JPH02135092A - 細胞への遺伝子導入法 - Google Patents
細胞への遺伝子導入法Info
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- JPH02135092A JPH02135092A JP28573888A JP28573888A JPH02135092A JP H02135092 A JPH02135092 A JP H02135092A JP 28573888 A JP28573888 A JP 28573888A JP 28573888 A JP28573888 A JP 28573888A JP H02135092 A JPH02135092 A JP H02135092A
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は細胞への遺伝子導入法に係る。
(従来の技術)
遺伝子工学的な手法の内で、遺伝子を細胞内に導入する
技術は、特に遺伝子疾患の治療をめざした研究において
極めて重要なものである。哺乳動物細胞への有用な遺伝
子の導入とその発現を行うために従来から種々の方法が
研究されてきた。例えば燐酸カルシウム共沈法[F、
L、 Graham等r Virology」第52巻
、第456頁(1973年)1、DUAE−dextr
an法[J、 Banarji等rce11」第33巻
、第729頁(1983年)1、プロトプラスト融合法
(W、 5chaffner、 r Proc。
技術は、特に遺伝子疾患の治療をめざした研究において
極めて重要なものである。哺乳動物細胞への有用な遺伝
子の導入とその発現を行うために従来から種々の方法が
研究されてきた。例えば燐酸カルシウム共沈法[F、
L、 Graham等r Virology」第52巻
、第456頁(1973年)1、DUAE−dextr
an法[J、 Banarji等rce11」第33巻
、第729頁(1983年)1、プロトプラスト融合法
(W、 5chaffner、 r Proc。
Natl、 Acad、 Set、 USAJ第77巻
、第2163頁(19110年)1、マイクロインジェ
クション法IF。
、第2163頁(19110年)1、マイクロインジェ
クション法IF。
Yamamoto等rExp、 Ce1l Re5g第
142巻、第79頁(1982年)1、電気穿孔法[H
,Potter等r Proc、 Natl、 Aca
d、 Set、 USAJ第81巻、第7161頁(1
984年)1、赤血球ゴースト法[M。
142巻、第79頁(1982年)1、電気穿孔法[H
,Potter等r Proc、 Natl、 Aca
d、 Set、 USAJ第81巻、第7161頁(1
984年)1、赤血球ゴースト法[M。
Furusawa、 r Int、 Rev、 Cyt
ol、1第62巻、第29頁(1980年)1、レトロ
ウィルスをベクターに用いた感染による方法[C,L、
Cepko等rcell」第37巻、第1053頁(
1984年)]、リポソーム法[R,Fraley等r
J、 Biol、 ehem、 」第255巻、第1
0431頁(1980年)]、リボフェクション法[p
、 1. Felgner等r Proc、 Natl
、 Acad、 Sci。
ol、1第62巻、第29頁(1980年)1、レトロ
ウィルスをベクターに用いた感染による方法[C,L、
Cepko等rcell」第37巻、第1053頁(
1984年)]、リポソーム法[R,Fraley等r
J、 Biol、 ehem、 」第255巻、第1
0431頁(1980年)]、リボフェクション法[p
、 1. Felgner等r Proc、 Natl
、 Acad、 Sci。
USAJ第84巻、第7413頁(1987年)1等の
方法がある。
方法がある。
(発明が解決しようとする課題)
従来提案されてきた細胞への遺伝子の導入法の大部分の
ものは生体への適用に問題を有している。即ち、例えば
マイクロインジェクション法を利用する場合には細胞核
に直接DNAを注入しなければならず、電気穿孔法を利
用する場合には高電圧の且つ短時間のパルスにより細胞
膜に一過性の孔を形成せねばならないからであり、又他
の諸方法を利用する場合にも、DNAを効率良く細胞に
取り込ませるために、グリセロール処理を行ったり、D
NAを封入した膜と細胞との融合性を高めるためにポリ
エチレングリコール処理等を行わねばならないからであ
る。
ものは生体への適用に問題を有している。即ち、例えば
マイクロインジェクション法を利用する場合には細胞核
に直接DNAを注入しなければならず、電気穿孔法を利
用する場合には高電圧の且つ短時間のパルスにより細胞
膜に一過性の孔を形成せねばならないからであり、又他
の諸方法を利用する場合にも、DNAを効率良く細胞に
取り込ませるために、グリセロール処理を行ったり、D
NAを封入した膜と細胞との融合性を高めるためにポリ
エチレングリコール処理等を行わねばならないからであ
る。
上記の諸方法の内で、生体への適用の可能性があるもの
としてはレトロウィルスをベクターに用いた感染による
遺伝子導入法及びリポソーム法があるが、レトロウィル
スを用いた場合には内在性のウィルスと組換えを起こし
て新たな感染性のウィルスを生じる危険性があり、又リ
ポソーム法においてはリポソーム単独では各種細胞への
遺伝子の導入効率が低いのが実情である。
としてはレトロウィルスをベクターに用いた感染による
遺伝子導入法及びリポソーム法があるが、レトロウィル
スを用いた場合には内在性のウィルスと組換えを起こし
て新たな感染性のウィルスを生じる危険性があり、又リ
ポソーム法においてはリポソーム単独では各種細胞への
遺伝子の導入効率が低いのが実情である。
尚、上記のりボフェクション法はカチオン性脂質として
N−[1−(2,3−ジオレイロキシ)−プロピル]−
N、N、N−トリメチルアンモニウムクロライドを、又
その他の成分としてジオレオイルホスファチジルエタノ
ールアミンを用いているので、脂肪酸側鎖の不飽和性に
起因して脂質の過酸化が生じ易く、従って細胞への毒性
や保存中の劣化が懸念される。
N−[1−(2,3−ジオレイロキシ)−プロピル]−
N、N、N−トリメチルアンモニウムクロライドを、又
その他の成分としてジオレオイルホスファチジルエタノ
ールアミンを用いているので、脂肪酸側鎖の不飽和性に
起因して脂質の過酸化が生じ易く、従って細胞への毒性
や保存中の劣化が懸念される。
(課題を解決するための手段及び作用)本発明者等は、
効率の良い細胞への遺伝子導入法を開発するために、生
体への応用が可能なこと、細胞に対する毒性がないこと
、収率が良好なこと及び保存時の安定性等を考慮して研
究を重ねた結果、細胞への遺伝子導入法として、炭素原
子数8−18個の飽和した直鎖又は分岐鎖を有し且つ少
くとも 1個のカチオン性親水基を有する脂質又はその
薬理学的に許容される塩を構成成分とするリポソーム乃
至脂質懸濁液を用いることにより、高率で遺伝子を細胞
に導入し得ることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
効率の良い細胞への遺伝子導入法を開発するために、生
体への応用が可能なこと、細胞に対する毒性がないこと
、収率が良好なこと及び保存時の安定性等を考慮して研
究を重ねた結果、細胞への遺伝子導入法として、炭素原
子数8−18個の飽和した直鎖又は分岐鎖を有し且つ少
くとも 1個のカチオン性親水基を有する脂質又はその
薬理学的に許容される塩を構成成分とするリポソーム乃
至脂質懸濁液を用いることにより、高率で遺伝子を細胞
に導入し得ることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
上記のカチオン性脂質としてはジステアリルアミン、N
−メチル−N−ジドデシルアミン、ジメチルジステアリ
ルアンモニウムブロマイド、0.O゛−シトデカノイル
−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジェタ
ノールアミンクロライド、0,0°−ジパルミトイル−
N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジェタノ
ールアミンクロライド、N−(αトリメチルアンモニオ
アセチル)−ジドデシルーログルタメートクロライド等
を例示することができる。上記のカチオン性脂質の他に
第二の脂質成分を用いることもでき、この第二成分とし
ては燐脂質、例えばホスファチジルコリン(例えば、卵
黄由来のもの)、シミリストイルホスファチジルコリン
、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイ
ルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン等を例示することができる
。
−メチル−N−ジドデシルアミン、ジメチルジステアリ
ルアンモニウムブロマイド、0.O゛−シトデカノイル
−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジェタ
ノールアミンクロライド、0,0°−ジパルミトイル−
N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジェタノ
ールアミンクロライド、N−(αトリメチルアンモニオ
アセチル)−ジドデシルーログルタメートクロライド等
を例示することができる。上記のカチオン性脂質の他に
第二の脂質成分を用いることもでき、この第二成分とし
ては燐脂質、例えばホスファチジルコリン(例えば、卵
黄由来のもの)、シミリストイルホスファチジルコリン
、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイ
ルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン等を例示することができる
。
本発明方法においては、カチオン性脂質が用いられてい
るために、負に荷電している細胞、特に哺乳動物細胞の
膜への付着及び該膜からの細胞内への取り込みが容易と
なる。更に、正に荷電しているためにDNAとの静電気
的結合が良好となるので、リポソームへのDNAの包埋
乃至結合量が大となり、又脂質懸濁液の場合には懸濁脂
質への結合量が高くなる。
るために、負に荷電している細胞、特に哺乳動物細胞の
膜への付着及び該膜からの細胞内への取り込みが容易と
なる。更に、正に荷電しているためにDNAとの静電気
的結合が良好となるので、リポソームへのDNAの包埋
乃至結合量が大となり、又脂質懸濁液の場合には懸濁脂
質への結合量が高くなる。
尚、リポソームとして形成される場合に、その大きさや
、脂質二重層の数に格別の制限はなく、又脂質懸濁液の
場合にはO/W型になされる。リポソーム乃至脂質懸濁
液を調製する際に、カチオン性脂質とその他の構成成分
との組み合わせ及び調製方法自体は任意であるが、リポ
ソーム内に遺伝子を封入する際には、逆相蒸発法を利用
するのが好ましい。何故ならば染色体、プラスミドDN
A、 mRNA等の遺伝情報物質が存在する場合には、
その分解や失活を避けるために操作条件の温和なことが
要求されるが、逆相蒸発法は、この要求を満たし、又カ
チオン性脂質を構成成分とじて逆相蒸発法により遺伝子
包埋りボソームを調製した場合に、カチオン性脂質とD
NAとの静電気的結合も相まって、従来法の10−50
倍量ものDNAが包埋可能となるからである。調製され
たリポソームの表面に、更にDNAを結合させることに
より、細胞への遺伝子導入効率を向上させることができ
、又特定の細胞へのターゲツティングを目的とする場合
には、リポソーム表面に抗体を結合させることもできる
。
、脂質二重層の数に格別の制限はなく、又脂質懸濁液の
場合にはO/W型になされる。リポソーム乃至脂質懸濁
液を調製する際に、カチオン性脂質とその他の構成成分
との組み合わせ及び調製方法自体は任意であるが、リポ
ソーム内に遺伝子を封入する際には、逆相蒸発法を利用
するのが好ましい。何故ならば染色体、プラスミドDN
A、 mRNA等の遺伝情報物質が存在する場合には、
その分解や失活を避けるために操作条件の温和なことが
要求されるが、逆相蒸発法は、この要求を満たし、又カ
チオン性脂質を構成成分とじて逆相蒸発法により遺伝子
包埋りボソームを調製した場合に、カチオン性脂質とD
NAとの静電気的結合も相まって、従来法の10−50
倍量ものDNAが包埋可能となるからである。調製され
たリポソームの表面に、更にDNAを結合させることに
より、細胞への遺伝子導入効率を向上させることができ
、又特定の細胞へのターゲツティングを目的とする場合
には、リポソーム表面に抗体を結合させることもできる
。
(実施例等)
次に、参考例及び実施例により本発明を更に詳細に且つ
具体的に説明する。
具体的に説明する。
11鮭ユ
(超音波処理法によるリポソーム又は脂質懸濁液調製の
概要) カチオン性脂質、又は該カチオン性脂質と燐脂質の有機
溶媒溶液(クロロホルム、メタノール等)をナシ型フラ
スコに入れ、ロータリーエバポレーターを用い溶媒を減
圧除去し、フラスコ底部ガラス壁面に脂質薄膜を形成さ
せる。更に、減圧下にデシケータ−内に放置して有機溶
媒を完全に除去した後に、滅菌したダルベツコ燐酸緩衝
生理食塩水等の水溶液を加え振盪膨潤させ、ポルテック
スミキサーを用い薄膜を剥がす。次いで、窒素気流下に
5−40℃でプローブ型ソニヶーターで、出力25−6
0W、50%パルスの断続的照射を1−20分間行って
リポソーム乃至脂質懸濁液を調製する。
概要) カチオン性脂質、又は該カチオン性脂質と燐脂質の有機
溶媒溶液(クロロホルム、メタノール等)をナシ型フラ
スコに入れ、ロータリーエバポレーターを用い溶媒を減
圧除去し、フラスコ底部ガラス壁面に脂質薄膜を形成さ
せる。更に、減圧下にデシケータ−内に放置して有機溶
媒を完全に除去した後に、滅菌したダルベツコ燐酸緩衝
生理食塩水等の水溶液を加え振盪膨潤させ、ポルテック
スミキサーを用い薄膜を剥がす。次いで、窒素気流下に
5−40℃でプローブ型ソニヶーターで、出力25−6
0W、50%パルスの断続的照射を1−20分間行って
リポソーム乃至脂質懸濁液を調製する。
参考例2
(リポソームの具体的調製法)
N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジドデシ
ル−〇−グルタメートクロライド4μmol、シミリス
トイルホスファチジルコリン2μmol をクロロホル
ムに溶解してナシ型フラスコにいれ、ロータリーエバポ
レーターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス内
壁面に脂質薄膜を作成し、デシケータ−中で減圧乾燥さ
せた。これに2.4mlの滅菌ダルベツコ燐酸緩衝生理
食塩水を加え振盪膨潤させ、次いでポルテックスミキサ
ーを用い薄膜を剥がした。続いて、窒素気流下に20℃
でプローブ型ソニケーターにより、出力30W、50%
パルスの断続的照射を2分間行って小さな一枚膜リポソ
ームを調製した。
ル−〇−グルタメートクロライド4μmol、シミリス
トイルホスファチジルコリン2μmol をクロロホル
ムに溶解してナシ型フラスコにいれ、ロータリーエバポ
レーターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス内
壁面に脂質薄膜を作成し、デシケータ−中で減圧乾燥さ
せた。これに2.4mlの滅菌ダルベツコ燐酸緩衝生理
食塩水を加え振盪膨潤させ、次いでポルテックスミキサ
ーを用い薄膜を剥がした。続いて、窒素気流下に20℃
でプローブ型ソニケーターにより、出力30W、50%
パルスの断続的照射を2分間行って小さな一枚膜リポソ
ームを調製した。
K1鮭ユ
参考例1及び2に従って調製した種々のリポソーム乃至
脂質懸濁液5−250nmolと SV40前期プロモ
ーターにヒトβ型インターフェロン構造遺伝子を結合し
たプラスミドPSV21FNβ(’2μg)を混合し、
これを I x 105個ノSV40で形質転換された
繊維芽様のサル腎臓細胞(CO3−1)上の10%牛脂
児血清含有ダルベツコMEM培地(2ml)に添加して
細胞を培養した。16時間後に培地の交換を行った後、
72時間後に培地を採取し、培地中に含まれるヒトβ型
インターフェロン量を酵素免疫定量法により測定し、本
発明方法による遺伝子導入の効果を測定した。結果は下
記の表1に示される通りであった。
脂質懸濁液5−250nmolと SV40前期プロモ
ーターにヒトβ型インターフェロン構造遺伝子を結合し
たプラスミドPSV21FNβ(’2μg)を混合し、
これを I x 105個ノSV40で形質転換された
繊維芽様のサル腎臓細胞(CO3−1)上の10%牛脂
児血清含有ダルベツコMEM培地(2ml)に添加して
細胞を培養した。16時間後に培地の交換を行った後、
72時間後に培地を採取し、培地中に含まれるヒトβ型
インターフェロン量を酵素免疫定量法により測定し、本
発明方法による遺伝子導入の効果を測定した。結果は下
記の表1に示される通りであった。
尚、表1並びに後記の表2及び表3に記載の符号乃至略
号は下記の化合物を意味している。
号は下記の化合物を意味している。
A−F:カチオン性脂質であって
Aニジステアリルアミン。
It、 N−メチル−N−ジドデシルアミン。
Cニジメチルジステアリルアンモニウムブロマイド。
D ; 0,0’−シトデカノイル−N−(α−トリメ
チルアンモニオアセチル)−ジェタノールアミンクロラ
イド E ; 0,0−ジパルミトイル=N−(α−トリメチ
ルアンモニオアセチル)−ジェタノールアミンクロライ
ド。
チルアンモニオアセチル)−ジェタノールアミンクロラ
イド E ; 0,0−ジパルミトイル=N−(α−トリメチ
ルアンモニオアセチル)−ジェタノールアミンクロライ
ド。
F 、 N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−
ジドデシル−〇−グルタメートクロライド。
ジドデシル−〇−グルタメートクロライド。
PC,DMPC,口PPC,PPE、 OPE :燐脂
質であッテPC; ホスファチジルコリン(卵黄由来
)DMPC、シミリストイルホスファチジルコリン。
質であッテPC; ホスファチジルコリン(卵黄由来
)DMPC、シミリストイルホスファチジルコリン。
DPPC、ジパルミトイルホスファチジルコリン
=9
この表1から明らかなように、各種のカチオン性脂質を
含有する種々のリポソーム乃至脂質懸濁液を用いること
により細胞への遺伝子導入を効率良く行うことができ、
その結果インターフェロンが発現し、又第二の脂質成分
としても飽和タイプのものを用いることにより細胞への
遺伝子導入を良好に行い得ることが判明した。
含有する種々のリポソーム乃至脂質懸濁液を用いること
により細胞への遺伝子導入を効率良く行うことができ、
その結果インターフェロンが発現し、又第二の脂質成分
としても飽和タイプのものを用いることにより細胞への
遺伝子導入を良好に行い得ることが判明した。
尚、プラスミドDNAを単独で用いたり、或はプラスミ
ドDNAを混合していないリポソーム単独を用いた場合
には、インターフェロンの発現は認められなかった。
ドDNAを混合していないリポソーム単独を用いた場合
には、インターフェロンの発現は認められなかった。
K1鮭ユ
参考例2に従って調製したリポソーム 100100n
とプラスミドpSV2IFNβ (2μg)とを混合し
、2xlO’個の浮遊細胞である前骨髄球性白血病細胞
(HL60)を含む5mlのlO%牛脂児血清含有RP
M11640培地に、上記の混合物を添加した。48時
間培養した後に培地を採取し、培地中に含まれるヒトβ
型インターフェロン量を酵素免疫定量法により測定した
。その結果、浮遊細胞においても遺伝子が導入され、6
0 IU/mlのインターフェロン活性が認められた。
とプラスミドpSV2IFNβ (2μg)とを混合し
、2xlO’個の浮遊細胞である前骨髄球性白血病細胞
(HL60)を含む5mlのlO%牛脂児血清含有RP
M11640培地に、上記の混合物を添加した。48時
間培養した後に培地を採取し、培地中に含まれるヒトβ
型インターフェロン量を酵素免疫定量法により測定した
。その結果、浮遊細胞においても遺伝子が導入され、6
0 IU/mlのインターフェロン活性が認められた。
11鮭ユ
(逆相蒸発法による遺伝子包埋りボソーム調製の概要)
カチオン性脂質及び燐脂質の有機溶媒(クロロホルム、
メタノール等)溶液をナシ型フラスコに入れ、ロータリ
ーエバポレーターを用い溶媒を減圧除去し、フラスコ内
壁面に脂質薄膜を形成させる。更に減圧下にデシケータ
−内に放置して完全に有機溶媒を減圧除去する。この脂
質薄膜をジエチルエーテルと少量のクロロホルムにより
溶解した後に、DNAを添加した滅菌ダルベツコ燐酸緩
衝生理食塩水を添加し、超音波処理して乳化させる。こ
の乳化試料から有機溶媒をロータリーエバポレーターに
て減圧除去し、試料がペースト状になった時点で、5%
グリセロールを含有する滅菌ダルベツコ燐酸緩衝生理食
塩水を添加して攪拌し、再びロータリーエバポレーター
を用いて残余の有機溶媒を減圧除去してリポソームを調
製する。リポソームに包埋されなかったDNAはフィコ
ールバクの密度勾配遠心分離法にて除去するか、又はデ
オキシリボヌクレアーゼにて分解除去する。
メタノール等)溶液をナシ型フラスコに入れ、ロータリ
ーエバポレーターを用い溶媒を減圧除去し、フラスコ内
壁面に脂質薄膜を形成させる。更に減圧下にデシケータ
−内に放置して完全に有機溶媒を減圧除去する。この脂
質薄膜をジエチルエーテルと少量のクロロホルムにより
溶解した後に、DNAを添加した滅菌ダルベツコ燐酸緩
衝生理食塩水を添加し、超音波処理して乳化させる。こ
の乳化試料から有機溶媒をロータリーエバポレーターに
て減圧除去し、試料がペースト状になった時点で、5%
グリセロールを含有する滅菌ダルベツコ燐酸緩衝生理食
塩水を添加して攪拌し、再びロータリーエバポレーター
を用いて残余の有機溶媒を減圧除去してリポソームを調
製する。リポソームに包埋されなかったDNAはフィコ
ールバクの密度勾配遠心分離法にて除去するか、又はデ
オキシリボヌクレアーゼにて分解除去する。
吸考1
(逆相蒸発法による遺伝子包埋りボソーム調製の具体例
〉 N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジドデシ
ル−〇−グルタメートクロライド4μmol及びシミリ
ストイルホスファチジルコリン2μmol をクロロホ
ルムに溶解してナシ型フラスコに入れ、ロータリーエバ
ポレーターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス
内壁面に脂質薄膜を作成し、デシケータ−中で減圧乾燥
させた。0.5mlのジエチルエーテルと 0.1ml
のクロロホルムとを添加して上記の脂質薄膜を溶解した
後に、100μgのDNAを添加した0、17m1の滅
菌ダルベツコ燐酸緩衝生理食塩水を加えて、約60秒間
超音波処理を行い乳化させた。この乳化試料から有機溶
媒をロータリーエバポレーターにより 41i0mmH
gで減圧除去し、試料がペースト状になった時点で0.
17m1の5%グリセロールを含有する滅菌ダルベツコ
燐酸緩衝生理食塩水を添加して攪拌し、再びロータリー
エバポレーターを用いて約150mmHgで残余の有機
溶媒を減圧除去してリポソームを調製した。
〉 N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジドデシ
ル−〇−グルタメートクロライド4μmol及びシミリ
ストイルホスファチジルコリン2μmol をクロロホ
ルムに溶解してナシ型フラスコに入れ、ロータリーエバ
ポレーターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス
内壁面に脂質薄膜を作成し、デシケータ−中で減圧乾燥
させた。0.5mlのジエチルエーテルと 0.1ml
のクロロホルムとを添加して上記の脂質薄膜を溶解した
後に、100μgのDNAを添加した0、17m1の滅
菌ダルベツコ燐酸緩衝生理食塩水を加えて、約60秒間
超音波処理を行い乳化させた。この乳化試料から有機溶
媒をロータリーエバポレーターにより 41i0mmH
gで減圧除去し、試料がペースト状になった時点で0.
17m1の5%グリセロールを含有する滅菌ダルベツコ
燐酸緩衝生理食塩水を添加して攪拌し、再びロータリー
エバポレーターを用いて約150mmHgで残余の有機
溶媒を減圧除去してリポソームを調製した。
リポソームに包埋されなかったDNAについてはデオキ
シリボヌクレアーゼ100 units/mlにて分解
除去した。
シリボヌクレアーゼ100 units/mlにて分解
除去した。
K1鮭ユ
参考例4に従ってSV40後期プロモーターにラット肝
臓グロノラクトン酸化酵素cDNAを結合したプラスミ
ドDNA包埋りボソームを調製し、脂質量として80−
600nmolの上記リポソームを約1x105個のS
V40で形質転換されたサル腎臓細胞(COS−1)上
の10%牛脂児血清含有ダルベツコMEM培地(2ml
>に添加して培養し、16時間後に培地の交換を行っ
た。72時間後に細胞をアセトン:メタノール(1:H
で固定後、細胞内で発現したグロノラクトン酸化酵素を
酵素免疫染色法により検出した。結果は下記の表2に示
されている。
臓グロノラクトン酸化酵素cDNAを結合したプラスミ
ドDNA包埋りボソームを調製し、脂質量として80−
600nmolの上記リポソームを約1x105個のS
V40で形質転換されたサル腎臓細胞(COS−1)上
の10%牛脂児血清含有ダルベツコMEM培地(2ml
>に添加して培養し、16時間後に培地の交換を行っ
た。72時間後に細胞をアセトン:メタノール(1:H
で固定後、細胞内で発現したグロノラクトン酸化酵素を
酵素免疫染色法により検出した。結果は下記の表2に示
されている。
表−λ
表2に示されているように、プラスミドDNAを包埋し
たリポソームを用いても本発明方法による細胞への遺伝
子導入を行うことができる。
たリポソームを用いても本発明方法による細胞への遺伝
子導入を行うことができる。
尚、プラスミドDNA単独又はプラスミドDNAを包埋
していないリポソーム単独を用いた場合には、グロノラ
クトン酸化酵素の発現は認められなかった。
していないリポソーム単独を用いた場合には、グロノラ
クトン酸化酵素の発現は認められなかった。
夾舊%J 4
参考例4に従って5V40 訂期プロモーターにヒトβ
型インターフェロン構造遺伝子を結合したプラスミドD
NA包埋りポソームを調製し、脂質量として13−10
0100nの上記リポソームを1 x 105個のサル
の腎臓細胞(CO!J−1)上の10%牛脂児血清含有
ダルベツコMEM培地(2ml)に添加して培養し、1
6時間後に培地の交換を行った。72時間後に培地を採
取し、培地中に含まれるヒトβ型インターフェロン量を
酵素免疫定量法により測定し、本発明方法による遺伝子
導入の効果を測定した。結果は下記の表3に示される通
りであり、カチオン性脂質と燐脂質とにより調製された
プラスミドDNA包埋リポソームによれば遺伝子の導入
が行われ、インターフェロンの発現することが判明した
。
型インターフェロン構造遺伝子を結合したプラスミドD
NA包埋りポソームを調製し、脂質量として13−10
0100nの上記リポソームを1 x 105個のサル
の腎臓細胞(CO!J−1)上の10%牛脂児血清含有
ダルベツコMEM培地(2ml)に添加して培養し、1
6時間後に培地の交換を行った。72時間後に培地を採
取し、培地中に含まれるヒトβ型インターフェロン量を
酵素免疫定量法により測定し、本発明方法による遺伝子
導入の効果を測定した。結果は下記の表3に示される通
りであり、カチオン性脂質と燐脂質とにより調製された
プラスミドDNA包埋リポソームによれば遺伝子の導入
が行われ、インターフェロンの発現することが判明した
。
尚、プラスミドDNA単独又はプラスミドDNAを包埋
していないリポソーム単独を用いた場合には、インター
フェロンの発現が認められなかった。
していないリポソーム単独を用いた場合には、インター
フェロンの発現が認められなかった。
表」−
(注、脂質組成はF : DMPCであり、そのモル比
は2:lである) (発明の効果) 細胞への遺伝子導入法において、本発明によれば、炭素
原子数8−18個の飽和した直鎖又は分枝鎖を有し且つ
カチオン性親水基を少くとも 1個有している脂質を必
須構成成分とするリポソーム乃至脂質懸濁液が遺伝子の
包埋用乃至結合用担体として用いられる結果、細胞への
遺伝子導入効率が著しく向上する。遺伝子をリポソーム
に包埋させる場合に、リポソームの調製法として逆相蒸
発法を適用すれば、その包埋効率を更に向上させること
ができる。
は2:lである) (発明の効果) 細胞への遺伝子導入法において、本発明によれば、炭素
原子数8−18個の飽和した直鎖又は分枝鎖を有し且つ
カチオン性親水基を少くとも 1個有している脂質を必
須構成成分とするリポソーム乃至脂質懸濁液が遺伝子の
包埋用乃至結合用担体として用いられる結果、細胞への
遺伝子導入効率が著しく向上する。遺伝子をリポソーム
に包埋させる場合に、リポソームの調製法として逆相蒸
発法を適用すれば、その包埋効率を更に向上させること
ができる。
尚、上記のカチオン性脂質は脂肪酸側鎖が飽和状態にあ
るので、過酸化が生じ難く、従って保存安定性に優れ、
又細胞に対する毒性も生じないので、本発明方法は生体
への適用が可能となる。
るので、過酸化が生じ難く、従って保存安定性に優れ、
又細胞に対する毒性も生じないので、本発明方法は生体
への適用が可能となる。
Claims (2)
- (1)炭素原子数8−18個の飽和した直鎖又は分岐鎖
を有し且つ少くとも1個のカチオン性親水基を有する脂
質又はその薬理学的に許容される塩を構成成分とするリ
ポソーム乃至脂質懸濁液を用いることを特徴とする、細
胞への遺伝子導入法。 - (2)リポソームの調製を逆相蒸発法により行うことを
特徴とする、請求項1に記載の細胞への遺伝子導入法
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63285738A JP2923296B2 (ja) | 1988-11-14 | 1988-11-14 | 細胞への遺伝子導入法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63285738A JP2923296B2 (ja) | 1988-11-14 | 1988-11-14 | 細胞への遺伝子導入法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02135092A true JPH02135092A (ja) | 1990-05-23 |
JP2923296B2 JP2923296B2 (ja) | 1999-07-26 |
Family
ID=17695406
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63285738A Expired - Lifetime JP2923296B2 (ja) | 1988-11-14 | 1988-11-14 | 細胞への遺伝子導入法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2923296B2 (ja) |
Cited By (11)
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WO2008001505A1 (fr) | 2006-06-30 | 2008-01-03 | Hokkaido System Science Co., Ltd. | Composition pour la pénétration d'acides nucléiques |
WO2008056623A1 (fr) | 2006-11-09 | 2008-05-15 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Composition pour l'introduction d'acide nucléique |
US7384923B2 (en) | 1999-05-14 | 2008-06-10 | Lipoxen Technologies Limited | Liposomes |
WO2014013995A1 (ja) * | 2012-07-16 | 2014-01-23 | 協和発酵キリン株式会社 | KRAS遺伝子発現抑制RNAi医薬組成物 |
-
1988
- 1988-11-14 JP JP63285738A patent/JP2923296B2/ja not_active Expired - Lifetime
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US7790696B2 (en) | 1996-09-13 | 2010-09-07 | Lipoxen Technologies Limited | Cationic liposomes containing immune response generating moieties |
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