더 구체적으로 설명된다. 그러나, 본 발명은 실시예로 제한되지 않는다. 실시예 및 제조예에서, 화합물의 명명법은 소프트웨어 상에서 얻어진다(상품명 "ChemDraw Ultra ver.12.0", PerkinElmer Co., Ltd.사제).
본 발명의 화합물의 합성에 사용되는 모든 출발 재료, 시약, 산, 염기, 탈수제, 용매 및 촉매는 구매 가능하거나 당업자에게 잘 알려진 유기 합성 방법에 따라 생성될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 하기 실시예에서 보여준 바와 같이 당업자에게 잘 알려진 유기 합성 방법에 따라 생성될 수 있다.
실시예에 사용된 약어는 통상적이며 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 약어 중 일부가 하기에 제시된다.
DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DMAP: 4-(디메틸아미노)피리딘
DMF: N,N-디메틸포름아미드
EDC: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드
n-: 노르말
tert-: 3차
EtOAc: 에틸 아세테이트
TFA: 트리플루오로아세트산
THF: 테트라하이드로푸란
1H-NMR: 양성자 핵자기 공명 분광법
하기 실시예 및 제조예에서, "실온"은 일반적으로 약 10℃ 내지 약 35℃를 나타낸다. %는 달리 언급되지 않는 한 중량%를 나타낸다.
양성자 핵자기 공명 분광법의 화학적 이동은 테트라메틸실란으로부터의 δ 단위(ppm)로 기록되어 있다. 패턴에서의 약어는 하기에 나타낸 바와 같다:
s: 단일선, d: 이중선, t: 삼중선, q: 사중선, quin: 오중선, m: 다중선, br: 넓음.
크로마토그래피의 경우, YAMAZEN Corporation사제의 Parallel Prep{컬럼: YAMAZEN Corporation사제, Hi-Flash™ 컬럼(실리카 겔), 크기; S (16 x 60 mm), M(20 x 75 mm), L(26 x 100 mm), 2L(26 x 150 mm)}, 또는 Biotage사제의 플래시 자동 정제 시스템 Isolera™{컬럼: SNAP 카트리지 KP-Sil(10 g, 25 g, 50 g, 100 g, 340 g)}을 사용하였다.
A. 양이온성 지질의 합성
[제조예 1]
2-부틸옥틸 9-브로모노나노에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00027
9-브로모노난산(1.1 g, 4.7 mmol), DIPEA(0.91 mL, 5.3 mmol) 및 DMAP(76 mg, 0.63 mmol)를 메틸렌 클로라이드(13 mL) 중에 용해시키고, 빙랭 하에서 EDC(1.0 g, 5.3 mmol)를 첨가하였다. 2-부틸-1-옥탄올(0.58 g, 3.1 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(1.2 g, 2.96 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.82-0.95(m,6H),1.17-1.49(m,24H),1.52-1.70(m,3H),1.75-1.93(m,2H),2.23-2.36(m,2H),3.34-3.47(m,2H),3.91-4.02(m,2H).
[제조예 2]
벤질 9-브로모노나노에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00028
벤질 알코올(0.50 mL, 4.84 mmol), 9-브로모노난산(1.38 g, 5.80 mmol) 및 DMAP(59 mg, 0.48 mmol)를 메틸렌 클로라이드(9.6 mL) 중에 용해시키고, 빙랭 하에서, EDC(1.16 g, 6.05 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(1.49 g, 4.55 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.22-1.48(m,8H),1.58-1.71(m,2H),1.78-1.90(m,2H),2.30-2.40(m,2H),3.35-3.44(m,2H),5.12(s,2H),7.26-7.45(m,5H).
[제조예 3]
벤질 8-브로모옥타노에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00029
제조예 2에서의 방법에 따라, 벤질 알코올(1.85 mL, 17.9 mmol), 8-브로모옥탄산(4.0 g, 17.9 mmol), EDC(3.78 g, 19.7 mmol), DMAP(0.22 g, 1.79 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(36 mL)로부터 표제 화합물(4.8 g, 15.3 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.22-1.48(m,6H),1.58-1.71(m,2H),1.78-1.90(m,2H),2.30-2.38(m,2H),3.33-3.45(m,2H),5.12(s,2H),7.28-7.44(m,5H).
[제조예 4]
8-펜틸트리데칸-1-올의 합성
Figure 112018118131233-pct00030
(1) (6-카르복시헥실)트리페닐포스포늄 브로마이드의 합성
Figure 112018118131233-pct00031
7-브로모헵탄산(2.0 g, 9.57 mmol) 및 트리페닐포스핀(2.5 g, 9.57 mmol)을 아세토니트릴(20 mL) 중에 현탁시키고, 18시간 동안 가열 하에서 환류하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시켜 표제 화합물(4.1 g, 8.66 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.22-1.59(m,8H),2.12-2.25(m,2H),3.47-3.62(m,2H),7.19-7.28(m,2H),7.34-7.44(m,2H),7.71-7.85(m,10H),7.85-7.94(m,3H),11.97(br s,1H).
(2) 8-펜틸-7-트리데센산의 합성
Figure 112018118131233-pct00032
제조예 4-(1)에서 수득된 화합물(4.65 g, 9.87 mmol)을 THF(15 mL) 중에 용해시키고, 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드/THF 용액(1 M, 19.7 mL, 19.7 mmol)을 질소 분위기에서 실온에서 첨가하였다. 반응 용액을 45℃까지 가열하고, 이어서 30분 동안 교반하였다. THF(5 mL) 중 운데칸-6-온(1.7 mL, 8.22 mmol)의 용액을 적가한 후, 가열에 의해 환류하였다. 반응 혼합물을 22시간 동안 교반하고, 이어서 염산(2 M)을 pH 2가 될 때까지 조심스럽게 첨가하였다. 물(100 mL)을 첨가하고 디에틸 에테르로 추출한 후에, 유기 층을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/사이클로헥산)로 정제하여 표제 화합물과 운데칸-6-온의 1:1 혼합물(1.36 g)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.80-0.89(m,6H),1.16-1.38(m,18H),1.43-1.53(m,2H),1.89-1.99(m,4H),2.17(t,J=7.43Hz,2H),5.07(t,J=6.90Hz,1H),11.83(br s,1H).
(3) 8-펜틸트리데실산의 합성
Figure 112018118131233-pct00033
제조예 4-(2)에서 수득된 화합물(1.36 g) 및 10% 팔라듐-탄소(0.06 g, 0.060 mmol)를 에탄올(5 mL) 중에 현탁시키고, 현탁액을 수소 분위기에서 상압 하에서 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)를 통해 여과하고, 에탄올로 세척하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켜 표제 화합물(0.60 g, 2.18 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.85(t,J=7.1Hz,6H),1.14-1.32(m,25H),1.42-1.52(m,2H),2.18(t,J=7.43Hz,2H).
(4) 8-펜틸트리데칸-1-올의 합성
Figure 112018118131233-pct00034
질소 분위기에서 수소화알루미늄리튬/THF 용액(2.4 M, 1.3 mL, 3.15 mmol)에, THF(5 mL) 중 제조예 4-(3)에서 수득된 화합물(1.36 g)의 용액을 빙랭 하에서 적가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후에, 염산(1 M, 8 mL)을 적가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 유기 층을 디에틸 에테르로 추출하고, 이어서 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 염화나트륨 용액으로 순차적으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/사이클로헥산)로 정제하여 표제 화합물(0.28 g, 1.02 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.88(t,J=7.24Hz,6H),1.13-1.41(m,28H),1.54-1.60(m,2H),3.59-3.68(m,2H).
[제조예 5]
4-노닐트리데칸-1-올의 합성
Figure 112018118131233-pct00035
(1) (3-브로모프로폭시)(tert-부틸)디메틸실란의 합성
Figure 112018118131233-pct00036
3-브로모-1-프로판올(6.5 mL, 71.9 mmol)을 메틸렌 클로라이드(250 mL) 중에 용해시키고, 이미다졸(7.84 g, 115.0 mmol)을 실온에서 첨가하고, 완전히 용해시켰다. tert-부틸디메틸실릴 클로라이드(13.0 g, 86.3 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과하고, 이어서 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물에 디에틸 에테르(300 mL)를 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 염화나트륨 용액으로 순차적으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산)로 정제하여 표제 화합물(16.2 g, 64.0 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.08(s,6H),0.91(s,9H),2.05(quin,J=6.05Hz,2H),3.53(t,J=6.42Hz,2H),3.75(t,J=5.69Hz,2H).
(2) {3-[(tert-부틸디메틸실릴)옥시]프로필}트리페닐포스포늄 브로마이드의 합성
Figure 112018118131233-pct00037
제조예 4-(1)의 방법에 따라, 제조예 5-(1)에서 수득된 화합물(16.2 g, 63.9 mmol), 트리페닐포스핀(16.8 g, 63.9 mmol) 및 아세토니트릴(125 mL)로부터 표제 화합물(21.2 g, 41.1 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.01(s,6H),0.84(s,9H),1.65-1.75(m,2H),3.48-3.57(m,2H),3.69(t,J=6.14Hz,2H),7.73-7.84(m,12H),7.87-7.93(m,3H).
(3) tert-부틸디메틸[(4-노닐-3-트리데센-1-일)옥시]실란의 합성
Figure 112018118131233-pct00038
제조예 5-(2)에서 수득된 화합물(4.38 g, 8.50 mmol)을 THF(15 mL) 중에 용해시키고, 질소 분위기에서 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드/THF 용액(1 M, 8.5 mL, 8.5 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 반응 용액을 45℃까지 가열하고, 이어서 30분 동안 교반하였다. THF(10 mL) 중 노나데칸-10-온(2.0 g, 7.08 mmol)의 용액을 적가하고, 21시간 동안 가열 하에서 환류하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 이어서 디에틸 에테르를 첨가하고, 물 및 포화 염화나트륨 용액으로 순차적으로 세척하고, 유기 층을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산)로 정제하여 표제 화합물(1.16 g)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.07(s,6H),0.90(m,15H),1.21-1.41(m,28H),1.92-2.04(m,4H),2.24(q,J=7.34Hz,2H),3.58(t,J=7.24 Hz,2H),5.09(t,J=7.15Hz,1H).
(4) 4-노닐트리데칸-1-올의 합성
Figure 112018118131233-pct00039
제조예 5-(3)에서 수득된 화합물(1.16 g, 2.64 mmol) 및 10% 팔라듐-탄소(0.28 g, 0.26 mmol)를 에틸 아세테이트(10 mL) 및 아세트산(0.15 mL, 2.64 mmol) 중에 현탁시키고, 현탁액을 수소 분위기에서 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 에탄올로 세척하고, 이어서 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/사이클로헥산)로 정제하여 표제 화합물(0.35 g, 1.08 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.80-0.90(m,6H),1.13-1.30(m,35H),1.32-1.39(m,2H),3.32-3.38(m,2H),4.30(t,J=5.23Hz,1H).
[제조예 6]
4-헵틸운데칸-1-올의 합성
Figure 112018118131233-pct00040
(1) tert-부틸[(4-헵틸-3-운데센-1-일)옥시]디메틸실란의 합성
Figure 112018118131233-pct00041
제조예 5-(3)에서의 방법에 따라, {3-[(tert-부틸디메틸실릴)옥시]프로필}트리페닐포스포늄 브로마이드(3.0 g, 5.83 mmol), THF(10 mL), 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드/THF 용액(1 M, 5.8 mL, 5.8 mmol) 및 펜타데칸-8-온(1.1 g, 4.86 mmol)으로부터 표제 화합물(0.83 g, 2.17 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600Hz,CDCl3)δ(ppm):0.07(s,6H),0.84-0.95(m,15H),0.89(s,1H),1.21-1.41(m,20H),1.92-2.05(m,4H),2.24(q,J=7.34Hz,2H),3.58(t,J=7.24Hz,2H),5.09(t,J=7.24Hz,1H).
(2) 4-헵틸운데칸-1-올의 합성
Figure 112018118131233-pct00042
제조예 5-(4)의 방법에 따라, 제조예 6-(1)에서 수득된 화합물(0.83 g, 2.17 mmol), 10% 팔라듐-탄소(0.23 g, 0.22 mmol), 에틸 아세테이트(10 mL) 및 아세트산(0.25 mL, 4.35 mmol)으로부터 표제 화합물(0.42 g, 1.56 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.82-0.89(m,6H),1.14-1.31(m,27H),1.33-1.39(m,2H),3.32-3.38(m,2H),4.30(t,J=5.14 Hz,1H).
[제조예 7]
4-펜틸노난-1-올의 합성
Figure 112018118131233-pct00043
(1) tert-부틸디메틸실릴[(4-펜틸-3-노넨-1-일)옥시]실란의 합성
Figure 112018118131233-pct00044
제조예 5-(3)에서의 방법에 따라, {3-[(tert-부틸디메틸실릴)옥시]프로필}트리페닐포스포늄 브로마이드(5.0 g, 9.72 mmol), THF(4 mL), 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드/THF 용액(1 M, 9.7 mL, 9.7 mmol) 및 운데칸-6-온(1.7 mL, 8.10 mmol)으로부터 표제 화합물(1.16 g)을 수득하였다.
1H-NMR(600Hz,CDCl3)δ(ppm):0.07(s,6H),0.90(m,15H),1.19-1.43(m,13H),1.92-2.05(m,4H),2.21-2.29(m,2H),3.58(t,J=7.24Hz,2H),5.10(t,J=7.15Hz,1H).
(2) 4-펜틸노난-1-올의 합성
Figure 112018118131233-pct00045
제조예 5-(4)의 방법에 따라, 제조예 7-(1)에서 수득된 화합물(1.12 g, 3.43 mmol), 10% 팔라듐-탄소(0.37 g, 0.34 mmol), 에틸 아세테이트(15 mL) 및 아세트산(0.39 mL, 6.86 mmol)으로부터 표제 화합물(0.22 g, 1.02 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.87-0.93(m,6H),1.18-1.36(m,19H),1.37-1.45(m,2H),3.36-3.42(m,2H),4.35(t,J=5.23Hz,1H).
[제조예 8]
벤질 4-브로모부타노에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00046
벤질 알코올(2.84 mL, 27.3 mmol), 4-브로모부탄산(5.01 g, 30.0 mmol) 및 DMAP(0.33 g, 2.73 mmol)를 메틸렌 클로라이드(50 mL) 중에 용해시키고, 빙랭 하에서 EDC(6.5 g, 34.1 mmol)를 첨가하고, 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 이어서 디에틸 에테르 중에 용해시켰다. 용액을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 물 및 10% 시트르산 수용액으로 순차적으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하여 표제 화합물(6.41 g, 24.9 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):2.20(quin,J=6.83Hz,2H),2.56(t,J=7.15Hz,2H),3.46(t,J=6.51Hz,2H),5.13(s,2H),7.28-7.42(m,5H).
[제조예 9]
벤질 6-브로모헥사노에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00047
제조예 8에서의 방법에 따라, 벤질 알코올(1.93 mL, 18.5 mmol), 6-브로모헥산산(4.33 g, 22.2 mmol), DMAP(0.23 g, 1.85 mmol), EDC(4.43 g, 23.1 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(35 mL)로부터 표제 화합물(5.43 g, 19.0 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):1.44-1.51(m,2H),1.64-1.72(m,2H),1.83-1.90(m,2H),2.38(t,J=7.43 Hz,2H),3.39(t,J=6.69 Hz,2H),5.12(s,2H),7.30-7.40(m,5H).
[제조예 10]
(1R,5S,6r)-3-메틸-3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-6-카르복실산 하이드로클로라이드의 합성
Figure 112018118131233-pct00048
(1) (1R,5S,6r)-에틸 3-메틸-3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-6-카르복실레이트의 합성
(1R,5S,6r)-에틸 3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-6-카르복실레이트(CAS 174456-77-0)(0.89 g, 5.74 mmol)를 THF(20 mL) 중에 용해시키고, 여기에 아세트산(0.49 mL, 8.6 mmol) 및 포름알데하이드 용액(11.7 mL, 161.5 mol)을 실온에서 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 나트륨 트리(아세톡시)보로하이드라이드(2.43 g, 11.5 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 이어서 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 혼합물을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(메틸렌 클로라이드/메탄올)로 정제하여 표제 화합물(0.70 g, 4.14 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.25(t,J=7.2Hz,3H),1.94(br s,2H),2.01(br s,1H),2.29(s,3H),2.35(d,J=9.2Hz,2H),3.05(d,J=9.2Hz,2H),4.09(q,J=7.2Hz,2H).
(2) (1R,5S,6r)-3-메틸-3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-6-카르복실산 하이드로클로라이드의 합성
진한 염산(10 mL)을 제조예 10-(1)에서 수득된 화합물(0.60 g, 3.55 mmol)에 첨가하고, 70℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시켜 표제 화합물(0.52 g, 3.05 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):2.14(br s,2H),2.25(br s,1H),2.74(br s,3H),3.25-3.37(m,2H),3.56-3.67(m,2H),10.91(br s,1H),12.49(br s,1H).
[제조예 11]
(1R,5S,6s)-3-메틸-3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-6-카르복실산 하이드로클로라이드의 합성
Figure 112018118131233-pct00049
(1) (1R,5S,6s)-에틸 3-메틸-3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-6-카르복실레이트의 합성
제조예 10-(1)에서의 방법에 따라, (1R,5S,6s)-에틸 3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-6-카르복실레이트(CAS 1144099-54-6)(2.5 g, 16.1 mmol), 아세트산(1.4 mL, 24.2 mmol), 포름알데하이드 용액(10.0 mL, 134.3 mmol), 나트륨 트리(아세톡시)보로하이드라이드(6.8 g, 32.2 mmol) 및 THF(50 mL)로부터 표제 화합물(2.5 g, 14.8 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.23(t,J=7.1Hz,3H),1.48-1.68(m,3H),2.22(s,3H),2.33(br d,J=8.8Hz,2H),3.02(d,J=8.8Hz,2H),4.10(q,J=7.1Hz,2H).
(2) (1R,5S,6s)-3-메틸-3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산-6-카르복실산 하이드로클로라이드의 합성
제조예 10-(2)의 방법에 따라, 제조예 10-(2)에서 수득된 화합물(500 mg, 2.96 mmol) 및 진한 염산(10 mL)으로부터 표제 화합물(350 mg, 1.97 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.88-1.94(m,0.45H),1.94-2.00(m,0.55H),2.35-2.45(m,2H),2.68(br s,1.65H),2.67(br s,1.35H),3.08-3.18(m,1.1H),3.45-3.57(m,0.9H),3.73-3.88(m, 2H),9.16(br s,1H),11.52(br s,1H).
(양이온성 지질 (1)의 합성)
[실시예 A-1]
2-{9-[(2-부틸옥틸)옥시]-9-옥소노닐}도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 1)
Figure 112018118131233-pct00050
(1) 1,1-디-tert-부틸 9-(2-부틸옥틸)노난-1,1,9-트리카르복실레이트의 합성
60% 수소화나트륨(59 mg, 1.48 mmol)을 1,4-디옥산(6.5 mL) 중에 현탁시키고, 여기에 디-tert-부틸 말로네이트(0.30 mL, 1.35 mmol)를 실온에서 서서히 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 제조예 1에서 수득된 화합물(573 mg, 1.41 mmol)에 1,4-디옥산(1 mL)을 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 3시간 동안 그리고 95℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수조 내에서 냉각시키고, 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, n-헵탄으로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(490 mg, 0.91 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.80-0.98(m,6H),1.18-1.38(m,24H),1.39-1.54(m,2H),1.46(s,18H),1.55-1.69(m,3H),1.71-1.87(m,2H),2.24-2.35(m,2H),3.06-3.15(m,1H),3.91-4.02(m,2H).
(2) 9,9-디-tert-부틸 1-(2-부틸옥틸)노나데칸-1,9,9-트리카르복실레이트의 합성
실시예 A-1-(1)에서 수득된 화합물(490 mg, 0.91 mmol)을 1,4-디옥산(4 mL) 중에 용해시키고, 여기에 60% 수소화나트륨(47 mg, 1.18 mmol)을 수냉 하에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 1-요오도데칸(0.39 mL, 1.81 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수조 내에서 냉각시키고, 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, n-헵탄으로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(450 mg, 0.66 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.80-0.96(m,9H),1.05-1.36(m,40H),1.39-1.49(m,2H),1.44(s,18H),1.53-1.68(m,3H),1.70-1.82(m,4H),2.23-2.34(m,2H),3.92-4.01(m,2H).
(3) 2-{9-[(2-부틸옥틸)옥시]-9-옥소노닐}도데칸산의 합성
실시예 A-1-(2)에서 수득된 화합물(450 mg, 0.66 mmol)을 메틸렌 클로라이드(2 mL) 중에 용해시키고, 여기에 TFA(1 mL)를 빙랭 하에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 톨루엔을 첨가하고, 용매를 감압 하에서 증류 제거하였다. 톨루엔의 첨가 및 증류를 2회 반복하여 반응물을 건조시킴으로써, 2-{9-[(2-부틸옥틸)옥시]-9-옥소노닐}-2-데실말론산의 조 생성물(crude product)을 수득하였다. 수득된 조 생성물을 자일렌(5 mL) 중에 용해시키고, 용액을 150℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 수득된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(240 mg, 0.46 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.80-0.97(m,9H),1.16-1.70(m,49H),2.22-2.41(m,3H),3.92-4.02(m,2H).
(4) 2-부틸옥틸 10-(하이드록시메틸)이코사노에이트의 합성
실시예 A-1-(3)에서 수득된 화합물(240 mg, 0.46 mmol)을 THF(4 mL) 중에 용해시키고, 여기에 0.92M 보란-THF 착물(0.75 mL, 0.69 mmol)을 -15℃에서 적가하고, 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(197 mg, 0.39 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.80-0.98(m,9H),1.10-1.39(m,46H),1.39-1.50(m,1H),1.54-1.69(m,4H),2.23-2.36(m,2H),3.48-3.59(m,2H),3.92-4.02(m,2H).
(5) 2-{9-[(2-부틸옥틸)옥시]-9-옥소노닐}도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트의 합성
실시예 A-1-(4)에서 수득된 화합물(38 mg, 0.074 mmol), DIPEA(0.054 mL, 0.31 mmol), 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 하이드로클로라이드(27 mg, 0.15 mmol) 및 DMAP(1.8 mg, 0.015 mmol)를 메틸렌 클로라이드(0.8 mL) 중에 용해시키고, 여기에 EDC(31 mg, 0.16 mmol)를 빙랭 하에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트/메탄올)로 정제하여 표제 화합물(38 mg, 0.060 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.77-0.97(m,9H),1.13-1.41(m,46H),1.50-1.69(m,4H),1.69-1.85(m,2H),1.85-2.09(m,4H),2.18-2.35(m,3H),2.27(s,3H),2.72-2.88(m,2H),3.90-4.03(m,4H).
(양이온성 지질 (2)의 합성)
[실시예 A-2]
2-{9-옥소-9-[(3-펜틸옥틸)옥시]노닐}도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 2)
Figure 112018118131233-pct00051
(1) 9-벤질 1,1-디-tert-부틸 노난-1,1,9-트리카르복실레이트의 합성
60% 수소화나트륨(83 mg, 2.07 mmol)을 1,4-디옥산(9.4 mL) 중에 현탁시키고, 여기에 디-tert-부틸 말로네이트(0.42 mL, 1.88 mmol)를 실온에서 서서히 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 제조예 2에서 수득된 화합물(650 mg, 1.99 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 95℃에서 13시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수조 내에서 냉각시키고, 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, n-헵탄으로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(536 mg, 1.16 mmol)을 수득하였다.
(2) 1-벤질 9,9-디-tert-부틸 노나데칸-1,9,9-트리카르복실레이트의 합성
실시예 A-1-(2)에서의 방법에 따라, 실시예 A-2-(1)에서 수득된 화합물(590 mg, 1.28 mmol), 1-요오도데칸(0.54 mL, 2.55 mmol), 65% 수소화나트륨(71 mg, 1.91 mmol) 및 1,4-디옥산(5 mL)으로부터 표제 화합물(470 mg, 0.78 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.83-0.93(m,3H),1.05-1.36(m,26H),1.44(s,18H),1.57-1.68(m,2H),1.71-1.82(m,4H),2.29-2.39(m,2H),5.11(s,2H),7.28-7.42(m,5H).
(3) 2-[9-(벤질옥시)-9-옥소노닐]도데칸산의 합성
실시예 A-1-(3)에서의 방법에 따라, 실시예 A-2-(2)에서 수득된 화합물(470 mg, 0.78 mmol), 메틸렌 클로라이드(2 mL), TFA(1 mL) 및 자일렌(2 mL)으로부터 표제 화합물(286 mg, 0.64 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.81-0.95(m,3H),1.18-1.37(m,26H),1.39-1.52(m,2H),1.54-1.69(m,4H),2.28-2.41(m,3H),5.11(s,2H),7.28-7.40(m,5H).
(4) 벤질 10-(하이드록시메틸)이코사노에이트의 합성
실시예 A-1-(4)에서의 방법에 따라, 실시예 A-2-(3)에서 수득된 화합물(285 mg, 0.64 mmol), 0.92M 보란-THF 착물(1.0 mL, 0.96 mmol) 및 THF(3.2 mL)로부터 표제 화합물(223 mg, 0.52 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.81-0.95(m,3H),1.12-1.38(m,31H),1.39-1.50(m,1H),1.58-1.72(m,2H),2.23-2.36(m,2H),3.48-3.59(m,2H),5.11(s,2H),7.28-7.41(m,5H).
(5) 2-[9-(벤질옥시)-9-옥소노닐]도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트의 합성
실시예 A-1-(5)에서의 방법에 따라, 실시예 A-2-(4)에서 수득된 화합물(114 mg, 0.26 mmol), 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 하이드로클로라이드(95 mg, 0.53 mmol), EDC(111 mg, 0.58 mmol), DIPEA(0.090 mL, 0.53 mmol), DMAP(6.4 mg, 0.053 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(1.3 mL)로부터 표제 화합물(128 mg, 0.23 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.81-0.96(m,3H),1.15-1.41(m,31H),1.52-1.70(m,2H),1.70-1.84(m,2H),1.85-2.06(m,4H),2.18-2.40(m,3H),2.27(s,3H),2.73-2.89(m,2H),3.92-4.03(m,2H),5.12(s,2H),7.28-7.44(m,5H).
(6) 10-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}이코산산의 합성
실시예 A-2-(5)에서 수득된 화합물(127 mg, 0.23 mmol)을 에틸 아세테이트(2 mL) 중에 용해시키고, 여기에 10% 팔라듐-탄소(24 mg, 50% 물을 함유함)를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 수소 분위기에서 상압 하에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 수득된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올)로 정제하여 표제 화합물(94 mg, 0.20 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.81-0.95(m,3H),1.12-1.44(m,31H),1.53-1.71(m,2H),1.74-1.95(m,2H),1.97-2.10(m,2H),2.11-2.37(m,5H),2.40(s,3H),3.11-3.28(m,2H),3.79-3.92(m,1H),4.14-4.25(m,1H).
(7) 2-{9-옥소-9-[(3-펜틸옥틸)옥시]노닐}도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트의 합성
제조예 2에서의 방법에 따라, 실시예 A-2-(6)에서 수득된 화합물(93 mg, 0.20 mmol), 3-펜틸옥탄-1-올(CAS 1443519-63-8)(60 mg, 0.30 mmol), EDC(42 mg, 0.22 mmol), DMAP(4.9 mg, 0.040 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(1.5 mL)로부터 표제 화합물(103 mg, 0.16 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.82-0.95(m,9H),1.14-1.46(m,46H),1.50-1.68(m,6H),1.70-1.84(m,2H),1.85-2.06(m,4H),2.19-2.33(m,3H),2.27(s,3H),2.74-2.87(m,2H),3.93-4.02(m,2H),4.03-4.14(m,2H).
(양이온성 지질 (3)의 합성)
[실시예 A-3]
2-노닐-11-옥소-11-[(3-펜틸옥틸)옥시]운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 3)
Figure 112018118131233-pct00052
(1) 1-벤질 9,9-디-tert-부틸 옥타데칸-1,9,9-트리카르복실레이트의 합성
실시예 A-2-(1)에서 수득된 화합물(536 mg, 1.16 mmol)을 THF(6 mL) 중에 용해시키고, 여기에 60% 수소화나트륨(58 mg, 1.45 mmol)을 수냉 하에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 1-요오도노난(0.23 mL, 1.16 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수조 내에서 냉각시키고, 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, n-헵탄으로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(340 mg, 0.577 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.82-0.92(m,3H),1.03-1.36(m,24H),1.44(s,18H),1.57-1.68(m,2H),1.71-1.81(m,4H),2.28-2.40(m,2H),5.11(s,2H),7.28-7.41(m,5H).
(2) 11-(벤질옥시)-2-노닐-11-옥소운데칸산의 합성
실시예 A-1-(3)에서의 방법에 따라, 실시예 A-3-(1)에서 수득된 화합물(340 mg, 0.58 mmol), 메틸렌 클로라이드(2 mL), TFA(1 mL) 및 자일렌(2 mL)으로부터 표제 화합물(96 mg, 0.22 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.80-0.95(m,3H),1.12-1.74(m,30H),2.28-2.41(m,3H),5.11(s,2H),7.28-7.40(m,5H).
(3) 벤질 10-(하이드록시메틸)노나데카노에이트의 합성
실시예 A-1-(4)에서의 방법에 따라, 실시예 A-3-(2)에서 수득된 화합물(96 mg, 0.22 mmol), 0.92M 보란-THF 착물(0.36 mL, 0.33 mmol) 및 THF(1.1 mL)로부터 표제 화합물(80 mg, 0.19 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.81-0.94(m,3H),1.09-1.38(m,29H),1.38-1.50(m,1H),1.58-1.71(m,2H),2.30-2.40(m,2H),3.48-3.58(m,2H),5.11(s,2H),7.29-7.42(m,5H).
(4) 11-(벤질옥시)-2-노닐-11-옥소운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트의 합성
실시예 A-1-(5)에서의 방법에 따라, 실시예 A-3-(3)에서 수득된 화합물(80 mg, 0.19 mmol), 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 하이드로클로라이드(69 mg, 0.38 mmol), EDC(81 mg, 0.42 mmol), DIPEA(0.066 mL, 0.38 mmol), DMAP(4.7 mg, 0.038 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(1.0 mL)로부터 표제 화합물(97 mg, 0.18 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.83-0.94(m,3H),1.15-1.39(m,29H),1.52-1.70(m,2H),1.70-1.85(m,2H),1.85-2.07(m,4H),2.19-2.40(m,3H),2.27(s,3H),2.73-2.88(m,2H),3.94-4.02(m,2H),5.12(s,2H),7.28-7.43(m,5H).
(5) 10-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}노나데칸산의 합성
실시예 A-2-(6)에서의 방법에 따라, 실시예 A-3-(4)에서 수득된 화합물(96 mg, 0.18 mmol)을 에틸 아세테이트(2 mL) 중에 용해시키고, 여기에 10% 팔라듐-탄소(19 mg, 50% 물을 함유함)를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 수소 분위기에서 상압 하에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 수득된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올)로 정제하여 표제 화합물(74 mg, 0.163 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.81-0.95(m,3H),1.12-1.44(m,29H),1.53-1.71(m,2H),1.74-1.94(m,2H),1.98-2.08(m,2H),2.08-2.38(m,5H),2.39(s,3H),3.10-3.30(m,2H),3.80-3.91(m,1H),4.14-4.25(m,1H).
(6) 2-노닐-11-옥소-11-[(3-펜틸옥틸)옥시]운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트의 합성
제조예 2에서의 방법에 따라, 실시예 A-3-(5)에서 수득된 화합물(74 mg, 0.16 mmol), 3-펜틸옥탄-1-올(CAS 1443519-63-8)(49 mg, 0.25 mmol), EDC(38 mg, 0.20 mmol), DMAP(4.0 mg, 0.033 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(1.2 mL)로부터 표제 화합물(81 mg, 0.13 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.81-0.95(m,9H),1.15-1.47(m,44H),1.50-1.68(m,6H),1.70-1.84(m,2H),1.84-2.06(m,4H),2.18-2.33(m,3H),2.27(s,3H),2.73-2.87(m,2H),3.94-4.01(m,2H),4.04-4.12(m,2H).
(양이온성 지질 (4)의 합성)
[실시예 A-4]
비스(3-펜틸옥틸) 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}헵타데칸디오에이트(양이온성 지질 4)
Figure 112018118131233-pct00053
(1) 8-벤질 1,1-디-tert-부틸 옥탄-1,1,8-트리카르복실레이트의 합성
60% 수소화나트륨(59 mg, 1.48 mmol)을 DMF(5.4 mL) 중에 현탁시키고, 여기에 디-tert-부틸 말로네이트(0.30 mL, 1.35 mmol)를 빙랭 하에서 서서히 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 5분 동안 교반하고, 이어서 조(bath)를 꺼낸 후 20분 동안 교반하였다. 빙랭 하에서, 요오드화나트륨(61 mg, 0.40 mmol) 및 제조예 3에서 수득된 화합물(443 mg, 1.41 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수조 내에서 냉각시키고, 물을 첨가하고, 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(456 mg, 1.02 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.23-1.36(m,8H),1.45(s,18H),1.58-1.69(m,2H),1.72-1.84(m,2H),2.30-2.40(m,2H),3.05-3.15(m,1H),5.11(s,2H),7.28-7.41(m,5H).
(2) 1,15-디벤질 8,8-디-tert-부틸 펜타데칸-1,8,8,15-테트라카르복실레이트의 합성
실시예 A-4-(1)에서의 방법에 따라, 실시예 A-4-(1)에서 수득된 화합물(456 mg, 1.02 mmol), 제조예 3에서 수득된 화합물(478 mg, 1.53 mmol), 요오드화나트륨(46 mg, 0.31 mmol), 60% 수소화나트륨(49 mg, 1.22 mmol) 및 DMF(3.3 mL)로부터 표제 화합물(380 mg, 0.56 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.03-1.17(m,4H),1.23-1.36(m,12H),1.43(s,18H),1.56-1.68(m,4H),1.70-1.80(m,4H),2.29-2.38(m,4H),5.11(s,4H),7.27-7.41(m,10H).
(3) 10-(벤질옥시)-2-[8-(벤질옥시)-8-옥소옥틸]-10-옥소데칸산의 합성
실시예 A-1-(3)에서의 방법에 따라, 실시예 A-4-(2)에서 수득된 화합물(380 mg, 0.56 mmol), 메틸렌 클로라이드(2 mL), TFA(1 mL) 및 자일렌(2 mL)으로부터 표제 화합물(234 mg, 0.45 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.18-1.37(m,16H),1.38-1.71(m,8H),2.26-2.41(m,5H),5.11(s,4H),7.28-7.43(m,10H).
(4) 디벤질 9-(하이드록시메틸)헵타데칸디오에이트의 합성
실시예 A-1-(4)에서의 방법에 따라, 실시예 A-4-(3)에서 수득된 화합물(234 mg, 0.45 mmol), 0.92M 보란-THF 착물(0.73 mL, 0.67 mmol) 및 THF(1.8 mL)로부터 표제 화합물(188 mg, 0.37 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.12-1.51(m,22H),1.56-1.72(m,4H),2.29-2.41(m,4H),3.47-3.58(m,2H),5.11(s,4H),7.28-7.44(m,10H).
(5) 디벤질 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸} 헵타데칸디오에이트의 합성
실시예 A-1-(5)에서의 방법에 따라, 실시예 A-4-(4)에서 수득된 화합물(188 mg, 0.37 mmol), 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 하이드로클로라이드(132 mg, 0.74 mmol), EDC(155 mg, 0.81 mmol), DIPEA(0.126 mL, 0.74 mmol), DMAP(9.0 mg, 0.074 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(1.9 mL)로부터 표제 화합물(217 mg, 0.34 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.16-1.38(m,21H),1.53-1.69(m,4H),1.70-1.84(m,2H),1.85-2.04(m,4H),2.19-2.40(m,5H),2.26(s,3H),2.74-2.86(m,2H),3.92-4.01(m,2H),5.11(s,4H),7.28-7.41(m,10H).
(6) 비스(3-펜틸옥틸) 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸} 헵타데칸디오에이트의 합성
실시예 A-4-(5)에서 수득된 화합물(217 mg, 0.34 mmol)을 THF(4 mL) 및 메탄올(2 mL) 중에 용해시키고, 여기에 10% 팔라듐-탄소(19 mg, 50% 물을 함유함)를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 수소 분위기에서 상압 하에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 시스템을 질소로 교체하고, 반응 용액을 여과하고 메탄올로 세척하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켜 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시] 메틸}헵타데칸이산(160 mg)의 조 생성물을 수득하였다.
제조예 2에서의 방법에 따라, 수득된 조 생성물(40 mg), 3-펜틸옥탄-1-올(CAS 1443519-63-8) (44 mg, 0.22 mmol), EDC(37 mg, 0.19 mmol), DMAP(2.1 mg, 0.018 mmol) 및 THF(1 mL)로부터 표제 화합물(34 mg, 0.041 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.83-0.94(m,12H),1.14-1.48(m,53H),1.51-1.67(m,10H),1.70-1.84(m,2H),1.85-2.07(m,4H),2.18-2.34(m,5H),2.27(s,3H),2.74-2.88(m,2H),3.93-4.01(m,2H),4.03-4.12(m,4H).
(양이온성 지질 (5)의 합성)
[실시예 A-5]
디[(Z)-2-노넨-1-일] 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}헵타데칸디오에이트(양이온성 지질 5)
Figure 112018118131233-pct00054
제조예 2에서의 방법에 따라, 실시예 A-4-(6)에서 수득된 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}헵타데칸이산의 조 생성물(60 mg), 시스-2-노넨-1-올(0.066 mL, 0.40 mmol), EDC(56 mg, 0.29 mmol), DMAP(3.2 mg, 0.026 mmol) 및 THF(1.3 mL)로부터 표제 화합물(76 mg, 0.11 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.81-0.96(m,6H),1.15-1.44(m,35H),1.52-1.68(m,6H),1.70-1.84(m,2H),1.85-2.05(m,4H),2.05-2.15(m,4H),2.21-2.35(m,5H),2.27(s,3H),2.74-2.88(m,2H),3.93-4.01(m,2H),4.57-4.67(m,4H),5.47-5.58(m,2H),5.59-5.70(m,2H).
(양이온성 지질 (6)의 합성)
[실시예 A-6]
(1R,5S,6r)-2-{9-[(2-부틸옥틸)옥시]-9-옥소노닐}도데실 3-메틸-3-아자바이사이클로[3.1.0] 헥산-6-카르복실레이트(양이온성 지질 6)
Figure 112018118131233-pct00055
실시예 A-1-(5)에서의 방법에 따라, 실시예 A-1-(4)에서 수득된 화합물(40 mg, 0.078 mmol), 제조예 10-(2)에서 수득된 화합물(28 mg, 0.16 mmol), EDC(33 mg, 0.17 mmol), DIPEA(0.027 mL, 0.16 mmol), DMAP(1.9 mg, 0.016 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(1.0 mL)로부터 표제 화합물(40 mg, 0.063 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.80-1.00(m,9H),1.16-1.40(m,46H),1.52-1.70(m,4H),1.89-1.97(m,2H),1.98-2.06(m,1H),2.23-2.42(m,4H),2.30(s,3H),3.00-3.12(m,2H),3.87-4.03(m,4H).
(양이온성 지질 (7)의 합성)
[실시예 A-7]
(1R,5S,6s)-2-{9-[(2-부틸옥틸)옥시]-9-옥소노닐}도데실 3-메틸-3-아자바이사이클로[3.1.0] 헥산-6-카르복실레이트(양이온성 지질 7)
Figure 112018118131233-pct00056
실시예 A-1-(5)에서의 방법에 따라, 실시예 A-1-(4)에서 수득된 화합물(40 mg, 0.078 mmol), 제조예 11-(2)에서 수득된 화합물(27.8 mg, 0.16 mmol), EDC(33 mg, 0.17 mmol), DIPEA(0.027 mL, 0.157 mmol), DMAP(1.9 mg, 0.016 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(1.0 mL)로부터 표제 화합물(38 mg, 0.060 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.81-0.97(m,9H),1.15-1.40(m,46H),1.46-1.70(m,7H),2.21(s,3H),2.24-2.38(m,4H),2.96-3.07(m,2H),3.85-4.02(m,4H).
(양이온성 지질 (8)의 합성)
[실시예 A-8]
2-{9-[(2-부틸옥틸)옥시]-9-옥소노닐}도데실 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트(양이온성 지질 8)
Figure 112018118131233-pct00057
실시예 A-1-(4)에서 수득된 화합물(11 mg, 0.022 mmol) 및 피리딘(0.0043 mL, 0.054 mmol)을 메틸렌 클로라이드(0.8 mL) 중에 용해시키고, 여기에 4-니트로페닐 클로로포르메이트(12 mg, 0.060 mmol)를 빙랭 하에서 첨가하고, 혼합물을 동알한 온도에서 10분 동안 그리고 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 1-메틸피페라진(0.010 mL, 0.090 mmol)을 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(11 mg, 0.017 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.80-0.98(m,9H),1.16-1.42(m,46H),1.52-1.77(m,4H),2.23-2.44(m,6H),2.30(s,3H),3.42-3.57(m,4H),3.90-4.04(m,4H).
(양이온성 지질 (9)의 합성)
[실시예 A-9]
2-[9-(헥실옥시)-9-옥소노닐]도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 9)
Figure 112018118131233-pct00058
제조예 2에서의 방법에 따라, 실시예 A-2-(6)에서 수득된 화합물(100 mg, 0.21 mmol), 헥산-1-올(32 μL, 0.26 mmol), EDC(49 mg, 0.26 mmol), DMAP(5.0 mg, 0.050 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(5.0 mL)로부터 표제 화합물(102 mg, 0.19 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.85-0.92(m,6H),1.19-1.39(m,37H),1.57-1.66(m,5H),1.73-1.84(m,2H),1.87-1.94(m,2H),1.96-2.07(m,2H),2.22-2.32(m,6H),2.73-2.87(m,2H),3.98(d,J=5.50Hz,2H),4.06(t,J=6.79Hz,2H).
(양이온성 지질 (10)의 합성)
[실시예 A-10]
2-[9-(옥틸옥시)-9-옥소노닐]도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 10)
Figure 112018118131233-pct00059
제조예 2에서의 방법에 따라, 실시예 A-2-(6)에서 수득된 화합물(200 mg, 0.42 mmol), 옥탄-1-올(67 mg, 0.51 mmol), EDC(98 mg, 0.51 mmol), DMAP(10 mg, 0.09 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(10 mL)로부터 표제 화합물(109 mg, 0.19 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.91(t,J=6.97Hz,6H),1.23-1.40(m,40H),1.60-1.68(m,5H),1.76-1.85(m,2H),1.89-1.95(m,2H),1.97-2.06(m,2H),2.25-2.33(m,6H),2.78-2.86(m,2H),4.00(d,J=5.69 Hz,2H),4.08(t,J=6.79 Hz,2H).
(양이온성 지질 (11)의 합성)
[실시예 A-11]
2-[9-(데실옥시)-9-옥소노닐]도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 11)
Figure 112018118131233-pct00060
제조예 2에서의 방법에 따라, 실시예 A-2-(6)에서 수득된 화합물(200 mg, 0.42 mmol), 데칸-1-올(100 μL, 0.51 mmol), EDC(98 mg, 0.51 mmol), DMAP(10 mg, 0.09 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(10 mL)로부터 표제 화합물(153 mg, 0.25 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.91(t,J=7.06Hz,6H),1.17-1.42(m,44H),1.60-1.68(m,5H),1.75-1.86(m,2H),1.88-1.96(m,2H),1.97-2.07(m,2H),2.24-2.35(m,6H),2.78-2.87(m,2H),4.00(d,J=5.50Hz,2H),4.08(t,J=6.79 Hz,2H).
(양이온성 지질 (12)의 합성)
[실시예 A-12]
2-{9-옥소-9-[(4-펜틸노닐)옥시]노닐}도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 12)
Figure 112018118131233-pct00061
제조예 2에서의 방법에 따라, 실시예 A-2-(6)에서 수득된 화합물(200 mg, 0.42 mmol), 제조예 7-(2)에서 수득된 화합물(115 mg, 0.60 mmol), EDC(98 mg, 0.51 mmol), DMAP(10 mg, 0.09 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(10 mL)로부터 표제 화합물(212 mg, 0.32 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.85-0.92(m,9H),1.16-1.34(m,49H),1.51-1.66(m,5H),1.73-1.84(m,2H),1.86-1.94(m,2H),1.95-2.05(m,2H),2.23-2.31(m,6H),2.75-2.85(m,2H),3.98(d,J=5.50Hz,2H),4.04(t,J=6.79 Hz,2H).
(양이온성 지질 (13)의 합성)
[실시예 A-13]
2-(4-옥소-4-(트리데실옥시)부틸)도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 13)
Figure 112018118131233-pct00062
(1) 4-벤질 1,1-디-tert-부틸 부탄-1,1,4-트리카르복실레이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00063
60% 수소화나트륨(1.05 g, 26.2 mmol)을 THF(50 mL) 중에 현탁시키고, 여기에 디-tert-부틸 말로네이트(5.86 mL, 26.2 mmol)를 빙랭 하에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 빙랭 하에서, 요오드화나트륨(0.37 g, 2.49 mmol)을 첨가하고, 이어서 제조예 8에서 수득된 화합물(6.41 g, 24.9 mmol)을 적가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르로 희석시키고, 물로 세척하고, 이어서 수성 층을 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하여 표제 화합물(9.88 g, 25.2 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):1.42-1.49(m,18H),1.65-1.72(m,2H),1.80-1.87(m,2H),2.39(t,J=7.52 Hz,2H),3.13(t,J=7.52Hz,1H),5.11(s,2H),7.29-7.40(m,5H).
(2) 1-벤질 4,4-디-tert-부틸 테트라데칸-1,4,4-트리카르복실레이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00064
실시예 A-13-(1)에서 수득된 화합물(9.88 g, 25.2 mmol)을 THF(100 mL) 중에 용해시키고, 여기에 60% 수소화나트륨(1.51 g, 37.8 mmol)을 수냉 하에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 1-요오도데칸(10.7 mL, 50.4 mmol)을 서서히 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, n-펜탄으로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/디에틸 에테르)로 정제하여 표제 화합물(4.31 g, 8.09 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.85-0.91(m,3H),1.07-1.17(m,2H),1.21-1.33(m,16H),1.44(s,18H),1.49-1.54(m,2H),1.74-1.84(m,4H),2.36(t,J=7.34Hz,2H),5.11(s,2H),7.28-7.38(m,5H).
(3) 2-[4-(벤질옥시)-4-옥소부틸]도데칸산의 합성
Figure 112018118131233-pct00065
실시예 A-13-(2)에서 수득된 화합물(4.31 g, 8.09 mmol)을 메틸렌 클로라이드(20 mL) 중에 용해시키고, 여기에 TFA(10 mL)를 빙랭 하에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시킨 후, 톨루엔을 첨가하고, 공비 증류를 2회 수행하였다. 수득된 조 생성물을 자일렌(25 mL) 중에 용해시키고, 8시간 동안 가열 하에서 환류하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 수득된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(2.74 g, 7.28 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.82-0.89(m,3H),1.17-1.31(m,16H),1.32-1.42(m,3H),1.43-1.57(m,4H),2.16-2.22(m,1H),2.32-2.38(m,2H),5.08(s,2H),7.29-7.40(m,5H),12.06(br s,1H).
(4) 벤질 5-(하이드록시메틸)펜타데카노에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00066
실시예 A-13-(3)에서 수득된 화합물(2.74 g, 7.28 mmol)을 THF(30 mL) 중에 용해시키고, 여기에 보란-THF 착물(1 M, 16.9 mL, 16.9 mmol)을 -78℃에서 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 8시간 동안 그리고 이어서 15℃에서 22시간 동안 교반하였다. 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(2.30 g, 6.34 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.85(t,J=6.88Hz,3H),1.08-1.37(m,18H),1.49-1.58(m,2H),2.27-2.36(m,2H),3.21-3.29(m,2H),4.28(t,J=5.14Hz,1H),5.01-5.12(m,2H),7.30-7.40(m,5H).
(5) 2-(4-(벤질옥시)-4-옥소부틸)도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00067
실시예 A-13-(4)에서 수득된 화합물(2.30 g, 6.34 mmol), DIPEA(2.2 mL, 12.7 mmol), 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 하이드로클로라이드(2.28 g, 12.7 mmol) 및 DMAP(0.16 g, 1.27 mmol)를 메틸렌 클로라이드(30 mL) 중에 용해시키고, 여기에 EDC(2.68 g, 13.9 mmol)를 빙랭 하에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 디에틸 에테르 중에 용해시켰다. 용액을 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 물로 순차적으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하여 표제 화합물(2.97 g, 6.09 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.88(t,J=7.06Hz,3H),1.17-1.38(m,21H),1.60-1.70(m,3H),1.77-1.87(m,2H),1.89-1.99(m,2H),2.23-2.38(m,6H),2.74-2.91(m,2H),3.94-4.02(m,2H),5.09-5.13(m,2H),7.30-7.41(m,5H).
(6) 5-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}펜타데칸산의 합성
Figure 112018118131233-pct00068
실시예 A-13-(5)에서 수득된 화합물(2.97 g, 6.09 mmol)을 에틸 아세테이트(35 mL) 중에 용해시키고, 여기에 10% 팔라듐-탄소(0.65 g, 0.61 mmol, 50% 물을 함유함)를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 수소 분위기에서 상압 하에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켜 표제 화합물(2.31 g, 5.81 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.85(t,J=6.88Hz,3H),1.21-1.32(m,20H),1.44-1.66(m,5H),1.75-1.83(m,2H),1.95-1.98(m,1H),1.99-2.06(m,1H),2.13-2.23(m,5H),2.23-2.30(m,1H),2.64-2.77(m,2H),3.88-3.97(m,2H).
(7) 2-(4-옥소-4-(트리데실옥시)부틸)도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00069
실시예 A-13-(6)에서 수득된 화합물(200 mg, 0.50 mmol), 트리데칸-1-올(121 mg, 0.60 mmol) 및 DMAP(12 mg, 0.10 mmol)를 메틸렌 클로라이드(5 mL) 중에 용해시키고, 여기에 EDC(116 mg, 0.60 mmol)를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(메탄올/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(170 mg, 0.29 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.88(t,J=6.7Hz,6H),1.26(br s,41H),1.57-1.69(m,6H), 1.73-1.82(m,2H),1.90(br dd,J=13.5,3.03Hz,2H),1.94-2.04(m,2H),2.22-2.34(m,6H), 2.67-2.90(br d,J=9.8Hz,2H),3.95-4.02(m,2H),4.03-4.08(t,J=6.8Hz,2H).
(양이온성 지질 (14)의 합성)
[실시예 A-14]
2-(4-옥소-4-((8-펜틸트리데실)옥시)부틸)도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 14)
Figure 112018118131233-pct00070
실시예 A-13-(7)에서의 방법에 따라, 실시예 A-13-(6)에서 수득된 화합물(120 mg, 0.30 mmol), 제조예 4-(4)에서 수득된 화합물(90 mg, 0.33 mmol), EDC(64 mg, 0.33 mmol), DMAP(4.0 mg, 0.033 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(1.5 mL)로부터 표제 화합물(133 mg, 0.21 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):0.87-0.97(m,9H),1.18-1.45(m,47H),1.60-1.73(m,5H),1.73-1.83(m,2H),1.88-1.99(m,2H),2.06-2.19(m,2H),2.23-2.43(m,6H),2.77-2.89(m,2H),3.99-4.15(m,4H).
(양이온성 지질 (15)의 합성)
[실시예 A-15]
2-{4-[(4-노닐트리데실)옥시]-4-옥소부틸}도데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트(양이온성 지질 15)
Figure 112018118131233-pct00071
실시예 A-13-(7)에서의 방법에 따라, 실시예 A-13-(6)에서 수득된 화합물(110 mg, 0.28 mmol), 제조예 5-(4)에서 수득된 화합물(99 mg, 0.30 mmol), EDC(58 mg, 0.30 mmol), DMAP(4.0 mg, 0.033 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(1.3 mL)로부터 표제 화합물(106 mg, 0.15 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):0.85-0.99(m,9H),1.15-1.44(m,55H),1.56-1.84(m,7H),1.94(m,J=13.2Hz,2H),2.06-2.19(m,2H),2.23-2.44(m,6H),2.76-2.90(m,2H),3.96-4.14(m,4H).
(양이온성 지질 (16)의 합성)
[실시예 A-16]
디옥틸 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}헵타데칸디오에이트(양이온성 지질 16)
Figure 112018118131233-pct00072
(1) 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}헵타데칸이산의 합성
Figure 112018118131233-pct00073
실시예 A-4-(5)에서 수득된 화합물(0.80 g, 1.25 mmol)을 에탄올(5 mL) 중에 용해시키고, 여기에 10% 팔라듐-탄소(0.13 g, 0.13 mmol, 50% 물을 함유함)를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 수소 분위기에서 상압 하에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트를 통해 여과하고, 에탄올로 세척하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켜 표제 화합물(0.58 g, 1.26 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.17-1.30(m,20H),1.43-1.52(m,4H),1.52-1.62(m,3H),1.77-1.82(m,2H),1.92-2.03(m,2H),2.12-2.22(m,7H),2.23-2.33(m,1H),2.66-2.75(m,2H),3.93(d,J=5.50Hz,2H).
(2) 디옥틸 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸} 헵타데칸디오에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00074
실시예 A-16-(1)에서 수득된 화합물(100 mg, 0.22 mmol), 옥탄-1-올(83 μL, 0.53 mmol) 및 DMAP(11 mg, 0.09 mmol)를 메틸렌 클로라이드(5 mL) 중에 용해시키고, 여기에 EDC(101 mg, 0.53 mmol)를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 이어서 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(메탄올/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(101 mg, 0.15 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.83-0.92(m,6H),1.21-1.39(m,40H),1.55-1.66(m,9H),1.72-1.83(m,2H),1.85-1.95(m,2H),1.95-2.06(m,2H),2.22-2.33(m,8H),2.75-2.87(m,2H),3.97(d,J=5.69Hz,2H),4.05(t,J=6.69Hz,4H).
(양이온성 지질 (17)의 합성)
[실시예 A-17]
비스(4-펜틸노닐) 9-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}헵타데칸디오에이트(양이온성 지질 17)
Figure 112018118131233-pct00075
실시예 A-16-(2)에서의 방법에 따라, 실시예 A-16-(1)에서 수득된 화합물(0.20 g, 0.44 mmol), 제조예 7-(2)에서 수득된 화합물(0.23 g, 1.05 mmol), EDC(0.20 g, 1.05 mmol), DMAP(11 mg, 0.09 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(5 mL)로부터 표제 화합물(0.23 g, 0.27 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.88(t,J=7.24Hz,12H),1.17-1.35(m,58H),1.58-1.65(m,9H),1.73-1.83(m,2H),1.87-1.93(m,2H),1.95-2.04(m,2H),2.23-2.32(m,8H),2.75-2.86(m,2H),3.97(d,J=5.50Hz,2H),4.04(t,J=6.79 Hz,4H).
(양이온성 지질 (18)의 합성)
[실시예 A-18]
디트리데실 5-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}노난디오에이트(양이온성 지질 18)
Figure 112018118131233-pct00076
(1) 1,7-디벤질 4,4-디-tert-부틸 헵탄-1,4,4,7-테트라카르복실레이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00077
실시예 A-13-(1)에서 수득된 화합물(3.84 g, 9.78 mmol)을 THF(30 mL) 중에 용해시키고, 여기에 60% 수소화나트륨(0.43 g, 10.8 mmol)을 수냉 하에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. THF(10 mL) 중 벤질 4-브로모부타노에이트(3.02 g, 11.7 mmol)의 용액을 적가하고, 18시간 동안 가열 하에서 환류하였다. 반응 용액을 실온까지 냉각시키고, 디에틸 에테르로 희석시켰다. 유기 층을 물 및 포화 염화나트륨 용액으로 순차적으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/사이클로헥산)로 정제하여 표제 화합물(1.88 g, 3.31 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):1.43(s,18H),1.47-1.54(m,4H),1.78-1.85(m,4H),2.36(t,J=7.34Hz,4H),5.10(s,4H),7.27-7.40(m,10H).
(2) 6-(벤질옥시)-2-[4-(벤질옥시)-4-옥소부틸]-6-옥소헥산산의 합성
Figure 112018118131233-pct00078
실시예 A-13-(3)에서의 방법에 따라, 실시예 A-18-(1)에서 수득된 화합물(1.88 g, 3.31 mmol), TFA(4 mL), 메틸렌 클로라이드(8 mL) 및 자일렌(10 mL)으로부터 표제 화합물(1.01 g, 2.45 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.31-1.58(m,8H),2.19-2.25(m,1H),2.33-2.37(m,4H),5.05-5.11(m,4H),7.27-7.40(m,10H),12.14(br s,1H).
(3) 디벤질 5-(하이드록시메틸)노난디오에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00079
실시예 A-18-(2)에서 수득된 화합물(1.01 g, 2.45 mmol)을 THF(10 mL) 중에 용해시키고, 여기에 보란-THF 착물(1 M, 4.9 mL, 4.9 mmol)을 -78℃에서 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 16시간 동안 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기 층을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(0.59 g, 1.47 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.09-1.37(m,6H),1.48-1.56(m,4H),2.32(t,J=7.34Hz,4H),3.26(t,J=5.23Hz,2H),4.32(t,J=5.14Hz,1H),5.08(s,4H),7.28-7.41(m,10H).
(4) 디벤질 5-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸} 노난디오에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00080
실시예 A-13-(5)에서의 방법에 따라, 실시예 A-18-(3)에서 수득된 화합물(0.58 g, 1.47 mmol), DIPEA(0.51 mL, 2.95 mmol), 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 하이드로클로라이드(0.52 g, 2.95 mmol), DMAP(36 mg, 0.30 mmol), EDC(0.62 g, 3.24 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(7 mL)로부터 표제 화합물(0.62 g, 1.19 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):1.27-1.38(m,4H),1.59-1.69(m,5H),1.70-1.81(m,2H),1.85-1.92(m,2H),1.92-2.02(m,2H),2.26(s,4H),2.33(t,J=7.34Hz,4H),2.74-2.83(m,2H),3.97(d,J=5.69Hz,2H),5.11(s,4H),7.28-7.39(m,10H).
(5) 5-[{(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시}메틸]노난이산의 합성
Figure 112018118131233-pct00081
실시예 A-16-(1)에서의 방법에 따라, 실시예 A-18-(4)에서 수득된 화합물(0.62 g, 1.19 mmol), 10% 팔라듐-탄소(62 mg, 0.06 mmol, 50% 물을 함유함) 및 에탄올(2 mL)로부터 표제 화합물(0.41 g, 1.19 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.20-1.31(m,4H),1.44-1.66(m,7H),1.72-1.81(m,4H),1.88-1.97(m,2H),2.13(s,3H),2.16-2.22(m,4H),2.22-2.30(m,1H),2.64-2.71(m,2H),3.93(d,J=5.32Hz,2H).
(6) 디트리데실 5-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}노난디오에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00082
실시예 A-13-(7)에서의 방법에 따라, 실시예 A-18-(5)에서 수득된 화합물(135 mg, 0.39 mmol), 트리데칸-1-올(189 mg, 0.94 mmol), DMAP(9 mg, 0.08 mmol), EDC(166 mg, 0.87 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(5 mL)로부터 표제 화합물(107 mg, 0.15 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.88(t,J=7.06Hz,6H),1.20-1.41(m,45H),1.58-1.71(m,9H),1.71-1.82(m,2H),1.86-1.94(m,2H),1.95-2.04(m,2H),2.23-2.30(m,8H),2.77-2.83(m,2H),4.00(d,J=5.5Hz,2H),4.05(t,J=6.88Hz,4H).
(양이온성 지질 (19)의 합성)
[실시예 A-19]
비스(8-펜틸트리데실) 5-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}노난디오에이트(양이온성 지질 19)
Figure 112018118131233-pct00083
실시예 A-13-(7)에서의 방법에 따라, 실시예 A-18-(5)에서 수득된 화합물(80 mg, 0.23 mmol), 제조예 4-(4)에서 수득된 화합물(151 mg, 0.56 mmol), DMAP(6 mg, 0.05 mmol), EDC(98 mg, 0.51 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(5 mL)로부터 표제 화합물(79 mg, 0.09 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.88(t,J=7.24Hz,12H),1.15-1.40(m,60H),1.59-1.71(m,10H),1.72-1.82(m,2H),1.86-1.94(m,2H),1.94-2.04(m,2H),2.23-2.32(m,8H),2.77-2.85(m,2H),4.00(d,J=5.5Hz,2H),4.05(t,J=6.88Hz,4H).
(양이온성 지질 (20)의 합성)
[실시예 A-20]
비스(4-노닐트리데실) 5-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}노난디오에이트(양이온성 지질 20)
Figure 112018118131233-pct00084
실시예 A-13-(7)에서의 방법에 따라, 실시예 A-18-(5)에서 수득된 화합물(80 mg, 0.23 mmol), 제조예 5-(4)에서 수득된 화합물(198 mg, 0.61 mmol), DMAP(6 mg, 0.05 mmol), EDC(98 mg, 0.51 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(5 mL)로부터 표제 화합물(46 mg, 0.05 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.88(t,J=6.97Hz,12H),1.17-1.41(m,77H),1.57-1.72(m,9H),1.72-1.81(m,2H),1.85-1.94(m,2H),1.94-2.03(m,2H),2.23-2.31(m,8H),2.80(m,J=10.50Hz,2H),4.00(d,J=5.50Hz,2H),4.03(t,J=6.88 Hz,4H).
(양이온성 지질 (21)의 합성)
[실시예 A-21]
디운데실 7-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}트리데칸디오에이트(양이온성 지질 21)
Figure 112018118131233-pct00085
(1) 6-벤질 1,1-디-tert-부틸 헥산-1,1,6-트리카르복실레이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00086
60% 수소화나트륨(0.80 g, 20.0 mmol)을 THF(35 mL) 중에 현탁시키고, 여기에 디-tert-부틸 말로네이트(4.48 mL, 20.0 mmol)를 빙랭 하에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 빙랭 하에서, 요오드화나트륨(0.29 g, 1.90 mmol)을 첨가하고, 이어서 THF(10 mL) 중 제조예 9에서 수득된 화합물(5.43 g, 19.0 mmol)의 용액을 적가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르로 추출하고, 물로 세척하고, 수성 층을 디에틸 에테르로 희석시켰다. 유기 층을 합하고, 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과 후에, 용매를 감압 하에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(사이클로헥산/에틸 아세테이트)로 정제하여 표제 화합물(6.01 g, 14.3 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):1.27-1.38(m,4H),1.45(s,18H),1.62-1.68(m,2H),1.73-1.82(m,2H),2.35(t,J=7.52Hz,2H),3.09(t,J=7.61Hz,1H),5.11(s,2H),7.29-7.40(m,5H).
(2) 1,11-디벤질 6,6-디-tert-부틸 운데칸-1,6,6,11-테트라카르복실레이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00087
실시예 A-18-(1)에서의 방법에 따라, 실시예 A-21-(1)에서 수득된 화합물(4.0 g, 9.51 mmol), 60% 수소화나트륨(0.42 g, 10.5 mmol), 제조예 9에서 수득된 화합물(3.25 g, 11.4 mmol) 및 THF(30 mL)로부터 표제 화합물(5.18 g, 8.29 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):1.09-1.19(m,4H),1.28-1.36(m,5H),1.43(s,18H),1.60-1.69(m,4H),1.72-1.80(m,4H),2.34(t,J=7.52Hz,4H),5.05-5.15(m,4H),7.28-7.41(m,9H).
(3) 8-(벤질옥시)-2-[6-(벤질옥시)-6-옥소헥실]-8-옥소옥탄산의 합성
Figure 112018118131233-pct00088
실시예 A-13-(3)에서의 방법에 따라, 실시예 A-21-(2)에서 수득된 화합물(5.18 g, 8.29 mmol), TFA(10 mL), 메틸렌 클로라이드(20 mL) 및 자일렌(25 mL)으로부터 표제 화합물(2.49 g, 5.31 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.15-1.57(m,16H),2.11-2.20(m,1H),2.33(t,J=7.34Hz,4H),5.08(s,4H),7.23-7.43(m,10H),12.01(br s,1H).
(4) 디벤질 7-(하이드록시메틸)트리데칸디오에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00089
실시예 A-18-(3)에서의 방법에 따라, 실시예 A-21-(3)에서 수득된 화합물(2.49 g, 5.31 mmol), 보란-THF 착물(1 M, 13.2 mL, 13.2 mmol) 및 THF(20 mL)로부터 표제 화합물(1.95 g, 4.29 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):1.11-1.36(m,13H),1.39-1.46(m,1H),1.60-1.70(m,4H),2.35(t,J=7.52 Hz,4H),3.51(d,J=5.32Hz,2H),5.11(s,4H),7.29-7.40(m,10H).
(5) 디벤질 7-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸} 트리데칸디오에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00090
실시예 A-13-(5)에서의 방법에 따라, 실시예 A-21-(4)에서 수득된 화합물(1.95 g, 4.29 mmol), DIPEA(1.5 mL, 8.58 mmol), 1-메틸-피페리딘-4-카르복실산 하이드로클로라이드(1.54 g, 8.58 mmol), DMAP(0.11 g, 0.86 mmol), EDC(1.81 g, 9.44 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(20 mL)로부터 표제 화합물(2.97 g, 6.09 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):1.22-1.35(m,12H),1.61-1.68(m,4H),1.70-1.84(m,3H),1.85-1.93(m,2H),1.95-2.06(m,2H),2.21-2.30(m,4H),2.35(t,J=7.52Hz,4H),2.74-2.85(m,2H),3.96(d,J=5.50Hz,2H),5.11(s,4H),7.29-7.39 (m,10H).
(6) 7-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}트리데칸이산의 합성
Figure 112018118131233-pct00091
실시예 A-16-(1)에서의 방법에 따라, 실시예 A-21-(5)에서 수득된 화합물(2.28 g, 3.93 mmol), 10% 팔라듐-탄소(0.42 g, 0.39 mmol, 50% 물을 함유함) 및 에탄올(20 mL)로부터 표제 화합물(1.34 g, 3.35 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.19-1.30(m,12H),1.44-1.53(m,4H),1.53-1.63(m,3H),1.72-1.81(m,2H),1.90-1.98(m,2H),2.14(s,3H),2.18(t,J=7.43Hz,4H),2.23-2.31(m,1H),2.64-2.73(m,2H),3.93(d,J=5.50Hz,2H).
(7) 디운데실 7-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸} 트리데칸디오에이트의 합성
Figure 112018118131233-pct00092
실시예 A-21-(6)에서 수득된 화합물(200 mg, 0.50 mmol), 운데칸-1-올(83 μL, 1.20 mmol) 및 DMAP(24 mg, 0.20 mmol)를 메틸렌 클로라이드(10 mL) 중에 용해시키고, 여기에 EDC(230 mg, 1.20 mmol)를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 이어서 유기 층을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/사이클로헥산/메탄올)로 정제하여 표제 화합물(220 mg, 0.32 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.88(t,J=7.06Hz,6H),1.19-1.39(m,44H),1.57-1.68(m,9H)1.71-1.86(m,2H),1.84-1.95(m,2H),1.95-2.06(m,2H),2.21-2.34(m,8H),2.75-2.87(m,2H),3.97(d,J=5.69Hz,2H),4.05(t,J=6.79Hz,4H).
(양이온성 지질 (22)의 합성)
[실시예 A-22]
비스(4-헵틸운데실) 7-{[(1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시]메틸}트리데칸디오에이트(양이온성 지질 22)
Figure 112018118131233-pct00093
실시예 A-16-(2)에서의 방법에 따라, 실시예 A-21-(6)에서 수득된 화합물(200 mg, 0.25 mmol), 제조예 6-(2)에서 수득된 화합물(160 mg, 0.60 mmol), DMAP(12 mg, 0.10 mmol), EDC(120 mg, 0.60 mmol) 및 메틸렌 클로라이드(5 mL)로부터 표제 화합물(88 mg, 0.10 mmol)을 수득하였다.
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):0.88(t,J=6.97Hz,12H),1.11-1.36(m,66H),1.49-1.67(m,9H),1.71-1.84(m,2H),1.84-1.95(m,2H),1.95-2.05(m,2H),2.21-2.33(m,8H),2.74-2.88(m,2H),3.97(d,J=5.50Hz,2H),4.04(t,J=6.88Hz,4H).
합성된 양이온성 지질 1 내지 22가 하기 표 A에 나타나 있다.
[표 A-1]
표 A: 합성된 양이온성 지질 1 내지 22
Figure 112018118131233-pct00094
[표 A-2]
Figure 112018118131233-pct00095
[표 A-3]
Figure 112018118131233-pct00096
[표 A-4]
Figure 112018118131233-pct00097
[표 A-5]
Figure 112018118131233-pct00098
B. 조성물의 제조 및 분석
(조성물 (1)의 제조)
[실시예 B-1]
실시예 A-1의 양이온성 지질 1을 사용하여 조성물을 제조하였다. 핵산으로서, 인자 VII(혈액 응고 인자 VII) 유전자의 발현을 침묵시키고 염기 서열: 5'-GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCT*T-3'(T: DNA, fU, fC= 2'-플루오로 RNA, *= 포스포로티오에이트 결합)(서열번호 1)을 갖는 센스 가닥 및 염기 서열: 5'-GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCT*T-3'(T: DNA, fU, fC= 2'-플루오로 RNA, *= 포스포로티오에이트 결합)(서열번호 2)을 갖는 안티센스 가닥으로 이루어진 어닐링된 siRNA(GeneDesign Inc.사, 이하 "인자 VII siRNA"로도 지칭됨)를 사용하였다.
인자 VII siRNA를 80 μg/mL로 25 mM 아세트산나트륨(pH 4.0) 중에 용해시켜 희석된 siRNA 용액을 수득하였다. 양이온성 지질 1, DSPC(Nippon Fine Chemical Co., Ltd.사), 콜레스테롤(Nippon Fine Chemical Co., Ltd.사), MPEG2000-DMG(NOF Corporation사)를 60/8.5/30/1.5(몰비)의 비로 총 지질 농도가 7.2 mM로 설정되도록 에탄올 중에 용해시키고, 이어서 지질 용액을 수득하였다. 희석된 siRNA 용액 및 지질 용액을 각각 3 mL/min 및 1 mL/min의 유속으로 공급하고 혼합하여 지질 복합체 수용액을 수득하였다. 수득된 지질 복합체 수용액을 투석막(상품명 "Float-A-Lyzer G2", SPECTRUM, Inc.사, 50K MWCO)을 사용하여 투석을 거쳐서 외부 용액을 인산염 완충액(PBS, pH 7.4)으로 대체하였다. 투석 후에, 농축 및 여과 멸균을 수행하였으며, 그럼으로써 실시예 B-1의 액체 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-2]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-2의 양이온성 지질 2를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-1과 동일한 방식으로 실시예 B-2의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-3]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-3의 양이온성 지질 3을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-1과 동일한 방식으로 실시예 B-3의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-4]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-4의 양이온성 지질 4를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-1과 동일한 방식으로 실시예 B-4의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-5]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-5의 양이온성 지질 5를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-1과 동일한 방식으로 실시예 B-5의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-6]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-6의 양이온성 지질 6을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-1과 동일한 방식으로 실시예 B-6의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-7]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-7의 양이온성 지질 7을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-1과 동일한 방식으로 실시예 B-7의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-8]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-8의 양이온성 지질 8을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-1과 동일한 방식으로 실시예 B-8의 조성물을 수득하였다.
[비교예 B-1]
특허문헌 2에 개시된 방법에 따라 합성된 특허문헌 2에 개시된 하기 화학식 (12)로 나타낸 양이온성 지질, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-(디메틸아미노) 부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(이하, "ALN-319"로도 지칭됨)를 양이온성 지질 1 대신 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-1에서와 동일한 방식으로 비교예 B-1의 조성물을 수득하였다.
Figure 112018118131233-pct00099
(조성물 (1)의 분석)
실시예 B-1 내지 실시예 B-8 및 비교예 B-1의 조성물에서, 지질 복합체 내로의 siRNA의 봉입률을 측정하였다.
구체적으로는, RNase Free Water로 조성물을 희석시킨 후에 Quant-iT RiboGreen RNA 시약(Invitrogen사)을 사용하여 측정된 siRNA 농도 (A)를 지질 복합체의 외부 용액에 존재하는 siRNA의 농도로 설정하였다. 1% Triton X-100으로 조성물을 희석시킨 후에 측정된 siRNA 농도 (B)를 조성물 중의 총 siRNA 농도로 설정하였다. 다음으로, 하기 식 (F1)에 따라, 핵산의 봉입률을 계산하였다.
봉입률(%) = 100 - (A/B) x 100 (F1)
지질 복합체의 평균 입자 직경을 입자 직경 분석기(상품명 "Zetasizer Nano ZS", Malvern Panalytical Ltd.사제)를 사용하여 측정하였다.
표 1은 siRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경(Z-평균) 및 분산 지수를 나타낸다.
조성물 양이온성 지질 봉입률(%) 평균 입자 직경(nm) 분산 지수
실시예 B-1 1 98 87 0.11
실시예 B-2 2 98 78 0.09
실시예 B-3 3 98 77 0.10
실시예 B-4 4 99 86 0.11
실시예 B-5 5 96 76 0.14
실시예 B-6 6 91 69 0.17
실시예 B-7 7 96 69 0.14
실시예 B-8 8 97 69 0.14
비교예 B-1 ALN-319 98 84 0.11
실시예 B-1 내지 실시예 B-8의 조성물은 비교예 B-1의 조성물의 봉입률과 동등한, siRNA의 높은 봉입률을 나타내는 것으로 확인된다.
(조성물 (2)의 제조)
[실시예 B-9]
실시예 A-1의 양이온성 지질 1을 사용하여 조성물을 제조하였다. 핵산으로서, Firefly Luciferase(FLuc)의 mRNA(TriLink Biotechnologies사, 이하, "FLuc mRNA"로도 지칭됨)를 사용하였다.
FLuc mRNA를 27 μg/mL로 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.0) 중에 용해시켜 희석된 mRNA 용액을 수득하였다. 양이온성 지질 1, DSPC(Nippon Fine Chemical Co., Ltd.사), 콜레스테롤(Nippon Fine Chemical Co., Ltd.사), MPEG2000-DMG(NOF Corporation사)를 60/8.5/30/1.5(몰비)의 비로 총 지질 농도가 2.4 mM로 설정되도록 에탄올 중에 용해시켜 지질 용액을 수득하였다. 희석된 mRNA 용액 및 지질 용액을 각각 3 mL/min 및 1 mL/min의 유속으로 공급하고 혼합하여 지질 복합체 수용액을 수득하였다. 수득된 지질 복합체 수용액을 투석막(상품명 "Float-A-Lyzer G2", SPECTRUM, Inc.사, 50K MWCO)을 사용하여 투석을 거쳐서 외부 용액을 인산염 완충액(PBS, pH 7.4)으로 대체하였다. 투석 후에, 농축 및 여과 멸균을 수행하였으며, 그럼으로써 실시예 B-9의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-10]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-2의 양이온성 지질 2를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-9와 동일한 방식으로 실시예 B-10의 조성물을 수득하였다.
[비교예 B-2]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 전술된 ALN-319를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-9와 동일한 방식으로 비교예 B-2의 조성물을 수득하였다.
(조성물 (2)의 분석)
조성물 (1)의 분석에서와 동일한 방식으로, 지질 복합체 내에의 mRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경을 실시예 B-9, 실시예 B-10 및 비교예 B-2의 조성물에 대해 측정하였다. 표 2는 mRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경(Z-평균)을 나타낸다.
조성물 양이온성 지질 봉입률(%) 평균 입자 직경(nm) 분산 지수
실시예 B-9 1 94 104 0.06
실시예 B-10 2 92 110 <0.01
비교예 B-2 ALN-319 95 125 0.04
실시예 B-9 및 실시예 B-10의 조성물은 비교예 B-2의 조성물의 봉입률과 동등한, mRNA의 높은 봉입률을 나타내는 것으로 확인된다.
(조성물 (3)의 제조)
[실시예 B-11]
실시예 A-2의 양이온성 지질 2를 사용하여 조성물을 제조하였다. 양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 양이온성 지질 2를 사용하고, 핵산으로서, FLuc mRNA 대신에 Human Erythropoietin(hEPO) mRNA(TriLink Biotechnologies, 이하 "EPO mRNA"로도 지칭됨)를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-9에서와 동일한 방식으로 실시예 B-11의 조성물을 수득하였다.
[비교예 B-3]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 2 대신에 전술된 ALN-319를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-11에서와 동일한 방식으로 비교예 B-3의 조성물을 수득하였다.
(조성물 (3)의 분석)
조성물 (1)의 분석에서와 동일한 방식으로, 지질 복합체 내에의 mRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경을 실시예 B-11 및 비교예 B-3의 조성물에 대해 측정하였다. 표 3은 mRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경(Z-평균)을 나타낸다.
조성물 양이온성 지질 봉입률(%) 평균 입자 직경(nm) 분산 지수
실시예 B-11 2 98 109 0.06
비교예 B-3 ALN-319 92 127 0.06
실시예 B-11의 조성물은 비교예 B-3의 조성물의 봉입률과 동등한, mRNA의 높은 봉입률을 나타내는 것으로 확인된다.
(조성물 (4)의 제조)
[실시예 B-12]
조성물 (1)의 제조에서와 동일한 방식으로, 실시예 A-1의 양이온성 지질 1을 사용하여, 인자 VII siRNA를 함유하는 실시예 B-12의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-13]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-2의 양이온성 지질 2를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-12에서와 동일한 방식으로 실시예 B-13의 조성물을 수득하였다.
[비교예 B-4]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 전술된 ALN-319를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-12에서와 동일한 방식으로 비교예 B-4의 조성물을 수득하였다.
(조성물 (4)의 분석)
조성물 (1)의 분석에서와 동일한 방식으로, 지질 복합체의 평균 입자 직경(저장 전 평균 입자 직경)을 실시예 B-12, 실시예 B-13 및 비교예 B-4의 조성물에 대해 측정하였다. 조성물을 4℃에서 3개월 동안 밀봉된 바이알 내에서 추가로 저장하고, 지질 복합체의 평균 입자 직경(저장 후 평균 입자 직경)을 측정하였다. 표 4는 지질 복합체의 평균 입자 직경(Z-평균)의 변화를 나타낸다. 상기 표에서, 저장 후 평균 입자 직경/저장 전 평균 입자 직경 x 100에 의해 평균 입자 직경의 변화(%)를 계산하였다.
조성물 양이온성 지질 저장 전 평균 입자 직경(nm) 저장 후 평균 입자 직경(nm) 평균 입자 직경의 변화(%)
실시예 B-12 1 91 96 105
실시예 B-13 2 90 92 102
비교예 B-4 ALN-319 76 115 151
실시예 B-12 및 실시예 B-13의 조성물은 평균 입자 직경이 3개월에 걸친 저장 후에 거의 변화되지 않고 비교예 B-4의 조성물보다 물리적으로 더 안정한 것으로 입증되었다.
(조성물 (5)의 제조)
[실시예 B-14]
조성물 (1)의 제조에서와 동일한 방식으로, 실시예 A-9의 양이온성 지질 9를 사용하여, 인자 VII siRNA를 함유하는 실시예 B-14의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-15]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 9 대신에 실시예 A-10의 양이온성 지질 10을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-14에서와 동일한 방식으로 실시예 B-15의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-16]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 9 대신에 실시예 A-11의 양이온성 지질 11을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-14에서와 동일한 방식으로 실시예 B-16의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-17]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 9 대신에 실시예 A-12의 양이온성 지질 12를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-14에서와 동일한 방식으로 실시예 B-17의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-18]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 9 대신에 실시예 A-13의 양이온성 지질 13을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-14에서와 동일한 방식으로 실시예 B-18의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-19]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 9 대신에 실시예 A-14의 양이온성 지질 14를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-14에서와 동일한 방식으로 실시예 B-19의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-20]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 9 대신에 실시예 A-15의 양이온성 지질 15를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-14에서와 동일한 방식으로 실시예 B-20의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-21]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 9 대신에 실시예 A-2의 양이온성 지질 2를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-14에서와 동일한 방식으로 실시예 B-21의 조성물을 수득하였다.
(조성물 (5)의 분석)
조성물 (1)의 분석에서와 동일한 방식으로, 지질 복합체 내에의 siRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경을 실시예 B-14 내지 실시예 B-21의 조성물에 대해 측정하였다. 표 5는 siRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경(Z-평균) 및 분산 지수를 나타낸다.
조성물 양이온성 지질 봉입률(%) 평균 입자 직경(nm) 분산 지수
실시예 B-14 9 80 84 0.11
실시예 B-15 10 94 78 0.14
실시예 B-16 11 96 71 0.06
실시예 B-17 12 98 78 0.16
실시예 B-18 13 99 77 0.12
실시예 B-19 14 99 73 0.05
실시예 B-20 15 99 74 0.06
실시예 B-21 2 99 87 0.16
(조성물 (6)의 제조)
[실시예 B-22]
조성물 (1)의 제조에서와 동일한 방식으로, 실시예 A-16의 양이온성 지질 16을 사용하여, 인자 VII siRNA를 함유하는 실시예 B-22의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-23]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 16 대신에 실시예 A-17의 양이온성 지질 17을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-22에서와 동일한 방식으로 실시예 B-23의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-24]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 16 대신에 실시예 A-18의 양이온성 지질 18을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-22에서와 동일한 방식으로 실시예 B-24의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-25]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 16 대신에 실시예 A-19의 양이온성 지질 19를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-22에서와 동일한 방식으로 실시예 B-25의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-26]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 16 대신에 실시예 A-20의 양이온성 지질 20을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-22에서와 동일한 방식으로 실시예 B-26의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-27]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 16 대신에 실시예 A-21의 양이온성 지질 21을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-22에서와 동일한 방식으로 실시예 B-27의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-28]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 16 대신에 실시예 A-22의 양이온성 지질 22를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-22에서와 동일한 방식으로 실시예 B-28의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-29]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 16 대신에 실시예 A-2의 양이온성 지질 2를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-22에서와 동일한 방식으로 실시예 B-29의 조성물을 수득하였다.
(조성물 (6)의 분석)
조성물 (1)의 분석에서와 동일한 방식으로, 지질 복합체 내에의 siRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경을 실시예 B-22 내지 실시예 B-29의 조성물에 대해 측정하였다. 표 6은 siRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경(Z-평균) 및 분산 지수를 나타낸다.
조성물 양이온성 지질 봉입률(%) 평균 입자 직경(nm) 분산 지수
실시예 B-22 16 72 87 0.12
실시예 B-23 17 97 80 0.08
실시예 B-24 18 97 90 0.13
실시예 B-25 19 97 78 0.18
실시예 B-26 20 97 91 0.11
실시예 B-27 21 96 90 0.13
실시예 B-28 22 97 82 0.14
실시예 B-29 2 99 87 0.16
(조성물 (7)의 제조)
[실시예 B-30]
조성물 (1)의 제조에서와 동일한 방식으로, 실시예 A-1의 양이온성 지질 1을 사용하여, 인자 VII siRNA를 함유하는 실시예 B-30의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-31]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-2의 양이온성 지질 2를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-30에서와 동일한 방식으로 실시예 B-31의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-32]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-3의 양이온성 지질 3을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-30에서와 동일한 방식으로 실시예 B-32의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-33]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-4의 양이온성 지질 4를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-30에서와 동일한 방식으로 실시예 B-33의 조성물을 수득하였다.
[비교예 B-5]
양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 전술된 ALN-319를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 B-30에서와 동일한 방식으로 비교예 B-5의 조성물을 수득하였다.
(조성물 (7)의 분석)
조성물 (1)의 분석에서와 동일한 방식으로, 지질 복합체의 평균 입자 직경(저장 전 평균 입자 직경)을 실시예 B-30 내지 실시예 B-33 및 비교예 B-5의 조성물에 대해 측정하였다. 조성물을 4℃에서 밀봉된 바이알 내에서 추가로 저장하고, 3개월 및 6개월 후에 지질 복합체의 평균 입자 직경(저장 후 평균 입자 직경)을 측정하였다. 표 7은 지질 복합체의 평균 입자 직경(Z-평균)의 변화를 나타낸다. 상기 표에서, 저장 후 평균 입자 직경(6개월 후)/저장 전 평균 입자 직경 x 100에 의해 평균 입자 직경의 변화(%)를 계산하였다.
조성물 양이온성 지질 저장 전 3개월 후 6개월 후 평균 입자 직경의 변화 (%)
평균 입자 직경 (nm) 분산 지수 평균 입자 직경 (nm) 분산 지수 평균 입자 직경 (nm) 분산 지수
실시예 B-30 1 87 0.11 88 0.09 91 0.12 105
실시예 B-31 2 78 0.09 80 0.12 85 0.14 109
실시예 B-32 3 77 0.10 79 0.12 83 0.12 108
실시예 B-33 4 86 0.11 85 0.11 87 0.08 101
비교예 B-5 ALN-319 84 0.11 102 0.10 117 0.09 139
실시예 B-30 내지 실시예 B-33의 조성물은 평균 입자 직경이 6개월의 저장 후에 거의 변화되지 않고 비교예 B-5의 조성물보다 물리적으로 더 안정한 것으로 입증되었다.
(조성물 (8)의 제조)
[실시예 B-34]
실시예 A-2의 양이온성 지질 2를 사용하여 조성물을 제조하였다. 핵산으로서, EPO mRNA를 사용하였다.
EPO mRNA를 80 μg/mL로 10 mM 시트르산나트륨(pH 4.0) 중에 용해시켜 희석된 mRNA 용액을 수득하였다. 양이온성 지질 2, DOPE(NOF Corporation사), 콜레스테롤(Nippon Fine Chemical Co., Ltd.사), MPEG2000-DMG(NOF Corporation사)를 60/5.0/33.5/1.5(몰비)의 비로 총 지질 농도가 2.25 mM로 설정되도록 에탄올 중에 용해시켜 지질 용액을 수득하였다. 희석된 mRNA 용액 및 지질 용액을 각각 3 mL/min 및 1 mL/min의 유속으로 공급하고 혼합하여 지질 복합체 수용액을 수득하였다. 수득된 지질 복합체 수용액을 투석막(상품명 "Float-A-Lyzer G2", SPECTRUM, Inc.사, 50K MWCO)을 사용하여 투석을 거쳐서 외부 용액을 인산염 완충액(PBS, pH 7.4)으로 대체하였다. 투석 후에, 농축 및 여과 멸균을 수행하였으며, 그럼으로써 실시예 B-34의 조성물을 수득하였다.
[실시예 B-35]
핵산으로서, 인자 VII siRNA 대신에 Luciferase siRNA를 사용하고, 양이온성 지질로서, 양이온성 지질 1 대신에 실시예 A-2의 양이온성 지질 2를 사용한 것을 제외하고는, 조성물 (1)의 제조에서와 동일한 방식으로 실시예 B-35의 조성물을 수득하였다. Luciferase siRNA는 염기 서열: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAT*T-3'(T: DNA, *= 포스포로티오에이트)(서열번호 3)을 갖는 센스 가닥 및 염기 서열: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGT*T-3'(T: DNA, *= 포스포로티오에이트)(서열번호 4)을 갖는 안티센스 가닥으로 이루어진 어닐링된 siRNA(GeneDesign Inc.사)였다.
(조성물 (8)의 분석)
조성물 (1)의 분석에서와 동일한 방식으로, 지질 복합체 내에의 mRNA 또는 siRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경을 실시예 B-34 및 실시예 B-35의 조성물에 대해 측정하였다. 표 8은 mRNA 또는 siRNA의 봉입률 및 지질 복합체의 평균 입자 직경(Z-평균)을 나타낸다.
조성물 핵산 봉입률(%) 평균 입자 직경(nm) 분산 지수
실시예 B-34 EPO mRNA 98 105 0.06
실시예 B-35 Luciferase siRNA 99 66 0.06
실시예 B-34 및 실시예 B-35의 조성물은 핵산의 높은 봉입률을 나타내는 것으로 확인된다. 이러한 결과는 실시예들의 조성물이 핵산의 유형에 관계 없이 핵산 전달에 사용될 수 있음을 나타낸다.
C. 시험예
[시험예 1]
실시예 B-1 내지 실시예 B-3 및 비교예 B-1의 조성물을, 지질 복합체 내에 봉입된 인자 VII siRNA 농도가 1 μg/mL 또는 5 μg/mL가 되도록 PBS로 희석시켰다. 조성물을 10 mL/kg의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 ICR 마우스(5주령, 암컷, 평균 체중: 25 g, n=3)에 투여하고, 투여 후 24시간째에 마취 하에서 혈액 및 간을 수집하였다. 원심분리에 의해 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 구매 가능한 키트(상품명 "BIOPHEN FVII", HYPHEN BioMed사)를 사용하여 혈장 중의 인자 VII 단백질 농도를 평가하였다. 음성 대조군으로서, PBS가 투여된 그룹에서 동일한 처리를 수행하였다.
PBS가 투여된 그룹의 인자 VII 단백질 농도를 100%로 설정하였을 때, 조성물이 투여된 그룹의 인자 VII 단백질 농도를 상대값으로서 계산하였다. 결과가 도 1 및 표 9에 나타나 있다.
siRNA 용량(mg/kg) 조성물 양이온성 지질 인자 VII 단백질 농도(상대값)
0.01 실시예 B-1 1 50%
실시예 B-2 2 46%
실시예 B-3 3 44%
비교예 B-1 ALN-319 63%
0.05 실시예 B-1 1 13%
실시예 B-2 2 12%
실시예 B-3 3 11%
비교예 B-1 ALN-319 21%
실시예 B-1 내지 실시예 B-3의 조성물이 비교예 B-1의 조성물보다 인자 VII 단백질 발현에 대해 더 높은 억제 효과를 갖는 것으로 확인된다. 이러한 결과는 실시예들의 조성물이 핵산을 세포질 내로 효과적으로 방출함을 나타낸다.
[시험예 2]
시험예 1에서와 동일한 방식으로, 실시예 B-4 및 비교예 B-1의 조성물을 ICR 마우스(5주령, 암컷, 평균 체중: 25 g, n=3)에 투여하고, 투여 후 24시간 째에 혈장 중의 인자 VII 단백질 농도의 상대값을 계산하였다. 결과가 도 2 및 표 10에 나타나 있다.
siRNA 용량(mg/kg) 조성물 양이온성 지질 인자 VII 단백질 농도(상대값)
0.01 실시예 B-4 4 68%
비교예 B-1 ALN-319 77%
0.05 실시예 B-4 4 18%
비교예 B-1 ALN-319 24%
실시예 B-4의 조성물이 비교예 B-1의 조성물보다 인자 VII 단백질 발현에 대해 더 높은 억제 효과를 갖는 것으로 확인된다. 이러한 결과는 실시예들의 조성물이 핵산을 세포질 내로 효과적으로 방출함을 나타낸다.
[시험예 3]
시험예 1에서와 동일한 방식으로, 실시예 B-5의 조성물을 ICR 마우스(5주령, 암컷, 평균 체중: 25 g, n=3)에 투여하고, 투여 후 24시간 째에 혈장 중의 인자 VII 단백질 농도의 상대값을 계산하였다. 결과가 표 11에 나타나 있다.
siRNA 용량(mg/kg) 조성물 양이온성 지질 인자 VII 단백질 농도(상대값)
0.01 실시예 B-5 5 77%
0.05 실시예 B-5 5 14%
실시예 B-5의 조성물이 인자 VII 단백질 발현에 대해 높은 억제 효과를 갖는 것으로 확인된다. 이러한 결과는 실시예들의 조성물이 핵산을 세포질 내로 효과적으로 방출함을 나타낸다.
[시험예 4]
실시예 B-11 및 비교예 B-3의 조성물을, 지질 복합체 내에 봉입된 hEPO mRNA 농도가 1 μg/mL 또는 3 μg/mL가 되도록 PBS로 희석시켰다. 조성물을 10 mL/kg의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 ICR 마우스(5주령, 암컷, 평균 체중: 25 g, n=3)에 투여하고, 투여 후 24시간째에 마취 하에서 혈액을 수집하였다. 원심분리에 의해 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 구매 가능한 키트(상품명 "Human Erythropoietin Quantikine IVD ELISA Kit", R&D Systems사)를 사용하여 혈장 중의 hEPO 단백질 농도를 평가하였다. 음성 대조군으로서, 투여가 없는 마우스의 그룹(무처리) 및 PBS가 투여된 마우스의 그룹에서 동일한 처리를 수행하였다. 결과가 표 12에 나타나 있다.
Figure 112018118131233-pct00100
실시예 B-11의 조성물이 비교예 B-3의 조성물보다 hEPO 단백질 발현의 더 높은 효과를 갖는 것으로 확인된다. 이러한 결과는 실시예들의 조성물이 핵산을 세포질 내로 효과적으로 방출함을 나타낸다.
[시험예 5]
실시예 B-14 내지 실시예 B-21의 조성물을, 지질 복합체 내에 봉입된 인자 VII siRNA 농도가 3 μg/mL 또는 30 μg/mL가 되도록 PBS로 희석시켰다. 조성물을 10 mL/kg의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 ICR 마우스(5주령, 암컷, 평균 체중: 25 g, n=3)에 투여하고, 투여 후 24시간째에 마취 하에서 혈액 및 간을 수집하였다. 원심분리에 의해 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 구매 가능한 키트(상품명 "BIOPHEN FVII", HYPHEN BioMed사)를 사용하여 혈장 중의 인자 VII 단백질 농도를 평가하였다. 음성 대조군으로서, PBS가 투여된 그룹에서 동일한 처리를 수행하였다.
PBS가 투여된 그룹의 인자 VII 단백질 농도를 100%로 설정하였을 때, 조성물이 투여된 그룹의 인자 VII 단백질 농도를 상대값으로서 계산하였다. 결과가 표 13에 나타나 있다.
siRNA 용량(mg/kg) 조성물 양이온성 지질 인자 VII 단백질 농도(상대값)
0.03 실시예 B-14 9 38%
실시예 B-15 10 69%
실시예 B-16 11 71%
실시예 B-17 12 52%
실시예 B-18 13 93%
실시예 B-19 14 88%
실시예 B-20 15 44%
실시예 B-21 2 45%
0.3 실시예 B-14 9 7%
실시예 B-15 10 15%
실시예 B-16 11 19%
실시예 B-17 12 3%
실시예 B-18 13 93%
실시예 B-19 14 57%
실시예 B-20 15 2%
실시예 B-21 2 2%
[시험예 6]
시험예 5에서와 동일한 방식으로, 실시예 B-22 내지 실시예 B-29의 조성물을 ICR 마우스(5주령, 암컷, 평균 체중: 25 g, n=3)에 투여하고, 투여 후 24시간 째에 혈장 중의 인자 VII 단백질 농도의 상대값을 계산하였다. 결과가 표 14에 나타나 있다.
siRNA 용량(mg/kg) 조성물 양이온성 지질 인자 VII 단백질 농도(상대값)
0.03 실시예 B-22 16 45%
실시예 B-23 17 51%
실시예 B-24 18 101%
실시예 B-25 19 53%
실시예 B-26 20 18%
실시예 B-27 21 62%
실시예 B-28 22 59%
실시예 B-29 2 20%
0.3 실시예 B-22 16 6%
실시예 B-23 17 4%
실시예 B-24 18 83%
실시예 B-25 19 4%
실시예 B-26 20 <1%
실시예 B-27 21 23%
실시예 B-28 22 <1%
실시예 B-29 2 1%
[시험예 7]
EPO mRNA를 봉입한 실시예 B-34의 조성물을, 지질 복합체 내에 봉입된 RNA 농도가 30 μg/mL가 되도록 PBS로 희석시켰다. 조성물을 10 mL/kg의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 BALB/c 마우스(암컷, n=4)에 투여하고, 투여 후 1일째 및 4일째에 마취 하에서 혈액을 수집하였다. 원심분리에 의해 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 구매 가능한 키트(상품명 "Human Erythropoietin Quantikine IVD ELISA Kit", R&D Systems사)를 사용하여 혈장 중의 hEPO 단백질 농도를 평가하였다. 망상적혈구의 수를 또한 측정하였다. 음성 대조군으로서, 투여가 없는 마우스의 그룹(무처리) 및 Luciferase siRNA를 봉입한 실시예 B-35의 조성물을 투여한 마우스의 그룹에서 동일한 처리를 수행하였다. 결과가 표 15에 나타나 있다.
투여된 샘플 조성물 핵산 용량(mg/kg) 투여 후 일수(들) hEPO 농도(pg/mL)
(평균 ± S.D.)		 망상적혈구의 수(109/L)
(평균 ± S.D.)
무처리 - - - 검출되지 않음 435 ± 57
Luc siRNA 실시예 B-35 0.30 1일 검출되지 않음 404 ± 74
EPO mRNA 실시예 B-34 0.30 1일 3175 ± 379 310 ± 25
Luc siRNA 실시예 B-35 0.30 4일 검출되지 않음 330 ± 101
EPO mRNA 실시예 B-34 0.30 4일 검출되지 않음 615 ± 60
무처리군 및 Luc siRNA 투여군에서는 hEPO가 검출되지 않은 반면, EPO mRNA 투여군에서는, 투여 후 1일째에 hEPO가 검출되었다. 생성된 EPO의 작용으로 인해, 망상적혈구의 수가 투여 후 4일째에 증가된 것으로 또한 확인되었다. 이러한 결과는 실시예들의 조성물이 핵산을 세포질 내로 효과적으로 방출함을 나타낸다.
상기 결과로부터, 본 발명의 양이온성 지질에 따르면, 핵산을 세포질 내로 효과적으로 방출하는 것이 가능하다. 게다가, 본 발명의 양이온성 지질에 따르면, 소정 기간에 걸친 저장 후 지질 복합체의 입자 직경의 증가를 억제하는 것이 가능하다.
본 발명에 따르면, 핵산을 세포질 내로 효과적으로 방출할 수 있는 양이온성 지질을 제공하는 것이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> EISAI R & D MANAGEMENT Co., Ltd. <120> Cationic lipid <130> G1579 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #1 sense <220> <221> misc_difference <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n stands for 2'- fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n stands for 2'- fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n stands for 2'- fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n stands for 2'- fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n stands for 2'- fluorocytidine <220> <221> misc_difference <222> (20)..(21) <223> DNA <220> <221> misc_binding <222> (20)..(21) <223> phosphorothioate binding <400> 1 ggannannnn aagnnnnant t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #1 antisense <220> <221> misc_difference <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n stands for 2'- fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n stands for 2'- fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n stands for 2'- fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n stands for 2'- fluorocytidine <220> <221> misc_difference <222> (20)..(21) <223> DNA <220> <221> misc_binding <222> (20)..(21) <223> phosphorothioate binding <400> 2 gnaagannng agangannnt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 sense <220> <221> misc_difference <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_difference <222> (20)..(21) <223> DNA <220> <221> misc_binding <222> (20)..(21) <223> phosphorothioate binding <400> 3 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 antisense <220> <221> misc_difference <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_difference <222> (20)..(21) <223> DNA <220> <221> misc_binding <222> (20)..(21) <223> phosphorothioate binding <400> 4 ucgaaguacu cagcguaagt t 21

Claims (15)

  1. 하기 화학식 (1a)로 나타낸 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure 112018118131233-pct00101

    (상기 식에서, L1 및 L2는 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 기를 나타내고; R1 및 R2는 독립적으로 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 또는 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기를 나타내고; X1은 단일 결합 또는 -CO-O-를 나타내고; 고리 P는 하기 화학식 (P-1) 내지 화학식 (P-5) 중 어느 하나를 나타내고:
    Figure 112018118131233-pct00102

    상기 식에서, R3은 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타냄).
  2. 제1항에 있어서, 화학식 (1)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure 112018118131233-pct00103

    (상기 식에서, L1 및 L2는 독립적으로 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 기를 나타내고; R1 및 R2는 독립적으로 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 또는 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기를 나타내고; X1은 단일 결합 또는 -CO-O-를 나타냄).
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A1) 내지 화학식 (A22)로 나타낸 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00104

    Figure 112020058531222-pct00105

    Figure 112020058531222-pct00106
  4. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A1)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00107
  5. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A2)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00108
  6. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A3)으로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00109
  7. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A4)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00110
  8. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A5)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00111
  9. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A9)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00112
  10. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A12)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00113
  11. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A15)로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00114
  12. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (A20)으로 나타낸, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    Figure 112020058531222-pct00115
  13. (I) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및
    (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질
    을 포함하는 지질 복합체.
  14. (I) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
    (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질; 및
    (III) 핵산
    을 포함하는 조성물.
  15. (I) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 (II) 중성 지질, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 지질 및 스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 함유하는 극성 유기 용매-함유 수용액을 (III) 핵산을 함유하는 수용액과 혼합하여 혼합 용액을 수득하는 단계; 및
    혼합 용액 중의 극성 유기 용매의 함량 백분율을 감소시키는 단계를 포함하는, 조성물의 생성 방법.
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