JP2923296B2 - 細胞への遺伝子導入法 - Google Patents
細胞への遺伝子導入法Info
- Publication number
- JP2923296B2 JP2923296B2 JP63285738A JP28573888A JP2923296B2 JP 2923296 B2 JP2923296 B2 JP 2923296B2 JP 63285738 A JP63285738 A JP 63285738A JP 28573888 A JP28573888 A JP 28573888A JP 2923296 B2 JP2923296 B2 JP 2923296B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- liposome
- lipid
- gene
- gene transfer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は細胞への遺伝子導入法に係る。
（従来の技術） 遺伝子工学的な手法の内で、遺伝子を細胞内に導入す
る技術は、特に遺伝子疾患の治療をめざした研究におい
て極めて重要なものである。哺乳動物細胞への有用な遺
伝子の導入とその発現を行うために従来から種々の方法
が研究されてきた。例えば、燐酸カルシウム共沈法［F.
L.Graham等「Virology」第52巻、第456頁（1973
年）］、DEAE−daxtran法、［J.Banarji等「Cell」第33
巻、第729頁（1983年）］、プロトプラスト融合法［W.S
chaffner,「Proc.Natl.Acad.USA」第77巻、第2163頁（1
980年）］、マイクロインジェクション法［F.Yamamoto
等「Exp.Cell Res.」第142巻、第79頁（1982年）］、電
気穿孔法［H.Potter等「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」第81
巻、第7161頁（1984年）］、赤血球ゴースト法［M.Furu
sawa,「Int.Rev.Cytol.」第62巻、第29頁（1980
年）］、レトロウイルスをベクターに用いた感染による
方法［C.L.Cepko等「Cell」第37巻、第1053頁（1984
年）］、リポソーム法［R.Fraley等「J.Biol.Chem.」第
255巻、第10431頁（1980年）］、リポフェクション法
［P.L.Felgner等「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」第84巻、
第7413頁（1987年）］等の方法がある。
る技術は、特に遺伝子疾患の治療をめざした研究におい
て極めて重要なものである。哺乳動物細胞への有用な遺
伝子の導入とその発現を行うために従来から種々の方法
が研究されてきた。例えば、燐酸カルシウム共沈法［F.
L.Graham等「Virology」第52巻、第456頁（1973
年）］、DEAE−daxtran法、［J.Banarji等「Cell」第33
巻、第729頁（1983年）］、プロトプラスト融合法［W.S
chaffner,「Proc.Natl.Acad.USA」第77巻、第2163頁（1
980年）］、マイクロインジェクション法［F.Yamamoto
等「Exp.Cell Res.」第142巻、第79頁（1982年）］、電
気穿孔法［H.Potter等「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」第81
巻、第7161頁（1984年）］、赤血球ゴースト法［M.Furu
sawa,「Int.Rev.Cytol.」第62巻、第29頁（1980
年）］、レトロウイルスをベクターに用いた感染による
方法［C.L.Cepko等「Cell」第37巻、第1053頁（1984
年）］、リポソーム法［R.Fraley等「J.Biol.Chem.」第
255巻、第10431頁（1980年）］、リポフェクション法
［P.L.Felgner等「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」第84巻、
第7413頁（1987年）］等の方法がある。
（発明が解決しようとする課題） 従来提案されてきた細胞への遺伝子の導入法の大部分
のものは生体への適用に問題を有している。即ち、例え
ばマイクロインジェクション法を利用する場合には細胞
核に直接DNAを注入しなければならず、電気穿孔法を利
用する場合には高電圧の且つ短時間のパルスにより細胞
に一過性の孔を形成せねばならないからであり、又他の
諸方法を利用する場合にも、DNAを効率良く細胞に取り
込ませるために、グリセロール処理を行ったり、DNAを
投入した膜と細胞との融合性を高めるためにポリエチレ
ングリコール処理等を行わねばならないからである。
のものは生体への適用に問題を有している。即ち、例え
ばマイクロインジェクション法を利用する場合には細胞
核に直接DNAを注入しなければならず、電気穿孔法を利
用する場合には高電圧の且つ短時間のパルスにより細胞
に一過性の孔を形成せねばならないからであり、又他の
諸方法を利用する場合にも、DNAを効率良く細胞に取り
込ませるために、グリセロール処理を行ったり、DNAを
投入した膜と細胞との融合性を高めるためにポリエチレ
ングリコール処理等を行わねばならないからである。
上記の諸方法の内で、生体への適用の可能性があるも
のとしてはレイロウイルスをベクターに用いた感染によ
る遺伝子導入法及びリポソーム法があるが、レトロウイ
ルスを用いた場合には内在性のウイルスと組換えを起こ
して新たな感染症のウイルスを生じる危険性があり、又
リポソーム法においてはリポソーム単独では各種細胞へ
の遺伝子の導入効率が低いのが実情である。
のとしてはレイロウイルスをベクターに用いた感染によ
る遺伝子導入法及びリポソーム法があるが、レトロウイ
ルスを用いた場合には内在性のウイルスと組換えを起こ
して新たな感染症のウイルスを生じる危険性があり、又
リポソーム法においてはリポソーム単独では各種細胞へ
の遺伝子の導入効率が低いのが実情である。
尚、上記のリポフェクション法はカオチン性脂質とし
てＮ−［１−（2,3−ジオレイロキシ）プロピル］−N,
N,N−トリメチルアンモニウムクロライドを、又その他
の成分としてジオレオイルホスファチジルエタノールア
ミンを用いているので、脂肪酸側鎖の不飽和性に起因し
て脂質の過酸化が生じ易く、従って細胞への毒性や保存
中の劣化が懸念される。
てＮ−［１−（2,3−ジオレイロキシ）プロピル］−N,
N,N−トリメチルアンモニウムクロライドを、又その他
の成分としてジオレオイルホスファチジルエタノールア
ミンを用いているので、脂肪酸側鎖の不飽和性に起因し
て脂質の過酸化が生じ易く、従って細胞への毒性や保存
中の劣化が懸念される。
（課題を解決するための手段及び作用） 本発明者等は、効率の良い細胞への遺伝子導入法を開
発するために、生体への応用が可能なこと、細胞に対す
る毒性がないこと、収率が良好なこと及び保存時の安定
性等を考慮して研究を重ねた結果、細胞への遺伝子導入
法として、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）
−ジドデシル−Ｄ−グルタメート又はその薬理学的に許
容される塩を単独で、若しくは炭素原子数８−18個の飽
和した直鎖又は分岐鎖を有し且つ少くとも１個のカオチ
ン性親水基を有する脂質又はその薬理学的に許容される
塩と燐脂質とを構成成分とするリポソーム乃至脂質懸濁
液を用いることにより、高率で遺伝子を細胞に導入し得
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
発するために、生体への応用が可能なこと、細胞に対す
る毒性がないこと、収率が良好なこと及び保存時の安定
性等を考慮して研究を重ねた結果、細胞への遺伝子導入
法として、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）
−ジドデシル−Ｄ−グルタメート又はその薬理学的に許
容される塩を単独で、若しくは炭素原子数８−18個の飽
和した直鎖又は分岐鎖を有し且つ少くとも１個のカオチ
ン性親水基を有する脂質又はその薬理学的に許容される
塩と燐脂質とを構成成分とするリポソーム乃至脂質懸濁
液を用いることにより、高率で遺伝子を細胞に導入し得
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
上記のＮ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−
ジドデシル−Ｄ−グルタメート以外のカオチン性脂質及
びその塩としてはジステアリルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ
−ジドデシルアミン、ジメチルジステアリルアンモニウ
ムブロマイド、O,O′−ジドデカノイル−Ｎ−（α−ト
リメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンク
ロライド、O,O′−ジセパルミトイル−Ｎ−（α−トリ
メチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロ
ライド等を例示することができる。一方、上記の燐脂質
としてはホスファチジルコリン（例えば、卵黄由来のも
の）、ジミリスリトイルホスファチジルコリン、ジパル
ミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスフ
ァジチルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジ
ルエタノールアミン等を例示することができる。
ジドデシル−Ｄ−グルタメート以外のカオチン性脂質及
びその塩としてはジステアリルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ
−ジドデシルアミン、ジメチルジステアリルアンモニウ
ムブロマイド、O,O′−ジドデカノイル−Ｎ−（α−ト
リメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンク
ロライド、O,O′−ジセパルミトイル−Ｎ−（α−トリ
メチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロ
ライド等を例示することができる。一方、上記の燐脂質
としてはホスファチジルコリン（例えば、卵黄由来のも
の）、ジミリスリトイルホスファチジルコリン、ジパル
ミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスフ
ァジチルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジ
ルエタノールアミン等を例示することができる。
本発明方法においては、カオチン性脂質が用いられて
いるために、負に荷電している細胞、特に哺乳類細胞の
膜への付着及び該膜からの細胞内への取り組みが容易と
なる。更に、正に荷電しているためにDNAとの静電気的
結合が良好となるので、リポソームへのDNAの包埋乃至
結合量が大となり、又脂質懸濁液の場合には懸濁液への
結合量が高くなる。
いるために、負に荷電している細胞、特に哺乳類細胞の
膜への付着及び該膜からの細胞内への取り組みが容易と
なる。更に、正に荷電しているためにDNAとの静電気的
結合が良好となるので、リポソームへのDNAの包埋乃至
結合量が大となり、又脂質懸濁液の場合には懸濁液への
結合量が高くなる。
尚、リポソームとして形成される場合に、その大きさ
や、脂質二重層の数に格別の制限はなく、又脂質懸濁液
の場合にはO/W型になされる。リポソーム乃至脂質懸濁
液を調製する際に、カチオン性脂質とその他の構成成分
との組み合わせ及び調製方法自体は任意であるが、リポ
ソーム内に遺伝子を封入する際には、逆相蒸発法を利用
するのが好ましい。何故ならば染色体、プラスミドDN
A、mRNA等の遺伝情報物質が存在する場合には、その分
解や失活を避けるために操作条件の温和なことが要求さ
れるが、逆相蒸発法は、この要求を満たし、又カチオン
性脂質を構成成分として逆相蒸発法により遺伝子包埋リ
ポソームを調製した場合に、カチオン性脂質とDNAとの
静電気的結合も相まって、従来法の10−50倍量ものDNA
が包埋可能となるからである。調製されたりポソームの
表面に、更にDNAを結合させることにより、細胞への遺
伝子導入効率を向上させることができ、又特定の細胞へ
のターゲッティングを目的とする場合には、リポソーム
表面に抗体を結合させることもできる。
や、脂質二重層の数に格別の制限はなく、又脂質懸濁液
の場合にはO/W型になされる。リポソーム乃至脂質懸濁
液を調製する際に、カチオン性脂質とその他の構成成分
との組み合わせ及び調製方法自体は任意であるが、リポ
ソーム内に遺伝子を封入する際には、逆相蒸発法を利用
するのが好ましい。何故ならば染色体、プラスミドDN
A、mRNA等の遺伝情報物質が存在する場合には、その分
解や失活を避けるために操作条件の温和なことが要求さ
れるが、逆相蒸発法は、この要求を満たし、又カチオン
性脂質を構成成分として逆相蒸発法により遺伝子包埋リ
ポソームを調製した場合に、カチオン性脂質とDNAとの
静電気的結合も相まって、従来法の10−50倍量ものDNA
が包埋可能となるからである。調製されたりポソームの
表面に、更にDNAを結合させることにより、細胞への遺
伝子導入効率を向上させることができ、又特定の細胞へ
のターゲッティングを目的とする場合には、リポソーム
表面に抗体を結合させることもできる。
（実施例等） 次に、参考例及び実施例により本発明を更に詳細に且
つ具体的に説明する。
つ具体的に説明する。
参考例 １ （超音波処理法によるリポソーム又は脂質懸濁液調製の
概要） カチオン性脂質、又は該カチオン性脂質と燐脂質の有
機溶媒溶液（クロロホルム、メタノール等）をナシ型フ
ラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用い溶媒を
減圧除去し、フラスコ底部ガラス壁面に脂質薄膜を形成
させる。更に、減圧下にデシケーター内に放置して有機
溶媒を完全に除去した後に、減菌したダルベッコ燐酸緩
衝生理食塩水等の水溶液を加え振盪膨潤させ、ボルテッ
クスミキサーを用い薄膜を剥がす。次いで、窒素気流下
に５−40℃でプローブ型ソニーケーターで、出力25−60
W、50％パルスの断続的照射を１−20分間行ってリポソ
ーム乃至脂質懸濁液を調製する。
概要） カチオン性脂質、又は該カチオン性脂質と燐脂質の有
機溶媒溶液（クロロホルム、メタノール等）をナシ型フ
ラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用い溶媒を
減圧除去し、フラスコ底部ガラス壁面に脂質薄膜を形成
させる。更に、減圧下にデシケーター内に放置して有機
溶媒を完全に除去した後に、減菌したダルベッコ燐酸緩
衝生理食塩水等の水溶液を加え振盪膨潤させ、ボルテッ
クスミキサーを用い薄膜を剥がす。次いで、窒素気流下
に５−40℃でプローブ型ソニーケーターで、出力25−60
W、50％パルスの断続的照射を１−20分間行ってリポソ
ーム乃至脂質懸濁液を調製する。
参考例 ２ （リポソームの具体的調整法） Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデ
シル−Ｄ−グルタメートクロライド４μmol、ジミリス
トイルホスファチジルコリン２μmolをクロロホルムに
溶解してナシ型フラスコにいれ、ロータリーエバポレー
ターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス内壁面
に脂質薄膜を作成し、デシケーター中で減圧乾燥させ
た。これに2.4mlの減菌ダルベッコ燐酸緩衝整理食塩水
を加え振盪膨潤させ、次いでボルテックスミキサーを用
い薄膜を剥がした。続いて、窒素気流下に20℃でプロー
ブ型ソニーケーターにより、出力30W、50％パルスの断
続的照射を２分間行って小さな一枚膜リポソームを調製
した。
シル−Ｄ−グルタメートクロライド４μmol、ジミリス
トイルホスファチジルコリン２μmolをクロロホルムに
溶解してナシ型フラスコにいれ、ロータリーエバポレー
ターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス内壁面
に脂質薄膜を作成し、デシケーター中で減圧乾燥させ
た。これに2.4mlの減菌ダルベッコ燐酸緩衝整理食塩水
を加え振盪膨潤させ、次いでボルテックスミキサーを用
い薄膜を剥がした。続いて、窒素気流下に20℃でプロー
ブ型ソニーケーターにより、出力30W、50％パルスの断
続的照射を２分間行って小さな一枚膜リポソームを調製
した。
実施例 １ 参考例１及び２に従って調製した種々のリポソーム乃
至脂質懸濁液５−250nmolとSV40前期プロモーターにヒ
トβ型インターフェロン構造遺伝子を結合したプラスミ
ドpSV2IFNβ（２μｇ）を混合し、これを１×105個のSV
40で形質転換された繊維芽様のサル腎臓細胞（COS−
１）上の10％牛胎児血清含有ダルベッコMEM培地（2ml）
に添加して細胞を培養した。16時間後に培地の交換を行
った後、72時間後に培地を採取し、培地中に含まれるヒ
トβ型インターフェロン量を酸素免除定量法により測定
し、本発明方法による遺伝子導入の効果を測定した。結
果は下記の表１に示される通りであった。
至脂質懸濁液５−250nmolとSV40前期プロモーターにヒ
トβ型インターフェロン構造遺伝子を結合したプラスミ
ドpSV2IFNβ（２μｇ）を混合し、これを１×105個のSV
40で形質転換された繊維芽様のサル腎臓細胞（COS−
１）上の10％牛胎児血清含有ダルベッコMEM培地（2ml）
に添加して細胞を培養した。16時間後に培地の交換を行
った後、72時間後に培地を採取し、培地中に含まれるヒ
トβ型インターフェロン量を酸素免除定量法により測定
し、本発明方法による遺伝子導入の効果を測定した。結
果は下記の表１に示される通りであった。
尚、表１並びに後記の表２及び表３に記載の符号乃至
略号は下記の化合物を意味している。
略号は下記の化合物を意味している。
Ａ−F:カチオン性脂質であって A;ジステアリルアミン， B;N−メチル−Ｎ−ジドデシルアミン， C;ジメチルジステアリルアンモニウムブロマイド， D;O,O′−ジドデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアン
モニオアセチル）−ジエタノールアミンクロライド， E;O,O′−ジパルミトイル−Ｎ−（α−トリメチルアン
モニオアセチル）−ジエタノールアミンクロライド， F;N−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデ
シル−Ｄ−グルタメートクロライド． PC,DMPC,DPPC,PPE,OPE:燐樹脂であって PC;ホスファチジルコリン（卵黄由来）， DMPC;ジミリストイルホスファチジルコリン， DPPC;ジパルミトイルホスファチジルコリン， PPE;ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン， OPE;ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン． この表１から明らかなように、各種のカオチン性脂質
を含有する種々のリポソーム乃至脂質懸濁液を含有する
種々のリポソーム乃至脂質懸濁液を用いることにより細
胞への遺伝子導入を効率良く行うことができ、その結果
インターフェロンが発現し、又第二の脂質成分としても
飽和タイプのものを用いることにより細胞への遺伝子導
入を良好に行い得ることが判明した。
モニオアセチル）−ジエタノールアミンクロライド， E;O,O′−ジパルミトイル−Ｎ−（α−トリメチルアン
モニオアセチル）−ジエタノールアミンクロライド， F;N−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデ
シル−Ｄ−グルタメートクロライド． PC,DMPC,DPPC,PPE,OPE:燐樹脂であって PC;ホスファチジルコリン（卵黄由来）， DMPC;ジミリストイルホスファチジルコリン， DPPC;ジパルミトイルホスファチジルコリン， PPE;ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン， OPE;ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン． この表１から明らかなように、各種のカオチン性脂質
を含有する種々のリポソーム乃至脂質懸濁液を含有する
種々のリポソーム乃至脂質懸濁液を用いることにより細
胞への遺伝子導入を効率良く行うことができ、その結果
インターフェロンが発現し、又第二の脂質成分としても
飽和タイプのものを用いることにより細胞への遺伝子導
入を良好に行い得ることが判明した。
尚、プラスミドDNAを単独で用いたり、或はプラスミ
ドDNAを混合していないリポソーム単独を用いた場合に
は、インターフェロンの発現は認められなかった。
ドDNAを混合していないリポソーム単独を用いた場合に
は、インターフェロンの発現は認められなかった。
実施例 ２ 参考例２に従って調製したリポソーム100nmolとプラ
スミドpSV2IFNβ（２μｇ）とを混合し、２×105個の浮
遊細胞である前骨髄急性白血病細胞（HL60）を含む5ml
の10％牛胎児血清含有PRMI1640培地に、上記の混合物を
添加した。48時間培養した後に培値を採取し、培地中に
含まれるヒトβ型のインターフェロン量を酵素免疫定量
法により測定した。その結果、浮遊細胞においても遺伝
子が導入され、60IU/mlのインターフェロン活性が認め
られた。
スミドpSV2IFNβ（２μｇ）とを混合し、２×105個の浮
遊細胞である前骨髄急性白血病細胞（HL60）を含む5ml
の10％牛胎児血清含有PRMI1640培地に、上記の混合物を
添加した。48時間培養した後に培値を採取し、培地中に
含まれるヒトβ型のインターフェロン量を酵素免疫定量
法により測定した。その結果、浮遊細胞においても遺伝
子が導入され、60IU/mlのインターフェロン活性が認め
られた。
参考例 ３ （逆相蒸発法による遺伝子包埋リポソーム調製の概要） カチオン性脂質及び燐脂質の有機溶媒（クロロホル
ム、メタノール等）溶液をナシ型フラスコに入れ、ロー
タリーエバポレーターを用い溶媒を減圧除去し、フラス
コ内壁面に脂質薄膜を形成させる。更に減圧下にデシケ
ーター内に放置して完全に有機溶媒を減圧除去する。こ
の脂質薄膜をジエチルエーテルと小量のクロロホルムに
より溶解した後に、DNAを添加した減菌ダルベッコ燐酸
緩衝生理食塩水を添加し、超音波処理して乳化させる。
この乳化試料から有機溶媒をロータリーエバポレーター
にて減圧除去し、試料がペースト状になった時点で、５
％グリセロールを含有する減菌ダルベッコ燐酸緩衝生理
食塩水を添加して撹拌し、再びロータリーエバポレータ
ーを用いて残余の有機溶媒を減圧除去してリポソームを
調製する。リポソームに包埋されなかったDNAはフィコ
ールパクの密度勾配遠心分離法にて除去するか、又はデ
オキシリボヌクレアーゼに分解除去する。
ム、メタノール等）溶液をナシ型フラスコに入れ、ロー
タリーエバポレーターを用い溶媒を減圧除去し、フラス
コ内壁面に脂質薄膜を形成させる。更に減圧下にデシケ
ーター内に放置して完全に有機溶媒を減圧除去する。こ
の脂質薄膜をジエチルエーテルと小量のクロロホルムに
より溶解した後に、DNAを添加した減菌ダルベッコ燐酸
緩衝生理食塩水を添加し、超音波処理して乳化させる。
この乳化試料から有機溶媒をロータリーエバポレーター
にて減圧除去し、試料がペースト状になった時点で、５
％グリセロールを含有する減菌ダルベッコ燐酸緩衝生理
食塩水を添加して撹拌し、再びロータリーエバポレータ
ーを用いて残余の有機溶媒を減圧除去してリポソームを
調製する。リポソームに包埋されなかったDNAはフィコ
ールパクの密度勾配遠心分離法にて除去するか、又はデ
オキシリボヌクレアーゼに分解除去する。
参考例 ４ （逆相蒸発法による遺伝子包埋リポソーム調製の具体
例） Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデ
シル−Ｄ−グルタメートクロライド４μmol及びジミリ
ストイルホスファチジルコリン２μmolをクロロホルム
に溶解してナシ型フラスコに入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス内壁
面に脂質薄膜を作成し、デシケーター中で減圧乾燥させ
た。0.5mlのジエチルエーテルと0.1mlのクロロホルムと
を添加して上記の脂質薄膜を溶解した後に、100μｇのD
NAを添加した0.17mlの減菌ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩
水を加えて、約60秒間超音波処理を行い乳化させた。こ
の乳化試料から有機溶剤をロータリーエバポレーターに
より480mmHgで減圧除去し、試料がペースト状になった
時点で0.17mlの５％グリセロールを含有する減菌ダルベ
ッコ燐酸緩衝生理食塩水を添加して撹拌し、再びロータ
リーエバポレーターを用いて約105mmHgで残余の有機溶
媒を減圧除去してリポソームを調製した。
例） Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデ
シル−Ｄ−グルタメートクロライド４μmol及びジミリ
ストイルホスファチジルコリン２μmolをクロロホルム
に溶解してナシ型フラスコに入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いクロロホルムを減圧除去して、ガラス内壁
面に脂質薄膜を作成し、デシケーター中で減圧乾燥させ
た。0.5mlのジエチルエーテルと0.1mlのクロロホルムと
を添加して上記の脂質薄膜を溶解した後に、100μｇのD
NAを添加した0.17mlの減菌ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩
水を加えて、約60秒間超音波処理を行い乳化させた。こ
の乳化試料から有機溶剤をロータリーエバポレーターに
より480mmHgで減圧除去し、試料がペースト状になった
時点で0.17mlの５％グリセロールを含有する減菌ダルベ
ッコ燐酸緩衝生理食塩水を添加して撹拌し、再びロータ
リーエバポレーターを用いて約105mmHgで残余の有機溶
媒を減圧除去してリポソームを調製した。
リポソームに包埋されなかったDNAについてはデオキ
シリボヌクレアーゼ100units/mlにて分解除去した。
シリボヌクレアーゼ100units/mlにて分解除去した。
実施例 ３ 参考例４に従ってSV40後期プロモーターにラット貯蔵
グロノラクトン酸化酵素cDNAを結合したプラスミドDNA
包埋リポソームを調製し、脂質量として80−600nmolの
上記リポソームを約１×105個のSV40で軽質転換された
サル腎臓細胞（COS−１）上の10％牛胎児血清含有ダル
ベッコMEM培地（2ml）に添加して培養し、16時間後に培
地の交換を行った。72時間後に細胞をアセトン：メタノ
ール（1:1）で固定後、細胞内で発現したグロノラクト
ン酸化酵素を酵素免疫染色法により検出した。結果は下
記の表２に示されている。
グロノラクトン酸化酵素cDNAを結合したプラスミドDNA
包埋リポソームを調製し、脂質量として80−600nmolの
上記リポソームを約１×105個のSV40で軽質転換された
サル腎臓細胞（COS−１）上の10％牛胎児血清含有ダル
ベッコMEM培地（2ml）に添加して培養し、16時間後に培
地の交換を行った。72時間後に細胞をアセトン：メタノ
ール（1:1）で固定後、細胞内で発現したグロノラクト
ン酸化酵素を酵素免疫染色法により検出した。結果は下
記の表２に示されている。
表２に示されているように、プラスミドDNAを包埋し
たリゾームを用いても本発明方法による細胞への遺伝子
導入を行うことができる。
たリゾームを用いても本発明方法による細胞への遺伝子
導入を行うことができる。
尚、プラスミドDNA単独又はプラスミドDNAを包埋して
いないリポゾーム単独を用いた場合には、グロノラクト
ン酸化酵素の発現は認められなかった。
いないリポゾーム単独を用いた場合には、グロノラクト
ン酸化酵素の発現は認められなかった。
実施例 ４ 参考例４に従ってSV40前期プロモーターにヒトβ型イ
ンターフェロン構造遺伝子を結合したプラスミドDNA包
埋リポソームを調製し、脂質量として13−100nmolの上
記リポソームを１×105個のサルの腎臓細胞（COS−１）
上の10％牛胎児血清含有ダルベッコMEM培地（2ml）に添
加して培養し、16時間後に培地の交換を行った。72時間
後に培地を採取し、培地中に含まれるヒトβ型インター
フェロン量を酵素免疫定量法により測定し、本発明方法
による遺伝子導入の効果を測定した。結果は下記の表３
に示される通りであり、カチオン性脂質と燐脂質とによ
り調製されたプラスミドDNA包埋リポソームによれば遺
伝子の導入が行われ、インターフェロンの発現すること
が判明した。
ンターフェロン構造遺伝子を結合したプラスミドDNA包
埋リポソームを調製し、脂質量として13−100nmolの上
記リポソームを１×105個のサルの腎臓細胞（COS−１）
上の10％牛胎児血清含有ダルベッコMEM培地（2ml）に添
加して培養し、16時間後に培地の交換を行った。72時間
後に培地を採取し、培地中に含まれるヒトβ型インター
フェロン量を酵素免疫定量法により測定し、本発明方法
による遺伝子導入の効果を測定した。結果は下記の表３
に示される通りであり、カチオン性脂質と燐脂質とによ
り調製されたプラスミドDNA包埋リポソームによれば遺
伝子の導入が行われ、インターフェロンの発現すること
が判明した。
尚、プラスミドDNA単独又はプラスミドDNAを包埋して
いないリポソーム単独を用いた場合には、インターフェ
ロンの発現が認められなかった。
いないリポソーム単独を用いた場合には、インターフェ
ロンの発現が認められなかった。
（発明の効果） 細胞への遺伝子導入法において、本発明によれば、Ｎ
−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル
−Ｄ−グルタメート又はその薬理学的に許容される塩を
単独で、若しくは炭素原子数８−18個の飽和した直鎖又
は分岐鎖を有し且つ少くとも１個のカチオン性親水基を
有する脂質又はその薬理学的に許容される塩と燐脂質と
を必須構成成分とするリポソーム乃至脂質懸濁液が遺伝
子の包埋用乃至結合用担体として用いられる結果、細胞
への遺伝子導入効率が著しく向上する。遺伝子をリポソ
ームに包埋させる場合に、リポソームの調製法として逆
相蒸発法を適用すれば、その包埋効率を更に向上させる
ことができる。尚、カチオン性脂質は脂肪酸側鎖が飽和
状態にあるので、過酸化が生じ難く、従って保存安定性
に優れ、又細胞に対する毒性も生じないので、本発明方
法は生体への適用が可能となる。
−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル
−Ｄ−グルタメート又はその薬理学的に許容される塩を
単独で、若しくは炭素原子数８−18個の飽和した直鎖又
は分岐鎖を有し且つ少くとも１個のカチオン性親水基を
有する脂質又はその薬理学的に許容される塩と燐脂質と
を必須構成成分とするリポソーム乃至脂質懸濁液が遺伝
子の包埋用乃至結合用担体として用いられる結果、細胞
への遺伝子導入効率が著しく向上する。遺伝子をリポソ
ームに包埋させる場合に、リポソームの調製法として逆
相蒸発法を適用すれば、その包埋効率を更に向上させる
ことができる。尚、カチオン性脂質は脂肪酸側鎖が飽和
状態にあるので、過酸化が生じ難く、従って保存安定性
に優れ、又細胞に対する毒性も生じないので、本発明方
法は生体への適用が可能となる。
Claims (2)
- 【請求項１】Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチ
ル）−ジドデシル−Ｄ−グルメタート又は薬理学的に許
容される塩を単独で、若しくは炭素原子数８−18個の飽
和した直鎖又は分岐鎖を有し且つ少くとも１個のカチオ
ン性親水基を有する脂質又はその薬理学的に許容される
塩と燐脂質とを構成成分とするリポソーム乃至脂質懸濁
液を用いることを特徴とする、細胞への遺伝子導入法。 - 【請求項２】リポソームの調製を逆相蒸発法により行う
ことを特徴とする、請求項１に記載の細胞への遺伝子導
入法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63285738A JP2923296B2 (ja) | 1988-11-14 | 1988-11-14 | 細胞への遺伝子導入法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63285738A JP2923296B2 (ja) | 1988-11-14 | 1988-11-14 | 細胞への遺伝子導入法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02135092A JPH02135092A (ja) | 1990-05-23 |
| JP2923296B2 true JP2923296B2 (ja) | 1999-07-26 |
Family
ID=17695406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63285738A Expired - Lifetime JP2923296B2 (ja) | 1988-11-14 | 1988-11-14 | 細胞への遺伝子導入法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2923296B2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6867195B1 (en) | 1989-03-21 | 2005-03-15 | Vical Incorporated | Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected |
| JP2958076B2 (ja) * | 1990-08-27 | 1999-10-06 | 株式会社ビタミン研究所 | 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法 |
| DE19605175A1 (de) | 1996-02-13 | 1997-08-14 | Sourovoi Andrej Dr | Lipidverbindungen und deren Verwendung |
| JPH09248182A (ja) * | 1996-03-15 | 1997-09-22 | Oyo Seikagaku Kenkyusho | プラスミド包埋多重膜リポソーム |
| US7384923B2 (en) | 1999-05-14 | 2008-06-10 | Lipoxen Technologies Limited | Liposomes |
| ES2305157T3 (es) * | 1996-09-13 | 2008-11-01 | Lipoxen Technologies Limited | Liposomas. |
| CA2286177C (en) * | 1997-04-07 | 2011-06-21 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Composition for gene transfer into cells |
| JPWO2005054486A1 (ja) * | 2003-12-05 | 2007-06-28 | 福岡県 | 遺伝子導入試薬調製法 |
| US8227248B2 (en) | 2006-06-30 | 2012-07-24 | Hokkaido System Science Co., Ltd. | Composition for nucleic-acid transfection |
| WO2008056623A1 (fr) | 2006-11-09 | 2008-05-15 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Composition pour l'introduction d'acide nucléique |
| CA2878314A1 (en) * | 2012-07-16 | 2014-01-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Rnai pharmaceutical composition for suppressing expression of kras gene |
-
1988
- 1988-11-14 JP JP63285738A patent/JP2923296B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02135092A (ja) | 1990-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2923296B2 (ja) | 細胞への遺伝子導入法 | |
| EP0741689B1 (en) | Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids | |
| US5744335A (en) | Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein | |
| Kohn et al. | Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses | |
| EP1019365B1 (en) | Novel compositions for the delivery of negatively charged molecules | |
| KR100447517B1 (ko) | 형질감염제로서리포폴리아민및이의약학적용도 | |
| US5851548A (en) | Liposomes containing cationic lipids and vitamin D | |
| US7041312B2 (en) | Wound healing compositions and methods of use | |
| RU2179549C2 (ru) | Новые катионные и поликатионные амфифильные соединения, содержащие их реагенты и их применение | |
| JPH03505671A (ja) | Ｄｎａ修復酵素の精製と投与 | |
| EP0625049A1 (en) | Ex vivo gene transfer | |
| JPH04108391A (ja) | 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法 | |
| US6245427B1 (en) | Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles | |
| US5739271A (en) | Thiocationic lipids | |
| KR20140041593A (ko) | 아미노 지질, 이의 합성 및 이의 용도 | |
| KR20010112301A (ko) | 리포좀내에 생활성 복합체의 포집 | |
| SK99399A3 (en) | N-acyl phosphatidylethanolamine-mediated liposomal drug delivery | |
| EA003130B1 (ru) | Катионные виросомы в качестве системы для переноса генетического материала | |
| EP1068306B1 (en) | Pentaerythritol lipid derivatives | |
| CN1863558A (zh) | 具有向核内转移能力的聚精氨酸修饰的脂质体 | |
| US5711964A (en) | Method for the intracellular delivery of biomolecules using liposomes containing cationic lipids and vitamin D | |
| US5980935A (en) | Cationic lipids and methods of use therefor | |
| US20030134423A1 (en) | Compounds for delivering substances into cells | |
| WO1998056423A1 (fr) | Nouveaux complexes lipidiques pour le transfert d'au moins une substance therapeutiquement active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique | |
| Alino et al. | In vivo delivery of human α1-antitrypsin gene to mouse hepatocytes by liposomes |