WO2014013995A1 - KRAS遺伝子発現抑制RNAi医薬組成物 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a composition that suppresses KRAS gene expression, a pharmaceutical comprising the composition, and the like.
- KRAS belongs to the RAS family, which is a protein having a GTP hydrolysis activity with a molecular weight of about 21 kDa. KRAS is located inside the cell membrane and plays a role in transmitting signals generated by the binding of extracellular growth factors such as epidermal growth factor (EGF) and its receptors into the cell. KRAS has an activating mutation, and activating mutations have been observed in about 20% of human cancers. In particular, activating mutations of KRAS have been observed in pancreatic cancer, colon cancer and lung cancer (see Cancer Research, 2012, Vol. 72, p. 2457).
- EGF epidermal growth factor
- KRAS antiepidermal growth factor receptor
- RNAi RNA interference
- RNAi has also been extensively verified in in vivo studies, with effects in fetal animals using siRNAs of 50 base pairs or less (see US Patent Application Publication No. 2002-132788) and in adult mice. The effect (see WO03 / 10180 pamphlet) has been reported. Furthermore, when siRNA is administered intravenously to mouse fetuses, it has been confirmed to suppress the expression of specific genes in the kidney, spleen, lung, pancreas, and liver organs (“Nature Genetics”). , 2002, Vol.32, No.1, p.107-108). Furthermore, it has been reported that expression of a specific gene is also suppressed in brain cells by direct administration of siRNA (“Nature Biotechnology”, 2002, Volume 20, 10No.10, (See p.1006-1010).
- KRAS siRNA is described in, for example, Patent Document 1, Patent Document 2, and the like.
- Patent Document 3 discloses a medicine containing siRNA and, for example, 1,2-dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA) and the like.
- DLinDMA etc. is a structurally similar cationic lipid N- (2,3-di- (9) for the purpose of developing more flexible cationic lipids and thereby enhancing membrane fluidity of liposomes.
- Patent Document 4 discloses a pharmaceutical containing siRNA and, for example, 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl- [1,3] -dioxolane (DLin-K-DMA). Yes. Patent Document 5 discloses, for example, trans-3,4-bis (((Z) -octadeca-9-enoyloxy) methyl) pyrrolidine (Compound I-3) and the like.
- An object of the present invention is to provide a composition that suppresses the expression of KRAS gene, a pharmaceutical comprising the composition, and the like.
- the present invention relates to the following (1) to (23).
- Lipid particles are further represented by formula (II)
- R 4 and R 5 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms
- R 6 is a hydrogen atom, alkyl having 1 to 6 carbons, alkenyl having 3 to 6 carbons, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl or the same or different 1 to 3 amino, Monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted alkyl of 1 to 6 carbons or alkenyl of 3 to 6 carbons).
- composition according to (1) above which is a lipid particle containing a cationic lipid.
- R 4 and R 5 are both dodecyl, tridecyl, tetradecyl, 2,6,10-trimethylundecyl, pentadecyl, 3,7,11-trimethyldodecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, 6,10,14- Trimethylpentadecan-2-yl, nonadecyl, 2,6,10,14-tetramethylpentadecyl, icosyl, 3,7,11,15-tetramethylhexadecyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl, (Z) -tetradeca -9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -
- R 4 and R 5 are both tetradecyl, hexadecyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (Z) -octadec-6-enyl, (Z) -octadec-9-enyl, (9Z, 12Z)
- the composition according to the above (2) which is -octadeca-9,12-dienyl, (Z) -icosa-11-enyl or (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl.
- R 6 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl or the same or different 1 to 3 amino, monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy,
- (6) The composition according to any one of (1) to (5), wherein R 3 is a hydrogen atom or methyl.
- L 1 and L 2 are -O-CO-, and R 1 and R 2 are identically dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, octadecyl, icosyl, docosyl, tetracosyl, (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (E) -octadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-11-enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (9Z, 12Z, 15Z) -octadeca-9,12,15-trienyl, (Z) -icosa-11-enyl, (11Z, 14Z) -icosa- 11,14-dien
- L 1 and L 2 are -CO-O-, and R 1 and R 2 are identically tridecyl, pentadecyl, heptadecyl, nonadecyl, henicosyl, tricosyl, (Z) -tridec-8-enyl, ( (Z) -pentadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-5-enyl, (Z) -heptadeca-8-enyl, (E) -heptadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-10-enyl, ( 8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl, (8Z, 11Z, 14Z) -heptadeca-8,11,14-trienyl, (Z) -nonadec-10-enyl, (10Z, 13Z) -nonadec-10 , 13-dienyl, (11Z, 14Z)
- Cationic lipid forms a complex with the double-stranded nucleic acid, or forms a complex with a combination of neutral lipid and / or polymer and the double-stranded nucleic acid
- (12) A method for suppressing the expression of a RAS gene which comprises introducing the double-stranded nucleic acid into a cell using the composition according to any one of (1) to (11).
- (13) The method according to (12) above, wherein the cell is a cell in a mammalian tumor.
- the method according to any one of the above (12) to (14), wherein the method of introducing into cells is a method of introducing into cells by intravenous administration.
- a method for treating a RAS-related disease comprising administering the composition according to any one of (1) to (11) to a mammal.
- the method of administration is intravenous administration.
- a method for treating cancer comprising administering the composition according to any one of (1) to (11) to a mammal.
- the method according to (18) above, wherein the method of administration is intravenous administration.
- a medicament for use in the treatment of a RAS-related disease comprising the composition according to any one of (1) to (11).
- a cancer therapeutic agent comprising the composition according to any one of (1) to (11).
- composition of the present invention can be administered to a mammal to suppress KRAS gene expression and treat RAS-related diseases in vivo.
- the amount of KRAS mRNA in the tumor 48 hours after administration of siRNA ⁇ ⁇ 10 ⁇ ⁇ mg / kg equivalent of each of the preparations 1-A to C obtained in Example 1 to MIAPaCa-2 xenograft mice is shown.
- the vertical axis shows the relative value of KRAS mRNA amount when the physiological saline administration group is 1. Changes in the relative value of the tumor volume when miRNAaCa-2 xenograft mice were administered with the equivalent of siRNA 10 mg / kg of preparations 1-A to C obtained in Example 1 on day 0 and day 7 .
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
- Each white circle represents a physiological saline administration group
- each black circle represents a preparation administration group.
- the amount of anti-PEG antibody in the blood on the seventh day after administration of each of the preparations 1-A to C obtained in Example 1 in an equivalent amount of siRNA 10 mg / kg to BALB / c mice is shown.
- the vertical axis represents the amount of anti-PEG antibody.
- the amount of KRAS mRNA in tumor 48 hours after administration of siRNA 1, 3 or 10 mg / kg equivalent of formulation 2-A, D or E obtained in Example 2 to MIAPaCa-2 xenograft mice is shown.
- the vertical axis shows the relative value of KRAS mRNA amount when the physiological saline administration group is 1.
- the horizontal axis shows the dosage of each preparation.
- FIG. 7 shows the relative value of the tumor volume on the 7th day after administration of siRNAAP1, 3 or 10 mg / kg equivalent of formulation 2-A, D or E obtained in Example 2 to MIAPaCa-2 xenograft mice, respectively.
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- the horizontal axis shows the dosage of each preparation. Relative to tumor volume on day 7 after administration of MIAPaCa-2 xenografted mice with siRNA ⁇ ⁇ 2.5 mg / kg equivalent to each of preparation 1-A obtained in Example 1 and preparation 2-A obtained in Example 2 Indicates the value.
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- MIAPaCa-2 xenografted mice equivalent to siRNA 2.5 mg / kg of formulation 1-A obtained in Example 1, formulation 3-A obtained in Example 3, and formulation 4-A obtained in Example 4
- the relative value of the tumor volume 7 days after administration of the amount is shown.
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- MIAPaCa-2 xenografted mice, equivalent to siRNA 2.5 mg / kg of formulation 1-A obtained in Example 1, formulation 5-A obtained in Example 5, and formulation 6-A obtained in Example 6 The relative value of the tumor volume 7 days after administration of the amount is shown.
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- Relative tumor volume at 7 days after administration of MIAPaCa-2 xenografted mice with siRNA 5 mg / kg equivalent to each of preparation 1-A obtained in Example 1 and preparation 7-A obtained in Example 7 Indicates the value.
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- HCT116 (ATCC) shows changes in the relative value of the tumor volume when the preparation 1-A obtained in Example 1 was administered to the xenograft mouse at an equivalent amount of siRNA 10 mg / k on day 0 and day 7. .
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
- a white circle indicates a physiological saline administration group, and a black circle indicates a preparation administration group.
- the present invention provides a composition comprising a double-stranded nucleic acid having the ability to reduce or stop the expression of the KRAS gene as a drug, and lipid particles containing a cationic lipid.
- a method for treating a RAS-related disease by suppressing the KRAS gene expression in vivo by administering the composition to a mammal is also provided.
- the present invention treats or prevents hyperproliferative diseases or disorders (e.g., leukemia, melanoma, cell tumor, cancer, tumor, adenoma) or one or more angiogenic diseases associated with inappropriate RAS gene expression.
- a method for providing is also provided.
- the lipid particles in the composition of the present invention have the formula (I)
- R 1 and R 2 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms, L 1 and L 2 are the same or different and are —CO—O— or —O—CO—, a and b are the same or different and are 1 to 3, R 3 is a hydrogen atom, an alkyl having 1 to 6 carbon atoms or an alkenyl having 3 to 6 carbon atoms).
- the compound represented by the formula (I) may be referred to as the compound (I). The same applies to the compounds of other formula numbers.
- the lipid particles in the composition of the present invention include the compound (I) and the formula (II)
- R 4 and R 5 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms
- R 6 is a hydrogen atom, alkyl having 1 to 6 carbons, alkenyl having 3 to 6 carbons, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl or the same or different 1 to 3 amino, Monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted alkyl of 1 to 6 carbons or alkenyl of 3 to 6 carbons). It is a lipid particle containing a cationic lipid.
- examples of the linear or branched alkyl having 12 to 24 carbon atoms include dodecyl, tridecyl, tetradecyl, 2,6,10-trimethylundecyl, pentadecyl, 3, 7,11-trimethyldodecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, 6,10,14-trimethylpentadecan-2-yl, nonadecyl, 2,6,10,14-tetramethylpentadecyl, icosyl, 3,7,11,15 -Tetramethylhexadecyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl, etc.
- the linear or branched alkenyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 double bonds.
- the linear or branched alkynyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 triple bonds.
- R 1 and R 2 are preferably the same linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms.
- R 1 and R 2 are more preferably linear or branched alkyl or alkenyl having 12 to 24 carbon atoms, and further preferably linear alkenyl having 12 to 24 carbon atoms. .
- examples of the linear or branched alkyl having 12 to 24 carbon atoms include dodecyl, tridecyl, tetradecyl, 2,6,10-trimethylundecyl, pentadecyl, 3, 7,11-trimethyldodecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, 6,10,14-trimethylpentadecan-2-yl, nonadecyl, 2,6,10,14-tetramethylpentadecyl, icosyl, 3,7,11,15 -Tetramethylhexadecyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl and the like.
- the linear or branched alkenyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 double bonds.
- the linear or branched alkynyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 triple bonds.
- the alkynyl in the form of a ring may be used, and examples thereof include dodeca-11-ynyl, tetradec-6-ynyl, hexadec-7-ynyl, hexadec-5,7-diynyl, octadec-9-ynyl and the like.
- R 4 and R 5 are preferably the same linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms.
- R 4 and R 5 are more preferably linear or branched alkyl or alkenyl having 12 to 24 carbon atoms, and further preferably linear alkenyl having 12 to 24 carbon atoms. .
- examples of the alkyl having 1 to 6 carbon atoms include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, cyclopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, Cyclobutyl, cyclopropylmethyl, pentyl, isopentyl, sec-pentyl, neopentyl, tert-pentyl, cyclopentyl, hexyl, cyclohexyl and the like, preferably methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl Examples include butyl, pentyl, isopentyl, sec-pentyl, tert-pentyl, neopentyl, hexyl, and more preferably methyl, ethyl, propyl, isopropyl, cycl
- alkenyl having 3 to 6 carbon atoms examples include allyl, 1-propenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, and preferably allyl.
- alkyl moiety in the substituted alkyl having 1 to 6 carbons and the alkenyl moiety in the substituted alkenyl having 3 to 6 carbons are as defined above for the alkyl having 1 to 6 carbons and the alkenyl having 3 to 6 carbons, respectively. .
- a hydrogen ion may be coordinated to a lone pair on the nitrogen atom in the structure, and the nitrogen atom coordinated with the hydrogen ion is a pharmaceutically acceptable anion.
- the compound (I) and the compound (II) also include a compound in which a hydrogen ion is coordinated to a lone electron pair on the nitrogen atom.
- pharmaceutically acceptable anions include inorganic ions such as chloride ion, bromide ion, nitrate ion, sulfate ion and phosphate ion, acetate ion, oxalate ion, maleate ion, fumarate ion and citrate ion.
- organic acid ions such as benzoate ion and methanesulfonate ion.
- pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl and piperidin-4-yl are respectively those in which the hydrogen atom bonded on the nitrogen atom in the ring is converted to methyl or ethyl Is included.
- monoalkylamino and dialkylamino one each and the same or different two alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above) or amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl Alternatively, it may be any amino substituted with alkyl having 1 to 6 carbon atoms substituted with morpholinyl (as defined above), such as methylamino, ethylamino, propylamino, butylamino, pentylamino, hexylamino, dimethylamino, Diethylamino, ethylmethylamino, methylpropylamino, butylmethylamino, methylpentylamino, hexylmethylamino, aminoethylamino, aminopropylamino, (aminoethyl) methylamino, bis (aminoethy
- amino, monoalkylamino, and dialkylamino each form a hydrogen ion coordinated to a lone pair of electrons on the nitrogen atom to form an ammonio, monoalkylammonio, and dialkylammonio.
- Amino, monoalkylamino and dialkylamino include ammonio, monoalkylammonio and dialkylammonio, respectively.
- an ammonio, monoalkylammonio and dialkylammonio in which a hydrogen ion is coordinated to a lone pair of electrons on the nitrogen atoms of amino, monoalkylamino and dialkylamino are pharmaceutically acceptable anions (as defined above). ) And a salt.
- Alkoxy includes alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above), or alkyl having 1 to 6 carbon atoms substituted with amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl (as described above). Hydroxy) substituted with the same meaning), for example, methoxy, ethoxy, propyloxy, butyloxy, pentyloxy, hexyloxy, aminoethoxy, methylaminoethoxy and the like, preferably methoxy, ethoxy, aminoethoxy, methylamino And ethoxy.
- monoalkylcarbamoyl and dialkylcarbamoyl one each and the same or different two alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above), or amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl
- any carbamoyl substituted with morpholinyl-substituted alkyl having 1 to 6 carbon atoms for example, methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, propylcarbamoyl, butylcarbamoyl, pentylcarbamoyl, hexylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl, Diethylcarbamoyl, ethylmethylcarbamoyl, methylpropylcarbamoyl, butylmethylcarbamoyl, methylp
- R 1 and R 2 are the same or different and dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, octadecyl, icosyl, docosyl, tetracosyl, ( (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (E) -octadeca-9-enyl, ( Z) -octadeca-11-enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (9Z, 12Z, 15Z) -octadeca-9,12,15-trienyl, (Z) -icosa-11-enyl (11Z, 14Z) -icos
- R 1 and R 2 are the same or different and are tridecyl, pentadecyl, heptadecyl, nonadecyl, henicosyl, tricosyl, (Z) -trideca-8 -Enyl, (Z) -pentadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-5-enyl, (Z) -heptadeca-8-enyl, (E) -heptadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-10 -Enyl, (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl, (8Z, 11Z, 14Z) -heptadeca-8,11,14-trienyl, (Z) -nonadec-10-enyl, (10Z, 13Z) -Nonadeca-10,13-dienyl, (11Z, 14Z
- a and b are more preferably 1 at the same time. It is also a more preferred embodiment of the present invention that a and b are 1 at the same time, and L 1 and L 2 are —CO—O—.
- R 1 and R 2 are preferably the same or different and are (Z) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl, more preferably the same (Z Most preferred is) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl.
- R 3 is more preferably a hydrogen atom or methyl. It is also possible that a and b are 1, L 1 and L 2 are identically —CO—O— or —O—CO—, preferably —CO—O—, and R 3 is methyl,
- R 1 and R 2 may be the same or different and are (Z) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl. More preferably, it is most preferably (Z) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl.
- L 1 and L 2 are also preferably —CO—O— or —O—CO—, preferably —CO—O—. More preferably, R 1 and R 2 are the same or different and are (Z) -heptadeca-5-enyl or (Z) -heptadeca-8-enyl, and preferably (Z)- Most preferred is heptadeca-5-enyl or (Z) -heptadeca-8-enyl.
- R 4 and R 5 are the same or different and are tetradecyl, hexadecyl, (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl.
- R 6 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different one to three amino, monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, carbamoyl , Monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl, preferably alkyl having 1 to 6 carbon atoms or alkenyl having 3 to 6 carbon atoms, hydrogen atom, methyl or one amino, hydroxy or carbamoyl It is more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkenyl group having 3 to 6 carbon atoms, which is most preferably a hydrogen atom, methyl or the like.
- R 6 is a hydrogen atom, which is one of the more preferable embodiments of the present invention.
- R 4 and R 5 are the same or different and are tetradecyl, hexadecyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (Z) -octadec-6-enyl, (Z) -octadec-9-enyl, (9Z , 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (Z) -icosa-11-enyl or (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl, more preferably (Z) -hexadeca- Most preferred is 9-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl or (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl.
- R 6 is methyl.
- R 4 and R 5 are the same or different and are tetradecyl, hexadecyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (Z) -octadec-6-enyl, (Z) -octadec-9-enyl, (9Z , 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (Z) -icosa-11-enyl or (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl, more preferably (Z) -hexadeca- Most preferred are 9-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl.
- Compound (I) can be obtained by a method similar to the production method described in International Publication No. 2011/136368 pamphlet.
- a method for introducing and removing a protective group commonly used in organic synthetic chemistry for example, protective group
- the target compound by using the method described in, for example, Protective Groups ⁇ in Organic Synthesis, third edition, TWGreene, John Wiley & Sons Inc. (1999)] Can be manufactured. Further, the order of reaction steps such as introduction of substituents can be changed as necessary.
- Manufacturing method 1 Compound (II) can be produced by the following method.
- R 4 , R 5 and R 6 are as defined above, and Z is a chlorine atom, bromine atom, iodine atom, trifluoromethanesulfonyloxy, methanesulfonyloxy, benzenesulfonyloxy, p-toluenesulfonyl) (Represents a leaving group such as oxy)
- Step 1 and 2 Compound (IIIb) is obtained by reacting Compound (IIIa) and Compound (IVa) in the absence of a solvent or in a solvent, preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of a base, at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes. It can be produced by reacting for ⁇ 100 hours. Further, compound (II) is obtained by reacting compound (IIIb) and compound (IVb) in the absence of a solvent or in a solvent, preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of a base, at a temperature between room temperature and 200 ° C. It can be produced by reacting for 5 minutes to 100 hours.
- solvent examples include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide, N, N -Dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, pyridine, water and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
- Examples of the base include potassium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium methoxide, potassium tert-butoxide, triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7- Undecene (DBU).
- Compound (IIIa) is a commercially available product or a known method (for example, 5th edition Experimental Chemistry Course 14 ⁇ Synthesis of organic compounds II '', 5th edition, p.351, Maruzen (2005)) or a method analogous thereto.
- Compound (IVa) and Compound (IVb) are commercially available or known methods (e.g., 5th edition Experimental Chemistry Course 13 ⁇ Synthesis of organic compounds I '', 5th edition, p.374, Maruzen (2005)) Or it can obtain by the method according to it.
- Compound (IIa) in the case where R 4 and R 5 are the same can be obtained by using 2 equivalents or more of compound (IVa) in Step 1.
- R 6 is —CHR A R B (wherein R A and R B are the same or different and each represents a hydrogen atom, an alkyl having 1 to 5 carbon atoms, an alkenyl having 2 to 5 carbon atoms, or pyrrolidine.
- R a and R B are, are both hydrogen atoms Except for cases, alkyl of R A and R B, the alkyl moiety of the substituted alkyl, the total number of carbon atoms of the alkenyl moiety of alkenyl
- Compound (IIb) is compound (IIc) in which R 6 of compound (II) is a hydrogen atom, preferably 1 to 10 equivalents of compound (V), and preferably 1 to a large excess amount in a solvent. It can be produced by reacting at a temperature between ⁇ 20 ° C. and 150 ° C. for 5 minutes to 72 hours in the presence of a reducing agent and preferably 1 to 10 equivalents of an acid.
- Examples of the solvent include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide, N, N -Dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, water and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
- Examples of the reducing agent include sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride and the like.
- Examples of the acid include hydrochloric acid and acetic acid.
- Compound (V) is a commercially available product or a known method (for example, 5th edition Experimental Chemistry Lecture 15 ⁇ Synthesis of Organic Compounds III '', 5th edition, p.1, Maruzen (2005), 5th edition experimental chemistry. Lecture 15 “Synthesis of Organic Compounds III”, 5th Edition, p.153, Maruzen (2005)) or similar.
- R 6 is —CH 2 —C (OH) R C R D (wherein R C and R D are the same or different and are a hydrogen atom, alkyl having 1 to 4 carbon atoms, carbon number 2-4 alkenyl, pyrrolidin-2-yl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-2-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, morpholin-2-yl, morpholin-3-yl or the same or 1 to 4 carbon atoms substituted with 1 or 2 amino, monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl, or 2 to a 4 alkenyl, R C and R D are, unless both hydrogen atom, alkyl of R C and R D, substituted alkyl mo
- Compound (IId) can be produced by reacting compound (IIc) and compound (VI) in a solvent or without solvent at a temperature between 0 ° C. and 230 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
- the solvent include methanol, ethanol, 1-propanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide. , N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide and the like, and these may be used alone or in combination.
- Compound (VI) is obtained as a commercial product or obtained by a known method (for example, 5th edition Experimental Chemistry Course 17 “Synthesis of Organic Compounds V”, 5th edition, p.186, Maruzen (2005)) or in conformity thereto. be able to.
- Conversion of the functional group contained in R 4 , R 5 or R 6 in compound (II) can be carried out by a known method (for example, Comprehensive Organic Transformations 2nd edition, RC Laloc (Larock), Vch Verlagsgesellschaft Mbh (1999), etc.] or similar methods.
- the intermediates and target compounds in each of the above production methods are isolated and purified by separation and purification methods commonly used in synthetic organic chemistry, such as filtration, extraction, washing, drying, concentration, recrystallization, and various chromatography. be able to.
- the intermediate can be subjected to the next reaction without any particular purification.
- compounds (I) and (II) there may be stereoisomers such as geometric isomers and optical isomers, tautomers, etc., but compounds (I) and (II) Includes all possible isomers, including these, and mixtures thereof.
- Some or all of the atoms in compound (I) and compound (II) may be replaced with the corresponding isotope atoms, respectively, and compound (I) and compound (II) are replaced with these isotope atoms.
- the compound is also included.
- some or all of the hydrogen atoms in the compounds (I) and (II) may be hydrogen atoms having a weight of 2 (deuterium atoms).
- a compound in which part or all of each atom in compound (I) and compound (II) is replaced with the corresponding isotope atom is produced by a method similar to the above production method using a commercially available building block. can do.
- compounds in which some or all of the hydrogen atoms in the compounds (I) and (II) are replaced with deuterium atoms include, for example, alcohols, carboxyls using iridium complexes as catalysts and deuterium as a deuterium source. Synthesis using a method of deuterating acids, etc. [Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), Vol. 124, No. 10, 2092 (2002)] You can also.
- the double-stranded nucleic acid as a drug used in the present invention is a double-stranded nucleic acid having the ability to reduce or stop the expression of the KRAS gene when introduced into a mammalian cell, and has a sense strand and an antisense strand.
- the sense strand and the antisense strand have at least 25 base pairs
- the antisense strand comprises mRNA of any one of the KRAS genes of SEQ ID NOs: 1 to 3 (KRAS mRNA
- KRAS mRNA A double-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to a continuous sequence of at least 19 bases and a length of up to 35 nucleotides.
- the double-stranded nucleic acid may be any molecule as long as it is a double-stranded molecule obtained by polymerizing nucleotides and / or molecules having functions equivalent to the nucleotides, such as RNA that is a polymer of ribonucleotides, Examples include DNA, which is a polymer of deoxyribonucleotides, chimeric nucleic acids composed of RNA and DNA, and nucleotide polymers in which at least one nucleotide of these nucleic acids is substituted with a molecule having a function equivalent to that of the nucleotide.
- a derivative containing at least one molecule obtained by polymerizing a nucleotide and / or a molecule having a function equivalent to that of the nucleotide as a constituent unit is also included in the double-stranded nucleic acid of the present invention.
- PNA peptide nucleic acids
- OPNA oxypeptide nucleic acids
- PRNA peptide ribonucleic acids
- uridine U in RNA and thymine T in DNA can be replaced with each other.
- nucleotide derivatives examples include nucleotide derivatives.
- the nucleotide derivative may be any molecule as long as it is a modified nucleotide. For example, it improves nuclease resistance or stabilizes from other degradation factors compared to naturally-occurring RNA or DNA.
- a molecule in which ribonucleotides or deoxyribonucleotides are modified is preferably used.
- nucleotide derivatives include sugar-modified nucleotides, phosphodiester bond-modified nucleotides, base-modified nucleotides, and the like.
- the sugar-modified nucleotide any or all of the chemical structure of the sugar of the nucleotide may be modified or substituted with any substituent, or substituted with any atom.
- '-Modified nucleotides are preferably used.
- Examples of the modifying group in the sugar moiety-modified nucleotide include 2′-cyano, 2′-alkyl, 2′-substituted alkyl, 2′-alkenyl, 2′-substituted alkenyl, 2′-halogen and 2′-O-cyano.
- a crosslinked structure-type artificial nucleic acid having a structure in which the modifying group at the 2 ′ position is crosslinked to the carbon atom at the 4 ′ position, more specifically, the oxygen atom at the 2 ′ position and the 4 ′ position Locked Nucleic Acid (LNA) in which the carbon atom at the position is cross-linked via methylene, and Ethylene bridged nucleic acid (ENA) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004) ] And the like are also included in the nucleotide substituted with a modifying group at the 2 ′ position in the present invention.
- BNA crosslinked structure-type artificial nucleic acid
- 2′-cyano, 2′-fluoro, 2′-chloro, 2'-bromo, 2'-trifluoromethyl, 2'-O-methyl, 2'-O-ethyl, 2'-O-isopropyl, 2'-O-trifluoromethyl, 2'-O- [2- (Methoxy) ethyl], 2'-O- (3-aminopropyl), 2'-O- [2- (N, N-dimethyl) aminooxy] ethyl, 2'-O- [3- (N, N -Dimethylamino) propyl], 2'-O- ⁇ 2- [2- (N, N-dimethylamino) ethoxy] ethyl ⁇ , 2'-O- [2- (methylamino) -2-oxoethyl], 2 '-Se-methyl and the like are more preferable, 2'-O-methyl, 2'-O-ethyl, 2'-fluoro
- the modifying group of the sugar moiety-modified nucleotide can also define a preferred range based on its size, and the size corresponding to the size of -O-butyl is preferred from the size of fluoro, and the size of -O-methyl To a size corresponding to the size of -O-ethyl is more preferable.
- Alkyl in the modifying group of the sugar moiety-modified nucleotide has the same meaning as alkyl having 1 to 6 carbon atoms in compound (II).
- Alkenyl in the modifying group of the sugar moiety-modified nucleotide has the same meaning as alkenyl having 3 to 6 carbon atoms in compound (II).
- Examples of the halogen in the modifying group of the sugar-modified nucleotide include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.
- amino acids in amino acid residues include aliphatic amino acids (specifically, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, etc.), hydroxy amino acids (specifically, serine, threonine, etc.), acidic amino acids (specifically, Is aspartic acid, glutamic acid, etc.), acidic amino acid amide (specifically, asparagine, glutamine, etc.), basic amino acid (specifically, lysine, hydroxylysine, arginine, ornithine, etc.), sulfur-containing amino acid (specifically, Cysteine, cystine, methionine, etc.), imino acids (specifically, proline, 4-hydroxyproline, etc.) and the like.
- aliphatic amino acids specifically, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, etc.
- hydroxy amino acids specifically, serine, threonine, etc.
- acidic amino acids specifically, Is aspartic
- substituent in the modified group of the sugar-modified nucleotide and the substituted alkenyl include, for example, halogen (as defined above), hydroxy, sulfanyl, amino, oxo, -O-alkyl (the alkyl part of the -O-alkyl is -S-alkyl (the alkyl part of the -S-alkyl is the same as the alkyl), -NH-alkyl (the alkyl part of the -NH-alkyl is the same as the alkyl), dialkylaminooxy ( The two alkyl moieties of the dialkylaminooxy are the same or different and have the same meaning as the alkyl), dialkylamino (the two alkyl parts of the dialkylamino are the same or different and have the same meaning as the alkyl), dialkylaminoalkyleneoxy (the dialkylaminooxy The two alkyl moieties of alkyleneoxy are the same or different and have
- the phosphodiester bond-modified nucleotide is any nucleotide that has been modified or substituted with an arbitrary substituent for a part or all of the chemical structure of the phosphodiester bond of the nucleotide, or with any atom.
- a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorothioate bond a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorodithioate bond
- a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with an alkylphosphonate bond a phosphate
- Examples thereof include nucleotides in which a diester bond is substituted with a phosphoramidate bond.
- any or all of the nucleotide base chemical structure modified or substituted with an arbitrary substituent or substituted with an arbitrary atom may be used.
- oxygen atoms are substituted with sulfur atoms
- hydrogen atoms are substituted with alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms
- methyl groups are substituted with hydrogen atoms or alkyl groups with 2 to 6 carbon atoms
- Examples thereof include those in which an amino group is protected with a protecting group such as an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms.
- nucleotide derivative a nucleotide, sugar moiety, phosphodiester bond or nucleotide derivative modified with at least one of a base, a lipid, phospholipid, phenazine, folate, phenanthridine, anthraquinone, acridine, fluorescein, rhodamine, coumarin, Examples include dyes and other chemical substances added.
- 5'-polyamine-added nucleotide derivatives examples include a fluorescent dye-added nucleotide derivative, a Cy3 fluorescent dye-added nucleotide derivative, a 6-fluorescein (FAM) -added nucleotide derivative, and a biotin-added nucleotide derivative.
- FAM 6-fluorescein
- Nucleotide derivatives also form cross-linked structures such as alkylene structures, peptide structures, nucleotide structures, ether structures, ester structures, and combinations of at least one of these with other nucleotides or nucleotide derivatives in double-stranded nucleic acids. May be.
- the double stranded nucleic acid has a sufficient length to be processed by Dicer to produce siRNA.
- the double-stranded nucleic acid anneals to the sense strand under biological conditions, such as a sense strand, preferably between 26 and 30 nucleotides in length, and conditions found in the cytoplasm of the cell. Contains the antisense strand.
- a double-stranded nucleic acid may have several characteristics that enhance its processing by Dicer.
- the double stranded nucleic acid has a length sufficient to be processed by Dicer to produce siRNA and at least one, preferably all of the following properties: (i) the double stranded nucleic acid is asymmetric Yes, for example, with a 3 ′ overhang on the antisense strand. (ii) A nucleotide derivative (as defined above) is included at the 3 ′ end of the sense strand for Dicer binding and processing.
- Suitable nucleotide derivatives include nucleotides such as deoxyribonucleotides, acyclonucleotides, and the like, and sterically crowded molecules such as fluorescent molecules and the like, preferably deoxyribonucleotides.
- nucleotide derivatives are used, they are replaced with ribonucleotides in the double stranded nucleic acid so that the length of the double stranded nucleic acid does not change.
- the sense strand contains a phosphate at the 5 ′ end. 5'-terminal containing phosphate is modified with a phosphate group or a group that can be converted to a phosphate group by a nucleolytic enzyme in vivo, etc. Has been.
- double stranded nucleic acids preferably have one or more 2′-O-methyl modified nucleotides in the antisense strand, or the sense strand, or both strands.
- the sense strand comprises 25-28 nucleotides, and the 2 nucleotides at the 3 ′ end of the sense strand are deoxyribonucleotides.
- the sense strand contains a phosphate at the 5 ′ end.
- the antisense strand contains 26-30 nucleotides and contains a 1-4 ′ 3 ′ overhang.
- the antisense and sense strands have one or more 2′-O-methyl modified nucleotides.
- the antisense strand comprises a phosphate at the 3 ′ end of the sense strand
- the antisense strand comprises a phosphate at the 3 ′ end of the sense strand
- the double-stranded nucleic acid used in the present invention includes derivatives in which an oxygen atom or the like contained in a phosphoric acid part, an ester part, or the like in the structure of the nucleic acid is substituted with another atom such as a sulfur atom.
- the sugar that binds to the 5 ′ terminal base of the antisense strand and the sense strand has a 5′-position hydroxyl group, a phosphate group or the aforementioned modifying group, or a phosphate group or a nucleolytic enzyme in vivo. It may be modified by a group that is converted to the above-mentioned modifying group.
- the sugar that binds to the 3 ′ terminal base of the antisense strand and the sense strand has a phosphate group or the above-mentioned modifying group, or a phosphate group or a nucleolytic enzyme in vivo in each 3 ′ position. It may be modified by a group that is converted to the above-mentioned modifying group.
- the double-stranded nucleic acid used in the present invention may be produced using a known RNA or DNA synthesis method and RNA or DNA modification method. Double stranded nucleic acids can be designed to interact with target sequences within the KRAS gene sequence. The sequence of one strand of a double stranded nucleic acid is complementary to the target site sequence described above. Double stranded nucleic acids can be chemically synthesized using the methods described herein. RNA may be produced enzymatically or by partial / total organic synthesis, and modified ribonucleotides can be introduced in vitro by enzymatic or organic synthesis. In one embodiment, each chain is prepared chemically.
- RNA molecules are known in the art [see Nucleic Acids Res., 1998, Vol. 32, p. 936-948].
- double stranded nucleic acids can be synthesized by using solid phase oligonucleotide synthesis methods (e.g., Usman et al., U.S. Patent Nos. 5,804,683; 5,831,071; 5,998,203; 6,117,657; 6,353,098; 6,362,323; 6,437,117; 6,469,158; Scaringe et al., U.S. Patent 6,111,086; 6,008,400; 6,111,086).
- Single-stranded nucleic acids are synthesized using the solid phase phosphoramidite method (Nucleic Acids. Res., 1993, Vol. 30, p.2435-2443) and deprotected. And desalted on a NAP-5 column (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Oligomers are Amersham Source 15Q column-1.0 cm using a 15 minute linear gradient. Purify using ion exchange high performance liquid chromatography (IE-HPLC) at a height of .25 cm (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
- IE-HPLC ion exchange high performance liquid chromatography
- each single-stranded nucleic acid is determined by capillary electrophoresis (CE) on a Beckman PACE 5000 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Calif).
- CE capillaries have an inner diameter of 100 ⁇ m and contain ssDNA 100R Gel (Beckman-Coulter).
- ssDNA 100R Gel (Beckman-Coulter).
- about 0.6 nmole of oligonucleotide is injected into the capillary and run in an electric field of 444 V / cm and detected by UV absorbance at 260 nm.
- Denatured tris-borate-7M-urea running buffer is purchased from Beckman-Coulter.
- Single-stranded nucleic acids are obtained that are at least 90% pure as assessed by CE for use in the experiments described below.
- Compound identity is determined by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry on a Voyager DE.TM.Biospectometry workstation (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) According to the manufacturer's recommended protocol Verified by law.
- the relative molecular mass of single stranded nucleic acids can be obtained within 0.2% of the expected molecular mass.
- Single-stranded nucleic acids are resuspended at a concentration of 100 ⁇ M in a buffer consisting of 100 mM potassium acetate, 30 mM HEPES, pH 7.5.
- Complementary sense and antisense strands are mixed in equivalent molar amounts to obtain a final solution of 50 ⁇ M double stranded nucleic acid.
- the sample is heated to 95 ° C. for 5 minutes and allowed to cool to room temperature before use.
- Double-stranded nucleic acids are stored at -20 ° C.
- Single stranded nucleic acids are lyophilized or stored at ⁇ 80 ° C. in nuclease-free water. Specific examples of the double-stranded nucleic acid used in the present invention are shown in Table 3.
- sugars that bind to the bases with r, m, and d in the table are ribose, ribose in which the 2′-position hydroxyl group is substituted with —O-methyl, and deoxyribose, respectively.
- the lipid particle in the present invention is a lipid particle containing Compound (I) or Compound (I) and Compound (II) and a double-stranded nucleic acid.
- Compound (I) or Compound (I) and Compound (II) And double-stranded nucleic acid, or compound (I) or a combination of compound (I) and compound (II) with neutral lipid and / or polymer and double-stranded nucleic acid
- lipid particles composed of a lipid membrane that encloses the complex and the complex.
- the lipid membrane may be a lipid monolayer (lipid monomolecular membrane) or a lipid bilayer membrane (lipid bimolecular membrane).
- the lipid membrane may contain compound (I), compound (II), neutral lipid and / or polymer. Further, the complex and / or the lipid membrane may contain a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II).
- the lipid particles in the present invention include, for example, a complex of compound (II) and a double-stranded nucleic acid, or a combination of compound (II) with a neutral lipid and / or polymer and a double-stranded nucleic acid. Examples also include a lipid particle comprising a complex and a lipid membrane encapsulating the complex, and containing the compound (I) in the lipid membrane.
- the lipid membrane in this case may also be a lipid monolayer (lipid monomolecular membrane) or a lipid bilayer membrane (lipid bimolecular membrane).
- the lipid membrane may contain compound (II), neutral lipid and / or polymer. Further, the complex and / or the lipid membrane may contain a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II).
- a complex of a double-stranded nucleic acid and a membrane composed of a lipid monolayer reverse micelle
- a complex of a double-stranded nucleic acid and a liposome a double-stranded nucleic acid and a micelle
- a complex of a double-stranded nucleic acid and a membrane composed of a lipid monolayer or a complex of a double-stranded nucleic acid and a liposome.
- the lipid particles composed of the complex and a lipid bilayer encapsulating the complex include liposomes composed of the complex and a lipid bilayer encapsulating the complex.
- the lipid particles may be one or more of compound (I) and compound (II), and compound (I) and / or compound (II) may be compound (I). ) And a cationic lipid other than compound (II) may be mixed.
- a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II) include, for example, DOTMA, DOTAP, etc. disclosed in JP-A-61-161246 (US Pat.
- DOTMA DOTAP
- DORIE DOSPA
- DLinDMA DLin-K- Tertiary amine moiety with two unsubstituted alkyl groups such as DMA or quaternary ammonia with three unsubstituted alkyl groups
- cationic lipids having a tertiary amine moiety are more preferred.
- the unsubstituted alkyl group of the tertiary amine moiety and the quaternary ammonium moiety is more preferably a methyl group.
- the lipid particles in the present invention can be produced according to a known production method or similar methods, and may be produced by any production method.
- a known liposome preparation method can be applied to the production of a liposome, which is one of lipid particles.
- Known liposome preparation methods include, for example, Bangham et al.'S liposome preparation method [“J. Mol. Biol.”, 1965, Vol. 13, p.238- 252], ethanol injection method [“Journal of Cell Biology”, 1975, Vol. 66, pp. 621-634], French press method [“FBS Letters (FEBS Lett.) ”, 1979, Vol. 99, p. 210-214], freeze-thaw method [“ Arch. Biochem. Biophys.
- liposomes for example, an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), for example, an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride can be added. is there.
- an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride
- Liposomes can also be produced by dissolving lipids or the like in an organic solvent such as ethanol and distilling off the solvent, and then adding physiological saline or the like and stirring to form liposomes.
- the lipid particles in the present invention include, for example, compound (I), compound (I) and compound (II), cationic lipid other than compound (I) and compound (I) and compound (II) or compound (I) And cationic lipid other than compound (II) and compound (I) and compound (II) are dissolved in chloroform in advance, and then an aqueous solution of double-stranded nucleic acid and methanol are added and mixed to form a cationic lipid / double-stranded nucleic acid.
- the chloroform layer is taken out and polyethylene glycolated phospholipid, neutral lipid and water are added to form a water-in-oil (W / O) emulsion, which is then processed by the reverse phase evaporation method.
- a double-stranded nucleic acid is dissolved in an acidic aqueous electrolyte solution, lipid (in ethanol) is added, and the ethanol concentration is lowered to 20 v / v% to Preparing double-stranded nucleic acid-encapsulating liposomes, sizing filtration, After removing excess ethanol by dialysis, the sample is dialyzed by raising the pH further to remove the double-stranded nucleic acid adhering to the liposome surface (Japanese translations of PCT publication No. 2002-501511 and Biokimika et. Biophymica Acta (2001, Vol. 1510, p. 152-166) and the like.
- lipid particles in the present invention a liposome composed of a complex and a lipid bilayer encapsulating the complex is described in, for example, WO 02/28367 pamphlet and WO 2006/080118 pamphlet. It can manufacture according to the manufacturing method of.
- lipid particles in the present invention for example, compound (I) or compound (I) and complex of compound (II) and double-stranded nucleic acid, or compound (I) or compound (I) and compound (II) A complex of a combination of a neutral lipid and / or a polymer with a double-stranded nucleic acid, and a lipid membrane encapsulating the complex, wherein the lipid membrane contains compound (I), compound (II), and / or Alternatively, lipid particles containing a cationic lipid other than compound (I) and compound (II), a complex of compound (II) and double-stranded nucleic acid, or compound (II) with neutral lipid and / or polymer A complex of a combination and a double-stranded nucleic acid and a lipid membrane that encapsulates the complex, lipid particles containing compound (I) or compound (I) and compound (II) in the lipid membrane, etc.
- each complex is produced and dispersed in water or a 0-20% aqueous ethanol solution without dissolving it (solution A).
- each lipid membrane component Can be obtained by dissolving in an aqueous ethanol solution (liquid B), mixing liquid A and liquid B, and adding water appropriately.
- the compound (I), the compound (II), and the cationic lipids other than the compound (I) and the compound (II) in the liquid A and the liquid B may be used alone or in combination.
- compound (I) or compound (I) and a complex of compound (II) and a double-stranded nucleic acid, or compound (I) or compound (I) and compound (II) with neutral lipid is composed of a complex of a combination of a polymer and a double-stranded nucleic acid, and a lipid membrane encapsulating the complex, and the lipid membrane contains compound (I), compound (II), and / or compound (I) And lipid particles containing a cationic lipid other than compound (II), a complex of compound (II) and nucleic acid, or a combination of compound (II) with neutral lipid and / or polymer and nucleic acid Body and a lipid membrane encapsulating the complex, and two lipids in the complex during and after production of lipid particles containing compound (I) or compound (I) and compound (II) in the lipid membrane Electrostatic interaction between the chain nucleic acid and the cationic lipid in the lipid membrane
- a lipid particle comprising a compound (I), a compound (II), and / or a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II) in a lipid membrane, a complex of the compound (II) and a nucleic acid, Alternatively, it is composed of a complex of a combination of a neutral lipid and / or polymer with compound (II) and a nucleic acid, and a lipid membrane encapsulating the complex, and the lipid membrane contains compound (I) or compound (I) and Included in lipid particles containing compound (II).
- compound (I) or a complex of compound (I) and compound (II) and a double-stranded nucleic acid, or compound (I) or compound (I) and compound (II) are neutral. It is composed of a complex of a combination of lipid and / or polymer and a double-stranded nucleic acid, and a lipid membrane encapsulating the complex, and the lipid membrane contains compound (I), compound (II) or compound (I) and Lipid particles containing cationic lipids other than compound (II) are more preferred, compound (I) or compound (I) and a complex of compound (II) and double-stranded nucleic acid, or compound (I) or compound ( A complex of a combination of a neutral lipid and / or a polymer with (I) and compound (II) and a double-stranded nucleic acid, and a lipid membrane encapsulating the complex, wherein the compound (I) or More preferred are
- the total number of molecules of compound (I) and compound (II) in the complex is preferably 0.5 to 4 times, more preferably 1.5 to 3.5 times the number of phosphorus atoms of the double-stranded nucleic acid. Is more preferably 2 to 3 times.
- the total number of molecules of the compound (I) and the compound (II) and cationic lipids other than the compound (I) and the compound (II) in the complex is based on the number of phosphorus atoms of the double-stranded nucleic acid. It is preferably 0.5 to 4 times, more preferably 1.5 to 3.5 times, and even more preferably 2 to 3 times.
- the total number of molecules of the compound (I) and the compound (II) in the lipid particle is the double chain.
- the number is preferably 1 to 10 times, more preferably 2.5 to 9 times, and even more preferably 3.5 to 8 times the number of phosphorus atoms in the nucleic acid.
- the total number of molecules of the compound (I) and the compound (II) and cationic lipids other than the compound (I) and the compound (II) in the lipid particles is based on the number of phosphorus atoms of the double-stranded nucleic acid. It is preferably 1 to 10 times, more preferably 2.5 to 9 times, and even more preferably 3.5 to 8 times.
- Neutral lipids may be any of simple lipids, complex lipids or derived lipids, such as, but not limited to, phospholipids, glyceroglycolipids, sphingoglycolipids, sphingoids or sterols.
- the lipid particles of the present invention contain neutral lipids, the total number of neutral lipid molecules is compound (I) and compound (II), and cationic lipids other than compound (I) and compound (II). Is preferably 0.1 to 1.8 times, more preferably 0.3 to 1.1 times, and still more preferably 0.4 to 0.9 times.
- the lipid particles in the present invention may contain a neutral lipid in a complex, may be contained in a lipid membrane encapsulating the complex, or at least contained in a lipid membrane encapsulating the complex. More preferably, it is contained in both the complex and the lipid membrane encapsulating the complex.
- phospholipids in neutral lipids include phosphatidylcholine (specifically soybean phosphatidylcholine, egg yolk phosphatidylcholine (EPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), dimyristoylphosphatidylcholine).
- EPC egg yolk phosphatidylcholine
- DSPC distearoylphosphatidylcholine
- DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
- POPC palmitoyloleoylphosphatidylcholine
- dimyristoylphosphatidylcholine dimyristoylphosphatidylcholine
- DMPC dioleoylphosphatidylcholine
- DOPC dioleoylphosphatidylcholine
- phosphatidylethanolamine specifically distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE), dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE), dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE)), Dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE), 16-0-monomethyl PE, 16-0-dimethyl PE, 18-1-trans PE, palmitoyl oleoyl-phosphatidylethanolamine ( POPE), 1 -stearoyl-2-oleoyl-phosphatidylethanolamine (SOPE), etc.), glycerophospholipids (specifically phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, palmitoyloleoylphosphatidylglycerol (PO
- Examples of the glyceroglycolipid in the neutral lipid include sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride and the like.
- glycosphingolipid in the neutral lipid examples include galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside, and the like.
- Examples of the sphingoid in the neutral lipid include sphingan, icosasphingan, sphingosine or derivatives thereof.
- Derivatives include, for example, —NH 2 such as sphingan, icosasphingan, or sphingosine —NHCO (CH 2 ) xCH 3 (wherein x is an integer from 0 to 18, with 6, 12 or 18 being preferred) And the like converted to.
- sterols in neutral lipids include cholesterol, dihydrocholesterol, lanosterol, ⁇ -sitosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, ergocasterol, fucosterol or 3 ⁇ - [N- (N ', N'-dimethyl Aminoethyl) carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) and the like.
- Neutral lipids preferably include phospholipids, sterols, and the like, more preferably phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, and cholesterol, and still more preferably phosphatidylethanolamine, cholesterol, and combinations thereof.
- macromolecules include protein, albumin, dextran, polyfect, chitosan, dextran sulfate, poly-L-lysine, polyethyleneimine, polyaspartic acid, styrene maleic acid copolymer, isopropylacrylamide-acryl pyrrolidone copolymer.
- polymers such as polyethylene glycol-modified dendrimers, polylactic acid, polylactic acid polyglycolic acid or polyethylene glycolated polylactic acid, or salts thereof.
- the salts in the polymer include, for example, metal salts, ammonium salts, acid addition salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts and the like.
- the metal salt include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt and zinc salt.
- the ammonium salt include salts such as ammonium and tetramethylammonium.
- the acid addition salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate or phosphate, and organic acid salts such as acetate, maleate, fumarate or citrate.
- organic amine addition salts include addition salts such as morpholine and piperidine.
- amino acid addition salts include addition salts such as glycine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid or lysine.
- the lipid particles in the present invention preferably further contain a water-soluble polymer lipid derivative or fatty acid derivative.
- the lipid derivative or fatty acid derivative of the water-soluble polymer may be contained in a complex, may be contained in a lipid membrane that encapsulates the complex, or a lipid membrane that encapsulates the complex and the complex. It is more preferable that both are contained.
- the total number of molecules of the lipid derivative and fatty acid derivative of the water-soluble polymer is the compound (I) and the compound (II), and It is preferably 0.05 to 0.3 times, more preferably 0.07 to 0.25 times, more preferably 0.1 to 0.2 times the total number of cationic lipid molecules other than Compound (I) and Compound (II). Further preferred.
- a water-soluble polymer lipid derivative or fatty acid derivative has a property that a part of the molecule binds to other constituents of the lipid particle by, for example, hydrophobic affinity, electrostatic interaction, etc., and the other part is a lipid particle.
- a substance having a two-sided property which has a property of binding with a solvent at the time of manufacture, for example, by hydrophilic affinity, electrostatic interaction or the like, is preferable.
- lipid derivatives or fatty acid derivatives of water-soluble polymers include polyethylene glycol, polyglycerin, polyethyleneimine, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, polyacrylamide, oligosaccharide, dextrin, water-soluble cellulose, dextran, chondroitin sulfate, chitosan, polyvinyl Pyrrolidone, polyaspartic acid amide, poly-L-lysine, mannan, pullulan, oligoglycerol and the like or their derivatives and neutral lipids, compound (I) or compound (II) listed in the definition of the lipid particles, Or, for example, those formed by binding with fatty acids such as stearic acid, palmitic acid, myristic acid or lauric acid, salts thereof, and the like, more preferably lipid derivatives such as polyethylene glycol derivatives, polyglycerin derivatives or the like Examples thereof include fatty acid derivatives and salts thereof, and more preferred are lipid derivatives
- lipid derivatives or fatty acid derivatives of polyethylene glycol derivatives include polyethylene glycolated lipids (specifically, polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine (more specifically, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine).
- PEG-DSPE 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000]
- PEG-DMPE Etc. 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000]
- PEG-DMPE Etc. polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, Cremophor EL, etc.
- polyethylene glycol sorbitan fatty acid esters specifically polyoxyethylene sorbitan monooleate, etc.
- polyethylene glycol fatty acid esters etc.
- PEG-DSPE and PEG-DMPE are preferred.
- lipid derivatives or fatty acid derivatives of polyglycerin derivatives include polyglycerinized lipids (specifically polyglycerin-phosphatidylethanolamine) and polyglycerin fatty acid esters, and more preferably polyglycerinized lipids. can give.
- the lipid particles in the present invention can be optionally subjected to surface modification with, for example, a water-soluble polymer, a polyoxyethylene derivative, etc. [Radics, edited by F. Martin, “Stealth Liposomes "(USA), CRC Press Inc., 1995, p. 93-102].
- a water-soluble polymer e.g., a polyoxyethylene derivative
- examples of the polymer that can be used for the surface modification include dextran, pullulan, mannan, amylopectin, and hydroxyethyl starch.
- the polyoxyethylene derivative include polysorbate 80, Pluronic F68, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyoxyethylene lauryl alcohol, and PEG-DSPE.
- a lipid derivative or a fatty acid derivative of a water-soluble polymer can be contained in the complex and lipid membrane in the lipid particle.
- the average particle size of the lipid particles in the present invention can be freely selected as desired, but is preferably the following average particle size.
- a method for adjusting the average particle size for example, an extrusion method, a method of mechanically crushing large multilamellar liposomes (MLV) or the like (specifically using a manton gourin, a microfluidizer, etc.) [Müller (RH Muller, S. Benita, B. Bohm, “Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs) ”, Scientific Publishers Stuttgart, 1998, p.267-294].
- the average size of the lipid particles in the present invention is preferably about 10 nm to 1000 nm, more preferably about 30 nm to 300 nm, and further preferably about 50 nm to 200 nm.
- the double-stranded nucleic acid in the composition of the present invention can be introduced into cells by administering the composition of the present invention to mammalian cells.
- the method of introducing the composition of the present invention into a mammalian cell in vivo may be performed according to known transfection procedures that can be performed in vivo.
- the composition of the present invention when the composition of the present invention is intravenously administered to mammals including humans, it is delivered to, for example, an organ or site in which cancer or inflammation has occurred, and the composition of the present invention is contained in the cells of the delivery organ or site.
- the double-stranded nucleic acid can be introduced.
- the organ or site where cancer or inflammation has occurred is not particularly limited, and examples thereof include the stomach, large intestine, liver, lung, spleen, pancreas, kidney, bladder, skin, blood vessel, eyeball, etc., preferably the large intestine or pancreas. can give.
- the composition of the present invention is intravenously administered to mammals including humans, so that it is delivered to, for example, blood vessels, liver, lungs, spleen and / or kidney, and the composition of the present invention is delivered into cells of a delivery organ or site.
- a double-stranded nucleic acid in a product can be introduced.
- the blood vessel, liver, lung, spleen and / or kidney cells may be normal cells.
- KRAS-related diseases such as leukemia, melanoma, cell tumor, cancer Tumors, adenomas, etc. can be treated.
- the expression of the RAS gene can be reduced to treat RAS-related diseases such as leukemia, melanoma, cell tumor, cancer, tumor, adenoma and the like.
- the administration subject is preferably a human.
- the composition of the present invention can also be used as a tool for verifying the effectiveness of suppressing the KRAS gene in an in vivo drug efficacy evaluation model relating to a therapeutic or preventive agent for cancer.
- composition of the present invention When used as a therapeutic or prophylactic agent for cancer, it is desirable to use the most effective route for treatment, preferably intravenous administration or intramuscular administration. More preferred is intravenous administration.
- the dose varies depending on the disease state, age, route of administration, etc. of the administration subject, but for example, it may be administered such that the daily dose converted to double-stranded nucleic acid is about 0.1 ⁇ g to 1000 mg.
- preparations suitable for intravenous administration or intramuscular administration include injections, and lipid particle dispersions prepared by the above-described method can be used as they are, for example, in the form of injections.
- the dispersion can be used after removing the solvent, for example, by filtration, centrifugation, etc., or the dispersion can be used after lyophilization, and / or an excipient such as mannitol, lactose, trehalose, maltose or glycine.
- the added dispersion can be lyophilized for use.
- injection is performed by mixing, for example, water, acid, alkali, various buffers, physiological saline or amino acid infusion, etc.
- an injection can be prepared by adding an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA or an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride.
- an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA or an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride.
- it can also be cryopreserved by adding a cryopreservation agent such as glycerin.
- Methyldi ((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl) amine (Compound II-1) Methylamine (Aldrich, approximately 2 mol / L tetrahydrofuran solution, 10.5 mL, 21.0 mmol) was added to (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc), 1.03 g, 3.00 mmol) was added, and the mixture was heated and stirred at 150 ° C. for 90 minutes using a microwave reactor.
- reaction solution is diluted with ethyl acetate, washed with 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution and then with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give methyl ((9Z, 12Z) -octadeca A crude product of -9,12-dienyl) amine was obtained.
- the crude product obtained was (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc., 0.93 g, 2.70 mmol) and 50% aqueous sodium hydroxide (0.960 g, 12.0 mmol) was added, and the mixture was heated and stirred at 135 ° C. for 60 minutes in an oil bath. After cooling to room temperature, the reaction mixture was diluted with ethyl acetate, washed with water and then with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
- Reference example 2 Methyldi ((Z) -hexadec-9-enyl) amine (Compound II-2)
- methylamine manufactured by Aldrich, approximately 2 mol / L tetrahydrofuran solution, 10.0 mL, 20.0 mmol
- (Z) -hexadec-9-enyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc.
- Compound II-2 (0.491 g, 51.6%) was obtained using 1.21 g, 3.80 mmol).
- Reference example 3 Methyldi ((11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl) amine (Compound II-3)
- methylamine manufactured by Aldrich, about 2 mol / L tetrahydrofuran solution, 16.0 mL, 32.0 mmol
- (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl methanesulfonate (Nu- Chek Prep, Inc., 2.98 g, 8.00 mmol) was used to obtain compound II-3 (1.27 g, 54.4%).
- Reference example 4 Di ((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl) amine (Compound II-4)
- ammonia manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., approximately 2 mol / L methanol solution, 18.0 mL, 36.0 mmol
- (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl methanesulfonate (Nu -Chek Prep, Inc., 2.79 g, 8.10 mmol) was used to obtain compound II-4 (0.838 g, 36.2%).
- Reference Example 5 Di ((Z) -octadeca-9-enyl) amine (Compound II-5)
- ammonia manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., about 2 mol / L methanol solution, 12.0 mL, 24.0 mmol
- Z) -octadeca-9-enyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc., 1.87 g, 5.40 mmol) was used to obtain compound II-5 (0.562 g, 36.2%).
- Reference Example 8 trans-1- (tert-butoxycarbonyl) -3,4-bis (((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienoyloxy) methyl) pyrrolidine (Compound VII-2) Tert-butyl trans-3,4-bis (hydroxymethyl) pyrrolidine-1-carboxylate (150 mg, 0.674 mmol) synthesized in the same manner as in Reference Example 7 with reference to WO 2006/100036 pamphlet Using linoleic acid (Aldrich, 400 mg, 1.48 mmol), Compound VII-2 (351 mg, 71.7%) was obtained.
- Reference Example 11 trans-1-methyl-3,4-bis (((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienoyloxy) methyl) pyrrolidine (Compound I-3)
- Compound I-2 80 mg, 0.12 mmol obtained in Reference Example 10 was dissolved in 1,2-dichloroethane (1.5 mL) and methanol (1.5 mL), and formaldehyde (0.091 mL, 1.22 mmol), sodium triacetoxy was dissolved.
- Borohydride manufactured by Acros Organics, 129 mg, 0.610 mmol
- siRNA solution The double-stranded nucleic acid was dissolved in distilled water and prepared to 24 mg / mL (hereinafter referred to as siRNA solution).
- This suspension was passed through a 0.2 ⁇ m polycarbonate membrane filter and a 0.05 ⁇ m polycarbonate membrane filter at room temperature to obtain a dispersion of lead particles.
- a dispersion of lipid / double-stranded nucleic acid complex particles was prepared.
- the resulting dispersion of cationic lipid / double-stranded nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and several times the amount of distilled water is mixed. Were mixed to obtain a crude preparation.
- the obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), further replacing the solvent with physiological saline, and filtered in a clean bench using a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.).
- siRNA concentration of the obtained preparation was measured, and diluted with physiological saline so that the siRNA concentration was 1.0 mg / mL, whereby preparations 1-A to C (compound II-1 and compound I-3 As a lipid and siRNA A, B or C as a double-stranded nucleic acid).
- preparations 1-A to C compound II-1 and compound I-3 As a lipid and siRNA A, B or C as a double-stranded nucleic acid.
- the average particle size of lipid particles in the preparation was measured with a particle size measuring device. The results are shown in Table 4.
- This suspension was passed through a 0.2 ⁇ m polycarbonate membrane filter and a 0.05 ⁇ m polycarbonate membrane filter at room temperature to obtain a dispersion of lead particles.
- the average particle size of the lead particles obtained with a particle size measuring device was measured and confirmed to be within the range of 30 nm to 100 nm.
- a dispersion of lipid / double-stranded nucleic acid complex particles was prepared.
- a solution of lipid membrane constituents was prepared. After heating the resulting lipid membrane component solution, the resulting dispersion of cationic lipid / double-stranded nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and several times the amount of distilled water is mixed. Were mixed to obtain a crude preparation. The obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), and the solvent was replaced with physiological saline.
- Test example 1 Using the preparations 1-A to C obtained in Example 1, an in vivo mRNA knockdown evaluation test was performed by the following methods. Human pancreatic cancer-derived cell line MIA PaCa-2 received from JCRB cell bank, 10% inactivated fetal calf serum (GIBCO) and 1vol% penicillin-streptomycin (GIBCO, 15140-122) was cultured in a DMEM medium containing Glucose (GIBCO, 11995-065) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
- GIBCO inactivated fetal calf serum
- GIBCO 1vol% penicillin-streptomycin
- MIA PaCa-2 was suspended in phosphate buffered saline (PBS) to a concentration of 8 ⁇ 10 7 cells / mL, and 100 ⁇ L of this cell suspension was subcutaneously applied to the back of SCID mice (received from Harlan Labs). (8 ⁇ 10 6 cells / 0.1 mL PBS / head).
- the tumor volume was used as an index, and the animals were divided into groups of 5 animals, and each formulation obtained in Example 1 in an amount corresponding to siRNA 10 mg / kg was intravenously administered to mice.
- physiological saline administration group physiological saline 10 mL / kg was administered. Mice were weighed before administration and 48 hours after administration.
- mice were euthanized after weighing and subcutaneous tumors were removed.
- the excised tumor was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at ⁇ 80 ° C. until use.
- For the obtained tumor sample add 1 mL Trizol reagent (Invitrogen, 10296-028) and 5 mm Stainless Steel Beads (QIAGEN, 69989) to the 2 mL round-bottom tube containing the sample. Then, it was crushed with Tissue lyser II (QIAGEN) under the conditions of 1/25 freq, 1.5 minutes ⁇ 2 times.
- Trizol reagent Invitrogen, 10296-028
- 5 mm Stainless Steel Beads QIAGEN, 69989
- RNA equivalent to 500-1000 ng. Reverse transcription The reaction solution and reaction conditions followed the instruction manual attached to the Transcriptor.
- the obtained cDNA sample was diluted 10-fold with dH 2 O and used as a template for qPCR.
- TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, 4369542) and TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, 4331182) were used for the qPCR reaction.
- the PCR reaction conditions were in accordance with the instruction manual attached to TaqMan Gene Expression.
- the amount of mRNA of the specimen was calculated as a relative ratio when the amount of KRAS mRNA was 1 in the physiological saline administration group.
- FIG. 1 shows the amount of KRAS mRNA in the tumor.
- Example 1 As is clear from FIG. 1, each preparation obtained in Example 1 extremely strongly suppressed the expression of the KRAS gene.
- Test example 2 Using the preparations 1-A to C obtained in Example 1, a tumor growth evaluation test was performed by the following method. In the same manner as in Test Example 1, the test was performed using a xenograft model in which MIA PaCa-2, which is a human pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice. Grouping was performed (Day 0) so that there were 7 mice per group using the tumor volume as an index, and each formulation obtained in Example 1 was administered intravenously on Day 0 and Day 7 in an amount corresponding to 10 mg / kg of siRNA. As a control, physiological saline 10 mL / kg was administered. The tumor diameter of each individual was measured from Day 0 to Day 17, and the tumor volume and volume ratio were calculated using the following formula. Fig. 2 shows the transition of the relative value of the tumor volume.
- composition of the present invention can be administered to a mammal to reduce the expression of the RAS gene and treat RAS-related diseases in vivo.
- Test example 3 The changes in blood concentration after the preparations 1-A and 1-C obtained in Example 1 were administered twice at an interval of 1 week were compared. An amount corresponding to 10 mg / kg of siRNA of the preparation 1-A or 1-C obtained in Example 1 was administered to male CD1 mice (6 weeks old, Charles River, Japan) from the tail vein. Similarly, the second administration was performed at intervals of 7 days.
- Test example 4 Using preparations 1-A to C obtained in Example 1, in vivo anti-PEG antibody production action was examined by the following methods.
- BALB / c mice (received from Harlan Labs) were randomly divided into groups of 3 mice, and each formulation obtained in Example 1 in an amount corresponding to siRNA 10 mg / kg was intravenously administered to mice.
- physiological saline administration group physiological saline 10 mL / kg was administered.
- the mice were anesthetized with isoflurane. Thereafter, the abdomen was opened, and about 500 ⁇ L of blood was collected from the abdominal vena cava. The collected blood was placed in a tube containing a serum separating agent and left at room temperature for 30 minutes.
- Biotin-PEG Biotin-PEG
- Biotin-PEG Nanocs Inc. 50 ⁇ L of PEG5-0001.
- Biotin-PEG was not added to wells to which standards were added.
- the plate was washed 3 times with Tris-buffered saline Tween 20 (Tris-Buffered Saline Tween-20; TBST).
- BSA bovine serum albumin
- Biotin-mouse anti-human CCR4 antibody (BD Biosciences, 551266) was added as a standard (0.98 to 62.5 pg / mL) to wells to which Biotin-PEG was not added. After standing at room temperature for about 2 hours, the plate was washed 4 times with TBST. 50 ⁇ L of POD conjugated anti-mouse IgGAM antibody (ICN / Cappel, 55570) diluted 5000 times with PBS containing 1% BSA was added to all wells. After standing at room temperature for about 2 hours, the plate was washed 4 times with TBST. 50 ⁇ L of TMB Substrate Reagent Set (BD Biosciences, 555214) was added.
- FIG. 3 shows the amount of blood anti-PEG antibody.
- Test Example 5 Using the preparations 2-A, 2-D and 2-E obtained in Example 2, an in vivo mRNA knockdown evaluation test was performed by the following method. In the same manner as in Test Example 1, the test was performed using a xenograft model in which MIA PaCa-2, which is a human pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice (received from CLEA Japan). Grouping was performed so that there were 3 mice per group using the tumor volume as an index (Day 0), and obtained in Example 2 in an amount corresponding to siRNA 10 mg / kg, 3 mg / kg or 1 mg / kg on Day 0 Each formulation was administered. In the physiological saline administration group, physiological saline 10 mL / kg was administered.
- MIA PaCa-2 which is a human pancreatic cancer-derived cell line
- MagNA PURE 96 Roche
- Cellular RNA Large Volume Kit Roche, 5467535
- the mRNA amount of the extracted RNA sample was calculated as a relative ratio when the mRNA amount of KRAS in the physiological saline-administered group was 1.
- FIG. 4 shows the amount of KRAS mRNA in the tumor.
- Test Example 6 Using the preparations 2-A, 2-D and 2-E obtained in Example 2, a tumor growth evaluation test was performed by the following method. In the same manner as in Test Example 2, the test was performed using a xenograft model in which MIA PaCa-2, which is a human pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice (received from CLEA Japan). Grouping was performed so that there were 5 mice per group using the tumor volume as an index (Day 0), and obtained in Example 2 in an amount corresponding to siRNA 10 mg / kg, 3 mg / kg or 1 mg / kg on Day 0 Each formulation was administered intravenously. In the physiological saline administration group, physiological saline 10 mL / kg was administered. The tumor diameter of each individual was measured on Day 7, and the tumor volume and volume ratio were calculated in the same manner as in Test Example 2. FIG. 5 shows the relative value of the tumor volume.
- composition of the present invention can be administered to a mammal to reduce the expression of the RAS gene and treat RAS-related diseases in vivo.
- Test Example 7 Using the preparation 1-A obtained in Example 1 and the preparation 2-A obtained in Example 2, a tumor growth evaluation test was performed by the following method. In the same manner as in Test Example 2, the test was performed using a xenograft model in which MIA PaCa-2, which is a human pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice (received from CLEA Japan). Grouping was performed so that there were 5 mice per group using the tumor volume as an index (Day 0), and each formulation in an amount corresponding to 2.5 mg / kg of siRNA was intravenously administered on Day 0. In the physiological saline administration group, physiological saline 10 mL / kg was administered. The tumor diameter of each individual was measured on Day 7, and the tumor volume and volume ratio were calculated in the same manner as in Test Example 2. FIG. 6 shows the relative value of the tumor volume.
- Test Example 8 Using the formulation 1-A obtained in Example 1, the formulation 3-A obtained in Example 3, and the formulation 4-A obtained in Example 4, tumor growth evaluation was performed in the same manner as in Test Example 7. The test was conducted.
- FIG. 7 shows the relative value of the tumor volume.
- Test Example 9 Using the formulation 1-A obtained in Example 1, the formulation 5-A obtained in Example 5, and the formulation 6-A obtained in Example 6, tumor growth evaluation was performed in the same manner as in Test Example 7. The test was conducted.
- FIG. 8 shows the relative value of the tumor volume.
- Test Example 10 Using the preparation 1-A obtained in Example 1 and the preparation 7-A obtained in Example 7, a tumor growth evaluation test was performed by the following method. In the same manner as in Test Example 2, the test was performed using a xenograft model in which MIA PaCa-2, which is a human pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice (received from CLEA Japan). Grouping was performed (Day 0) so that there were 5 animals per group using the tumor volume as an index, and each formulation in an amount corresponding to siRNA 5 mg / kg was intravenously administered on Day 0. In the physiological saline administration group, physiological saline 10 mL / kg was administered. The tumor diameter of each individual was measured on Day 7, and the tumor volume and volume ratio were calculated in the same manner as in Test Example 2. FIG. 9 shows the relative value of the tumor volume.
- Test Example 11 Using the preparation 1-A obtained in Example 1, a tumor growth evaluation test was performed by the following method. In the same manner as in Test Example 2, the test was performed using a xenograft model in which HCT116 (ATCC), which is a human colon cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice (received from CLEA Japan). Grouping was performed so that there were 5 mice per group using the tumor volume as an index (Day 0), and the amount of preparation 1-A obtained in Example 1 corresponding to siRNA 10 mg / kg was intravenously administered to mice on Day 0 and Day 7. It was administered internally. In the physiological saline administration group, physiological saline 10 mL / kg was administered. The tumor diameter of each individual was measured from Day 0 to Day 17, and the tumor volume and volume ratio were calculated in the same manner as in Test Example 2. FIG. 10 shows the transition of the relative value of the tumor volume.
- composition of the present invention can be administered to mammals to suppress KRAS gene expression and treat RAS-related diseases in vivo.
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Abstract
Description
特許文献3中には、siRNA類と、例えば、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)等を含有する医薬が開示されている。DLinDMA等は、より柔軟なカチオン性脂質を開発すること、それによりリポソーム等の膜流動性を高めることを目的に、構造上類似のカチオン性脂質であるN-(2,3-ジ-(9-(Z)-オクタデセノイルオキシ))-プロパン-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)およびN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)の高級アルキル基を、不飽和部位を少なくとも2ヵ所含む高級アルキル基としたことにより特徴付けられる。また、特許文献4中には、siRNA類と、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)等を含有する医薬が開示されている。
また、特許文献5中には、例えば、trans-3,4-ビス(((Z)-オクタデカ-9-エノイルオキシ)メチル)ピロリジン(化合物I-3)等が開示されている。
(1) センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、該センス鎖と該アンチセンス鎖とは少なくとも25塩基対を有し、該アンチセンス鎖は、配列番号1~3のいずれか1つのKRAS遺伝子のmRNAの連続する少なくとも19塩基の配列に相補的な塩基の配列を有し、最大35ヌクレオチドの長さを有する、薬物としての二本鎖核酸と、式(I)
L1およびL2は、同一または異なって-CO-O-または-O-CO-であり、
aおよびbは、同一または異なって1~3であり、
R3は水素原子、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有する組成物。
(2) 脂質粒子が、さらに式(II)
R6は水素原子、炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子である、前記(1)の組成物。
(3) R4およびR5が、ともにドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである前記(2)の組成物。
(4) R4およびR5が、ともにテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである前記(2)記載の組成物。
(5) R6が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである前記(3)または(4)記載の組成物。
(6) R3が水素原子またはメチルである前記(1)~(5)のいずれかに記載の組成物。
(7) L1およびL2が-O-CO-であり、R1およびR2が、同一にドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである前記(1)~(6)のいずれかに記載の組成物。
(8) L1およびL2が、-CO-O-であり、R1およびR2が、同一にトリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-ヘプタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルである前記(1)~(6)のいずれかに記載の組成物。
(9) 薬物として、配列番号4および5、6および7、8および9、4および10または4および11の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸を含有する前記(1)~(8)のいずれかに記載の組成物。
(10) カチオン性脂質が、該二本鎖核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該二本鎖核酸との複合体を形成している、前記(1)~(9)のいずれかに記載の組成物。
(11) カチオン性脂質が、該二本鎖核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該二本鎖核酸との複合体を形成しており、脂質粒子が該複合体と該複合体を封入する脂質膜から構成された脂質粒子である前記(1)~(9)のいずれかに記載の組成物。
(12) 前記(1)~(11)のいずれかに記載の組成物を用いて該二本鎖核酸を細胞内に導入することを特徴とする、RAS遺伝子の発現を抑制する方法。
(13) 細胞が、ほ乳類の腫瘍にある細胞である前記(12)記載の方法。
(14) 細胞が、ほ乳類の大腸または膵臓にある細胞である前記(12)記載の方法。
(15) 細胞内に導入する方法が、静脈内投与によって細胞内に導入する方法である前記(12)~(14)のいずれかに記載の方法。
(16) 前記(1)~(11)のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与するRAS関連疾患の治療方法。
(17) 投与する方法が、静脈内投与である前記(16)記載の方法。
(18) 前記(1)~(11)のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与する癌の治療方法。
(19) 投与する方法が、静脈内投与である前記(18)記載の方法。
(20) 前記(1)~(11)のいずれかに記載の組成物からなる、RAS関連疾患の治療に用いるための医薬。
(21) 静脈内投与用である前記(20)記載の医薬。
(22) 前記(1)~(11)のいずれかに記載の組成物からなる、癌の治療剤。
(23) 静脈内投与用である前記(22)記載の癌の治療剤。
また、該組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、KRAS遺伝子発現を抑制し、RAS関連疾患を治療する方法も、提供する。
本発明は、過剰増殖性疾病または疾患(例えば、白血病、メラノーマ、細胞腫、癌、腫瘍、腺腫)または不適切なRAS遺伝子の発現に関連する1つ以上の血管新生性疾病を治療または予防するための方法も、提供する。
L1およびL2は、同一または異なって-CO-O-または-O-CO-であり、
aおよびbは、同一または異なって1~3であり、
R3は水素原子、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する。以下、式(I)で表される化合物を、化合物(I)ということもある。他の式番号の化合物についても同様である。
また、本発明の組成物における脂質粒子は、化合物(I)および式(II)
R6は水素原子、炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子である。
製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等があげられる。
化合物(II)において、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれ、窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位して、アンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを形成していてもよく、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを包含する。この場合、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノの窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位したアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオは、製薬上許容し得る陰イオン(前記と同義)と塩を形成していてもよい。
また、aおよびbが、同時に1であり、L1およびL2が、-CO-O-であることも本発明のより好ましい形態の一つである。その場合には、R1およびR2は、同一または異なって(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることが最も好ましい。
また、aおよびbが1であり、L1およびL2が、同一に-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であり、R3がメチルであることも、本発明のさらに好ましい形態の1つであり、R1およびR2は、同一または異なって(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることが最も好ましい。
なお、R3が水素原子の場合には、L1およびL2が、同一に-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であることも、本発明のより好ましい形態の1つであり、R1およびR2は、同一または異なって(Z)-ヘプタデカ-5-エニルまたは(Z)-ヘプタデカ-8-エニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-5-エニルまたは(Z)-ヘプタデカ-8-エニルであることが最も好ましい。
化合物(II)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(IIIb)は、化合物(IIIa)と化合物(IVa)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1~10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間~100時間反応させることにより製造することができる。さらに、化合物(II)は、化合物(IIIb)と化合物(IVb)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1~10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間~100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)等があげられる。
化合物(IIIa)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、第5版実験化学講座14「有機化合物の合成II」、第5版、p.351、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(IVa)および化合物(IVb)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、第5版実験化学講座13「有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
R4とR5が同一の場合の化合物(IIa)は、工程1において、2当量以上の化合物(IVa)を用いることで得ることができる。
化合物(II)のうち、R6が-CHRARB(式中、RAおよびRBは、同一または異なって水素原子、炭素数1~5のアルキル、炭素数2~5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~5のアルキルもしくは炭素数2~5のアルケニルであるか、または隣接する炭素原子と一緒になってピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イルもしくはピペリジン-4-イルを形成し、RAおよびRBが、ともに水素原子である場合を除き、RAおよびRBのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1~5であり、RAおよびRBのいずれかが、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該RAおよびRBのもう一方は、水素原子、炭素数1~5のアルキル、炭素数2~5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~5のアルキルもしくは炭素数2~5のアルケニルであり、RAおよびRBが、置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2または3である)である、化合物(IIb)は以下の方法によって製造することもできる。
化合物(IIb)は、化合物(II)のうちのR6が水素原子である化合物(IIc)を、好ましくは1~10当量の化合物(V)と、溶媒中、好ましくは1~大過剰量の還元剤および必要により好ましくは1~10当量の酸の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間~72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
還元剤としては、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム等があげられる。
酸としては、例えば塩酸、酢酸等があげられる。
化合物(II)のうち、R6が-CH2-C(OH)RCRD(式中、RCおよびRDは、同一または異なって水素原子、炭素数1~4のアルキル、炭素数2~4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~4のアルキルもしくは炭素数2~4のアルケニルであり、RCおよびRDが、ともに水素原子である場合を除き、RCおよびRDのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1~4であり、RCおよびRDのいずれかが、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該RCおよびRDのもう一方は水素原子、炭素数1~4のアルキル、炭素数2~4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは1つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~4のアルキルもしくは炭素数2~4のアルケニルであり、RCおよびRDが、置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2である)である、化合物(IId)は以下の方法によって製造することもできる。
化合物(IId)は、化合物(IIc)と化合物(VI)を溶媒中または無溶媒で、0℃と230 ℃の間の温度で、5分間から100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
上記各製造方法における中間体および目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、ろ過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
化合物(I)および化合物(II)中の各原子の一部またはすべては、それぞれ対応する同位体原子で置き換わっていてもよく、化合物(I)および化合物(II)は、これら同位体原子で置き換わった化合物も包含する。例えば、化合物(I)および化合物(II)中の水素原子の一部またはすべては、原子量2の水素原子(重水素原子)であってもよい。
化合物(I)および化合物(II)中の各原子の一部またはすべてが、それぞれ対応する同位体原子で置き換わった化合物は、市販のビルディングブロックを用いて、上記各製造方法と同様な方法で製造することができる。また、化合物(I)および化合物(II)中の水素原子の一部またはすべてが重水素原子で置き換わった化合物は、例えば、イリジウム錯体を触媒として用い、重水を重水素源として用いてアルコール、カルボン酸等を重水素化する方法[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ(J.Am.Chem.Soc.), Vol.124,No.10,2092(2002)参照]等を用いて合成することもできる。
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えば天然由来のRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性を向上させるかもしくはその他の分解因子から安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基として、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル等が好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチル)アミノオキシ]エチル、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ等がさらに好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチルがもっとも好ましい。
また、糖部修飾ヌクレオチドの修飾基は、その大きさから好ましい範囲を定義することもでき、フルオロの大きさから-O-ブチルの大きさに相当するものが好ましく、-O-メチルの大きさから-O-エチルの大きさに相当する大きさのものがより好ましい。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるアルケニルは、化合物(II)における炭素数3~6のアルケニルと同義である。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基における置換アルキルおよび置換アルケニルにおける置換基としては、例えば、ハロゲン(前記と同義)、ヒドロキシ、スルファニル、アミノ、オキソ、-O-アルキル(該-O-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-S-アルキル(該-S-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-NH-アルキル(該-NH-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノオキシ(該ジアルキルアミノオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノ(該ジアルキルアミノの2つのアルキル部分は同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノアルキレンオキシ(該ジアルキルアミノアルキレンオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記アルキルと同義であり、アルキレン部分は前記アルキルから水素原子が1つ除かれたものを意味する)等があげられ、置換数は好ましくは1~3である。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されたもの、メチル基が水素原子もしくは炭素数2~6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1~6のアルキル基、炭素数1~6のアルカノイル基等の保護基で保護されたものがあげられる。
さらに、ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素等、別の化学物質を付加したものもあげられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5蛍光色素付加ヌクレオチド誘導体、Cy3蛍光色素付加ヌクレオチド誘導体、6-フルオレセイン(FAM)付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
また、ヌクレオチド誘導体は、二本鎖核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
最も好ましくは、センス鎖は25~28ヌクレオチドを含み、センス鎖の3'末端の2ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。センス鎖は、5'末端にリン酸を含む。アンチセンス鎖は、26~30ヌクレオチドを含み、そして、1~4ヌクレオチドの3'突出部を含む。アンチセンス鎖およびセンス鎖は、1つまたはそれ以上の2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを有する。
例えば、25ヌクレオチドセンス鎖、および2ヌクレオチドの3'突出部を含む27ヌクレオチドアンチセンス鎖で、センス鎖およびアンチセンス鎖の5'末端の第一塩基をポジション番号1と数える場合、2'-O-メチル修飾の位置としては、センス鎖のポジション番号1、2、4、6、8、12、14、16、18および23ならびにアンチセンス鎖のポジション番号1、2、3、4、11、13、25および27、センス鎖のポジション番号1、2、4、6、8、12、14、16、18および23ならびにアンチセンス鎖のポジション番号1、2、3、4、11、13、21、23、25、26および27、センス鎖のポジション番号1、2、4、6、8、12、14、16、18および23ならびにアンチセンス鎖のポジション番号1、2、3、4、11、13、15、17、19、21、23、25、26および27等があげられ、いずれの場合も、好ましくはセンス鎖の3'末端の2ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は5'末端にリン酸を含む。
また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の3’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ3’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
二本鎖核酸は、KRAS遺伝子配列内の標的配列と相互作用するように設計することができる。
二本鎖核酸の1つの鎖の配列は、上で記述した標的部位配列に対して相補的である。二本鎖核酸は、本明細書に記述された方法を使用して、化学的に合成することができる。
RNAは、酵素的または部分/全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。RNA分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において公知である[ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic. Acids. Res. )、1998年、第32巻、p.936-948参照 ]。一般に、二本鎖核酸は、固相オリゴヌクレオチド合成法を使用することによって合成することができる(たとえば、Usman et al.,米国特許第5,804,683号;第5,831,071号;第5,998,203号;第6,117,657号;第6,353,098号;第6,362,323号;第6,437,117号;第6,469,158号;Scaringe et al.,米国特許第6,111,086号;第6,008,400号;第6,111,086号を参照)。
一本鎖核酸は、固相ホスホロアミダイト法(ヌクレイック・アシッズ・レサーチ(Nucleic. Acids. Res.)、1993年、第30巻、p.2435-2443参照)を使用して合成され、脱保護され、およびNAP-5カラム(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)上で脱塩される。オリゴマーは、15分工程のリニア勾配を使用するAmersham Source 15Qカラム-1.0cm。高さ.25 cm (Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)でのイオン交換高性能液体クロマトグラフィー(IE-HPLC)を使用して精製する。勾配は、90:10の緩衝液A:Bから52:48の緩衝液A:Bに変化し、緩衝液Aは100mM Tris pH 8.5であり、および緩衝液Bは、100mM Tris pH 8.5(1MのNaCl)である。試料は、260nmにてモニターされ、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークは、収集され、プールされ、NAP-5カラムで脱塩され、および凍結乾燥される。
一本鎖核酸は、100mM 酢酸カリウム、30mM HEPES、pH 7.5からなる緩衝液中に100μM濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、50μM二本鎖核酸の最終溶液を得る。試料を95℃まで5分間加熱して、使用前に室温に冷却させる。二本鎖核酸は、-20℃にて保存する。一本鎖核酸は、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、-80℃で貯蔵する。
本発明で用いられる二本鎖核酸の具体例を第3表に示す。なお、表中のr、mおよびdが付された塩基に結合する糖は、それぞれリボース、2’位の水酸基が-O-メチルで置換されているリボースおよびデオキシリボースである。
また、本発明における脂質粒子としては、例えば化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)を含有する脂質粒子等もあげられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、化合物(II)、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、該複合体および/または該脂質膜に、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有していてもよい。
該複合体の形態としては、いずれの場合も二本鎖核酸と脂質一重層からなる膜(逆ミセル)との複合体、二本鎖核酸とリポソームとの複合体、二本鎖核酸とミセルとの複合体等があげられ、好ましくは二本鎖核酸と脂質一重層からなる膜との複合体または二本鎖核酸とリポソームとの複合体があげられる。
該複合体および該複合体を封入する脂質二重膜から構成された脂質粒子としては、該複合体および該複合体を封入する脂質二重膜から構成されたリポソーム等があげられる。
なお、本発明における脂質粒子には、化合物(I)および化合物(II)のそれぞれ一種または複数種を使用してもよく、また化合物(I)および/または化合物(II)には、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を混合してもよい。
化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質としては、例えば、特開昭61-161246号公報(米国特許5049386号明細書)中で開示される、DOTMA、DOTAP等、国際公開第91/16024号パンフレットおよび国際公開第97/019675号パンフレット中で開示される、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DORIE)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)等、国際公開第2005/121348号パンフレット中で開示される、DLinDMA等、国際公開第2009/086558号パンフレット中で開示される、DLin-K-DMA等があげられ、好ましくはDOTMA、DOTAP、DORIE、DOSPA、DLinDMA、DLin-K-DMA等の2つの非置換アルキル基を有する3級アミン部位または3つの非置換アルキル基を有する4級アンモニウム部位を有するカチオン性脂質があげられ、より好ましくは該3級アミン部位を有するカチオン性脂質があげられる。該3級アミン部位および該4級アンモニウム部位の非置換アルキル基はメチル基であることがより好ましい。
なお、本発明において、化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)、ならびに/または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質粒子、化合物(II)と核酸との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質粒子等の製造中および製造後に、複合体中の二本鎖核酸と脂質膜中のカチオン性脂質との静電相互作用や、複合体中のカチオン性脂質と脂質膜中のカチオン性脂質との融合によって、複合体および膜の構造が変位したものも、それぞれ化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)、ならびに/または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質粒子、化合物(II)と核酸との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質粒子等に包含される。
本発明における脂質粒子としては、化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質粒子がより好ましく、化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/または高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質粒子がより好ましく、化合物(I)もしくは化合物(I)に中性脂質を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)を含有する脂質粒子または化合物(II)もしくは化合物(II)に中性脂質を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質粒子がさらに好ましい。
本発明の脂質粒子において、複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成される場合には、該脂質粒子中の化合物(I)および化合物(II)の分子の総数は、該二本鎖核酸のリン原子の数に対して1~10倍であるのが好ましく、2.5~9倍であるのがより好ましく、3.5~8倍であるのがさらに好ましい。また、該脂質粒子中の化合物(I)および化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質の分子の総数は、該二本鎖核酸のリン原子の数に対して1~10倍であるのが好ましく、2.5~9倍であるのがより好ましく、3.5~8倍であるのがさらに好ましい。
本発明の脂質粒子において中性脂質を含有する場合には、中性脂質の分子の総数は、化合物(I)および化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.1~1.8倍であるのが好ましく、0.3~1.1倍であるのがより好ましく、0.4~0.9倍であるのがさらに好ましい。本発明における脂質粒子は、中性脂質を、複合体に含有していてもよく、該複合体を封入する脂質膜に含有していてもよく、少なくとも該複合体を封入する脂質膜に含有していることがより好ましく、該複合体および該該複合体を封入する脂質膜のどちらにも含有していることがさらに好ましい。
本発明の脂質粒子において水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有する場合には、水溶性高分子の脂質誘導体および脂肪酸誘導体の分子の総数は、化合物(I)および化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.05~0.3倍であるのが好ましく、0.07~0.25倍であるのがより好ましく、0.1~0.2倍であるのがさらに好ましい。
送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸が導入されると、その細胞内のRAS遺伝子の発現を低下させ、KRAS関連疾患、例えば白血病、メラノーマ、細胞腫、癌、腫瘍、腺腫等を治療することができる。
即ち、本発明の組成物を哺乳動物に投与することで、RAS遺伝子の発現を低下させ、RAS関連疾患、例えば白血病、メラノーマ、細胞腫、癌、腫瘍、腺腫等を治療することができる。投与対象は、人であることが好ましい。
また、本発明における組成物は、癌の治療剤または予防剤に関するインビボの薬効評価モデルにおいて、KRAS遺伝子を抑制することの有効性を検証するためのツールとして使用することもできる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖核酸に換算した1日投与量が約0.1μg~1000mgとなるように投与すればよい。
注射剤の場合、前記の脂質粒子の分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
なお、参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
メチルジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン(化合物II-1)
メチルアミン(アルドリッチ(Aldrich)社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、10.5 mL、21.0 mmol)に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(ニューチェック・プレップ(Nu-Chek Prep,Inc)社製, 1.03 g, 3.00 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて150℃で90分間加熱撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮することでメチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミンの粗生成物を得た。
得られた粗生成物に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 0.93 g, 2.70 mmol)および50%水酸化ナトリウム水溶液(0.960 g, 12.0 mmol)を加え、油浴上135℃で60分間加熱撹拌した。室温まで冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0~97/3)で精製することにより化合物II-1(1.07 g, 67.2 %)を得た。
ESI-MS m/z: 529 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 32H), 1.40-1.51 (m, 4H), 1.97-2.06 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
メチルジ((Z)-ヘキサデカ-9-エニル)アミン (化合物II-2)
参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、10.0 mL、20.0 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 1.21 g, 3.80 mmol)を用い、化合物II-2(0.491 g, 51.6 %)を得た。
ESI-MS m/z: 477 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 36H), 1.46-1.57 (m, 4H), 1.97-2.05 (m, 8H), 2.33 (s, 3H), 2.45 (t, J = 7.9 Hz, 4H), 5.29-5.41 (m, 4H).
メチルジ((11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル)アミン (化合物II-3)
参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、16.0 mL、32.0 mmol)および(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.98 g, 8.00 mmol)を用い、化合物II-3(1.27 g, 54.4%)を得た。
ESI-MS m/z: 585 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.27 (br s, 40H), 1.39-1.51 (m, 4H), 2.01-2.09 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.79 (d, J = 6.3 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン (化合物II-4)
参考例1と同様の方法で、アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、18.0 mL、36.0 mmol)および(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.79 g, 8.10 mmol)を用い、化合物II-4(0.838 g, 36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 515 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.30 (br s, 33H), 1.41-1.54 (m, 4H), 2.01-2.09 (m, 8H), 2.59 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (化合物II-5)
参考例1と同様の方法で、アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、12.0 mL、24.0 mmol)および(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 1.87 g, 5.40 mmol)を用い、化合物II-5(0.562 g, 36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 519 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 45H), 1.41-1.52 (m, 4H), 1.97-2.05 (m, 8H), 2.58 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 5.28-5.40 (m, 4H).
メチルジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (化合物II-6)
参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、11.2 mL、22.4 mmol)および(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.11 g, 6.09 mmol)を用い、化合物II-6(1.20 g, 70.2 %)を得た。
ESI-MS m/z: 533 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27 (br s, 44H), 1.39-1.50 (m, 4H), 1.97-2.06 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 5.28-5.40 (m, 4H).
国際公開第2006/100036号パンフレットを参考にして合成したtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチル(156 mg, 0.674 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、オレイン酸(東京化成工業社製、419 mg, 1.48 mmol)、水溶性 カルボジイミド(WSCD)(国産化学社製、297 mg, 1.55 mmol)および4-ジメチルアミノピリジン(東京化成工業社製、DMAP (20.6 mg, 0.169 mmol)を加え室温で終夜撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/クロロホルム=50/50~0/100)で精製することにより化合物VII-1 (280 mg, 54.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 761 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.25-1.46 (m, 36H), 1.46 (s, 9H), 1.46-1.66 (m, 8H), 1.97-2.04 (m, 8H), 2.27-2.38 (m, 6H), 3.10-3.23 (m, 2H), 3.53-3.66 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 10.8, 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 10.8, 6.0 Hz, 2H), 5.28-5.40 (m, 4H).
参考例7と同様の方法で、国際公開第2006/100036号パンフレットを参考にして合成したtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチル(150 mg, 0.674 mmol)およびリノール酸(アルドリッチ社製、400 mg, 1.48 mmol)を用い、化合物VII-2 (351 mg, 71.7%)を得た。
ESI-MS m/z: 757 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.21-1.45 (m, 26H), 1.46 (s, 9H), 1.47-1.68 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 2.26-2.38 (m, 6H), 2.77 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 3.10-3.23 (m, 2H), 3.53-3.66 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 11.0, 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.0, 6.0 Hz, 2H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例7で得られた化合物VII-1 (278 mg, 0.366 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(0.563 mL, 7.31 mmol)を加え室温で3時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣を少量のメタノールに溶解し、プラスチックカラムに充填したBONDESIL-SCX(ヴァリアン(VARIAN)社製、6 g)の上部に吸着させ、メタノールで洗浄し、次いでアンモニア・メタノール溶液(東京化成工業社製、2 mol/L)で目的物を溶出させた。目的物を含むフラクションを減圧下濃縮することで化合物I-1 (162 mg, 67.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 661 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27-1.35 (m, 40H), 1.56-1.64 (m, 4H), 2.01 (q, J = 5.9 Hz, 8H), 2.09-2.16 (m, 2H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.72 (dd, J = 11.3, 5.5 Hz, 2H), 3.11 (dd, J = 11.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
参考例9と同様の方法で、参考例8で得られた化合物VII-2(350 mg, 0.463 mmol)を用い、化合物I-2 (224 mg, 73.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 657 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.40 (m, 28H), 1.57-1.66 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.6 Hz, 8H), 2.09-2.17 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.72 (dd, J = 11.3, 6.0 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.2 Hz, 4H), 3.11 (dd, J = 11.3, 7.3 Hz, 2H), 3.99-4.13 (m, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例10で得られた化合物I-2 (80 mg, 0.12 mmol)を1,2-ジクロロエタン(1.5 mL)、メタノール(1.5 mL)に溶解させ、ホルムアルデヒド(0.091 mL, 1.22 mmol)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(アクロス・オーガニクス(Acros Organics)社製、129 mg, 0.610 mmol)を複数回にわたって加え室温で1.5時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=100/0~93/7)で精製することで化合物I-3 (66 mg, 81%)を得た。
ESI-MS m/z: 671 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.25-1.40 (m, 28H), 1.57-1.66 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 2.13-2.24 (m, 2H), 2.27-2.37 (m, 9H), 2.66 (dd, J = 9.2, 7.3 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 5.7 Hz, 4H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例11と同様の方法で、参考例9で得られた化合物I-1 (50 mg, 0.076 mmol)を用い、化合物I-4 (47 mg, 92%)を得た。
ESI-MS m/z: 675 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.35 (m, 40H), 1.56-1.65 (m, 4H), 2.01 (q, J = 5.5 Hz, 8H), 2.15-2.24 (m, 2H), 2.27-2.37 (m, 9H), 2.67 (dd, J = 9.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
二本鎖核酸は蒸留水に溶解し、24 mg/mLに調製して用いた(以下siRNA溶液という)。
化合物II-1/1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DMPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)=57.3/5.52 mmol/Lとなるように、各脂質を塩酸およびエタノールを含有する水溶液に懸濁させ、vortex攪拌ミキサーで攪拌および、加温を繰り返して均一な懸濁液を得た。この懸濁液を室温下で0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルターおよび0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、リード粒子の分散液を得た。Dynamic light scattering (DLS) 粒子径測定装置(Zetasizer Nano ZS、マルバーン(Malvern)社製、以下同じ)で得られたリード粒子の平均粒子径を測定し、30 nmから100 nmの範囲内であることを確認した。得られたリード粒子の分散液 に、siRNA 溶液を、3:1(=リード粒子の分散液:siRNA溶液)の割合で混合し、さらに3倍量の蒸留水を加えて混合することでカチオン性脂質/二本鎖核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物II-1/化合物I-3/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)= 2.98/5.97/2.94/5.71/11.8 mmol/Lとなるように、各脂質を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/二本鎖核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤1-A~C(化合物II-1および化合物I-3を脂質として含有し、siRNA A, BまたはCを二本鎖核酸として含有する組成物)を得た。粒子径測定装置で製剤中の脂質粒子の平均粒子径を測定した。結果を第4表に示す。
二本鎖核酸は蒸留水に溶解し24 mg/mLに調製して用いた(以下siRNA溶液という)。
化合物II-1/PEG-DSPE Na=57.3/5.52 mmol/Lとなるように、各脂質を塩酸およびエタノールを含有する水溶液に懸濁させ、vortex攪拌ミキサーで攪拌および、加温を繰り返して均一な懸濁液を得た。この懸濁液を室温下で0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルターおよび0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、リード粒子の分散液を得た。粒子径測定装置で得られたリード粒子の平均粒子径を測定し、30 nmから100 nmの範囲内であることを確認した。得られたリード粒子の分散液 に、siRNA 溶液を、3:1(=リード粒子の分散液:siRNA溶液)の割合で混合し、さらに3倍量の蒸留水を加えて混合することでカチオン性脂質/二本鎖核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物II-1/化合物I-3/PEG-DSPE Na/DSPC/コレステロール= 2.98/5.97/2.94/5.71/11.8 mmol/Lとなるように、各脂質を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/二本鎖核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、溶媒を生理食塩水に置換した。さらに生理食塩水に対して透析膜(Spectrum Laboratories社、Spectra Por Biotechセルロースエステル膜、MWCO:300 KDa)で透析し、アミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤2-A, 2-Dおよび2-E(化合物II-1および化合物I-3を脂質として含有し、siRNA A, DまたはEを二本鎖核酸として含有する組成物)を得た。粒子径測定装置で製剤中の脂質粒子の平均粒子径を測定した。結果を第5表に示す。
実施例1で得られた製剤1-A~Cを用いて、それぞれ以下の方法によりインビボ mRNAノックダウン評価試験を実施した。
ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2はJCRB細胞バンクより受領し、10%非働化ウシ胎仔血清(ギブコ(GIBCO)社製)及び1vol%ペニシリン‐ストレプトマイシン(GIBCO社製、15140-122)を含む高グルコース含有DMEM培地(GIBCO社製, 11995-065)で37℃、5%CO2条件下で培養した。MIA PaCa-2を8×107 cells / mLの濃度となるようにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁し、この細胞懸濁液100 μLをSCIDマウス(Harlan Labsより入荷)の背部皮下に移植した(8×106 cells /0.1mL PBS /head)。移植5日後、腫瘍体積を指標に一群5匹として群分けを行い、siRNA 10 mg/kgに相当する量の実施例1で得られた各製剤をマウスに静脈内投与した。生理食塩水投与群は、生理食塩水 10mL/kgを投与した。投与前及び投与48時間後にマウスの体重を測定した。体重測定後にマウスを安楽死させ、皮下腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍は直ちに液体窒素で凍結し、使用するまで-80℃に保存した。
得られた腫瘍サンプルについて、サンプルの入った2 mL丸底tubeに1 mLのTrizol reagent (インビトロジェン(Invitrogen)製, 10296-028)及び5mmのStainless Steel Beads (キアゲン(QIAGEN)製, 69989)を添加し、Tissue lyser II (キアゲン(QIAGEN)製)にて1/25 freq, 1.5 分 x 2回の条件で破砕した。破砕後遠心(10000 rpm, 10 分)し上清を回収、200 μLのクロロホルムを添加し激しく攪拌後再び遠心(15000 rpm, 15 分)した。得られた上清に同量の70%エタノール溶液を加えて混ぜ、RNeasy Mini Kit スピンカラム(キアゲン製)にアプライし遠心(8000 x g, 15秒)した。ろ液を捨て、700μLのRNeasy Mini Kit RW1(キアゲン製)を加えて遠心(8000 x g, 15秒)し、ろ液を捨て、新たに500μLのRNeasy Mini Kit RPE(キアゲン(QIAGEN)製)を加えて遠心(8000 x g, 15秒)した。ろ液を捨て、再度500μLのRNeasy Mini Kit RPEを加えて遠心(8000 x g, 2分)し、ろ液を捨てた後、更に遠心(15000 rpm, 1分)してカラム内の溶液を除外した。RNeasyスピンカラムに30μLのRNase free waterを加えて遠心(8000 x g, 1分)しRNAを抽出した。抽出したRNAの濃度を吸光光度計Spectra Max M3 (モリュキュラーデバイシス(Molecular Devices)社製)にて測定し、500-1000 ng相当のRNAについてTranscriptor (ロシュ(Roche)製、4897030)を用いて逆転写を行った。反応液、反応条件はTranscriptor添付の使用説明書に従った。得られたcDNAサンプルをdH2Oで10倍希釈し、qPCRの鋳型として用いた。qPCR反応にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4369542), TaqMan Gene Expression Assays(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4331182)を用いた。PCR反応の条件はTaqMan Gene Expression添付の使用説明書に従った。検体のmRNA量は、生理食塩水投与群における、KRASのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。
図1に、腫瘍中KRAS mRNA量を示す。
実施例1で得られた製剤1-A~Cを用いて、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
試験例1と同様にして、ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群7匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0及びDay7にsiRNA 10 mg/kgに相当する量の実施例1で得られた各製剤を静脈内投与した。対照として生理食塩水 10mL/kgを投与した。各個体の腫瘍径を、Day0からDay17まで測定し、以下の式を用いて腫瘍体積、体積比を算出した。
よって、本発明の組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、RAS遺伝子の発現を低下させ、RAS関連疾患を治療することができることが明らかになった。
実施例1で得られた製剤1-Aおよび1-Cを1週間間隔で2回投与した後の血中濃度推移を比較した。
実施例1で得られた製剤1-Aまたは1-CのsiRNA 10 mg/kgに相当する量を雄性CD1マウス(6週齢、日本チャールス・リバー)に、尾静脈より投与した。7日間の間隔をあけ、同様に2回目の投与を行った。初回および2回目の投与の後、0.5, 2, 6および24時間目に、尾動脈より20 μLの血液を採取し、denaturing solution (4 mol/L グアニジンチオシアネート、25 mmol/L クエン酸ナトリウム、1 mmol/L ジチオスレイトール、0.5 w/v% sodium N-lauroyl sarcosine) 100 μLを添加して混合した。
得られた液に、内部標準物質と、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール pH 8.0 (Invitrogen)を添加して混合し遠心分離した。
上清に酢酸ナトリウムとGenTLE precipitation carrier (タカラバイオ)を添加して混合した後、エタノール を添加して混合し、遠心分離した後、上清を捨てた。沈殿に75 v/v% エタノールを添加して遠心分離した後、上清を捨て、沈殿を風乾した後、蒸留水に溶解し、LC/MSによってアンチセンス鎖およびセンス鎖(配列番号5または配列番号9の核酸)を定量した。
<装置>
HPLC装置;ACQUITY UPLC system (Waters)
質量分析装置;TQ Detector (Waters)
<HPLC条件>
内標準物質
以下に示した二本鎖の核酸
5'-mGmUrAmUrUmUrGmCrGrUrAmUrUmUrAmUrUmArUrGrUrAmAdAdT-3' (配列番号12)
5'-mAmUmUmUrArCrArUrArAmUrAmArArUrArCrGrCrArArArUrAmCrAmC-3' (配列番号13)
(mおよびrが付された塩基に結合する糖は、それぞれ2’-O-メチルで置換されているリボースおよびリボースである)
カラム;ACQUITY UPLC OST C18 (1.7 μm、2.1 mm I.D. x 100 mm、Waters)
カラム温度:70℃
移動相:
A液 15 mmol/L トリエチルアミン, 400 mmol/L ヘキサフルオロイソプロピルアルコール 水溶液
B液 メタノール
グラジエント:B液濃度を10%から25%まで9分間で直線的に上昇させた。
流速:0.4 mL/分
すなわち、例えば配列番号4および5、6および7、8および9、4および10または4および11の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸等は、例えば、本発明の組成物等を、哺乳動物に投与する場合において、すぐれた血中濃度推移を示すことが明らかとなった。
実施例1で得られた製剤1-A~Cを用いて、それぞれ以下の方法によりインビボにおける抗PEG抗体産生作用を検討した。
BALB/cマウス(Harlan Labsより入荷)一群3匹で無作為に群分けを行い、siRNA 10 mg/kgに相当する量の実施例1で得られた各製剤をマウスに静脈内投与した。生理食塩水投与群は、生理食塩水 10mL/kgを投与した。投与1週間後にイソフルランを用いてマウスに麻酔をかけた。その後、開腹し、腹部大静脈より血液を約500μL回収した。回収した血液は血清分離剤入りのチューブに入れ、30分間室温に放置した。その後、3000rpmで10分間遠心分離し、回収した血清は使用するまで-20℃に保存した。
アビジンコートのプレート(サーモ フィッシャー サイエンティフィック インク(Thermo Fisher Scientific Inc.)社, (Nunc), 236001)にPBSで40μg/mLに希釈したビオチンPEG入り(Biotin-PEG) (ナノックス インク(Nanocs Inc.)社, PEG5-0001)を50μL添加した。ただし、スタンダードを添加するウェルにはBiotin-PEGを添加しなかった。約1時間室温で放置後、トリスバッファー生理食塩水Tween20入り(Tris-Buffered Saline Tween-20;TBST)でプレートを3回洗浄した。Biotin-PEGを添加したウェルに1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで50倍希釈した血清サンプルを50μL添加した。また、Biotin-PEGを添加していないウェルにBiotin-mouse anti-human CCR4 antibody(ビィ ディ バイオサイエンシス(BD Biosciences)社, 551266)をスタンダードとして50μL添加した(0.98~62.5 pg/mL)。約2時間室温で放置後、TBSTでプレートを4回洗浄した。すべてのウェルに1%BSAを含むPBSで5000倍希釈したPOD conjugated anti-mouse IgGAM antibody (アイシーエヌ カッペル(ICN/Cappel)社, 55570)を50μL添加した。約2時間室温で放置後、TBSTでプレートを4回洗浄した。TMB Substrate Reagent Set(BD Biosciences社, 555214)を50μL添加した。約30分間暗所で室温放置後、1M-H2SO4を50μL加えて酵素反応を止めた。プレートリーダーで450nmと620nmの吸光度を測定し、スタンダードサンプルによる検量線によりサンプルの相対的な抗PEG抗体量を算出した。
図3に血中抗PEG抗体量を示す。
実施例2で得られた製剤2-A、2-Dおよび2-Eを用いて、以下の方法によりインビボ mRNAノックダウン評価試験を実施した。
試験例1と同様にして、ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウス(日本クレアより入荷)に移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群3匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0にsiRNA 10 mg/kg、3 mg/kgまたは1 mg/kgに相当する量の実施例2で得られた各製剤を投与した。生理食塩水投与群は、生理食塩水10mL/kgを投与した。試験例1と同様にして、得られた腫瘍サンプルを破砕し、遠心して上清を回収し、上清にクロロホルムを添加し激しく攪拌後再び遠心(15000 rpm, 15 分)し、得られた上清200 μLから自動核酸抽出機MagNA PURE 96 (ロシュ(Roche)製)にて、Cellular RNA Large Volume Kit (ロシュ(Roche)製, 5467535)を用いてRNAを抽出した。試験例1と同様にして、抽出したRNA検体のmRNA量を、生理食塩水投与群における、KRASのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。
図4に、腫瘍中KRAS mRNA量を示す。
実施例2で得られた製剤2-A、2-Dおよび2-Eを用いて、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
試験例2と同様にして、ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウス(日本クレアより入荷)に移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群5匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0にsiRNA 10 mg/kg、3 mg/kgまたは1 mg/kgに相当する量の実施例2で得られた各製剤を静脈内投与した。生理食塩水投与群は、生理食塩水10mL/kgを投与した。各個体の腫瘍径を、Day7に測定し、試験例2と同様の方法で腫瘍体積、体積比を算出した。
図5に、腫瘍体積の相対値を示す。
よって、本発明の組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、RAS遺伝子の発現を低下させ、RAS関連疾患を治療することができることが明らかになった。
実施例1で得られた製剤1-Aおよび実施例2で得られた製剤2-Aを用いて、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
試験例2と同様にして、ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウス(日本クレアより入荷)に移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群5匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0にsiRNA 2.5 mg/kgに相当する量の各製剤を静脈内投与した。生理食塩水投与群は、生理食塩水10mL/kgを投与した。各個体の腫瘍径を、Day7に測定し、試験例2と同様の方法で腫瘍体積、体積比を算出した。
図6に、腫瘍体積の相対値を示す。
実施例1で得られた製剤1-A、実施例3で得られた製剤3-Aおよび実施例4で得られた製剤4-Aを用いて、試験例7と同様の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
図7に、腫瘍体積の相対値を示す。
実施例1で得られた製剤1-A、実施例5で得られた製剤5-Aおよび実施例6で得られた製剤6-Aを用いて、試験例7と同様の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
図8に、腫瘍体積の相対値を示す。
実施例1で得られた製剤1-Aおよび実施例7で得られた製剤7-Aを用いて、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
試験例2と同様にして、ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウス(日本クレアより入荷)に移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群5匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0にsiRNA 5 mg/kgに相当する量の各製剤を静脈内投与した。生理食塩水投与群は、生理食塩水10mL/kgを投与した。各個体の腫瘍径を、Day7に測定し、試験例2と同様の方法で腫瘍体積、体積比を算出した。
図9に、腫瘍体積の相対値を示す。
実施例1で得られた製剤1-Aを用いて、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
試験例2と同様にして、ヒト大腸癌由来細胞株であるHCT116(ATCC)をSCIDマウス(日本クレアより入荷)に移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群5匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0及びDay7にsiRNA 10 mg/kgに相当する量の実施例1で得られた製剤1-Aをマウスに静脈内投与した。生理食塩水投与群は、生理食塩水10mL/kgを投与した。各個体の腫瘍径を、Day0からDay17まで測定し、試験例2と同様の方法で腫瘍体積、体積比を算出した。
図10に、腫瘍体積の相対値の推移を示す。
配列番号2-KRASmRNA内のターゲット
配列番号3-KRASmRNA内のターゲット
配列番号4-siRNA センス
配列番号5-siRNA アンチセンス
配列番号6-siRNA センス
配列番号7-siRNA アンチセンス
配列番号8-siRNA センス
配列番号9-siRNA アンチセンス
配列番号10-siRNA アンチセンス
配列番号11-siRNA アンチセンス
配列番号12-siRNA センス用のIS
配列番号13-siRNA アンチセンス用のIS
Claims (23)
- センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、該センス鎖と該アンチセンス鎖とは少なくとも25塩基対を有し、該アンチセンス鎖は、配列番号1~3のいずれか1つのKRAS遺伝子のmRNAの連続する少なくとも19塩基の配列に相補的な塩基の配列を有し、最大35ヌクレオチドの長さを有する、薬物としての二本鎖核酸と、式(I)
(式中、R1およびR2は、同一または異なって炭素数12~24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、
L1およびL2は、同一または異なって-CO-O-または-O-CO-であり、
aおよびbは、同一または異なって1~3であり、
R3は水素原子、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有する組成物。 - 脂質粒子が、さらに式(II)
(式中、R4およびR5は、同一または異なって炭素数12~24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、
R6は水素原子、炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子である、請求項1記載の組成物。 - R4およびR5が、ともにドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである請求項2記載の組成物。
- R4およびR5が、ともにテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである請求項2記載の組成物。
- R6が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである請求項3または4記載の組成物。
- R3が水素原子またはメチルである請求項1~5のいずれかに記載の組成物。
- L1およびL2が-O-CO-であり、R1およびR2が、同一にドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである請求項1~6のいずれかに記載の組成物。
- L1およびL2が、-CO-O-であり、R1およびR2が、同一にトリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-ヘプタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルである請求項1~6のいずれかに記載の組成物。
- 薬物として、配列番号4および5、6および7、8および9、4および10または4および11の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸を含有する請求項1~8のいずれかに記載の組成物。
- カチオン性脂質が、該二本鎖核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該二本鎖核酸との複合体を形成している、請求項1~9のいずれかに記載の組成物。
- カチオン性脂質が、該二本鎖核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該二本鎖核酸との複合体を形成しており、脂質粒子が該複合体と該複合体を封入する脂質膜から構成された脂質粒子である請求項1~9のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1~11のいずれかに記載の組成物を用いて該二本鎖核酸を細胞内に導入することを特徴とする、RAS遺伝子の発現を抑制する方法。
- 細胞が、ほ乳類の腫瘍にある細胞である請求項12記載の方法。
- 細胞が、ほ乳類の大腸または膵臓にある細胞である請求項12記載の方法。
- 細胞内に導入する方法が、静脈内投与によって細胞内に導入する方法である請求項12~14のいずれかに記載の方法。
- 請求項1~11のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与するRAS関連疾患の治療方法。
- 投与する方法が、静脈内投与である請求項16記載の方法。
- 請求項1~11のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与する癌の治療方法。
- 投与する方法が、静脈内投与である請求項18記載の方法。
- 請求項1~11のいずれかに記載の組成物からなる、RAS関連疾患の治療に用いるための医薬。
- 静脈内投与用である請求項20記載の医薬。
- 請求項1~11のいずれかに記載の組成物からなる、癌の治療剤。
- 静脈内投与用である請求項22記載の癌の治療剤。
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