JPH02135092A - 細胞への遺伝子導入法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は細胞への遺伝子導入法に係る。

（従来の技術） 遺伝子工学的な手法の内で、遺伝子を細胞内に導入する
技術は、特に遺伝子疾患の治療をめざした研究において
極めて重要なものである。哺乳動物細胞への有用な遺伝
子の導入とその発現を行うために従来から種々の方法が
研究されてきた。例えば燐酸カルシウム共沈法［Ｆ、　
Ｌ、　Ｇｒａｈａｍ等ｒ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」第５２巻
、第４５６頁（１９７３年）１、ＤＵＡＥ−ｄｅｘｔｒ
ａｎ法［Ｊ、　Ｂａｎａｒｊｉ等ｒｃｅ１１」第３３巻
、第７２９頁（１９８３年）１、プロトプラスト融合法
（Ｗ、　５ｃｈａｆｆｎｅｒ、　ｒ　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡＪ第７７巻
、第２１６３頁（１９１１０年）１、マイクロインジェ
クション法ＩＦ。

Ｙａｍａｍｏｔｏ等ｒＥｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｇ第
１４２巻、第７９頁（１９８２年）１、電気穿孔法［Ｈ
，Ｐｏｔｔｅｒ等ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡＪ第８１巻、第７１６１頁（１
９８４年）１、赤血球ゴースト法［Ｍ。

Ｆｕｒｕｓａｗａ、　ｒ　Ｉｎｔ、　Ｒｅｖ、　Ｃｙｔ
ｏｌ、１第６２巻、第２９頁（１９８０年）１、レトロ
ウィルスをベクターに用いた感染による方法［Ｃ，Ｌ、
　Ｃｅｐｋｏ等ｒｃｅｌｌ」第３７巻、第１０５３頁（
１９８４年）］、リポソーム法［Ｒ，Ｆｒａｌｅｙ等ｒ
　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ｅｈｅｍ、　」第２５５巻、第１
０４３１頁（１９８０年）］、リボフェクション法［ｐ
、　１．　Ｆｅｌｇｎｅｒ等ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡＪ第８４巻、第７４１３頁（１９８７年）１等の
方法がある。

（発明が解決しようとする課題） 従来提案されてきた細胞への遺伝子の導入法の大部分の
ものは生体への適用に問題を有している。即ち、例えば
マイクロインジェクション法を利用する場合には細胞核
に直接ＤＮＡを注入しなければならず、電気穿孔法を利
用する場合には高電圧の且つ短時間のパルスにより細胞
膜に一過性の孔を形成せねばならないからであり、又他
の諸方法を利用する場合にも、ＤＮＡを効率良く細胞に
取り込ませるために、グリセロール処理を行ったり、Ｄ
ＮＡを封入した膜と細胞との融合性を高めるためにポリ
エチレングリコール処理等を行わねばならないからであ
る。

上記の諸方法の内で、生体への適用の可能性があるもの
としてはレトロウィルスをベクターに用いた感染による
遺伝子導入法及びリポソーム法があるが、レトロウィル
スを用いた場合には内在性のウィルスと組換えを起こし
て新たな感染性のウィルスを生じる危険性があり、又リ
ポソーム法においてはリポソーム単独では各種細胞への
遺伝子の導入効率が低いのが実情である。

尚、上記のりボフェクション法はカチオン性脂質として
Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）−プロピル］−
Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドを、又
その他の成分としてジオレオイルホスファチジルエタノ
ールアミンを用いているので、脂肪酸側鎖の不飽和性に
起因して脂質の過酸化が生じ易く、従って細胞への毒性
や保存中の劣化が懸念される。

（課題を解決するための手段及び作用）本発明者等は、
効率の良い細胞への遺伝子導入法を開発するために、生
体への応用が可能なこと、細胞に対する毒性がないこと
、収率が良好なこと及び保存時の安定性等を考慮して研
究を重ねた結果、細胞への遺伝子導入法として、炭素原
子数８−１８個の飽和した直鎖又は分岐鎖を有し且つ少
くとも　１個のカチオン性親水基を有する脂質又はその
薬理学的に許容される塩を構成成分とするリポソーム乃
至脂質懸濁液を用いることにより、高率で遺伝子を細胞
に導入し得ることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。

上記のカチオン性脂質としてはジステアリルアミン、Ｎ
−メチル−Ｎ−ジドデシルアミン、ジメチルジステアリ
ルアンモニウムブロマイド、０．Ｏ゛−シトデカノイル
−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジェタ
ノールアミンクロライド、０，０°−ジパルミトイル−
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジェタノ
ールアミンクロライド、Ｎ−（αトリメチルアンモニオ
アセチル）−ジドデシルーログルタメートクロライド等
を例示することができる。上記のカチオン性脂質の他に
第二の脂質成分を用いることもでき、この第二成分とし
ては燐脂質、例えばホスファチジルコリン（例えば、卵
黄由来のもの）、シミリストイルホスファチジルコリン
、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイ
ルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン等を例示することができる
。

本発明方法においては、カチオン性脂質が用いられてい
るために、負に荷電している細胞、特に哺乳動物細胞の
膜への付着及び該膜からの細胞内への取り込みが容易と
なる。更に、正に荷電しているためにＤＮＡとの静電気
的結合が良好となるので、リポソームへのＤＮＡの包埋
乃至結合量が大となり、又脂質懸濁液の場合には懸濁脂
質への結合量が高くなる。

尚、リポソームとして形成される場合に、その大きさや
、脂質二重層の数に格別の制限はなく、又脂質懸濁液の
場合にはＯ／Ｗ型になされる。リポソーム乃至脂質懸濁
液を調製する際に、カチオン性脂質とその他の構成成分
との組み合わせ及び調製方法自体は任意であるが、リポ
ソーム内に遺伝子を封入する際には、逆相蒸発法を利用
するのが好ましい。何故ならば染色体、プラスミドＤＮ
Ａ、　ｍＲＮＡ等の遺伝情報物質が存在する場合には、
その分解や失活を避けるために操作条件の温和なことが
要求されるが、逆相蒸発法は、この要求を満たし、又カ
チオン性脂質を構成成分とじて逆相蒸発法により遺伝子
包埋りボソームを調製した場合に、カチオン性脂質とＤ
ＮＡとの静電気的結合も相まって、従来法の１０−５０
倍量ものＤＮＡが包埋可能となるからである。調製され
たリポソームの表面に、更にＤＮＡを結合させることに
より、細胞への遺伝子導入効率を向上させることができ
、又特定の細胞へのターゲツティングを目的とする場合
には、リポソーム表面に抗体を結合させることもできる
。

（実施例等） 次に、参考例及び実施例により本発明を更に詳細に且つ
具体的に説明する。

１１鮭ユ （超音波処理法によるリポソーム又は脂質懸濁液調製の
概要） カチオン性脂質、又は該カチオン性脂質と燐脂質の有機
溶媒溶液（クロロホルム、メタノール等）をナシ型フラ
スコに入れ、ロータリーエバポレーターを用い溶媒を減
圧除去し、フラスコ底部ガラス壁面に脂質薄膜を形成さ
せる。更に、減圧下にデシケータ−内に放置して有機溶
媒を完全に除去した後に、滅菌したダルベツコ燐酸緩衝
生理食塩水等の水溶液を加え振盪膨潤させ、ポルテック
スミキサーを用い薄膜を剥がす。次いで、窒素気流下に
５−４０℃でプローブ型ソニヶーターで、出力２５−６
０Ｗ、５０％パルスの断続的照射を１−２０分間行って
リポソーム乃至脂質懸濁液を調製する。

参考例２ （リポソームの具体的調製法） Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシ
ル−〇−グルタメートクロライド４μｍｏｌ、シミリス
トイルホスファチジルコリン２μｍｏｌ　をクロロホル
ムに溶解してナシ型フラスコにいれ、ロータリーエバポ
レーターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス内
壁面に脂質薄膜を作成し、デシケータ−中で減圧乾燥さ
せた。これに２．４ｍｌの滅菌ダルベツコ燐酸緩衝生理
食塩水を加え振盪膨潤させ、次いでポルテックスミキサ
ーを用い薄膜を剥がした。続いて、窒素気流下に２０℃
でプローブ型ソニケーターにより、出力３０Ｗ、５０％
パルスの断続的照射を２分間行って小さな一枚膜リポソ
ームを調製した。

Ｋ１鮭ユ 参考例１及び２に従って調製した種々のリポソーム乃至
脂質懸濁液５−２５０ｎｍｏｌと　ＳＶ４０前期プロモ
ーターにヒトβ型インターフェロン構造遺伝子を結合し
たプラスミドＰＳＶ２１ＦＮβ（’２μｇ）を混合し、
これを　Ｉ　ｘ　１０５個ノＳＶ４０で形質転換された
繊維芽様のサル腎臓細胞（ＣＯ３−１）上の１０％牛脂
児血清含有ダルベツコＭＥＭ培地（２ｍｌ）に添加して
細胞を培養した。１６時間後に培地の交換を行った後、
７２時間後に培地を採取し、培地中に含まれるヒトβ型
インターフェロン量を酵素免疫定量法により測定し、本
発明方法による遺伝子導入の効果を測定した。結果は下
記の表１に示される通りであった。

尚、表１並びに後記の表２及び表３に記載の符号乃至略
号は下記の化合物を意味している。

Ａ−Ｆ：カチオン性脂質であって Ａニジステアリルアミン。

Ｉｔ、　　Ｎ−メチル−Ｎ−ジドデシルアミン。

Ｃニジメチルジステアリルアンモニウムブロマイド。

Ｄ　；　０，０’−シトデカノイル−Ｎ−（α−トリメ
チルアンモニオアセチル）−ジェタノールアミンクロラ
イド Ｅ　；　０，０−ジパルミトイル＝Ｎ−（α−トリメチ
ルアンモニオアセチル）−ジェタノールアミンクロライ
ド。

Ｆ　、　Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−
ジドデシル−〇−グルタメートクロライド。

ＰＣ，ＤＭＰＣ，口ＰＰＣ，ＰＰＥ、　ＯＰＥ　：燐脂
質であッテＰＣ；　　ホスファチジルコリン（卵黄由来
）ＤＭＰＣ、シミリストイルホスファチジルコリン。

ＤＰＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン ＝９ この表１から明らかなように、各種のカチオン性脂質を
含有する種々のリポソーム乃至脂質懸濁液を用いること
により細胞への遺伝子導入を効率良く行うことができ、
その結果インターフェロンが発現し、又第二の脂質成分
としても飽和タイプのものを用いることにより細胞への
遺伝子導入を良好に行い得ることが判明した。

尚、プラスミドＤＮＡを単独で用いたり、或はプラスミ
ドＤＮＡを混合していないリポソーム単独を用いた場合
には、インターフェロンの発現は認められなかった。

Ｋ１鮭ユ 参考例２に従って調製したリポソーム　１００１００ｎ
とプラスミドｐＳＶ２ＩＦＮβ　（２μｇ）とを混合し
、２ｘｌＯ’個の浮遊細胞である前骨髄球性白血病細胞
（ＨＬ６０）を含む５ｍｌのｌＯ％牛脂児血清含有ＲＰ
Ｍ１１６４０培地に、上記の混合物を添加した。４８時
間培養した後に培地を採取し、培地中に含まれるヒトβ
型インターフェロン量を酵素免疫定量法により測定した
。その結果、浮遊細胞においても遺伝子が導入され、６
０　ＩＵ／ｍｌのインターフェロン活性が認められた。

１１鮭ユ （逆相蒸発法による遺伝子包埋りボソーム調製の概要） カチオン性脂質及び燐脂質の有機溶媒（クロロホルム、
メタノール等）溶液をナシ型フラスコに入れ、ロータリ
ーエバポレーターを用い溶媒を減圧除去し、フラスコ内
壁面に脂質薄膜を形成させる。更に減圧下にデシケータ
−内に放置して完全に有機溶媒を減圧除去する。この脂
質薄膜をジエチルエーテルと少量のクロロホルムにより
溶解した後に、ＤＮＡを添加した滅菌ダルベツコ燐酸緩
衝生理食塩水を添加し、超音波処理して乳化させる。こ
の乳化試料から有機溶媒をロータリーエバポレーターに
て減圧除去し、試料がペースト状になった時点で、５％
グリセロールを含有する滅菌ダルベツコ燐酸緩衝生理食
塩水を添加して攪拌し、再びロータリーエバポレーター
を用いて残余の有機溶媒を減圧除去してリポソームを調
製する。リポソームに包埋されなかったＤＮＡはフィコ
ールバクの密度勾配遠心分離法にて除去するか、又はデ
オキシリボヌクレアーゼにて分解除去する。

吸考１ （逆相蒸発法による遺伝子包埋りボソーム調製の具体例
〉 Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシ
ル−〇−グルタメートクロライド４μｍｏｌ及びシミリ
ストイルホスファチジルコリン２μｍｏｌ　をクロロホ
ルムに溶解してナシ型フラスコに入れ、ロータリーエバ
ポレーターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス
内壁面に脂質薄膜を作成し、デシケータ−中で減圧乾燥
させた。０．５ｍｌのジエチルエーテルと　０．１ｍｌ
のクロロホルムとを添加して上記の脂質薄膜を溶解した
後に、１００μｇのＤＮＡを添加した０、１７ｍ１の滅
菌ダルベツコ燐酸緩衝生理食塩水を加えて、約６０秒間
超音波処理を行い乳化させた。この乳化試料から有機溶
媒をロータリーエバポレーターにより　４１ｉ０ｍｍＨ
ｇで減圧除去し、試料がペースト状になった時点で０．
１７ｍ１の５％グリセロールを含有する滅菌ダルベツコ
燐酸緩衝生理食塩水を添加して攪拌し、再びロータリー
エバポレーターを用いて約１５０ｍｍＨｇで残余の有機
溶媒を減圧除去してリポソームを調製した。

リポソームに包埋されなかったＤＮＡについてはデオキ
シリボヌクレアーゼ１００　ｕｎｉｔｓ／ｍｌにて分解
除去した。

Ｋ１鮭ユ 参考例４に従ってＳＶ４０後期プロモーターにラット肝
臓グロノラクトン酸化酵素ｃＤＮＡを結合したプラスミ
ドＤＮＡ包埋りボソームを調製し、脂質量として８０−
６００ｎｍｏｌの上記リポソームを約１ｘ１０５個のＳ
Ｖ４０で形質転換されたサル腎臓細胞（ＣＯＳ−１）上
の１０％牛脂児血清含有ダルベツコＭＥＭ培地（２ｍｌ
　＞に添加して培養し、１６時間後に培地の交換を行っ
た。７２時間後に細胞をアセトン：メタノール（１：Ｈ
で固定後、細胞内で発現したグロノラクトン酸化酵素を
酵素免疫染色法により検出した。結果は下記の表２に示
されている。

表−λ 表２に示されているように、プラスミドＤＮＡを包埋し
たリポソームを用いても本発明方法による細胞への遺伝
子導入を行うことができる。

尚、プラスミドＤＮＡ単独又はプラスミドＤＮＡを包埋
していないリポソーム単独を用いた場合には、グロノラ
クトン酸化酵素の発現は認められなかった。

夾舊％Ｊ　４ 参考例４に従って５Ｖ４０　訂期プロモーターにヒトβ
型インターフェロン構造遺伝子を結合したプラスミドＤ
ＮＡ包埋りポソームを調製し、脂質量として１３−１０
０１００ｎの上記リポソームを１　ｘ　１０５個のサル
の腎臓細胞（ＣＯ！Ｊ−１）上の１０％牛脂児血清含有
ダルベツコＭＥＭ培地（２ｍｌ）に添加して培養し、１
６時間後に培地の交換を行った。７２時間後に培地を採
取し、培地中に含まれるヒトβ型インターフェロン量を
酵素免疫定量法により測定し、本発明方法による遺伝子
導入の効果を測定した。結果は下記の表３に示される通
りであり、カチオン性脂質と燐脂質とにより調製された
プラスミドＤＮＡ包埋リポソームによれば遺伝子の導入
が行われ、インターフェロンの発現することが判明した
。

尚、プラスミドＤＮＡ単独又はプラスミドＤＮＡを包埋
していないリポソーム単独を用いた場合には、インター
フェロンの発現が認められなかった。

表」− （注、脂質組成はＦ　：　ＤＭＰＣであり、そのモル比
は２：ｌである） （発明の効果） 細胞への遺伝子導入法において、本発明によれば、炭素
原子数８−１８個の飽和した直鎖又は分枝鎖を有し且つ
カチオン性親水基を少くとも　１個有している脂質を必
須構成成分とするリポソーム乃至脂質懸濁液が遺伝子の
包埋用乃至結合用担体として用いられる結果、細胞への
遺伝子導入効率が著しく向上する。遺伝子をリポソーム
に包埋させる場合に、リポソームの調製法として逆相蒸
発法を適用すれば、その包埋効率を更に向上させること
ができる。

尚、上記のカチオン性脂質は脂肪酸側鎖が飽和状態にあ
るので、過酸化が生じ難く、従って保存安定性に優れ、
又細胞に対する毒性も生じないので、本発明方法は生体
への適用が可能となる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）炭素原子数８−１８個の飽和した直鎖又は分岐鎖
   を有し且つ少くとも１個のカチオン性親水基を有する脂
   質又はその薬理学的に許容される塩を構成成分とするリ
   ポソーム乃至脂質懸濁液を用いることを特徴とする、細
   胞への遺伝子導入法。
2. （２）リポソームの調製を逆相蒸発法により行うことを
   特徴とする、請求項１に記載の細胞への遺伝子導入法