TW201408324A - ＫＲＡＳ基因表現抑制ＲＮＡｉ醫藥組合物 - Google Patents

ＫＲＡＳ基因表現抑制ＲＮＡｉ醫藥組合物 Download PDF

Info

Publication number
TW201408324A
TW201408324A TW102125430A TW102125430A TW201408324A TW 201408324 A TW201408324 A TW 201408324A TW 102125430 A TW102125430 A TW 102125430A TW 102125430 A TW102125430 A TW 102125430A TW 201408324 A TW201408324 A TW 201408324A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
alkenyl
compound
lipid
nucleic acid
Prior art date
Application number
TW102125430A
Other languages
English (en)
Inventor
Tomoyuki Naoi
Takeshi Kuboyama
Junichi Enokizono
Toshihiko Ishii
Akihiro Tokunaga
Kentarou Hatanaka
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Dicerna Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd, Dicerna Pharmaceuticals Inc filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Publication of TW201408324A publication Critical patent/TW201408324A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本發明提供一種抑制KRAS基因表現之組合物等，該組合物包含反義鏈具有與序列編號1~3中任一KRAS基因之mRNA之連續之至少19個鹼基序列互補之鹼基序列的作為藥物之雙鏈核酸、及含有式(I)所表示之陽離子性脂質之脂質粒子，□(式中，R1及R2為相同或不同，而為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或炔基，L1及L2為相同或不同，而為-CO-O-或-O-CO-，a及b為相同或不同，而為1~3，R3為氫原子、碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基)。

Description

KRAS基因表現抑制RNAi醫藥組合物
本發明係關於一種抑制KRAS基因表現之組合物、包含該組合物之醫藥等
KRAS屬於分子量約21kDa之具有GTP(Guanosine Triphosphate，鳥苷三磷酸)水解活性之蛋白質的RAS家族。KRAS存在於細胞膜之內側，承擔將由上皮生長因子(EGF，Epidermal Growth Factor)等細胞外之增殖因子與其受體之結合所產生之訊號向細胞內傳遞之作用。KRAS存在活化突變，於約20%之人類之癌症中確認到活化突變。尤其於胰臟癌、大腸癌及肺癌中，高頻度地確認到KRAS之活化突變(參照癌症研究(Cancer Research)(Cancer Res),2012年，第72卷，p.2457)。關於大腸癌，報告有作為抗上皮生長因子受體(EGFR，epidermal growth factor receptor)抗體醫藥之西妥昔單抗(cetuximab)與帕尼單抗(panitumumab)對具有KRAS之活化突變之患者並無效果(參照“新英格蘭醫學雜誌(New England Journal of Medicine)(N Engl J Med)”,2009年，第360卷，p.1408、“臨床腫瘤學雜誌(Journal of Clinical Oncology)(J Clin Oncol)”,2008年，第26卷，p.374、“臨床腫瘤學雜誌(Journal of Clinical Oncology)(J Clin Oncol)”,2008年，第26卷，p.1626)。一般認為KRAS係抗癌劑之良好標靶，業界多年來一直嘗試 根據低分子藥物開發而創製KRAS阻害劑(參照“癌症生物學與治療(Cancer Biology & Therapy)”,2002年，第1卷，p.599)。然而，尚無以KRAS作為標靶之癌症等之有效之治療藥。
作為抑制標靶基因之表現之方法，例如已知有利用RNA干擾(RNA interference，以下稱作RNAi)之方法等，具體而言，報告有藉由於線蟲中導入具有與設為標靶之基因同源之序列的雙鏈RNA，而特異性抑制該標靶基因之表現之現象(參照“自然(Nature)”,1998年，第391卷，第6669號，p.806-811)。又發現，藉由於果蠅中導入21~23個鹼基之長度之雙鏈RNA代替較長之雙鏈RNA，亦抑制標靶基因之表現，並將其命名為短干擾RNA(siRNA，short interfering RNA)(參照國際公開第01/75164號說明書)。
關於RNAi，於活體內(in vivo)試驗中亦被大量驗證出，並報告有使用50個鹼基對以下之siRNA於動物胎兒中之效果(參照美國專利申請公開第2002-132788號說明書)及於成熟小鼠中之效果(參照國際公開第03/10180號說明書)。又，於對胎鼠靜脈內投予siRNA之情形時，在腎臟、脾臟、肺、胰臟及肝臟之各器官中確認到特定之基因之表現抑制效果(參照“自然-遺傳學(Nature Genetics)”,2002年，第32卷，第1號，p.107-108)。進而，報告有藉由於腦細胞內直接投予siRNA而抑制特定基因之表現(參照“自然-生物技術(Nature Biotechnology)”,2002年，第20卷，第10號，p.1006-1010)。
KRAS siRNA例如記載於專利文獻1、專利文獻2等中。
含有siRNA類之醫藥例如記載於專利文獻3、專利文獻4、專利文獻5等中。
於專利文獻3中，揭示有含有siRNA類、及例如1,2-二亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)等之醫藥。DLinDMA等係以開發出更柔軟之陽離子性脂質而提高脂質體等之膜流動性為目的，藉由將結 構上類似之陽離子性脂質N-(2,3-二-(9-(Z)-十八碳烯醯氧基))-丙烷-1-基-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)及N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)之高級烷基設為包含至少2處不飽和部位之高級烷基而賦予特徵。又，專利文獻4中揭示有含有siRNA類、及例如2,2-二亞麻基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)等之醫藥。
又，專利文獻5中例如揭示有反式-3,4-雙(((Z)-十八碳-9-烯醯氧基)甲基)吡咯啶(化合物I-3)等。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：國際公開第2008/109516號說明書
專利文獻2：國際公開第2010/115206號說明書
專利文獻3：國際公開第2005/121348號說明書
專利文獻4：國際公開第2009/086558號說明書
專利文獻5：國際公開第2011/136368號說明書
本發明之目的在於提供一種抑制KRAS基因表現之組合物、包含該組合物之醫藥等。
本發明關於下述(1)至(23)。
(1)一種組合物，其包含作為藥物之雙鏈核酸、及含有式(I)所表示之陽離子性脂質之脂質粒子，該雙鏈核酸具有正義鏈及反義鏈，該正義鏈與該反義鏈具有至少25個鹼基對，該反義鏈具有與序列編號1~3中之任一KRAS基因之mRNA之連續之至少19個鹼基序列互補之鹼基序列，且具有最大35個核苷酸之長度，
(式中，R1及R2為相同或不同，而為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或炔基，L1及L2為相同或不同，而為-CO-O-或-O-CO-，a及b為相同或不同，而為1~3，R3為氫原子、碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基)。
(2)如上述(1)之組合物，其中上述脂質粒子係進而含有式(II)所表示之陽離子性脂質者，
(式中，R4及R5為相同或不同，而為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或炔基，R6為氫原子、碳數1~6之烷基、碳數3~6之烯基、吡咯啶-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基，或者經相同或不同之1~3個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基)。
(3)如上述(2)之組合物，其中R4及R5均為十二烷基、十三烷基、十四烷基、2,6,10-三甲基十一烷基、十五烷基、3,7,11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、6,10,14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2,6,10,14-四甲基十五烷基、二十烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基。
(4)如上述(2)之組合物，其中R4及R5均為十四烷基、十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基。
(5)如上述(3)或(4)之組合物，其中R6為氫原子、甲基、吡咯啶-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基，或者經相同或不同之1~3個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基。
(6)如上述(1)至(5)中任一項之組合物，其中R3為氫原子或甲基。
(7)如上述(1)至(6)中任一項之組合物，其中L1及L2為-O-CO-，R1及R2同為十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯 基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基。
(8)如上述(1)至(6)中任一項之組合物，其中L1及L2為-CO-O-，R1及R2同為十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、二十三烷基、(Z)-十三碳-8-烯基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(E)-十七碳-8-烯基、(Z)-十七碳-10-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、(Z)-十九碳-10-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、2,6,10-三甲基十一碳-1,5,9-三烯基或2,6,10,14-四甲基十五碳-1-烯基。
(9)如上述(1)至(8)中任一項之組合物，其含有具有序列編號4及5、6及7、8及9、4及10或4及11之各正義鏈及反義鏈之雙鏈核酸作為藥物。
(10)如上述(1)至(9)中任一項之組合物，其中陽離子性脂質係與該雙鏈核酸形成複合物，或者與中性脂質及/或高分子組合而成者以及該雙鏈核酸形成複合物。
(11)如上述(1)至(9)中任一項之組合物，其中陽離子性脂質係與該雙鏈核酸形成複合物，或者與中性脂質及/或高分子組合而成者以及該雙鏈核酸形成複合物，且脂質粒子包含該複合物與封入該複合物之脂質膜。
(12)一種抑制RAS基因之表現之方法，其特徵在於：使用如上述(1)至(11)中任一項之組合物而將該雙鏈核酸導入至細胞內。
(13)如上述(12)之方法，其中細胞係位於哺乳類之腫瘤的細胞。
(14)如上述(12)之方法，其中細胞係位於哺乳類之大腸或胰臟的細胞。
(15)如上述(12)至(14)中任一項之方法，其中導入至細胞內之方 法係藉由靜脈內投予而導入至細胞內之方法。
(16)一種RAS相關疾病之治療方法，其係將如上述(1)至(11)中任一項之組合物投予至哺乳動物。
(17)如上述(16)之方法，其中投予方法係靜脈內投予。
(18)一種癌症之治療方法，其係將如上述(1)至(11)中任一項之組合物投予至哺乳動物。
(19)如上述(18)之方法，其中投予方法係靜脈內投予。
(20)一種用以治療RAS相關疾病之醫藥，其包含如上述(1)至(11)中任一項之組合物。
(21)如上述(20)之醫藥，其係靜脈內投予用。
(22)一種癌症之治療劑，其包含如上述(1)至(11)中任一項之組合物。
(23)如上述(22)之醫藥，其係靜脈內投予用。
例如將本發明之組合物投予至哺乳動物，可於生物體內抑制KRAS基因表現，而治療RAS相關疾病。
圖1表示對MIAPaCa-2異種移植(Xenograft)小鼠分別投予相當於siRNA 10mg/kg之量之實施例1中獲得之製劑1-A~C後經過48小時後之腫瘤中之KRAS mRNA量。縱軸表示將生理食鹽水投予群設為1時之KRAS mRNA量之相對值。
圖2表示於第0天及第7天對MIAPaCa-2異種移植小鼠分別投予相當於siRNA 10mg/kg之量之實施例1中獲得之製劑1-A~C時之腫瘤體積之相對值之推移。縱軸表示將第0天設為1時之腫瘤體積之相對值。橫軸表示實驗開始後之經過天數。各白圓圈表示生理食鹽水投予群，黑圓圈表示製劑投予群。
圖3表示對BALB/c小鼠分別投予相當於siRNA 10mg/kg之量之實施例1中獲得之製劑1-A~C後第7天之血中抗PEG(Polyethylene Glycol，聚乙二醇)抗體量。縱軸表示抗PEG抗體量。
圖4表示對MIAPaCa-2異種移植小鼠分別投予相當於siRNA 1、3或10mg/kg之量之實施例2中獲得之製劑2-A、D或E後經過48小時後之腫瘤中之KRAS mRNA量。縱軸表示將生理食鹽水投予群設為1時之KRAS mRNA量之相對值。橫軸表示各製劑之投予量。
圖5表示對MIAPaCa-2異種移植小鼠分別投予相當於siRNA 1、3或10mg/kg之量之實施例2中獲得之製劑2-A、D或E後第7天之腫瘤體積之相對值。縱軸表示將第0天設為1時之腫瘤體積之相對值。橫軸表示各製劑之投予量。
圖6表示對MIAPaCa-2異種移植小鼠分別投予相當於siRNA 2.5mg/kg之量之實施例1中獲得之製劑1-A及實施例2中獲得之製劑2-A後第7天之腫瘤體積之相對值。縱軸表示將第0天設為1時之腫瘤體積之相對值。
圖7表示對MIAPaCa-2異種移植小鼠分別投予相當於siRNA 2.5mg/kg之量之實施例1中獲得之製劑1-A、實施例3中獲得之製劑3-A及實施例4中獲得之製劑4-A後第7天之腫瘤體積之相對值。縱軸表示將第0天設為1時之腫瘤體積之相對值。
圖8表示對MIAPaCa-2異種移植小鼠分別投予相當於siRNA 2.5mg/kg之量之實施例1中獲得之製劑1-A、實施例5中獲得之製劑5-A及實施例6中獲得之製劑6-A後第7天之腫瘤體積之相對值。縱軸表示將第0天設為1時之腫瘤體積之相對值。
圖9表示對MIAPaCa-2異種移植小鼠分別投予相當於siRNA 5mg/kg之量之實施例1中獲得之製劑1-A及實施例7中獲得之製劑7-A後第7天之腫瘤體積之相對值。縱軸表示將第0天設為1時之腫瘤體積之 相對值。
圖10表示於第0天及第7天對HCT116(ATCC(American type culture collection，美國菌種保存中心))異種移植小鼠投予相當於siRNA 10mg/kg之量之實施例1中獲得之製劑1-A時之腫瘤體積之相對值之推移。縱軸表示將第0天設為1時之腫瘤體積之相對值。橫軸表示實驗開始後之經過天數。白圓圈表示生理食鹽水投予群，黑圓圈表示製劑投予群。
本發明提供一種包含作為藥物之具有降低或終止KRAS基因表現之能力之雙鏈核酸、及含有陽離子性脂質之脂質粒子的組合物。
又，本發明亦提供一種將該組合物投予至哺乳動物，而於生物體內抑制KRAS基因表現，治療RAS相關疾病之方法。
本發明亦提供一種用以治療或預防過度增殖性病症或疾病(例如白血病、黑色素瘤、細胞瘤、癌症、腫瘤、腺瘤)或者與不適當之RAS基因之表現相關之1種以上之血管新生性疾病的方法。
本發明之組合物中之脂質粒子含有式(I)所表示之陽離子性脂質，
(式中，R1及R2為相同或不同，而為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或炔基，L1及L2為相同或不同，而為-CO-O-或-O-CO-， a及b為相同或不同，而為1~3，R3為氫原子、碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基)。以下，亦存在將式(I)所表示之化合物稱為化合物(I)之情形。關於其他式編號之化合物亦相同。
又，本發明之組合物中之脂質粒子係含有化合物(I)及式(II)所表示之陽離子性脂質者，
(式中，R4及R5為相同或不同，而為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或炔基，R6為氫原子、碳數1~6之烷基、碳數3~6之烯基、吡咯啶-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基，或者經相同或不同之1~3個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基)。
式(I)之各基之定義中，作為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如可列舉：十二烷基、十三烷基、十四烷基、2,6,10-三甲基十一烷基、十五烷基、3,7,11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、6,10,14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2,6,10,14-四甲基十五烷基、二十烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基等。
式(I)之各基之定義中，作為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烯 基，只要為含有1~3個雙鍵之碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烯基即可，例如可列舉：(Z)-十三碳-8-烯基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十七碳-8-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十七碳-10-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-十九碳-10-烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、2,6,10-三甲基十一碳-1,5,9-三烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基、2,6,10,14-四甲基十五碳-1-烯基、3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基等，較佳可列舉(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基等。
式(I)之各基之定義中，作為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之炔基，只要為含有1~3個三鍵之碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之炔基即可，例如可列舉：十二碳-11-炔基、十三碳-12-炔基、十五碳-6-炔基、十六碳-7-炔基、十五碳-4,6-二炔基、十六碳-5,7-二炔基、十七碳-8-炔基、十八碳-9-炔基等。
再者，化合物(I)中，R1及R2較佳為相同之碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或炔基。又，R1及R2更佳為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基或烯基，進而較佳為碳數12~24之直鏈狀之烯基。
式(II)之各基之定義中，作為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如可列舉：十二烷基、十三烷基、十四烷基、2,6,10-三甲基十一烷基、十五烷基、3,7,11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、6,10,14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2,6,10,14-四甲基 十五烷基、二十烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基等。
式(II)之各基之定義中，作為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烯基，只要為含有1~3個雙鍵之碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烯基即可，例如可列舉：(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基、3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基等，較佳可列舉(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基等。
式(II)之各基之定義中，作為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之炔基，只要為含有1~3個三鍵之碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之炔基即可，例如可列舉：十二碳-11-炔基、十四碳-6-炔基、十六碳-7-炔基、十六碳-5,7-二炔基、十八碳-9-炔基等。
再者，式(II)中，R4及R5較佳為相同之碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或炔基。又，R4及R5更佳為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基或烯基，進而較佳為碳數12~24之直鏈狀之烯基。
式(I)及式(II)之各基之定義中，作為碳數1~6之烷基，例如可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、環丁基、環丙基甲基、戊基、異戊基、第二戊基、新戊基、第三戊基、環戊基、己基、環己基等，較佳可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、第二戊基、第三戊基、新戊基、己基等，進而較佳可列舉：甲基、乙基、丙基等。
作為碳數3~6之烯基，例如可列舉：烯丙基、1-丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等，較佳可列舉烯丙基等。
經取代之碳數1~6之烷基中之烷基部分及經取代之碳數3~6之烯基中之烯基部分分別與上述碳數1~6之烷基及碳數3~6之烯基含義相同。
化合物(I)及化合物(II)中，亦可對結構中之氮原子上之孤電子對配位氫離子，配位有該氫離子之氮原子亦可與製藥上可容許之陰離子形成鹽，化合物(I)及化合物(II)亦包含對該氮原子上之孤電子對配位有氫離子之化合物。
作為製藥上可容許之陰離子，例如可列舉：氯化物離子、溴化物離子、硝酸根離子、硫酸根離子、磷酸根離子等無機離子；乙酸根離子、草酸根離子、順丁烯二酸根離子、反丁烯二酸根離子、檸檬酸根離子、苯甲酸根離子、甲磺酸根離子等有機酸根離子等。
式(II)之定義中，吡咯啶-3-基、哌啶-3-基及哌啶-4-基分別包含將環上所鍵結之氮原子上之氫原子轉化為甲基或乙基者。
作為單烷基胺基及二烷基胺基，分別只要為經1個及相同或不同之2個碳數1~6之烷基(與上述含義相同)，或者經胺基、甲基胺基、乙基胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~6之烷基(與上述含義相同)所取代之胺基即可，例如可列舉：甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、丁基胺基、戊基胺基、己基胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、乙基甲基胺基、甲基丙基胺基、丁基甲基胺基、甲基戊基胺基、己基甲基胺基、胺基乙基胺基、胺基丙基胺基、(胺基乙基)甲基胺基、雙(胺基乙基)胺基等，較佳可列舉：甲基胺基、乙基胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、胺基丙基胺基、雙(胺基乙基)胺基等。
化合物(II)中，胺基、單烷基胺基及二烷基胺基亦可分別對氮原 子上之孤電子對配位氫離子而形成銨基、單烷基銨基及二烷基銨基，胺基、單烷基胺基及二烷基胺基分別包含銨基、單烷基銨基及二烷基銨基。於該情形時，對胺基、單烷基胺基及二烷基胺基之氮原子上之孤電子對配位有氫離子之銨基、單烷基銨基及二烷基銨基亦可與製藥上可容許之陰離子(與上述含義相同)形成鹽。
作為烷氧基，只要為經碳數1~6之烷基(與上述含義相同)，或者經胺基、甲基胺基、乙基胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~6之烷基(與上述含義相同)所取代之羥基即可，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、胺基乙氧基、甲基胺基乙氧基等，較佳可列舉：甲氧基、乙氧基、胺基乙氧基、甲基胺基乙氧基等。
作為單烷基胺甲醯基及二烷基胺甲醯基，分別只要為經1個及相同或不同之2個碳數1~6之烷基(與上述含義相同)，或者經胺基、甲基胺基、乙基胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~6之烷基(與上述含義相同)所取代之胺甲醯基即可，例如可列舉：甲基胺甲醯基、乙基胺甲醯基、丙基胺甲醯基、丁基胺甲醯基、戊基胺甲醯基、己基胺甲醯基、二甲基胺甲醯基、二乙基胺甲醯基、乙基甲基胺甲醯基、甲基丙基胺甲醯基、丁基甲基胺甲醯基、甲基戊基胺甲醯基、己基甲基胺甲醯基、胺基乙基胺甲醯基、胺基丙基胺甲醯基、(胺基乙基)甲基胺甲醯基、雙(胺基乙基)胺甲醯基等，較佳可列舉：甲基胺甲醯基、乙基胺甲醯基、二甲基胺甲醯基等。
化合物(I)中，L1及L2為-O-CO-之情形時，R1及R2更佳為相同或不同，而為十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十 八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基，進而較佳為相同或不同，而為十四烷基、十六烷基、十八烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基。再者，於任一情形時，R1及R2均進而較佳為相同。
又，於L1及L2為-CO-O-之情形時，R1及R2更佳為相同或不同，而為十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、二十三烷基、(Z)-十三碳-8-烯基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(E)-十七碳-8-烯基、(Z)-十七碳-10-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、(Z)-十九碳-10-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、2,6,10-三甲基十一碳-1,5,9-三烯基或2,6,10,14-四甲基十五碳-1-烯基，進而較佳為相同或不同，而為十三烷基、十五烷基、十七烷基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基或(Z)-十九碳-10-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基。再者，於任一情形時，R1及R2均較佳為相同。
又，a及b更佳為同時為1。
又，a及b同時為1且L1及L2為-CO-O-亦為本發明之更佳之形態之一。於該情形時，R1及R2更佳為相同或不同，而為(Z)-十七碳-8-烯基或(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基，最佳為同為(Z)-十七碳-8-烯基或(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基。
又，R3更佳為氫原子或甲基。
又，a及b為1且L1及L2同為-CO-O-或-O-CO-、較佳為-CO-O-，R3 為甲基亦為本發明之進而較佳之形態之一，R1及R2更佳為相同或不同，而為(Z)-十七碳-8-烯基或(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基，最佳為同為(Z)-十七碳-8-烯基或(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基。
再者，於R3為氫原子之情形時，L1及L2同為-CO-O-或-O-CO-、較佳為-CO-O-亦為本發明之更佳之形態之一，R1及R2更佳為相同或不同，而為(Z)-十七碳-5-烯基或(Z)-十七碳-8-烯基，最佳為同為(Z)-十七碳-5-烯基或(Z)-十七碳-8-烯基。
化合物(II)中，R4及R5較佳為相同或不同，而為十四烷基、十六烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基，更佳為相同或不同，而為(Z)-十八碳-9-烯基或(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基，最佳為同為(Z)-十八碳-9-烯基或(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基。
又，較佳為R6為氫原子、甲基、吡咯啶-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基，或者經相同或不同之1~3個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基，更佳為氫原子、甲基或經1個胺基、羥基或胺甲醯基取代之碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基，最佳為氫原子、甲基等。
又，R6為氫原子亦為本發明之更佳之形態之一。於該情形時，R4及R5更佳為相同或不同，而為十四烷基、十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基，最佳為同為(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基或(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基。
又，R6為甲基亦為本發明之更佳之形態之一。於該情形時，R4及R5更佳為相同或不同，而為十四烷基、十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基，最佳為同為(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基。
化合物(I)可藉由與國際公開第2011/136368號說明書中記載之製造方法相同之方法而獲得。再者，於所定義之基在該製造方法之條件下發生變化或不適合於實施該製造方法之情形時，可藉由使用有機合成化學中常用之保護基之導入及去除方法[例如有機合成中之保護基第3版(Protective Groups in Organic Synthesis，third edition),T.W.Greene著，John Wiley & Sons Inc.(1999年)等中記載之方法]等，而製造目標化合物。又，視需要亦可改變取代基導入等反應步驟之順序。
其次，對化合物(II)之製造方法進行說明。再者，於下述所示之製造方法中，於所定義之基在該製造方法之條件下發生變化或不適合於實施該製造方法之情形時，可藉由使用有機合成化學中常用之保護基之導入及去除方法[例如有機合成中之保護基 第3版(Protective Groups in Organic Synthesis，third edition),T.W.Greene著，John Wiley & Sons Inc.(1999年)等中記載之方法]等，而製造目標化合物。又，視需要亦可改變取代基導入等反應步驟之順序。
製造方法1
化合物(II)可藉由下述方法而製造。
[化5]
(式中，R4、R5及R6分別與上述含義相同，Z表示氯原子、溴原子、碘原子、三氟甲磺醯氧基、甲磺醯氧基、苯磺醯氧基、對甲苯磺醯氧基等脫離基)
步驟1及2
化合物(IIIb)可藉由於無溶劑下或溶劑中，視需要較佳為於1~10當量之鹼之存在下，在室溫與200℃之間之溫度下使化合物(IIIa)與化合物(IVa)反應5分鐘~100小時而製造。進而，化合物(II)可藉由於無溶劑下或溶劑中，視需要較佳為於1~10當量之鹼基之存在下，在室溫與200℃之間之溫度下使化合物(IIIb)與化合物(IVb)反應5分鐘~100小時而製造。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二烷、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、吡啶、水等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)等。
化合物(IIIa)可以市售品之形式獲得，或者利用公知之方法(例如第5版實驗化學講座14「有機化合物之合成II」，第5版，p.351，丸善(2005年))或依據其之方法而獲得。
化合物(IVa)及化合物(IVb)可以市售品之形式獲得，或者利用公知之方法(例如第5版實驗化學講座13「有機化合物之合成I」，第5版， p.374，丸善(2005年))或依據其之方法而獲得。
R4與R5相同之情形時之化合物(IIa)可藉由於步驟1中使用2當量以上之化合物(IVa)而獲得。
製造方法2
化合物(II)中，R6為-CHRARB(式中，RA及RB為相同或不同，而為氫原子、碳數1~5之烷基、碳數2~5之烯基、吡咯啶-2-基、吡咯啶-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、嗎啉-2-基、嗎啉-3-基，或者經相同或不同之1~3個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~5之烷基或碳數2~5之烯基、或者與所鄰接之碳原子一起形成吡咯啶-3-基、哌啶-3-基或哌啶-4-基，RA及RB均為氫原子之情形除外，於RA及RB之烷基、經取代之烷基之烷基部分、烯基及經取代烯基之烯基部分之碳數之總和為1~5，且RA及RB中之任一者為吡咯啶-2-基、吡咯啶-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、嗎啉-2-基或嗎啉-3-基之情形時，該RA及RB中之一者為氫原子、碳數1~5之烷基、碳數2~5之烯基、吡咯啶-2-基、吡咯啶-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、嗎啉-2-基、嗎啉-3-基，或者經相同或不同之1個或2個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~5之烷基或碳數2~5之烯基，於RA及RB為經取代之烷基或烯基之情形時，該取代基之總數為2或3)的化合物(IIb)，亦可藉由下述方法而製造。
[化6]
(式中，R4、R5、RA及RB分別與上述含義相同)
步驟3
化合物(IIb)可藉由於溶劑中、較佳為1~大為過量之還原劑及視需要較佳為1~10當量之酸之存在下，在-20℃與150℃之間之溫度下使化合物(II)中之R6為氫原子的化合物(IIc)與較佳為1~10當量之化合物(V)反應5分鐘~72小時而製造。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二烷、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、水等，該等可單獨使用或混合使用。
作為還原劑，例如可列舉：三乙醯氧基硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉等。
作為酸，例如可列舉：鹽酸、乙酸等。
化合物(V)可以市售品之形式獲得，或者藉由公知之方法(例如第5版實驗化學講座15「有機化合物之合成III」，第5版，p.1，丸善(2005年)、第5版實驗化學講座15「有機化合物之合成III」，第5版，p.153，丸善(2005年))或依據其之方法而獲得。
製造方法3
化合物(II)中，R6為-CH2-C(OH)RCRD(式中，RC及RD為相同或不同，而為氫原子、碳數1~4之烷基、碳數2~4之烯基、吡咯啶-2-基、吡咯啶-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、嗎啉-2-基、嗎 啉-3-基，或者經相同或不同之1個或2個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~4之烷基或碳數2~4之烯基，RC及RD均為氫原子之情形除外，於RC及RD之烷基、經取代之烷基之烷基部分、烯基及經取代烯基之烯基部分之碳數之總和為1~4，且RC及RD中之任一者為吡咯啶-2-基、吡咯啶-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、嗎啉-2-基或嗎啉-3-基之情形時，該RC及RD中之一者為氫原子、碳數1~4之烷基、碳數2~4之烯基、吡咯啶-2-基、吡咯啶-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、嗎啉-2-基、嗎啉-3-基或經1個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~4之烷基或碳數2~4之烯基，於RC及RD為經取代之烷基或烯基之情形時，該取代基之總數為2)的化合物(IId)，亦可藉由下述方法而製造。
(式中，R4、R5、RC及RD分別與上述含義相同)
步驟4
化合物(IId)可藉由於溶劑中或於無溶劑下，在0℃與230℃之間之溫度下使化合物(IIc)與化合物(VI)反應5分鐘至100小時而製造。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、1-丙醇、二氯甲烷、氯 仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二烷、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、二甲基亞碸等，該等可單獨使用或混合使用。
化合物(VI)可以市售品之形式獲得，或者藉由公知之方法(例如第5版實驗化學講座17「有機化合物之合成V」，第5版，p.186，丸善(2005年))或依據其之方法而獲得。
化合物(II)中之R4、R5或R6所含之官能基之轉化亦可利用公知之方法[例如綜合有機轉化 第2版(Comprehensive Organic Transformations 2nd edition),R.C.Larock著，Vch Verlagsgesellschaft Mbh(1999年)等中記載之方法]或依據該等方法而實施。
上述各製造方法中之中間物及目標化合物可供於有機合成化學中常用之分離純化法、例如過濾、萃取、清洗、乾燥、濃縮、再結晶、各種層析法等而單離純化。又，關於中間物，亦可不特別進行純化而供於下述反應。
化合物(I)及化合物(II)中，亦具有可能存在幾何異構物、光學異構物等立體異構物、互變異構物等者，化合物(I)及化合物(II)包括該等在內，包含全部可能之異構物及該等之混合物。
化合物(I)及化合物(II)中之各原子之一部分或全部可經各自對應之同位素原子置換，化合物(I)及化合物(II)亦包含該等經同位素原子置換之化合物。例如化合物(I)及化合物(II)中之氫原子之一部分或全部亦可為原子量為2之氫原子(氘原子)。
化合物(I)及化合物(II)中之各原子之一部分或全部經各自對應之同位素原子置換之化合物可使用市售之基本組份，可藉由與上述各製造方法相同之方法進行製造。又，化合物(I)及化合物(II)中之氫原子之一部分或全部經氘原子置換之化合物，例如亦可利用使用銥錯合物作為觸媒，使用重水作為氘源而將醇、羧酸等氘化之方法[參照美國 化學學會雜誌(Journal of American Chemical Society)(J.Am.Chem.Soc.),Vol.124,No.10,2092(2002)]等而合成。
將化合物(I)之具體例示於第1表，將化合物(II)之具體例示於第2表。但是，本發明中之化合物(I)及化合物(II)並不限定於該等。
又，關於本發明所使用之作為藥物之雙鏈核酸，於導入至哺乳類細胞中之情形時，其係具有降低或終止KRAS基因表現之能力者，且係具有正義鏈及反義鏈之雙鏈核酸，該正義鏈與該反義鏈具有至少25個鹼基對，該反義鏈具有與序列編號1~3中任一KRAS基因之mRNA(KRAS mRNA)之標靶序列之連續之至少19個鹼基序列互補的鹼基序列，且具有最大35個核苷酸之長度者。
作為雙鏈核酸，只要為由核苷酸及/或具有與該核苷酸同等功能之分子聚合而成之雙鏈的分子，則可為任意分子，例如可列舉：作為 核糖核苷酸之聚合物的RNA、作為脫氧核糖核苷酸之聚合物的DNA、包含RNA與DNA之嵌合核酸、及該等核酸之至少一個核苷酸被取代為具有與該核苷酸同等功能之分子的核苷酸聚合物。又，包含至少一個由核苷酸及/或具有與該核苷酸同等功能之分子聚合而成之分子作為結構單元的衍生物亦包含於本發明之雙鏈核酸中。進而亦可列舉：肽核酸(PNA)[Acc.Chem.Res.,32,624(1999)]、氧基肽核酸(OPNA)[J.Am.Chem.Soc.,123,4653(2001)]、肽核糖核酸(PRNA)[J.Am.Chem.Soc.,122,6900(2000)]等。再者，於本發明中，RNA中之尿苷U與DNA中之胸腺嘧啶T可分別互換。
作為具有與核苷酸同等功能之分子，例如可列舉核苷酸衍生物等。
作為核苷酸衍生物，只要為對核苷酸實施修飾之分子，則可為任意分子，例如與來自天然之RNA或DNA相比，為了提高耐核酸酶性或者對其他分解因子穩定化，為了提高與互補鏈核酸之親和性，為了提高細胞透過性，或為了使其可視化，可適宜地使用對核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸實施修飾之分子等。
作為核苷酸衍生物，例如可列舉：糖部修飾核苷酸、磷酸二酯鍵修飾核苷酸、鹼基修飾核苷酸等。
作為糖部修飾核苷酸，只要為對核苷酸之糖之化學結構之一部分或全部藉由任意取代基進行修飾或取代而成者、或者藉由任意原子進行取代而成者，則可為任意者，可較佳地使用2'-修飾核苷酸。
作為糖部修飾核苷酸之修飾基，例如可列舉：2'-氰基、2'-烷基、2'-取代烷基、2'-烯基、2'-取代烯基、2'-鹵基、2'-O-氰基、2'-O-烷基、2'-O-取代烷基、2'-O-烯基、2'-O-取代烯基、2'-S-烷基、2'-S-取代烷基、2'-S-烯基、2'-S-取代烯基、2'-胺基、2'-NH-烷基、2'-NH-取代烷基、2'-NH-烯基、2'-NH-取代烯基、2'-SO-烷基、2'-SO-取代烷 基、2'-羧基、2'-CO-烷基、2'-CO-取代烷基、2'-Se-烷基、2'-Se-取代烷基、2'-SiH2-烷基、2'-SiH2-取代烷基、2'-ONO2、2'-NO2、2'-N3、2'-胺基酸殘基(自胺基酸之羧酸去除羥基而成者)、2'-O-胺基酸殘基(與上述胺基酸殘基含義相同)等。又，具有2'位之修飾基橋接於4'位之碳原子上之結構的橋接結構型人工核酸(BNA，Bridged Nucleic Acid)，更具體為2'位之氧原子與4'位之碳原子經由亞甲基而橋接之鎖定人工核酸(LNA，Locked Nucleic Acid)、及伸乙基橋接結構型人工核酸(ENA，Ethylene bridged nucleic acid)[核酸研究(Nucleic Acid Research),32,e175(2004)]等亦包含於本發明中之2'位經修飾基取代之核苷酸中。
作為糖部修飾核苷酸之修飾基，較佳為2'-氰基、2'-鹵基、2'-O-氰基、2'-烷基、2'-取代烷基、2'-O-烷基、2'-O-取代烷基、2'-O-烯基、2'-O-取代烯基、2'-Se-烷基、2'-Se-取代烷基等，更佳為2'-氰基、2'-氟、2'-氯、2'-溴、2'-三氟甲基、2'-O-甲基、2'-O-乙基、2'-O-異丙基、2'-O-三氟甲基、2'-O-[2-(甲氧基)乙基]、2'-O-(3-胺基丙基)、2'-O-[2-(N,N-二甲基)胺基氧基]乙基、2'-O-[3-(N,N-二甲基胺基)丙基]、2'-O-{2-[2-(N,N-二甲基胺基)乙氧基]乙基}、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基]、2'-Se-甲基等，進而較佳為2'-O-甲基、2'-O-乙基、2'-氟等，最佳為2'-O-甲基、2'-O-乙基。
又，糖部修飾核苷酸之修飾基亦可根據其大小而定義較佳之範圍，根據氟之大小，較佳為相當於-O-丁基之大小者，根據-O-甲基之大小，較佳為相當於-O-乙基之大小者。
糖部修飾核苷酸之修飾基中之烷基與化合物(II)中之碳數1~6之烷基含義相同。
糖部修飾核苷酸之修飾基中之烯基與化合物(II)中之碳數3~6之烯基含義相同。
作為糖部修飾核苷酸之修飾基中之鹵基，可列舉：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
作為胺基酸殘基中之胺基酸，例如可列舉：脂肪族胺基酸(具體而言為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸等)、羥基胺基酸(具體而言為絲胺酸、蘇胺酸等)、酸性胺基酸(具體而言為天冬胺酸、麩胺酸等)、酸性胺基酸醯胺(具體而言為天冬醯胺、麩醯胺等)、鹼性胺基酸(具體而言為離胺酸、羥基離胺酸、精胺酸、鳥胺酸等)、含硫胺基酸(具體而言為半胱胺酸、胱胺酸、甲硫胺酸等)、亞胺基酸(具體而言為脯胺酸、4-羥基脯胺酸等)等。
作為糖部修飾核苷酸之修飾基中之取代烷基及取代烯基之取代基，例如可列舉：鹵基(與上述含義相同)、羥基、磺胺基、胺基、側氧基、-O-烷基(該-O-烷基之烷基部分與上述烷基含義相同)、-S-烷基(該-S-烷基之烷基部分與上述烷基含義相同)、-NH-烷基(該-NH-烷基之烷基部分與上述烷基含義相同)、二烷基胺基氧基(該二烷基胺基氧基之2個烷基部分相同或不同，且與上述烷基之含義相同)、二烷基胺基(該二烷基胺基之2個烷基部分相同或不同，且與上述烷基之含義相同)、二烷基胺基伸烷基氧基(該二烷基胺基伸烷基氧基之2個烷基部分相同或不同，且與上述烷基之含義相同，伸烷基部分表示自上述烷基去除1個氫原子而成者)等，取代數較佳為1~3。
作為磷酸二酯鍵修飾核苷酸，只要為對核苷酸之磷酸二酯鍵之化學結構之一部分或全部藉由任意取代基進行修飾或取代而成者、或者藉由任意原子進行取代而成者，則可為任意者，例如可列舉：磷酸二酯鍵被取代為硫代磷酸酯鍵之核苷酸、磷酸二酯鍵被取代為二硫代磷酸酯鍵之核苷酸、磷酸二酯鍵被取代為烷基膦酸酯鍵之核苷酸、磷酸二酯鍵被取代為胺基磷酸酯鍵之核苷酸等。
作為鹼基修飾核苷酸，只要為對核苷酸之鹼基之化學結構之一 部分或全部藉由任意取代基進行修飾或取代而成者、或者藉由任意原子進行取代而成者，則可為任意者，例如可列舉：鹼基內之氧原子被取代為硫原子者、氫原子被取代為碳數1~6之烷基者、甲基被取代為氫原子或碳數2~6之烷基者、胺基經碳數1~6之烷基、碳數1~6之烷醯基等保護基保護者。
進而，作為苷酸衍生物，亦可列舉：於核苷酸或糖部、磷酸二酯鍵或鹼基中之至少一者經修飾之核苷酸衍生物上加成脂質、磷脂質、啡、葉酸鹽、啡啶、蒽醌、吖啶、螢光素、玫瑰紅、香豆素、色素等其他化學物質者，具體可列舉：5'-多胺加成核苷酸衍生物、膽固醇加成核苷酸衍生物、類固醇加成核苷酸衍生物、膽汁酸加成核苷酸衍生物、維生素加成核苷酸衍生物、Cy5螢光色素加成核苷酸衍生物、Cy3螢光色素加成核苷酸衍生物、6-螢光素(FAM)加成核苷酸衍生物、及生物素加成核苷酸衍生物等。
又，核苷酸衍生物亦可與雙鏈核酸內之其他核苷酸或核苷酸衍生物形成伸烷基結構、肽結構、核苷酸結構、醚結構、酯結構、及組合有該等中之至少一種之結構等橋接結構。
雙鏈核酸具有對於藉由切丁酶進行加工而產生siRNA而言充分之長度。根據本態樣，雙鏈核酸較佳為包含26至30個核苷酸之間之長度的正義鏈、及於細胞之細胞質中可見之條件等生物條件下與正義鏈黏接之反義鏈。
又，雙鏈核酸亦可具有使利用切丁酶之加工亢進之若干特性。根據本態樣，雙鏈核酸具有對於藉由切丁酶進行加工而產生siRNA而言充分之長度、及下述特性中之至少1種、較佳為全部特性：(i)雙鏈核酸為非對稱，例如反義鏈上之3'處具有突出物。(ii)於正義鏈之3'末端含有核苷酸衍生物(與上述含義相同)用以切丁酶結合及加工。作為適當之核苷酸衍生物，包括脫氧核糖核苷酸、非環狀核苷酸、及其類 似物等核苷酸、以及螢光分子及其類似物等立體上組合之分子、較佳為脫氧核糖核苷酸。於使用核苷酸衍生物之情形時，該等可以使雙鏈核酸之長度不發生變化之方式被取代為雙鏈核酸中之核糖核苷酸。(iii)正義鏈於5'末端含有磷酸。所謂於5'末端含有磷酸，係指與5'末端之鹼基結合之糖之5'位之羥基係藉由磷酸基或藉由生物體內之核酸分解酶等轉化為磷酸基之基進行修飾。
又，雙鏈核酸較佳為於反義鏈、或正義鏈、或兩鏈中具有1個或其以上之2'-O-甲基修飾核苷酸。
最佳為正義鏈含有25~28個核苷酸，且正義鏈之3'末端之2個核苷酸為脫氧核糖核苷酸。正義鏈於5'末端含有磷酸。反義鏈含有26~30個核苷酸，並且包含1~4個核苷酸之3'突出部。反義鏈及正義鏈具有1個或其以上之2'-O-甲基修飾核苷酸。
例如於包含25個核苷酸正義鏈及2個核苷酸之3'突出部之27個核苷酸反義鏈且將正義鏈及反義鏈之5'末端之第一鹼基計數為位置編號1之情形時，作為2'-O-甲基修飾之位置，可列舉：正義鏈之位置編號1、2、4、6、8、12、14、16、18及23、以及反義鏈之位置編號1、2、3、4、11、13、25及27；正義鏈之位置編號1、2、4、6、8、12、14、16、18及23、以及反義鏈之位置編號1、2、3、4、11、13、21、23、25、26及27；正義鏈之位置編號1、2、4、6、8、12、14、16、18及23、以及反義鏈之位置編號1、2、3、4、11、13、15、17、19、21、23、25、26及27等，於任一情形時均較佳為正義鏈之3'末端之2個核苷酸為脫氧核糖核苷酸，且反義鏈於5'末端含有磷酸。
本發明所使用之雙鏈核酸包含核酸之結構中之磷酸部、酯部等中所含之氧原子等例如被取代為硫原子等其他原子之衍生物。
又，與反義鏈及正義鏈之5'末端之鹼基結合之糖之各5'位之羥基亦可藉由磷酸基或上述修飾基、或藉由生物體內之核酸分解酶等轉化 為磷酸基或上述修飾基之基進行修飾。
又，與反義鏈及正義鏈之3'末端之鹼基結合之糖之各3'位之羥基亦可藉由磷酸基或上述修飾基、或藉由生物體內之核酸分解酶等轉化為磷酸基或上述修飾基之基進行修飾。
再者，本發明所使用之雙鏈核酸只要使用已知之RNA或DNA合成法、及RNA或DNA修飾法進行製造即可。
雙鏈核酸可設計為與KRAS基因序列內之標靶序列相互作用。
雙鏈核酸之一條鏈之序列係與上述標靶部位序列互補。雙鏈核酸可使用本說明書中所說明之方法進行化學合成。
RNA亦可藉由酵素性或部分/全部有機合成而生成，又，經修飾之核糖核苷酸可於體外藉由酵素性或有機合成而導入。於一態樣中，各鏈係藉由化學方法製備。化學合成RNA分子之方法於該技術領域係公知[參照核酸研究(Nucleic Acid Res).,1998年，第32卷，p.936-948]。一般而言，雙鏈核酸可藉由使用固相寡核苷酸合成法進行合成(例如參照Usman et al.，美國專利第5,804,683號、第5,831,071號、第5,998,203號、第6,117,657號、第6,353,098號、第6,362,323號、第6,437,117號、第6,469,158號，Scaringe et al.，美國專利第6,111,086號、第6,008,400號、第6,111,086號)。
單鏈核酸係使用固相亞磷醯胺法(參照核酸研究(Nucleic Acid Res).,1993年，第30卷，p.2435-2443)進行合成，並去保護，及於NAP-5管柱(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)上進行脫鹽。低聚物係採用使用15分步驟之線性梯度的Amersham Source 15Q管柱-1.0cm、高度25cm(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)之離子交換高性能液體層析法(IE-HPLC，Ion Exchange-High Performance Liquid Chromatography)進行純化。梯度係自90：10之緩衝液A：B變更為52：48之緩衝液A：B，緩衝液A為100mM Tris pH值8.5，及緩衝 液B為100mM Tris pH值8.5(1M之NaCl)。樣本係於260nm下進行監測，收集與全長寡核苷酸種類對應之波峰並匯總，利用NAP-5管柱進行脫鹽，以及進行冷凍乾燥。
各單鏈核酸之純度係藉由Beckman PACE 5000(Beckman Coulter Inc.,Fullerton,Calif)之毛細管電泳(CE，capillaryelectrophoresis)而確定。CE毛細管具有100μm之內徑，且含有ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter)。典型而言，將約0.6nmole之寡核苷酸注射至毛細管內，於444V/cm之電場下實施，藉由260nm下之UV(ultraviolet，紫外線)吸光度而檢測。改性三硼酸-7M-尿素泳動緩衝液係自Beckman-Coulter購入。可獲得用於下述說明之實驗中之藉由CE進行評估則至少90%純淨的單鏈核酸。化合物同源性係依據製造商之推薦操作說明，藉由Voyager DE.TM.Biospectometry workstation(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)之基質輔助雷射脫附游離-飛行時間型(MALDI-TOF，Matrix Assisted Laser Desorption Inoization-Time of Flight)質譜分光法進行驗證。單鏈核酸之相對分子質量可於預測之分子質量之0.2%以內獲得。
單鏈核酸係以100μM濃度再懸浮於包含100mM之乙酸鉀、30mM之HEPES(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid，2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌基]乙磺酸)、pH值7.5之緩衝液中。以相同之莫耳量混合互補正義鏈及反義鏈，獲得50μM雙鏈核酸之最終溶液。將樣本以5分鐘加熱至95℃，並於使用前冷卻至室溫。將雙鏈核酸於-20℃下進行保存。對單鏈核酸進行冷凍乾燥或於無核酸酶之水中、-80℃下儲存。
將本發明所使用之雙鏈核酸之具體例示於第3表。再者，表中之與附有r、m及d之鹼基結合之糖分別為核糖、2'位之羥基被取代為-O-甲基之核糖及脫氧核糖。
本發明中之脂質粒子係含有化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)、與雙鏈核酸的脂質粒子，例如可列舉：含有化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)與雙鏈核酸之複合物、或者於化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與雙鏈核酸之複合物的脂質粒子，包含該複合物及封入該複合物之脂質膜的脂質粒子等。脂質膜可為脂質單膜(脂質1分子膜)亦可為脂質雙層膜(脂質2分子膜)。再者，該脂質膜中亦可含有化合物(I)、化合物(II)、中性脂質及/或高分子。又，該複合物及/或該脂質膜中亦可含有化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質。
又，作為本發明中之脂質粒子，例如亦可列舉：包含化合物(II)與雙鏈核酸之複合物、或者於化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與雙鏈核酸之複合物、以及封入該複合物之脂質膜，且於脂質 膜中含有化合物(I)之脂質粒子等。於該情形時之脂質膜可為脂質單膜(脂質1分子膜)亦可為脂質雙層膜(脂質2分子膜)。再者，該脂質膜中亦可含有化合物(II)、中性脂質及/或高分子。又，該複合物及/或該脂質膜中亦可含有化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質。
作為該複合物之形態，於任意情形時均可列舉雙鏈核酸與包含脂質單層之膜(逆微胞)之複合物、雙鏈核酸與脂質體之複合物、雙鏈核酸與微胞之複合物等，較佳可列舉雙鏈核酸與包含脂質單層之膜之複合物或雙鏈核酸與脂質體之複合物。
作為包含該複合物及封入該複合物之脂質雙層膜的脂質粒子，可列舉包含該複合物及封入該複合物之脂質雙層膜的脂質體等。
再者，本發明中之脂質粒子中均可分別使用一種或複數種化合物(I)及化合物(II)，又，於化合物(I)及/或化合物(II)中亦可混合化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質。
作為化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質，例如可列舉：日本專利特開昭61-161246號公報(美國專利5049386號說明書)中所揭示之DOTMA、DOTAP等、國際公開第91/16024號說明書及國際公開第97/019675號說明書中所揭示之N-[1-(2,3-二油氧基丙基)]-N,N-二甲基-N-羥基乙基溴化銨(DORIE，N-[1-(2,3-Dioleoyloxypropyl)]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide)、2,3-二油氧基-N-[2-(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基三氟乙酸銨(DOSPA，2,3-dioleoyloxy-N-[2-(spermine-carboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetic acid)等、國際公開第2005/121348號說明書中所揭示之DLinDMA等、國際公開第2009/086558號說明書中所揭示之DLin-K-DMA等，較佳可列舉DOTMA、DOTAP、DORIE、DOSPA、DLinDMA、DLin-K-DMA等包含具有2個未經取代之烷基之三級胺部位或具有3個未經取代之烷基之四級銨部位之陽離子性脂 質，更佳可列舉包含該三級胺部位之陽離子性脂質。該三級胺部位及該四級銨部位之未經取代之烷基更佳為甲基。
本發明中之脂質粒子可藉由公知之製造方法或依據其之方法而製造，亦可為利用任意製造方法所製造者。例如製造作為脂質粒子之一種的脂質體時，可應用公知之脂質體之製備方法。作為公知之脂質體之製備方法，例如可列舉班厄姆(Bangham)等人之脂質體製備法[參照“分子生物學雜誌(Journal of molecular Biology)(J.Mol.Biol.)”,1965年，第13卷，p.238-252]、乙醇注入法[參照“細胞生物學雜誌(Journal of Cell Biology)(J.Cell Biol.)”,1975年，第66卷，p.621-634]、法式壓碎法[參照“歐洲生化學會聯合會快報(FEBS Lett.)”,1979年，第99卷，p.210-214]、冷凍融解法[參照“生物化學與生物物理學集刊(Archives of Biochemistry and Biophysics)(Arch.Biochem.Biophys.)”,1981年，第212卷，p.186-194]、逆相蒸發法[參照“美國國家科學院院刊(Proceedings of the National Academy of Science United States of America)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)”,1978年，第75卷，p.4194-4198]或pH值梯度法(例如參照專利第2572554號公報、專利第2659136號公報等)等。作為製造脂質體時分散脂質體之溶液，例如可使用水、酸、鹼、各種緩衝液、生理食鹽水或胺基酸輸液等。又，於製造脂質體時，亦可添加例如檸檬酸、抗壞血酸、半胱胺酸或乙二胺四乙酸(EDTA，Ethylenediamine Tetraacetic acid)等抗氧化劑，例如甘油、葡萄糖或氯化鈉等等張劑等。又，亦可藉由如下方式製造脂質體：將脂質等溶解於例如乙醇等有機溶劑中，蒸餾去除溶劑後添加生理食鹽水等並進行振盪攪拌，形成脂質體。
又，本發明之脂質粒子例如可藉由如下方法製造：預先將化合物(I)、化合物(I)及化合物(II)、化合物(I)與化合物(I)及化合物(II)以外 之陽離子性脂質或化合物(I)及化合物(II)與化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質溶解於氯仿中，繼而加入雙鏈核酸之水溶液與甲醇進行混合而形成陽離子性脂質/雙鏈核酸之複合物，進而提取氯仿層，向其中加入聚乙二醇化磷脂質、中性脂質及水而形成油中水型(W/O)乳化液，藉由逆相蒸發法進行處理而製造之方法(參照日本專利特表2002-508765號公報)；或將雙鏈核酸溶解於酸性之電解質水溶液中，加入脂質(乙醇中)，將乙醇濃度降低至20v/v%而製備上述雙鏈核酸內包脂質體，進行篩分過濾，並藉由透析而去除過量之乙醇後，進而提高pH值而對樣本進行透析，去除附著於脂質體表面之雙鏈核酸而製造之方法(參照日本專利特表2002-501511號公報及生物化學與生物物理學報(Biochimica et Biophysica Acta),2001年，第1510卷，p.152-166)等。
本發明中之脂質粒子中，包含複合物及封入該複合物之脂質雙層膜的脂質體例如可根據國際公開第02/28367號說明書及國際公開第2006/080118號說明書等中記載之製造方法而製造。
又，本發明中之脂質粒子中，例如包含化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)與雙鏈核酸之複合物、或者於化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與雙鏈核酸之複合物、以及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)、化合物(II)、及/或化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質的脂質粒子；包含化合物(II)與雙鏈核酸之複合物、或者於化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與雙鏈核酸之複合物、以及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)之脂質粒子等可藉由如下方式獲得：根據國際公開第02/28367號說明書及國際公開第2006/080118號說明書等中記載之製造方法，製造各複合物，於水或0~20%乙醇水溶液中分散而非溶解該複合物(A液)，另行使各脂質膜 成分溶解於乙醇水溶液中(B液)，將A液與B液加以混合，進而適當加入水。又，A液及B液中之化合物(I)、化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質可分別使用一種或者亦可使用複數種。
再者，於本發明中，包含化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)與雙鏈核酸之複合物、或者於化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與雙鏈核酸之複合物、以及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)、化合物(II)、及/或化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質的脂質粒子，包含化合物(II)與核酸之複合物、或者於化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與核酸之複合物、以及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)的脂質粒子等的製造中及製造後，因複合物中之雙鏈核酸與脂質膜中之陽離子性脂質之靜電相互作用、或複合物中之陽離子性脂質與脂質膜中之陽離子性脂質之融合，而使複合物及膜之結構產生移位者亦分別包含於包含化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)與雙鏈核酸之複合物、或者於化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與雙鏈核酸之複合物、以及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)、化合物(II)、及/或化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質的脂質粒子，包含化合物(II)與核酸之複合物、或者於化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與核酸之複合物、以及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)的脂質粒子等中。
作為本發明中之脂質粒子，較佳為包含化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)與雙鏈核酸之複合物、或者於化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與雙鏈核酸之複合物、以及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)、化合物(II)或化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質的脂質粒子，更佳為包含化 合物(I)或化合物(I)及化合物(II)與雙鏈核酸之複合物、或者於化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)中組合中性脂質及/或高分子而成者與雙鏈核酸之複合物、以及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)或化合物(I)及化合物(II)的脂質粒子，進而較佳為包含於化合物(I)或化合物(I)中組合中性脂質而成者與雙鏈核酸之複合物及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)的脂質粒子、或者包含於化合物(II)或化合物(II)中組合中性脂質而成者與雙鏈核酸之複合物及封入該複合物之脂質膜且於脂質膜中含有化合物(I)及化合物(II)的脂質粒子。
該複合物中之化合物(I)及化合物(II)之分子總數相對於該雙鏈核酸之磷原子數較佳為0.5~4倍，更佳為1.5~3.5倍，進而較佳為2~3倍。又，該複合物中之化合物(I)及化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質之分子總數相對於該雙鏈核酸之磷原子數較佳為0.5~4倍，更佳為1.5~3.5倍，進而較佳為2~3倍。
於本發明之脂質粒子包含複合物及封入該複合物之脂質膜之情形時，該脂質粒子中之化合物(I)及化合物(II)之分子總數相對於該雙鏈核酸之磷原子數較佳為1~10倍，更佳為2.5~9倍，進而較佳為3.5~8倍。又，該脂質粒子中之化合物(I)及化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質之分子總數相對於該雙鏈核酸之磷原子數較佳為1~10倍，更佳為2.5~9倍，進而較佳為3.5~8倍。
作為中性脂質，亦可為單純脂質、複合脂質或衍生脂質中之任意者，例如可列舉：磷脂質、甘油糖脂、神經鞘糖脂、鞘胺醇類或固醇等，但並不限定於該等。
於本發明之脂質粒子中含有中性脂質之情形時，中性脂質之分子總數相對於化合物(I)及化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質之分子總數，較佳為0.1~1.8倍，更佳為0.3~1.1 倍，進而較佳為0.4~0.9倍。本發明中之脂質粒子可於複合物中含有中性脂質，亦可於封入該複合物之脂質膜中含有，更佳為至少於封入該複合物之脂質膜中含有，進而較佳為於該複合物及該封入該複合物之脂質膜中均含有。
作為中性脂質中之磷脂質，例如可列舉：磷脂醯膽鹼(具體而言為大豆磷脂醯膽鹼、蛋黃磷脂醯膽鹼(EPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)等)、磷脂醯乙醇胺(具體而言為二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二軟脂醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、16-0-單甲基PE、16-0-二甲基PE、18-1-反式PE、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)等)、甘油磷脂質(具體而言為磷脂絲胺酸、磷脂酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、棕櫚醯基油醯基磷脂醯甘油(POPG)、溶血磷脂醯膽鹼等)、神經鞘磷脂質(具體而言為神經鞘磷脂、腦醯胺磷脂醯乙醇胺、腦醯胺磷脂醯甘油、腦醯胺磷脂醯甘油磷酸等)、甘油膦醯脂質、神經鞘膦醯脂質、天然卵磷脂(具體而言為蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂等)或氫化磷脂質(具體而言為氫化大豆磷脂醯膽鹼等)等天然或合成之磷脂質。
作為中性脂質中之甘油糖脂，例如可列舉：磺醯氧核糖基甘油酯、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯或糖苷基二甘油酯等。
作為中性脂質中之神經鞘糖脂，例如可列舉：半乳糖基腦苷脂、乳糖基腦苷脂或神經節苷脂等。
作為中性脂質中之鞘胺醇類，例如可列舉：鞘胺糖、二十碳鞘胺糖、神經鞘胺醇或該等之衍生物等。作為衍生物，例如可列舉將鞘 胺糖、二十碳鞘胺糖或神經鞘胺醇等之-NH2轉化為-NHCO(CH2)xCH3(式中，x為0~18之整數，其中較佳為6、12或18)而成者等。
作為中性脂質中之固醇，例如可列舉：膽固醇、二氫膽固醇、羊毛固醇、β-植固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、麥角固醇、海藻固醇或3β-[N-(N',N'-二甲基胺基乙基)胺甲醯基]膽固醇(DC-Chol)等。
作為中性脂質，較佳可列舉磷脂質、固醇等，更佳可列舉磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、膽固醇，進而較佳可列舉磷脂醯乙醇胺、膽固醇及該等之組合。
作為高分子，可列舉：例如蛋白質、白蛋白、聚葡糖、Polyfect、殼聚糖、硫酸聚葡糖，例如聚-L-離胺酸、聚伸乙基亞胺、聚天冬胺酸、苯乙烯順丁烯二酸共聚物、異丙基丙烯醯胺-丙烯醯基吡咯啶酮共聚物、聚乙二醇修飾樹枝狀聚合物、聚乳酸、聚乳酸聚乙醇酸或聚乙二醇化聚乳酸等高分子或該等之鹽中之1種以上。
此處，高分子之鹽例如包含金屬鹽、銨鹽、酸加成鹽、有機胺加成鹽、胺基酸加成鹽等。作為金屬鹽，例如可列舉：鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等鹼土金屬鹽，鋁鹽或鋅鹽等。作為銨鹽，例如可列舉：銨或四甲基銨等鹽。作為酸加成鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽或磷酸鹽等無機酸鹽，及乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽或檸檬酸鹽等有機酸鹽。作為有機胺加成鹽，例如可列舉：嗎啉或哌啶等之加成鹽。作為胺基酸加成鹽，例如可列舉：甘胺酸、苯丙胺酸、天冬胺酸、麩胺酸或離胺酸等之加成鹽。
又，本發明中之脂質粒子較佳為進而含有水溶性高分子之脂質衍生物或脂肪酸衍生物。該水溶性高分子之脂質衍生物或脂肪酸衍生物可於複合物中含有，亦可於封入複合物之脂質膜中含有，更佳為於 複合物及封入該複合物之脂質膜中均含有。
於本發明之脂質粒子中含有水溶性高分子之脂質衍生物或脂肪酸衍生物之情形時，水溶性高分子之脂質衍生物及脂肪酸衍生物之分子總數相對於化合物(I)及化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外之陽離子性脂質之分子總數，較佳為0.05~0.3倍，更佳為0.07~0.25倍，進而較佳為0.1~0.2倍。
水溶性高分子之脂質衍生物或脂肪酸衍生物較佳為具有分子之一部分藉由例如疏水性親和力、靜電相互作用等而與脂質粒子之其他構成成分結合之性質，其他部分具有藉由例如親水性親和力、靜電相互作用等而與製造脂質粒子時之溶劑結合之性質，從而具有兩面性之物質。
作為水溶性高分子之脂質衍生物或脂肪酸衍生物，例如可列舉：聚乙二醇、聚甘油、聚伸乙基亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯醯胺、寡糖、糊精、水溶性纖維素、聚葡糖、硫酸軟骨素、殼聚糖、聚乙烯吡咯啶酮、聚天冬胺酸醯胺、聚-L-離胺酸、甘露聚糖、支鏈澱粉、寡甘油等或該等之衍生物，與上述脂質粒子之定義中所列舉之中性脂質、化合物(I)或化合物(II)、或者例如硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸或月桂酸等脂肪酸結合而成者、該等之鹽等，更佳可列舉聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等脂質衍生物或脂肪酸衍生物及該等之鹽，進而較佳可列舉聚乙二醇衍生物之脂質衍生物或脂肪酸衍生物及該等之鹽。
作為聚乙二醇衍生物之脂質衍生物或脂肪酸衍生物，例如可列舉：聚乙二醇化脂質(具體而言為聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺(更具體而言為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DSPE)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DMPE)等)、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、 CREMOPHOR EL等)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯類(具體而言為聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯等)或聚乙二醇脂肪酸酯類等，更佳可列舉聚乙二醇化脂質，進而較佳可列舉PEG-DSPE、PEG-DMPE。
作為聚甘油衍生物之脂質衍生物或脂肪酸衍生物，例如可列舉：聚甘油化脂質(具體而言為聚甘油-磷脂醯乙醇胺等)或聚甘油脂肪酸酯類等，更佳可列舉聚甘油化脂質。
又，對於本發明中之脂質粒子，亦可任意地進行例如利用水溶性高分子、聚氧乙烯衍生物等之表面改質[參照拉西奇(D.D.Lasic)、馬丁(F.Martin)編，“隱形脂質體(Stealth Liposomes)”(美國)，CRC Press Inc,1995年，p.93-102]。作為可使用於表面改質之高分子，例如可列舉：聚葡糖、聚三葡萄糖(pullulan)、甘露聚糖、支鏈澱粉或羥基乙基澱粉等。作為聚氧乙烯衍生物，例如可列舉：聚山梨糖醇酯80、Pluronic F68、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇或PEG-DSPE等。藉由該表面改質，可使脂質粒子中之複合物及脂質膜含有水溶性高分子之脂質衍生物或脂肪酸衍生物。
本發明中之脂質粒子之平均粒徑可視所需而自由選擇，較佳為設為下述平均粒徑。作為調節平均粒徑之方法，例如可列舉：擠壓法、對較大之多層膜脂質體(MLV)等進行機械粉碎(具體而言使用曼頓高林均質機(Manton Gaulin)、微噴均質機等)之方法[參照R.H.Muller、S.Benita、B.Bohm編著，“用於難溶性藥劑之乳液與奈米懸浮液(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)”，德國(Deuts)，斯圖加特科學出版社(Scientific Publishers Stuttgart),1998年，p.267-294]等。
本發明中之脂質粒子之大小較佳為平均粒徑為約10nm~1000nm，更佳為約30nm~300nm，進而較佳為約50nm~200nm。
藉由將本發明之組合物投予至哺乳類之細胞，可將本發明之組 合物中之雙鏈核酸導入至細胞內。
於活體內將本發明組合物導入哺乳類之細胞內之方法根據可於活體內進行之公知之轉染之順序進行即可。例如藉由將本發明之組合物對包括人在內之哺乳動物靜脈內投予，可傳遞至例如產生癌或炎症之器官或部位，而將本發明之組合物中之雙鏈核酸導入傳遞器官或部位之細胞內。作為產生癌或炎症之器官或部位，並無特別限定，例如可列舉：胃、大腸、肝臟、肺、脾臟、胰臟、腎臟、膀胱、皮膚、血管、眼球等，較佳可列舉大腸或胰臟。又，藉由將本發明之組合物對包括人在內之哺乳動物靜脈內投予，可傳遞至例如血管、肝臟、肺、脾臟及/或腎臟，而將本發明之組合物中之雙鏈核酸導入傳遞器官或部位之細胞內。血管、肝臟、肺、脾臟及/或腎臟之細胞亦可為正常細胞。
若本發明之組合物中之雙鏈核酸導入傳遞器官或部位之細胞內，則可降低該細胞內之RAS基因之表現，而治療KRAS相關疾病例如白血病、黑色素瘤、細胞瘤、癌症、腫瘤、腺瘤等。
即，藉由將本發明之組合物投予至哺乳動物，可降低RAS基因之表現，治療RAS相關疾病例如白血病、黑色素瘤、細胞瘤、癌症、腫瘤、腺瘤等。投予對象較佳為人。
又，本發明中之組合物於與癌症之治療劑或預防劑有關之活體內之藥效評估模型中，亦可用作用以驗證抑制KRAS基因之有效性的工具。
於使用本發明之組合物作為癌症之治療劑或預防劑之情形時，作為投予途徑，較理想為使用治療時最有效果之投予途徑，較佳可列舉靜脈內投予或肌內投予，更佳可列舉靜脈內投予。
投予量根據投予對象之症狀或年齡、投予途徑等而異，例如可以換算為雙鏈核酸之1天投予量成為約0.1μg~1000mg之方式進行投 予。
作為適合於靜脈內投予或肌內投予之製劑，例如可列舉注射劑，藉由上述方法所製備之脂質粒子之分散液亦可直接例如以注射劑等形態使用，亦可藉由例如過濾、離心分離等自該分散液中去除溶劑而使用，亦可將該分散液冷凍乾燥而使用，及/或將添加有例如甘露醇、乳糖、海藻糖、麥芽糖或甘胺酸等賦形劑之分散液冷凍乾燥而使用。
於注射劑之情形時，較佳為於上述脂質粒子之分散液、或者去除上述溶劑或加以冷凍乾燥之組合物中混合例如水、酸、鹼、各種緩衝液、生理食鹽水或胺基酸輸液等而製備注射劑。又，例如亦可添加檸檬酸、抗壞血酸、半胱胺酸或EDTA等抗氧化劑、或者甘油、葡萄糖或氯化鈉等等張劑等而製備注射劑。又，例如亦可添加甘油等冷凍防腐劑而冷凍保存。
其次，藉由實施例、參考例及試驗例對本發明加以具體說明。但本發明並不限定於該等實施例及試驗例。
再者，參考例所示之質子核磁共振光譜(1H NMR)係於270MHz、300MHz或400MHz下測得者，存在因化合物及測定條件而未能明確地觀測到交換性質子之情況。再者，作為訊號之多重度之表述，使用通常所使用者，所謂br表示表觀上寬廣之訊號。
參考例1 甲基-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)胺(化合物II-1)
於甲胺(Aldrich公司製造，約2mol/L四氫呋喃溶液，10.5mL，21.0mmol)中添加甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司製造，1.03g，3.00mmol)，使用微波反應裝置，於150℃下加熱攪拌90分鐘。利用乙酸乙酯稀釋反應液，利用2mol/L氫氧化鈉水溶液，繼而利用飽和食鹽水進行清洗，以無水硫酸鎂進行乾 燥後過濾，於減壓下進行濃縮，藉此獲得甲基-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)胺之粗產物。
於所獲得之粗產物中添加甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司製造，0.93g，2.70mmol)及50%氫氧化鈉水溶液(0.960g，12.0mmol)，於油浴上、135℃下加熱攪拌60分鐘。將其冷卻至室溫後，以乙酸乙酯稀釋反應液，利用水進行清洗，繼而利用飽和食鹽水進行清洗，以無水硫酸鎂進行乾燥後過濾，於減壓下進行濃縮。利用矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇=100/0~97/3)對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得化合物II-1(1.07g，67.2%)。
ESI-MS m/z：529(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.89(t,J=6.7Hz,6H),1.29(brs,32H),1.40-1.51(m,4H),1.97-2.06(m,8H),2.20(s,3H),2.30(t,J=7.6Hz,4H),2.77(t,J=5.8Hz,4H),5.28-5.43(m,8H)。
參考例2 甲基-二((Z)-十六碳-9-烯基)胺(化合物II-2)
藉由與參考例1相同之方法，使用甲胺(Aldrich公司製造，約2mol/L四氫呋喃溶液，10.0mL，20.0mmol)及甲磺酸(Z)-十六碳-9-烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司製造，1.21g，3.80mmol)，獲得化合物II-2(0.491g，51.6%)。
ESI-MS m/z：477(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.88(t,J=6.7Hz,6H),1.29(brs,36H),1.46-1.57(m,4H),1.97-2.05(m,8H),2.33(s,3H),2.45(t,J=7.9Hz,4H),5.29-5.41(m,4H)。
參考例3 甲基-二((11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基)胺(化合物II-3)
藉由與參考例1相同之方法，使用甲胺(Aldrich公司製造，約2mol/L四氫呋喃溶液，16.0mL，32.0mmol)及甲磺酸(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司製造，2.98g，8.00 mmol)，獲得化合物II-3(1.27g，54.4%)。
ESI-MS m/z：585(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.89(t,J=6.7Hz,6H),1.27(brs,40H),1.39-1.51(m,4H),2.01-2.09(m,8H),2.20(s,3H),2.30(t,J=7.6Hz,4H),2.79(d,J=6.3Hz,4H),5.28-5.43(m,8H)。
參考例4 二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)胺(化合物II-4)
藉由與參考例1相同之方法，使用氨(東京化成工業公司製造，約2mol/L甲醇溶液，18.0mL，36.0mmol)及甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司製造，2.79g，8.10mmol)，獲得化合物II-4(0.838g，36.2%)。
ESI-MS m/z：515(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.89(t,J=6.9Hz,6H),1.30(brs,33H),1.41-1.54(m,4H),2.01-2.09(m,8H),2.59(t,J=7.2Hz,4H),2.77(t,J=5.6Hz,4H),5.28-5.43(m,8H)。
參考例5 二((Z)-十八碳-9-烯基)胺(化合物II-5)
藉由與參考例1相同之方法，使用氨(東京化成工業公司製造，約2mol/L甲醇溶液，12.0mL，24.0mmol)及甲磺酸(Z)-十八碳-9-烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司製造，1.87g，5.40mmol)，獲得化合物II-5(0.562g，36.2%)。
ESI-MS m/z：519(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.88(t,J=6.7Hz,6H),1.29(brs,45H),1.41-1.52(m,4H),1.97-2.05(m,8H),2.58(t,J=7.2Hz,4H),5.28-5.40(m,4H)。
參考例6 甲基-二((Z)-十八碳-9-烯基)胺(化合物II-6)
藉由與參考例1相同之方法，使用甲胺(Aldrich公司製造，約2mol/L四氫呋喃溶液，11.2mL，22.4mmol)及甲磺酸(Z)-十八碳-9-烯 基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司製造，2.11g，6.09mmol)，獲得化合物II-6(1.20g，70.2%)。
ESI-MS m/z：533(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.88(t,J=6.6Hz,6H),1.27(brs,44H),1.39-1.50(m,4H),1.97-2.06(m,8H),2.20(s,3H),2.30(t,J=7.6Hz,4H),5.28-5.40(m,4H)。
參考例7 反式-1-(第三丁氧基羰基)-3,4-雙(((Z)-十八碳-9-烯醯氧基)甲基)吡咯啶(化合物VII-1)
將參考國際公開第2006/100036號說明書所合成之反式-3,4-雙(羥基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(156mg，0.674mmol)溶解於二氯甲烷(6mL)中，添加油酸(東京化成工業公司製造，419mg，1.48mmol)、水溶性碳二醯亞胺(WSCD，Water-Soluble Carbodiimide)(國產化學公司製造，297mg，1.55mmol)及4-二甲基胺基吡啶(東京化成工業公司製造，DMAP，20.6mg，0.169mmol)，於室溫下徹夜攪拌。於反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取。利用水及飽和食鹽水清洗有機層，以無水硫酸鎂進行乾燥後，於減壓下進行濃縮。利用矽膠管柱層析法(己烷/氯仿=50/50~0/100)對殘渣進行純化，藉此獲得化合物VII-1(280mg，54.6%)。
ESI-MS m/z：761(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.88(t,J=6.6Hz,6H),1.25-1.46(m,36H),1.46(s,9H),1.46-1.66(m,8H),1.97-2.04(m,8H),2.27-2.38(m,6H),3.10-3.23(m,2H),3.53-3.66(m,2H),4.03(dd,J=10.8,6.0Hz,2H),4.14(dd,J=10.8,6.0Hz,2H),5.28-5.40(m,4H)。
參考例8 反式-1-(第三丁氧基羰基)-3,4-雙(((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醯氧基)甲基)吡咯啶(化合物VII-2)
藉由與參考例7相同之方法，使用參考國際公開第2006/100036號說明書所合成之反式-3,4-雙(羥基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(150 mg，0.674mmol)及亞麻油酸(Aldrich公司製造，400mg，1.48mmol)，獲得化合物VII-2(351mg，71.7%)。
ESI-MS m/z：757(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.89(t,J=6.8Hz,6H),1.21-1.45(m,26H),1.46(s,9H),1.47-1.68(m,6H),2.05(q,J=6.7Hz,8H),2.26-2.38(m,6H),2.77(t,J=5.9Hz,4H),3.10-3.23(m,2H),3.53-3.66(m,2H),4.03(dd,J=11.0,6.0Hz,2H),4.14(dd,J=11.0,6.0Hz,2H),5.28-5.43(m,8H)。
參考例9 反式-3,4-雙(((Z)-十八碳-9-烯醯氧基)甲基)吡咯啶(化合物I-1)
將參考例7中獲得之化合物VII-1(278mg，0.366mmol)溶解於二氯甲烷(6mL)中，添加三氟乙酸(0.563mL，7.31mmol)，於室溫下攪拌3小時。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用氯仿萃取水層。利用飽和食鹽水清洗有機層，以無水硫酸鎂進行乾燥後過濾，於減壓下進行濃縮。將所獲得之殘渣溶解於少量之甲醇中，使其吸附於填充至塑膠管柱中之BONDESIL-SCX(VARIAN公司製造，6g)之上部，利用甲醇進行清洗，繼而利用氨-甲醇溶液(東京化成工業公司製造，2mol/L)使目標物溶出。於減壓下對含有目標物之組分進行濃縮，藉此獲得化合物I-1(162mg，67.2%)。
ESI-MS m/z：661(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.88(t,J=6.6Hz,6H),1.27-1.35(m,40H),1.56-1.64(m,4H),2.01(q,J=5.9Hz,8H),2.09-2.16(m,2H),2.30(t,J=7.5Hz,4H),2.72(dd,J=11.3,5.5Hz,2H),3.11(dd,J=11.3,7.1Hz,2H),3.99-4.12(m,4H),5.29-5.40(m,4H)。
參考例10 反式-3,4-雙(((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醯氧基)甲基)吡咯啶(化合物I-2)
藉由與參考例9相同之方法，使用參考例8中獲得之化合物VII- 2(350mg，0.463mmol)，獲得化合物I-2(224mg，73.6%)。
ESI-MS m/z：657(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.89(t,J=6.8Hz,6H),1.26-1.40(m,28H),1.57-1.66(m,4H),2.05(q,J=6.6Hz,8H),2.09-2.17(m,2H),2.31(t,J=7.5Hz,4H),2.72(dd,J=11.3,6.0Hz,2H),2.77(t,J=6.2Hz,4H),3.11(dd,J=11.3,7.3Hz,2H),3.99-4.13(m,4H),5.28-5.43(m,8H)。
參考例11 反式-1-甲基-3,4-雙(((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯醯氧基)甲基)吡咯啶(化合物I-3)
將參考例10中獲得之化合物I-2(80mg，0.12mmol)溶解於1,2-二氯乙烷(1.5mL)、甲醇(1.5mL)中，歷經數次添加甲醛(0.091mL，1.22mmol)、三乙醯氧基硼氫化鈉(Acros Organics公司製造，129mg，0.610mmol)，於室溫下攪拌1.5小時。於反應溶液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯萃取水層。利用飽和氯化鈉水溶液清洗有機層，以無水硫酸鎂進行乾燥後過濾，於減壓下進行濃縮。利用矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇=100/0~93/7)對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得化合物I-3(66mg，81%)。
ESI-MS m/z：671(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.89(t,J=6.8Hz,6H),1.25-1.40(m,28H),1.57-1.66(m,4H),2.05(q,J=6.7Hz,8H),2.13-2.24(m,2H),2.27-2.37(m,9H),2.66(dd,J=9.2,7.3Hz,2H),2.77(t,J=5.7Hz,4H),3.99-4.12(m,4H),5.28-5.43(m,8H)。
參考例12 反式-1-甲基-3,4-雙(((Z)-十八碳-9-烯醯氧基)甲基)吡咯啶(化合物I-4)
藉由與參考例11相同之方法，使用參考例9中獲得之化合物I-1(50mg，0.076mmol)，獲得化合物I-4(47mg，92%)。
ESI-MS m/z：675(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ：0.88(t,J=6.6Hz,6H),1.26-1.35(m,40H),1.56-1.65(m,4H),2.01(q,J=5.5Hz,8H), 2.15-2.24(m,2H),2.27-2.37(m,9H),2.67(dd,J=9.3,7.1Hz,2H),3.99-4.12(m,4H),5.29-5.40(m,4H)。
[實施例1]
使用參考例1中獲得之化合物II-1及參考例11中獲得之化合物I-3、及第3表之siRNA A~C，利用下述方式製造製劑。
將雙鏈核酸溶解於蒸餾水中，製備成24mg/mL而使用(以下稱為siRNA溶液)。
以成為化合物II-1/1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)-2000)鈉鹽(PEG-DMPE Na，N-(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺=鈉鹽，日油公司製造)=57.3/5.52mmol/L之方式，使各脂質懸浮於含有鹽酸及乙醇之水溶液中，反覆利用渦流(vortex)攪拌混合機進行攪拌及加溫，獲得均勻之懸浮液。使該懸浮液於室溫下通過0.2μm之聚碳酸酯薄膜過濾器及0.05μm之聚碳酸酯薄膜過濾器，獲得引導粒子之分散液。利用動態光散射(DLS，Dynamic light scattering)粒徑測定裝置(Zetasizer Nano ZS，Malvern公司製造，以下相同)對所獲得之引導粒子之平均粒徑進行測定，確認到其在30nm至100nm之範圍內。於所獲得之引導粒子之分散液中以3：1(=引導粒子之分散液：siRNA溶液)之比例混合siRNA溶液，進而加入3倍量之蒸餾水進行混合，藉此製備陽離子性脂質/雙鏈核酸複合物粒子之分散液。
另一方面，以成為化合物II-1/化合物I-3/1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)-2000)鈉鹽(PEG-DSPE Na，N-(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺=鈉鹽，日油公司製造)/二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC，1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼，日油公司製造)/膽固醇(日油公司製造)=2.98/5.97/2.94/5.71/11.8mmol/L之方式，稱取各脂質並溶解於90vol% 乙醇中，製備脂質膜構成成分之溶液。
將所獲得之脂質膜構成成分之溶液加溫後，以1：1之比例混合所獲得之陽離子性脂質/雙鏈核酸複合物粒子之分散液，進而混合數倍量之蒸餾水，製備粗製劑。
使用Amicon Ultra(Millipore公司製造)對所獲得之粗製劑進行濃縮，進而將溶劑置換為生理食鹽水，使用0.2μm之過濾器(東洋濾紙公司製造)，於清潔台內進行過濾。進而，測定所獲得之製劑之siRNA濃度，以siRNA濃度計成為1.0mg/mL之方式使用生理食鹽水進行稀釋，藉此獲得製劑1-A~C(含有化合物II-1及化合物I-3作為脂質，且含有siRNA A、B或C作為雙鏈核酸之組合物)。利用粒徑測定裝置測定製劑中之脂質粒子之平均粒徑。將結果示於第4表。
[實施例2]
使用參考例1中獲得之化合物II-1及參考例11中獲得之化合物I-3、及第3表之siRNA A、D或E，利用下述方式製造製劑。
將雙鏈核酸溶解於蒸餾水中，製備成24mg/mL而使用(以下稱為siRNA溶液)。
以成為化合物II-1/PEG-DSPE Na=57.3/5.52mmol/L之方式，使各脂質懸浮於含有鹽酸及乙醇之水溶液中，反覆利用渦流(vortex)攪拌混合機進行攪拌及加溫，獲得均勻之懸浮液。使該懸浮液於室溫下通過0.2μm之聚碳酸酯薄膜過濾器及0.05μm之聚碳酸酯薄膜過濾器，獲得引導粒子之分散液。利用粒徑測定裝置對所獲得之引導粒子 之平均粒徑進行測定，確認到其在30nm至100nm之範圍內。於所獲得之引導粒子之分散液中以3：1(=引導粒子之分散液：siRNA溶液)之比例混合siRNA溶液，進而加入3倍量之蒸餾水進行混合，藉此製備陽離子性脂質/雙鏈核酸複合物粒子之分散液。
另一方面，以成為化合物II-1/化合物I-3/PEG-DSPE Na/DSPC/膽固醇=2.98/5.97/2.94/5.71/11.8mmol/L之方式，稱取各脂質並溶解於90vol%乙醇中，製備脂質膜構成成分之溶液。
將所獲得之脂質膜構成成分之溶液加溫後，以1：1之比例混合所獲得之陽離子性脂質/雙鏈核酸複合物粒子之分散液，進而混合數倍量之蒸餾水，製備粗製劑。
使用Amicon Ultra(Millipore公司製造)對所獲得之粗製劑進行濃縮，將溶劑置換為生理食鹽水。進而，對生理食鹽水利用透析膜(Spectrum Laboratories公司，Spectra Por Biotech纖維素酯膜，MWCO：300KDa)進行透析，使用Amicon Ultra(Millipore公司製造)進行濃縮，使用0.2μm之過濾器(東洋濾紙公司製造)，於清潔台內進行過濾。測定所獲得之製劑之siRNA濃度，以siRNA濃度計成為1.0mg/mL之方式使用生理食鹽水進行稀釋，藉此獲得製劑2-A、2-D及2-E(含有化合物II-1及化合物I-3作為脂質，且含有siRNA A、D或E作為雙鏈核酸之組合物)。利用粒徑測定裝置測定製劑中之脂質粒子之平均粒徑。將結果示於第5表。
[實施例3]
使用參考例1中獲得之化合物II-1及參考例11中獲得之化合物I- 3、及第3表之siRNA A，將引導粒子設為化合物II-1/PEG-DSPE Na=57.3/5.52mmol/L，將脂質膜構成成分設為化合物II-1/化合物I-3/PEG-DSPE Na/DSPC/膽固醇=2.98/8.83/3.93/8.83/14.7mmol/L，藉此，藉由與實施例1相同之方法獲得製劑3-A(含有化合物II-1及化合物I-3作為脂質，且含有siRNA A作為雙鏈核酸之組合物)。利用粒徑測定裝置所測得之製劑中之脂質粒子之平均粒徑為101nm。
[實施例4]
使用參考例1中獲得之化合物II-1及參考例11中獲得之化合物I-3、及第3表之siRNA A，將引導粒子設為化合物II-1/PEG-DSPE Na=57.3/5.52mmol/L，將脂質膜構成成分設為化合物II-1/化合物I-3/PEG-DSPE Na/DSPC/膽固醇=0.736/8.83/2.70/8.83/5.89mmol/L，藉此，藉由與實施例1相同之方法獲得製劑4-A(含有化合物II-1及化合物I-3作為脂質，且含有siRNA A作為雙鏈核酸之組合物)。利用粒徑測定裝置所測得之製劑中之脂質粒子之平均粒徑為80nm。
[實施例5]
使用參考例1中獲得之化合物II-1及參考例11中獲得之化合物I-3、及第3表之siRNA A，將引導粒子設為化合物II-1/PEG-DSPE Na=57.3/5.52mmol/L，將脂質膜構成成分設為化合物II-1/化合物I-3/PEG-DSPE Na/DSPC/膽固醇=2.98/8.83/2.95/8.83/5.89mmol/L，藉此，藉由與實施例1相同之方法獲得製劑5-A(含有化合物II-1及化合物I-3作為脂質，且含有siRNA A作為雙鏈核酸之組合物)。利用粒徑測定裝置所測得之製劑中之脂質粒子之平均粒徑為79nm。
[實施例6]
使用參考例1中獲得之化合物II-1及參考例11中獲得之化合物I-3、及第3表之siRNA A，將引導粒子設為化合物II-1/PEG-DSPE Na=57.3/5.52mmol/L，將脂質膜構成成分設為化合物II-1/化合物I-3/PEG- DSPE Na/DSPC/膽固醇=0.736/8.83/3.68/8.83/14.7mmol/L，藉此，藉由與實施例1相同之方法獲得製劑6-A(含有化合物II-1及化合物I-3作為脂質，且含有siRNA A作為雙鏈核酸之組合物)。利用粒徑測定裝置所測得之製劑中之脂質粒子之平均粒徑為98nm。
[實施例7]
使用參考例1中獲得之化合物I-3、及第3表之siRNA A，將引導粒子設為化合物I-3/PEG-DSPE Na=57.3/5.52mmol/L，將脂質膜構成成分設為化合物I-3/PEG-DSPE Na/DSPC/膽固醇=8.95/2.94/5.71/11.8mmol/L，藉此，藉由與實施例1相同之方法獲得製劑7-A(含有化合物I-3作為脂質，且含有siRNA A作為雙鏈核酸之組合物)。利用粒徑測定裝置所測得之製劑中之脂質粒子之平均粒徑為92nm。
試驗例1
使用實施例1中獲得之製劑1-A~C，分別藉由下述方法實施活體內mRNA表現弱化評估試驗。
源自人類胰臟癌之細胞株的MIA PaCa-2係自JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources，日本研究生物資源收藏中心)細胞庫獲取，利用含有10%滅活胎牛血清(GIBCO公司製造)及1vol%青黴素-鏈黴素(GIBCO公司製造，15140-122)之含高葡萄糖DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，達爾伯克改良伊格爾培養基)培養基(GIBCO公司製造，11995-065)於37℃、5%CO2條件下進行培養。以使MIA PaCa-2成為8×107cells/mL之濃度之方式將其懸浮於磷酸緩衝生理食鹽水(PBS，Phosphate Buffered Saline)中，將該細胞懸浮液100μL移植至SCID小鼠(自Harlan Labs購入)之背部皮下(8×106cells/0.1mL PBS/head)。移植5天後，以腫瘤體積為指標，以5隻為一群進行分群，將相當於siRNA 10mg/kg之量之實施例1中獲得之各製劑靜脈內投予至小鼠。生理食鹽水投予群係投予生理食鹽水10 mL/kg。於投予前及投予48小時後測定小鼠之體重。體重測定後使小鼠安樂死，摘出皮下腫瘤。將所摘出之腫瘤立即於液氮中冷凍，於使用前一直保存於-80℃下。
關於所獲得之腫瘤樣本，於裝有樣本之2mL圓底試管(tube)中添加1mL之Trizol試劑(Invitrogen製造，10296-028)及5mm之不鏽鋼珠(Stainless Steel Beads)(QIAGEN製造，69989)，利用組織粉碎機(Tissue lyser II)(QIAGEN製造)於1/25freq、1.5分鐘×2次之條件下進行粉碎。於粉碎後進行離心(10000rpm，10分鐘)並回收上清液，添加200μL之氯仿並劇烈攪拌後再次進行離心(15000rpm，15分鐘)。於所獲得之上清液中加入等量之70%乙醇溶液進行混合，供於RNeasy迷你套組(Mini Kit)旋轉柱(QIAGEN製造)中進行離心(8000×g，15秒)。去除濾液，加入700μL之RNeasy迷你套組(Mini Kit)RW1(QIAGEN製造)進行離心(8000×g，15秒)，去除濾液，重新加入500μL之RNeasy迷你套組(Mini Kit)RPE(QIAGEN製造)進行離心(8000×g，15秒)。去除濾液，再次加入500μL之RNeasy迷你套組(Mini Kit)RPE進行離心(8000xg，2分鐘)，去除濾液後，進而進行離心(15000rpm，1分鐘)，去除管柱內之溶液。於RNeasy旋轉柱中加入30μL之RNase自由水(free water)進行離心(8000×g，1分鐘)並提取RNA。利用吸光光度計Spectra Max M3(Molecular Devices公司製造)測定所提取之RNA之濃度，使用Transcriptor(Roche製造，4897030)對相當於500~1000ng之RNA進行反轉錄。反應液、反應條件係依據Transcriptor隨附之使用說明書。利用dH2O將所獲得之cDNA樣本稀釋10倍，用作qPCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)之模板。qPCR反應中使用TaqMan基因表現母混合液(Gene Expression Master Mix)(Applied Biosystems製造，4369542)、TaqMan基因表現分析試劑盒(Gene Expression Assays)(Applied Biosystems製造，4331182)。PCR反應之條件係依據 TaqMan Gene Expression隨附之使用說明書。檢體之mRNA量係作為將生理食鹽水投予群中之KRAS之mRNA量設為1時之相對比率而算出。
圖1表示腫瘤中之KRAS mRNA量。
由圖1明確可知，實施例1中獲得之各製劑極強地抑制KRAS基因之表現。
試驗例2
使用實施例1中獲得之製劑1-A~C，藉由下述方法實施腫瘤增殖評估試驗。
藉由與試驗例1相同之方式，使用將源自人類胰臟癌之細胞株的MIA PaCa-2移植至SCID小鼠中之異種移植模型而實施。以腫瘤體積為指標，以7隻為一群進行分群(Day0)，於Day0及Day7靜脈內投予相當於siRNA 10mg/kg之量之實施例1中獲得之各製劑。作為對照，投予生理食鹽水10mL/kg。自Day0至Day17測定各個體之腫瘤直徑，使用下述式算出腫瘤體積、體積比。
[數1]腫瘤體積(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)×0.5
[數2]體積比(V/V0)=各時刻之腫瘤體積(mm3)÷Day0之腫瘤體積(mm3)
圖2表示腫瘤體積之相對值之推移。
由圖2明確可知，於活體內對實施例1中獲得之各製劑進行藥效評估試驗，結果抗腫瘤作用較強。
因此明確可知，將本發明之組合物投予至哺乳動物，可於生物體內抑制RAS基因之表現，治療RAS相關疾病。
試驗例3
對以每隔1週之方式投予2次實施例1中獲得之製劑1-A及1-C後之 血中濃度推移進行比較。
將實施例1中獲得之製劑1-A或1-C之相當於siRNA 10mg/kg之量自尾靜脈投予至雄性CD1小鼠(6週齡，Japan Charles River Laboratories)。間隔7天，以相同之方式實施第2次之投予。於初次及第2次之投予後，在第0.5、2、6及24小時自尾動脈採集20μL之血液，添加變性溶液(denaturing solution)(4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L檸檬酸鈉、1mmol/L二硫蘇糖醇、0.5w/v%N-月桂醯基肌胺酸鈉(sodium N-lauroylsarcosine))100μL進行混合。
於所獲得之液體中添加內部標準物質與苯酚：氯仿：異戊醇pH值8.0(Invitrogen)進行混合，並實施離心分離。
於上清液中添加乙酸鈉與GenTLE沈澱載體(precipitation carrier)(TakaraBIO)進行混合後，添加乙醇進行混合，並實施離心分離，其後去除上清液。向沈澱中添加75v/v%乙醇並進行離心分離後，去除上清液，將沈澱風乾，其後將其溶解於蒸餾水中，藉由LC/MS(Liquid chromatography/mass spectrometry，液相層析/質譜法)定量反義鏈及正義鏈(序列編號5或序列編號9之核酸)。
<裝置>
HPLC裝置：ACQUITY UPLC(ultra-high performance liquid chromatography，超高效液相層析法)系統(Waters)
質量分析裝置：TQ檢測器(Waters)
<HPLC條件>
內標準物質
下述所示之雙鏈核酸
5'-mGmUrAmUrUmUrGmCrGrUrAmUrUmUrAmUrUmArUrGrUrAmAdAdT-3'(序列編號12)
5'-mAmUmUmUrArCrArUrArAmUrAmArArUrArCrGrCrArArArUr AmCrAmC-3'(序列編號13)
(與附有m及r之鹼基結合之糖係分別經2'-O-甲基取代之核糖及核糖)
管柱：ACQUITY UPLC OST C18(1.7μm，2.1mm I.D.x100mm，Waters)
管柱溫度：70℃
流動相：
A液 15mmol/L三乙胺，400mmol/L六氟異丙醇水溶液
B液 甲醇
梯度：使B液濃度於9分鐘內自10%直線性上升至25%。
流速：0.4mL/分鐘
於製劑1-A與製劑1-C之任一投予群中，均未於第1次投予與第2次投予之血中濃度推移確認到差異。
即，明確可知具有例如序列編號4及5、6及7、8及9、4及10或4及11之各正義鏈及反義鏈之雙鏈核酸等例如於將本發明之組合物等投予至哺乳動物之情形時，顯示出優異之血中濃度推移。
試驗例4
使用實施例1中獲得之製劑1-A~C，分別藉由下述方法對活體內之抗PEG抗體產生作用進行研究。
以3隻BALB/c小鼠(自Harlan Labs購入)為一群進行隨機分群，將相當於siRNA 10mg/kg之量之實施例1中獲得之各製劑靜脈內投予至小鼠。生理食鹽水投予群係投予生理食鹽水10mL/kg。投予1週後使用異氟烷將小鼠麻醉。其後進行剖腹，自腹部大靜脈回收約500μL血液。將回收之血液添加至裝有血清分離劑之試管中，於室溫下放置30分鐘。其後，以3000rpm離心分離10分鐘，回收之血清係於使用前一直保存於-20℃下。
於塗有抗生物素蛋白之培養板(Thermo Fisher Scientific Inc.公司，(Nunc)，236001)中添加50μL經PBS稀釋成40μg/mL之含生物素PEG(Biotin-PEG)(Nanocs Inc.公司，PEG5-0001)。但是，添加標準品之孔中未添加Biotin-PEG。於室溫下放置約1小時後，利用裝有Tris緩衝生理食鹽水Tween20(Tris-Buffered Saline Tween-20，TBST)將培養板清洗3次。添加有Biotin-PEG之孔中添加50μL之含有1%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)之經PBS稀釋50倍之血清樣本。又，未添加Biotin-PEG之孔中添加生物素小鼠抗人類CCR4抗體(Biotin-mouse anti-human CCR4 antibody)(BD Biosciences公司，551266)50μL作為標準品(0.98~62.5pg/mL)。於室溫下放置約2小時後，利用TBST將培養板清洗4次。全部孔中均添加50μL之含有1%BSA之經PBS稀釋5000倍之POD(peroxidase，過氧化酶)複合抗小鼠IgGAM抗體(conjugated anti-mouse IgGAM antibody)(ICN/Cappel公司，55570)。於室溫下放置約2小時後，利用TBST將培養板清洗4次。添加50μL之TMB(tetramethylbenzidine，四甲基聯苯胺)受質試劑套組(Substrate Reagent Set)(BD Biosciences公司，555214)。於暗處、室溫下放置約30分鐘後，加入50μL之1M之H2SO4停止酵素反應。利用讀板儀測定450nm與620nm之吸光度，藉由標準樣本之校準曲線，算出樣本之相對之抗PEG抗體量。
圖3表示血中抗PEG抗體量。
試驗例5
使用實施例2中獲得之製劑2-A、2-D及2-E，藉由下述方法實施活體內mRNA表現弱化評估試驗。
藉由與試驗例1相同之方式，使用將源自人類胰臟癌之細胞株的MIA PaCa-2移植至SCID小鼠(自Clea Japan購入)中之異種移植模型而實施。以腫瘤體積為指標，以3隻為一群進行分群(Day0)，於Day0投 予相當於siRNA 10mg/kg、3mg/kg或1mg/kg之量之實施例2中獲得之各製劑。生理食鹽水投予群係投予生理食鹽水10mL/kg。藉由與試驗例1相同之方式，將所獲得之腫瘤樣本粉碎，進行離心，並回收上清液，於上清液中添加氯仿並劇烈攪拌，其後再次進行離心(15000rpm，15分鐘)，利用自動核酸提取機MagNA PURE 96(Roche製造)，使用細胞RNA大容量套組(Cellular RNA Large Volume Kit)(Roche製造，5467535)自所獲得之上清液200μL中提取RNA。藉由與試驗例1相同之方式，作為將生理食鹽水投予群中之KRAS之mRNA量設為1時之相對比率而算出所提取之RNA檢體之mRNA量。
圖4表示腫瘤中之KRAS mRNA量。
由圖4明確可知，實施例2中獲得之各製劑極強地抑制KRAS基因之表現。
試驗例6
使用實施例2中獲得之製劑2-A、2-D及2-E，藉由下述方法實施腫瘤增殖評估試驗。
藉由與試驗例2相同之方式，使用將源自人類胰臟癌之細胞株的MIA PaCa-2移植至SCID小鼠(自Clea Japan購入)中之異種移植模型而實施。以腫瘤體積為指標，以5隻為一群進行分群(Day0)，於Day0靜脈內投予相當於siRNA 10mg/kg、3mg/kg或1mg/kg之量之實施例2中獲得之各製劑。生理食鹽水投予群係投予生理食鹽水10mL/kg。於Day7測定各個體之腫瘤直徑，藉由與試驗例2相同之方法算出腫瘤體積、體積比。
圖5表示腫瘤體積之相對值。
由圖5明確可知，於活體內對實施例2中獲得之各製劑進行藥效評估試驗，結果抗腫瘤作用較強。
因此明確可知，將本發明之組合物投予至哺乳動物，可於生物 體內抑制RAS基因之表現，治療RAS相關疾病。
試驗例7
使用實施例1中獲得之製劑1-A及實施例2中獲得之製劑2-A，藉由下述方法實施腫瘤增殖評估試驗。
藉由與試驗例2相同之方式，使用將源自人類胰臟癌之細胞株的MIA PaCa-2移植至SCID小鼠(自Clea Japan購入)中之異種移植模型而實施。以腫瘤體積為指標，以5隻為一群進行分群(Day0)，於Day0靜脈內投予相當於siRNA 2.5mg/kg之量之各製劑。生理食鹽水投予群係投予生理食鹽水10mL/kg。於Day7測定各個體之腫瘤直徑，藉由與試驗例2相同之方法算出腫瘤體積、體積比。
圖6表示腫瘤體積之相對值。
試驗例8
使用實施例1中獲得之製劑1-A、實施例3中獲得之製劑3-A及實施例4中獲得之製劑4-A，藉由與試驗例7相同之方法實施腫瘤增殖評估試驗。
圖7表示腫瘤體積之相對值。
試驗例9
使用實施例1中獲得之製劑1-A、實施例5中獲得之製劑5-A及實施例6中獲得之製劑6-A，藉由與試驗例7相同之方法實施腫瘤增殖評估試驗。
圖8表示腫瘤體積之相對值。
試驗例10
使用實施例1中獲得之製劑1-A及實施例7中獲得之製劑7-A，藉由下述方法實施腫瘤增殖評估試驗。
藉由與試驗例2相同之方式，使用將源自人類胰臟癌之細胞株的MIA PaCa-2移植至SCID小鼠(自Clea Japan購入)中之異種移植模型而 實施。以腫瘤體積為指標，以5隻為一群進行分群(Day0)，於Day0靜脈內投予相當於siRNA 5mg/kg之量之各製劑。生理食鹽水投予群係投予生理食鹽水10mL/kg。於Day7測定各個體之腫瘤直徑，藉由與試驗例2相同之方法算出腫瘤體積、體積比。
圖9表示腫瘤體積之相對值。
試驗例11
使用實施例1中獲得之製劑1-A，藉由下述方法實施腫瘤增殖評估試驗。
藉由與試驗例2相同之方式，使用將源自人類大腸癌之細胞株的HCT116(ATCC)移植至SCID小鼠(自Clea Japan購入)中之異種移植模型而實施。以腫瘤體積為指標，以5隻為一群進行分群(Day0)，於Day0及Day7對小鼠靜脈內投予相當於siRNA 10mg/kg之量之實施例1中獲得之製劑1-A。生理食鹽水投予群係投予生理食鹽水10mL/kg。自Day0至Day17測定各個體之腫瘤直徑，藉由與試驗例2相同之方法算出腫瘤體積、體積比。
圖10表示腫瘤體積之相對值之推移。
[產業上之可利用性]
將本發明之組合物投予至哺乳動物，可於生物體內抑制KRAS基因表現，治療RAS相關疾病。
[序列表自由內容]
序列編號1-KRAS mRNA內之標靶
序列編號2-KRAS mRNA內之標靶
序列編號3-KRAS mRNA內之標靶
序列編號4-siRNA正義鏈
序列編號5-siRNA反義鏈
序列編號6-siRNA正義鏈
序列編號7-siRNA反義鏈
序列編號8-siRNA正義鏈
序列編號9-siRNA反義鏈
序列編號10-siRNA反義鏈
序列編號11-siRNA反義鏈
序列編號12-siRNA正義鏈用之IS
序列編號13-siRNA反義鏈用之IS
<110> 日商協和醱酵麒麟有限公司
<110> 美商戴瑟納製藥股份有限公司
<120> KRAS基因表現抑制RNAi醫藥組合物
<130> 1001P12225
<150> US61671963
<151> 2012-07-16
<160> 13
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<223> KRAS mRNA內之標靶
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<223> KRAS mRNA內之標靶
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<223> KRAS mRNA內之標靶
<400> 3
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正義鏈
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> gm
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (2)..(2)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (4)..(4)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (4)..(4)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (5)..(5)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (6)..(6)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> cm
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (11)..(11)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (14)..(14)
<223> am
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (15)..(15)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (16)..(16)
<223> am
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (18)..(18)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (18)..(18)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (21)..(21)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (23)..(23)
<223> am
<400> 4
<210> 5
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反義鏈
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (2)..(4)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (13)..(13)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (25)..(25)
<223> cm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (27)..(27)
<223> cm
<400> 5
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正義鏈
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> cm
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (2)..(2)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (4)..(4)
<223> am
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (6)..(6)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> am
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (9)..(11)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> gm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (14)..(14)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (16)..(16)
<223> am
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (17)..(17)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (18)..(18)
<223> am
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (19)..(19)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (19)..(19)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (20)..(20)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (23)..(23)
<223> cm
<400> 6
<210> 7
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反義鏈
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> gm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> cm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (13)..(13)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (15)..(15)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (19)..(19)
<223> gm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (21)..(21)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (23)..(23)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (25)..(25)
<223> gm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (26)..(26)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (27)..(27)
<223> am
<400> 7
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正義鏈
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> cm
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (3)..(3)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (3)..(3)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (7)..(7)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (10)..(12)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (16)..(16)
<223> gm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> am
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (18)..(18)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (18)..(18)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (20)..(21)
<223> n=尿嘧啶
<400> 8
<210> 9
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反義鏈
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(2)
<223> gm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (3)..(3)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (4)..(4)
<223> gm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (13)..(13)
<223> cm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (23)..(23)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (25)..(25)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (27)..(27)
<223> um
<400> 9
<210> 10
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反義鏈
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (2)..(4)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (13)..(13)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (21)..(21)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (23)..(23)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (25)..(25)
<223> cm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (26)..(26)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (27)..(27)
<223> cm
<400> 10
<210> 11
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反義鏈
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (2)..(4)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (13)..(13)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (15)..(15)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> gm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (19)..(19)
<223> cm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (21)..(21)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (23)..(23)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (25)..(25)
<223> cm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (26)..(26)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (27)..(27)
<223> cm
<400> 11
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正義鏈用之IS
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> gm
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (2)..(2)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (4)..(4)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (4)..(4)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (5)..(5)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (6)..(6)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> cm
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (10)..(10)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (12)..(12)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (13)..(13)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (14)..(14)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (14)..(14)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (16)..(16)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (16)..(16)
<223> um
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (17)..(17)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (18)..(18)
<223> am
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (19)..(19)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 未歸類之特徵
<222> (21)..(21)
<223> n=尿嘧啶
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (23)..(23)
<223> am
<400> 12
<210> 13
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反義鏈用之IS
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (2)..(4)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> um
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (13)..(13)
<223> am
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (25)..(25)
<223> cm
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (27)..(27)
<223> cm
<400> 13

Claims (23)

  1. 一種組合物，其包含作為藥物之雙鏈核酸、及含有式(I)所表示之陽離子性脂質之脂質粒子，該雙鏈核酸具有正義鏈及反義鏈，該正義鏈與該反義鏈具有至少25個鹼基對，該反義鏈具有與序列編號1~3中任一KRAS基因之mRNA之連續之至少19個鹼基序列互補之鹼基序列，且具有最大35個核苷酸之長度， (式中，R1及R2為相同或不同，而為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或炔基，L1及L2為相同或不同，而為-CO-O-或-O-CO-，a及b為相同或不同，而為1~3，R3為氫原子、碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基)。
  2. 如請求項1之組合物，其中脂質粒子係進而含有式(II)所表示之陽離子性脂質者， (式中，R4及R5為相同或不同，而為碳數12~24之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或炔基，R6為氫原子、碳數1~6之烷基、碳數3~6之烯基、吡咯啶-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基，或者經相同或不同之1~3個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代之碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基)。
  3. 如請求項2之組合物，其中R4及R5均為十二烷基、十三烷基、十四烷基、2,6,10-三甲基十一烷基、十五烷基、3,7,11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、6,10,14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2,6,10,14-四甲基十五烷基、二十烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基。
  4. 如請求項2之組合物，其中R4及R5均為十四烷基、十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基。
  5. 如請求項3或4之組合物，其中R6為氫原子、甲基、吡咯啶-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基，或者經相同或不同之1~3個胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羥基、烷氧基、胺甲醯基、單烷基胺甲醯基、二烷基胺甲醯基、吡咯啶基、哌啶基或嗎啉基取代 之碳數1~6之烷基或碳數3~6之烯基。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中R3為氫原子或甲基。
  7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中L1及L2為-O-CO-，R1及R2同為十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基。
  8. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中L1及L2為-CO-O-，R1及R2同為十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、二十三烷基、(Z)-十三碳-8-烯基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(E)-十七碳-8-烯基、(Z)-十七碳-10-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、(Z)-十九碳-10-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、2,6,10-三甲基十一碳-1,5,9-三烯基或2,6,10,14-四甲基十五碳-1-烯基。
  9. 如請求項1至8中任一項之組合物，其含有具有序列編號4及5、6及7、8及9、4及10或4及11之各正義鏈及反義鏈的雙鏈核酸作為藥物。
  10. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中陽離子性脂質係與該雙鏈核酸形成複合物，或者與中性脂質及/或高分子組合而成者以及該雙鏈核酸形成複合物。
  11. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中陽離子性脂質係與該雙鏈核酸形成複合物，或者與中性脂質及/或高分子組合而成者以 及該雙鏈核酸形成複合物，且脂質粒子包含該複合物與封入該複合物之脂質膜。
  12. 一種抑制RAS基因表現之方法，其特徵在於：使用如請求項1至11中任一項之組合物而將該雙鏈核酸導入至細胞內。
  13. 如請求項12之方法，其中細胞係位於哺乳類之腫瘤的細胞。
  14. 如請求項12之方法，其中細胞係位於哺乳類之大腸或胰臟的細胞。
  15. 如請求項12至14中任一項之方法，其中導入至細胞內之方法係藉由靜脈內投予而導入至細胞內之方法。
  16. 一種RAS相關疾病之治療方法，其係將如請求項1至11中任一項之組合物投予至哺乳動物。
  17. 如請求項16之方法，其中投予方法係靜脈內投予。
  18. 一種癌症之治療方法，其係將如請求項1至11中任一項之組合物投予至哺乳動物。
  19. 如請求項18之方法，其中投予方法係靜脈內投予。
  20. 一種用以治療RAS相關疾病之醫藥，其包含如請求項1至11中任一項之組合物。
  21. 如請求項20之醫藥，其係靜脈內投予用。
  22. 一種癌症之治療劑，其包含如請求項1至11中任一項之組合物。
  23. 如請求項22之癌症之治療劑，其係靜脈內投予用。
TW102125430A 2012-07-16 2013-07-16 ＫＲＡＳ基因表現抑制ＲＮＡｉ醫藥組合物 TW201408324A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261671963P 2012-07-16 2012-07-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201408324A true TW201408324A (zh) 2014-03-01

Family

ID=49948821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102125430A TW201408324A (zh) 2012-07-16 2013-07-16 ＫＲＡＳ基因表現抑制ＲＮＡｉ醫藥組合物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9913907B2 (zh)
EP (1) EP2873732A4 (zh)
JP (1) JP6272226B2 (zh)
CN (1) CN104471062A (zh)
AU (1) AU2013291125A1 (zh)
CA (1) CA2878314A1 (zh)
HK (2) HK1207113A1 (zh)
SG (1) SG11201502954TA (zh)
TW (1) TW201408324A (zh)
WO (1) WO2014013995A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE059432T2 (hu) 2009-04-03 2022-11-28 Dicerna Pharmaceuticals Inc Módszerek és kompozíciók a kras aszimmetrikus kettõs szálú RNS által történõ specifikus gátlására
AU2015269485A1 (en) * 2014-06-04 2016-12-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. CKAP5-gene-silencing RNAi pharmaceutical composition
TW201619137A (zh) * 2014-06-30 2016-06-01 協和醱酵麒麟有限公司 陽離子性脂質
EP4035659A1 (en) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
US20190351039A1 (en) 2017-02-01 2019-11-21 Modernatx, Inc. Immunomodulatory therapeutic mrna compositions encoding activating oncogene mutation peptides
JPWO2018199340A1 (ja) * 2017-04-28 2020-03-12 協和キリン株式会社 オリゴヌクレオチド誘導体またはその塩
MX2020009149A (es) * 2018-03-02 2021-01-15 Elicio Therapeutics Inc Compuestos que incluyen una secuencia de kras mutante y un lipido y usos de los mismos.
CN111534520A (zh) * 2020-05-27 2020-08-14 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 特异抑制K-ras基因表达的慢病毒和重组载体构建及其应用

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1270198C (en) 1984-08-08 1990-06-12 Marcel B Bally ENCAPSULATION OF ANTINEOPLASTIC AGENTS IN LIPOSONES
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
DE3669503D1 (de) 1985-01-07 1990-04-19 Syntex Inc Oberflaechenaktive n-(omega, omega-1-dialkoxy)- und n-(omega, omega-1-dialkenoxy)-alk-1-yl-n,n,n-trisubstituierte ammoniumverbindungen, deren herstellung und sie enthaltende pharmazeutische formulierungen.
IL91664A (en) 1988-09-28 1993-05-13 Yissum Res Dev Co Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release
JP2923296B2 (ja) 1988-11-14 1999-07-26 株式会社ビタミン研究所 細胞への遺伝子導入法
JPH0696670B2 (ja) 1988-11-16 1994-11-30 日本ポリウレタン工業株式会社 反応性安定化ポリオール組成物
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6469158B1 (en) 1992-05-14 2002-10-22 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes
US5977343A (en) 1992-05-14 1999-11-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes
US5804683A (en) 1992-05-14 1998-09-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Deprotection of RNA with alkylamine
PT748382E (pt) 1993-09-02 2003-03-31 Ribozyme Pharm Inc Acidos nucleicos enzimaticos contendo nao-nucleotidos
US5889136A (en) 1995-06-09 1999-03-30 The Regents Of The University Of Colorado Orthoester protecting groups in RNA synthesis
CA2237316C (en) 1995-11-30 2012-06-26 Vical Incorporated Complex cationic lipids
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
CA2294579C (en) 1997-06-23 2007-10-09 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposome-entrapped polynucleotide composition and method
US6111086A (en) 1998-02-27 2000-08-29 Scaringe; Stephen A. Orthoester protecting groups
WO2000030444A1 (en) * 1998-11-25 2000-06-02 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
DK2796553T3 (da) 2000-03-30 2019-09-30 Whitehead Inst Biomedical Res Rna-sekvensspecifikke formidlere af rna-interferens
EP1323415B1 (en) 2000-10-04 2010-01-13 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method of coating fine particle with lipid film
US20020132788A1 (en) 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
JP2005508306A (ja) 2001-07-23 2005-03-31 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 哺乳類における遺伝子発現のＲＮＡｉによる阻害に関する方法および組成物
US7799565B2 (en) 2004-06-07 2010-09-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
JPWO2006080118A1 (ja) 2005-01-28 2008-06-19 協和醗酵工業株式会社 標的遺伝子の発現を抑制する組成物
GB0505969D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Novartis Ag Organic compounds
JP2010519912A (ja) 2007-03-02 2010-06-10 エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｒａｓ遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
EP2379083B1 (en) * 2008-12-18 2017-08-16 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
HUE059432T2 (hu) * 2009-04-03 2022-11-28 Dicerna Pharmaceuticals Inc Módszerek és kompozíciók a kras aszimmetrikus kettõs szálú RNS által történõ specifikus gátlására
WO2011136368A1 (ja) * 2010-04-28 2011-11-03 協和発酵キリン株式会社 カチオン性脂質
TW201330874A (zh) * 2011-12-12 2013-08-01 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 含有陽離子性脂質之組合之脂質奈米粒子
US9839616B2 (en) * 2011-12-12 2017-12-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Lipid nano particles comprising cationic lipid for drug delivery system

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201502954TA (en) 2015-05-28
EP2873732A4 (en) 2016-03-23
AU2013291125A1 (en) 2015-01-22
US9913907B2 (en) 2018-03-13
HK1207113A1 (zh) 2016-01-22
HK1207666A1 (zh) 2016-02-05
JPWO2014013995A1 (ja) 2016-07-07
US20140044755A1 (en) 2014-02-13
EP2873732A1 (en) 2015-05-20
CA2878314A1 (en) 2014-01-23
WO2014013995A1 (ja) 2014-01-23
CN104471062A (zh) 2015-03-25
JP6272226B2 (ja) 2018-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI594767B (zh) 含有陽離子性脂質之藥物傳遞系統用脂質奈米粒子
CN104159615B (zh) 含有阳离子性脂质的组合的脂质纳米粒子
TW201408324A (zh) ＫＲＡＳ基因表現抑制ＲＮＡｉ醫藥組合物
EP2319519B1 (en) Composition for inhibiting expression of target gene
WO2013032643A2 (en) Lipids capable of conformational change and their use in formulations to deliver therapeutic agents to cells
TW201625310A (zh) ＣＫＡＰ５基因表現抑制ＲＮＡｉ醫藥組合物
JP6774965B2 (ja) カチオン性脂質としての化合物
WO2017010573A1 (ja) β２ＧＰＩ遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ医薬組成物
WO2018225873A1 (ja) 核酸含有ナノ粒子
WO2018062233A1 (ja) カチオン性脂質としての化合物
US20140294978A1 (en) Cationic lipid
US20120244210A1 (en) Composition for suppressing expression of target gene
US20120207818A1 (en) Composition for suppressing expression of target gene
US20140039034A1 (en) Composition for suppressing expression of target gene
US20150247148A1 (en) Composition for suppressing expression of target gene