JP6641272B2 - カチオン性脂質 - Google Patents

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Description

本発明は、核酸を、例えば、細胞内等に導入することを容易にするカチオン性脂質、該カチオン性脂質を含有する組成物等に関する。
カチオン性脂質は、一つまたは複数の炭化水素基を含む脂質親和性領域と、少なくとも一つのプラスに帯電した極性ヘッドグループを含む親水性領域を有する両親媒性分子である。カチオン性脂質と核酸等の巨大分子が、総荷電としてプラスに帯電する複合体を形成することにより、核酸等の巨大分子が細胞の原形質膜を通過して細胞質に入りやすくなるため、カチオン性脂質は有用である。インビトロおよびインビボにおいて行うことのできるこのプロセスは、トランスフェクションとして知られている。
特許文献1〜4は、インビボにて核酸を細胞内に送達するために、および疾患の治療に好適な核酸-脂質粒子組成物に使用するために有用であるカチオン性脂質および該脂質を含む脂質粒子を開示している。特許文献1には、例えば、

2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane; DLin-KC2-DMA)等、特許文献2には、例えば、

(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル 4-(ジメチルアミノ)ブタノアート((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate; DLin-MC3-DMA)等、特許文献3には、例えば、

1-メチル-3，3-ビス{[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}アゼチジン (1-methyl-3,3-bis{[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-diene-1-yloxy]methyl}azetidine)等、特許文献4には、例えば

2-(1-メチルピロリジン-2-イル)エチル ジ[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル]カルバマート(2-(1-methylpyrrolidin-2-yl)ethyl di[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienyl]carbamate)等のカチオン性脂質が開示されている。
国際公開第2010/042877号 国際公開第2010/054401号 国際公開第2012/108397号 国際公開第2014/007398号
本発明の目的は、例えば、細胞内等に核酸を導入することを容易にするカチオン性脂質、該カチオン性脂質を含有する組成物等を提供することにある。
本発明は以下の(1)〜(35)に関する。
(1) 式(I)

[式中、R1およびR2は、同一または異なって、炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、またはC7-C20アルキルオキシC1-C3アルキルもしくはC7-C20アルキニルオキシC1-C3アルキルであり、
R3は、水素原子、炭素数1〜3のアルキル、式(A)

(式中、R4およびR5は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR4およびR5が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n3は2〜6の整数である)、または式(B)

(式中、R6およびR7は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR6およびR7が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n4は1〜6の整数である)であり、
n1は0〜4の整数であり、n2は1〜4の整数である(但し、n1が0であり、n2が1である場合を除く)]で表されるカチオン性脂質。
(2) R1およびR2が、同一または異なって、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルおよび(Z)-ドコサ-13-エニルからなる群から選ばれる、前記(1)記載のカチオン性脂質。
(3) R1およびR2が、同一または異なって、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルおよび(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルからなる群から選ばれる、前記(1)記載のカチオン性脂質。
(4) R3が、炭素数1〜3のアルキルまたは式(A)である、前記(1)〜(3)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(5) R1およびR2が同一である、前記(1)〜(4)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(6) n1が1であり、n2が1〜3の整数である、前記(1)〜(5)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(7) n1およびn2がともに1である、前記(1)〜(5)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(8) 式(I’)

[式中、R1’およびR2’は、同一または異なって、炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、またはC7-C20アルキルオキシC1-C3アルキル、C7-C20アルケニルオキシC1-C3アルキルもしくはC7-C20アルキニルオキシC1-C3アルキルであり、
R3は、水素原子、炭素数1〜3のアルキル、式(A)

(式中、R4およびR5は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR4およびR5が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n3は2〜6の整数である)、または式(B)

(式中、R6およびR7は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR6およびR7が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n4は1〜6の整数である)であり、
n1は0〜4の整数であり、n2は1〜4の整数である(但し、n1が0であり、n2が1である場合を除く)]で表されるカチオン性脂質。
(9) R1’およびR2’が、同一または異なって、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルおよび(Z)-ドコサ-13-エニルからなる群から選ばれる、前記(8)記載のカチオン性脂質。
(10) R1’およびR2’が、同一または異なって、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルおよび(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルからなる群から選ばれる、前記(8)記載のカチオン性脂質。
(11) R3が、炭素数1〜3のアルキルまたは式(A)である、前記(8)〜(10)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(12) R1’およびR2’が同一である、前記(8)〜(11)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(13) n1が1であり、n2が1〜3の整数である、前記(8)〜(12)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(14) n1およびn2がともに1である、前記(8)〜(12)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(15) 式(I’’)
[式中、R1’およびR2’は、同一または異なって、炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、またはC7-C20アルキルオキシC1-C3アルキル、C7-C20アルケニルオキシC1-C3アルキルもしくはC7-C20アルキニルオキシC1-C3アルキルであり、
R3’は、水素原子、炭素数1〜3のアルキル、ヒドロキシC2-C4アルキル、C1-C3ジアルキルアミノC2-C4アルキル、式(A)

(式中、R4およびR5は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR4およびR5が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n3は2〜6の整数である)、または式(B)

(式中、R6およびR7は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR6およびR7が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n4は1〜6の整数である)であり、
n1は0〜4の整数であり、n2は1〜4の整数であり(但し、n1が0であり、n2が1である場合を除く)、
Z1は、結合する炭素ごとにそれぞれ独立して、水素原子または炭素数1〜3のアルキルであり、
Z２は、結合する炭素ごとにそれぞれ独立して、水素原子または炭素数1〜3のアルキルである]で表わされるカチオン性脂質。
(16) R1’およびR2’が、同一または異なって、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルおよび(Z)-ドコサ-13-エニルからなる群から選ばれる、前記(15)記載のカチオン性脂質。
(17) R1’およびR2’が、同一または異なって、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルおよび(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルからなる群から選ばれる、前記(15)記載のカチオン性脂質。
(18) R3’が、炭素数1〜3のアルキルまたは式(A)である、前記(15)〜(17)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(19) R1’およびR2’が同一である、前記(15)〜(18)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(20) n1が1であり、n2が1〜3の整数である、前記(15)〜(19)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(21) n1およびn2がともに1である、前記(15)〜(19)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(22) 前記(1)〜(21)のいずれかに記載のカチオン性脂質および核酸を含有する組成物。
(23) 該カチオン性脂質と該核酸とが複合体を形成しているか、または該カチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸とが複合体を形成している、前記(22)記載の組成物。
(24) 該カチオン性脂質と該核酸とが複合体を形成しているか、または該カチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸とが複合体を形成しており、該複合体を封入する脂質膜を含有する、前記(22)記載の組成物。
(25)核酸が、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である、前記(22)〜(24)のいずれかに記載の組成物。
(26) 標的遺伝子が、肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子である、前記(25)記載の組成物。
(27) 前記(22)〜(26)のいずれかに記載の組成物を用いて該核酸を細胞内に導入する方法。
(28) 細胞が、哺乳動物の肝臓、肺、腎臓または脾臓にある細胞である、前記(27)記載の方法。
(29) 細胞内に導入する方法が、該組成物の静脈内投与によって細胞内に導入する方法である、前記(27)または(28)記載の方法。
(30) 前記(26)記載の組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療方法。
(31) 投与する方法が、静脈内投与である、前記(30)記載の方法。
(32) 前記(25)記載の組成物を含む、疾患の治療に用いるための医薬。
(33) 静脈内投与用である、前記(32)記載の医薬。
(34) 前記(26)記載の組成物を含む、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤。
(35) 静脈内投与用である、前記(34)記載の肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤。
本発明のカチオン性脂質および核酸を含有する組成物を、哺乳動物等に投与することにより、該核酸を、例えば細胞内等に容易に導入することができる。
実施例21および22で得られた製剤(化合物1、2、4〜7のそれぞれを用いた製剤)を、それぞれマウスにsiRNA 0.03mg/kg相当量投与してから48時間後の血漿中Factor VIIタンパクの濃度を示す。縦軸は生理食塩水投与群を100とした場合の血漿中Factor VIIタンパクの濃度の相対値を示す。横軸は化合物番号を示す。 実施例22で得られた製剤(化合物2、4のそれぞれを用いた製剤)を、それぞれマウスにsiRNA 0.3mg/kg相当量投与してから48時間後の血漿中Factor VIIタンパクの濃度を示す。縦軸は生理食塩水投与群を100とした場合の血漿中Factor VIIタンパクの濃度の相対値を示す。横軸は化合物番号を示す。 実施例23で得られた製剤（化合物1を用いた製剤)および比較例1で得られた製剤（化合物Aを用いた製剤）を、それぞれマウスにsiRNA 0.3mg/kgと0.03mg/kg相当量投与してから48時間後の血漿中Factor VIIタンパクの濃度を示す。縦軸は生理食塩水投与群を100とした場合の血漿中Factor VIIタンパクの濃度の相対値を示す。横軸は化合物番号を示す。
本発明のカチオン性脂質は、
式(I)


(式中、R1およびR2は、同一または異なって、炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、またはC7-C20アルキルオキシC1-C3アルキルもしくはC7-C20アルキニルオキシC1-C3アルキルであり、
R3は、水素原子、炭素数1〜3のアルキル、式(A)

(式中、R4およびR5は、同一または異なって、水素原子、炭素数1〜3のアルキル、もしくはR4およびR5が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n3は2〜6の整数である)、または式(B)

(式中、R6およびR7は、同一または異なって、水素原子、炭素数1〜3のアルキル、もしくはR6およびR7が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n4は1〜6の整数である)であり、
n1は0〜4の整数であり、n2は1〜4の整数である(但し、n1が0であり、n2が1である場合を除く)である)で表されるカチオン性脂質であるか、または
式(I’)

[式中、R1’およびR2’は、同一または異なって、炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、またはC7-C20アルキルオキシC1-C3アルキル、C7-C20アルケニルオキシC1-C3アルキルもしくはC7-C20アルキニルオキシC1-C3アルキルであり、
R3は、水素原子、炭素数1〜3のアルキル、式(A)

(式中、R4およびR5は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR4およびR5が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n3は2〜6の整数である)、または式(B)

(式中、R6およびR7は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR6およびR7が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n4は1〜6の整数である)であり、
n1は0〜4の整数であり、n2は1〜4の整数である(但し、n1が0であり、n2が1である場合を除く)]で表されるカチオン性脂質であるか、または
式(I’’)
[式中、R1’およびR2’は、同一または異なって、炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、またはC7-C20アルキルオキシC1-C3アルキル、C7-C20アルケニルオキシC1-C3アルキルもしくはC7-C20アルキニルオキシC1-C3アルキルであり、
R3’は、水素原子、炭素数1〜3のアルキル、ヒドロキシC2-C4アルキル、C1-C3ジアルキルアミノC2-C4アルキル、式(A)

(式中、R4およびR5は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR4およびR5が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n3は2〜6の整数である)、または式(B)

(式中、R6およびR7は、同一または異なって、水素原子もしくは炭素数1〜3のアルキルであるか、またはR6およびR7が結合する窒素原子と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成してもよく、n4は1〜6の整数である)であり、
n1は0〜4の整数であり、n2は1〜4の整数であり(但し、n1が0であり、n2が1である場合を除く)、
Z1は、結合する炭素ごとにそれぞれ独立して、水素原子または炭素数1〜3のアルキルであり、
Z２は、結合する炭素ごとにそれぞれ独立して、水素原子または炭素数1〜3のアルキルである]で表わされるカチオン性脂質である。
以下、式(I)で表される化合物を化合物(I)、式(I’)で表される化合物を化合物(I’)、式(I’’)で表わされる化合物を化合物(I’’)ということもある。他の式番号の化合物についても同様である。
炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキルとしては、例えばオクチル、デシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル等が挙げられ、好ましくはデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル等が挙げられ、より好ましくはテトラデシル、ヘキサデシルが挙げられる。
炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルケニルとしては、1以上の2重結合を含む炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルケニルであればよく、例えば(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル、(Z)-ドコサ-13-エニル等が挙げられ、好ましくは(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、(Z)-ドコサ-13-エニル等が挙げられる。
炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキニルとしては、1以上の3重結合を含む炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキニルであればよく、例えばドデカ-11-イニル、テトラデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニル、オクタデカ-9-イニル等が挙げられる。
C7-C20アルキルオキシC1-C3アルキルにおけるC7-C20アルキル部分としては、例えばヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル等が挙げられ、C1-C3アルキル部分としてはメチル、エチル、プロピル等に対応するアルキレンが挙げられる。
C7-C20アルケニルオキシC1-C3アルキルにおけるC7-C20アルケニル部分としては、例えば(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等が挙げられ、好ましくは(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル等が挙げられ、C1-C3アルキル部分としてはメチル、エチル、プロピル等に対応するアルキレンが挙げられる。
C7-C20アルキニルオキシC1-C3アルキルにおけるC7-C20アルキニル部分としては、例えばドデカ-11-イニル、テトラデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニル、オクタデカ-9-イニル等が挙げられ、C1-C3アルキル部分としてはメチル、エチル、プロピル等が挙げられる。
また、本発明においては、炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルケニルの二重結合にメチレンビラジカルが形式的に付加したシクロプロパン環を有する基も、炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルケニルに包含される。さらに、C7-C20アルケニルオキシC1-C3アルキルにおけるC7-C20アルケニル部分についても同様である。例えば、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルに対応する以下のシクロプロパン環を有する基

および

等が挙げられる。
炭素数1〜3のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル等が挙げられる。
ヒドロキシC2-C4アルキルにおけるC2-C4アルキル部分としては、エチル、プロピル、ブチル等に対応するアルキレンが挙げられる。
C1-C3ジアルキルアミノC2-C4アルキルにおけるC1-C3アルキル部分としては、メチル、エチル、プロピル等が挙げられ、それらは同一でも異なっていてもよい。またC1-C3ジアルキルアミノC2-C4アルキルにおけるC2-C4アルキル部分としては、エチル、プロピル、ブチル等に対応するアルキレンが挙げられる。
炭素数2〜6の含窒素複素環としては、アジリジン環、アゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、アゼパン環等が挙げられる。
なお、R1およびR2は、同一または異なって炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキルもしくはアルケニル、またはC7-20アルキルオキシC1-C3アルキルであることがより好ましく、同一または異なって直鎖状の炭素数8〜24のアルケニルであることがさらに好ましい。また、R1およびR2は、同一であることがより好ましく、その場合には、炭素数12〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであることがより好ましく、炭素数12〜24の直鎖状のアルケニルであることがさらに好ましい。またR1’およびR2’は、同一または異なって炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキルもしくはアルケニル、またはC7-20アルキルオキシC1-C3アルキルもしくはC7-C20アルケニルオキシC1-C3アルキルであることがより好ましく、同一または異なって直鎖状の炭素数8〜24のアルケニルであることがさらに好ましい。また、R1’およびR2’は、同一であることがより好ましく、その場合には、炭素数12〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであることがより好ましく、炭素数12〜24の直鎖状のアルケニルであることがさらに好ましい。
R1およびR2ならびにR1’およびR2’が、異なる場合には、R1およびR1’が炭素数16〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、R2およびR2’が炭素数8〜12の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであることも本発明の好ましい形態のひとつである。この場合、R1およびR1’が炭素数16〜24の直鎖状のアルケニルであり、R2およびR2’が炭素数8〜12の直鎖状のアルキルであることがより好ましく、R1およびR1’が(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであり、R2およびR2’がオクチル、デシルまたはドデシルであることが最も好ましい。
R1およびR2ならびにR1’およびR2’が、同一または異なって炭素数8〜24の直鎖状もしくは分枝状のアルキルもしくはアルケニルである場合には、同一または異なってデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルまたは(Z)-ドコサ-13-エニルであることが好ましく、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルまたは(Z)-ドコサ-13-エニルであることがより好ましい。
R3およびR3’は、炭素数1〜3のアルキル、または上記式(A)であることが好ましく、メチル、エチル、プロピルまたはシクロプロピルであることがより好ましく、メチルまたはエチルであることがさらに好ましく、メチルであることが最も好ましい。そしてR3が式(A)である場合、R4およびR5は、同一または異なって、水素原子、または炭素数1〜3のアルキルであることが好ましく、R3が式(B)である場合、R6およびR7は、同一または異なって、水素原子、もしくは炭素数1〜3のアルキルであることが好ましい。
R４とR５が結合する窒素原子と一緒になって形成する、炭素数2〜6の含窒素複素環として、好ましくはアゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、アゼパン環が挙げられる。
なお、R4がR5と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成しない場合には、R5はメチルまたはエチルであることが好ましく、メチルであることがより好ましく、R４とR5がそれぞれメチルであることが最も好ましい。また、R4がR5と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成する場合には、ピロリジン環またはピペリジン環を形成することが好ましい。
n3は2〜4の整数であることが好ましく、3であることがより好ましい。
上記式(B)中のR6がR7と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成しない場合には、R7はメチルまたはエチルであることが好ましく、メチルであることがより好ましく、R６とR７がそれぞれメチルであることが最も好ましい。また、R6がR7と一緒になって炭素数2〜6の含窒素複素環を形成する場合には、ピロリジン環またはピペリジン環を形成することが好ましい。
n4は2〜4の整数であることが好ましく、3であることがより好ましい。
n1は1であることが好ましい。この場合、n2は1〜3の整数であることが好ましく、1であることがより好ましい。
Z1は、結合する炭素ごとにそれぞれ独立して、水素原子または炭素数1〜3のアルキルであることが好ましく、水素原子またはメチルであることがより好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。ここで、用語「結合する炭素ごとにそれぞれ独立して」とは、式（I’’）に2つ以上のZ1が存在する場合において、Z1が結合する炭素原子ごとに、それぞれのZ1が同一または異なって、水素原子または炭素数1〜3のアルキルを選択できることを意味する。例えば、式（I’’）中にZ1が2つ存在する場合、それぞれのZ1が同一の置換基を選択し得ることを意味するだけでなく、一方のZ1が水素原子であり、他方のZ1が炭素数1〜3のアルキルである場合も包含することを意味する。
Z2は、結合する炭素ごとにそれぞれ独立して、水素原子または炭素数1〜3のアルキルであることが好ましく、水素原子またはメチルであることがより好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。ここで、用語「結合する炭素ごとにそれぞれ独立して」とは、式（I’’）に2つ以上のZ2が存在する場合において、Z2が結合する炭素原子ごとに、それぞれのZ2が同一または異なって、水素原子または炭素数1〜3のアルキルを選択できることを意味する。例えば、式（I’’）中にZ2が2つ存在する場合、それぞれのZ2が同一の置換基を選択し得ることを意味するだけでなく、一方のZ2が水素原子であり、他方のZ2が炭素数1〜3のアルキルである場合も包含することを意味する。
またn1とn2がともに1である時、Z1とZ2がそれぞれ同一または異なって水素原子またはメチルであることが好ましく、Z1が水素原子またはメチルであり、Z2が水素原子であることがより好ましく、Z1とZ2が同一に水素原子であることが最も好ましい。
次に本発明のカチオン性脂質の製造法について説明する。なお、以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等に記載の方法]等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
製造法1
化合物(I)のうち、n1およびn2がともに1であり、R3が水素原子または炭素数1〜3のアルキルである化合物(Ia)は以下の方法によって製造することができる。なお、化合物(I’)のうち、n1およびn2がともに1であり、R3が水素原子または炭素数1〜3のアルキルである化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。さらに、化合物(I’’)のうち、n1およびn2がともに1であり、Z1およびZ2がともに水素原子であり、R3’が水素原子、炭素数1〜3のアルキル、ヒドロキシC2-C4アルキルまたはC1-C3ジアルキルアミノC2-C4アルキルである化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。

(式中、R1およびR2はそれぞれ前記と同義であり、R3ａは水素原子または前記R3が炭素数1〜3のアルキルである場合と同義の炭素数1〜3のアルキルであり、X1、X2およびX3は、同一または異なって、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシ等の脱離基を表す)
工程１および２
化合物(IIa)は、マロン酸ジメチルと化合物(IIIa)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。さらに、化合物(IIb)は、化合物(IIa)と化合物(IIIb)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いることができる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、水素化ナトリウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)等が挙げられる。
化合物(IIIa)および化合物(IIIb)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、「第5版実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法、または後述の製造法で得ることもできる。
R1とR2が同一の場合の化合物(IIb)は、工程1において、2当量以上の化合物(IIIa)を用いることで得ることができる。
マロン酸ジメチルは市販品として得ることができる。
工程3
化合物(IIc)は化合物(IIb)を4当量〜大過剰量のヒドリド還元剤と、必要に応じて触媒量〜10当量の添加剤の存在下、溶媒中、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。ここで、触媒量とは0.01当量〜0.5当量であることを示す。
ヒドリド還元剤としては、例えば水素化アルミウニウムリチウム、水素化ホウ素リチウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化ビス(2-メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウム等が挙げられる。
溶媒としては、例えばトルエン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、1,4-ジオキサン等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いることができる。
添加剤としては、塩化アルミニウム、塩化セリウム、四塩化チタン、チタニウムテトライソプロポキシド等を用いることができる。
工程4
化合物(IId)は化合物(IIc)を2当量以上のハロゲン化試薬または擬ハロゲン化試薬と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基および必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
ハロゲン化試薬または擬ハロゲン化試薬としては、例えば塩化チオニル、塩化スルフリル、三塩化リン、五塩化リン、オキシ塩化リン、三臭化リン、臭化水素、ヨウ化水素、無水メシル酸、メシル酸クロリド、無水トシル酸、ベンゼンスルホン酸クロリド、無水ベンゼンスルホン酸、トシル酸クロリド、無水トリフルオロメタンスルホン酸等が挙げられる。
溶媒としては、工程3で例示したものが挙げられる。
塩基としては、例えばピリジン、2,6-ルチジン、2,4,6-コリジン、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられる。
添加剤としては、例えば塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、臭化リチウム、塩化リチウム等が挙げられる。
工程5
化合物(Ia)は、化合物(IId)と1当量〜大過剰量の化合物(IVa)を、無溶媒でまたは溶媒中、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものが挙げられる。
化合物(IVa)は、市販品として得ることができる。
製造法2
化合物(I)のうち、n1およびn2がともに1であり、R3が式(A)である化合物(Ic)は以下の方法によって製造することができる。なお、化合物(I’)のうち、n1およびn2がともに1であり、R3が式(A)である化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。さらに、化合物(I’’)のうち、n1およびn2がともに1であり、Z1およびZ2がともに水素原子であり、R3’が式(A)である化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。

(式中、R1、R2、R4、R5およびn3はそれぞれ前記と同義であり、Arはp-ニトロフェニル、o-ニトロフェニル、p-クロロフェニル等の置換フェニル基または無置換フェニル基を表す)
工程6
化合物(VII)は、化合物(V)と化合物(VI)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、1,4-ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いることができる。
添加剤としては、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)等が挙げられる。
化合物(V)は、市販品として得ることができる。
化合物(VI)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、「第5版実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、p.1、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
工程7
化合物(Ic)は、化合物(Ib)と化合物(VII)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により1〜10当量の添加剤の存在下、および／または必要により1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
化合物(Ib)は製造法1の工程5で化合物(IVa)としてアンモニアを用いるか、または製造法7で製造することができる。
溶媒、添加剤および塩基としては、それぞれ工程6で例示したものが挙げられる。
製造法3
化合物(I)のうち、n1およびn2がともに1であり、R3が式(B)である化合物(Id)は以下の方法によって製造することができる。なお、化合物(I’)のうち、n1およびn2がともに1であり、R3が式(B)である化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。さらに、化合物(I’’)のうち、n1およびn2がともに1であり、Z1およびZ2がともに水素原子であり、R3’が式(B)である化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。

(式中、R1、R2、R6、R7およびn4はそれぞれ前記と同義である)
工程8
化合物(IIe)は、化合物(Ib)を、化合物(VIII)と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程6で例示したものが挙げられる。
塩基としては、工程4で例示したものが挙げられる。
化合物(VIII)は、市販品として得ることができる。
工程9
化合物(Id)は、化合物(IIe)と1〜20当量の化合物(VIb)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
化合物(VIb)は、市販品として得ることができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものが挙げられる。
塩基としては、工程6で例示したものが挙げられる。
製造法4
化合物(IIIa)および化合物(IIIb)のうち、R1および/またはR2がC7-C20アルキルオキシC2-C3アルキルもしくはC7-C20アルキニルオキシC2-C3アルキルである化合物(IIId)は、以下の方法によって製造できる。なお、化合物(I’)および化合物(I’’)のうち、R1’および/またはR2’がC7-C20アルキルオキシC2-C3アルキル、C7-C20アルケニルオキシC2-C3アルキルもしくはC7-C20アルキニルオキシC2-C3アルキルである化合物を製造する際に用いる化合物(IIId)に相当する化合物も、以下の方法によって同様に製造することができる。

(式中、X4およびX5は前記X1と同義であり、R9は前記C7-C20アルキルオキシC1-C3アルキルにおけるC7-C20アルキル部分と同義の炭素数7〜20のアルキル、前記C7-C20アルケニルオキシC1-C3アルキルにおけるC7-C20アルケニル部分と同義の炭素数7〜20のアルケニル、もしくは前記C7-C20アルキニルオキシC1-C3アルキルにおけるC7-C20アルキニル部分と同義の炭素数7〜20のアルキニルであり、Yはエチレンまたはプロピレンを表す)
工程10
化合物(X)は、化合物(IIIc)と化合物(IX)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および塩基としては、それぞれ工程6で例示したものが挙げられる。
化合物(IIIc)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、「第5版実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、p.1、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(IX)は、市販品として得ることができる。
工程11
化合物(IIId)は、化合物(X)を、ハロゲン化試薬または擬ハロゲン化試薬と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基および必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および塩基としては、それぞれ工程6で例示したものが挙げられる。
ハロゲン化試薬または擬ハロゲン化試薬としては、工程4で例示したものが挙げられる。
添加剤としては、工程4で例示したものが挙げられる。
製造法5
化合物(I)のうち、n1が1であり、R3が炭素数1〜3のアルキルである化合物(Ie)は以下の方法によって製造することができる。なお、化合物(I’)のうち、n1が1であり、R3が炭素数1〜3のアルキルである化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。さらに、化合物(I’’)のうち、n1が1であり、Z1およびZ2がともに水素原子であり、R3’が炭素数1〜3のアルキルである化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。

(式中、R1、R2、n2、X1およびX2はそれぞれ前記と同義であり、X6は前記X1と同義であり、R10は前記R3が炭素数1〜3のアルキルである場合と同義の炭素数1〜3のアルキルを表す)
工程12
化合物(XIb)は、化合物(XIa)と化合物(IIIe)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および塩基としては、それぞれ工程1および工程2で例示したものが挙げられる。
化合物(XIa)および化合物(IIIe)はそれぞれ市販品として得ることができる。
工程13および工程14
化合物(XIc)は、化合物(XIb)と化合物(IIIa)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。さらに、化合物(XId)は、化合物(XIc)と化合物(IIIb)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程3で例示したものが挙げられる。
塩基としては、リチウムジイソプロピルアミド、ヘキサメチルジシラザンリチウム、ヘキサメチルジシラザンナトリウム、n-ブチルリチウム等が挙げられる。
R1とR2が同一の場合の化合物(XId)は、工程13において、2当量以上の化合物(IIIa)を用いることで得ることができる。
工程15
化合物(Ie)は化合物(XId)を4〜100当量のヒドリド還元剤と、必要に応じて触媒量〜10当量の添加剤の存在下、溶媒中、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。ここで、触媒量は、前記と同義である。
ヒドリド還元剤、添加剤および溶媒としては工程3で例示したものが挙げられる。
製造法6
化合物(I)のうち、n1およびn2が同一または異なって1〜4の整数であり(但し、n1が1であり、n2が1である場合を除く)、R3が水素原子または炭素数1〜3のアルキルである化合物(If)は以下の方法によって製造することができる。なお、化合物(I’)のうち、n1およびn2が同一または異なって1〜4の整数であり(但し、n1が1であり、n2が1である場合を除く)、R3が水素原子または炭素数1〜3のアルキルである化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。さらに、化合物(I’’)のうち、n1およびn2が同一または異なって1〜4の整数であり(但し、n1が1であり、n2が1である場合を除く)、Z1およびZ2がともに水素原子であり、R3’が水素原子、炭素数1〜3のアルキル、ヒドロキシC2-C4アルキルまたはC1-C3ジアルキルアミノC2-C4アルキルである化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。

[式中、R1、R2、R3a、X1、X2およびX3はそれぞれ前記と同義であり、m1およびm2は同一または異なって1〜4の整数であり(但し、m1が1であり、m2が1である場合を除く)、P1およびP2は、同一または異なって保護基を表す]
工程16および工程17
化合物(XIIb)は、マロン酸ジメチルの代わりに化合物(XIIa)を用い、工程１と同様の方法により得られる。化合物(XIIc)は、化合物(IIa)の代わりに化合物(XIIb)を用い、工程2と同様の方法により得られる。R1とR2が同一の場合の(XIIc)については工程16において２等量以上の化合物(IIIa)を用いることによって得られる。ここで、P1およびP2としては有機合成化学で常用される保護基[例えば、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等に記載の保護基]を用いることができる。また、化合物(XIIa)は公知の方法[例えば、「新実験化学講座14 有機化合物の合成と反応(II)」、初版、p.751、丸善(1977年)]もしくはそれに準じた方法で得られる。
工程18
化合物(XIId)は、化合物(XIIc)を公知の方法[例えば、「新実験化学講座15 酸化と還元(II)」、初版、丸善(1977年)]もしくはそれに準じた方法で還元することで得られる。
工程19
化合物(XIIe)は、化合物(XIId)の保護基P1およびP2をそれぞれ適切な方法で除去することによって得られる。保護基の除去方法としては、有機合成化学で常用される保護基の除去方法[例えば、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等に記載の除去方法]を用いることができ、これにより目的とする化合物を製造することができる。
工程20
化合物(XIIf)は、化合物(IIc)の代わりに化合物(XIIe)を用い、工程4と同様の方法により得られる。
工程21
化合物(If)は、化合物(IId)の代わりに化合物(XIIf)を用い、工程5と同様の方法により得られる。
製造法7
化合物(I)のうち、n1およびn2が1であり、R3が水素原子である化合物(Ib)は以下の方法によって製造することができる。なお、化合物(I’)のうち、n1およびn2が1であり、R3が水素原子である化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。さらに、化合物(I’’)のうち、n1およびn2が1であり、Z1およびZ2がともに水素原子であり、R3’が水素原子である化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。

(式中、R1、R2、X1、X2およびX3はそれぞれ前記と同義であり、P3はtert-ブトキシカルボニル、o-ニトロベンゼンスルホニルまたはp-メチルベンゼンスルホニル等の保護基を表す)
工程22および23
化合物(XIIIa)は、シアノ酢酸エチルと化合物(IIIa)を、工程１と同様の条件で反応させることにより製造することができる。さらに、化合物(XIIIb)は、化合物(XIIIa)と化合物(IIIb)を、工程2と同様の条件で反応させることにより製造することができる。
R1とR2が同一の場合の化合物(XIIIb)は、工程22において、2当量以上の化合物(IIIa)を用いることで得ることができる。
シアノ酢酸エチルは市販品として得ることができる。
化合物(IIIa)および化合物(IIIb)は、製造法1に記載のものと同様である。
工程24
化合物(XIIIc)は化合物(XIIIb)を工程3と同様の条件で反応させることにより製造することができる。
工程25
化合物(XIIId)は、化合物(XIIIc)を、1〜10当量の炭酸ジtert-ブトキシカルボニル、o-ニトロベンゼンスルホニルクロリドまたはp-メチルベンゼンスルホニルクロリド等と、溶媒中、1〜10当量の塩基の存在下、0℃と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程6で例示したものが挙げられる。
塩基としては、工程4で例示したものが挙げられる。
工程26
化合物(XIIIe)は化合物(XIIId)を1当量以上のハロゲン化試薬または擬ハロゲン化試薬と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-0℃と150℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
ハロゲン化試薬または擬ハロゲン化試薬としては、工程4で例示したものが挙げられる。
溶媒としては、工程3で例示したものが挙げられる。
塩基としては、工程4で例示したものが挙げられる。
工程27
化合物(XIIIf)は化合物(XIIIe)を無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、0℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間分子内で反応させることにより製造することができる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)、リチウムジイソプロピルアミド、ヘキサメチルジシラザンリチウム、ヘキサメチルジシラザンナトリウム、n-ブチルリチウム等が挙げられる。
溶媒としては、工程１および２で例示したものが挙げられる。
工程28
化合物(Ib)は、化合物(XIIIf)の保護基P3を適切な方法で除去することによって得られる。保護基の除去方法としては、有機合成化学で常用される保護基の除去方法[例えば、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等に記載の除去方法]を用いることができ、これにより目的とする化合物を製造することができる。
製造法8
化合物(I)のうち、n1およびn2が1であり、R3が炭素数1-3のアルキルである(Ig)は以下の方法によって製造することができる。なお、化合物(I’)のうち、n1およびn2が1であり、R3が炭素数1-3のアルキルである化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。さらに、化合物(I’’)のうち、n1およびn2が1であり、Z1およびZ2がともに水素原子であり、R3’が炭素数1-3のアルキルである化合物も以下の方法によって同様に製造することができる。

[式中、R1、R2はそれぞれ前記と同義であり、R11は水素原子、メチルまたはエチルであり、R12は水素原子またはメチルであるか、またはR11とR12は隣接する炭素と一緒になってシクロプロピル環を形成する（ただし、R11が水素原子またはエチルであるとき、R12はメチルでない)]
工程29
化合物(Ig)は、化合物(Ib)を好ましくは1〜10当量の化合物(XIX)と、溶媒中、好ましくは1当量〜大過剰量の還元剤および必要により好ましくは1〜10当量の酸の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
還元剤としては、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム等があげられる。
酸としては、例えば塩酸、酢酸等があげられる。
化合物(XIX)は、市販品として得ることができる。
製造法9
化合物(I’’)のうち、n1およびn2が1であり、R3’が水素であり、Z1が炭素数1〜3のアルキルであり、Z2が水素原子である化合物(I’’b)は以下の方法によって製造することができる。

(式中、R1’、R2’、X3およびP3はそれぞれ前記と同義であり、Z1aは前記Z1が炭素数1〜3のアルキルである場合と同義の炭素数1〜3のアルキルであり、Mはリチウム、マグネシウムブロミド、マグネシウムクロリド等を表す。)
工程30
化合物(XIIIh)は化合物(XIIIg)を溶媒中、1〜10当量の酸化剤と0℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
酸化剤としては、例えばデス-マーチン試薬、クロロクロム酸ピリジニウム、二クロム酸ピリジニウム、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム等が挙げられる。
溶媒としては、工程6で例示したものが挙げられる。
化合物(XIIIg)は製造法7における化合物（XIIIｄ）と同様の方法により製造することができる。
工程31
化合物（XIIIi）は化合物(XIIIh)を溶媒中、1〜10当量の有機金属試薬と、-78℃と100℃の間の温度で5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
有機金属試薬としては、例えばメチルリチウム、エチルリチウム等のアルキルリチウム試薬、メチルマグネシウムブロミド、エチルマグネシウムブロミド等のグリニャール試薬、ジメチル亜鉛、ジエチル亜鉛等の有機亜鉛試薬等が挙げられる。
溶媒としては、工程3で例示したものが挙げられる。
工程32
化合物(XIIIj)は工程26と同様の方法により製造することができる。
工程33
化合物(XIIIk)は工程27と同様の方法により製造することができる。
工程34
化合物(I’’b)は工程28と同様の方法により製造することができる。
製造法10
化合物(I’’)のうち、n1およびn2が1であり、R3’が炭素数1-3のアルキルであり、Z1が炭素数1〜3のアルキルであり、Z2が水素原子である化合物(I’’g)は以下の方法によって製造することができる。また、n1およびn2が1であり、R3’が式(A)であり、Z1が炭素数1〜3のアルキルであり、Z2が水素原子である化合物(I’’c)は以下の方法によって製造することができる。さらに、n1およびn2が1であり、R3’が式(B)であり、Z1が炭素数1〜3のアルキルであり、Z2が水素原子である化合物(I’’d)は以下の方法によって製造することができる。

(式中、R1’、R2’、R4、R5、R6、R7、R11、R12、n3、n4、ArおよびZ1aはそれぞれ前記と同義である)
工程35
化合物(I’’g)は工程29と同様の方法により製造することができる。
工程36
化合物(I’’c)は工程7と同様の方法により製造することができる。
工程37
化合物(II’e)は工程8と同様の方法により製造することができる。
工程38
化合物(I’’d)は工程9と同様の方法により製造することができる。
なお、化合物(I)、(I’)、(I’’)のうち、前記化合物(Ia)〜(Ig)および(I’’b)〜(I’’d)以外の化合物は、目的とする化合物の構造に適した原料や試薬等を採用することにより、上記の製造法に準じて、あるいは有機合成化学で常用される一般的な製造方法を適用することによって製造することができる。
上記各製造法における中間体および目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、ろ過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
本発明のカチオン性脂質において、構造中の窒素原子上の孤立電子対に水素イオンが配位してもよく、その場合には、製薬上許容し得る陰イオン(前記と同義)と塩を形成していてもよく、本発明のカチオン性脂質には、該窒素原子上の孤立電子対に水素イオンが配位した化合物も包含される。
本発明において、製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。
本発明のカチオン性脂質の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、本発明のカチオン性脂質は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
本発明のカチオン性脂質中の各原子の一部またはすべては、それぞれ対応する同位体原子で置き換わっていてもよく、化合物(I)は、これら同位体原子で置き換わった化合物も包含する。例えば、化合物(I)中の水素原子の一部またはすべては、原子量2の水素原子(重水素原子)であってもよい。
本発明のカチオン性脂質中の各原子の一部またはすべてが、それぞれ対応する同位体原子で置き換わった化合物は、市販のビルディングブロックを用いて、上記各製造法と同様な方法で製造することができる。また、化合物(I)中の水素原子の一部またはすべてが重水素原子で置き換わった化合物は、例えば、イリジウム錯体を触媒として用い、重水を重水素源として用いてアルコール、カルボン酸等を重水素化する方法[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ(J.Am.Chem.Soc.), Vol.124,No.10,2092(2002)参照]等を用いて合成することもできる。
本発明のカチオン性脂質の具体例を表1〜表3に示す。ただし、本発明のカチオン性脂質はこれらに限定されるものではない。
また、本発明で用いられる核酸としては、例えばヌクレオチドおよび/またはヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であれば、いかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるリボ核酸(RNA)、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるデオキシリボ核酸(DNA)、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体等が挙げられる。また、ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子の構造を少なくとも一部に含む誘導体も、本発明の核酸に含まれる。なお、本発明において、ウラシルUと、チミンTとは、それぞれ読み替えることができる。
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えばヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性を向上させるかもしくはその他の分解因子から安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、例えばヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基としては、例えば、2’-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-アルケニル、2’-置換アルケニル、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-S-アルキル、2’-S-置換アルキル、2’-S-アルケニル、2’-S-置換アルケニル、2’-アミノ、2’-NH-アルキル、2’-NH-置換アルキル、2’-NH-アルケニル、2’-NH-置換アルケニル、2’-SO-アルキル、2’-SO-置換アルキル、2’-カルボキシ、2’-CO-アルキル、2’-CO-置換アルキル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル、2’-SiH2-アルキル、2’-SiH2-置換アルキル、2’-ONO2、2’-NO2、2’-N3、2’-アミノ酸残基(アミノ酸のカルボン酸から水酸基が除去されたもの)、2’-O-アミノ酸残基(前記アミノ酸残基と同義)等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)があげられ、具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA) [“テトラヘドロンレターズ(Tetrahedron Letters)”, Volume 38, Issue 50, 1997, Pages 8735-8738、および“テトラヘドロン (Tetrahedron)”, Volume 54, Issue 14, 1998, Pages 3607-3630]、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[“ヌクレイックアシッドリサーチ(Nucleic Acid Research)”, 32, e175(2004)]等があげられる。
さらに糖部修飾ヌクレオチドとして、ペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653(2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)]等も挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基として、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル等が好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチルアミノオキシ)エチル]、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ等がさらに好ましく、2’-O-メチルおよび2’-O-エチルが最も好ましい。
また、糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基は、その大きさから好ましい範囲を定義することもでき、フルオロの大きさから-O-ブチルの大きさに相当するものが好ましく、-O-メチルの大きさから-O-エチルの大きさに相当するものがより好ましい。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基におけるアルキルとしては、炭素数1〜6のアルキルが挙げられ、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等の炭素数1〜6のアルキルである。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基におけるアルケニルとしては、炭素数3〜6のアルケニルが挙げられ、例えばアリル、1-プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基におけるハロゲンとしては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
アミノ酸残基におけるアミノ酸としては、例えば脂肪族アミノ酸(具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等)、ヒドロキシアミノ酸(具体的には、セリン、トレオニン等)、酸性アミノ酸(具体的には、アスパラギン酸、グルタミン酸等)、酸性アミノ酸アミド(具体的には、アスパラギン、グルタミン等)、塩基性アミノ酸(具体的には、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン等)、含硫アミノ酸(具体的には、システイン、シスチン、メチオニン等)、イミノ酸(具体的には、プロリン、4-ヒドロキシプロリン等)等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基における置換アルキルおよび置換アルケニルにおける置換基としては、例えば、ハロゲン(前記と同義)、ヒドロキシ、スルファニル、アミノ、オキソ、-O-アルキル(該-O-アルキルのアルキル部分は前記炭素数1〜6のアルキルルと同義)、-S-アルキル(該-S-アルキルのアルキル部分は前記炭素数1〜6のアルキルと同義)、-NH-アルキル(該-NH-アルキルのアルキル部分は前記炭素数1〜6のアルキルと同義)、ジアルキルアミノオキシ(該ジアルキルアミノオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記炭素数1〜6のアルキルと同義)、ジアルキルアミノ(該ジアルキルアミノの2つのアルキル部分は同一または異なって前記炭素数1〜6のアルキルと同義)、ジアルキルアミノアルキルオキシ(該ジアルキルアミノアルキルオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記炭素数1〜6のアルキルと同義であり、アルキレン部分は前記アルキルから水素原子が1つ除かれたものを意味する)等が挙げられ、置換数は好ましくは1〜3である。
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられる。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基で置換されたもの、メチル基が水素原子もしくは炭素数2〜6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基等の保護基で保護されたもの等が挙げられる。
さらに、ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素等、別の化学物質を付加したものも挙げられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、緑色蛍光色素(Cy3)付加ヌクレオチド誘導体、赤色蛍光色素(Cy5)付加ヌクレオチド誘導体、フルオロセイン(6-FAM)付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
また、本発明で用いられる核酸においては、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体が、該核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
本発明で用いられる核酸としては、好ましくは標的遺伝子の発現を抑制する核酸が挙げられ、より好ましくはRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸が挙げられる。
本発明における標的遺伝子としては、mRNAを産生して発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、腫瘍または炎症に関連する遺伝子が好ましく、例えば血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、以下VEGFと略す)、血管内皮増殖因子受容体(vascular endothelial growth factor receptor、以下VEGFRと略す)、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子(Kruppel-like factor、以下KLFと略す)、エクスプレスドシーケンスタグ(Ets)転写因子、核因子、低酸素誘導因子、細胞周期関連因子、染色体複製関連因子、染色体修復関連因子、微小管関連因子、増殖シグナル経路関連因子、増殖関連転写因子、アポトーシス関連因子等のタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられ、具体的にはVEGF遺伝子、VEGFR遺伝子、線維芽細胞増殖因子遺伝子、線維芽細胞増殖因子受容体遺伝子、血小板由来増殖因子遺伝子、血小板由来増殖因子受容体遺伝子、肝細胞増殖因子遺伝子、肝細胞増殖因子受容体遺伝子、KLF遺伝子、Ets転写因子遺伝子、核因子遺伝子、低酸素誘導因子遺伝子、細胞周期関連因子遺伝子、染色体複製関連因子遺伝子、染色体修復関連因子遺伝子、微小管関連因子遺伝子(例えば、CKAP5遺伝子等)、増殖シグナル経路関連因子遺伝子(例えば、KRAS遺伝子等)、増殖関連転写因子遺伝子、アポトーシス関連因子(例えば、BCL-2遺伝子等)等が挙げられる。
また、本発明における標的遺伝子としては、例えば、肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子が好ましく、肝臓において発現する遺伝子がより好ましく、例えば前記の腫瘍または炎症に関連する遺伝子、B型肝炎ウイルスゲノム、C型肝炎ウイルスゲノム、アポリポタンパク質(APO)、ヒドロキシメチルグルタリル(HMG)CoA還元酵素、ケキシン 9 型セリンプロテアーゼ(PCSK9)、第12因子、グルカゴン受容体、グルココルチコイド受容体、ロイコトリエン受容体、トロンボキサンA2受容体、ヒスタミンH1受容体、炭酸脱水酵素、アンギオテンシン変換酵素、レニン、p53、チロシンホスファターゼ(PTP)、ナトリウム依存性グルコース輸送担体、腫瘍壊死因子、インターロイキン、ヘプシジン、トランスサイレン、アンチトロンビン、プロテインC、マトリプターゼ酵素(例えば、TMPRSS6遺伝子等)等のタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。
標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えば蛋白質等をコードする遺伝子(標的遺伝子)のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含み、かつ標的遺伝子の発現を抑制する核酸であれば、例えばsiRNA(short interference RNA)、miRNA(micro RNA)等の二本鎖核酸、shRNA(short hairpin RNA)、アンチセンス核酸、リボザイム等の一本鎖核酸等、いずれの核酸を用いてもよいが、二本鎖核酸が好ましい。
標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸といい、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸ともいう。センス鎖核酸は、標的遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸そのもの等、アンチセンス鎖核酸と対合して二重鎖形成部ができる核酸をいう。
二本鎖核酸とは、二本の鎖が対合し二重鎖形成部を有する核酸をいう。二重鎖形成部とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖形成部を構成する塩基対は、通常15〜27塩基対であり、15〜25塩基対が好ましく、15〜23塩基対がより好ましく、15〜21塩基対がさらに好ましく、15〜19塩基対が特に好ましい。
二重鎖形成部のアンチセンス鎖核酸としては、例えば標的遺伝子のmRNAの一部配列からなる核酸、または該核酸において1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつ標的蛋白質の発現抑制活性を有する核酸が好適に用いられる。二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常15〜30塩基(ヌクレオシド)の連なりからなるが、15〜29塩基が好ましく、15〜27塩基がより好ましく、15〜25塩基がさらに好ましく、17〜23塩基が特に好ましく、19〜21塩基が最も好ましい。
二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖、センス鎖のいずれか一方、または両方の核酸は、二重鎖形成部に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加の核酸を有してもよい。この二重鎖を形成しない部分を突出部(オーバーハング)ともいう。
突出部を有する二本鎖核酸としては、例えば少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜4塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、dTdTまたはUUからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。
また、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの塩基配列と一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの相補鎖の塩基配列と一部または全てが一致する配列を用いてもよい。さらに、標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により前記の二本鎖核酸を生成する核酸分子(国際公開第2005/089287号)や、3’末端や5’末端の突出部を有していない二本鎖核酸等を用いることもできる。
また、前記の二本鎖核酸がsiRNAである場合、好ましくはアンチセンス鎖は、5’末端側から3’末端側に向って少なくとも1〜17番目の塩基(ヌクレオシド)の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する17塩基の配列と相補的な塩基の配列であり、より好ましくは、該アンチセンス鎖は、5’末端側から3’末端側に向って1〜19番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する19塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、1〜21番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する21塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、1〜25番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する25塩基の配列と相補的な塩基の配列である。
さらに、本発明で用いられる核酸がsiRNAである場合、好ましくは該核酸中の糖の10〜70%、より好ましくは15〜60%、さらに好ましくは20〜50%が、2’位において修飾基で置換されたリボースである。本発明における2’位において修飾基で置換されたリボースとは、リボースの2’位の水酸基が修飾基に置換されているものを意味し、リボースの2’位の水酸基と立体配置が同じであっても異なっていてもよいが、好ましくはリボースの2’位の水酸基と立体配置が同じである。2’位において修飾基で置換されたリボースにおける修飾基としては、糖部修飾ヌクレオチドにおける2’-修飾ヌクレオチドにおける修飾基の定義で例示したものおよび水素原子が挙げられ、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル等が好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチル)アミノオキシ]エチル、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル、水素原子等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ、水素原子等がさらに好ましく、2’-O-メチルおよび2’-O-フルオロが最も好ましい。
本発明で用いられる核酸は、核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。
また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の5’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ5’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の3’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ3’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
一本鎖の核酸としては、例えば標的遺伝子の連続する15〜27塩基(ヌクレオシド)、好ましくは15〜25塩基、より好ましくは15〜23塩基、さらに好ましくは15〜21塩基、特に好ましくは15〜19塩基からなる配列の相補配列からなる核酸、または該核酸において1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつ標的蛋白質の発現抑制活性を有する核酸であればいずれでもよい。該一本鎖の核酸は、15〜30塩基(ヌクレオシド)の連なりからなることが好ましく、より好ましくは15〜27塩基、さらに好ましくは15〜25塩基、特に好ましくは15〜23塩基の一本鎖核酸が好適に用いられる。
一本鎖核酸として、上記の二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を、スペーサー配列(スペーサーオリゴヌクレオチド)を介して連結したものを用いてもよい。スペーサーオリゴヌクレオチドとしては6〜12塩基の一本鎖核酸分子が好ましく、その5’末端側の配列は2個のUであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、UUCAAGAGAの配列からなる核酸が挙げられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれるアンチセンス鎖およびセンス鎖の順番はどちらが5’側になってもよい。該一本鎖核酸としては、例えばステムループ構造によって二重鎖形成部を有するshRNA等の一本鎖核酸であることが好ましい。shRNA等の一本鎖核酸は、通常50〜70塩基長である。
リボヌクレアーゼ等の作用により、上記の一本鎖核酸または二本鎖核酸を生成するように設計した、70塩基長以下、好ましくは50塩基長以下、さらに好ましくは30塩基長以下の核酸を用いてもよい。
なお、本発明で用いられる核酸は、既知のRNAまたはDNA合成法、およびRNAまたはDNA修飾法を用いて製造することができる。
本発明の組成物は、本発明のカチオン性脂質および核酸を含有する組成物であり、例えば本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体を含有する組成物、該複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する組成物等が挙げられる。該脂質膜は、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、本発明のカチオン性脂質、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、該複合体および/または該脂質膜に、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質を含有していてもよい。
また、本発明の組成物としては、例えば本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物等も挙げられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。また、該脂質膜に、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。
本発明の組成物において、本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体を含有する組成物、本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物、ならびに本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物がより好ましく、本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体を含有する組成物、ならびに本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物がさらに好ましく、本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物が最も好ましい。なお、いずれの場合も該脂質膜に、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、該複合体および/または該脂質膜に、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質を含有していてもよい。
複合体の形態としては、例えば核酸と脂質一重(一分子)層からなる膜(逆ミセル)との複合体、核酸とリポソームとの複合体、核酸とミセルとの複合体等が挙げられ、好ましくは核酸と脂質一重層からなる膜との複合体または核酸とリポソームとの複合体が挙げられる。
複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する組成物としては、例えば該複合体および該複合体を脂質二重膜で封入するリポソーム等が挙げられる。
なお、本発明の組成物には、本発明のカチオン性脂質を一種または複数種を使用してよく、また本発明のカチオン性脂質には、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質を混合してもよい。
本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質としては、例えば、特開昭61-161246号公報(米国特許5049386号明細書)中で開示される、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N-(2,3-ジ-(9-(Z)-オクタデセノイルオキシ))-プロパ-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)等、国際公開第91/16024号および国際公開第97/019675号中で開示される、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DORIE)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)等、国際公開第2005/121348号中で開示される、DLinDMA等、国際公開第2009/086558号中で開示される、DLin-K-DMA、国際公開第2011/136368号中で開示される、(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)-1-メチルピロリジン、N-メチル-N,N-ビス(2-((Z)-オクタデカ-6-エニルオキシ)エチル)アミン等が挙げられ、好ましくはDOTMA、DOTAP、DORIE、DOSPA、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)等の2つの非置換アルキル基を有する3級アミン部位または3つの非置換アルキル基を有する4級アンモニウム部位を有するカチオン性脂質が挙げられ、より好ましくは、該3級アミン部位を有するカチオン性脂質が挙げられる。該3級アミン部位および該4級アンモニウム部位の非置換アルキル基はメチル基であることがより好ましい。
なお、本発明の組成物は、核酸を含有することができるが、核酸と化学的に近似した化合物も含有することもできる。
本発明の組成物は、公知の製造方法またはそれに準じて製造することができ、いかなる製造方法で製造されたものであってよい。例えば、組成物の1つであるリポソームを含有する組成物の製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム(Bangham)らのリポソーム調製法[“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)”,1965年,第13巻,p.238-252参照]、エタノール注入法[“ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J.Cell Biol.)”,1975年,第66巻,p.621-634参照]、フレンチプレス法[“エフイービーエス・レターズ(FEBS Lett.)”,1979年,第99巻,p.210-214参照]、凍結融解法[“アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch.Biochem.Biophys.)”,1981年,第212巻,p.186-194参照]、逆相蒸発法[“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)”,1978年,第75巻, p.4194-4198参照]またはpH勾配法(例えば特許第2572554号公報、特許第2659136号公報等参照)等が挙げられる。リポソームの製造の際にリポソームを分散させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインまたはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖または塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、例えば、本発明のカチオン性脂質、または本発明のカチオン性脂質と本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質との混合物等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒を留去した後、生理食塩水等を添加、振とう攪拌し、リポソームを形成させることによってもリポソームを製造することができる。
また、本発明の組成物は、例えば、本発明のカチオン性脂質、または本発明のカチオン性脂質と本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質との混合物をクロロホルムに予め溶解し、次いで核酸の水溶液とメタノールを加えて混合してカチオン性脂質/核酸の複合体を形成させ、さらにクロロホルム層を取り出し、これにポリエチレングリコール化リン脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型(W/O)エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理して製造する方法(特表2002-508765号公報参照)や、核酸を、酸性の電解質水溶液に溶解し、例えば、本発明のカチオン性脂質、または本発明のカチオン性脂質と本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質との混合物(エタノール中)を加え、エタノール濃度を20v/v%まで下げて前記核酸内包リポソームを調製し、サイジングろ過し、透析によって、過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにpHを上げて透析して組成物表面に付着した核酸を除去して製造する方法(特表2002-501511号公報およびバイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta),2001年,第1510巻,p.152-166参照)等によって製造することができる。
本発明の組成物のうち、本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入した脂質二重膜を含有するリポソームを含有する組成物は、例えば、国際公開第02/28367号および国際公開第2006/080118号等に記載の製造方法に従って製造することができる。
また、本発明の組成物のうち、例えば本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入した脂質膜を含有する組成物、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物等は、国際公開第02/28367号および国際公開第2006/080118号等に記載の製造方法に従って、それぞれの複合体を製造し、水または0〜40%エタノール水溶液中に、該複合体を溶解させずに分散させ(A液)、別途、それぞれの脂質膜成分を、例えばエタノール水溶液中に溶解させ(B液)、等量または体積比1:1〜7:3のA液とB液を混合し、さらに適宜に水を加えることで得ることができる。なお、A液およびB液中のカチオン性脂質としては、一種または複数種の本発明のカチオン性脂質または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質を使用してよく、また本発明のカチオン性脂質と本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質を組み合わせて混合して使用してもよい。
なお、本発明において、本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入した脂質膜を含有する組成物、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物等の製造中および製造後に、複合体中の核酸と脂質膜中のカチオン性脂質との静電相互作用や、複合体中のカチオン性脂質と脂質膜中のカチオン性脂質との融合によって、複合体および膜の構造が変位したものも、それぞれ本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入した脂質膜を含有する組成物、または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物等に包含される。
国際公開第02/28367号および国際公開第2006/080118号等に記載の製造方法に従って、核酸(前記と同義)、好ましくは二本鎖核酸と本発明のカチオン性脂質および/または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質を含有するリポソームとの複合体を製造し、水または0〜40%エタノール水溶液中に、該複合体を溶解させずに分散させ(A液)、別途、本発明のカチオン性脂質および/または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質を、エタノール水溶液中に溶解させ(B液)、等量または体積比1:1〜7:3のA液とB液を混合すること、または、さらに適宜に水を加えることでも、該核酸と該カチオン性脂質を含有する組成物を得ることができる。該組成物は、好ましくはカチオン性脂質と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する組成物であるか、または該核酸と該カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する組成物である。これらの場合の脂質膜は、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。
また、本開示の該核酸と該リポソームとの複合体中のリポソームは、予め大きさを、平均粒子径10nm〜400nm、より好ましくは20nm〜110nm、さらに好ましくは30nm〜80nmに調節したリポソームが好ましい。また、該複合体および/または脂質膜に、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、A液は、リポソームと該核酸との複合体を形成させることができれば、エタノール濃度は、20〜70%であってもよい。
また、等量のA液とB液を混合する代わりに、A液とB液を混合後に複合体が溶解せず、かつB液中のカチオン性脂質が溶解しないエタノール濃度となる比率で混ぜてもよい。好ましくは複合体が溶解せず、B液中のカチオン性脂質が溶解せず、かつエタノール濃度が30〜60%のエタノール水溶液になるような比でA液とB液を混合することに代えてもよく、あるいはA液とB液を混合後に複合体が溶解しないようなエタノール濃度になるような比でA液とB液を混合し、さらに水を加えることで、B液中のカチオン性脂質が溶解しなくなるエタノール濃度にすることにしてもよい。
本開示の該A液中での核酸とリポソームとの複合体は、A液とB液を混合し、さらに適宜に水を加えた後には、カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)と核酸との複合体に形態が変化している。本開示の製造方法で得られる該核酸と該カチオン性脂質を含有する組成物は、好ましくはカチオン性脂質と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する組成物であり、または、カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜にカチオン性脂質を含有する組成物であり、その製造性(収率および/または均一性)は優れている。
本発明の組成物において、複合体中の本発明のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して0.5〜4倍であるのが好ましく、1.5〜3.5倍であるのがより好ましく、2〜3倍であるのがさらに好ましい。また、該複合体中の本発明のカチオン性脂質および本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して0.5〜4倍であるのが好ましく、1.5〜3.5倍であるのがより好ましく、2〜3倍であるのがさらに好ましい。
本発明の組成物において、複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する組成物中の本発明のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1〜10倍であるのが好ましく、2.5〜9倍であるのがより好ましく、3.5〜8倍であるのがさらに好ましい。また、該組成物中の本発明のカチオン性脂質および本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1〜10倍であるのが好ましく、2.5〜9倍であるのがより好ましく、3.5〜8倍であるのがさらに好ましい。
中性脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイドまたはステロール等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の組成物において中性脂質を含有する場合には、中性脂質の分子の総数は、本発明のカチオン性脂質および本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.1〜2倍であるのが好ましく、0.2〜1.5倍であるのがより好ましく、0.3〜1.2倍であるのがさらに好ましい。本発明の組成物は、いずれも中性脂質を、複合体に含有してもよく、複合体を封入する脂質膜に含有していてもよく、少なくとも複合体を封入する脂質膜に含有していることがより好ましく、複合体および該複合体を封入する脂質膜のどちらにも含有していることがさらに好ましい。
中性脂質におけるリン脂質としては、例えばホスファチジルコリン(具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)等)、ホスファチジルエタノールアミン(具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、16-0-モノメチルPE、16-0-ジメチルPE、18-1-トランスPE、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、1 -ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)等)、グリセロリン脂質(具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、リゾホスファチジルコリン等)、スフィンゴリン脂質(具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等)、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン(具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等)または水素添加リン脂質(具体的には水素添加大豆ホスファチジルコリン等)等の天然または合成のリン脂質が挙げられる。
中性脂質におけるグリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリドまたはグリコシルジグリセリド等が挙げられる。
中性脂質におけるスフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド等が挙げられる。
中性脂質におけるスフィンゴイドとしては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシンまたはそれらの誘導体等が挙げられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガンまたはスフィンゴシン等の-NH2を-NHCO(CH2)xCH3(式中、xは0〜18の整数であり、中でも6、12または18が好ましい)に変換したもの等が挙げられる。
中性脂質におけるステロールとしては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロールまたは3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)等が挙げられる。
高分子としては、例えばタンパク質、アルブミン、デキストラン、ポリフェクト(polyfect)、キトサン、デキストラン硫酸、例えばポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸またはポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の高分子またはそれらの塩の1以上からなるミセル等が挙げられる。
ここで、高分子の塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩または亜鉛塩等が挙げられる。アンモニウム塩としては、例えばアンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩またはクエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。有機アミン付加塩としては、例えばモルホリンまたはピペリジン等の付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはリジン等の付加塩が挙げられる。
また、本発明の組成物はいずれも、例えば糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または界面活性剤等を含有することが好ましく、複合体に含有していてもよく、複合体を封入する脂質膜に含有していてもよく、複合体および該複合体を封入する脂質膜ともに含有していることがより好ましい。
本発明の組成物が、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有する場合には、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体および脂肪酸誘導体の分子の総数は、本発明のカチオン性脂質および本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.01〜0.3倍であるのが好ましく、0.02〜0.25倍であるのがより好ましく、0.03〜0.15倍であるのがさらに好ましい。
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または界面活性剤としては、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体が挙げられ、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体が挙げられる。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または界面活性剤は、分子の一部が組成物の他の構成成分と例えば疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもち、他の部分が組成物の製造時の溶媒と例えば親水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもつ、2面性をもつ物質であるのが好ましい。
糖、ペプチドまたは核酸の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、または例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNA、ODN等の核酸と、前記組成物の定義の中で挙げた中性脂質もしくは本発明のカチオン性脂質または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等が挙げられる。
また、糖の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば前記組成物の定義の中で挙げたグリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質等も含まれる。
水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、前記組成物の定義の中で挙げた中性脂質もしくは本発明のカチオン性脂質、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの、それらの塩等が挙げられ、より好ましくは、ポリエチレングリコールまたはポリグリセリン等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体およびそれらの塩が挙げられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコールの脂質誘導体または脂肪酸誘導体およびそれらの塩が挙げられる。
ポリエチレングリコールの脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質[具体的にはポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミン(より具体的には1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DSPE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DMPE)等)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、クレモフォアイーエル(CREMOPHOR EL)等]、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル類(具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等)またはポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等が挙げられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質が挙げられる。
ポリグリセリンの脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリグリセリン化脂質(具体的にはポリグリセリン-ホスファチジルエタノールアミン等)またはポリグリセリン脂肪酸エステル類等が挙げられ、より好ましくは、ポリグリセリン化脂質が挙げられる。
界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(具体的にはポリソルベート80等)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール(具体的にはプルロニックF68等)、ソルビタン脂肪酸エステル(具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等)、ポリオキシエチレン誘導体(具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等)、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等が挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等が挙げられる。
また、本発明の組成物中の複合体および脂質膜には、例えば水溶性高分子等による表面改質も任意に行うことができる[ラジック(D.D.Lasic)、マーティン(F.Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc),1995年,p.93-102参照]。表面改質に使用し得る水溶性高分子としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等が挙げられ、好ましくはデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチンまたはヒドロキシエチルデンプン等が挙げられる。また、表面改質には、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体または脂肪酸誘導体(前記と同義)等を用いることができる。該表面改質は、本発明の組成物中の複合体および脂質膜に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または界面活性剤を含有させる方法の1つである。
また、標的化リガンドを、本発明の組成物の脂質成分の極性ヘッド残基に共有結合することにより本発明の組成物の表面に直接結合させることも任意に行うことができる(国際公開第2006/116107号参照)。
本発明の組成物中の複合体または複合体を封入する脂質膜の平均粒子径は、所望により自由に選択できるが、下記する平均粒子径とするのが好ましい。平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム(MLV)等を機械的に粉砕(具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用)する方法[ミュラー(R.H.Muller)、ベニタ(S.Benita)、ボーム(B.Bohm)編著,“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)”,ドイツ,サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト(Scientific Publishers Stuttgart),1998年,p.267-294参照]等が挙げられる。
本発明の組成物中の複合体の大きさは、平均粒子径が約5nm〜200nmであるのが好ましく、約20nm〜150nmであるのがより好ましく、約30nm〜100nmであるのがさらに好ましい。
本発明の組成物(複合体を封入する脂質膜)の大きさは、平均粒子径が約10nm〜300nmであるのが好ましく、約30nm〜200nmであるのがより好ましく、約50nm〜150nmであるのがさらに好ましい。
本発明の組成物中の複合体または複合体を封入する脂質膜の平均粒子径は、例えば動的光散乱法で測定することができる。
本発明の組成物を、哺乳動物の細胞に導入することで、本発明の組成物中の核酸を細胞内に導入することができる。
インビボにおける本発明の組成物の哺乳動物の細胞への導入は、インビボにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。例えば、本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば腫瘍または炎症の生じた臓器または部位へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の核酸を導入することができる。腫瘍または炎症の生じた臓器または部位としては、特に限定されないが、例えば胃、大腸、肝臓、肺、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱、皮膚、血管、眼球等が挙げられる。また、本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば肝臓、肺、脾臓および/または腎臓へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の核酸を導入することができる。肝臓、肺、脾臓および/または腎臓の細胞は、正常細胞、腫瘍もしくは炎症に関連した細胞またはその他の疾患に関連した細胞のいずれでもよい。
本発明の組成物中の核酸が、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸であれば、インビボで哺乳動物の細胞内に、標的遺伝子の発現を抑制する該核酸等を導入することができ、標的遺伝子の発現の抑制ができる。投与対象は、人であることが好ましい。
また、本発明における標的遺伝子が、例えば肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子、好ましくは肝臓において発現する遺伝子であれば、本発明の組成物を、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤または予防剤、好ましくは肝臓に関連する疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。即ち、本発明は、上記説明した本発明の組成物を哺乳動物に投与する肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療方法も提供する。投与対象は、人であることが好ましく、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患に罹患している人がより好ましい。
また、本発明の組成物は、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤または予防剤に関するインビボの薬効評価モデルにおいて、標的遺伝子を抑制することの有効性を検証するためのツールとして使用することもできる。
本発明の組成物は、例えば血液成分等の生体成分(例えば血液、消化管等)中での前記核酸の安定化、副作用の低減または標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器への薬剤集積性の増大等を目的とする製剤としても使用できる。
本発明の組成物を、医薬品の肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患等の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、例えば口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内等の非経口投与または経口投与を挙げることができ、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与を挙げることができ、より好ましくは静脈内投与が挙げられる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば核酸に換算した1日投与量が約0.1μg〜1000mgとなるように投与すればよい。
静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤が挙げられ、上述の方法により調製した組成物の分散液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該分散液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該分散液を凍結乾燥して使用する、および/または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースもしくはグリシン等の賦形剤を加えた分散液を凍結乾燥して使用することもできる。
注射剤の場合、前記の組成物の分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
次に、実施例、参考例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例、参考例および試験例に限定されるものではない。
なお、実施例および参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHz、400MHzまたは500MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いている。
参考例1
2,2-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル]プロパン-1,3-ジオール(化合物IIc-1)
マロン酸ジメチル (東京化成工業社製, 0.50 g, 3.78 mmol)をテトラヒドロフラン (20 mL)に溶解させ、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (ニューチェック・プレップ・インク(Nu-Chek Prep,Inc)社製, 3.26 g, 9.46 mmol)、水素化ナトリウム (ナカライテスク社製, 油性60%, 0.454 g, 11.4 mmol)およびヨウ化テトラブチルアンモニウム (和光純薬工業社製, 0.280 g, 0.757 mmol)を加えて、70℃で3時間撹拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、水層をヘプタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をショートカラムにて精製することで2,2-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル]マロン酸ジメチルの粗生成物を得た。
得られた粗生成物をテトラヒドロフラン (4 mL)に溶解させ、氷冷下水素化アルミニウムリチウム (東京化成工業社製, 0.826 g, 21.8 mmol)を加え、1時間撹拌した。反応混合物に水 (0.75 mL)、15% 水酸化ナトリウム水溶液 (0.75 mL)、水 (2.25 mL)を順次加え、反応を停止した。生じた不溶物をろ過することにより除去した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル=80/20)で精製することにより、化合物IIc-1 (1.51 g, 収率70%)を得た。
ESI-MS m/z: 573 (M + H)+
1-メチル-3,3-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル]アゼチジン(化合物1)
工程１
参考例1で得られる化合物IIc-1 (1.00 g, 1.75 mmol)をジクロロメタン(5 mL)に溶解させ、ピリジン (和光純薬工業社製, 1.41 mL, 17.5 mmol)およびジメチルアミノピリジン (ナカライテスク社製, 0.0210 g, 0.175 mmol)を加えた。氷冷下、無水トリフルオロメタンスルホン酸 (ナカライテスク社製, 0.855 mL, 5.24 mmol)を加え、1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、ヘプタンで3回抽出した。有機層を塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮することで、2,2-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル]プロパン-1,3-ジイル ビス(トリフルオロメタンスルホナート)の粗生成物 (1.50g, 収率100%)を得た。
工程2
工程1で得られる粗生成物 (0.500 g, 0597 mmol)をN,N-ジメチルアセトアミド (3 mL)に溶解させ、メチルアミン (東京化成工業社製, 約9.8 mol/Lメタノール溶液, 3.05 mmol, 29.9 mmol)を加え、油浴上60℃で1時間撹拌した。室温まで冷却後、反応混合物に水を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(NHシリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル=100/0〜70/30)で精製することで、化合物1 (0.32 g, 収率94%)を得た。
ESI-MS m/z: 568(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 6.8 Hz), 1.12-1.38 (36H, m), 1.48-1.55 (4H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.30 (3H, s), 2.78 (4H, t, J = 6.8 Hz), 2.93 (4H, s), 5.29-5.43 (8H, m).
3,3-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル]-1-プロピルアゼチジン(化合物2)
工程1
参考例1で得られる化合物IIc-1 (3.50 g, 6.11 mmol)をジクロロメタン (15 mL)に溶解させ、氷冷下トリエチルアミン (和光純薬工業社製, 2.55 mL, 18.3 mmol)およびメシル酸クロリド(東京化成工業社製, 1.12 mL, 15.3 mmol)加え、1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、ヘプタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜97/3)で精製することで、2,2-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル]プロパン-1,3-ジイル ジメタンスルホナート (3.30 g,収率74%)を得た。
工程2
工程1で得られる2,2-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル]プロパン-1,3-ジイル ジメタンスルホナート (0.200 g, 0.274 mmol)をN,N-ジメチルアセトアミド (0.5 mL)に溶解させ、プロピルアミン (0.451 mL, 5.49 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて130℃で6時間攪拌した。反応混合物に水を加え、ヘプタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(NHシリカゲル、ヘプタン/酢酸エチル=100/0〜80/20)で精製することで、化合物2 (14.8 mg, 収率9%)を得た。
ESI-MS m/z: 597(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.84-0.92 (9H, m), 1.11-1.41 (38H, m), 1.49-1.56 (4H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.6 Hz), 2.36 (2H, t, J = 7.7 Hz), 2.77 (4H, t, J = 5.9 Hz), 2.90 (4H, s), 5.27-5.45 (8H, m).
3,3-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル]アゼチジン(化合物3)
実施例1と同様の方法で、メチルアミンの代わりにアンモニア (シグマアルドリッチ(Sigma-Aldrich) 社製, 約7 mol/Lメタノール溶液, 4.27 mL, 29.9 mmol)を用い、化合物3 (0.0750g, 収率23%)を得た。
ESI-MS m/z: 554(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3)δ: 0.89 (6H, t, J = 7.0 Hz), 1.12-1.38 (36H, m), 1.53-1.58 (4H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.78 (4H, t, J = 6.8 Hz), 3.28 (4H, s), 5.31-5.41 (8H, m).
3-(ジメチルアミノ)プロピル 3,3-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル]アゼチジン-1-カルボキシラート(化合物4)
実施例3で得られた化合物3をアセトニトリル (2 mL)に溶解させ、“ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(J.Am.Chem.Soc.)”,1981年,第103巻,p.4194-4199記載の方法に準じた方法で合成した3-(ジメチルアミノ)プロピル 4-ニトロフェニルカルボナート塩酸塩(化合物VII-1) (0.0620 g, 0.203 mmol)およびトリエチルアミン (0.0570 mL, 0.406 mmol)を加え、80℃で2時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(NHシリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル=80/20)で精製することにより、化合物4 (0.0580 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 683(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 6.8 Hz), 1.13-1.22 (4H, m), 1.25-1.39 (32H, m), 1.49-1.55 (4H, m), 1.73-1.81 (2H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.22 (6H, s), 2.33 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.77 (4H, t, J = 6.8 Hz), 3.58 (4H, s), 4.08 (2H, t, J = 6.5 Hz), 5.29-5.42 (8H, m).
参考例2
2,2-ビス[(Z)-オクタデカ-9-エン-1-イル]プロパン-1,3-ジオール(化合物IIc-2)
参考例1と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートの代わりに(Z)-オクタデカ-9-エン-1-イル メタンスルホナート (Nu-Chek Prep,Inc社製, 4.50 g, 13.0 mmol)を用い、化合物IIc-2 (1.06 g, 収率35%)を得た。
ESI-MS m/z: 577(M + H)+
1-メチル-3,3-ビス[(Z)-オクタデカ-9-エン-1-イル]アゼチジン(化合物5)
実施例1と同様の方法で、参考例1で得られる化合物IIc-1の代わりに参考例2で得られる化合物IIc-2 (0.300 g, 0.520 mmol)を用い、化合物5 (0.272 g, 収率92%)を得た。
ESI-MS m/z: 572(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz), 1.14-1.35 (48H, m), 1.50-1.53 (4H, m), 2.02 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.31 (3H, s), 2.94 (4H, s), 5.31-5.39 (4H, m).
参考例3
2,2-ビス[(Z)-ヘキサデカ-9-エン-1-イル]プロパン-1,3-ジオール(化合物IIc-3)
参考例1と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートの代わりに(Z)-ヘキサデカ-9-エン-1-イル メタンスルホナート (Nu-Chek Prep,Inc社製, 5.00 g, 15.7 mmol)を用い、化合物IIc-3 (2.07 g, 収率59%)を得た。
ESI-MS m/z: 521(M + H)+
3,3-ビス[(Z)-ヘキサデカ-9-エン-1-イル]-1-メチルアゼチジン(化合物6)
実施例1と同様の方法で、参考例1で得られる化合物IIc-1の代わりに参考例3で得られる化合物IIc-3 (0.300 g, 0.576 mmol)を用い、化合物6 (0.263 g, 収率89%)を得た。
ESI-MS m/z: 516(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 6.8 Hz), 1.14-1.35 (40H, m), 1.50-1.53 (4H, m), 2.02 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.31 (3H, s), 2.94 (4H, s), 5.31-5.39 (4H, m).
参考例4
2,2-ビス[(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエン-1-イル]プロパン-1,3-ジオール(化合物IIc-4)
参考例1と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートの代わりに(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエン-1-イル メタンスルホナート (Nu-Chek Prep,Inc社製, 5.00 g, 13.4 mmol)を用い、化合物IIc-4 (2.07 g, 収率59%)を得た。
ESI-MS m/z: 629(M + H)+
3,3-ビス[(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエン-1-イル]-1-メチルアゼチジン(化合物7)
実施例1と同様の方法で、参考例1で得られる化合物IIc-1の代わりに参考例4で得られる化合物IIc-4 (0.300 g、0.477 mmol)を用い、化合物7(0.256 g、収率86%)を得た。
ESI-MS m/z: 624(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.16-1.37 (44H, m), 1.50-1.54 (4H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.31 (3H, s), 2.78 (4H, t, J = 6.4 Hz), 2.94 (4H, s), 5.30-5.42 (8H, m).
3-(3,3-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アゼチジン-1-イル)プロパン-1-オール(化合物8)
実施例1と同様の方法で、メチルアミンの代わりに3-アミノプロパン-1-オール (東京化成工業社製, 0.468 mL, 6.16 mmol)を用い、化合物8 (0.237 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 613(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3)δ: 0.89 (6H, t, J = 6.8 Hz), 1.13-1.39 (40H, m), 1.50-1.56 (2H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.69 (2H, t, J = 5.4 Hz), 2.77 (4H, t, J = 6.3 Hz), 2.93 (4H, s), 3.75 (2H, t, J = 5.4 Hz), 5.27-5.44 (8H, m).
2-(3,3-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アゼチジン-1-イル)エタン-1-オール(化合物9)
実施例2と同様の方法で、メチルアミンの代わりに2-アミノエタノール (東京化成工業社製, 0.800 g, 13.1 mmol)を用い、化合物9 (0.012 g, 収率13%)を得た。
ESI-MS m/z: 598(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3)δ: 0.89 (6H, t, J = 6.8 Hz), 1.14-1.42 (40H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.5 Hz), 2.59 (2H, t, J = 5.3 Hz), 2.77 (4H, t, J = 5.9 Hz), 2.96 (4H, s), 3.48 (2H, t, J = 5.3 Hz), 5.28-5.44 (8H, m).
参考例5
2-デシル-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)プロパン-1,3-ジオール (化合物IIc-5)
工程1
マロン酸ジメチル (0.400 g, 3.03 mmol)をアセトニトリル (10 mL)に溶解させ、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (1.25 g, 3.63 mmol)、炭酸セシウム (和光純薬工業社製, 1.97 g, 6.06 mmol)およびヨウ化テトラブチルアンモニウム (1.34 g, 3.63 mmol)を加えて、60℃で1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=90/10)にて精製することでジメチル 2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)マロナート (0.800 g, 収率69%)を得た。
ESI-MS m/z: 381(M + H)+;
工程2
工程1で得られたジメチル 2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)マロナート(0.400 g, 1.05 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解させ、1-ブロモデカン(東京化成工業社製, 0.326 g, 1.58 mmol)、水素化ナトリウム (油性60%, 0.063 g, 1.58 mmol)およびヨウ化テトラブチルアンモニウム (0.280 g, 0.757 mmol)を加えて、70℃で3時間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過した。ろ液を減圧濃縮することにより、ジメチル 2-デシル-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)マロナートの粗生成物を得た。
得られた粗生成物をテトラヒドロフラン (3 mL)に溶解させ、氷冷下水素化アルミニウムリチウム (0.122 g, 3.23 mmol)を加え、1時間撹拌した。反応混合物に水 (0.1 mL)、15% 水酸化ナトリウム水溶液 (0.1 mL)、水 (0.3 mL)を順次加え、反応を停止した。生じた不溶物をろ過することにより除去した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=90/10〜50/50)で精製することにより、化合物IIc-5 (0.265 g, 収率53%)を得た。
ESI-MS m/z: 465(M + H)+
3-デシル-1-メチル-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アゼチジン(化合物10)
実施例1と同様の方法で、参考例1で得られる化合物IIc-1の代わりに参考例5で得られる化合物IIc-5 (0.265 g, 0.570 mmol)を用い、化合物10 (0.206 g, 収率79%)を得た。
ESI-MS m/z: 460(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.84-0.93 (6H, m), 1.11-1.40 (34, m), 1.50-1.55 (4H, m), 2.05 (4H, q, J = 6.8 Hz), 2.30 (3H, s), 2.77 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.93 (4H, s), 5.29-5.43 (4H, m).
3-(3,3-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アゼチジン-1-イル)-N,N-ジメチルプロパン-1-アミン(化合物11)
実施例1と同様の方法で、メチルアミンの代わりにN,N-ジメチル-1,3-プロパンジアミン (東京化成工業社製, 0.427 mL, 4.18 mmol)を用い、化合物11 (0.091 g, 収率34%)を得た。
ESI-MS m/z: 639(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3)δ:0.86 (6H, t, J = 7.0 Hz), 1.08-1.18 (4H, m), 1.21-1.38 (32H, m), 1.56-1.60 (4H, m), 1.61-1.69 (2H, m), 2.01 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.21 (6H, s), 2.31 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.65-2.72 (2H, m), 2.75 (4H, t, J = 6.7 Hz), 3.20 (4H, s), 5.25-5.40 (8H, m).
2-(3,3-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アゼチジン-1-イル)-N,N-ジメチルエタン-1-アミン(化合物12)
実施例1と同様の方法で、メチルアミンの代わりにN,N-ジメチルエチレンジアミン (東京化成工業社製, 0.709 mL, 6.51 mmol)を用い、化合物12 (0.312 g, 収率77%)を得た。
ESI-MS m/z: 625(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3)δ:0.89 (6H, t, J = 7.0 Hz), 1.11-1.20 (4H, m), 1.23-1.39 (32H, m), 1.49-1.55 (4H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.21 (6H, s), 2.22-2.26 (2H, m), 2.52-2.58 (2H, m), 2.77 (4H, t, J = 6.7 Hz), 2.93 (4H, s), 5.28-5.43 (8H, m).
参考例6
2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)-2-オクタデシルプロパン-1,3-ジオール (化合物IIc-6)
参考例5と同様の方法で、1-ブロモデカンの代わりに1-ブロモオクタデカン (東京化成工業社製, 0.394 g, 1.18 mmol)を用い、化合物IIc-6 (0.186 g, 通し収率28%)を得た。
ESI-MS m/z: 577(M + H)+
1-メチル-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)-3-オクタデシルアゼチジン(化合物13)
実施例1と同様の方法で、参考例1で得られる化合物IIc-1の代わりに参考例6で得られる化合物IIc-6 (0.186 g, 0.322 mmol)を用い、化合物13 (0.030 g, 収率16%)を得た。
ESI-MS m/z: 572(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ:0.84-0.90 (6H, m), 1.10-1.22 (4H, m), 1.23-1.38 (46H, m), 1.56-1.62 (4H, m), 2.04 (4H, q, J = 6.8 Hz), 2.51 (3H, s), 2.76 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.25 (4H, s), 5.28-5.42 (4H, m).
参考例7
1-((2-ニトロフェニル)スルホニル)-3,3-ビス(2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)エチル)アゼチジン(化合物XIIIf-1)
工程1
国際公開第2012/108397号に記載の方法で合成した2-((9Z,12)-オクタデカ9,12-ジエン-1-イルオキシ)エタノール (2.30 g, 7.41 mmol)をジクロロメタン(20 mL)に溶解させ、氷冷下トリエチルアミン (1.55 mL, 11.1 mmol)、2-ニトロベンゼン-1-スルホニルクロリド (2.13 g, 9.63 mmol)を加え、2時間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=90/10)にて精製することで2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)エチル 2-ニトロベンゼンスルホナート(1.93 g, 収率53%)を得た。
ESI-MS m/z: 496(M + H)+
工程2
工程1で得られた2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)エチル 2-ニトロベンゼンスルホナート (1.93g, 3.89 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (8 mL)に溶解させ、2-シアノ酢酸エチル (東京化成工業社製, 0.189 ml, 1.77 mmol)、炭酸セシウム (1.73 g, 5.30 mmol)を加えて、100℃で1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過した。ろ液を減圧濃縮することでエチル 2-シアノ-4-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)-2-(2-(((9Z,12Z)-オクタデエカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)エチル)ブタノアートの粗生成物を得た。
得られた粗生成物をテトラヒドロフラン (8 mL)に溶解させ、氷冷下水素化アルミニウムリチウム (0.239 g, 6.30 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物に水 (0.24 mL)、15%水酸化ナトリウム水溶液 (0.24 mL)、水 (0.72 mL)を順次加え、反応を停止した。生じた不溶物をろ過することにより除去した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=99/1〜50/50)で精製することにより、 2-(アミノエチル)-4-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)-2-(2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)エチル)ブタン-1-オール (0.350 g, 収率34%)を得た。
ESI-MS m/z: 660 (M + H)+
工程3
工程2で得られる2-(アミノエチル)-4-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)-2-(2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)エチル)ブタン-1-オール (0.53 g, 0.803 mmolをジクロロメタン (4 mL)に溶解させ、氷冷下トリエチルアミン (0.168 mL, 1.20 mmol)、2-ニトロベンゼン-1-スルホニルクロリド (0.231 g, 1.04 mmol)を加え、1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をヘキサンで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過した。ろ液を濃縮することによりN-(2-(ヒドロキシメチル)-4-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)-2-(2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)エチル)ブチル)-2-ニトロベンゼンスルホンアミドの粗生成物を得た。
得られた粗生成物をテトラヒドロフラン (4 mL)に溶解させ、トリフェニルホスフィン (ナカライテスク社製, 0.340 g, 1.30 mmol)、アゾジカルボン酸ジイソプロピル (東京化成工業社製, 40%トルエン溶液, 1.9 mol/L, 0.682 mL, 1.30 mmol)を加え、室温で15分撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜70/30)で精製することにより、化合物XIIIf-1 (0.585 g, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 827 (M + H)+
3,3-ビス(2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)エチル)アゼチジン(化合物14)
参考例7で得られた化合物XIIIf-1 (0.585 g, 0.707 mmol)をアセトニトリル (7 mL)に溶解させ、1-ドデカンチオール (東京化成工業社製, 0.412 mL, 1.77 mmol)、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン (ナカライテスク社製, 0.246 mL, 1.77 mmol)を加え、70℃で1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をNHシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=99/1〜30/70)で精製することにより、化合物14 (0.045 g, 収率10%)を得た。
ESI-MS m/z: 642(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 7.0 Hz), 1.24-1.39 (32H, m), 1.50-1.57 (4H, m), 1.91(4H, t, J = 7.0 Hz), 2.05 (8H, q, J = 6.9 Hz), 2.77 (4H, t, J = 6.6 Hz), 3.38 (4H, t, J = 6.7 Hz), 3.41 (4H, s), 3.46 (4H, t, J = 7.0 Hz), 5.28-5.44 (8H, m).
1-メチル−3,3-ビス(2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)エチル)アゼチジン(化合物15)
実施例14で得られる化合物14 (0.134 g, 0.209 mmol)を1,2-ジクロロエタン (1 mL)とメタノール (1 mL)に溶解させ、ホルムアルデヒド (和光純薬工業社製, 37%水溶液, 0.076 mL, 1.04 mmol)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド (東京化成工業社製, 0.111 g, 0.522 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をNHシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、化合物15 (0.088 g, 収率64%)を得た。
ESI-MS m/z: 656(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 6.8 Hz), 1.24-1.40 (32H, m), 1.49-1.57 (4H, m), 1.87 (4H, t, J = 6.8 Hz), 2.05 (8H, q, J = 6.9 Hz), 2.30 (3H, s), 2.77 (4H, t, J = 6.3 Hz), 3.04 (4H, s), 3.37 (4H, t, J= 6.7 Hz), 3.44 (4H, t, J = 7.0 Hz), 5.28-5.44 (8H, m).
参考例8
1-((2-ニトロフェニル)スルホニル)-3,3-ビス(3-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)プロピル)アゼチジン(化合物XIIIf-2)
工程1
(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (10.0 g、29.0 mmol)を1,4-ジオキサン (20 mL)に溶解させ、1,3-プロパンジオール (和光純薬工業社製, 55.2 g, 726 mmol)を加えて、加熱環流下2日間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロパン-1-オール (4.96 g, 収率53%)を得た。
ESI-MS m/z: 324(M + H)+;
工程2
工程1で得られた3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロパン-1-オール (4.95 g, 15.3 mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解させ、氷冷下トリエチルアミン (4.25 mL, 30.5 mmol)、メシル酸クロリド (2.36 mL、30.5 mmol)を加えて、0℃で2時間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロピル メタンスルホナート (5.47 g, 収率89%)を得た。
ESI-MS m/z: 403(M + H)+;
工程3
参考例7の工程2、工程3と同様の方法で、2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)エチル 2-ニトロベンゼンスルホナートの代わりに工程2で得られた3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロピル メタンスルホナート (1.57 g, 3.89 mmol)を用い、化合物XIIIf-2 (0.109 g, 通し収率7.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 855(M + H)+;
3,3-ビス(3-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)プロピル)アゼチジン(化合物16)
実施例14と同様の方法で、化合物XIIIf-1の代わりに化合物XIIIf-2 (0.109 g, 0.135 mmol)を用い、化合物16 (0.062 g, 収率69%)を得た。
ESI-MS m/z: 670(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 7.0 Hz), 1.22-1.40 (32H, m), 1.44-1.67 (12H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.8 Hz), 2.77 (4H, t, J = 6.7 Hz), 3.31 (4H, s), 3.39 (8H, t, J = 6.7 Hz), 5.28-5.45 (8H, m).
1-メチル−3,3-ビス(3-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)プロピル)アゼチジン(化合物17)
実施例15と同様の方法で、化合物14の代わりに化合物16 (0.062 g, 0.093 mmol)を用い、化合物17 (0.056 g, 収率88%)を得た。
ESI-MS m/z: 684(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 6.8 Hz), 1.23-1.40 (32H, m), 1.42-1.62 (12H, m), 2.05 (8H, q, J = 6.9 Hz), 2.31 (3H, s), 2.77 (4H, t, J = 6.7 Hz), 2.96 (4H, s), 3.35-3.43 (8H, m), 5.25-5.47 (8H, m).
2-ジメチル-3,3-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アゼチジン(化合物18)
工程1
シアノ酢酸エチル (2.00 g, 17.7 mmol)をアセトニトリル(50 mL)に溶解させ、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (13.4 g, 38.9 mmol)、炭酸セシウム(17.3 g, 53.1 mmol)を加えて、60℃で2時間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過した、ろ液を減圧濃縮することで、エチル (11Z,14Z)-2-シアノ-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエノアートの粗生成物を得た。
得られた粗生成物をテトラヒドロフラン (5 mL)に溶解させ、氷冷下水素化アルミニウムリチウム (2.49 g, 65.6 mmol)を加え、30分撹拌した。反応混合物に水 (2.5 mL)、15% 水酸化ナトリウム水溶液 (2.5 mL)、水 (7.5 mL)を順次加え、反応を停止した。生じた不溶物をろ過することにより除去した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=99/1〜90/10)で精製することにより、 (11Z,14Z)-2-(アミノエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール (2.50 g, 収率25%)を得た。
ESI-MS m/z: 572 (M + H)+
工程2
工程1で得られた(11Z,14Z)-2-(アミノエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール(2.50 g, 4.37 mmol)をテトラヒドロフラン(20 mL)に溶解させ、トリエチルアミン (1.83 mL, 13.1 mmol)、二炭酸tert-ブチル (渡辺化学社製, 1.12 mL, 4.81 mmol)を加えて、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=95/5)で精製することにより、tert-ブチル ((11Z,14Z)-2-(ヒドロキシメチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル)カルバマート (2.65 g, 収率90%)を得た。
ESI-MS m/z: 672 (M + H)+
工程3
工程2で得られたtert-ブチル ((11Z,14Z)-2-(ヒドロキシメチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル)カルバマート (2.10 g, 3.12 mmol)をジクロロメタン (10 mL)に溶解させ、氷冷下デスマーチン試薬 (東京化成工業社製, 1.72 g, 4.06 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応混合物に水を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=100/0〜80/20)で精製することにより、tert-ブチル ((11Z,14Z)-2-ホルミル-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル)カルバマート (2.00 g, 収率96%)を得た。
ESI-MS m/z: 670(M + H)+
工程4
工程3で得られたtert-ブチル((11Z,14Z)-2-ホルミル-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル)カルバマート (0.432 g, 0.645 mmol)をテトラヒドロフラン(2 mL)に溶解させ、氷冷下メチルマグネシウムブロミド (関東化学工業社製, mol/L, 0.258 mL, 0.774 mmol)を加えた。その後-50℃まで冷却し、メチルマグネシウムブロミド (3 mol/L, 0.150 mL, 0.451 mmol)を加えて、1時間撹拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜50/50)で精製することにより、tert-ブチル ((11Z,14Z)-2-(1-ヒドロキシエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル)カルバマート (0.200 g, 収率45%)を得た。
ESI-MS m/z: 686(M + H)+
工程5
工程4で得られるtert-ブチル ((11Z,14Z)-2-(1-ヒドロキシエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル)カルバマート (0.290 g, 0.423 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解させ、氷冷下ピリジン(0.171 mL, 2.11 mmol)、メシル酸クロリド (0.049 mL, 0.634 mmol)を加えて、0℃で30分撹拌した。さらにピリジン (0.171 mL, 2.11 mmol)、メシル酸クロリド (0.098 mL, 1.27 mmol)を順に添加し、反応を完結させた。反応混合物に水を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過した。得られたろ液を減圧濃縮することで、(12Z,15Z)-3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)メチル)-3- ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)ヘンイコサ-12,15-ジエン-2-イル メタンスルホナートの粗生成物を得た。
得られた粗生成物をN,N-ジメチルホルムアミド (8 mL)に溶解させ、氷冷下水素化ナトリウム (油性60%, 8 mg, 0.335 mmol)を加えた。その後、50℃で1時間撹拌し、室温で終夜撹拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜50/50)で精製することにより、tert-ブチル 2-メチル-3,3-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アゼチジン-1-カルボキシラート (0.070 g, 収率31%)を得た。
ESI-MS m/z: 668 (M + H)+
工程6
工程5で得られるtert-ブチル 2-メチル-3,3-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アゼチジン-1-カルボキシラート (0.090 g, 0.135 mmol)をジクロロメタン(2 mL)に溶解させ、氷冷下トリフルオロ酢酸 (0.500 mL, 6.49 mmol)を加え、0℃で30分撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をNHシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜90/10)で精製することにより、化合物18 (0.030 g, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 568(M + H)+;
1,2-ジメチル-3,3-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アゼチジン(化合物19)
実施例15と同様の方法で、化合物14の代わりに化合物18 (0.030 g, 0.053 mmol)を用い、化合物19 (0.020 g, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 582(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 6.8 Hz), 1.03 (3H, d, J = 6.6 Hz), 1.07-1.65 (40H, m), 2.05 (8H, q, J= 6.8 Hz), 2.27 (3H, s), 2.39 (1H, d, J = 6.8 Hz), 2.69-2.81 (5H, m), 3.21 (1H, d, J = 6.6 Hz), 5.28-5.44 (8H, m).
参考例9
2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)-2-((((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)メチル)プロパン-1,3-ジオール(化合物IIc-7)
工程1
参考例5と同様の方法で、1-ブロモデカンの代わりに2-(クロロメトキシ)エチルトリメチルシラン (0.210 mL, 1.18 mmol)を用いることで、2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)-2-((2-(トリメチルシリル)エトキシ)メチル)プロパン-1,3-ジオール(0.312 g, 通し収率87％)を得た。
ESI-MS m/z: 455(M + H)+
工程2
工程1で得られた2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)-2-((2-(トリメチルシリル)エトキシ)メチル)プロパン-1,3-ジオール (0.312 g, 0.686 mmol)をテトラヒドロフラン (4 mL)に溶解させ、氷冷下水素化ナトリウム (油性60%, 0.063 g, 1.58 mmol)および(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (0.355 g, 1.03 mmol)を加えて、60℃で2時間撹拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、水層をヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=99/1〜70/30)で精製することにより(11Z,14Z)-2-((((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)メチル)-2-((2-(トリメチルシリル)エトキシ)メチル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール(0.230 g, 収率48%)を得た。
ESI-MS m/z: 703(M + H)+
工程3
工程2で得られた(11Z,14Z)-2-((((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)メチル)-2-((2-(トリメチルシリル)エトキシ)メチル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール (0.230 g、0.327 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解させ、氷冷下三ふっ化ほう素ジエチルエーテル錯体 (東京化成工業社製, 0.207 mL, 1.64 mmol)を加えて、0℃で1時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=99/1〜50/50)で精製することにより化合物IIc-7 (0.150 g, 収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 603(M + H)+
1-メチル-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)-3-((((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)メチル)アゼチジン(化合物20)
実施例1と同様の方法で、参考例1で得られる化合物IIc-1の代わりに参考例8で得られる化合物IIc-7 (0.140 g, 0.232 mmol)を用い、化合物20 (0.080 g, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 598(M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (6H, t, J = 7.0 Hz), 1.17-1.40 (34H, m), 1.52-1.61 (4H, m), 2.02-2.08 (8H, m), 2.30 (3H, s), 2.77 (4H, t, J = 6.6 Hz), 2.90 (2H, d, J = 7.6 Hz), 3.10 (2H, d, J = 7.6 Hz), 3.39-3.45 (4H, m), 5.27-5.44 (8H, m).
実施例1で得られた化合物1を用いて、以下のように組成物を調製した。用いた核酸は、センス鎖[5'-rGrGrAfUfCrAfUfCfUfCrArArGfUfCfUfUrAfCdTdT -3'(r、dおよびfが付された塩基に結合する糖は、それぞれリボース、デオキシリボースおよび2’位の水酸基がフッ素で置換されているリボースであり、5’末端側から3’末端側に向って 20番目の塩基に結合するデオキシリボースと21番目の塩基に結合するデオキシリボースとの結合がホスホロチオエート結合である)]と、アンチセンス鎖[5'-rGfUrArArGrAfCfUfUrGrArGrAfUrGrAfUfCfCdTdT-3'(r、dおよびfが付された塩基に結合する糖は、それぞれリボース、デオキシリボースおよび2’位の水酸基がフッ素で置換されているリボースであり、5’末端側から3’末端側に向って 20番目の塩基に結合するデオキシリボースと21番目の塩基に結合するデオキシリボースとの結合がホスホロチオエート結合である)]からなる、血液凝固第7因子(Blood Coagulation Factor VII、以下f7と表す)遺伝子の発現を抑制する抗f7 siRNAであり、ジーンデザイン社から入手した(以下f7 siRNA-1という)。核酸は蒸留水で24 mg/mLに調製して用いた。
化合物1/PEG-DMPE Na(日油社製)=57.3/5.52 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し、塩酸およびエタノールを含有する水溶液に懸濁させ、vortex攪拌ミキサーで攪拌および、加温を繰り返して均一な懸濁液を得た。この懸濁液を室温下で、0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、化合物1/PEG-DMPE Naの粒子(リポソーム)の分散液を得た。粒子径測定装置で得られたリポソームの平均粒子径を測定し、30 nmから100 nmの範囲内であることを確認した。得られたリポソームの分散液と、f7 siRNA-1溶液を、リポソームの分散液:f7 siRNA-1溶液=3:1の割合で混合し、さらに3倍量の蒸留水を加えて混合することで化合物1/PEG-DMPE Na/ f7 siRNA-1複合体の分散液を調製した。
一方、化合物1/PEG-DMPE Na(日油社製)/DSPC(日油社製)/コレステロール(日油社製)= 8.947/0.147/5.981/14.355 mmol/Lとなるように、各試料を秤量しエタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を、得られた化合物1/PEG-DMPE Na/ f7 siRN-1複合体の分散液と、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮後、生理食塩水で希釈し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。得られた組成物のsiRNA濃度を測定し、投与濃度にあわせて生理食塩水を用いて希釈することで、製剤(化合物1およびf7 siRNA-1を含有する組成物)を得た。
実施例2および4〜7で得られた化合物である化合物2および4〜7をそれぞれ用いて、実施例21と同様にして製剤(化合物2および4〜7のそれぞれ、およびf7 siRNA-1を含有する組成物)を得た。
実施例21および22で得られた製剤(組成物)の平均粒子径を粒子径測定装置で測定し、その結果を表4に示した。
実施例21で用いたf7 siRNA-1を、センス鎖が5'- CCCUGUCUUGGUUUCAAUUAA -3'(塩基に結合する糖は全てリボース)であり、アンチセンス鎖が5'- AAUUGAAACCAAGACAGGGUG-3'(塩基に結合する糖は全てリボース。5’末端はリン酸基で修飾されている。)であるf7 siRNA-2に変更し、実施例21と同様の方法で製剤を調製した。
比較例1
化合物1を、特許文献3記載の方法に準じた方法で合成した1-メチル-3，3-ビス{[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}アゼチジン(化合物A)にした以外、実施例23と同様の方法で製剤を調製した。
実施例23と比較例1で得られた製剤(組成物)の平均粒子径を粒子径測定装置で測定し、その結果を表5に示した。
試験例1
実施例21および22で得られた各製剤(化合物1、2、4〜7のそれぞれと、f7 siRNA-1を含有する組成物)について、それぞれ以下の方法によりインビボ薬効評価試験を実施した。なお、各製剤は、試験に合わせて生理食塩水で希釈して用いた。
マウス(Balb/c、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各製剤を、siRNA濃度で0.03、および/または0.3mg/kgでマウスに静脈内投与した。投与から48時間後に採血し、採取した血液を微量高速冷却遠心機(TOMY MX305:トミー精工社製)を用いて8000rpm、8分間、4℃で遠心分離した。BIOPHEN VII kit(ANIARA社製 cat#: A221304)を用いて、製品の説明書に記載された方法に従い、標準液および、血漿サンプル中の吸光度をARVO(405nm)で測定した。得られた吸光度から検量線を作成し、血漿中のFactor VIIタンパク濃度を算出した。なお例数は各群3匹とした。
算出された血漿中のFactor VIIタンパク濃度の結果を、図1および図2に示す。
試験例2
実施例21および22で得られた各製剤を、実施例23および比較例1で得られた各製剤にした以外、試験例１と同様にして、試験例2を実施した。
算出された血漿中のFactor VIIタンパク濃度の結果を、図3に示す。
図1および図2から明らかなように、実施例21および22で得られた各製剤(化合物1、2、4〜7のそれぞれと、f7 siRNA-1を含有する組成物)を投与することによって、Factor VII遺伝子の発現が強く抑制された。
また、図3から明らかなように、実施例23で得られた製剤（化合物1と、f7 siRNA-2を含有する組成物)は、比較例１で得られた製剤（化合物Aとf7 siRNA-2を含有する組成物）よりもFactor VII遺伝子の発現を強く抑制した。
よって、本発明の組成物は、核酸を細胞内等に導入することができ、本発明のカチオン性脂質は、インビボで細胞内に核酸を送達することを容易にすることが明らかとなった。
本発明のカチオン性脂質および核酸を含有する組成物を、哺乳動物等に投与することにより、該核酸を、例えば細胞内等に容易に導入することができる。
配列番号1-血液凝固第7因子 siRNA-1 センス鎖
配列番号2-血液凝固第7因子 siRNA-1 アンチセンス鎖
配列番号3-血液凝固第7因子 siRNA-2 センス鎖
配列番号4-血液凝固第7因子 siRNA-2 アンチセンス鎖

Claims (13)

  1. 式（I''）
    [式中、R1'およびR2'は、同一または異なって、炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキルもしくはアルケニルであり、
    R3'は、炭素数1〜3のアルキルであり、
    n1は1であり、
    n2は1であり、
    Z1は、水素原子であり、
    Z2は、水素原子である]で表わされるカチオン性脂質。
  2. R1'およびR2'が、同一または異なって、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルおよび(Z)-ドコサ-13-エニルからなる群から選ばれる、請求項1記載のカチオン性脂質。
  3. R1'およびR2'が、同一または異なって、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルおよび(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルからなる群から選ばれる、請求項1記載のカチオン性脂質。
  4. R1'およびR2'が同一である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のカチオン性脂質。
  5. 請求項1〜4のいずれか1項に記載のカチオン性脂質および核酸を含有する組成物。
  6. 該カチオン性脂質と該核酸とが複合体を形成しているか、または該カチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸とが複合体を形成している、請求項5記載の組成物。
  7. 該カチオン性脂質と該核酸とが複合体を形成しているか、または該カチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸とが複合体を形成しており、該複合体を封入する脂質膜を含有する、請求項5記載の組成物。
  8. 核酸が、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である、請求項5〜7のいずれか1項に記載の組成物。
  9. 標的遺伝子が、肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子である、請求項8記載の組成物。
  10. 請求項8記載の組成物を含む、疾患の治療に用いるための医薬。
  11. 静脈内投与用である、請求項10記載の医薬。
  12. 請求項9記載の組成物を含む、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤。
  13. 静脈内投与用である、請求項12記載の肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤。
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