KR20170023004A - 양이온성 지질 - Google Patents

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신타로 호소에
도모유키 나오이
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교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 하기 식 (I)로 표시되는 양이온성 지질, 그리고 이 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물 등을 제공하는 것을 목적으로 한다:
Figure pct00047

식 중, R1 및 R2는 탄소수 8∼24의 알킬 등이고, R3은 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 하기 식 (A)
Figure pct00048

(식 중, R4 및 R5는 수소 원자 등이며, n3은 2∼6의 정수임), 또는 하기 식 (B)
Figure pct00049

(식 중, R6 및 R7은 수소 원자 등이며, n4는 1∼6의 정수임)이며,
n1은 0∼4의 정수이고, n2는 1∼4의 정수이다(단, n1이 0이며, n2가 1인 경우를 제외함).

Description

양이온성 지질{CATIONIC LIPID}
본 발명은, 핵산을, 예컨대, 세포 내 등에 도입하는 것을 용이하게 하는 양이온성 지질, 이 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등에 관한 것이다.
양이온성 지질은, 하나 또는 복수의 탄화수소기를 포함하는 지질 친화성 영역과, 적어도 하나의 플러스로 대전된 극성 헤드 그룹을 포함하는 친수성 영역을 갖는 양친매성 분자이다. 양이온성 지질과 핵산 등의 거대 분자가, 총 하전으로서 플러스로 대전된 복합체를 형성함으로써, 핵산 등의 거대 분자가 세포의 원형질막을 통과하여 세포질로 들어가기 쉬워지기 때문에, 양이온성 지질은 유용하다. 시험관 내 및 생체 내에서 행할 수 있는 이 프로세스는, 트랜스펙션으로서 알려져 있다.
특허문헌 1∼4는, 생체 내로 핵산을 세포 내에 송달하기 위해서, 및 질환의 치료에 적합한 핵산-지질 입자 조성물에 사용하기 위해서 유용한 양이온성 지질 및 상기 지질을 포함하는 지질 입자를 개시하고 있다. 특허문헌 1에는, 예컨대,
Figure pct00001
2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane; DLin-KC2-DMA) 등, 특허문헌 2에는, 예컨대,
Figure pct00002
(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate; DLin-MC3-DMA) 등, 특허문헌 3에는, 예컨대,
Figure pct00003
1-메틸-3,3-비스{[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]메틸}아제티딘(1-methyl-3,3-bis{[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-diene-1-yloxy]methyl}azetidine) 등, 특허문헌 4에는, 예컨대
Figure pct00004
2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 디[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐]카르바메이트(2-(1-methylpyrrolidin-2-yl)ethyl di[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienyl]carbamate) 등의 양이온성 지질이 개시되어 있다.
국제 공개 제2010/042877호 국제 공개 제2010/054401호 국제 공개 제2012/108397호 국제 공개 제2014/007398호
본 발명의 목적은, 예컨대, 세포 내 등에 핵산을 도입하는 것을 용이하게 하는 양이온성 지질, 이 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등을 제공하는 것에 있다.
본 발명은 이하의 (1)∼(35)에 관한 것이다.
(1) 하기 식 (I)로 표시되는 양이온성 지질.
Figure pct00005
[식 중, R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이하고, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 또는 C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬이며,
R3은 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 하기 식 (A)
Figure pct00006
(식 중, R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R4 및 R5가 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋고, n3은 2∼6의 정수임), 또는 하기 식 (B)
Figure pct00007
(식 중, R6 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R6 및 R7이 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋고, n4는 1∼6의 정수임)이며,
n1은 0∼4의 정수이고, n2는 1∼4의 정수이다(단, n1이 0이고, n2가 1인 경우를 제외함)]
(2) R1 및 R2가 동일하거나 또는 상이하고, 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 및 (Z)-도코사-13-에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 (1)에 기재된 양이온성 지질.
(3) R1 및 R2가 동일하거나 또는 상이하고, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 및 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 (1)에 기재된 양이온성 지질.
(4) R3이 탄소수 1∼3의 알킬 또는 식 (A)인 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(5) R1 및 R2가 동일한 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(6) n1이 1이고, n2가 1∼3의 정수인 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(7) n1 및 n2가 모두 1인 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(8) 하기 식 (I')로 표시되는 양이온성 지질.
Figure pct00008
[식 중, R1' 및 R2'는 동일하거나 또는 상이하고, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 또는 C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬, C7-C20 알케닐옥시 C1-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬이며,
R3은 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 하기 식 (A)
Figure pct00009
(식 중, R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R4 및 R5가 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋으며, n3은 2∼6의 정수임), 또는 하기 식 (B)
Figure pct00010
(식 중, R6 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R6 및 R7이 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋고, n4는 1∼6의 정수임)이고,
n1은 0∼4의 정수이며, n2는 1∼4의 정수이다(단, n1이 0이고, n2가 1인 경우를 제외함)]
(9) R1' 및 R2'가 동일하거나 또는 상이하고, 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 및 (Z)-도코사-13-에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 (8)에 기재된 양이온성 지질.
(10) R1' 및 R2'가 동일하거나 또는 상이하고, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 및 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 (8)에 기재된 양이온성 지질.
(11) R3이 탄소수 1∼3의 알킬 또는 식 (A)인 상기 (8)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(12) R1' 및 R2'가 동일한 상기 (8)∼(11) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(13) n1이 1이고, n2가 1∼3의 정수인 상기 (8)∼(12) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(14) n1 및 n2가 모두 1인 상기 (8)∼(12) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(15) 하기 식 (I'')로 표시되는 양이온성 지질.
Figure pct00011
[식 중, R1' 및 R2'는 동일하거나 또는 상이하고, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 또는 C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬, C7-C20 알케닐옥시 C1-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬이며,
R3'는 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 히드록시 C2-C4 알킬, C1-C3 디알킬아미노 C2-C4 알킬, 하기 식 (A)
Figure pct00012
(식 중, R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나 또는 R4 및 R5가 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋고, n3은 2∼6의 정수임), 또는 하기 식 (B)
Figure pct00013
(식 중, R6 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R6 및 R7이 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋으며, n4는 1∼6의 정수임)이고,
n1은 0∼4의 정수이며, n2는 1∼4의 정수이고(단, n1이 0이고, n2가 1인 경우를 제외함),
Z1은, 결합하는 탄소마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬이며,
Z2는, 결합하는 탄소마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬이다]
(16) R1' 및 R2'가 동일하거나 또는 상이하고, 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 및 (Z)-도코사-13-에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 (15)에 기재된 양이온성 지질.
(17) R1' 및 R2'가 동일하거나 또는 상이하고, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 및 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 (15)에 기재된 양이온성 지질.
(18) R3'가 탄소수 1∼3의 알킬 또는 식 (A)인 상기 (15)∼(17) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(19) R1' 및 R2'가 동일한 상기 (15)∼(18) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(20) n1이 1이고, n2가 1∼3의 정수인 상기 (15)∼(19) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(21) n1 및 n2가 모두 1인 상기 (15)∼(19) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질.
(22) 상기 (1)∼(21) 중 어느 하나에 기재된 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물.
(23) 상기 양이온성 지질과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있거나 또는 상기 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있는 상기 (22)에 기재된 조성물.
(24) 상기 양이온성 지질과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있거나 또는 상기 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있고, 상기 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 상기 (22)에 기재된 조성물.
(25) 핵산이 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산인 상기 (22)∼(24) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(26) 표적 유전자가 간장, 폐, 신장 또는 비장에서 발현되는 유전자인 상기 (25)에 기재된 조성물.
(27) 상기 (22)∼(26) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 이용하여 상기 핵산을 세포 내에 도입하는 방법.
(28) 세포가 포유동물의 간장, 폐, 신장 또는 비장에 있는 세포인 상기 (27)에 기재된 방법.
(29) 세포 내에 도입하는 방법이 상기 조성물의 정맥내 투여에 의해 세포 내에 도입하는 방법인 상기 (27) 또는 (28)에 기재된 방법.
(30) 상기 (26)에 기재된 조성물을 포유동물에게 투여하는 공정을 포함하는 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료 방법.
(31) 투여하는 방법이 정맥내 투여인 상기 (30)에 기재된 방법.
(32) 상기 (25)에 기재된 조성물을 포함하는 질환의 치료에 이용하기 위한 의약.
(33) 정맥내 투여용인 상기 (32)에 기재된 의약.
(34) 상기 (26)에 기재된 조성물을 포함하는 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제.
(35) 정맥내 투여용인 상기 (34)에 기재된 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제.
본 발명의 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물을, 포유동물 등에게 투여함으로써, 상기 핵산을, 예컨대 세포 내 등에 용이하게 도입할 수 있다.
도 1은 실시예 21 및 22에서 얻어진 제제(화합물 1, 2, 4∼7의 각각을 이용한 제제)를, 각각 마우스에게 siRNA 0.03 ㎎/㎏ 상당량 투여하고 나서 48시간 후의 혈장 중 Factor VII 단백의 농도를 나타낸다. 종축은 생리 식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 Factor VII 단백의 농도의 상대치를 나타낸다. 횡축은 화합물 번호를 나타낸다.
도 2는 실시예 22에서 얻어진 제제(화합물 2, 4의 각각을 이용한 제제)를, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 ㎎/㎏ 상당량 투여하고 나서 48시간 후의 혈장 중 Factor VII 단백의 농도를 나타낸다. 종축은 생리 식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 Factor VII 단백의 농도의 상대치를 나타낸다. 횡축은 화합물 번호를 나타낸다.
도 3은 실시예 23에서 얻어진 제제(화합물 1을 이용한 제제) 및 비교예 1에서 얻어진 제제(화합물 A를 이용한 제제)를, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 ㎎/㎏과 0.03 ㎎/㎏ 상당량 투여하고 나서 48시간 후의 혈장 중 Factor VII 단백의 농도를 나타낸다. 종축은 생리 식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 Factor VII 단백의 농도의 상대치를 나타낸다. 횡축은 화합물 번호를 나타낸다.
본 발명의 양이온성 지질은,
하기 식 (I)
Figure pct00014
[식 중, R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이하고, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 또는 C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬이며,
R3은 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 하기 식 (A)
Figure pct00015
(식 중, R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 혹은 R4 및 R5가 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋고, n3은 2∼6의 정수임), 또는 하기 식 (B)
Figure pct00016
(식 중, R6 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 혹은 R6 및 R7이 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋으며, n4는 1∼6의 정수임)이고,
n1은 0∼4의 정수이며, n2는 1∼4의 정수이다(단, n1이 0이고, n2가 1인 경우를 제외함)]로 표시되는 양이온성 지질이거나, 또는
하기 식 (I')
Figure pct00017
[식 중, R1' 및 R2'는 동일하거나 또는 상이하고, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 또는 C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬, C7-C20 알케닐옥시 C1-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬이며,
R3은 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 하기 식 (A)
Figure pct00018
(식 중, R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R4 및 R5가 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋으며, n3은 2∼6의 정수임), 또는 하기 식 (B)
Figure pct00019
(식 중, R6 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R6 및 R7이 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋으며, n4는 1∼6의 정수임)이고,
n1은 0∼4의 정수이며, n2는 1∼4의 정수이다(단, n1이 0이고, n2가 1인 경우를 제외함)]로 표시되는 양이온성 지질이거나, 또는
하기 식 (I'')
Figure pct00020
[식 중, R1' 및 R2'는 동일하거나 또는 상이하고, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 또는 C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬, C7-C20 알케닐옥시 C1-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬이며,
R3'는 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 히드록시 C2-C4 알킬, C1-C3 디알킬아미노 C2-C4 알킬, 하기 식 (A)
Figure pct00021
(식 중, R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R4 및 R5가 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋으며, n3은 2∼6의 정수임), 또는 하기 식 (B)
Figure pct00022
(식 중, R6 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R6 및 R7이 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋으며, n4는 1∼6의 정수임)이고,
n1은 0∼4의 정수이며, n2는 1∼4의 정수이고(단, n1이 0이고, n2가 1인 경우를 제외함),
Z1은, 결합하는 탄소마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬이며,
Z2는, 결합하는 탄소마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬이다]로 표시되는 양이온성 지질이다.
이하, 식 (I)로 표시되는 화합물을 화합물 (I), 식 (I')로 표시되는 화합물을 화합물 (I'), 식 (I'')로 표시되는 화합물을 화합물 (I'')라고 하는 경우도 있다. 다른 식번호의 화합물에 대해서도 동일하다.
탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬로는, 예컨대 옥틸, 데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 2,6,10-트리메틸운데실, 펜타데실, 3,7,11-트리메틸도데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 6,10,14-트리메틸펜타데칸-2-일, 노나데실, 2,6,10,14-테트라메틸펜타데실, 이코실, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데실, 헤니코실, 도코실, 트리코실, 테트라코실 등을 들 수 있고, 바람직하게는 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, 이코실 등을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 테트라데실, 헥사데실을 들 수 있다.
탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알케닐로는, 1 이상의 이중 결합을 포함하는 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알케닐이면 좋고, 예컨대 (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데카-2-에닐, (Z)-도코사-13-에닐 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, (Z)-도코사-13-에닐 등을 들 수 있다.
탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알키닐로는, 1 이상의 삼중 결합을 포함하는 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알키닐이면 좋고, 예컨대 도데카-11-이닐, 테트라데카-6-이닐, 헥사데카-7-이닐, 헥사데카-5,7-디이닐, 옥타데카-9-이닐 등을 들 수 있다.
C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬에 있어서의 C7-C20 알킬 부분으로는, 예컨대 헵틸, 옥틸, 데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 2,6,10-트리메틸운데실, 펜타데실, 3,7,11-트리메틸도데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 6,10,14-트리메틸펜타데칸-2-일, 노나데실, 2,6,10,14-테트라메틸펜타데실, 이코실, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데실 등을 들 수 있고, C1-C3 알킬 부분으로는 메틸, 에틸, 프로필 등에 대응하는 알킬렌을 들 수 있다.
C7-C20 알케닐옥시 C1-C3 알킬에 있어서의 C7-C20 알케닐 부분으로는, 예컨대 (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데카-2-에닐 등을 들 수 있고, 바람직하게는 (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 등을 들 수 있으며, C1-C3 알킬 부분으로는 메틸, 에틸, 프로필 등에 대응하는 알킬렌을 들 수 있다.
C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬에 있어서의 C7-C20 알키닐 부분으로는, 예컨대 도데카-11-이닐, 테트라데카-6-이닐, 헥사데카-7-이닐, 헥사데카-5,7-디이닐, 옥타데카-9-이닐 등을 들 수 있고, C1-C3 알킬 부분으로는 메틸, 에틸, 프로필 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서는, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알케닐의 이중 결합에 메틸렌 2가 라디칼이 형식적으로 부가된 시클로프로판 고리를 갖는 기도, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알케닐에 포함된다. 또한, C7-C20 알케닐옥시 C1-C3 알킬에 있어서의 C7-C20 알케닐 부분에 대해서도 동일하다. 예컨대, (Z)-헥사데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에닐에 대응하는 이하의 시클로프로판 고리를 갖는 기
Figure pct00023
Figure pct00024
및
Figure pct00025
등을 들 수 있다.
탄소수 1∼3의 알킬로는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 시클로프로필 등을 들 수 있다.
히드록시 C2-C4 알킬에 있어서의 C2-C4 알킬 부분으로는, 에틸, 프로필, 부틸 등에 대응하는 알킬렌을 들 수 있다.
C1-C3 디알킬아미노 C2-C4 알킬에 있어서의 C1-C3 알킬 부분으로는, 메틸, 에틸, 프로필 등을 들 수 있고, 이들은 동일하여도 좋고 상이하여도 좋다. 또한 C1-C3 디알킬아미노 C2-C4 알킬에 있어서의 C2-C4 알킬 부분으로는, 에틸, 프로필, 부틸 등에 대응하는 알킬렌을 들 수 있다.
탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환으로는, 아지리딘 고리, 아제티딘 고리, 피롤리딘 고리, 피페리딘 고리, 피페라진 고리, 아제판 고리 등을 들 수 있다.
또한, R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이하게 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬 혹은 알케닐, 또는 C7-20 알킬옥시 C1-C3 알킬인 것이 보다 바람직하고, 동일하거나 또는 상이하게 직쇄형의 탄소수 8∼24의 알케닐인 것이 더욱 바람직하다. 또한, R1 및 R2는 동일한 것이 보다 바람직하고, 그 경우에는, 탄소수 12∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐인 것이 보다 바람직하며, 탄소수 12∼24의 직쇄형의 알케닐인 것이 더욱 바람직하다. 또한 R1' 및 R2'는 동일하거나 또는 상이하게 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬 혹은 알케닐, 또는 C7-20 알킬옥시 C1-C3 알킬 혹은 C7-C20 알케닐옥시 C1-C3 알킬인 것이 보다 바람직하고, 동일하거나 또는 상이하게 직쇄형의 탄소수 8∼24의 알케닐인 것이 더욱 바람직하다. 또한, R1' 및 R2'는 동일한 것이 보다 바람직하고, 그 경우에는, 탄소수 12∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐인 것이 보다 바람직하며, 탄소수 12∼24의 직쇄형의 알케닐인 것이 더욱 바람직하다.
R1 및 R2 및 R1' 및 R2'가 상이한 경우에는, R1 및 R1'가 탄소수 16∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고, R2 및 R2'가 탄소수 8∼12의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐인 것도 본 발명의 바람직한 형태 중 하나이다. 이 경우, R1 및 R1'가 탄소수 16∼24의 직쇄형의 알케닐이고, R2 및 R2'가 탄소수 8∼12의 직쇄형의 알킬인 것이 보다 바람직하며, R1 및 R1'가 (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐이고, R2 및 R2'가 옥틸, 데실 또는 도데실인 것이 가장 바람직하다.
R1 및 R2 그리고 R1' 및 R2'가 동일하거나 또는 상이하게 탄소수 8∼24의 직쇄형 혹은 분지형의 알킬 혹은 알케닐인 경우에는, 동일하거나 또는 상이하게 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, 이코실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 또는 (Z)-도코사-13-에닐인 것이 바람직하고, 동일하거나 또는 상이하게 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 또는 (Z)-도코사-13-에닐인 것이 보다 바람직하다.
R3 및 R3'는 탄소수 1∼3의 알킬, 또는 상기 식 (A)인 것이 바람직하고, 메틸, 에틸, 프로필 또는 시클로프로필인 것이 보다 바람직하며, 메틸 또는 에틸인 것이 더욱 바람직하고, 메틸인 것이 가장 바람직하다. 그리고 R3이 식 (A)인 경우, R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자, 또는 탄소수 1∼3의 알킬인 것이 바람직하며, R3이 식 (B)인 경우, R6 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자, 혹은 탄소수 1∼3의 알킬인 것이 바람직하다.
R4와 R5가 결합하는 질소 원자와 함께 형성하는, 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환으로서, 바람직하게는 아제티딘 고리, 피롤리딘 고리, 피페리딘 고리, 아제판 고리를 들 수 있다.
또한, R4가 R5와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하지 않는 경우에는, R5는 메틸 또는 에틸인 것이 바람직하고, 메틸인 것이 보다 바람직하며, R4와 R5가 각각 메틸인 것이 가장 바람직하다. 또한, R4가 R5와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하는 경우에는, 피롤리딘 고리 또는 피페리딘 고리를 형성하는 것이 바람직하다.
n3은 2∼4의 정수인 것이 바람직하고, 3인 것이 보다 바람직하다.
상기 식 (B) 중의 R6이 R7과 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하지 않는 경우에는, R7은 메틸 또는 에틸인 것이 바람직하고, 메틸인 것이 보다 바람직하며, R6과 R7이 각각 메틸인 것이 가장 바람직하다. 또한, R6이 R7과 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하는 경우에는, 피롤리딘 고리 또는 피페리딘 고리를 형성하는 것이 바람직하다.
n4는 2∼4의 정수인 것이 바람직하고, 3인 것이 보다 바람직하다.
n1은 1인 것이 바람직하다. 이 경우, n2는 1∼3의 정수인 것이 바람직하고, 1인 것이 보다 바람직하다.
Z1은, 결합하는 탄소마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬인 것이 바람직하고, 수소 원자 또는 메틸인 것이 보다 바람직하며, 수소 원자인 것이 더욱 바람직하다. 여기서, 용어 「결합하는 탄소마다 각각 독립적으로」란, 식 (I'')에 2개 이상의 Z1이 존재하는 경우에 있어서, Z1이 결합하는 탄소 원자마다, 각각의 Z1이 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬을 선택할 수 있는 것을 의미한다. 예컨대, 식 (I'') 중에 Z1이 2개 존재하는 경우, 각각의 Z1이 동일한 치환기를 선택할 수 있는 것을 의미할 뿐만 아니라, 한쪽의 Z1이 수소 원자이고, 다른 쪽의 Z1이 탄소수 1∼3의 알킬인 경우도 포함하는 것을 의미한다.
Z2는, 결합하는 탄소마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬인 것이 바람직하고, 수소 원자 또는 메틸인 것이 보다 바람직하며, 수소 원자인 것이 더욱 바람직하다. 여기서, 용어 「결합하는 탄소마다 각각 독립적으로」란, 식 (I'')에 2개 이상의 Z2가 존재하는 경우에 있어서, Z2가 결합하는 탄소 원자마다, 각각의 Z2가 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬을 선택할 수 있는 것을 의미한다. 예컨대, 식 (I'') 중에 Z2가 2개 존재하는 경우, 각각의 Z2이 동일한 치환기를 선택할 수 있는 것을 의미할 뿐만 아니라, 한쪽의 Z2가 수소 원자이고, 다른 쪽의 Z2가 탄소수 1∼3의 알킬인 경우도 포함하는 것을 의미한다.
또한 n1과 n2가 모두 1일 때, Z1과 Z2가 각각 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 메틸인 것이 바람직하고, Z1이 수소 원자 또는 메틸이며, Z2가 수소 원자인 것이 보다 바람직하고, Z1과 Z2가 동일하게 수소 원자인 것이 가장 바람직하다.
다음에 본 발명의 양이온성 지질의 제조법에 대해서 설명한다. 또한, 이하에 나타내는 제조법에 있어서, 정의한 기가 상기 제조법의 조건 하에서 변화되거나 또는 상기 제조법을 실시하는 데 부적절한 경우, 유기 합성 화학에서 상용되는 보호기의 도입 및 제거 방법[예컨대, 프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스 제3판(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition), 그린(T. W. Greene) 지음, John Wiley & Sons Inc.(1999년) 등에 기재된 방법] 등을 이용함으로써, 목적 화합물을 제조할 수 있다. 또한, 필요에 따라 치환기 도입 등의 반응 공정의 순서를 바꿀 수도 있다.
제조법 1
화합물 (I) 중, n1 및 n2가 모두 1이고, R3이 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬인 화합물 (Ia)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I') 중, n1 및 n2가 모두 1이고, R3이 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I'') 중, n1 및 n2가 모두 1이고, Z1 및 Z2가 모두 수소 원자이며, R3'가 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 히드록시 C2-C4 알킬 또는 C1-C3 디알킬아미노 C2-C4 알킬인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다.
Figure pct00026
(식 중, R1 및 R2는 각각 상기와 동일하고, R3a는 수소 원자 또는 상기 R3이 탄소수 1∼3의 알킬인 경우와 동일한 탄소수 1∼3의 알킬이며, X1, X2 및 X3은 동일하거나 또는 상이하고, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자, 트리플루오로메탄술포닐옥시, 메탄술포닐옥시, 벤젠술포닐옥시, p-톨루엔술포닐옥시 등의 이탈기를 나타낸다)
공정 1 및 2
화합물 (IIa)는, 말론산디메틸과 화합물 (IIIa)를, 무용매로 또는 용매 중, 1∼10 당량의 염기의 존재 하, 실온과 200℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (IIb)는, 화합물 (IIa)와 화합물 (IIIb)를, 무용매로 또는 용매 중, 1∼10 당량의 염기의 존재 하, 실온과 200℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 아세트산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 피리딘 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다.
염기로는, 예컨대 탄산칼륨, 탄산세슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 수소화나트륨, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(DBU) 등을 들 수 있다.
화합물 (IIIa) 및 화합물 (IIIb)는, 시판품으로서 또는 공지된 방법(예컨대, 「제5판 실험화학강좌 13 유기화합물의 합성 I」, 제5판, p.374, 마루젠(2005년)) 혹은 그것에 준한 방법, 또는 후술하는 제조법에 의해 얻을 수 있다.
R1과 R2가 동일한 경우의 화합물 (IIb)는, 공정 1에 있어서, 2 당량 이상의 화합물 (IIIa)을 이용함으로써 얻을 수 있다.
말론산디메틸은 시판품으로서 얻을 수 있다.
공정 3
화합물 (IIc)는 화합물 (IIb)를 4 당량∼대과잉량의 하이드라이드 환원제와, 필요에 따라 촉매량∼10 당량의 첨가제의 존재 하, 용매 중, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼72시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 여기서, 촉매량이란 0.01 당량∼0.5 당량인 것을 나타낸다.
하이드라이드 환원제로는, 예컨대 수소화알루미늄리튬, 수소화붕소리튬, 수소화트리에틸붕소리튬, 수소화디이소부틸알루미늄, 수소화비스(2-메톡시에톡시)알루미늄나트륨 등을 들 수 있다.
용매로는, 예컨대 톨루엔, 디클로로메탄, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 1,4-디옥산 등을 들 수 이고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다.
첨가제로는, 염화알루미늄, 염화세륨, 사염화티탄, 티타늄테트라이소프로폭시드 등을 이용할 수 있다.
공정 4
화합물 (IId)는 화합물 (IIc)를 2 당량 이상의 할로겐화 시약 또는 의(擬)할로겐화 시약과, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기 및 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 첨가제의 존재 하, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
할로겐화 시약 또는 의할로겐화 시약으로는, 예컨대 염화티오닐, 염화술푸릴, 삼염화인, 오염화인, 옥시염화인, 삼브롬화인, 브롬화수소, 요오드화수소, 무수메실산, 메실산클로라이드, 무수토실산, 벤젠술폰산클로라이드, 무수벤젠술폰산, 토실산클로라이드, 무수트리플루오로메탄술폰산 등을 들 수 있다.
용매로는, 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로는, 예컨대 피리딘, 2,6-루티딘, 2,4,6-코리딘, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 등을 들 수 있다.
첨가제로는, 예컨대 염화나트륨, 브롬화나트륨, 브롬화리튬, 염화리튬 등을 들 수 있다.
공정 5
화합물 (Ia)는, 화합물 (IId)와 1 당량∼대과잉량의 화합물 (IVa)를, 무용매로 또는 용매 중, 실온과 200℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로는, 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물 (IVa)는, 시판품으로서 얻을 수 있다.
제조법 2
화합물 (I) 중, n1 및 n2가 모두 1이고, R3이 식 (A)인 화합물 (Ic)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I') 중, n1 및 n2가 모두 1이고, R3이 식 (A)인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I'') 중, n1 및 n2가 모두 1이고, Z1 및 Z2가 모두 수소 원자이며, R3'가 식 (A)인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다.
Figure pct00027
(식 중, R1, R2, R4, R5 및 n3은 각각 상기와 동일하고, Ar은 p-니트로페닐, o-니트로페닐, p-클로로페닐 등의 치환 페닐기 또는 무치환 페닐기를 나타낸다)
공정 6
화합물 (VII)은, 화합물 (V)와 화합물 (VI)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 첨가제의 존재 하, 및/또는 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기의 존재 하, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼72시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로는, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 아세트산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 1,4-디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 디메틸술폭시드 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다.
첨가제로는, 예컨대 1-히드록시벤조트리아졸, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있다.
염기로는, 예컨대 탄산칼륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(DBU) 등을 들 수 있다.
화합물 (V)는, 시판품으로서 얻을 수 있다.
화합물 (VI)은, 시판품으로서 또는 공지된 방법(예컨대, 「제5판 실험화학강좌 14 유기화합물의 합성 II」, 제5판, p.1, 마루젠(2005년)) 혹은 그것에 준한 방법에 의해 얻을 수 있다.
공정 7
화합물 (Ic)는, 화합물 (Ib)와 화합물 (VII)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라 1∼10 당량의 첨가제의 존재 하, 및/또는 필요에 따라 1∼10 당량의 염기의 존재 하, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼72시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
화합물 (Ib)는 제조법 1의 공정 5에서 화합물 (IVa)로서 암모니아를 이용하거나 또는 제조법 7에 의해 제조할 수 있다.
용매, 첨가제 및 염기로는, 각각 공정 6에서 예시한 것을 들 수 있다.
제조법 3
화합물 (I) 중, n1 및 n2가 모두 1이고, R3이 식 (B)인 화합물 (Id)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I') 중, n1 및 n2가 모두 1이고, R3이 식 (B)인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I'') 중, n1 및 n2가 모두 1이고, Z1 및 Z2가 모두 수소 원자이며, R3'가 식 (B)인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다.
Figure pct00028
(식 중, R1, R2, R6, R7 및 n4는 각각 상기와 동하다)
공정 8
화합물 (IIe)는, 화합물 (Ib)를, 화합물 (VIII)과, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기의 존재 하, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼72시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로는, 공정 6에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로는, 공정 4에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물 (VIII)은, 시판품으로서 얻을 수 있다.
공정 9
화합물 (Id)는, 화합물 (IIe)와 1∼20 당량의 화합물 (VIb)를, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라 1∼10 당량의 염기의 존재 하, 실온과 200℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
화합물 (VIb)는, 시판품으로서 얻을 수 있다.
용매로는, 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로는, 공정 6에서 예시한 것을 들 수 있다.
제조법 4
화합물 (IIIa) 및 화합물 (IIIb) 중, R1 및/또는 R2가 C7-C20 알킬옥시 C2-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C2-C3 알킬인 화합물 (IIId)는, 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I') 및 화합물 (I'') 중, R1' 및/또는 R2'가 C7-C20 알킬옥시 C2-C3 알킬, C7-C20 알케닐옥시 C2-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C2-C3 알킬인 화합물을 제조할 때에 이용하는 화합물 (IIId)에 상당하는 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다.
Figure pct00029
(식 중, X4 및 X5는 상기 X1과 동일하고, R9는 상기 C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬에 있어서의 C7-C20 알킬 부분과 동일한 탄소수 7∼20의 알킬, 상기 C7-C20 알케닐옥시 C1-C3 알킬에 있어서의 C7-C20 알케닐 부분과 동일한 탄소수 7∼20의 알케닐, 혹은 상기 C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬에 있어서의 C7-C20 알키닐 부분과 동일한 탄소수 7∼20의 알키닐이며, Y는 에틸렌 또는 프로필렌을 나타낸다)
공정 10
화합물 (X)은, 화합물 (IIIc)와 화합물 (IX)를, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라 1∼10 당량의 염기의 존재 하, 실온과 200℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매 및 염기로는, 각각 공정 6에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물 (IIIc)는, 시판품으로서 또는 공지된 방법(예컨대, 「제5판 실험화학강좌 14 유기화합물의 합성 II」, 제5판, p.1, 마루젠(2005년)) 혹은 그것에 준한 방법에 의해 얻을 수 있다.
화합물 (IX)는, 시판품으로서 얻을 수 있다.
공정 11
화합물 (IIId)는, 화합물 (X)을, 할로겐화 시약 또는 의할로겐화 시약과, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기 및 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 첨가제의 존재 하, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매 및 염기로는, 각각 공정 6에서 예시한 것을 들 수 있다.
할로겐화 시약 또는 의할로겐화 시약으로는, 공정 4에서 예시한 것을 들 수 있다.
첨가제로는, 공정 4에서 예시한 것을 들 수 있다.
제조법 5
화합물 (I) 중, n1이 1이고, R3이 탄소수 1∼3의 알킬인 화합물 (Ie)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I') 중, n1이 1이고, R3이 탄소수 1∼3의 알킬인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I'') 중, n1이 1이고, Z1 및 Z2가 모두 수소 원자이며, R3'가 탄소수 1∼3의 알킬인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다.
Figure pct00030
(식 중, R1, R2, n2, X1 및 X2는 각각 상기와 동일하고, X6은 상기 X1과 동일하며, R10은 상기 R3이 탄소수 1∼3의 알킬인 경우와 동일한 탄소수 1∼3의 알킬을 나타낸다)
공정 12
화합물 (XIb)는 화합물 (XIa)와 화합물 (IIIe)를, 무용매로 또는 용매 중, 1∼10 당량의 염기의 존재 하, 실온과 200℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매 및 염기로는, 각각 공정 1 및 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물 (XIa) 및 화합물 (IIIe)는 각각 시판품으로서 얻을 수 있다.
공정 13 및 공정 14
화합물 (XIc)는, 화합물 (XIb)와 화합물 (IIIa)를, 무용매로 또는 용매 중, 1∼10 당량의 염기의 존재 하, 실온과 200℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (XId)는, 화합물 (XIc)와 화합물 (IIIb)를, 무용매로 또는 용매 중, 1∼10 당량의 염기의 존재 하, 실온과 200℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로는, 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로는, 리튬디이소프로필아미드, 헥사메틸디실라잔리튬, 헥사메틸디실라잔나트륨, n-부틸리튬 등을 들 수 있다.
R1과 R2가 동일한 경우의 화합물 (XId)는, 공정 13에 있어서, 2 당량 이상의 화합물 (IIIa)를 이용함으로써 얻을 수 있다.
공정 15
화합물 (Ie)는 화합물 (XId)를 4∼100 당량의 하이드라이드 환원제와, 필요에 따라 촉매량∼10 당량의 첨가제의 존재 하, 용매 중, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼72시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 여기서, 촉매량은, 상기와 동일하다.
하이드라이드 환원제, 첨가제 및 용매로는 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
제조법 6
화합물 (I) 중, n1 및 n2가 동일하거나 또는 상이하게 1∼4의 정수이며(단, n1이 1이고, n2가 1인 경우를 제외함), R3이 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬인 화합물 (If)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I') 중, n1 및 n2가 동일하거나 또는 상이하게 1∼4의 정수이며(단, n1이 1이고, n2가 1인 경우를 제외함), R3이 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I'') 중, n1 및 n2가 동일하거나 또는 상이하게 1∼4의 정수이며(단, n1이 1이고, n2가 1인 경우를 제외함), Z1 및 Z2가 모두 수소 원자이고, R3'가 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 히드록시 C2-C4 알킬 또는 C1-C3 디알킬아미노 C2-C4 알킬인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다.
Figure pct00031
[식 중, R1, R2, R3a, X1, X2 및 X3은 각각 상기와 동일하고, m1 및 m2는 동일하거나 또는 상이하게 1∼4의 정수이며(단, m1이 1이고, m2가 1인 경우를 제외함), P1 및 P2는 동일하거나 또는 상이하게 보호기를 나타낸다]
공정 16 및 공정 17
화합물 (XIIb)는, 말론산디메틸 대신에 화합물 (XIIa)를 이용하고, 공정 1과 동일한 방법에 의해 얻어진다. 화합물 (XIIc)는, 화합물 (IIa) 대신에 화합물 (XIIb)를 이용하고, 공정 2와 동일한 방법에 의해 얻어진다. R1과 R2가 동일한 경우의 (XIIc)에 대해서는 공정 16에 있어서 2 등량 이상의 화합물 (IIIa)를 이용함으로써 얻어진다. 여기서, P1 및 P2로서는 유기 합성 화학에서 상용되는 보호기[예컨대, 프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스 제3판(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition), 그린(T. W. Greene) 지음, John Wiley & Sons Inc.(1999년) 등에 기재된 보호기]를 이용할 수 있다. 또한, 화합물 (XIIa)는 공지된 방법[예컨대, 「신실험화학강좌 14 유기화합물의 합성과 반응(II)」, 초판, p.751, 마루젠(1977년)] 혹은 그것에 준한 방법에 의해 얻어진다.
공정 18
화합물 (XIId)는, 화합물 (XIIc)를 공지된 방법[예컨대, 「신실험화학강좌 15 산화와 환원(II)」, 초판, 마루젠(1977년)] 혹은 그것에 준한 방법에 의해 환원함으로써 얻어진다.
공정 19
화합물 (XIIe)는, 화합물 (XIId)의 보호기 P1 및 P2를 각각 적절한 방법으로 제거함으로써 얻어진다. 보호기의 제거 방법으로는, 유기 합성 화학에서 상용되는 보호기의 제거 방법[예컨대, 프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스 제3판(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition), 그린(T. W. Greene) 지음, John Wiley & Sons Inc.(1999년) 등에 기재된 제거 방법]을 이용할 수 있고, 이에 따라 목적으로 하는 화합물을 제조할 수 있다.
공정 20
화합물 (XIIf)는, 화합물 (IIc) 대신에 화합물 (XIIe)를 이용하고, 공정 4와 동일한 방법에 의해 얻어진다.
공정 21
화합물 (If)는, 화합물 (IId) 대신에 화합물 (XIIf)를 이용하고, 공정 5와 동일한 방법에 의해 얻어진다.
제조법 7
화합물 (I) 중, n1 및 n2가 1이고, R3이 수소 원자인 화합물 (Ib)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I') 중, n1 및 n2가 1이고, R3이 수소 원자인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I'') 중, n1 및 n2가 1이고, Z1 및 Z2가 모두 수소 원자이며, R3'가 수소 원자인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다.
Figure pct00032
(식 중, R1, R2, X1, X2 및 X3은 각각 상기와 동일한 이미이고, P3은 tert-부톡시카르보닐, o-니트로벤젠술포닐 또는 p-메틸벤젠술포닐 등의 보호기를 나타낸다)
공정 22 및 23
화합물 (XIIIa)는, 시아노아세트산에틸과 화합물 (IIIa)를, 공정 1과 동일한 조건으로 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (XIIIb)는, 화합물 (XIIIa)와 화합물 (IIIb)를, 공정 2와 동일한 조건으로 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
R1과 R2가 동일한 경우의 화합물 (XIIIb)는, 공정 22에 있어서, 2 당량 이상의 화합물 (IIIa)를 이용함으로써 얻을 수 있다.
시아노아세트산에틸은 시판품으로서 얻을 수 있다.
화합물 (IIIa) 및 화합물 (IIIb)는, 제조법 1에 기재된 것과 동일하다.
공정 24
화합물 (XIIIc)는 화합물 (XIIIb)를 공정 3과 동일한 조건으로 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
공정 25
화합물 (XIIId)는 화합물 (XIIIc)를, 1∼10 당량의 탄산디 tert-부톡시카르보닐, o-니트로벤젠술포닐클로라이드 또는 p-메틸벤젠술포닐클로라이드 등과, 용매중, 1∼10 당량의 염기의 존재 하, 0℃와 200℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로는, 공정 6에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로는, 공정 4에서 예시한 것을 들 수 있다.
공정 26
화합물 (XIIIe)는 화합물 (XIIId)를 1 당량 이상의 할로겐화 시약 또는 의할로겐화 시약과, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기의 존재 하, -0℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼100시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
할로겐화 시약 또는 의할로겐화 시약으로는, 공정 4에서 예시한 것을 들 수 있다.
용매로는, 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로는, 공정 4에서 예시한 것을 들 수 있다.
공정 27
화합물 (XIIIf)는 화합물 (XIIIe)를 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 염기의 존재 하, 0℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼72시간 동안 분자 내에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
염기로는, 예컨대 탄산칼륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(DBU), 리튬디이소프로필아미드, 헥사메틸디실라잔리튬, 헥사메틸디실라잔나트륨, n-부틸리튬 등을 들 수 있다.
용매로는, 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
공정 28
화합물 (Ib)는 화합물 (XIIIf)의 보호기 P3을 적절한 방법으로 제거함으로써 얻어진다. 보호기의 제거 방법으로는, 유기 합성 화학에서 상용되는 보호기의 제거 방법[예컨대, 프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스 제3판(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition), 그린(T. W. Greene) 지음, John Wiley & Sons Inc.(1999년) 등에 기재된 제거 방법]을 이용할 수 있고, 이에 따라 목적으로 하는 화합물을 제조할 수 있다.
제조법 8
화합물 (I) 중, n1 및 n2가 1이고, R3이 탄소수 1-3의 알킬인 (Ig)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I') 중, n1 및 n2가 1이고, R3이 탄소수 1-3의 알킬인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I'') 중, n1 및 n2가 1이고, Z1 및 Z2가 모두 수소 원자이며, R3'가 탄소수 1-3의 알킬인 화합물도 이하의 방법에 의해 마찬가지로 제조할 수 있다.
Figure pct00033
[식 중, R1, R2는 각각 상기와 동일하고, R11은 수소 원자, 메틸 또는 에틸이며, R12는 수소 원자 또는 메틸이거나, 또는 R11과 R12는 인접하는 탄소와 함께 시클로프로필 고리를 형성한다(단, R11이 수소 원자 또는 에틸일 때, R12는 메틸이 아님)]
공정 29
화합물 (Ig)는, 화합물 (Ib)를 바람직하게는 1∼10 당량의 화합물 (XIX)와, 용매 중, 바람직하게는 1 당량∼대과잉량의 환원제 및 필요에 따라 바람직하게는 1∼10 당량의 산의 존재 하, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼72시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 아세트산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 물 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
환원제로는, 예컨대 트리아세톡시수소화붕소나트륨, 시안화수소화붕소나트륨 등을 들 수 있다.
산으로는, 예컨대 염산, 아세트산 등을 들 수 있다.
화합물 (XIX)는, 시판품으로서 얻을 수 있다.
제조법 9
화합물 (I'') 중, n1 및 n2가 1이고, R3'가 수소이며, Z1이 탄소수 1∼3의 알킬이고, Z2가 수소 원자인 화합물 (I''b)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다.
Figure pct00034
(식 중, R1', R2', X3 및 P3은 각각 상기와 동일하고, Z1a는 상기 Z1이 탄소수 1∼3의 알킬인 경우와 동일한 탄소수 1∼3의 알킬이며, M은 리튬, 마그네슘브로마이드, 마그네슘클로라이드 등을 나타낸다.)
공정 30
화합물 (XIIIh)는 화합물 (XIIIg)를 용매 중, 1∼10 당량의 산화제와 0℃와 150℃ 사이의 온도에서 5분간∼72시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
산화제로는, 예컨대 데스마틴 시약, 클로로크롬산피리디늄, 이크롬산피리디늄, 과루테늄산테트라프로필암모늄 등을 들 수 있다.
용매로는, 공정 6에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물 (XIIIg)는 제조법 7에 있어서의 화합물 (XIIId)와 동일한 방법에 의해 제조할 수 있다.
공정 31
화합물 (XIIIi)는 화합물 (XIIIh)를 용매 중, 1∼10 당량의 유기 금속 시약과, -78℃와 100℃ 사이의 온도에서 5분간∼72시간 동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
유기 금속 시약으로는, 예컨대 메틸리튬, 에틸리튬 등의 알킬리튬 시약, 메틸마그네슘브로마이드, 에틸마그네슘브로마이드 등의 그리냐르 시약, 디메틸아연, 디에틸아연 등의 유기아연 시약 등을 들 수 있다.
용매로는, 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
공정 32
화합물 (XIIIj)는 공정 26과 동일한 방법에 의해 제조할 수 있다.
공정 33
화합물 (XIIIk)는 공정 27과 동일한 방법에 의해 제조할 수 있다.
공정 34
화합물 (I''b)는 공정 28과 동일한 방법에 의해 제조할 수 있다.
제조법 10
화합물 (I'') 중, n1 및 n2가 1이고, R3'가 탄소수 1-3의 알킬이며, Z1이 탄소수 1∼3의 알킬이고, Z2가 수소 원자인 화합물 (I''g)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, n1 및 n2가 1이고, R3'가 식 (A)이며, Z1이 탄소수 1∼3의 알킬이고, Z2가 수소 원자인 화합물 (I''c)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, n1 및 n2가 1이고, R3'가 식 (B)이며, Z1이 탄소수 1∼3의 알킬이고, Z2가 수소 원자인 화합물 (I''d)는 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다.
Figure pct00035
(식 중, R1', R2', R4, R5, R6, R7, R11, R12, n3, n4, Ar 및 Z1a는 각각 상기와 동일하다)
공정 35
화합물 (I''g)는 공정 29와 동일한 방법에 의해 제조할 수 있다.
공정 36
화합물 (I''c)는 공정 7과 동일한 방법에 의해 제조할 수 있다.
공정 37
화합물 (II'e)는 공정 8과 동일한 방법에 의해 제조할 수 있다.
공정 38
화합물 (I''d)는 공정 9와 동일한 방법에 의해 제조할 수 있다.
또한, 화합물 (I), (I'), (I'') 중, 상기 화합물 (Ia)∼(Ig) 및 (I''b)∼(I''d) 이외의 화합물은, 목적으로 하는 화합물의 구조에 알맞은 원료나 시약 등을 채용함으로써, 상기한 제조법에 준하여, 혹은 유기 합성 화학에서 상용되는 일반적인 제조 방법을 적용함으로써 제조할 수 있다.
상기 각 제조법에 있어서의 중간체 및 목적 화합물은, 유기 합성 화학에서 상용되는 분리 정제법, 예컨대, 여과, 추출, 세정, 건조, 농축, 재결정, 각종 크로마토그래피 등으로 처리하여 단리 정제할 수 있다. 또한, 중간체에 있어서는 특별히 정제하지 않고 다음 반응에 제공하는 것도 가능하다.
본 발명의 양이온성 지질에 있어서, 구조 중의 질소 원자 상의 고립 전자쌍에 수소 이온이 배위하여도 좋고, 그 경우에는, 제약상 허용할 수 있는 음이온(상기와 동일)과 염을 형성하고 있어도 좋으며, 본 발명의 양이온성 지질에는, 상기 질소 원자 상의 고립 전자쌍에 수소 이온이 배위한 화합물도 포함된다.
본 발명에 있어서, 제약상 허용할 수 있는 음이온으로는, 예컨대 염화물 이온, 브롬화물 이온, 질산 이온, 황산 이온, 인산 이온 등의 무기 이온, 아세트산 이온, 옥살산 이온, 말레산 이온, 푸마르산 이온, 시트르산 이온, 안식향산 이온, 메탄술폰산 이온 등의 유기산 이온 등을 들 수 있다.
본 발명의 양이온성 지질 중에는, 기하 이성체, 광학 이성체 등의 입체 이성체, 호변 이성체 등이 존재할 수 있는 것도 있지만, 본 발명의 양이온성 지질은, 이들을 포함시켜, 모든 가능한 이성체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 양이온성 지질 중의 각 원자의 일부 또는 전부는, 각각 대응하는 동위체 원자로 치환되어 있어도 좋고, 화합물 (I)은, 이들 동위체 원자로 치환된 화합물도 포함한다. 예컨대, 화합물 (I) 중의 수소 원자의 일부 또는 전부는 원자량 2의 수소 원자(중수소 원자)여도 좋다.
본 발명의 양이온성 지질 중의 각 원자의 일부 또는 전부가 각각 대응하는 동위체 원자로 치환된 화합물은, 시판되고 있는 빌딩 블록을 이용하여, 상기 각 제조법과 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (I) 중의 수소 원자의 일부 또는 전부가 중수소 원자로 치환된 화합물은, 예컨대, 이리듐 착체를 촉매로서 이용하고, 중수를 중수소원으로서 이용하여 알코올, 카르복실산 등을 중수소화하는 방법[저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(J. Am. Chem. Soc.), Vol.124, No.10,2092(2002) 참조] 등을 이용하여 합성할 수도 있다.
본 발명의 양이온성 지질의 구체예를 표 1∼표 3에 나타낸다. 단, 본 발명의 양이온성 지질은 이들에 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
또한, 본 발명에서 이용되는 핵산으로는, 예컨대 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합한 분자라면, 어떠한 분자라도 좋고, 예컨대 리보뉴클레오티드의 중합체인 리보핵산(RNA), 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체인 데옥시리보핵산(DNA), RNA와 DNA로 이루어진 키메라 핵산 및 이들 핵산 중 적어도 하나의 뉴클레오티드가 이 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자로 치환된 뉴클레오티드 중합체 등을 들 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합한 분자의 구조를 적어도 일부에 포함하는 유도체도, 본 발명의 핵산에 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서, 우라실(U)과, 티민(T)은 각각 바꿔 읽을 수 있다.
뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자로는, 예컨대 뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다.
뉴클레오티드 유도체로는, 예컨대 뉴클레오티드에 수식을 행한 분자라면 어떠한 분자여도 좋지만, 예컨대 RNA 또는 DNA와 비교하여 뉴클레아제 내성을 향상시키거나 혹은 그 밖의 분해 인자로부터 안정화시키기 위해서, 상보쇄 핵산과의 친화도를 높이기 위해서, 세포 투과성을 높이기 위해서 또는 가시화시키기 위해서, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드에 수식을 행한 분자 등이 적합하게 이용된다.
뉴클레오티드 유도체로는, 예컨대 당부 수식 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드, 염기 수식 뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드로는, 예컨대 뉴클레오티드의 당의 화학 구조의 일부 또는 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이면 어떠한 것이어도 좋지만, 2'-수식 뉴클레오티드가 바람직하게 이용된다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기로는, 예컨대, 2'-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-알케닐, 2'-치환 알케닐, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, 2'-S-알킬, 2'-S-치환 알킬, 2'-S-알케닐, 2'-S-치환 알케닐, 2'-아미노, 2'-NH-알킬, 2'-NH-치환 알킬, 2'-NH-알케닐, 2'-NH-치환 알케닐, 2'-SO-알킬, 2'-SO-치환 알킬, 2'-카르복시, 2'-CO-알킬, 2'-CO-치환 알킬, 2'-Se-알킬, 2'-Se-치환 알킬, 2'-SiH2-알킬, 2'-SiH2-치환 알킬, 2'-ONO2, 2'-NO2, 2'-N3, 2'-아미노산 잔기(아미노산의 카르복실산으로부터 수산기가 제거된 것), 2'-O-아미노산 잔기(상기 아미노산 잔기와 동일) 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드로는, 당부에 가교 구조를 도입함으로써 2개의 환상 구조를 갖는 가교 구조형 인공 핵산(Bridged Nucleic Acid)(BNA)을 들 수 있고, 구체적으로는, 2' 위치의 산소 원자와 4' 위치의 탄소 원자가 메틸렌을 통해 가교한 잠금 인공 핵산(Locked Nucleic Acid)(LNA)["테트라헤드론 레터즈(Tetrahedron Letters)", Volume 38, Issue 50, 1997, Pages 8735-8738 및 "테트라헤드론(Tetrahedron)", Volume 54, Issue 14, 1998, Pages 3607-3630], 에틸렌 가교 구조형 인공 핵산(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)["뉴클레익 애시드 리서치(Nucleic Acid Research)", 32, e175(2004)] 등을 들 수 있다.
또한 당부 수식 뉴클레오티드로서, 펩티드 핵산(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)], 옥시펩티드 핵산(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653(2001)], 펩티드 리보핵산(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)] 등도 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기로서, 2'-시아노, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, 2'-Se-알킬, 2'-Se-치환 알킬 등이 바람직하고, 2'-시아노, 2'-플루오로, 2'-클로로, 2'-브로모, 2'-트리플루오로메틸, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-이소프로필, 2'-O-트리플루오로메틸, 2'-O-[2-(메톡시)에틸], 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-[2-(N,N-디메틸아미노옥시)에틸], 2'-O-[3-(N,N-디메틸아미노)프로필], 2'-O-{2-[2-(N,N-디메틸아미노)에톡시]에틸}, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 2'-Se-메틸 등이 보다 바람직하며, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-플루오로 등이 더욱 바람직하고, 2'-O-메틸 및 2'-O-에틸이 가장 바람직하다.
또한, 당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기는, 그 크기로부터 바람직한 범위를 정의할 수도 있고, 플루오로의 크기로부터 -O-부틸의 크기에 상당하는 것이 바람직하며, -O-메틸의 크기로부터 -O-에틸의 크기에 상당하는 것이 보다 바람직하다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기에 있어서의 알킬로는, 탄소수 1∼6의 알킬을 들 수 있고, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실 등의 탄소수 1∼6의 알킬이다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기에 있어서의 알케닐로는, 탄소수 3∼6의 알케닐을 들 수 있고, 예컨대 알릴, 1-프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기에 있어서의 할로겐으로는, 예컨대 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
아미노산 잔기에 있어서의 아미노산으로는, 예컨대 지방족 아미노산(구체적으로는, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 등), 히드록시아미노산(구체적으로는, 세린, 트레오닌 등), 산성 아미노산(구체적으로는, 아스파라긴산, 글루타민산 등), 산성 아미노산아미드(구체적으로는, 아스파라긴, 글루타민 등), 염기성 아미노산(구체적으로는, 리신, 히드록시리신, 아르기닌, 오르니틴 등), 함황 아미노산(구체적으로는, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 등), 이미노산(구체적으로는, 프롤린, 4-히드록시프롤린 등) 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기에 있어서의 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예컨대, 할로겐(상기와 동일), 히드록시, 술파닐, 아미노, 옥소, -O-알킬(이 -O-알킬의 알킬 부분은 상기 탄소수 1∼6의 알킬과 동일), -S-알킬(이 -S-알킬의 알킬 부분은 상기 탄소수 1∼6의 알킬과 동일), -NH-알킬(이 -NH-알킬의 알킬 부분은 상기 탄소수 1∼6의 알킬과 동일), 디알킬아미노옥시(이 디알킬아미노옥시의 2개의 알킬 부분은 동일하거나 또는 상이하게 상기 탄소수 1∼6의 알킬과 동일), 디알킬아미노(이 디알킬아미노의 2개의 알킬 부분은 동일하거나 또는 상이하게 상기 탄소수 1∼6의 알킬과 동일), 디알킬아미노알킬옥시(이 디알킬아미노알킬옥시의 2개의 알킬 부분은 동일하거나 또는 상이하게 상기 탄소수 1∼6의 알킬과 동일하고, 알킬렌 부분은 상기 알킬로부터 수소 원자가 하나 제거된 것을 의미함) 등을 들 수 있고, 치환수는 바람직하게는 1∼3이다.
인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드로는, 뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 화학 구조의 일부 또는 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이면 어떠한 것이라도 좋고, 예컨대, 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 포스포로디티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 알킬포스포네이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 포스포로아미데이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
염기 수식 뉴클레오티드로는, 뉴클레오티드의 염기의 화학 구조의 일부 또는 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이면 어떠한 것이라도 좋고, 예컨대, 염기 내의 산소 원자가 황 원자로 치환된 것, 수소 원자가 탄소수 1∼6의 알킬기로 치환된 것, 메틸기가 수소 원자 혹은 탄소수 2∼6의 알킬기로 치환된 것, 아미노기가 탄소수 1∼6의 알킬기, 탄소수 1∼6의 알카노일기 등의 보호기로 보호된 것 등을 들 수 있다.
또한, 뉴클레오티드 유도체로서, 뉴클레오티드 또는 당부, 인산디에스테르 결합 혹은 염기 중 적어도 하나가 수식된 뉴클레오티드 유도체에 지질, 인지질, 페나진, 엽산, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 색소 등, 다른 화학 물질을 부가한 것도 들 수 있고, 구체적으로는, 5'-폴리아민 부가 뉴클레오티드 유도체, 콜레스테롤 부가 뉴클레오티드 유도체, 스테로이드 부가 뉴클레오티드 유도체, 담즙산 부가 뉴클레오티드 유도체, 비타민 부가 뉴클레오티드 유도체, 녹색 형광 색소(Cy3) 부가 뉴클레오티드 유도체, 적색 형광 색소(Cy5) 부가 뉴클레오티드 유도체, 플루오로세인(6-FAM) 부가 뉴클레오티드 유도체 및 비오틴 부가 뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 이용되는 핵산에 있어서는, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체가, 상기 핵산 내의 다른 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체와 알킬렌 구조, 펩티드 구조, 뉴클레오티드 구조, 에테르 구조, 에스테르 구조 및 이들 중 적어도 하나를 조합한 구조 등의 가교 구조를 형성하여도 좋다.
본 발명에서 이용되는 핵산으로는, 바람직하게는 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 표적 유전자로는, mRNA를 생성하여 발현되는 유전자라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 종양 또는 염증에 관련된 유전자가 바람직하고, 예컨대 혈관 내피 증식 인자(vascular endothelial growth factor, 이하 VEGF라 함), 혈관 내피 증식 인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor, 이하 VEGFR이라 함), 선유아세포 증식 인자, 선유아세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간세포 증식 인자, 간세포 증식 인자 수용체, 크루펠양 인자(Kruppel-like factor, 이하 KLF라 함), 익스프레스드 시퀀스 태그(Ets) 전사 인자, 핵 인자, 저산소 유도 인자, 세포 주기 관련 인자, 염색체 복제 관련 인자, 염색체 수복 관련 인자, 미소관 관련 인자, 증식 시그널 경로 관련 인자, 증식 관련 전사 인자, 아포토시스 관련 인자 등의 단백질을 코딩하는 유전자 등을 들 수 있고, 구체적으로는 VEGF 유전자, VEGFR 유전자, 선유아세포 증식 인자 유전자, 선유아세포 증식 인자 수용체 유전자, 혈소판 유래 증식 인자 유전자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체 유전자, 간세포 증식 인자 유전자, 간세포 증식 인자 수용체 유전자, KLF 유전자, Ets 전사 인자 유전자, 핵 인자 유전자, 저산소 유도 인자 유전자, 세포 주기 관련 인자 유전자, 염색체 복제 관련 인자 유전자, 염색체 수복 관련 인자 유전자, 미소관 관련 인자 유전자(예컨대, CKAP5 유전자 등), 증식 시그널 경로 관련 인자 유전자(예컨대, KRAS 유전자 등), 증식 관련 전사 인자 유전자, 아포토시스 관련 인자(예컨대, BCL-2 유전자 등) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 표적 유전자로는, 예컨대, 간장, 폐, 신장 또는 비장에서 발현되는 유전자가 바람직하고, 간장에서 발현되는 유전자가 보다 바람직하며, 예컨대 상기한 종양 또는 염증에 관련된 유전자, 비형 간염 바이러스 게놈, C형 간염 바이러스 게놈, 아포리포 단백질(APO), 히드록시메틸글루타릴(HMG) CoA 환원 효소, 켁신 9형 세린 프로테아제(PCSK9), 제12 인자, 글루카곤 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 류코트리엔 수용체, 트롬복산 A2 수용체, 히스타민 H1 수용체, 탄산 탈수 효소, 안지오텐신 변환 효소, 레닌, p53, 티로신포스파타아제(PTP), 나트륨 의존성 글루코오스 수송 담체, 종양 괴사 인자, 인터류킨, 헵시딘, 트란스타이레틴, 안티트롬빈, 프로테인 C, 매트립타아제 효소(예컨대, TMPRSS6 유전자 등) 등의 단백질을 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다.
표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산으로는, 예컨대 단백질 등을 코딩하는 유전자(표적 유전자)의 mRNA의 일부의 염기서열에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하고, 또한 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산이라면, 예컨대 siRNA(short interference RNA), miRNA(micro RNA) 등의 이중쇄 핵산, shRNA(short hairpin RNA), 안티센스 핵산, 리보자임 등의 단일쇄 핵산 등, 어느 쪽 핵산을 이용하여도 좋지만, 이중쇄 핵산이 바람직하다.
표적 유전자의 mRNA의 일부의 염기서열에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산을 안티센스쇄 핵산이라고 하고, 안티센스쇄 핵산의 염기서열에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산을 센스쇄 핵산이라고도 한다. 센스쇄 핵산은, 표적 유전자의 일부의 염기서열로 이루어진 핵산 그 자체 등, 안티센스쇄 핵산과 접합하여 이중쇄 형성부가 생기는 핵산을 말한다.
이중쇄 핵산이란, 2개의 쇄가 접합하여 이중쇄 형성부를 갖는 핵산을 말한다. 이중쇄 형성부란, 이중쇄 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 또는 그 유도체가 염기쌍을 구성하여 이중쇄를 형성하고 있는 부분을 말한다. 이중쇄 형성부를 구성하는 염기쌍은 통상 15∼27 염기쌍으로서, 15∼25 염기쌍이 바람직하고, 15∼23 염기쌍이 보다 바람직하며, 15∼21 염기쌍이 더욱 바람직하고, 15∼19 염기쌍이 특히 바람직하다.
이중쇄 형성부의 안티센스쇄 핵산으로는, 예컨대 표적 유전자의 mRNA의 일부 서열로 이루어지는 핵산, 또는 이 핵산에 있어서 1∼3 염기, 바람직하게는 1∼2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기가 치환, 결실 혹은 부가되고, 또한 표적 단백질의 발현 억제 활성을 갖는 핵산이 적합하게 이용된다. 이중쇄 핵산을 구성하는 단일쇄의 핵산은 통상 15∼30 염기(뉴클레오시드)의 연결로 이루어지지만, 15∼29 염기가 바람직하고, 15∼27 염기가 보다 바람직하며, 15∼25 염기가 더욱 바람직하고, 17∼23 염기가 특히 바람직하며, 19∼21 염기가 가장 바람직하다.
이중쇄 핵산을 구성하는 안티센스쇄, 센스쇄 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 핵산은, 이중쇄 형성부에 계속되는 3'측 또는 5'측에 이중쇄를 형성하지 않는 추가의 핵산을 가져도 좋다. 이 이중쇄를 형성하지 않는 부분을 돌출부(오버행)라고도 한다.
돌출부를 갖는 이중쇄 핵산으로는, 예컨대 적어도 한쪽 쇄의 3' 말단 또는 5' 말단에 1∼4 염기, 통상은 1∼3 염기로 이루어진 돌출부를 갖는 것이 이용되지만, 2 염기로 이루어진 돌출부를 갖는 것이 바람직하게 이용되고, dTdT 또는 UU로 이루어진 돌출부를 갖는 것이 보다 바람직하게 이용된다. 돌출부는, 안티센스쇄만, 센스쇄만 및 안티센스쇄와 센스쇄 양쪽에 가질 수 있지만, 안티센스쇄와 센스쇄 양쪽에 돌출부를 갖는 이중쇄 핵산이 바람직하게 이용된다.
또한, 이중쇄 형성부에 계속되어 표적 유전자의 mRNA의 염기서열과 일부 또는 모두가 일치하는 서열, 또는, 이중쇄 형성부에 계속되어 표적 유전자의 mRNA의 상보쇄의 염기서열과 일부 또는 모두가 일치하는 서열을 이용하여도 좋다. 또한, 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산으로는, 예컨대 Dicer 등의 리보뉴클레아제의 작용에 의해 상기한 이중쇄 핵산을 생성하는 핵산 분자(국제 공개 제2005/089287호)나, 3' 말단이나 5' 말단의 돌출부를 갖고 있지 않은 이중쇄 핵산 등을 이용할 수도 있다.
또한, 상기한 이중쇄 핵산이 siRNA인 경우, 바람직하게는 안티센스쇄는, 5' 말단측에서 3' 말단측을 향해 적어도 1∼17번째의 염기(뉴클레오시드)의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 17 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이며, 보다 바람직하게는, 상기 안티센스쇄는, 5' 말단측에서 3' 말단측을 향해 1∼19번째의 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 19 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이거나, 1∼21번째의 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 21 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이거나, 1∼25번째의 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 25 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이다.
또한, 본 발명에서 이용되는 핵산이 siRNA인 경우, 바람직하게는 상기 핵산 중의 당의 10∼70%, 보다 바람직하게는 15∼60%, 더욱 바람직하게는 20∼50%가, 2' 위치에 있어서 수식기로 치환된 리보오스이다. 본 발명에 있어서의 2' 위치에 있어서 수식기로 치환된 리보오스란, 리보오스의 2' 위치의 수산기가 수식기로 치환되어 있는 것을 의미하고, 리보오스의 2' 위치의 수산기와 입체 배치가 동일하여도 좋고 상이하여도 좋지만, 바람직하게는 리보오스의 2' 위치의 수산기와 입체 배치가 동일하다. 2' 위치에 있어서 수식기로 치환된 리보오스에 있어서의 수식기로는, 당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 2'-수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기의 정의로 예시한 것 및 수소 원자를 들 수 있고, 2'-시아노, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, 2'-Se-알킬, 2'-Se-치환 알킬 등이 바람직하며, 2'-시아노, 2'-플루오로, 2'-클로로, 2'-브로모, 2'-트리플루오로메틸, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-이소프로필, 2'-O-트리플루오로메틸, 2'-O-[2-(메톡시)에틸], 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-[2-(N,N-디메틸)아미노옥시]에틸, 2'-O-[3-(N,N-디메틸아미노)프로필], 2'-O-{2-[2-(N,N-디메틸아미노)에톡시]에틸}, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 2'-Se-메틸, 수소 원자 등이 보다 바람직하고, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-플루오로, 수소 원자 등이 더욱 바람직하며, 2'-O-메틸 및 2'-O-플루오로가 가장 바람직하다.
본 발명에서 이용되는 핵산은, 핵산의 구조 중의 인산부, 에스테르부 등에 포함되는 산소 원자 등이, 예컨대 황 원자 등의 다른 원자로 치환된 유도체를 포함한다.
또한, 안티센스쇄 및 센스쇄의 5' 말단의 염기에 결합하는 당은, 각각 5' 위치의 수산기가, 인산기 혹은 상기한 수식기, 또는 생체 내의 핵산 분해 효소 등으로 인산기 혹은 상기한 수식기로 변환되는 기에 의해 수식되어 있어도 좋다.
또한, 안티센스쇄 및 센스쇄의 3' 말단의 염기에 결합하는 당은, 각각 3' 위치의 수산기가, 인산기 혹은 상기한 수식기, 또는 생체 내의 핵산 분해 효소 등으로 인산기 혹은 상기한 수식기로 변환되는 기에 의해 수식되어 있어도 좋다.
단일쇄의 핵산으로는, 예컨대 표적 유전자의 연속되는 15∼27 염기(뉴클레오시드), 바람직하게는 15∼25 염기, 보다 바람직하게는 15∼23 염기, 더욱 바람직하게는 15∼21 염기, 특히 바람직하게는 15∼19 염기로 이루어진 서열의 상보 서열로 이루어진 핵산, 또는 이 핵산에 있어서 1∼3 염기, 바람직하게는 1∼2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기가 치환, 결실 혹은 부가되고, 또한 표적 단백질의 발현 억제 활성을 갖는 핵산이라면 어느 것이라도 좋다. 상기 단일쇄의 핵산은, 15∼30 염기(뉴클레오시드)의 연결로 이루어지는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 15∼27 염기, 더욱 바람직하게는 15∼25 염기, 특히 바람직하게는 15∼23 염기의 단일쇄 핵산이 적합하게 이용된다.
단일쇄 핵산으로서, 상기한 이중쇄 핵산을 구성하는 안티센스쇄 및 센스쇄를, 스페이서 서열(스페이서 올리고 뉴클레오티드)을 통해 연결한 것을 이용하여도 좋다. 스페이서 올리고 뉴클레오티드로는 6∼12 염기의 단일쇄 핵산 분자가 바람직하고, 그 5' 말단측의 서열은 2개의 U인 것이 바람직하다. 스페이서 올리고 뉴클레오티드의 예로서, UUCAAGAGA의 서열로 이루어지는 핵산을 들 수 있다. 스페이서 올리고 뉴클레오티드에 의해 연결되는 안티센스쇄 및 센스쇄의 순서는 어느 쪽이 5'측이 되어도 좋다. 상기 단일쇄 핵산으로는, 예컨대 스템 루프 구조에 의해 이중쇄 형성부를 갖는 shRNA 등의 단일쇄 핵산인 것이 바람직하다. shRNA 등의 단일쇄 핵산은 통상 50∼70 염기 길이이다.
리보뉴클레아제 등의 작용에 의해, 상기한 단일쇄 핵산 또는 이중쇄 핵산을 생성하도록 설계한 70 염기 길이 이하, 바람직하게는 50 염기 길이 이하, 더욱 바람직하게는 30 염기 길이 이하의 핵산을 이용하여도 좋다.
또한, 본 발명에서 이용되는 핵산은, 기지의 RNA 또는 DNA 합성법 및 RNA 또는 DNA 수식법을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 본 발명의 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물로서, 예컨대 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 핵산의 복합체를 함유하는 조성물, 상기 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물 등을 들 수 있다. 상기 지질막은, 지질 단일막(지질 1분자막)이어도 지질 이중막(지질 2분자막)이어도 좋다. 또한, 상기 지질막에, 본 발명의 양이온성 지질, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, 상기 복합체 및/또는 상기 지질막에, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 함유하고 있어도 좋다.
또한, 본 발명의 조성물로는, 예컨대 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등도 들 수 있다. 이 경우의 지질막도, 지질 단일막(지질 1분자막)이어도 지질 이중막(지질 2분자막)이어도 좋다. 또한, 상기 지질막에, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다.
본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산의 복합체를 함유하는 조성물, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물, 그리고 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물이 보다 바람직하며, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산의 복합체를 함유하는 조성물, 그리고 본 발명의 양이온성 지질과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물이 더욱 바람직하며, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물이 가장 바람직하다. 또한, 어느 쪽의 경우도 상기 지질막에, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, 상기 복합체 및/또는 상기 지질막에, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 함유하고 있어도 좋다.
복합체의 형태로는, 예컨대 핵산과 지질 단일(1분자)층으로 이루어진 막(역 미셀)의 복합체, 핵산과 리포솜의 복합체, 핵산과 미셀의 복합체 등을 들 수 있고, 바람직하게는 핵산과 지질 단일층으로 이루어진 막의 복합체 또는 핵산과 리포솜의 복합체를 들 수 있다.
복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물로는, 예컨대 상기 복합체 및 상기 복합체를 지질 이중막으로 봉입하는 리포솜 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물에는, 본 발명의 양이온성 지질을 1종 또는 복수종을 사용하여도 좋고, 또한 본 발명의 양이온성 지질에는, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 혼합하여도 좋다.
본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질로는, 예컨대, 일본 특허 공개 소화 제61-161246호 공보(미국 특허 제5049386호 명세서) 내에서 개시되는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA), N-(2,3-디-(9-(Z)-옥타데세노일옥시))-프로파-1-일-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP) 등, 국제 공개 제91/16024호 및 국제 공개 제97/019675호 내에서 개시되는 N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸브롬화암모늄(DORIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카르복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄트리플루오로아세트산(DOSPA) 등, 국제 공개 제2005/121348호 내에서 개시되는 DLinDMA 등, 국제 공개 제2009/086558호 내에서 개시되는 DLin-K-DMA, 국제 공개 제2011/136368호 내에서 개시되는 (3R,4R)-3,4-비스((Z)-헥사데카-9-에닐옥시)-1-메틸피롤리딘, N-메틸-N,N-비스(2-((Z)-옥타데카-6-에닐옥시)에틸)아민 등을 들 수 있고, 바람직하게는 DOTMA, DOTAP, DORIE, DOSPA, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 등의 2개의 비치환 알킬기를 갖는 3급 아민 부위 또는 3개의 비치환 알킬기를 갖는 4급 암모늄 부위를 갖는 양이온성 지질을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 상기 3급 아민 부위를 갖는 양이온성 지질을 들 수 있다. 상기 3급 아민 부위 및 상기 4급 암모늄 부위의 비치환 알킬기는 메틸기인 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 조성물은, 핵산을 함유할 수 있지만, 핵산과 화학적으로 근사한 화합물도 함유할 수도 있다.
본 발명의 조성물은, 공지된 제조 방법 또는 그것에 준하여 제조할 수 있고, 어떠한 제조 방법으로 제조된 것이어도 좋다. 예컨대, 조성물 중 하나인 리포솜을 함유하는 조성물의 제조에는, 공지된 리포솜의 조제 방법을 적용할 수 있다. 공지된 리포솜의 조제 방법으로는, 예컨대 뱅검(Bangham) 등의 리포솜 조제법["저널 오브 몰레큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.)", 1965년, 제13권, p.238-252 참조], 에탄올 주입법["저널 오브 셀 바이올로지(J. Cell Biol.)", 1975년, 제66권, p.621-634 참조], 프렌치 프레스법["에프이비에스 레터즈(FEBS Lett.)", 1979년, 제99권, p.210-214 참조], 동결 융해법["아카이브스 오브 바이오케미스트리 앤드 바이오피직스(Arch. Biochem. Biophys.)", 1981년, 제212권, p.186-194 참조], 역상 증발법["프로시딩즈 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)", 1978년, 제75권, p.4194-4198 참조] 또는 pH 구배법(예컨대 일본 특허 제2572554호 공보, 일본 특허 제2659136호 공보 등 참조) 등을 들 수 있다. 리포솜의 제조시에 리포솜을 분산시키는 용액으로는, 예컨대 물, 산, 알칼리, 여러 가지 완충액, 생리 식염수 또는 아미노산 수액 등을 이용할 수 있다. 또한, 리포솜의 제조시에는, 예컨대 시트르산, 아스코르빈산, 시스테인 또는 에틸렌디아민사아세트산(EDTA) 등의 항산화제, 예컨대 글리세린, 포도당 또는 염화나트륨 등의 등장화제 등의 첨가도 가능하다. 또한, 예컨대, 본 발명의 양이온성 지질, 또는 본 발명의 양이온성 지질과 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과의 혼합물 등을 예컨대 에탄올 등의 유기 용매에 용해하고, 용매를 증류 제거한 후, 생리 식염수 등을 첨가, 진탕 교반하고, 리포솜을 형성시킴으로써도 리포솜을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은, 예컨대, 본 발명의 양이온성 지질, 또는 본 발명의 양이온성 지질과 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과의 혼합물을 클로로포름에 미리 용해하고, 계속해서 핵산의 수용액과 메탄올을 첨가하고 혼합하여 양이온성 지질/핵산의 복합체를 형성시키며, 또한 클로로포름층을 취출하고, 이것에 폴리에틸렌글리콜화 인지질과 중성의 지질과 물을 첨가하여 유중수형(W/O) 에멀젼을 형성하고, 역상 증발법으로 처리하여 제조하는 방법(일본 특허 공표 제2002-508765호 공보 참조)나, 핵산을, 산성의 전해질 수용액에 용해하고, 예컨대, 본 발명의 양이온성 지질, 또는 본 발명의 양이온성 지질과 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과의 혼합물(에탄올 중)을 첨가하여, 에탄올 농도를 20 v/v%까지 낮추어 상기 핵산 내포 리포솜을 조제하고, 사이징 여과하며, 투석에 의해, 과잉의 에탄올을 제거한 후, 시료를 pH를 더 올려 투석하여 조성물 표면에 부착된 핵산을 제거하여 제조하는 방법(일본 특허 공표 제2002-501511호 공보 및 바이오키미카 악타 바이오 피지카 악타(Biochimica et Biophysica Acta), 2001년, 제1510권, p.152-166 참조) 등에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물 중, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입한 지질 이중막을 함유하는 리포솜을 함유하는 조성물은, 예컨대, 국제 공개 제02/28367호 및 국제 공개 제2006/080118호 등에 기재된 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물 중, 예컨대 본 발명의 양이온성 지질과 핵산의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입한 지질막을 함유하는 조성물, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등은, 국제 공개 제02/28367호 및 국제 공개 제2006/080118호 등에 기재된 제조 방법에 따라서, 각각의 복합체를 제조하여, 물 또는 0∼40% 에탄올 수용액 중에, 상기 복합체를 용해시키지 않고 분산시키고(A액), 별도, 각각의 지질막 성분을, 예컨대 에탄올 수용액 중에 용해시켜(B액), 등량 또는 체적비 1:1∼7:3의 A액과 B액을 혼합하고, 또한 적절히 물을 첨가함으로써 얻을 수 있다. 또한, A액 및 B액 중의 양이온성 지질로는, 1종 또는 복수종의 본 발명의 양이온성 지질 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 사용하여도 좋고, 또한 본 발명의 양이온성 지질과 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 조합하고 혼합하여 사용하여도 좋다.
또한, 본 발명에 있어서, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입한 지질막을 함유하는 조성물, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등의 제조 중 및 제조 후에, 복합체 중의 핵산과 지질막 중의 양이온성 지질과의 정전 상호 작용이나, 복합체 중의 양이온성 지질과 지질막 중의 양이온성 지질과의 융합에 의해, 복합체 및 막의 구조가 변위한 것도, 각각 본 발명의 양이온성 지질과 핵산의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입한 지질막을 함유하는 조성물, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등에 포함된다.
국제 공개 제02/28367호 및 국제 공개 제2006/080118호 등에 기재된 제조 방법에 따라, 핵산(상기와 동일), 바람직하게는 이중쇄 핵산과 본 발명의 양이온성 지질 및/또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 함유하는 리포솜과의 복합체를 제조하여, 물 또는 0∼40% 에탄올 수용액 중에, 상기 복합체를 용해시키지 않고 분산시키고(A액), 별도, 본 발명의 양이온성 지질 및/또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을, 에탄올 수용액 중에 용해시켜(B액), 등량 또는 체적비 1:1∼7:3의 A액과 B액을 혼합하는 것, 또는, 적절히 물을 더 첨가함으로써도, 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 조성물을 얻을 수 있다. 상기 조성물은, 바람직하게는 양이온성 지질과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물이거나 또는 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어진 막(역 미셀)의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물이다. 이들의 경우의 지질막은, 지질 단일막(지질 1분자막)이어도 지질 이중막(지질 2분자막)이어도 좋다.
또한, 본 개시의 상기 핵산과 상기 리포솜의 복합체 중의 리포솜은, 미리 크기를, 평균 입자경 10 ㎚∼400 ㎚, 보다 바람직하게는 20 ㎚∼110 ㎚, 더욱 바람직하게는 30 ㎚∼80 ㎚로 조절한 리포솜이 바람직하다. 또한, 상기 복합체 및/또는 지질막에, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, A액은 리포솜과 상기 핵산의 복합체를 형성시킬 수 있으면, 에탄올 농도는, 20∼70%여도 좋다.
또한, 등량의 A액과 B액을 혼합하는 대신에 A액과 B액을 혼합한 후에 복합체가 용해되지 않고, 또한 B액 중의 양이온성 지질이 용해되지 않는 에탄올 농도가 되는 비율로 혼합하여도 좋다. 바람직하게는 복합체가 용해되지 않고, B액 중의 양이온성 지질이 용해되지 않고, 또한 에탄올 농도가 30∼60%인 에탄올 수용액이 되는 비로 A액과 B액을 혼합하는 것으로 대체하여도 좋고, 혹은 A액과 B액을 혼합 후에 복합체가 용해되지 않는 에탄올 농도가 되는 비로 A액과 B액을 혼합하고, 또한 물을 첨가함으로써 B액 중의 양이온성 지질이 용해되지 않게 되는 에탄올 농도로 하는 것으로 하여도 좋다.
본 개시의 상기 A액 중에서의 핵산과 리포솜의 복합체는, A액과 B액을 혼합하고, 또한 적절히 물을 첨가한 후에는, 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어진 막(역 미셀)과 핵산의 복합체로 형태가 변화하고 있다. 본 개시의 제조 방법으로 얻어지는 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 조성물은, 바람직하게는 양이온성 지질과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물이며, 또는, 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어진 막(역 미셀)과 핵산의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 양이온성 지질을 함유하는 조성물로서, 그 제조성(수율 및/또는 균일성)은 우수하다.
본 발명의 조성물에 있어서, 복합체 중의 본 발명의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 0.5∼4배인 것이 바람직하고, 1.5∼3.5배인 것이 보다 바람직하며, 2∼3배인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 복합체 중의 본 발명의 양이온성 지질 및 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 0.5∼4배인 것이 바람직하고, 1.5∼3.5배인 것이 보다 바람직하며, 2∼3배인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물에 있어서, 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물 중의 본 발명의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 1∼10배인 것이 바람직하고, 2.5∼9배인 것이 보다 바람직하며, 3.5∼8배인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 조성물 중의 본 발명의 양이온성 지질 및 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 1∼10배인 것이 바람직하고, 2.5∼9배인 것이 보다 바람직하며, 3.5∼8배인 것이 더욱 바람직하다.
중성 지질로는, 단순 지질, 복합 지질 또는 유도 지질 중 어떠한 것이라도 좋고, 예컨대 인지질, 글리세로당지질, 스핑고당지질, 스핑고이드 또는 스테롤 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물에 있어서 중성 지질을 함유하는 경우에는, 중성 지질의 분자의 총수는, 본 발명의 양이온성 지질 및 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수에 대하여 0.1∼2배인 것이 바람직하고, 0.2∼1.5배인 것이 보다 바람직하며, 0.3∼1.2배인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 조성물은, 모두 중성 지질을, 복합체에 함유하여도 좋고, 복합체를 봉입하는 지질막에 함유하고 있어도 좋으며, 적어도 복합체를 봉입하는 지질막에 함유하고 있는 것이 보다 바람직하고, 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막의 어느 쪽에나 함유하고 있는 것이 더욱 바람직하다.
중성 지질에 있어서의 인지질로는, 예컨대 포스파티딜콜린(구체적으로는 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린(EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC) 등), 포스파티딜에탄올아민(구체적으로는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 16-0-모노메틸 PE, 16-0-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE) 등), 글리세로인지질(구체적으로는 포스파티딜세린, 포스파티딘산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 리조포스파티딜콜린 등), 스핑고인지질(구체적으로는 스핑고미엘린, 세라미드포스포에탄올아민, 세라미드포스포글리세롤, 세라미드포스포글리세로인산 등), 글리세로포스포노지질, 스핑고포스포노지질, 천연 레시틴(구체적으로는 난황 레시틴, 대두 레시틴 등) 또는 수소 첨가 인지질(구체적으로는 수소 첨가 대두 포스파티딜콜린 등) 등의 천연 또는 합성의 인지질을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 글리세로당지질로는, 예컨대 술폭시리보실글리세리드, 디글리코실디글리세리드, 디갈락토실디글리세리드, 갈락토실디글리세리드 또는 글리코실디글리세리드 등을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 스핑고당지질로는, 예컨대 갈락토실세레브로시드, 락토실세레브로시드 또는 강글리오시드 등을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 스핑고이드로는, 예컨대 스핑간, 이코사스핑간, 스핑고신 또는 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 유도체로는, 예컨대 스핑간, 이코사스핑간 또는 스핑고신 등의 -NH2를 -NHCO(CH2)xCH3(식 중, x는 0∼18의 정수이며, 그 중에서도 6, 12 또는 18이 바람직함)으로 변환한 것 등을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 스테롤로는, 예컨대 콜레스테롤, 디히드로콜레스테롤, 라노스테롤, β-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고스테롤, 푸코스테롤 또는 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol) 등을 들 수 있다.
고분자로는, 예컨대 단백질, 알부민, 덱스트란, 폴리펙트(polyfect), 키토산, 덱스트란황산, 예컨대 폴리-L-리신, 폴리에틸렌이민, 폴리아스파라긴산, 스티렌말레산 공중합체, 이소프로필아크릴아미드-아크릴피롤리돈 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 수식 덴드리머, 폴리젖산, 폴리젖산폴리글리콜산 또는 폴리에틸렌글리콜화폴리젖산 등의 고분자 또는 이들 염의 1 이상으로 이루어진 미셀 등을 들 수 있다.
여기서, 고분자의 염은, 예컨대 금속염, 암모늄염, 산부가염, 유기아민 부가염, 아미노산 부가염 등을 포함한다. 금속염으로는, 예컨대 리튬염, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 알루미늄염 또는 아연염 등을 들 수 있다. 암모늄염으로는, 예컨대 암모늄 또는 테트라메틸암모늄 등의 염을 들 수 있다. 산부가염으로는, 예컨대 염산염, 황산염, 질산염 또는 인산염 등의 무기산염 및 아세트산염, 말레산염, 푸마르산염 또는 시트르산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 유기아민 부가염으로는, 예컨대 모르폴린 또는 피페리딘 등의 부가염을 들 수 있다. 아미노산 부가염으로는, 예컨대 글리신, 페닐알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산 또는 리신 등의 부가염을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 모두 예컨대 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 1 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제 등을 함유하는 것이 바람직하고, 복합체에 함유하고 있어도 좋으며, 복합체를 봉입하는 지질막에 함유하고 있어도 좋고, 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막 모두 함유하고 있는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 조성물이, 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 1 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체를 함유하는 경우에는, 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 1 이상의 물질의 지질 유도체 및 지방산 유도체의 분자의 총수는, 본 발명의 양이온성 지질 및 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수에 대하여 0.01∼0.3배인 것이 바람직하고, 0.02∼0.25배인 것이 보다 바람직하며, 0.03∼0.15배인 것이 더욱 바람직하다.
당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 1 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제로는, 바람직하게는, 당지질, 또는 수용성 고분자의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체를 들 수 있다. 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 1 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제는, 분자의 일부가 조성물의 다른 구성 성분과 예컨대 소수성 친화력, 정전적 상호 작용 등에 의해 결합하는 성질을 지니며, 다른 부분이 조성물의 제조시의 용매와 예컨대 친수성 친화력, 정전적 상호 작용 등에 의해 결합하는 성질을 지닌 2면성을 지닌 물질인 것이 바람직하다.
당, 펩티드 또는 핵산의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로는, 예컨대 자당, 소르비톨, 젖당 등의 당, 예컨대 카제인 유래 펩티드, 난백 유래 펩티드, 대두 유래 펩티드, 글루타치온 등의 펩티드, 또는 예컨대 DNA, RNA, 플라스미드, siRNA, ODN 등의 핵산과, 상기 조성물의 정의 중에서 예를 든 중성 지질 혹은 본 발명의 양이온성 지질 또는 예컨대 스테아르산, 팔미트산, 미리스트산, 라우르산 등의 지방산이 결합하여 이루어지는 것 등을 들 수 있다.
또한, 당의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로는, 예컨대 상기 조성물의 정의 중에서 예를 든 글리세로당지질 또는 스핑고당지질 등도 포함된다.
수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세린, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 올리고당, 덱스트린, 수용성 셀룰로오스, 덱스트란, 콘드로이친황산, 폴리글리세린, 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아스파라긴산아미드, 폴리-L-리신, 만난, 풀루란, 올리고글리세롤 등 또는 이들의 유도체와, 상기 조성물의 정의 중에서 예를 든 중성 지질 혹은 본 발명의 양이온성 지질, 또는 예컨대 스테아르산, 팔미트산, 미리스트산 또는 라우르산 등의 지방산이 결합하여 이루어지는 것, 이들의 염 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리글리세린 등의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 및 이들의 염을 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 및 이들의 염을 들 수 있다.
폴리에틸렌글리콜의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜화지질[구체적으로는 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민(보다 구체적으로는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](PEG-DSPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](PEG-DMPE) 등), 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 60, 크레모포어 이엘(CREMOPHOR EL) 등], 폴리에틸렌글리콜소르비탄 지방산 에스테르류(구체적으로는 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 등) 또는 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르류 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜화지질을 들 수 있다.
폴리글리세린의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로는, 예컨대 폴리글리세린화지질(구체적으로는 폴리글리세린-포스파티딜에탄올아민 등) 또는 폴리글리세린 지방산 에스테르류 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리글리세린화지질을 들 수 있다.
계면활성제로는, 예컨대 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄(구체적으로는 폴리소르베이트 80 등), 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜(구체적으로는 플루로닉 F68 등), 소르비탄 지방산 에스테르(구체적으로는 소르비탄모노라우레이트, 소르비탄모노올리에이트 등), 폴리옥시에틸렌 유도체(구체적으로는 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 60, 폴리옥시에틸렌라우릴알코올 등), 글리세린 지방산 에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜알킬에테르 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 글리세린 지방산 에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜알킬에테르 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물 중의 복합체 및 지질막에는, 예컨대 수용성 고분자 등에 의한 표면 개질도 임의로 행할 수 있다[라직(D. D. Lasic), 마틴(F. Martin) 지음, "스텔스 리포솜즈(Stealth Liposomes)"(미국), 씨알씨 프레스 잉크(CRC Press Inc), 1995년, p.93-102 참조]. 표면 개질에 사용할 수 있는 수용성 고분자로는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세린, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 올리고당, 덱스트린, 수용성 셀룰로오스, 덱스트란, 콘드로이친황산, 폴리글리세린, 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아스파라긴산아미드, 폴리-L-리신, 만난, 풀루란, 올리고글리세롤 등을 들 수 있고, 바람직하게는 덱스트란, 풀루란, 만난, 아밀로펙틴 또는 히드록시에틸 전분 등을 들 수 있다. 또한, 표면 개질에는, 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 1 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체(상기와 동일) 등을 이용할 수 있다. 상기 표면 개질은, 본 발명의 조성물 중의 복합체 및 지질막에 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자로부터 선택되는 1 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제를 함유시키는 방법의 하나이다.
또한, 표적화 리간드를, 본 발명의 조성물의 지질 성분의 극성 헤드 잔기에 공유 결합함으로써 본 발명의 조성물의 표면에 직접 결합시키는 것도 임의로 행할 수 있다(국제 공개 제2006/116107호 참조).
본 발명의 조성물 중의 복합체 또는 복합체를 봉입하는 지질막의 평균 입자경은, 소망에 따라 자유롭게 선택할 수 있지만, 하기하는 평균 입자경으로 하는 것이 바람직하다. 평균 입자경을 조절하는 방법으로는, 예컨대 익스트루전법, 커다란 다중막 리포솜(MLV) 등을 기계적으로 분쇄(구체적으로는 멘톤 고린(Menton Gaulin), 마이크로플루이다이저 등을 사용)하는 방법[뮐러(R. H. Muller), 베니타(S. Benita), 뵘(B. Bohm) 지음, "에멀젼 앤드 나노서스펜션즈 포 더 포뮬레이션 오브 푸얼리 솔러블 드러그즈(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)", 독일, 사이언티픽 퍼블리셔스 슈투트가르트(Scientific Publishers Stuttgart), 1998년, p.267-294 참조] 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물 중의 복합체의 크기는, 평균 입자경이 약 5 ㎚∼200 ㎚인 것이 바람직하고, 약 20 ㎚∼150 ㎚인 것이 보다 바람직하며, 약 30 ㎚∼100 ㎚인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물(복합체를 봉입하는 지질막)의 크기는, 평균 입자경이 약 10 ㎚∼300 ㎚인 것이 바람직하고, 약 30 ㎚∼200 ㎚인 것이 보다 바람직하며, 약 50 ㎚∼150 ㎚인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물 중의 복합체 또는 복합체를 봉입하는 지질막의 평균 입자경은, 예컨대 동적 광산란법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 조성물을, 포유동물의 세포에 도입함으로써, 본 발명의 조성물 중의 핵산을 세포 내에 도입할 수 있다.
생체 내에 있어서의 본 발명의 조성물의 포유동물의 세포에 대한 도입은, 생체 내에 있어서 행할 수 있는 공지된 트랜스펙션의 절차에 따라 행하면 좋다. 예컨대, 본 발명의 조성물을, 사람을 포함하는 포유동물에게 정맥내 투여함으로써, 예컨대 종양 또는 염증이 생긴 장기 또는 부위에 송달되고, 송달 장기 또는 부위의 세포 내에 본 발명의 조성물 중의 핵산을 도입할 수 있다. 종양 또는 염증이 생긴 장기 또는 부위로는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 위, 대장, 간장, 폐, 비장, 췌장, 신장, 방광, 피부, 혈관, 안구 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을, 사람을 포함하는 포유동물에게 정맥내 투여함으로써, 예컨대 간장, 폐, 비장 및/또는 신장에 송달되며, 송달 장기 또는 부위의 세포 내에 본 발명의 조성물 중의 핵산을 도입할 수 있다. 간장, 폐, 비장 및/또는 신장의 세포는, 정상 세포, 종양 혹은 염증에 관련된 세포 또는 그 밖의 질환에 관련된 세포 중 어느 것이라도 좋다.
본 발명의 조성물 중의 핵산이, RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산이라면, 생체 내에서 포유동물의 세포 내에, 표적 유전자의 발현을 억제하는 상기 핵산 등을 도입할 수 있고, 표적 유전자의 발현의 억제를 할 수 있다. 투여 대상은, 사람인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서의 표적 유전자가, 예컨대 간장, 폐, 신장 또는 비장에서 발현되는 유전자, 바람직하게는 간장에서 발현되는 유전자라면, 본 발명의 조성물을, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제 또는 예방제, 바람직하게는 간장에 관련된 질환의 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은, 상기 설명한 본 발명의 조성물을 포유동물에게 투여하는 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료 방법도 제공한다. 투여 대상은, 사람인 것이 바람직하고, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환에 걸린 사람이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 조성물은, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제 또는 예방제에 관한 생체 내의 약효 평가 모델에 있어서, 표적 유전자를 억제하는 것의 유효성을 검증하기 위한 툴로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 조성물은, 예컨대 혈액 성분 등의 생체 성분(예컨대 혈액, 소화관 등) 중에서의 상기 핵산의 안정화, 부작용의 저감 또는 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에 대한 약제 집적성의 증대 등을 목적으로 하는 제제로서도 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을, 의약품의 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환 등의 치료제 또는 예방제로서 사용하는 경우, 투여 경로로는, 치료시에 가장 효과적인 투여 경로를 사용하는 것이 바람직하고, 예컨대 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여 또는 경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥내 투여 또는 근육내 투여를 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여량은, 투여 대상의 병의 증상이나 연령, 투여 경로 등에 따라 상이하지만, 예컨대 핵산으로 환산한 1일 투여량이 약 0.1 ㎍∼1000 ㎎이 되도록 투여하면 좋다.
정맥내 투여 또는 근육내 투여에 적당한 제제로는, 예컨대 주사제를 들 수 있고, 전술한 방법에 의해 조제한 조성물의 분산액을 그대로 예컨대 주사제 등의 형태로서 이용하는 것도 가능하지만, 상기 분산액으로부터 예컨대 여과, 원심분리 등에 의해 용매를 제거하여 사용할 수도 있고, 상기 분산액을 동결 건조하여 사용하거나 및/또는 예컨대 만니톨, 락토오스, 트레할로오스, 말토오스 혹은 글리신 등의 부형제를 첨가한 분산액을 동결 건조하여 사용할 수도 있다.
주사제의 경우, 상기한 조성물의 분산액 또는 상기한 용매를 제거 또는 동결 건조한 조성물에, 예컨대 물, 산, 알칼리, 여러 가지 완충액, 생리 식염수 또는 아미노산 수액 등을 혼합하여 주사제를 조제하는 것이 바람직하다. 또한, 예컨대 시트르산, 아스코르브산, 시스테인 혹은 EDTA 등의 항산화제 또는 글리세린, 포도당 혹은 염화나트륨 등의 등장화제 등을 첨가하여 주사제를 조제하는 것도 가능하다. 또한, 예컨대 글리세린 등의 동결 보존제를 첨가하여 동결 보존할 수도 있다.
다음에, 실시예, 참고예 및 시험예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예, 참고예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 실시예 및 참고예에 나타낸 프로톤 핵자기 공명 스펙트럼(1H NMR)은, 270 MHz, 300 MHz, 400 MHz 또는 500 MHz로 측정된 것으로서, 화합물 및 측정 조건에 따라서는 교환성 프로톤이 명료하게는 관측되지 않는 경우가 있다. 또한, 시그널의 다중도의 표기로는 통상 이용되는 것을 이용하고 있다.
참고예 1
2,2-비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]프로판-1,3-디올(화합물 IIc-1)
말론산디메틸(도쿄카세이고교사 제조, 0.50 g, 3.78 mmol)을 테트라히드로푸란(20 ㎖)에 용해시키고, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(뉴체크 프렙 잉크(Nu-Chek Prep, Inc)사 제조, 3.26 g, 9.46 mmol), 수소화나트륨(나카라이테스크사 제조, 유성 60%, 0.454 g, 11.4 mmol) 및 요오드화테트라부틸암모늄(와코쥰야쿠고교사 제조, 0.280 g, 0.757 mmol)을 첨가하여 70℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여, 수층을 헵탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 쇼트 컬럼으로 정제함으로써 2,2-비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]말론산디메틸의 조(粗)생성물을 얻었다.
얻어진 조생성물을 테트라히드로푸란(4 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 수소화알루미늄리튬(도쿄카세이고교사 제조, 0.826 g, 21.8 mmol)을 첨가하여 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물(0.75 ㎖), 15% 수산화나트륨 수용액(0.75 ㎖) 물(2.25 ㎖)을 순차 첨가하고, 반응을 정지시켰다. 생성된 불용물을 여과함으로써 제거하였다. 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헵탄/아세트산에틸=80/20)로 정제함으로써, 화합물 IIc-1(1.51 g, 수율 70%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 573(M+H)+
실시예 1
1-메틸-3,3-비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]아제티딘(화합물 1)
공정 1
참고예 1에서 얻어지는 화합물 IIc-1(1.00 g, 1.75 mmol)을 디클로로메탄(5 ㎖)에 용해시키고, 피리딘(와코쥰야쿠고교사 제조, 1.41 ㎖, 17.5 mmol) 및 디메틸아미노피리딘(나카라이테스크사 제조, 0.0210 g, 0.175 mmol)을 첨가하였다. 빙냉 하, 무수 트리플루오로메탄술폰산(나카라이테스크사 제조, 0.855 ㎖, 5.24 mmol)을 첨가하여, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 헵탄으로 3회 추출하였다. 유기층을 염화암모늄 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 농축함으로써, 2,2-비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]프로판-1,3-디일 비스(트리플루오로메탄술포네이트)의 조생성물(1.50 g, 수율 100%)을 얻었다.
공정 2
공정 1에서 얻어지는 조생성물(0.500 g, 0597 mmol)을 N,N-디메틸아세트아미드(3 ㎖)에 용해시키고, 메틸아민(도쿄카세이고교사 제조, 약 9.8 mol/ℓ 메탄올 용액, 3.05 mmol, 29.9 mmol)을 첨가하여, 유욕(oil bath) 상 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 실온까지 냉각시킨 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하여, 헥산으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시켜, 여과하였다. 여과약을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(NH 실리카겔, 헥산/아세트산에틸=100/0∼70/30)로 정제함으로써, 화합물 1(0.32 g, 수율 94%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 568(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=6.8Hz), 1.12-1.38(36H, m), 1.48-1.55(4H, m), 2.05(8H, q, J=6.8Hz), 2.30(3H, s), 2.78(4H, t, J=6.8Hz), 2.93(4H, s), 5.29-5.43(8H, m).
실시예 2
3,3-비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]-1-프로필아제티딘(화합물 2)
공정 1
참고예 1에서 얻어지는 화합물 IIc-1(3.50 g, 6.11 mmol)을 디클로로메탄(15 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하 트리에틸아민(와코쥰야쿠고교사 제조, 2.55 ㎖, 18.3 mmol) 및 메실산클로라이드(도쿄카세이고교사 제조, 1.12 ㎖, 15.3 mmol)를 첨가하여, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하여, 헵탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0∼97/3)로 정제함으로써, 2,2-비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]프로판-1,3-디일 디메탄술포네이트(3.30 g, 수율 74%)를 얻었다.
공정 2
공정 1에서 얻어지는 2,2-비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]프로판-1,3-디일 디메탄술포네이트(0.200 g, 0.274 mmol)를 N,N-디메틸아세트아미드(0.5 ㎖)에 용해시키고, 프로필아민(0.451 ㎖, 5.49 mmol)을 첨가하고, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 130℃에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하여, 헵탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(NH 실리카겔, 헵탄/아세트산에틸=100/0∼80/20)로 정제함으로써, 화합물 2(14.8 ㎎, 수율 9%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 597(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.84-0.92(9H, m), 1.11-1.41(38H, m), 1.49-1.56(4H, m), 2.05(8H, q, J=6.6Hz), 2.36(2H, t, J=7.7Hz), 2.77(4H, t, J=5.9Hz), 2.90(4H, s), 5.27-5.45(8H, m).
실시예 3
3,3-비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]아제티딘(화합물 3)
실시예 1과 동일한 방법으로, 메틸아민 대신에 암모니아(시그마알드리치(Sigma-Aldrich)사 제조, 약 7 mol/ℓ 메탄올 용액, 4.27 ㎖, 29.9 mmol)를 이용하여, 화합물 3(0.0750 g, 수율 23%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 554(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=7.0Hz), 1.12-1.38(36H, m), 1.53-1.58(4H, m), 2.05(8H, q, J=6.8Hz), 2.78(4H, t, J=6.8Hz), 3.28(4H, s), 5.31-5.41(8H, m).
실시예 4
3-(디메틸아미노)프로필 3,3-비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]아제티딘-1-카르복실레이트(화합물 4)
실시예 3에서 얻어진 화합물 3을 아세토니트릴(2 ㎖)에 용해시키고, "저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(J. Am. Chem. Soc.)", 1981년, 제103권, p.4194-4199 기재의 방법에 준한 방법으로 합성한 3-(디메틸아미노)프로필 4-니트로페닐카르보네이트 염산염(화합물 VII-1)(0.0620 g, 0.203 mmol) 및 트리에틸아민(0.0570 ㎖, 0.406 mmol)을 첨가하여, 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 아세트산에틸로 희석하고, 물로 세정하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하고, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(NH 실리카겔, 헥산/아세트산에틸=80/20)로 정제함으로써, 화합물 4(0.0580 g, 수율 63%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 683(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=6.8Hz), 1.13-1.22(4H, m), 1.25-1.39(32H, m), 1.49-1.55(4H, m), 1.73-1.81(2H, m), 2.05(8H, q, J=6.8Hz), 2.22(6H, s), 2.33(2H, t, J=7.6Hz), 2.77(4H, t, J=6.8Hz), 3.58(4H, s), 4.08(2H, t, J=6.5Hz), 5.29-5.42(8H, m).
참고예 2
2,2-비스[(Z)-옥타데카-9-엔-1-일]프로판-1,3-디올(화합물 IIc-2)
참고예 1과 동일한 방법으로, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트 대신에 (Z)-옥타데카-9-엔-1-일 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 4.50 g, 13.0 mmol)를 이용하여, 화합물 IIc-2(1.06 g, 수율 35%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 577(M+H)+
실시예 5
1-메틸-3,3-비스[(Z)-옥타데카-9-엔-1-일]아제티딘(화합물 5)
실시예 1과 동일한 방법으로, 참고예 1에서 얻어지는 화합물 IIc-1 대신에 참고예 2에서 얻어지는 화합물 IIc-2(0.300 g, 0.520 mmol)를 이용하여, 화합물 5(0.272 g, 수율 92%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 572(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(6H, t, J=6.8Hz), 1.14-1.35(48H, m), 1.50-1.53(4H, m), 2.02(8H, q, J=6.8Hz), 2.31(3H, s), 2.94(4H, s), 5.31-5.39(4H, m).
참고예 3
2,2-비스[(Z)-헥사데카-9-엔-1-일]프로판-1,3-디올(화합물 IIc-3)
참고예 1과 동일한 방법으로, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트 대신에 (Z)-헥사데카-9-엔-1-일 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 5.00 g, 15.7 mmol)를 이용하여, 화합물 IIc-3(2.07 g, 수율 59%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 521(M+H)+
실시예 6
3,3-비스[(Z)-헥사데카-9-엔-1-일]-1-메틸아제티딘(화합물 6)
실시예 1과 동일한 방법으로, 참고예 1에서 얻어지는 화합물 IIc-1 대신에 참고예 3에서 얻어지는 화합물 IIc-3(0.300 g, 0.576 mmol)을 이용하여, 화합물 6(0.263 g, 수율 89%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 516(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=6.8Hz), 1.14-1.35(40H, m), 1.50-1.53(4H, m), 2.02(8H, q, J=6.8Hz), 2.31(3H, s), 2.94(4H, s), 5.31-5.39(4H, m).
참고예 4
2,2-비스[(11Z,14Z)-이코사-11,14-디엔-1-일]프로판-1,3-디올(화합물 IIc-4)
참고예 1과 동일한 방법으로, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트 대신에 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디엔-1-일메탄 술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 5.00 g, 13.4 mmol)를 이용하여, 화합물 IIc-4(2.07 g, 수율 59%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 629(M+H)+
실시예 7
3,3-비스[(11Z,14Z)-이코사-11,14-디엔-1-일]-1-메틸아제티딘(화합물 7)
실시예 1과 동일한 방법으로, 참고예 1에서 얻어지는 화합물 IIc-1 대신에 참고예 4에서 얻어지는 화합물 IIc-4(0.300 g, 0.477 mmol)를 이용하여, 화합물 7(0.256 g, 수율 86%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 624(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=6.4Hz), 1.16-1.37(44H, m), 1.50-1.54(4H, m), 2.05(8H, q, J=6.8Hz), 2.31(3H, s), 2.78(4H, t, J=6.4Hz), 2.94(4H, s), 5.30-5.42(8H, m).
실시예 8
3-(3,3-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아제티딘-1-일)프로판-1-올(화합물 8)
실시예 1과 동일한 방법으로, 메틸아민 대신에 3-아미노프로판-1-올 (도쿄카세이고교사 제조, 0.468 ㎖, 6.16 mmol)을 이용하여, 화합물 8(0.237 g, 수율 63%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 613(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=6.8Hz), 1.13-1.39(40H, m), 1.50-1.56(2H, m), 2.05(8H, q, J=6.8Hz), 2.69(2H, t, J=5.4Hz), 2.77(4H, t, J=6.3Hz), 2.93(4H, s), 3.75(2H, t, J=5.4Hz), 5.27-5.44(8H, m).
실시예 9
2-(3,3-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아제티딘-1-일)에탄-1-올(화합물 9)
실시예 2와 동일한 방법으로, 메틸아민 대신에 2-아미노에탄올(도쿄카세이고교사 제조, 0.800 g, 13.1 mmol)을 이용하여, 화합물 9(0.012 g, 수율 13%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 598(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=6.8Hz), 1.14-1.42(40H, m), 2.05(8H, q, J=6.5Hz), 2.59(2H, t, J=5.3Hz), 2.77(4H, t, J=5.9Hz), 2.96(4H, s), 3.48(2H, t, J=5.3Hz), 5.28-5.44(8H, m).
참고예 5
2-데실-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)프로판-1,3-디올(화합물 IIc-5)
공정 1
말론산디메틸(0.400 g, 3.03 mmol)을 아세토니트릴(10 ㎖)에 용해시키고, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(1.25 g, 3.63 mmol), 탄산세슘(와코쥰야쿠고교사 제조, 1.97 g, 6.06 mmol) 및 요오드화테트라부틸암모늄(1.34 g, 3.63 mmol)을 첨가하여, 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 헥산으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=90/10)로 정제함으로써 디메틸 2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)말로네이트(0.800 g, 수율 69%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 381(M+H)+;
공정 2
공정 1에서 얻어진 디메틸 2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)말로네이트(0.400 g, 1.05 mmol)를 테트라히드로푸란(2 ㎖)에 용해시키고, 1-브로모데칸(도쿄카세이고교사 제조, 0.326 g, 1.58 mmol), 수소화나트륨(유성 60%, 0.063 g, 1.58 mmol) 및 요오드화테트라부틸암모늄(0.280 g, 0.757 mmol)을 첨가하여, 70℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 헥산으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 감압 농축함으로써, 디메틸 2-데실-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)말로네이트의 조생성물을 얻었다.
얻어진 조생성물을 테트라히드로푸란(3 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 수소화알루미늄리튬(0.122 g, 3.23 mmol)을 첨가하여, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물(0.1 ㎖), 15% 수산화나트륨 수용액(0.1 ㎖), 물(0.3 ㎖)을 순차 첨가하고, 반응을 정지시켰다. 생성된 불용물을 여과함으로써 제거하였다. 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=90/10∼50/50)로 정제함으로써, 화합물 IIc-5(0.265 g, 수율 53%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 465(M+H)+
실시예 10
3-데실-1-메틸-3-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아제티딘(화합물 10)
실시예 1과 동일한 방법으로, 참고예 1에서 얻어지는 화합물 IIc-1 대신에 참고예 5에서 얻어지는 화합물 IIc-5(0.265 g, 0.570 mmol)를 이용하여, 화합물 10(0.206 g, 수율 79%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 460(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.84-0.93(6H, m), 1.11-1.40(34, m), 1.50-1.55(4H, m), 2.05(4H, q, J=6.8Hz), 2.30(3H, s), 2.77(2H, t, J=6.5Hz), 2.93(4H, s), 5.29-5.43(4H, m).
실시예 11
3-(3,3-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아제티딘-1-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민(화합물 11)
실시예 1과 동일한 방법으로, 메틸아민 대신에 N,N-디메틸-1,3-프로판디아민(도쿄카세이고교사 제조, 0.427 ㎖, 4.18 mmol)을 이용하여, 화합물 11(0.091 g, 수율 34%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 639(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.86(6H, t, J=7.0Hz), 1.08-1.18(4H, m), 1.21-1.38(32H, m), 1.56-1.60(4H, m), 1.61-1.69(2H, m), 2.01(8H, q, J=6.8Hz), 2.21(6H, s), 2.31(2H, t, J=7.1Hz), 2.65-2.72(2H, m), 2.75(4H, t, J=6.7Hz), 3.20(4H, s), 5.25-5.40(8H, m).
실시예 12
2-(3,3-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아제티딘-1-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민(화합물 12)
실시예 1과 동일한 방법으로, 메틸아민 대신에 N,N-디메틸에틸렌디아민(도쿄카세이고교사 제조, 0.709 ㎖, 6.51 mmol)을 이용하여, 화합물 12(0.312 g, 수율 77%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 625(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=7.0Hz), 1.11-1.20(4H, m), 1.23-1.39(32H, m), 1.49-1.55(4H, m), 2.05(8H, q, J=6.8Hz), 2.21(6H, s), 2.22-2.26(2H, m), 2.52-2.58(2H, m), 2.77(4H, t, J=6.7Hz), 2.93(4H, s), 5.28-5.43(8H, m).
참고예 6
2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-2-옥타데실프로판-1,3-디올(화합물 IIc-6)
참고예 5와 동일한 방법으로, 1-브로모데칸 대신에 1-브로모옥타데칸(도쿄카세이고교사 제조, 0.394 g, 1.18 mmol)을 이용하여, 화합물 IIc-6(0.186 g, 통과 수율 28%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 577(M+H)+
실시예 13
1-메틸-3-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-3-옥타데실아제티딘(화합물 13)
실시예 1과 동일한 방법으로, 참고예 1에서 얻어지는 화합물 IIc-1 대신에 참고예 6에서 얻어지는 화합물 IIc-6(0.186 g, 0.322 mmol)을 이용하여, 화합물 13(0.030 g, 수율 16%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 572(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.84-0.90(6H, m), 1.10-1.22(4H, m), 1.23-1.38(46H, m), 1.56-1.62(4H, m), 2.04(4H, q, J=6.8Hz), 2.51(3H, s), 2.76(2H, t, J=6.7Hz), 3.25(4H, s), 5.28-5.42(4H, m).
참고예 7
1-((2-니트로페닐)술포닐)-3,3-비스(2-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)에틸)아제티딘(화합물 XIIIf-1)
공정 1
국제 공개 제2012/108397호에 기재된 방법으로 합성한 2-((9Z,12)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)에탄올(2.30 g, 7.41 mmol)을 디클로로메탄(20 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하 트리에틸아민(1.55 ㎖, 11.1 mmol), 2-니트로벤젠-1-술포닐클로라이드(2.13 g, 9.63 mmol)를 첨가하여, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=90/10)로 정제함으로써 2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)에틸 2-니트로벤젠술포네이트(1.93 g, 수율 53%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 496(M+H)+
공정 2
공정 1에서 얻어진 2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)에틸 2-니트로벤젠술포네이트(1.93 g, 3.89 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(8 ㎖)에 용해시키고, 2-시아노아세트산에틸(도쿄카세이고교사 제조, 0.189 ㎖, 1.77 mmol), 탄산세슘(1.73 g, 5.30 mmol)을 첨가하여, 100℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 헥산으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 감압 농축함으로써 에틸 2-시아노-4-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)-2-(2-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)에틸)부타노에이트의 조생성물을 얻었다.
얻어진 조생성물을 테트라히드로푸란(8 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 수소화알루미늄리튬(0.239 g, 6.30 mmol)을 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물(0.24 ㎖), 15% 수산화나트륨 수용액(0.24 ㎖), 물(0.72 ㎖)을 순차 첨가하고, 반응을 정지시켰다. 생성된 불용물을 여과함으로써 제거하였다. 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=99/1∼50/50)로 정제함으로써, 2-(아미노에틸)-4-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)-2-(2-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)에틸)부탄-1-올(0.350 g, 수율 34%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 660(M+H)+
공정 3
공정 2에서 얻어지는 2-(아미노에틸)-4-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)-2-(2-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)에틸)부탄-1-올 (0.53 g, 0.803 mmol을 디클로로메탄(4 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 트리에틸아민(0.168 ㎖, 1.20 mmol), 2-니트로벤젠-1-술포닐클로라이드(0.231 g, 1.04 mmol)를 첨가하여, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 헥산으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 농축함으로써 N-(2-(히드록시메틸)-4-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)-2-(2-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)에틸)부틸)-2-니트로벤젠술폰아미드의 조생성물을 얻었다.
얻어진 조생성물을 테트라히드로푸란(4 ㎖)에 용해시키고, 트리페닐포스핀(나카라이테스크사 제조, 0.340 g, 1.30 mmol), 아조디카르복실산디이소프로필(도쿄카세이고교사 제조, 40% 톨루엔 용액, 1.9 mol/ℓ, 0.682 ㎖, 1.30 mmol)을 첨가하여, 실온에서 15분간 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 헥산으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=95/5∼70/30)로 정제함으로써, 화합물 XIIIf-1(0.585 g, 수율 82%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 827(M+H)+
실시예 14
3,3-비스(2-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)에틸)아제티딘(화합물 14)
참고예 7에서 얻어진 화합물 XIIIf-1(0.585 g, 0.707 mmol)을 아세토니트릴(7 ㎖)에 용해시키고, 1-도데칸티올(도쿄카세이고교사 제조, 0.412 ㎖, 1.77 mmol), 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(나카라이테스크사 제조, 0.246 ㎖, 1.77 mmol)을 첨가하여, 70℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 헥산으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 NH 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=99/1∼30/70)로 정제함으로써, 화합물 14(0.045 g, 수율 10%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 642(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=7.0Hz), 1.24-1.39(32H, m), 1.50-1.57(4H, m), 1.91(4H, t, J=7.0Hz), 2.05(8H, q, J=6.9Hz), 2.77(4H, t, J=6.6Hz), 3.38(4H, t, J=6.7Hz), 3.41(4H, s), 3.46(4H, t, J=7.0Hz), 5.28-5.44(8H, m).
실시예 15
1-메틸-3,3-비스(2-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)에틸)아제티딘(화합물 15)
실시예 14에서 얻어지는 화합물 14(0.134 g, 0.209 mmol)를 1,2-디클로로에탄(1 ㎖)과 메탄올(1 ㎖)에 용해시키고, 포름알데히드(와코쥰야쿠고교사 제조, 37% 수용액, 0.076 ㎖, 1.04 mmol), 나트륨트리아세톡시보로하이드라이드(도쿄카세이고교사 제조, 0.111 g, 0.522 mmol)를 첨가하여, 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 수층을 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하고, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 NH 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=90/10)로 정제함으로써, 화합물 15(0.088 g, 수율 64%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 656(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=6.8Hz), 1.24-1.40(32H, m), 1.49-1.57(4H, m), 1.87(4H, t, J=6.8Hz), 2.05(8H, q, J=6.9Hz), 2.30(3H, s), 2.77(4H, t, J=6.3Hz), 3.04(4H, s), 3.37(4H, t, J= 6.7Hz), 3.44(4H, t, J=7.0Hz), 5.28-5.44(8H, m).
참고예 8
1-((2-니트로페닐)술포닐)-3,3-비스(3-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)프로필)아제티딘(화합물 XIIIf-2)
공정 1
(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(10.0 g, 29.0 mmol)를 1,4-디옥산(20 ㎖)에 용해시키고, 1,3-프로판디올(와코쥰야쿠고교사 제조, 55.2 g, 726 mmol)을 첨가하여, 가열 환류 하에 2일간 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=90/10)로 정제함으로써, 3-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)프로판-1-올(4.96 g, 수율 53%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 324(M+H)+;
공정 2
공정 1에서 얻어진 3-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)프로판-1-올(4.95 g, 15.3 mmol)을 디클로로메탄(20 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 트리에틸아민(4.25 ㎖, 30.5 mmol), 메실산클로라이드(2.36 ㎖, 30.5 mmol)를 첨가하여, 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=90/10)로 정제함으로써, 3-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)프로필 메탄술포네이트(5.47 g, 수율 89%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 403(M+H)+;
공정 3
참고예 7의 공정 2, 공정 3과 동일한 방법으로, 2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)에틸 2-니트로벤젠술포네이트 대신에 공정 2에서 얻어진 3-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)프로필 메탄술포네이트(1.57 g, 3.89 mmol)를 이용하여, 화합물 XIIIf-2(0.109 g, 통과 수율 7.6%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 855(M+H)+;
실시예 16
3,3-비스(3-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)프로필)아제티딘(화합물 16)
실시예 14와 동일한 방법으로, 화합물 XIIIf-1 대신에 화합물 XIIIf-2(0.109 g, 0.135 mmol)를 이용하여, 화합물 16(0.062 g, 수율 69%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 670(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=7.0Hz), 1.22-1.40(32H, m), 1.44-1.67(12H, m), 2.05(8H, q, J=6.8Hz), 2.77(4H, t, J=6.7Hz), 3.31(4H, s), 3.39(8H, t, J=6.7Hz), 5.28-5.45(8H, m).
실시예 17
1-메틸-3,3-비스(3-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)프로필)아제티딘(화합물 17)
실시예 15와 동일한 방법으로, 화합물 14 대신에 화합물 16(0.062 g, 0.093 mmol)을 이용하여, 화합물 17(0.056 g, 수율 88%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 684(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=6.8Hz), 1.23-1.40(32H, m), 1.42-1.62(12H, m), 2.05(8H, q, J=6.9Hz), 2.31(3H, s), 2.77(4H, t, J=6.7Hz), 2.96(4H, s), 3.35-3.43(8H, m), 5.25-5.47(8H, m).
실시예 18
2-디메틸-3,3-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아제티딘(화합물18)
공정 1
시아노아세트산에틸(2.00 g, 17.7 mmol)을 아세토니트릴(50 ㎖)에 용해시키고, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(13.4 g, 38.9 mmol), 탄산세슘(17.3 g, 53.1 mmol)을 첨가하여, 60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 헥산으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 감압 농축함으로써, 에틸(11Z,14Z)-2-시아노-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)이코사-11,14-디에노에이트의 조생성물을 얻었다.
얻어진 조생성물을 테트라히드로푸란(5 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 수소화알루미늄리튬(2.49 g, 65.6 mmol)을 첨가하여, 30분간 교반하였다. 반응 혼합물에 물(2.5 ㎖), 15% 수산화나트륨 수용액(2.5 ㎖), 물(7.5 ㎖)을 순차 첨가하고, 반응을 정지시켰다. 생성된 불용물을 여과함으로써 제거하였따. 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=99/1∼90/10)로 정제함으로써, (11Z,14Z)-2-(아미노에틸)-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)이코사-11,14-디엔-1-올(2.50 g, 수율 25%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 572(M+H)+
공정 2
공정 1에서 얻어진(11Z,14Z)-2-(아미노에틸)-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)이코사-11,14-디엔-1-올(2.50 g, 4.37 mmol)을 테트라히드로푸란(20 ㎖)에 용해시키고, 트리에틸아민(1.83 ㎖.1 mmol), 이탄산 tert-부틸(와타나베카가쿠사 제조, 1.12 ㎖, 4.81 mmol)을 첨가하여, 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=95/5)로 정제함으로써, tert-부틸((11Z,14Z)-2-(히드록시메틸)-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)이코사-11,14-디엔-1-일)카르바메이트(2.65 g, 수율 90%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 672(M+H)+
공정 3
공정 2에서 얻어진 tert-부틸((11Z,14Z)-2-(히드록시메틸)-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)이코사-11,14-디엔-1-일)카르바메이트(2.10 g, 3.12 mmol)를 디클로로메탄(10 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 데스마틴 시약(도쿄카세이고교사 제조, 1.72 g, 4.06 mmol)을 첨가하여,실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 헥산으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 하에 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=100/0∼80/20)로 정제함으로써, tert-부틸((11Z,14Z)-2-포르밀-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)이코사-11,14-디엔-1-일)카르바메이트(2.00 g, 수율 96%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 670(M+H)+
공정 4
공정 3에서 얻어진 tert-부틸((11Z,14Z)-2-포르밀-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)이코사-11,14-디엔-1-일)카르바메이트(0.432 g, 0.645 mmol)를 테트라히드로푸란(2 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 메틸마그네슘브로마이드(간토카가쿠고교사 제조, mol/ℓ, 0.258 ㎖, 0.774 mmol)를 첨가하였다. 그 후 -50℃까지 냉각시키고, 메틸마그네슘브로마이드(3 mol/ℓ, 0.150 ㎖, 0.451 mmol)를 첨가하여, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=95/5∼50/50)로 정제함으로써, tert-부틸((11Z,14Z)-2-(1-히드록시에틸)-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)이코사-11,14-디엔-1-일)카르바메이트(0.200 g, 수율 45%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 686(M+H)+
공정 5
공정 4에서 얻어지는 tert-부틸((11Z,14Z)-2-(1-히드록시에틸)-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)이코사-11,14-디엔-1-일)카르바메이트(0.290 g, 0.423 mmol)를 디클로로메탄(2 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 피리딘(0.171 ㎖, 2.11 mmol), 메실산클로라이드(0.049 ㎖, 0.634 mmol)를 첨가하여, 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(0.171 ㎖, 2.11 mmol), 메실산클로라이드(0.098 ㎖, 1.27 mmol)를 차례로 더 첨가하여, 반응을 완결시켰다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 수층을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하였다. 얻어진 여과액을 감압 농축함으로써, (12Z,15Z)-3-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)메틸)-3-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)헨이코사-12,15-디엔-2-일 메탄술포네이트의 조생성물을 얻었다.
얻어진 조생성물을 N,N-디메틸포름아미드(8 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 수소화나트륨(유성 60%, 8 ㎎, 0.335 mmol)을 첨가하였다. 그 후, 50℃에서 1시간 동안 교반하고, 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, 수층을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=95/5∼50/50)로 정제함으로써, tert-부틸 2-메틸-3,3-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아제티딘-1-카르복실레이트(0.070 g, 수율 31%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 668(M+H)+
공정 6
공정 5에서 얻어지는 tert-부틸 2-메틸-3,3-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아제티딘-1-카르복실레이트(0.090 g, 0.135 mmol)를 디클로로메탄(2 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 트리플루오로아세트산(0.500 ㎖, 6.49 mmol)을 첨가하여, 0℃에서 30분간 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하고, 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 NH 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0∼90/10)로 정제함으로써, 화합물 18(0.030 g, 수율 39%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 568(M+H)+;
실시예 19
1,2-디메틸-3,3-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아제티딘(화합물 19)
실시예 15와 동일한 방법으로, 화합물 14 대신에 화합물 18(0.030 g, 0.053 mmol)을 이용하여, 화합물 19(0.020 g, 수율 65%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 582(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=6.8Hz), 1.03(3H, d, J=6.6Hz), 1.07-1.65(40H, m), 2.05(8H, q, J=6.8Hz), 2.27(3H, s), 2.39(1H, d, J=6.8Hz), 2.69-2.81(5H, m), 3.21(1H, d, J=6.6Hz), 5.28-5.44(8H, m).
참고예 9
2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)메틸)프로판-1,3-디올(화합물 IIc-7)
공정 1
참고예 5와 동일한 방법으로, 1-브로모데칸 대신에 2-(클로로메톡시)에틸트리메틸실란(0.210 ㎖, 1.18 mmol)을 이용함으로써, 2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)프로판-1,3-디올(0.312 g, 통과 수율 87%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 455(M+H)+
공정 2
공정 1에서 얻어진 2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)프로판-1,3-디올(0.312 g, 0.686 mmol)을 테트라히드로푸란(4 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하에 수소화나트륨(유성 60%, 0.063 g, 1.58 mmol) 및 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(0.355 g, 1.03 mmol)를 첨가하여, 60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, 수층을 헥산으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 하에 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=99/1∼70/30)로 정제함으로써 (11Z,14Z)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)메틸)-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)이코사-11,14-디엔-1-올(0.230 g, 수율 48%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 703(M+H)+
공정 3
공정 2에서 얻어진 (11Z,14Z)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)메틸)-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)이코사-11,14-디엔-1-올 (0.230 g, 0.327 mmol)을 디클로로메탄(2 ㎖)에 용해시키고, 빙냉 하 삼불화붕소디에틸에테르 착체(도쿄카세이고교사 제조, 0.207 ㎖, 1.64 mmol)를 첨가하여, 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 수층을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여, 감압 하에 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=99/1∼50/50)로 정제함으로써 화합물 IIc-7(0.150 g, 수율 76%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 603(M+H)+
실시예 20
1-메틸-3-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-3-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)메틸)아제티딘(화합물 20)
실시예 1과 동일한 방법으로, 참고예 1에서 얻어지는 화합물 IIc-1 대신에 참고예 8에서 얻어지는 화합물 IIc-7(0.140 g, 0.232 mmol)을 이용하여, 화합물 20(0.080 g, 수율 58%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 598(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(6H, t, J=7.0Hz), 1.17-1.40(34H, m), 1.52-1.61(4H, m), 2.02-2.08(8H, m), 2.30(3H, s), 2.77(4H, t, J=6.6Hz), 2.90(2H, d, J=7.6Hz), 3.10(2H, d, J=7.6Hz), 3.39-3.45(4H, m), 5.27-5.44(8H, m).
실시예 21
실시예 1에서 얻어진 화합물 1을 이용하여, 이하와 같이 조성물을 조제하였다. 이용한 핵산은, 센스쇄[5'-rGrGrAfUfCrAfUfCfUfCrArArGfUfCfUfUrAfCdTdT-3'(r, d 및 f가 붙여진 염기에 결합하는 당은 각각 리보오스, 데옥시리보오스 및 2' 위치의 수산기가 불소로 치환되어 있는 리보오스이며, 5' 말단측에서 3' 말단측을 향해 20번째의 염기에 결합하는 데옥시리보오스와 21번째의 염기에 결합하는 데옥시리보오스와의 결합이 포스포로티오에이트 결합임)]와, 안티센스쇄[5'-rGfUrArArGrAfCfUfUrGrArGrAfUrGrAfUfCfCdTdT-3'(r, d 및 f가 붙여진 염기에 결합하는 당은 각각 리보오스, 데옥시리보오스 및 2' 위치의 수산기가 불소로 치환되어 있는 리보오스이며, 5' 말단측에서 3' 말단측을 향해 20번째의 염기에 결합하는 데옥시리보오스와 21번째의 염기에 결합하는 데옥시리보오스와의 결합이 포스포로티오에이트 결합임)]로 이루어지는, 혈액 응고제 7인자(Blood Coagulation Factor VII, 이하 f7이라 표시함) 유전자의 발현을 억제하는 항f7 siRNA이며, 진 디자인사에서 입수하였다(이하 f7 siRNA-1이라 함). 핵산은 증류수로 24 ㎎/㎖로 조제하여 이용하였다.
화합물 1/PEG-DMPE Na(니치유사 제조)=57.3/5.52 mmol/ℓ가 되도록 각 시료를 칭량하고, 염산 및 에탄올을 함유하는 수용액에 현탁시켜, vortex 교반 믹서로 교반 및 가온을 반복하여 균일한 현탁액을 얻었다. 이 현탁액을 실온 하에서, 0.05 ㎛의 폴리카보네이트 멤브레인 필터에 통과시켜, 화합물 1/PEG-DMPE Na의 입자(리포솜)의 분산액을 얻었다. 입자경 측정 장치로 얻어진 리포솜의 평균 입자경을 측정하고, 30 ㎚∼100 ㎚의 범위 내인 것을 확인하였다. 얻어진 리포솜의 분산액과, f7 siRNA-1 용액을, 리포솜의 분산액:f7 siRNA-1 용액=3:1의 비율로 혼합하고, 3배량의 증류수를 더 첨가하여 혼합함으로써 화합물 1/PEG-DMPE Na/f7 siRNA-1 복합체의 분산액을 조제하였다.
한편, 화합물 1/PEG-DMPE Na(니치유사 제조)/DSPC(니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=8.947/0.147/5.981/14.355 mmol/ℓ가 되도록, 각 시료를 칭량하여 에탄올에 용해시켜, 지질막 구성 성분의 용액을 조제하였다.
얻어진 지질막 구성 성분의 용액을, 얻어진 화합물 1/PEG-DMPE Na/f7 siRN-1 복합체의 분산액과, 1:1의 비율로 혼합하고, 수배량의 증류수를 더 혼합하여, 조(粗)제제를 얻었다.
얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축한 후, 생리 식염수로 희석하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과하였다. 얻어진 조성물의 siRNA 농도를 측정하고, 투여 농도에 맞춰 생리 식염수를 이용하여 희석함으로써, 제제(화합물 1 및 f7 siRNA-1을 함유하는 조성물)를 얻었다.
실시예 22
실시예 2 및 4∼7에서 얻어진 화합물인 화합물 2 및 4∼7을 각각 이용하여, 실시예 21과 동일하게 하여 제제(화합물 2 및 4∼7의 각각 및 f7 siRNA-1을 함유하는 조성물)를 얻었다.
실시예 21 및 22에서 얻어진 제제(조성물)의 평균 입자경을 입자경 측정 장치로 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
Figure pct00039
실시예 23
실시예 21에서 이용한 f7 siRNA-1을, 센스쇄가 5'-CCCUGUCUUGGUUUCAAUUAA -3'(염기에 결합하는 당은 전부 리보오스)이며, 안티센스쇄가 5'-AAUUGAAACCAAGACAGGGUG-3'(염기에 결합하는 당은 전부 리보오스. 5' 말단은 인산기로 수식되어 있다.)인 f7 siRNA-2로 변경하고, 실시예 21과 동일한 방법으로 제제를 조제하였다.
비교예 1
화합물 1을, 특허문헌 3에 기재된 방법에 준한 방법으로 합성한 1-메틸-3,3-비스{[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]메틸}아제티딘(화합물 A)으로 한 것 이외에, 실시예 23과 동일한 방법으로 제제를 조제하였다.
실시예 23와 비교예 1에서 얻어진 제제(조성물)의 평균 입자경을 입자경 측정 장치로 측정하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Figure pct00040
시험예 1
실시예 21 및 22에서 얻어진 각 제제(화합물 1, 2, 4∼7의 각각과, f7 siRNA-1을 함유하는 조성물)에 대해서, 각각 이하의 방법에 의해 생체 내 약효 평가 시험을 실시하였다. 또한, 각 제제는 시험에 맞춰 생리 식염수로 희석하여 이용하였다.
마우스(Balb/c, 니혼쿠레아에서 입수)를 순화 사육한 후, 각 제제를, siRNA 농도로 0.03 및/또는 0.3 ㎎/㎏으로 마우스에게 정맥내 투여하였다. 투여로부터 48시간 후에 채혈하고, 채취한 혈액을 미량 고속 냉각 원심기(TOMY MX305: 토미세이코사 제조)를 이용하여 8000 rpm, 8분간, 4℃에서 원심 분리하였다. BIOPHEN VII kit(ANIARA사 제조 cat#: A221304)를 이용하여, 제품의 설명서에 기재된 방법에 따라, 표준액 및 혈장 샘플 중의 흡광도를 ARVO(405 ㎚)로 측정하였다. 얻어진 흡광도로부터 검량선을 작성하고, 혈장 중의 Factor VII 단백 농도를 산출하였다. 또한 예수는 각 군 3마리로 하였다.
산출된 혈장 중의 Factor VII 단백 농도의 결과를 도 1 및 도 2에 나타낸다.
시험예 2
실시예 21 및 22에서 얻어진 각 제제를, 실시예 23 및 비교예 1에서 얻어진 각 제제로 한 이외에, 시험예 1과 동일하게 하여, 시험예 2를 실시하였다.
산출된 혈장 중의 Factor VII 단백 농도의 결과를 도 3에 나타낸다.
도 1 및 도 2로부터 밝혀진 바와 같이, 실시예 21 및 22에서 얻어진 각 제제(화합물 1, 2, 4∼7의 각각과, f7 siRNA-1을 함유하는 조성물)를 투여함으로써, Factor VII 유전자의 발현이 강하게 억제되었다.
또한, 도 3으로부터 밝혀진 바와 같이, 실시예 23에서 얻어진 제제(화합물 1과, f7 siRNA-2를 함유하는 조성물)는, 비교예 1에서 얻어진 제제(화합물 A와 f7 siRNA-2를 함유하는 조성물)보다도 Factor VII 유전자의 발현을 강하게 억제하였다.
따라서, 본 발명의 조성물은, 핵산을 세포 내 등에 도입할 수 있고, 본 발명의 양이온성 지질은, 생체 내에서 세포 내에 핵산을 송달하는 것을 용이하게 하는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물을, 포유동물 등에게 투여함으로써, 상기 핵산을, 예컨대 세포 내 등에 용이하게 도입할 수 있다.
서열표 프리 텍스트
서열번호 1-혈액 응고 제7 인자 siRNA-1 센스쇄
서열번호 2-혈액 응고 제7 인자 siRNA-1 안티센스쇄
서열번호 3-혈액 응고 제7 인자 siRNA-2 센스쇄
서열번호 4-혈액 응고 제7 인자 siRNA-2 안티센스쇄
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Cationic Lipid <130> 1000P12337 <150> JP2014-133913 <151> 2014-06-30 <160> 4 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blood Coagulation Factor VII siRNA -1 sense <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n = uracil <220> <221> modified_base <222> (4)..(5) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (7)..(10) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (14)..(17) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> 5'-phosphorothioated Thymidine <400> 1 ggancancnc aagncnnact t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blood Coagulation Factor VII siRNA -1 antisense <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n = uracil <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (7)..(9) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (17)..(19) <223> 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> 5'-phosphorothioated Thymidine <400> 2 gnaagacnng agangancct t 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blood Coagulation Factor VII siRNA -2 sense <400> 3 cccugucuug guuucaauua a 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blood Coagulation Factor VII siRNA -2 antisense <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5'-O-phosphorylated Adenine <400> 4 nauugaaacc aagacagggu g 21

Claims (28)

  1. 하기 식 (I)로 표시되는 양이온성 지질:
    Figure pct00041

    식 중, R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이하고, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 또는 C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬이며,
    R3은 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 하기 식 (A)
    Figure pct00042

    (식 중, R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R4 및 R5가 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋고, n3은 2∼6의 정수임), 또는 하기 식 (B)
    Figure pct00043

    (식 중, R6 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R6 및 R7이 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋고, n4는 1∼6의 정수임)이며,
    n1은 0∼4의 정수이고, n2는 1∼4의 정수이다(단, n1이 0이고, n2가 1인 경우를 제외함).
  2. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이하고, 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 및 (Z)-도코사-13-에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 양이온성 지질.
  3. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이하고, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 및 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 양이온성 지질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 탄소수 1∼3의 알킬 또는 식 (A)인 양이온성 지질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2는 동일한 것인 양이온성 지질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, n1은 1이고, n2는 1∼3의 정수인 양이온성 지질.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, n1 및 n2는 모두 1인 양이온성 지질.
  8. 하기 식 (I'')로 표시되는 양이온성 지질:
    Figure pct00044

    식 중, R1' 및 R2'은 동일하거나 또는 상이하고, 탄소수 8∼24의 직쇄형 또는 분지형의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 또는 C7-C20 알킬옥시 C1-C3 알킬, C7-C20 알케닐옥시 C1-C3 알킬 혹은 C7-C20 알키닐옥시 C1-C3 알킬이며,
    R3'은 수소 원자, 탄소수 1∼3의 알킬, 히드록시 C2-C4 알킬, C1-C3 디알킬아미노 C2-C4 알킬, 하기 식 (A)
    Figure pct00045

    (식 중, R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나 또는 R4 및 R5가 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋고, n3은 2∼6의 정수임), 또는 하기 식 (B)
    Figure pct00046

    (식 중, R6 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자 혹은 탄소수 1∼3의 알킬이거나, 또는 R6 및 R7이 결합하는 질소 원자와 함께 탄소수 2∼6의 질소 포함 복소환을 형성하여도 좋으며, n4는 1∼6의 정수임)이고,
    n1은 0∼4의 정수이며, n2는 1∼4의 정수이고(단, n1이 0이고, n2가 1인 경우를 제외함),
    Z1은, 결합하는 탄소마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬이며,
    Z2는, 결합하는 탄소마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1∼3의 알킬이다.
  9. 제8항에 있어서, R1' 및 R2'은 동일하거나 또는 상이하고, 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 및 (Z)-도코사-13-에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 양이온성 지질.
  10. 제8항에 있어서, R1' 및 R2'은 동일하거나 또는 상이하고, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 및 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 양이온성 지질.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, R3'은 탄소수 1∼3의 알킬 또는 식 (A)인 양이온성 지질.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R1' 및 R2'은 동일한 것인 양이온성 지질.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, n1은 1이고, n2는 1∼3의 정수인 양이온성 지질.
  14. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, n1 및 n2는 모두 1인 양이온성 지질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 양이온성 지질과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있거나 또는 상기 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있는 것인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 양이온성 지질과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있거나 또는 상기 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합한 것과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있고, 상기 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 것인 조성물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 표적 유전자는 간장, 폐, 신장 또는 비장에서 발현되는 유전자인 조성물.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 이용하여 상기 핵산을 세포 내에 도입하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 세포는 포유동물의 간장, 폐, 신장 또는 비장에 있는 세포인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 세포 내에 도입하는 방법이 상기 조성물의 정맥내 투여에 의해 세포 내에 도입하는 방법인 방법.
  23. 제26항에 기재된 조성물을 포유동물에게 투여하는 공정을 포함하는, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서, 투여하는 방법이 정맥내 투여인 치료 방법.
  25. 제18항에 기재된 조성물을 포함하는, 질환의 치료에 이용하기 위한 의약.
  26. 제25항에 있어서, 정맥내 투여용인 의약.
  27. 제19항에 기재된 조성물을 포함하는, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제.
  28. 제34항에 있어서, 정맥내 투여용인, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제.
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